RU1806190C - Штамм VIRUS нератIтIS А номINIS дл приготовлени вакцинных и диагностических препаратов - Google Patents
Штамм VIRUS нератIтIS А номINIS дл приготовлени вакцинных и диагностических препаратовInfo
- Publication number
- RU1806190C RU1806190C SU914942414A SU4942414A RU1806190C RU 1806190 C RU1806190 C RU 1806190C SU 914942414 A SU914942414 A SU 914942414A SU 4942414 A SU4942414 A SU 4942414A RU 1806190 C RU1806190 C RU 1806190C
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- strain
- cells
- frhk
- preparation
- vaccine
- Prior art date
Links
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Abstract
Использование: медицинска вирусологи . Сущность изобретени : штамм ГИСК № 213 выделен из фекалий больного и адаптирован к культуре FRhK-4. Инкубационный период внутриклеточного антигена наблюдаетс в течение 2 сут.;наибольшее количество антигена отмечаетс на 7-8 сут. и составл ет 1:64. Штамм обладает цитопати- ческим эффектом. Инфекционный титр составл ет (3-5)-105 БОЕ/мл. Штамм ГИСК N 213, адаптированный к диплоидным клеткам Л-68, обладает иммуногенной активностью . Титр антител у морских свинок составл ет 1:100-1:1000. 1 табл.
Description
Изобретение относитс к медицинской вирусологии и касаетс получени быстрорастущего штамма вируса гепатита А (ВГА). Этот штамм может быть использован в профилактических и диагностических цел х в медицине.
Целью изобретени вл етс получение в культуре клеток быстрорастущего штамма ВГА, способного образовывать бл шки, что значительно упрощает и удешевл ет работу при получении диагностических и профилактических препаратов.
Штамм ВГА МБ-7 депонирован под N 213 в коллекции Государственного института стандартизации и контрол медицинских и биологических препаратов им. Л.А.Тарасе вича.
Штамм получен из фекалий больного с клинически выраженными признаками гепатита А в 1988 г. Приготовленную 10% суспензию фекалий на 0,1 М Na-фосфатном буфере (рН 7,4)ресуспендируют, центрифугируют в течение 10 мин при 1500-2000 об/мин. Супернатант фильтруют через фильтр 0,22 мкм (производство Mlllipore), фасуют по 0,5 мл в стерильные флаконы и хран т при температуре (-70±0.5)°С. Полученный супернатант используют в качестве иноку- л та дл получени штамма ВГА на клетках FRhK-4.
На сформированный монослой клеток FRhK-4 нанос т инокул т. После адсорбции в сосуд добавл ют ростовую поддерживающую среду. Через неделю после заражени культуральную жидкость сливают, клетки промывают раствором трипсина-версена и отслоившиес клетки собирают в натрий-солевом фосфатном буфере. Собранные клетки трижды промораживают и клеточный лизат используют в качестве инокул та дл
00
о
о
ю . о
со
следующего пассажа. Уже на втором пассаже в клетках FRhK-4 вы вл етс антиген.
Антиген также вы вл етс в процессе адаптации полученного штамма к перевиваемой культуре клеток почки зеленой мартышки 4647 и диплоидной культуре клеток легкого человека Л68. Возможна адаптаци штамма и к другим клеточным лини м.
Штамм характеризуетс следующими признаками.
Морфологические признаки. Частицы ВГА, содержащие РНК, по данным электронной микроскопии имеют диаметр 27 нм. Основна масса частиц имеет плавучую плотность 1,34 г/см3 в градиенте хлористого цези и коэффициент седиментации 155- 160 S20w - в градиенте нейтральной сахарозы.
Культурапьные свойства. Дл культивировани штамма ВГА на клетках FRhK-4 используют поддерживающую среду Игла МЭМ, содержащую 5% фетальной сыворотки крупного рогатого скота и антибиотики пенициллин и стрептомицин по 100 ед/мл и 100 мг/мл,соответственно. В качестве ростовой среды дл клеток используют ту же среду с 10% фетальной сыворотки и указанными выше концентраци ми антибиотиков . Культивирование штамма ВГА МБ-7 на клетках FRhK-4 под покрытием, содержащим 5% бактоагара, на 11-12 сутки приводит к образованию четких бл шек размером 1-3 мм.
Реакцию нейтрализации провод т на уровне п того пассажа с нейтрализуемым отраслевым стандартным образом (ОСО4) и иммуноглобулинамм, содержащими специфичные антитела к вирусу гепатита A (IgG). В течение 1,5 ч каждое разведение вируса в равных объемах инкубируют с эмбриональной сывороткой плодов коров, с ОСО и фракцией сыворотки рёконвалесцента, содержащей иммуноглобулины класса G(lgG). Затем по 0,2 мл каждого комплекса нанос т на слитный монослой клеток FRhK-4 и инкубируют 1,5-2 ч при комнатной температуре. После адсорбции клетки культивируют под покрытием, содержащим 5% бактоагара. Через 10-12 суток на монослое по вл ютс бл шки.
