RU137198U1

RU137198U1 - CELLULAR IMPLANT FOR TREATMENT OF LIVER DISEASES AND Pancreas

Info

Publication number: RU137198U1
Application number: RU2012158224/15U
Authority: RU
Inventors: Ольга Сергеевна Петракова; Инесса Гивиевна Гвазава; Андрей Валентинович Васильев; Василий Васильевич Терских; Юрий Владимирович Суханов
Original assignee: Ольга Сергеевна Петракова; Инесса Гивиевна Гвазава; Андрей Валентинович Васильев; Василий Васильевич Терских; Юрий Владимирович Суханов
Priority date: 2012-12-29
Filing date: 2012-12-29
Publication date: 2014-02-10

Abstract

Клеточный имплантат для лечения заболеваний печени и поджелудочной железы, представляющий собой объемную трехмерную биоинженерную конструкцию, образованную пористой матрицей-носителем сферической формы и клеточным компонентом, отличающийся тем, что матрица-носитель выполнена из сшитого желатина в виде микрочастиц сферической формы размером 130-380 мкм и размерами пор 6-22 мкм, а в качестве клеточного компонента используют печеночные клетки-предшественники или протоковые стволовые клетки подчелюстной слюнной железы человека.A cell implant for the treatment of diseases of the liver and pancreas, which is a three-dimensional three-dimensional bioengineered structure formed by a spherical porous carrier matrix and a cellular component, characterized in that the carrier matrix is made of crosslinked gelatin in the form of spherical microparticles with a size of 130-380 microns and pore sizes of 6-22 microns, and hepatic progenitor cells or ductal stem cells of the human submandibular salivary gland are used as a cellular component.

Description

Полезная модель относится к области регенеративной медицины и клеточных технологий, в частности, к биоинженерным конструкциям, и может быть использована для заместительной клеточной терапии широкого спектра острых и хронических паренхиматозных заболеваний печени и поджелудочной железы, в том числе для лечения циррозов, острой и хронической печеночной недостаточности, возникающей вследствие вирусных, химических, медикаментозных и иных повреждений печени, для коррекции уровня инсулина в организме, а также для восстановления генетических дефектов тканей и органов энтодермального происхождения.The utility model relates to the field of regenerative medicine and cellular technologies, in particular, to bioengineered constructs, and can be used for cell replacement therapy for a wide range of acute and chronic parenchymal diseases of the liver and pancreas, including for the treatment of cirrhosis, acute and chronic liver failure arising from viral, chemical, drug and other liver damage, to correct the level of insulin in the body, as well as to restore genetic defects of tissues and organs of endodermal origin.

Создание клеточных имплантатов в виде биоинженерных конструкций для возмещения дисфункции и восстановления дефектов поврежденных тканей печени и поджелудочной железы является одним из самых сложных направлений тканевой инженерии. Известные на сегодняшний день конструкции способны лишь временно улучшать функции паренхимных органов и не позволяют существенным образом влиять на процессы репарации поврежденных тканей. Большую проблему представляет поддержание жизнеспособности и функциональной активности клеточных элементов биоинженерных конструкций в течение длительного времени при хранении и после трансплантации на весь период восстановления дефектной паренхимной ткани собственными клетками пациента. Еще одной проблемой является сложность получения донорского клеточного материала в количестве, достаточном для успешной репарации дефектов после трансплантации.The creation of cell implants in the form of bioengineered structures to compensate for dysfunction and repair defects in damaged tissues of the liver and pancreas is one of the most difficult areas of tissue engineering. Designs known to date can only temporarily improve the function of parenchymal organs and do not significantly affect the repair processes of damaged tissues. A major problem is maintaining the viability and functional activity of cellular elements of bioengineered structures for a long time during storage and after transplantation for the entire period of restoration of defective parenchymal tissue by the patient’s own cells. Another problem is the difficulty in obtaining the donor cell material in an amount sufficient for the successful repair of defects after transplantation.

Известен имплантат для хирургического лечения заболеваний внутренних органов, в частности, для лечения сахарного диабета, который содержит суспензию клеток поджелудочной железы, помещенную в иммуноизолированное вместилище, выполненное в виде сплошного объема сферической или уплощенной формы из пористого никелида титана с поперечным размером пор, не превышающим 0,5 мкм, через которые осуществляется обмен веществ клеточной суспензии, соответствующей заболевшему органу (RU 2143867, A61F 2/02, опубл. 10.01.2000).An implant is known for the surgical treatment of diseases of internal organs, in particular for the treatment of diabetes mellitus, which contains a suspension of pancreatic cells placed in an immuno-insulated container made in the form of a continuous volume of a spherical or flattened form of porous titanium nickelide with a transverse pore size not exceeding 0 , 5 μm, through which the metabolism of the cell suspension corresponding to the diseased organ is carried out (RU 2143867, A61F 2/02, publ. 10.01.2000).

