RU2335538C2

RU2335538C2 - Organization of cells similar to tissue and macroscopical designs similar to tissue obtained by means of culture of macromass of cells and method of macromass culture

Info

Publication number: RU2335538C2
Application number: RU2006134630/13A
Authority: RU
Inventors: Маниша Шарадчандра ДЕШПАНДЕ (IN); Маниша Шарадчандра ДЕШПАНДЕ; Манодж Виной МОДЖАМДАР (IN); Манодж Виной МОДЖАМДАР
Original assignee: Релайанс Лайф Сайенсиз Пвт Лтд
Priority date: 2004-03-31
Filing date: 2004-03-31
Publication date: 2008-10-10
Also published as: RU2006134630A

Abstract

FIELD: medicine.

SUBSTANCE: method of obtaining the live organization of cells of a similar tissue is revealed, that is the macromass culture including three-dimensional designs similar to tissue, without the aid of a skeleton or a foreign matrix. The cells are plated in a vessel for cell culture with high density per unit area in a range from 3.33×10⁵ to 3×10⁶ cells per cm². The three-dimensional organization of the cells received in the specified way similar to a tissue is described. When cultivating cell macromasses it is possible to receive the cells, organized in forms similar tissues without the aid of a matrix, and three-dimensional macroscopical structures similar to tissue. In the given work the organization similar to a tissue and macroscopical structures similar to tissue are obtained from fibroblasts of a skin, the osteogene cells received from fat stromal cells, chondrocytes and from osteoblasts. Thus any skeleton or a foreign matrix for obtaining of a tissue or any other agents is not used (except high density of cell plating) which promote formation of a tissue, tissues have completely cellular parentage.

EFFECT: present invention allows simplifying the method of obtaining of substitutes of a human body tissue.

13 cl, 24 dwg, 1 tbl

Description

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕFIELD OF THE INVENTION

Настоящее изобретение относится к инженерии ткани. Более точно, настоящее изобретение относится к созданию трехмерной подобной ткани организации клеток. Еще более точно, настоящее изобретение относится к получению трехмерных макроскопических подобных ткани конструкций для возможной имплантации в организм человека в качестве терапии болезненных состояний или состояний при повреждении тканей.The present invention relates to tissue engineering. More specifically, the present invention relates to the creation of a three-dimensional cell-like tissue organization. Even more precisely, the present invention relates to the production of three-dimensional macroscopic tissue-like structures for possible implantation in the human body as a therapy for disease states or conditions for tissue damage.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ ИЗОБРЕТЕНИЯBACKGROUND OF THE INVENTION

Организм человека может быть поражен несколькими болезненными состояниями или состояниями при повреждении тканей различных органов, для которых терапевтический подход заключается в замене поврежденных органов полученными извне или созданными эквивалентами ткани. Например, ожоги или язвы кожи можно лечить с применением подходящих эквивалентов кожи, не соединяемые разрывы в сломанной кости можно было бы лечить имплантацией подходящих заменителей кости и повреждение суставного хряща можно было бы восстановить подходящими имитирующими хрящ имплантатами.The human body can be affected by several painful conditions or conditions with damage to tissues of various organs, for which the therapeutic approach is to replace damaged organs with external or created tissue equivalents. For example, burns or skin ulcers can be treated with suitable skin equivalents, non-connected breaks in broken bones could be treated by implantation of suitable bone substitutes, and damage to the articular cartilage could be repaired with suitable cartilage-mimicking implants.

Каждый год хирурги проводят хирургические операции для лечения пациентов, которые испытывают недостаточность органа или потерю ткани. Хирурги/терапевты могли бы лечить таких пациентов, пересаживая органы от одного человека к другому, осуществляя восстановительную хирургию или используя механические устройства, такие как искусственная почка, протез тазобедренного сустава или механических сердечных клапанов. Хотя такие подходы спасли множество жизней, они имеют ограничения. Ограничение при трансплантации таких органов, как сердце, печень и почки заключается не в хирургической технике, а в недостаточной доступности органов донора.Each year, surgeons perform surgeries to treat patients who experience organ failure or tissue loss. Surgeons / therapists could treat such patients by transplanting organs from one person to another, performing reconstructive surgery, or using mechanical devices such as an artificial kidney, hip prosthesis, or mechanical heart valves. Although such approaches have saved many lives, they have limitations. The limitation in transplantation of organs such as the heart, liver and kidneys lies not in the surgical technique, but in the lack of accessibility of the donor organs.