В результате реакции нейтрализации антитела, содержащиес в ОСО+ и IgG, нейтрализуют часть вирусных частиц в препарате , в результате чего титр вируса в образцах, содержащих ОСО и IgG на пор док отличаетс от титра исходного вируса .
При иммунизации животных очищенным вирусом отмечаетс нарастание специфических антител в титрах 1:100-1:1000.
С целью исследовани данного штамма на молекул рном уровне был проведен анализ кДНК, полученный на матрице вирусной РНК. с помощью метода амплификации
ДНК. Затравками в процессе амплификации служил набор олигонуклеотидов, выбранных и синтезированных на основе теоретического анализа наиболее консервативных участков РНК нескольких известны4 штамO MOB ВГА, Такой анализ, проведенный с помощью термрстабильной ДНК полимеразы, обнаружил наличие небольшого фрагмента размером около 270 н.п., аналогично фрагменту в составе рекомбинантной плазмиды,
5 содержащей ген белка VP 1 вируса HAS-15, Гибридизационный анализ этого участка с соответствующими мечеными праймера- ми, а также с ник-транслированным фрагментом гена VP 1 в составе рекомбинантной
0 плазмиды дал положительный ответ. Анализиру в ПАА-SDS геле высолоочищенный ВГА штамм МБ-7, вы вили при окраске по методу Кумасси три полипептида с относительным . мол. массами 34000 (VP 1), 25500
5 (ур 2) и 23000 (VP 3).
Электронно-микроскопическое исследование с помощью негативного контраста позволило обнаружить частицы вируса гепатита А в клеточном лизате, культуральной
0 жидкости, сконцентрированной в 100 раз и культуральной жидкости, очищенной в градиенте CsCI.
Вирусные частицы имеют типичную морфологию и представл ют собой сфери5 ческие частицы с диаметром 25-28 нм. Концентраци в клеточном лизате составл ет 10 в.ч./мл, а в очищенной культуральной жидкости - 109 в,ч./мл. Следовательно, по физико-химическим и антигенным свойст0 вам штамм не отличаетс от естественного циркулирующего в природе ВГА и штамма HAS-15, адаптированного к перевиваемой культуре клеток 4647. Приведенные примеры подробно раскрывают сущность изобре5 тени ..
Пример 1. Получение штамма ВГА МБ-7.
Штамм ВГА МБ-7 получают из фекалий больного с.клинически выраженными приО знаками гепатита А. Готов т 10% суспензию фекалий на 0,1 М натрий-солевом фосфатном буфере (рН 7,4), центрифугируют в течение 10 мин при 1500-2000 об/мин.
Профильтрованный через фильтр с диа5 метром пор 0,22 мкм (МИНроге) супернатант фасуют и замораживают с последующим использованием в качестве инокул та.
Культивирование клеток FRhK-4 до формировани моносло осуществл ют на сре- де. Игла МЭМ с 10% фетальной сыворотки и
антибиотиками пенициллином и стрептомицином в количестве 100 ед/мл и 100 мг/мл среды, соответственно.
На предварительно сформированный слитный монослой перевиваемых клеток почки эмбриона макаки резус (FRhK-4) нанос т профильтрованную 10% суспензию фекалий и инкубируют при (37±0,5)°С в течение двух часов. Инркул т сливают, монослой промывают раствором Эрла и добав- л ют поддерживающую среду. Через неделю культуральную жидкость сливают, клетки промывают трипсином-версеном дважды и добавл ют 0,1 М натрий-солевой фосфатный буфер (рН 7,4). Суспензию кле- ток трижды промораживают при (-70±1,0)°С дл более полного разрушени клеток и клеточный лизат используют в качестве иноку- л та дл следующего пассажа.
Очищенный вирус получают после трех- кратного замораживани и оттаивани куль- туральной жидкости вместе с клетками. Дебрис удал ют низкоскоростным центрифугированием (2000 об/мин, 0,5-1 ч), добавл ют сульфат аммони в расчете 24 г на 100 мл супернатанта. Осадок формируют в холодильнике в течение суток при (4 ±0,5)°С, далее центрифугируют при 8000 g в течение 1-2 ч. Осадок ресуспендируют в необходимом объеме 0,1 М натрий-солевого буфера с рН 7,4. Вирус гепатита А осаждают через подушку 20% раствора сахарозы с последующим центрифугированием в градиенте хлористого цези .
Пример 2. Культивирование штамма и получение вирусного антигена.
Дл культивировани штамма № 213 на клетках FRhK-4 используют среду Игла МЭМ, содержащую 5% эмбриональной сыворотки крупного рогатого скота и антибио- тики, как в примере 1.
Достаточное дл определени количество внутриклеточного антигена (по данным ИФА) в клетках FRhK-4 по вл етс уже на 3 сутки (таблица). Наибольшее количество антигена в этой системе вы вл етс на 7-8 сутки и составл ет 1:64. что сопоставимо с параметрами дл системы FRhK-4- HAS-15.