Недостатком известного устройства является слабая фиксация клеточной культуры на поверхности никелида титана, что может привести к постепенной обратной диффузии культуры по сквозным каналам ячеек за пределы пористого каркаса и обрастанию каркаса фиброзной тканью, и тем самым к снижению эффективности лечения. Кроме того, имплантат изготавливается из никелида титана, что может привести к развитию онкологических заболеваний.A disadvantage of the known device is the weak fixation of the cell culture on the surface of titanium nickelide, which can lead to a gradual reverse diffusion of the culture through the cell channels outside the porous skeleton and fouling of the skeleton with fibrous tissue, and thereby reduce the effectiveness of treatment. In addition, the implant is made of titanium nickelide, which can lead to the development of cancer.

Известно имплантируемое устройство, которое имеет корпус из матричного материала, образованный фибриллами нерастворимого коллагена и расположенными в нем: (а) множеством клеток млекопитающих и (б) множеством микросфер, каждая из которых состоит в основном из одного или более следующих веществ: коллагена, полистирола, декстрана, полиакриламида, целлюлозы, альгината кальция, латекса, полисульфона или стекла (RU 2201765, А61К 39/00, опубл. 10.04.2003).An implantable device is known that has a body of matrix material formed by fibrils of insoluble collagen and located in it: (a) many mammalian cells and (b) many microspheres, each of which consists mainly of one or more of the following substances: collagen, polystyrene, dextran, polyacrylamide, cellulose, calcium alginate, latex, polysulfone or glass (RU 2201765, A61K 39/00, publ. 10.04.2003).

Недостатком указанного устройства является трудоемкость в исполнении и низкая биосовместимостъ, что со временем приводит к отторжению имплантата. Кроме того, такая конструкция имплантата не создает условий для прочного прикрепления клеток и сопровождается их потерей при культивировании.The disadvantage of this device is the complexity in execution and low biocompatibility, which over time leads to rejection of the implant. In addition, such an implant design does not create conditions for strong attachment of cells and is accompanied by their loss during cultivation.

Известен имплантат для лечения инсулинзависимого диабета в виде макрогранулы, сформированной гидрофильным гелем (из агарозы, смеси агарозы и коллагена или агарозы и желатина), внутри которой расположены секреторные клетки, в частности панкреатические островки, и сверху покрытой агарозой (RU 2208636, C12N 11/04, опубл. 20.07.2003).A known implant for the treatment of insulin-dependent diabetes in the form of a macrobead formed by a hydrophilic gel (from agarose, a mixture of agarose and collagen or agarose and gelatin), inside which are located secretory cells, in particular pancreatic islets, and coated with agarose on top (RU 2208636, C12N 11/04 , published on July 20, 2003).

Однако данная конструкция имплантата не обеспечивает оптимального микроокружения для клеток и не создает условий для клеточного метаболизма и секреции веществ, в следствие чего клетки гибнут от недостатка питательных веществ и кислорода внутри макрогранул. Кроме того, с течением времени макрогранула будет покрываться фиброзной капсулой внутри организма, что повлечет необходимость ее изъятия. Помимо этого существует проблема недостатка донорского материала из панкреатических островков поджелудочной железы.However, this implant design does not provide optimal microenvironment for cells and does not create conditions for cellular metabolism and secretion of substances, as a result of which cells die from a lack of nutrients and oxygen inside the macrobeads. In addition, over time, the macrobead will be covered with a fibrous capsule inside the body, which will entail the need for its removal. In addition, there is a problem of a lack of donor material from pancreatic pancreatic islets.

В патенте RU №2417090 описан имплантат для заместительной терапии диабета в виде макрогранул из агарозы Seakem Gold с диаметром 4-12 мм, содержащий инкапсулированные секреторные клетки, представляющие собой островки поджелудочной железы, и сверху покрытый вторым слоем агарозы толщиной 0.05-5 мм (RU 2417090, A61K 35/39, опубл. 24.04.2011).RU patent No. 2417090 describes an implant for diabetes replacement therapy in the form of macrogranules from Seakem Gold agarose with a diameter of 4-12 mm, containing encapsulated secretory cells representing pancreatic islets, and on top coated with a second layer of agarose 0.05-5 mm thick (RU 2417090 , A61K 35/39, publ. 04.24.2011).

Однако конструкция имплантата в виде крупных макрогранул имеет указанные выше недостатки, и кроме того такой имплантат способен лишь частично и временно компенсировать недостаточную функциональность органа и не стимулирует регенерацию собственных тканей пациента.However, the design of the implant in the form of large macrobeads has the above disadvantages, and in addition, such an implant can only partially and temporarily compensate for the insufficient functionality of the organ and does not stimulate the regeneration of the patient’s own tissues.

