RU1813089C - Способ получени комплексного соединени платины (II) с Н-ДНК, обладающего противоопухолевой активностью - Google Patents

Abstract

Изобретение касаетс  комплексных соединений пластины (2+), в частности получени  комплекса соединени  платины (2+) с н-ДНК, обладающего противоопухолевой активностью, что может быть использовано в медицине. Цель - повышение активности и снижение токсичности целевого продукта. Дл  этого ведут реакцию цис-дихлордиами- ноплатины с дезоксирибонуклеиновой кислотой (выделенной из селезенки крупного рогатого скота, марки А) в присутствии NaCI и цитрата натри  при мол рном соотношении 6:4:30:3, при нагревании до 78+0,5°С в течение 15-20 мин в водной среде. Полученный продукт обеспечивает 95%-ное торможение роста опухоли при 100%-ной выживаемости животных. 2 табл.

Description

Изобретение относитс  к способу получени  нового комплексного соединени  платины, обладающего противоопухолевой активностью.

Целью изобретени   вл етс  получение нового платиноорганического комплексного соединени  с более высокой активностью и более низкой токсичностью по сравнению с известными противоопухолевыми препаратами .

Способ получени  полиплатиллена заключаетс  в том, что предварительно нагретые до температуры плавлени  н-ДНК водные цитратно-солевые растворы цисдихлордиамминплатины и н-ДНК смешивают в мол рном соотношении Pt:P:NaC :Na3Cyt 6:4:30:3 и термостатиру- ют при этой температуре до окончани  реакции .

Нативную ДНК раствор ют в цитратно- солевом растворе (15 ммоль/л NaCI 1,5 ммоль/л NasCyt) при комнатной температуре и нагревают в термостате до Тпл.

Цис-дихлордиамминплатину (П) раствор ют в таком же цитратно-солевом растворе , предварительно нагретом до температуры плавлени  н-ДНК.

00

д

СлЭ

00

ю

Окончание взаимодействи  ДДП и н- ДНК контролируют спектрофотометрически по достижению параметров УФ-спектра поглощени  Амакс. 266,2+0,1 НМ И Е266.2 10000+100 л.моль 1см 1.

За вл емое вещество получают в водном растворе и в твердом виде как индиви- дуальное вещество или как смесь с NaCI+Na3Cyti5,5«H20.

Пример 1. Высокомолекул рную н-ДНК с температурой плавлени  78,0+0,°С в количестве 0,500 г раствор ют при комнатной температуре в 0,375 л водного раствора, содержащего 15 ммоль/л NaCI + 1,5 ммоль/л NaaCyt в дальнейшем такой раствор будет называтьс  цитратно-солевым) и нагревают раствор с термостате до 78,0±0,5°С со скоростью 1°С в минуту.

Препарат ДДН в количестве 0,675 г раствор ют в 0,375 л цитратно-солевого раствора , предварительно нагретого в термостате до 78,OtO,5°C.

Приготовленные растворы н-ДНК и ДДП смешивают при 78,0+0,5°С, тщательно перемешивают и термостатируют при 78,0+0,5°С еще в течение 15 мин.

Пример 2. Опыт провод т как в примере 1, только реакционную смесь подвергают лиофильной сушке по методике изготовлени  сухой плазмы крови.

Раствор полиплатиллена, полученный по реакции при посто нном вращении, охлаждают до минус 40°С в течение 40 мин, выдерживают при этой температуре 12 ч, а затем температуру повышают до минус 20°С, образец откачивают в течение 40 ч, нагрева ют до плюс40°С и снова откачивают 26 ч, Полученный после лиофильной сушки лиофилизат представл ет собой сложное вещество, состо щее из полиплатиллена, NaCI и NasCyt 5,5 НзО в мольном соотношении Pt:P:NaCI:Na3Cyt 6:4:30:3.

Пример 3. Опыт провод т как в примере 2, только из полученного после лиофильной сушки сложного вещества (лиофи- лизата) удал ют NaCI и №зСу1 5,5 Н20. Дл  этого к 0,250 г лиофилизата добавл ют 50 мл дистиллированной воды и тщательно перемешивают . Полученную известь центрифугируют при комнатной температуре со скоростью 7000 об/мин в течение 15 мин на центрифуге ОПн-8. Осадок отдел ют от над- осадочного раствора декантацией, промывают водой, спиртом, эфиром и сушат на воздухе. Сухое вещество хран т .при комнатной температуре в закрытой стекл нной посуде. Выход чистого полиплатиллена составл ет 60% от теоретического.