Особенностью за вл емого штамма вл етс способность образовывать крупные бл шки, что значительно упрощает работу. Дл получени бл шек штамм культивируют на клетках FRhK-4. Дл этой цели клетки выращивают на плоских флаконах объемом 50 мл до формировани слитного моносло , отмывают раствором Эрла, нанос т иноку- л т. Через два часа монослой отмывают и нанос т покрытие. В качестве покрыти используют среду Игла МЭМ, 2% фетальной сыворотки и 5% бактоагара. Флаконы инкубируют две недели в термостате при температуре (36,5±0,5)°С, затем монослой окрашивают0,05% раствором кристалла ви- олета, отмывают в течение 1-2 мин проточной водой и подсчитывают бл шки.
Инфекционный титр ВГА на уровне 5-го пассажа составл ет (3-5)-10 БОЕ/мл,
Таким образом, результаты эксперимента показали, что за вл емый штамм (быстрорастущий и обладающие цитопати- ческим эффектом) может быть использован при получении вакцинных пррпаратов, а также при получение f -игена в необходимом количеств дл и пользовани в различных тест-системах.
Claims (1)
- Формула изобретени Штамм virus hepatitis A hominis ГИСК № 213 дл приготовлени вакцинных и диагностических препаратов.Продукци антигена ВГА в клетках FRhK-4, определенна в реакции ИФА
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
SU914942414A RU1806190C (ru) | 1991-04-29 | 1991-04-29 | Штамм VIRUS нератIтIS А номINIS дл приготовлени вакцинных и диагностических препаратов |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
SU914942414A RU1806190C (ru) | 1991-04-29 | 1991-04-29 | Штамм VIRUS нератIтIS А номINIS дл приготовлени вакцинных и диагностических препаратов |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU1806190C true RU1806190C (ru) | 1993-03-30 |
Family
ID=21577738
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
SU914942414A RU1806190C (ru) | 1991-04-29 | 1991-04-29 | Штамм VIRUS нератIтIS А номINIS дл приготовлени вакцинных и диагностических препаратов |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
RU (1) | RU1806190C (ru) |
-
1991
- 1991-04-29 RU SU914942414A patent/RU1806190C/ru active
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
Авторское свидетельство СССР N° 1328376, кл. С 12 N 7/00, 1987. Авторское свидетельство СССР № 1606533, кл. С 12 N 7/00, 1990. * |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Hamre et al. | Growth and intracellular development of a new respiratory virus | |
PT1427817E (pt) | Multiplicação de vírus numa cultura celular | |
CA1175745A (en) | Methods of producing hb sag | |
EP0027347B1 (en) | Feline infectious peritonitis virus, its preparation and vaccines containing it | |
Brown et al. | Human foamy virus: further characterization, seroepidemiology, and relationship to chimpanzee foamy viruses | |
Danner et al. | In vitro studies on Borna virus: I. The use of cell cultures for the demonstration, titration and production of Borna virus | |
Vonka et al. | Some properties of the soluble (S) antigen of cultured lymphoblastoid cell lines | |
EP0011864B1 (en) | Attenuated strain of feline infectious peritonitis virus, method for preparing it and vaccine comprising it | |
Gilead et al. | Characterization of the Tumorlike (T) Antigen Induced by Type 12 Adenovirus: I. Purification of the Antigen from Infected KB Cells and a Hamster Tumor Cell Line | |
RU1806190C (ru) | Штамм VIRUS нератIтIS А номINIS дл приготовлени вакцинных и диагностических препаратов | |
KR100224331B1 (ko) | 조환수두 대상포진바이러스 및 그 제작방법 | |
KR20020020260A (ko) | 서코바이러스를 생장시키거나 생물학적 물질로부터제거하는 방법 | |
Gerber et al. | Attempts to transmit infectious mononucleosis to rhesus monkeys and marmosets and to isolate herpes-like virus | |
Takemoto et al. | Lymphotropic papovavirus transformation of hamster embryo cells | |
Schneider et al. | Purification of rabies virus from tissue culture | |
Solomon et al. | Procedures for the in vitro assay of viruses and antibody of avian lymphoid leukosis and Marek's disease | |
Buckley et al. | Production of hemagglutinin by dengue virus in HeLa cells | |
KR900007262B1 (ko) | 신(腎)증후성 출혈열 비루스 항원의 제조방법, 및 그 항원을 함유하는 백신 및 신증후성 출혈열 진단제 | |
WO1985005375A1 (en) | Methods for culturing diploid cells on cellulose fibers | |
Graessmann et al. | The biological activity of different forms of polyoma virus DNA and viral DNA fragments | |
Costa et al. | Oncogenicity of a nude mouse cell line transformed by a human papovavirus | |
CN117070476B (zh) | 一株牛疱疹病毒4型毒株及其在灭活疫苗制备中的应用 | |
ES2319254T3 (es) | Propagacion de coronavirus bovino en celulas de ovario de hamster chino. | |
RU2142816C1 (ru) | Способ получения антигерпетической вакцины и лекарственная форма на ее основе | |
RU2082432C1 (ru) | Способ получения вакцины против клещевого энцефалита |