Известен трансплантат для лечения печеночной недостаточности, включающий трехмерный биосовместимый биодеградируемый пористый матрикс, имеющий общий объем не менее 0,05 см³ и наименьший линейный размер не менее 0,2 мм, размеры пор 2-500 мкм, суммарную пористость 50-97%, и посаженные на него аллогенные прогениторные клетки костного мозга и аллогенные клетки печени, причем концентрация клеток печени и костного мозга 2·10⁶-15·10⁶ клеток на 1 см³ матрикса и соотношение клеток костного мозга к клеткам печени от 1:1 до 1:4. В качестве матрикса может быть использован биоматериал, созданный, например, на основе полиоксибутирата (3-оксибутирата) - ЭластоПОБ. Полиоксибутират - гомополимер, синтезируемый различными видами прокариотических клеток. (RU 2425647, А61В 17/00, опубл. 10.08.2011)A transplant for treating liver failure is known, including a three-dimensional biocompatible biodegradable porous matrix having a total volume of at least 0.05 cm ³ and a smallest linear size of at least 0.2 mm, pore sizes of 2-500 μm, total porosity of 50-97%, and allogeneic bone marrow progenitor cells and allogeneic liver cells planted on it, and the concentration of liver and bone marrow cells 2 · 10 ⁶ -15 · 10 ⁶ cells per 1 cm ³ matrix and the ratio of bone marrow cells to liver cells from 1: 1 to 1: four. As a matrix, biomaterial can be used, created, for example, on the basis of polyoxybutyrate (3-hydroxybutyrate) - ElastoPOB. Polyoxybutyrate is a homopolymer synthesized by various types of prokaryotic cells. (RU 2425647, А61В 17/00, published on 08/10/2011)

Недостатком данного трансплантата является использование аллогенного материала, который со временем элиминируется из организма иммуннойсистемой. Помимо этого, использование донорских прогениторных клеток печени является не оптимальным, так как данные клетки являются мало доступными.The disadvantage of this transplant is the use of allogeneic material, which over time is eliminated from the body by the immune system. In addition, the use of donor progenitor cells of the liver is not optimal, since these cells are not readily available.

Наиболее близким аналогом (прототипом) предлагаемой полезной модели является клеточный имплантат для замещения дефектов печени и поджелудочной железы, выполненный в виде объемной трехмерной биоинженерной конструкции, включающей гепатоциты, клетки островков Лангерганса и пористую матрицу - носитель со степенью пористости в диапазоне от 93 до 98%, выполненную из биологически совместимого полимера либо полимерной смеси, выбранных из природных полимеров, таких как альбумин, фибриноген, коллаген, желатин, хитин, хитозан, агароза, альгинат, и синтетических полимеров, таких как полиангидриды, поли(^∈-капролактон) и сложные поли(^α-гидроксиэфиры). Указанную матрицу получают за счет уплотнения смеси частиц полимера и частиц хлорида натрия и затем удаления хлорида натрия в результате растворения, при этом от 2 до 4% пор матрицы характеризуются средним диаметром в диапазоне от 70 до 100 мкм; от 4 до 6% пор характеризуются средним диаметром в диапазоне от 101 до 115 мкм; от 4 до 6% пор характеризуются средним диаметром в диапазоне от 116 до 130 мкм; от 3 до 5% пор характеризуются средним диаметром в диапазоне от 131 до 300 мкм; от 15 до 19% пор характеризуются средним диаметром в диапазоне от 301 до 330 мкм; от 6 до 8% пор характеризуются средним диаметром в диапазоне от 331 до 360 мкм; от 9 до 13% пор характеризуются средним диаметром в диапазоне от 361 до 390 мкм; от 11 до 15% пор характеризуются средним диаметром в диапазоне от 391 до 420 мкм; от 5 до 7% пор характеризуются средним диаметром в диапазоне от 421 до 450 мкм; от 16 до 20% пор характеризуются средним диаметром в диапазоне от 451 до 480 мкм; и от 9 до 13% пор характеризуются средним диаметром в диапазоне от 481 до 510 мкм. На поверхность матрицы наносят покрытие в виде, по меньшей мере, одного белка внеклеточного матрикса, выбранного из коллагенов, ламинина и фибронектина (RU 2392287, C08J 9/26, A61L 27/56, опубл. 20.06.2010).The closest analogue (prototype) of the proposed utility model is a cell implant to replace defects in the liver and pancreas, made in the form of a three-dimensional three-dimensional bioengineered design, including hepatocytes, cells of islets of Langerhans and a porous matrix - carrier with a degree of porosity in the range from 93 to 98%, made from a biocompatible polymer or a polymer mixture selected from natural polymers such as albumin, fibrinogen, collagen, gelatin, chitin, chitosan, agarose, alginate, and synthetic polymers such as polyanhydrides, poly ( ^∈- caprolactone) and poly ( ^α- hydroxy esters). The specified matrix is obtained by compacting a mixture of polymer particles and particles of sodium chloride and then removing sodium chloride as a result of dissolution, while from 2 to 4% of the pores of the matrix are characterized by an average diameter in the range from 70 to 100 microns; from 4 to 6% of the pores are characterized by an average diameter in the range from 101 to 115 microns; from 4 to 6% of the pores are characterized by an average diameter in the range from 116 to 130 microns; from 3 to 5% of the pores are characterized by an average diameter in the range from 131 to 300 microns; from 15 to 19% of the pores are characterized by an average diameter in the range from 301 to 330 microns; from 6 to 8% of the pores are characterized by an average diameter in the range from 331 to 360 microns; from 9 to 13% of the pores are characterized by an average diameter in the range from 361 to 390 microns; from 11 to 15% of the pores are characterized by an average diameter in the range from 391 to 420 microns; from 5 to 7% of the pores are characterized by an average diameter in the range from 421 to 450 microns; from 16 to 20% of the pores are characterized by an average diameter in the range from 451 to 480 microns; and from 9 to 13% of the pores are characterized by an average diameter in the range from 481 to 510 microns. The matrix surface is coated with at least one extracellular matrix protein selected from collagen, laminin and fibronectin (RU 2392287, C08J 9/26, A61L 27/56, publ. 06/20/2010).