Дл  экспериментальной проверки за вл емого способа получени  полиплатиллена было проведено еще 22 опыта, 10 из которых показали положительные результа- ты. В положительных опытах получен продукт , УФ-спектры которого имеют параметры, характерные дл  за вл емого соединени . Результаты опытов сведены в табл. 1, где приведены характеристики пол0

ученных продуктов в зависимости от способа их получени . Способы получени  охарактеризованы следующими параметрами; выбором концентрации исходных растворов ДДН и н-ДНК, мол рным

5 соотношением Pt:P:NaCi:Na3Cyt 5,5 HzO, временем и температурой проведени  реакции .

Из табл. 1 следует, что выбор исходных концентраций ДДН и н-ДНК в пределах

0 ошибки опыта не вли ет на характеристики полученного продукта (опыты 1-6). Максимальна  концентраци  ДДН ограничена ее растворимостью, составл ющей 0,2523 мас.% при250°С, Минимальна  концентра5 ци  ДДП ограничена минимально возможной дл  хорошей спектрофотометрической регистрации концентрацией н-ДНК, составл ющей 3,0 мкг/мл. Опыты 7-12 показали, что отклонение от соотношени 

0 Pt:P:NaCI:Na3Cyt в сторону избытка одного из компонентов не позвол ет получить целевое соединение полиплатиллен с выше указанными параметрами УФ-спектра. Результаты опытов 13-16, указывают

5 что взаимодействие реагентов по реакции протекает быстро и заканчиваетс  за врем , не превышающее 5 минут. Увеличение времени термостатировани  реакционной смеси до 30 минут не вли ет на параметры

0 продукта реакции.

Результаты опытов 17-22 говор т о существенном вли нии температуры проведени  реакции на такой параметр продукта реакции как E26G.2. Из зависимости Ё266.2 от

5 температуры видно, что дл  получени  за вл емого соединени  полиплатиллена тер- мостатирование реакционной смеси надо вести при 78+0,5°С. За пределами указанного температурного интервала нельз  пол0 учить продукт с необходимыми параметрами УФ-спектра.

Приведенные лишь данные позвол ют заключить, что смешением предварительно нагретых до температуры плавлени  н-ДНК

5 водных .цитратно-солевых растворов н- ДНК и цис-дихлородиаммин-платины (II) в мол рном соотношении Pt:P:NaCI:Na3Cyt 6:4:30:3 с последующим термостатированием при этой температуре в течение времени, необходимом дл  окончани  реакции, позвол ет

получить соединение, характеризуемое формулой (МНз)(Н20)}п- ДНК с нижеописанными физико-химическими свойствами . Соединение представл ет собой биологически активное высокомолекул рное вещество, которое способно эффективно тормозить рост опухоли и увеличивать продолжительность жизни организма при низкой токсичности и тем самым превосходит известные противоопухолевые препараты .

За вл емое вещество, полиплатиллен, существует в растворе и в твердой фазе в виде смеси с хлоридом натри  и цитратом натри  (формула цитрата натри  - №зСбОуН5 5,5 Н20, сокращенно- NaaCytJ n как индивидуальное вещество. Смесь полиплатиллен а с хлоридом натри  и цитратом натри  представл ет собой порошок желтого цвета. Индивидуальное соединение - мелкокристаллический светлокоричневый порошок. Оно устойчиво в растворах и в твердом виде, способно длительное врем  хранитьс  в воздухе и в холодильнике без изменени  свойств. Состав и строение соединени  определены на основе химико-аналитических и физико-химических исследований твердых образцов и растворов.

Элементный анализ соединени  в смеси с сол ми натри  и в индивидуальном состо нии подтверждает состав синтезированного целевого продукта лолиплатилле- на. Дл  смеси (МНз)(Н20)б- }п-уМ-ДНК +

+ ЗОп NaCI + ЗпМазСбОуНб 5,5 Н20.

Найдено, %: Pt 20.41: CI22.10: С 11,29: N 5,07; Р 1,99; Н 2,06: Na 15.40.

Вычислено.%: Pt 20,23: С 22.1-0: С 11,83; N5,08; Р 2,14; Н 2,19; Na 15,51.