Возможные виды легко доступных имплантатов представляли собой ксенотрансплантаты, полученные из животных, аллотрансплантаты, полученные от человеческих доноров и аутотрансплантатов, полученных из здоровых органов самого пациента. Для ксенотрансплантатов существует проблема иммунологической несовместимости и передачи зоонозных болезнетворных микроорганизмов, включающих ретровирусы. Для аллотрансплантатов существует проблема иммунного отторжения и недостатка доноров. Для аутотрансплантатов существует проблема нехватки необходимого количества подходящей ткани и увеличения травмирования пациента.Possible types of easily accessible implants were xenografts obtained from animals, allografts obtained from human donors and autografts obtained from healthy organs of the patient himself. For xenografts, there is a problem of immunological incompatibility and transmission of zoonotic pathogens, including retroviruses. For allografts, there is the problem of immune rejection and lack of donors. For autografts, there is the problem of a lack of the required amount of suitable tissue and an increase in trauma to the patient.

Для хирургического восстановления, ткань можно перенести от одной части органа пациента к другой части органа. Такие аутотрансплантаты (тканевые лоскуты пациента) включают тканевые лоскуты кожи для ожогов, тканевые лоскуты кровеносных сосудов для хирургических операций сердечного шунтирования и тканевые лоскуты нервов для восстановления лица и рук. Недостатки использования аутотрансплантатов также включают потребность в многократных хирургических операциях и потере функции на донорном участке. В дополнение, хирургическое восстановление часто охватывает использование тканей тела в первоначально не предназначенных для этого целях и может привести к долговременным осложнениям.For surgical repair, tissue can be transferred from one part of the patient’s organ to another part of the organ. Such autografts (patient tissue grafts) include tissue skin grafts for burns, tissue blood vessel grafts for cardiac bypass surgery, and tissue nerve grafts for face and arm restoration. The disadvantages of using autografts also include the need for multiple surgeries and loss of function at the donor site. In addition, surgical repair often encompasses the use of body tissue for purposes not originally intended for this purpose and can lead to long-term complications.

Как результат таких недостатков существующих терапевтических приемов, существует необходимость в инженерии эквивалентов ткани и в том, чтобы появилась в качестве новой дисциплины наука инженерии ткани. Ее цели заключаются в том, чтобы создать ткани в культуре для использования не только в качестве модельных систем в фундаментальных исследованиях, но и, что еще важнее, для использования в качестве тканей для замены поврежденных или пораженных болезнью органов организма. Хотя, усилия по получению биоискусственных тканей и органов для лечения человека берут начало, по меньшей мере, тридцать лет назад, такие усилия приблизились к клиническому успеху только в последние десять лет. Это стало возможным благодаря значительному прогрессу в молекулярной и клеточной биологии, в технологиях культивирования клеток и в материаловедении.As a result of such shortcomings of existing therapeutic techniques, there is a need for the engineering of tissue equivalents and the emergence of tissue engineering as a new discipline. Its goals are to create tissues in culture for use not only as model systems in basic research, but, more importantly, for use as tissues to replace damaged or diseased organs of the body. Although efforts to obtain bio-artificial tissues and organs for treating humans originate at least thirty years ago, such efforts have come close to clinical success only in the last ten years. This was made possible thanks to significant progress in molecular and cellular biology, in cell culture technologies and in material science.

Термин «инженерия ткани» появился относительно недавно и более широко используется в последние пять лет, чтобы описать междисциплинарную область, которая применяет принципы инженерии и медико-биологических наук для создания биоискусственных тканей и органов.The term “tissue engineering” has appeared relatively recently and has been used more widely in the last five years to describe an interdisciplinary field that applies the principles of engineering and life sciences to create bio-artificial tissues and organs.