Недостатком ближайшего аналога является сложность изготовления матрицы-носителя. Использование в качестве клеточного компонента гепатоцитов и островков Лангерганса является не оптимальным, так как существует значительный дефицит донорских клеток этого типа.The disadvantage of the closest analogue is the complexity of manufacturing a matrix carrier. The use of hepatocytes and islets of Langerhans as a cellular component is not optimal, since there is a significant deficit of donor cells of this type.

Задачей при создании полезной модели являлось получение клеточного имплантата для возмещения дисфункции и восстановления дефектов поврежденных тканей печени и поджелудочной железы в виде биоинженерной конструкции с устойчивой пространственной организацией и поверхностной адгезией клеточных элементов, позволяющей поддерживать рост клеток и их функциональную активность в течение длительного времени с использованием легкодоступных клеток, применяемых как в аутологичном, так и аллогенном варианте.The objective in creating the utility model was to obtain a cell implant to compensate for dysfunction and repair defects in damaged tissues of the liver and pancreas in the form of a bioengineered design with stable spatial organization and surface adhesion of cellular elements, allowing cell growth and functional activity to be maintained for a long time using readily available cells used in both autologous and allogeneic form.

Технический результат полезной модели заключается в упрощении ее изготовления, повышении эффективности лечения путем ускорения заживления дефектов паренхимных органов различной этиологии и тяжести, устранения фиброзных осложнений за счет конструктивных особенностей имплантата, позволяющих сохранить в течение длительного времени жизнеспособность, пролиферативную и функциональную активность клеточного компонента имплантата после трансплантации на весь период восстановления дефектной паренхимной ткани собственными клетками пациента.The technical result of the utility model is to simplify its manufacture, increase the effectiveness of treatment by accelerating the healing of defects of parenchymal organs of various etiologies and severity, eliminating fibrotic complications due to the structural features of the implant, which allows preserving for a long time the viability, proliferative and functional activity of the cellular component of the implant after transplantation for the entire period of restoration of defective parenchymal tissue by the patient’s own cells cient.

Достижение технического результата обеспечивается тем, что клеточный имплантат для лечения заболеваний печени и поджелудочной железы, в отличие от всех известных аналогов и ближайшего прототипа, конструктивно выполнен в виде микрочастиц сферической формы размером 130-380 мкм из сшитого желатина с размерами пор 6-22 мкм, включающих легкодоступные клетки: печеночные клетки - предшественники или протоковые стволовые клетки подчелюстной слюнной железы человека.The achievement of the technical result is ensured by the fact that the cell implant for the treatment of diseases of the liver and pancreas, unlike all known analogues and the closest prototype, is structurally made in the form of spherical microparticles with a size of 130-380 microns from cross-linked gelatin with pore sizes of 6-22 microns, including easily accessible cells: hepatic cells - precursors or ductal stem cells of the human submandibular salivary gland.

Сущность полезной модели заключается в следующем:The essence of the utility model is as follows:

Клеточный имплантат для лечения заболеваний печени и поджелудочной железы представляет собой объемную трехмерную биоинженерную конструкцию, образованную пористой матрицей - носителем и клеточным компонентом. Конструктивно он выполнен в виде микрочастиц сферической формы размером 130-380 мкм из пористого биодеградируемого материала, в частности, пористого сшитого желатина с размерами пор 6-22 мкм, и посаженных на них печеночных клеток - предшественников или протоковых стволовых клеток подчелюстной слюнной железы человека.A cell implant for the treatment of diseases of the liver and pancreas is a three-dimensional three-dimensional bioengineered structure formed by a porous matrix - a carrier and a cellular component. Structurally, it is made in the form of spherical microparticles with a size of 130-380 μm from porous biodegradable material, in particular, porous cross-linked gelatin with pore sizes of 6-22 μm, and hepatic cells, the precursors or ductal stem cells of the submandibular salivary gland, deposited on them.