Дл  индивидуального соединени  поли- платиллена

Найдено,%: Pt 39.81; CI 7,40; С 15.62; N 10,11;Р 4,38; Н 2,83.

Вычислено,0/,: Pt 39.58; С 7,21; С 15,83; N 9.95; Р 4,19; Н 2,67.

Измеренна  вискозиметричееким ме- тодрм молекул рна  масса полиплатиллена оставл ет 6,2 106 дальтонов. Рассчитанна  на основе данных о среднестатической молекул рной массе полипропиллена и массы его среднестатической мономерной единицы формулы (среднестатическа  величина п 2100Ј100)

{{PtCI(NH3)(H20)KC39H49032Nl5P4)}.

Следовательно, в среднем, на 2000 нуклео- тидных квартетов ДНК, состо щих из пар аденин-тимин, гуанин-цитозы, приходитс  примерно 120QO комплексных частиц {PtCI(NH3XH20)f. :

Полученный в индивидуальном виде полиплатиллен плохо раствор етс  в воде. Его растворимость повышаетс  в присутствии солей натри  (NaCI + NasCyt). Так при 20°С 5 растворимость препарата в дистиллированной воде составл ет всего 0,0005%, а в растворе , содержащем 18 ммоль/л NaCI и 1,8 ммоль/л NaCyt - 0,005%. Значительно лучше , чем индивидуальное вещество, растер0 р етс  полиплатиллен, полученный в смеси с NaCI + NaaCyt: растворимость такого образца в воде при 2°С равна 0.015%. Однако и эта величина на пор док ниже максимально достижимой концентрации соединени ,

5 полученного в растворе, Пониженна  растворимость твердых образцов говорит о необратимой десольватации полиплатиллена при его выделении из водного раствора, что обуславливает необходимость использо0 . вать суспензии твердых образцов при биологических испытани х.

Раствор чистого полиплатиллена практически не проводит электрический ток, что свидетельствует об отсутствии электролитй5 ческой диссоциации при его растворении.

УФ-спектры образцов полиплатиллена, полученных в водном растворе и выделенных в твердом виде индивидуально или как смесь с NaCI+NaaCyt, после растворени  в

0 воде характеризуютс  максимальным поглощением Амакс. - 266,2 нм, тогда как дл  свободной н-ДНК Амакс. 258,0 нм. Молекул рный коэффициент поглощени  полиплатиллена в расчете на моль нуклеотида, Е 266,2

5 10000 л , а у н-ДНК - Е258,о

. 7000 л, . Смещение максимума

поглощени  в длинноволновую область на

8,2 нм у полиплатиллена по сравнению с

н-ДНК говорит о св зывании макромолёку0 лы с платйноеодержащмми группировками в результате образовани  ковалентных св зей между ионом металла и донорными атомами азота оснований ДНК. Более высока  величина длинноволнового смещени  УФ5 максимума поглощени  у полиплатиллена, ДА 8,2 нм, по сравнению с аналогичной величиной ДЯ 7,7 нм дл  соединени  РЮН- ДНК, свидетельствует о том/что, в среднем, ковалентные св зи между платиной и осно0 вани ми ДНК в подиплатил ене прочнее, чем в соединении PtOH-ДНК: Сопровождающий это св зывание гиперхромный эффект составл ет 30%, указыва  на сильные конформационные изменени  двойной спи5 ра и ДНК при взаимодействии с металлом. Изменени  в ЙК-спектрах полиплатиллена по сравнению со свободной ДНК свидетельствуют о том. что металл в нем св зываетс  не только с азотистыми основани миДНК , ной с атомами кислорода фосфатных групп. При 1225 и 1060 см наход тс  полосы валентных колебаний фосфодиэфирных мостиков ДНК. В области 1500-1700 наблюдаютс  полосы валентных колебаний , , азотистых оснований ДНК, в области 300,0-3700 см-1 полосы валентных колебаний групп С-Н, N- Н, О-Н, вход щих в состав ДНК и молекул воды. Кроме того, при 340 см наблюдаетс  валентное колебание PtCI, при 1340 см деформационное колебание координированной молекулы NHs.