Одной из основных стратегий принятых для создания выращенных в лабораторных условиях тканей является выращивание изолированных клеток на трехмерных матрицах или каркасах (матриксах) в условиях, которые заставят клетки разрастаться в функциональную ткань. При имплантации такая биоискусственная ткань должна стать структурно и функционально интегрированной в организме. Матриксы можно изготовить из природных материалов, таких как коллаген, или из синтетических полимеров, таких как пластики. В конечном счете, материал каркаса должен биодеградировать в течение времени и должен служить в качестве первоначальной трехмерной матрицы для роста ткани.One of the main strategies adopted to create laboratory-grown tissues is to grow isolated cells on three-dimensional matrices or scaffolds (matrices) under conditions that will cause cells to grow into functional tissue. Upon implantation, such bio-artificial tissue should become structurally and functionally integrated in the body. Matrices can be made from natural materials such as collagen, or from synthetic polymers such as plastics. Ultimately, the carcass material must biodegrade over time and should serve as the initial three-dimensional matrix for tissue growth.

Поскольку клетки растут и дифференцируются на каркасе, они будут продуцировать различные белки, необходимые для воссоздания ткани. Деградация каркаса гарантирует, что в организме останется только природная ткань. Также существуют различные типы биореакторов, включающих различные технологии для задачи создания ткани из клеток.As the cells grow and differentiate on the scaffold, they will produce the various proteins necessary for tissue regeneration. Scaffold degradation ensures that only natural tissue remains in the body. There are also various types of bioreactors, including various technologies for the task of creating tissue from cells.

Фактически каждая ткань в организме представляет собой потенциальную цель для биоинженерии, и развитие быстро происходит на множестве направлений. Для кожи как органа разработаны различные типы полученных при помощи инженерии реплантаций - кожу повторно получали при помощи инженерии, используя несколько различных подходов с разной степенью успеха.In fact, every tissue in the body is a potential target for bioengineering, and development is rapidly occurring in many directions. For the skin as an organ, various types of replantations obtained by engineering have been developed — the skin was re-obtained by engineering using several different approaches with varying degrees of success.

В патенте США № 5489304 описан неклеточный трансплантат, который содержит синтетический внешний слой, связанный с аналогичным дермальному слоем, полученным из коллагена-хондроитинсульфата. Такая реплантация, которую первоначально помещают на пораженный участок до использования культивированного эпителиального аутотрансплантата, обладает недостатком, которым является отсутствие факторов роста, важных для заживления ран на коже, или клеток, которые могут обеспечить продукцию таких факторов.US Pat. No. 5,489,304 describes a non-cellular transplant that contains a synthetic outer layer bonded to a similar dermal layer derived from collagen-chondroitin sulfate. Such a replantation, which is initially placed on the affected area before using the cultured epithelial autograft, has the disadvantage of which is the absence of growth factors important for healing wounds on the skin, or cells that can produce such factors.

В патенте США № 5460939 описан другой трансплантат, который является клеточным. В данном случае фибробласты растут на способном к биологическому рассасыванию сополимере молочной кислоты/гликолевой кислоты, сцепленном в виде пласта. В данном трансплантате каркасная решетка неприродного происхождения.US Pat. No. 5,460,939 describes another transplant that is cellular. In this case, fibroblasts grow on a biodegradable lactic acid / glycolic acid copolymer, coupled in the form of a layer. In this transplant, the frame lattice is of non-natural origin.

Eaglstein & Falanga (1997) описали трансплантат кожи, который включает дермальный слой, содержащий фибробласты, растущие на бычьем коллагеновом матриксе. В данном трансплантате внеклеточный матрикс предоставляется клеткам извне, который, хотя изготовлен из коллагена человека, но чужеродный компонент остается во время применения трансплантата.Eaglstein & Falanga (1997) described a skin graft that includes a dermal layer containing fibroblasts growing on a bovine collagen matrix. In this transplant, the extracellular matrix is provided to cells from the outside, which, although made from human collagen, remains a foreign component during transplant application.