Матрица - носитель, которую также называют подложкой клеток или биоматриксом, выполняет роль трехмерного каркаса и имеет трехмерную проницаемую пористую структуру с порами большого размера (6-22 мкм).The carrier matrix, which is also called the cell substrate or biomatrix, plays the role of a three-dimensional skeleton and has a three-dimensional permeable porous structure with large pores (6-22 μm).

Такая структура носителя повышает прикрепление клеток к поверхности биоматрикса (100% клеток прикрепляются к микрочастицам в течение 24 часов), исключает потерю клеток при культивировании и препятствует вымыванию клеток после трансплантации, что обеспечивает устойчивую пространственную организацию клеточного компонента имплантата с пролонгированием пролиферативной и функциональной активности. Благодаря оптимальным параметрам размеров микрочастиц и пор матрицы - носителя клетки способны проникать внутрь частицы и формировать трехмерные структуры и, кроме того, обеспечивается обмен продуктами клеточного синтеза с микроокружением, а также миграция клеток в окружающие ткани. В результате улучшается функциональное состояние клеток, увеличивается их выживаемость и обеспечиваются оптимальные условия для направленной дифференцировки и стимуляции функциональной активности клеток в течение долгого периода времени без опасности возникновения фиброзов вокруг биоматрикса конструкции.Such a carrier structure increases the attachment of cells to the biomatrix surface (100% of the cells attach to microparticles within 24 hours), eliminates cell loss during cultivation and prevents the leaching of cells after transplantation, which ensures stable spatial organization of the cellular component of the implant with prolongation of proliferative and functional activity. Due to the optimal size parameters of the microparticles and pores of the matrix, the cells can penetrate into the particles and form three-dimensional structures and, in addition, the exchange of cell synthesis products with the microenvironment is ensured, as well as the migration of cells into the surrounding tissue. As a result, the functional state of the cells improves, their survival increases, and optimal conditions are provided for the directed differentiation and stimulation of the functional activity of cells over a long period of time without the risk of fibrosis around the biomatrix of the construct.

Выполнение матрицы - носителя в виде микрочастиц округлой или овальной формы также препятствует слипанию при культивировании и уменьшает микротравмирование тканей при введении имплантата в организм пациента.The implementation of the matrix of the carrier in the form of round or oval microparticles also prevents adhesion during cultivation and reduces microtrauma of the tissues when the implant is introduced into the patient.

Кроме того, матрица - носитель из сшитого желатина не цитотоксична, стабильна в растворе в условиях культивирования, по крайней мере, несколько месяцев, сохраняет свою структуру и целостность в условиях культивирования, имеет подходящие размеры для инъекции в паренхимные органы, является биодеградируемой в организме (в течение 1-4 месяцев), а продукты биодеградации также не обладают токсичностью, что особенно важно для активно обновляющихся тканей энтодермы и паренхимных органов.In addition, the carrier matrix of cross-linked gelatin is not cytotoxic, stable in solution under cultivation conditions for at least several months, retains its structure and integrity under cultivation conditions, has suitable sizes for injection into parenchymal organs, and is biodegradable in the body (in 1-4 months), and biodegradation products also do not have toxicity, which is especially important for actively renewed tissues of the endoderm and parenchymal organs.

Клеточный компонент заявленного имплантата может быть аутологичного и/или аллогенного происхождения и представляет собой печеночные клетки-предшественники или протоковые стволовые клетки подчелюстной слюнной железы человека, распределенные на матрице-носителе в количестве не менее чем 5×10⁶ на 1 мл суспензии (или 10-50 клеток на частицу).The cellular component of the claimed implant may be autologous and / or allogeneic in origin and represents hepatic progenitor cells or ductal stem cells of the human submandibular salivary gland, distributed on a carrier matrix in an amount of not less than 5 × 10 ⁶ per 1 ml of suspension (or 10- 50 cells per particle).