По данным термического анализа чистый полиплатиллен не тер ет молекулу воды даже при нагревании до 200° С, что Свидетельствует о ее прочном св зывании. Смесь полиплат иллена с NaCI + NaaCyt 5,5 Н20 при прогревании до 200°С тер ет кристаллизационную воду цитрата натри . Найдено, что потер  воды дл  смеси полиплатиллен + Nad + NaaCyt 5,5 НаО составл ет 5,10%, а вычисленное количество кристаллизационной воды равно 5,13%.

Спектры отражени  твердого полипла- тиллёна имеют значени  коэффициентов спектрального отражени , R,%, в экстремальных точках, отличие от значений R дл  ДДП. Дл  смеси полиплатиллен + NaCI + NaaCyt 5.5 ЖО R267.1 8,97; ,28; в то врем  как дл  ДДП R242.2 9,7, R269J 13,6; Рззз.з 10,4: Rs4o 17.10: R414,,80; Rsi4.4 50,57.

Спектры отражени  подтверждают, что полиплатиллен представл ет собой вещество , содержащее комплекс платины, состав координационной сферы которого изменен за счет замещени  одной молекулы аммиака и одного аниона хлора молекулой воды и фрагментами ДНК. Данные элементлого анализа, вискозиметрии, кондуктометрии, УФ- и ИК-спектров поглощени , а также спектров отражени  свидетельствуют о том, что синтезированное соединение действительно высокомолекул рное вещество - по- ли{гексакис хлороамминакваплатина(П)}- -дезоксирибонуклеат формулы

{ Р1С1{МНз)(Н20)6}п-/г-ДНК

В табл. 2 представлены результаты испытаний токсичности и противоопухолевой активности за вл емого соединени  и соединени  PtOH-ДНК, выбранного в качестве базового. Опыты проводили на мышах и крысах обоего пола разведени  питомника Столбова .

Токсичность изучали на группах животных из половозрелых нелинейных мышей весом 30,0+2,0 г, прошедших карантин 20

дней (в каждой группе было по 10 животных ), Препараты вводили внутрибрюшин- но трехкратно с интервалом в два часа по 0,5 мл. Дл  инъекций PtOH-ДНК использовали

водные растворы, а дл  инъекций полипла- тиллена - цитратно-солевые растворы (водный раствор, содержащий 15 ммоль/л NaCI и 1,5 ммоль/л NasCyt) или водные суспензии его твердых образцов, представл ющих собой индивидуальное вещество или его смесь с NaCI + NasCyt.

Суммарные дозы препаратов составл ли 34,0. 68,0, 84,0,102,0 и 136,0 мг/кг. Количество погибших животных в каждой группе

отмечали через каждые 24-48 часов расчет токсичной дозы, ЛДво, проводили по методике . Летальную дозу, ЛДюо, определ ли экспериментально.

В результате проведенных опытов установлено . что дл  соединени  PtOH-ДНК ЛДзо 66,0, ЛДзо 100 мг/кг. Токсичность полиплатиллена зависит от формы его введени . Дл  препарата, полученного в растворе , ЛДбо 102,0, а ЛДюо 136,0 мг/кг;

дл  препарата, выделенного индивидуально или в смеси с NaCI + NasCyt 5,5 НгО 82,5, ЛДбо 120,0 мг/кг. Из сравнени  приведенных величин следует, что токсичность полиплатиллена значительно ниже, чем у

соединени  PtOH-ДНК. Особенно снижена токсичность у полиплатиллена. полученного в:растворе.

Согласно гистологическим исследовани м гибель животных, получавших токсические дозы препаратов обусловлена энтеротоксичностью. Имеет место выраженна  дисплази  клеток эпители  в кишечнике , нарушение его регенераторной функции, сокращение количества митозов.

Незначительные изменени  отмечены в почках: небольшой отек стромы. зерниста  дистрофи  канальцев, мелкоочаговые кровоизли ни .

Противоопухолевую активность каждого из препаратов оценивали из экспериментов , проведенных на п ти группах животных (в каждой группе по 10 животных). Белым беспородным крысам весом 150-200 г под кожу бедра трансплантировали 2 -108 - 2

10-10 клеток перевивного штамма лейкоза Швеца. Животные I группы служили дл  контрол , II группа получала соединение PtOH- ДНК, III - полиплатиллен, полученный в растворе, IV-полиплатиллен, полученный в

смеси с NaCI+Na3Cyt 5,5 Н20, V - полиплатиллен , полученный в индивидуальном виде . Препараты вводили внутрибрюшинно трехкратно на 4-6 сутки после трансплантации опухоли, т.е. в период логарифмической фазы ее роста, второй и третий раз - с интервалами 24-48 ч соответственно. Суммарные дозы препаратов составл ли 27.3 мг/кг в расчете на чистый препарат.