В патенте США № 5613982 описан трансплантат, в котором обрабатывают трупную кожу человека для того, чтобы удалить антигенные клеточные компоненты, получая иммунологически инертный кожный слой. Данный трансплантат имеет ограничение, являясь бесклеточным и в трудной доступности трупной кожи человека.US Pat. No. 5,613,982 describes a graft in which human cadaver skin is treated in order to remove antigenic cellular components to form an immunologically inert skin layer. This transplant has a limitation, being cell-free and in the difficult accessibility of human cadaver skin.

Во всех описанных выше примерах технологические требования для получения эквивалентов достаточно сложны и, следовательно, будут увеличивать стоимость продукта. Были выращены клеточные пласты фибробластов с использованием аскорбата, но для образования таких пластов необходимо приблизительно 35 дней (Michel et al., 1999; L'Heureux et al., 1998).In all the examples described above, the technological requirements for obtaining equivalents are quite complex and, therefore, will increase the cost of the product. Fibroblast cell layers were grown using ascorbate, but it takes approximately 35 days to form such layers (Michel et al., 1999; L'Heureux et al., 1998).

Таким образом, существует необходимость в получении кожных эквивалентов, материалы для которых легко доступны, которые не содержат синтетический или чужеродный природный матрикс, который мог бы вызывать воспалительную реакцию у некоторых пациентов, которые имеют клеточную природу с тем, чтобы продуцировать факторы роста и другие белки, которые можно получить за относительно более короткое время, и получение которых технологически несложно с тем, чтобы продукт был более рентабельным.Thus, there is a need to obtain skin equivalents, materials for which are readily available, which do not contain a synthetic or foreign natural matrix, which could cause an inflammatory reaction in some patients who are of a cellular nature in order to produce growth factors and other proteins, which can be obtained in a relatively shorter time, and the production of which is technologically simple so that the product is more cost-effective.

Сфера деятельности, которая требует внимания в области продуктов, полученных при помощи инженерии тканей, представляет собой заменители кости для пациентов, чьи переломы не срастаются, оставляя несоединимые промежутки. Аутологичная трансплантация кости увеличивает травмирование пациента. Различные подходы подвергали испытанию в инженерии кости (Service, 2000). Пробовали применять биоматериалы, такие как коллагеновый матрикс, введенный с факторами роста, которые запускают образование кости, но такие конструкции теряли клеточный компонент, и введение необходимого значительного количества факторов роста делает их очень дорогостоящей альтернативой. Керамический или гидроксиапатитный матриксы, засеянные мезенхимальными стволовыми клетками, представляют собой другие подходы, но использование таких каркасов, возможно, не идеально для человеческого организма. Таким образом, существует необходимость в рентабельных клеточных имплантатах, которые бы вызвали заживление кости.A field of activity that requires attention in the field of products derived from tissue engineering is bone substitutes for patients whose fractures do not heal, leaving incompatible gaps. Autologous bone transplantation increases trauma to the patient. Various approaches have been tested in bone engineering (Service, 2000). We tried to use biomaterials, such as a collagen matrix, introduced with growth factors that trigger bone formation, but such constructs lost their cellular component, and the introduction of the required significant amount of growth factors makes them a very expensive alternative. Ceramic or hydroxyapatite matrices seeded with mesenchymal stem cells are other approaches, but the use of such scaffolds may not be ideal for the human body. Thus, there is a need for cost-effective cellular implants that would cause bone healing.

Другая сфера, которая требует внимания в области продуктов, полученных при помощи инженерии тканей, представляет собой восстановление хряща. Известный факт, что суставной хрящ обладает ограниченной возможностью полного восстановления после повреждения. Терапия на основе клеток при трансплантации аутологичных хондроцитов показала хорошие клинические результаты (McPherson & Tubo, 2000), но в этом случае остается достаточный объем для усовершенствования, поскольку, время для полного восстановления очень велико. Возможно, предварительно сформированная ткань, а не суспензия клеток, дала бы лучшие результаты при трансплантации. Предварительно сформированная ткань также имеет преимущество перед свободными клетками в отношении хирургической имплантации. Поэтому, различные подходы подвергались испытанию при создании подобной хрящу конструкции, используя клетки и каркас, но создание идеального каркасного матрикса, который позволит клеткам в имплантате хорошо имитировать естественный процесс формирования хряща, остается сложной задачей (Ilim & Han, 2000). Таким образом, существует необходимость в получении предварительно сформированной ткани, которая могла бы эффективно начать восстановление хряща при имплантации в участок поражения и которая была бы экономична по затратам.Another area that needs attention in the field of tissue engineering products is cartilage repair. It is a known fact that articular cartilage has a limited ability to fully recover from damage. Cell-based therapy for autologous chondrocyte transplantation has shown good clinical results (McPherson & Tubo, 2000), but in this case there is enough room for improvement, since the time for complete recovery is very long. Perhaps a preformed tissue, rather than a cell suspension, would give better transplant results. Preformed tissue also has an advantage over free cells in relation to surgical implantation. Therefore, different approaches have been tested to create a cartilage-like construct using cells and a skeleton, but creating the perfect skeleton matrix that will allow cells in the implant to mimic the natural process of cartilage formation well remains a challenge (Ilim & Han, 2000). Thus, there is a need to obtain preformed tissue that can effectively start the restoration of cartilage upon implantation in the lesion site and which would be cost-effective.