Указанные популяции клеток относятся к эпителиальным клеткам энтодермального происхождения, активно пролиферирующим in vitro, что позволяет получить данные клетки в большом количестве. Время удвоения клеточной популяции для клеток слюнной железы составляет 40 часов, для печеночных клеток-предшественников - 60 часов. Клетки могут быть выделены в количестве от 5×10⁵ до 10⁷ с 1 см³ ткани и за 14-30 дней возможно получить достаточное для трансплантации количество клеток (10⁸-10⁹). Данные клетки обладают бипотентным потенциалом дифференцировки и могут быть дифференцированы как в гепатоциты, так и в клетки желчных протоков. Клетки слюнной железы, кроме того, активно синтезируют инсулин и могут быть направлены в бета - клетки поджелудочной железы. Клетки экспрессируют гепатоцитарные маркеры: альбумин, альфа-фетопротеин, цитокератин 19, цитохромы Р450 1А1,2А6 и др. При попадании в 3D условия, клетки начинают синтезировать мочевину, что характерно для зрелых гепатоцитов. Клетки также активно синтезируют широкий спектр биологически активных веществ, в том числе фактор роста нервов, эпидермальный фактор роста, фактор роста эндотелия и др., что может оказывать стимулирующее действие на собственные клетки реципиента. Таким образом, клеточный компонент заявленного имплантата может замещать дефекты тканей и восполнять недостаточность функций гепатоцитов, бета - клеток и других тканей энтодермы. Общими признаками с прототипом являются:These cell populations belong to epithelial cells of endodermal origin, actively proliferating in vitro, which allows to obtain these cells in large numbers. The doubling time of the cell population for salivary gland cells is 40 hours, for hepatic progenitor cells - 60 hours. Cells can be isolated in an amount of 5 × 10 ⁵ to 10 ⁷ with 1 cm ³ tissue and in 14-30 days it is possible to obtain a sufficient number of cells for transplantation (10 ⁸ -10 ⁹ ). These cells have a bipotent potential for differentiation and can be differentiated both into hepatocytes and into bile duct cells. The salivary gland cells, in addition, actively synthesize insulin and can be sent to the beta cells of the pancreas. Cells express hepatocyte markers: albumin, alpha-fetoprotein, cytokeratin 19, cytochrome P450 1A1,2A6, etc. When exposed to 3D conditions, cells begin to synthesize urea, which is typical for mature hepatocytes. Cells also actively synthesize a wide range of biologically active substances, including nerve growth factor, epidermal growth factor, endothelial growth factor, etc., which can have a stimulating effect on the recipient's own cells. Thus, the cellular component of the claimed implant can replace tissue defects and make up for the insufficiency of the functions of hepatocytes, beta cells and other endoderm tissues. Common features with the prototype are:

- имплантат включает матрицу - носитель (биоматрикс) и клеточный компонент;- the implant includes a carrier matrix (biomatrix) and a cellular component;

- матрица - носитель выполнена в виде микрочастиц сферической формы из пористого биодеградируемого материала;- matrix - the carrier is made in the form of spherical microparticles of a porous biodegradable material;

- трехмерная пространственная организация клеточного компонента на пористой матрице - носителе.- three-dimensional spatial organization of the cellular component on a porous carrier matrix.

Полезная модель имеет следующие отличия от прототипа:The utility model has the following differences from the prototype:

- матрица - носитель выполнена из пористого сшитого желатина и имеет размер микрочастиц 130-380 мкм с размером пор 6-22 мкм;- matrix - the carrier is made of porous cross-linked gelatin and has a microparticle size of 130-380 microns with a pore size of 6-22 microns;

- в качестве клеточного компонента используют печеночные клетки - предшественники или протоковые стволовые клетки подчелюстной слюнной железы человека.- liver cells are used as a cellular component - precursors or ductal stem cells of the human submandibular salivary gland.

Указанные отличительные признаки являются существенными и взаимосвязаны с образованием устойчивой совокупности существенных признаков, достаточной для получения требуемого технического результата.These distinctive features are significant and interconnected with the formation of a stable set of essential features sufficient to obtain the desired technical result.

Сравнение предлагаемого клеточного имплантата для лечения заболеваний печени и поджелудочной железы с другими конструкциями имплантатов, известными в области медицины, показало его соответствие критериям полезной модели. Все элементы заявляемого клеточного имплантата являются однозначно идентифицируемыми, что позволяет сделать вывод о соответствии критерию «промышленная применимость». При анализе уровня техники заявителем не выявлены технические решения, относящиеся к клеточному имплантату для лечения заболеваний печени и поджелудочной железы, которым присущи все существенные признаки заявленной полезной модели, что свидетельствует о соответствии критерию «новизна».Comparison of the proposed cell implant for the treatment of diseases of the liver and pancreas with other implant designs known in the field of medicine showed its compliance with the criteria of a utility model. All elements of the claimed cell implant are uniquely identifiable, which allows us to conclude that the criterion of "industrial applicability". When analyzing the prior art, the applicant did not identify technical solutions related to the cell implant for the treatment of diseases of the liver and pancreas, which are inherent in all the essential features of the claimed utility model, which indicates compliance with the criterion of "novelty."

Клеточный имплантат для лечения заболеваний печени и поджелудочной железы получают следующим образом:A cell implant for the treatment of diseases of the liver and pancreas is obtained as follows:

1. Выделение и культивирование клеток энтодермы.1. Isolation and cultivation of endoderm cells.