Противоопухолевую активность оценивали по следующим физиологическим показател м:

- по объему опухоли, V (см3):

- по степени угнетени  роста опухоли (Т/С, %);

- выживаемости животных на 10-е сутки (ВЖ,%);

- продолжительности жизни животных (ПЖЖ, сутки).

Расчеты производили по следующим формулам:

V |±.

где mi, ГЛ2. тз - три взаимно-перпендикул рных измерени  опухолевого узла;

VKOH -Von

т/с

VK

100,

где VKOH и Von - объем опухоли в контрольной и опытной группах соответственно;

RS.X -А-100

ВЖ--fl-.

где А - число животных на 10-е сутки после трансплантации опухоли.

N - число животных в данной группе.

ПЖЖ определ ли по числу суток, прошедших от момента перевивки опухоли до гибели последнего животного в данной труппе. Данные о биологической активности полиплатиллена. приведенные в таблице , подтверждены актом испытаний противоопухолевой активности и токсичности .

Анализ данных, представленных в табл. 2 показывает, что препарат РЮН-ДНК по сравнению с контролем тормозит рост опухоли на 94%. Его применение позвол ет получить 100%-ную выживаемость животных . В то же врем  продолжительность жизни животных при его применении уменьшаетс  на 3-е суток по сравнению с контролем, т.е. с нелеченными животными. Противоопухолева  активность полиплатиллена не зависит от формы ведени  препарата . Во всех случа х он тормозит рост опухоли на 95%, обеспечивает 100%-ную выживаемость животных. В то же врем  продолжительность их жизни увеличиваетс  по сравнению с контролем на 7-8 суток, а по сравнению с PtOH-ДНК - вдвое, т.е. на 10+1 суток.

Сравнительный анализ данных, приведенных в таблице, позвол ет заключить, что за вл емое соединение, полиплатиллен,

менее токсично, чем препарат PtOH-ДНК, особенно если его примен ть в виде препарата , полученного в растворе. По уровню противоопухолевой активности и выживае- 5 мости не уступает соединению РЮН-ДНК, а по такому показателю, как продолжительность жизни, существенно превосходи его, так как увеличивает продолжительность жизни в два раза.

0 Таким образом, создание высокомолекул рного соединени  платины (II) с ДНК, полиплатиллена, привело к получению вещества более эффективного, чем известные противоопухолевые препараты, так как по

5 показател м физиологической активности, характеризующим его противоопухолевый эффект, предлагаемый препарат превосходит или сопоставим с известными веществами и выгодно отличааетс  от них из-за

0 уменьшени  токсичности.

Вы вленный комплекс свойств: высокие показатели степени торможени  роста опухоли, выживаемости животных и продолжительности их жизни при одновременном

5 снижении токсичности делает предложенное соединение перспективным дл  создани  препаратов, эффективных дл  лечени  злокачественных опухолей,

Дополнительным преимуществом пред0 латаемого противоопухолевого вещества  вл етс  обеспечение им возможности расширить р д высокомолекул рных платино- содержащихпротивоопухолевых препаратов и тем самым обеспечить пре5 одоление эффекта привыкани  организма к платиновым противоопухолевым средствам .

Способ обеспечивает также получение вещества в растворе и в твердой фазе как

0 индивидуального соединени  в чистом виде и как смеси его с хлоридом и цитратом натри .

Формул а изобретени  Способ получени  комплексного соеди5 нени  платины И) с н-ДНК, обладающего противоопухолевой активностью, взаимодействием цис-дихлордиаминплатины с дезоксирибонуклеиновой кислотой, выделенной из селезенки крупного рога0 того скота, марки А при нагревании до 78,0+0,5°С в водной среде, о т л и чающ и й- с   тем, что, с целью получени  соединени  с более высокой активностью и более низкой токсичностью, процесс провод т в при5 сутствии хлористого натри  и цитрата натри  при мол рном соотношении платины , фосфора, н-ДНК, хлористого натри  и цитрата натри  равном 6:4:30:3 в течение 15-20 мин.

Таблица 1

Таблица 2