Подводя итоги, существует необходимость создания относительно недорогих живых клеточных заменителей ткани в терапевтических целях. Упомянутые ранее технологически сложные биореакторы для создания трехмерных тканей представляют собой дорогие методологии. Кроме того, вообще, всегда существует необходимость в создании заменителей ткани новыми способами, которые при тестировании, как могло бы оказаться, имеют лучшие параметры в одном или нескольких отношениях, чем существующие заменители.Summing up, there is a need to create relatively inexpensive living cell tissue substitutes for therapeutic purposes. The previously mentioned technologically sophisticated bioreactors for creating three-dimensional tissues are expensive methodologies. In addition, in general, there is always a need to create tissue substitutes in new ways that, when tested, might prove to have better parameters in one or more respects than existing substitutes.

Принимая во внимание насущную необходимость, авторы настоящего изобретения создали новые трехмерные макроскопические подобные ткани конструкции, которые обладают возможностью для использования в качестве заменителей тканей в человеческом организме. Новая особенность таких подобных ткани конструкций состоит в том, что не требуется никакого каркаса или чужеродного матрикса для получения ткани, т.е. можно сформировать ткани полностью клеточного происхождения. Кроме того, никаких других средств, которые способствуют формированию ткани (кроме высокой плотности засевания клеток), таких как индуцирующие формирование ткани химические вещества, индуцирующие формирование ткани факторы роста, питательная среда со специальными свойствами, чередующиеся культуры, не применяли для формирования ткани. Не существует никаких определенных сложных требований к среде для формирования подобной ткани конструкции. Фактор, вызывающий формирование макроскопической подобной ткани конструкции представляет собой крупномасштабное культивирование клеток при высокой степени засевания клеток на единицу площади или пространства.Taking into account the urgent need, the authors of the present invention have created new three-dimensional macroscopic tissue-like structures that are suitable for use as tissue substitutes in the human body. A new feature of such fabric-like designs is that no frame or foreign matrix is required to produce fabric, i.e. tissues of completely cellular origin can be formed. In addition, no other means that promote tissue formation (other than high cell sowing density), such as tissue-inducing chemicals, tissue-inducing growth factors, culture media with special properties, alternating cultures, were not used for tissue formation. There are no specific complex environmental requirements for forming a tissue-like structure. The factor causing the formation of a macroscopic tissue-like structure is a large-scale cultivation of cells with a high degree of inoculation of cells per unit area or space.

Важный аспект в инженерии ткани заключается в том, как заставить клетки объединиться в ткань или трехмерную структуру. Настоящее изобретение предлагает новый способ для достижения этой цели.An important aspect in tissue engineering is how to get cells to integrate into a tissue or three-dimensional structure. The present invention provides a new method to achieve this.

ЦЕЛИ ИЗОБРЕТЕНИЯOBJECTS OF THE INVENTION

В свете вышеупомянутого, следовательно, цель настоящего изобретения состоит в том, чтобы предложить новый способ объединения клеток в трехмерную подобную ткани организацию и подобные ткани конструкции.In light of the foregoing, it is therefore an object of the present invention to provide a new method for combining cells into a three-dimensional tissue-like organization and tissue-like constructs.