Донорскую ткань (часть подчелюстной слюнной железы размером 0,5-2 см³ либо кусочек печени размером 0,5-2 см³) переносят в стерильную пробирку со средой DMEM/F12 и гентамицином (40 мкг/мл). Начиная с этого момента работают в стерильных условиях, отвечающих требованиям GMP (Good Manufacturing Practice). После удаления фиброзной капсулы и кровеносных сосудов, ткань измельчают, дважды промывают фосфатно-солевым буфером (DPBS), осаждают центрифугированием в течение 5 минут при 0,8 тыс.об/мин, инкубируют ткань с 4 мг/мл коллагеназы IV типа (всего - 1 мл на 0,5 см³ ткани) в среде DMEM/F12 60 минут при 37 С.Donor tissue (part of the submandibular salivary gland of 0.5-2 cm ³ in size or a piece of liver of 0.5-2 cm ³ in size) is transferred into a sterile tube with DMEM / F12 medium and gentamicin (40 μg / ml). From this moment, they work under sterile conditions that meet the requirements of GMP (Good Manufacturing Practice). After removing the fibrous capsule and blood vessels, the tissue is crushed, washed twice with phosphate-buffered saline (DPBS), precipitated by centrifugation for 5 minutes at 0.8 thousand rpm, incubated with 4 mg / ml type IV collagenase (total - 1 ml per 0.5 cm ³ tissue) in DMEM / F12 medium for 60 minutes at 37 C.

Затем к клеткам добавляют 10 мл полной ростовой среды, содержащей DMEM/F12 1:1, эмбриональную телячью сыворотку (7-20%, оптимально 10%); + глутамин (2 мМ); + 1х инсулин-трансферрин-селенит (ITS) и эпидермальный фактор роста (EGF) (5-80 нг/мл, оптимально 10-20 нг/мл). Взвесь клеток активно пипетируют в течение 5 минут, затем пропускают через нейлоновый фильтр с диаметром пор 40-100 мкм и осаждают клетки центрифугированием в течение 2 мин. при 0,8 тыс. об/мин.Then, 10 ml of a complete growth medium containing DMEM / F12 1: 1, fetal calf serum (7-20%, optimally 10%) was added to the cells; + glutamine (2 mM); + 1x insulin-transferrin-selenite (ITS) and epidermal growth factor (EGF) (5-80 ng / ml, optimally 10-20 ng / ml). A suspension of cells is actively pipetted for 5 minutes, then passed through a nylon filter with a pore diameter of 40-100 μm and the cells are pelleted by centrifugation for 2 minutes. at 0.8 thousand rpm

Далее проводят магнитную сепарацию по маркерам CD49f EpCAM, для чего полученную суспензию клеток ресуспендируют в 0,5 мл фосфатно-солевого буфера, инкубируют с первыми антителами (anti-human CD49f и anti-human EpCAM) в течение 30 минут при 4С, концентрация антител - 1 мкг/10⁶ клеток. Промывают 5 мл фосфатно-солевого буфера и инкубируют с вторыми антителами, (конъюгированными с магнитными частицами) в течение 20 минут, далее проводит магнитную сепарацию на колонках по инструкциям производителя. Отсортированные клетки осаждают центрифугированием (5 минут при 300g), ресуспендируют в полной ростовой среде, подсчитывают. Рассаживают на покрытые коллагеном I типа культуральные чашки из расчета 5×10³ клеток на см². Клетки культивируют при температуре 37°С в атмосфере 5% CO₂. После достижения клетками необходимого количества их переносят на матрицу - носитель.Next, magnetic separation is carried out by CD49f EpCAM markers, for which the resulting cell suspension is resuspended in 0.5 ml of phosphate-buffered saline, incubated with the first antibodies (anti-human CD49f and anti-human EpCAM) for 30 minutes at 4C, the concentration of antibodies is 1 mcg / 10 ⁶ cells. Wash with 5 ml of phosphate-buffered saline and incubate with second antibodies (conjugated with magnetic particles) for 20 minutes, then conduct magnetic separation on columns according to the manufacturer's instructions. Sorted cells are precipitated by centrifugation (5 minutes at 300g), resuspended in complete growth medium, counted. Plated on collagen type I coated culture dishes at the rate of 5 × 10 ³ cells per cm ² . Cells are cultured at a temperature of 37 ° C in an atmosphere of 5% CO ₂ . After the cells reach the required amount, they are transferred to the carrier matrix.

2. Культивирование клеток на матрице - носителе.2. Cultivation of cells on a matrix - carrier.

Матрицу - носитель из пористого сшитого желатина, имеющую размер микрочастиц 130-380 мкм и размер пор около 20 мкм, например, коммерческий микроноситель CultiSpher-S (HyClone Laboratories, Logan, UT) суспендируют в DPBS без кальция и магния (50 мл на 1 г сухого микроносителя), оставляют при комнатной температуре на 30 минут, затем автоклавируют 15 минут при 121°С для дегазации и стерилизации. Осаждают центрифугированием, удаляют супернатант. Промывают стерильным DPBS 2 раза. Приготовленный таким образом микроноситель может храниться при +4°С 1 месяц. Перед употреблением микроноситель осаждают, удаляют супернатант и добавляют среду культивирования, инкубируют 30 минут при 37°С.The matrix is a carrier of porous cross-linked gelatin having a microparticle size of 130-380 μm and a pore size of about 20 μm, for example, the commercial microcarrier CultiSpher-S (HyClone Laboratories, Logan, UT) is suspended in DPBS without calcium and magnesium (50 ml per 1 g dry microcarrier), left at room temperature for 30 minutes, then autoclaved for 15 minutes at 121 ° C for degassing and sterilization. Precipitated by centrifugation, remove the supernatant. Wash with sterile DPBS 2 times. The microcarrier prepared in this way can be stored at + 4 ° C for 1 month. Before use, the microcarrier is precipitated, the supernatant is removed and the culture medium is added, incubated for 30 minutes at 37 ° C.

Клетки с пластика снимают трипсином стандартным способом: дважды промывают DPBS, добавляют 0,25% трипсин. Инкубируют при 37°С 5 минут, смывают клетки с культурального пластика средой культивирования в центрифужную пробирку, подсчитывают в камере Горяева, затем осаждают центрифугированием в течение 5 минут при 300g. Удаляют супернатант и разводят в среде культивирования из расчета 5×10⁵ клеток на 1 мл среды.Cells are removed from the plastic with trypsin in the standard way: washed twice with DPBS, 0.25% trypsin is added. Incubated at 37 ° C for 5 minutes, wash the cells from the culture plastic with the culture medium in a centrifuge tube, count in a Goryaev chamber, then precipitate by centrifugation for 5 minutes at 300g. The supernatant is removed and diluted in culture medium at the rate of 5 × 10 ⁵ cells per 1 ml of medium.

Подготовленную суспензию микроносителя осаждают центрифугированием в течение 10 минут при 5000g, затем удаляют супернатант и добавляют к суспензии клеток в соотношении 10-50 клеток на 1 частицу носителя. Культивируют клетки на микроносителях в роллерной установке при постоянном перемешивании 15-50 RPM.The prepared suspension of microcarrier is precipitated by centrifugation for 10 minutes at 5000 g, then the supernatant is removed and added to the cell suspension in the ratio of 10-50 cells per 1 particle of the carrier. Cells on microcarriers are cultured in a roller unit with constant stirring of 15-50 RPM.

Продолжительность всего технологического процесса изготовления имплантата составляет 14-30 дней.The duration of the entire technological process of manufacturing the implant is 14-30 days.

Клеточный имплантат для лечения заболеваний печени и поджелудочной железы может быть использован при хронических гепатитах и циррозах печени, развившихся вследствие гепатотропных вирусов (вирусы гепатита В, С, D, G, F, TTV, CMV, EBV), токсического фактора (алкоголь, лекарства, промышленные вещества и др.), метаболических нарушений (гемохроматоз, болезнь Вильсона-Коновалова, недостаточность α1-антитрипсина, гликогеноз IV типа, галактоземия, наследственный тирозиноз, наследственные гипербилирубинемии), аутоиммунных заболеваний (первичный билиарный цирроз, первичный склерозирующий холангит, аутоиммунный гепатит) и многих других факторов. Инъекции производят по 100 мкл в паренхиму органа (печень или поджелудочная железа) из расчета 10⁶-10⁹ клеток на пациента в зависимости от характера дефекта; либо вводят в селезенку или интраперитонеально, пункционно в большой сальник.A cell implant for the treatment of diseases of the liver and pancreas can be used for chronic hepatitis and cirrhosis of the liver, developed as a result of hepatotropic viruses (hepatitis B, C, D, G, F, TTV, CMV, EBV viruses), toxic factor (alcohol, drugs, industrial substances, etc.), metabolic disorders (hemochromatosis, Wilson-Konovalov’s disease, α1-antitrypsin deficiency, type IV glycogenosis, galactosemia, hereditary tyrosinosis, hereditary hyperbilirubinemia), autoimmune diseases (primary biliary cirrhosis, primary sclerosing cholangitis, autoimmune hepatitis) and many other factors. Injections produce 100 μl into the organ parenchyma (liver or pancreas) at a rate of 10 ⁶ -10 ⁹ cells per patient, depending on the nature of the defect; either injected into the spleen or intraperitoneally, puncture in a large omentum.

Claims

A cell implant for the treatment of diseases of the liver and pancreas, which is a three-dimensional three-dimensional bioengineered structure formed by a spherical porous carrier matrix and a cellular component, characterized in that the carrier matrix is made of crosslinked gelatin in the form of spherical microparticles with a size of 130-380 microns and pore sizes of 6-22 microns, and hepatic progenitor cells or ductal stem cells of the human submandibular salivary gland are used as a cellular component.