Также в свете вышеупомянутого, следовательно, цель настоящего изобретения состоит в том, чтобы предложить трехмерные макроскопические подобные ткани конструкции для возможной имплантации в организм человека в качестве терапии болезненных состояний или состояний повреждения ткани.Also in light of the foregoing, it is therefore an object of the present invention to provide three-dimensional macroscopic tissue-like constructs for possible implantation in the human body as a therapy for disease states or conditions for tissue damage.

Другая цель настоящего изобретения состоит в том, чтобы предложить макроскопические подобные ткани конструкции, которые гистологически компетентны. Термин «гистологическая компетентность» обозначает, что такие подобные ткани конструкции можно легко секционировать без разрушения.Another objective of the present invention is to provide macroscopic tissue-like constructs that are histologically competent. The term "histological competence" means that such tissue-like constructs can be easily partitioned without destruction.

Еще одна цель настоящего изобретения состоит в том, чтобы предложить трехмерную подобную ткани организацию клеток и экономичные по затратам предполагаемые эквиваленты ткани, сформированные из клеток-фибробластов мезенхимального происхождения (по меньшей мере), таких как полученный при помощи инженерии предполагаемый эквивалент кожи, полученный из фибробластов кожи, предполагаемый заменитель с подобными кости свойствами, сформированный из остеогенных клеток, полученный из жировых стромальных клеток или из остеобластов и предполагаемый заменитель для восстановления хряща, сформированный из хондроцитов. Сопутствующая цель настоящего изобретения состоит в том, чтобы ясно показать возможность предоставления также других тканей, которые можно получить из соответствующих типов клеток способом по настоящему изобретению, если такие другие типы клеток обладают свойствами, позволяющими им претерпевать подобное ткани формирование массы при культивировании макромассы, как определено в настоящем изобретении.Another objective of the present invention is to provide a three-dimensional tissue-like cell organization and cost-effective putative tissue equivalents formed from mesenchymal fibroblast cells (at least), such as an engineering putative putative skin equivalent derived from fibroblasts skin, an alleged substitute with bone-like properties, formed from osteogenic cells, derived from fatty stromal cells or from osteoblasts and Chondrocyte replacement cartilage replacement. A related objective of the present invention is to clearly show the possibility of providing also other tissues that can be obtained from the respective cell types by the method of the present invention, if such other types of cells have properties that allow them to undergo tissue-like mass formation during macromass cultivation, as defined in the present invention.

Еще одна цель настоящего изобретения состоит в том, чтобы предложить трехмерную подобную ткани организацию клеток и макроскопические подобные ткани конструкции без применения каркаса или чужеродного матрикса или сложного биореактора для получения ткани.Another objective of the present invention is to provide a three-dimensional tissue-like cell organization and macroscopic tissue-like structures without the use of a framework or a foreign matrix or complex bioreactor to produce tissue.

Еще одна цель настоящего изобретения состоит в том, чтобы предложить трехмерную подобную ткани организацию клеток и макроскопические подобные ткани конструкции без применения каких-либо средств, которые способствуют формированию ткани, таких как индуцирующие формирование ткани химические вещества, индуцирующие формирование ткани факторы роста, питательная среда со специальными свойствами, чередующиеся культуры и так далее.Another objective of the present invention is to provide three-dimensional tissue-like cell organization and macroscopic tissue-like constructs without using any means that promote tissue formation, such as tissue-forming inducing chemicals, tissue-forming inducing growth factors, culture medium with special properties, alternating cultures and so on.

Еще одна цель настоящего изобретения состоит в том, чтобы предложить трехмерную подобную ткани организацию клеток и макроскопические подобные ткани конструкции различных типов, полученных использованием высокой плотности засевания клеток на единицу площади или пространства сосуда для культивирования, без необходимости наличия любого другого средства, которое способствует формированию ткани.Another objective of the present invention is to propose a three-dimensional tissue-like cell organization and macroscopic tissue-like structures of various types obtained using high cell seeding density per unit area or space of a culture vessel, without the need for any other agent that promotes tissue formation .

Еще одна цель настоящего изобретения состоит в том, чтобы предложить макроскопические подобные ткани конструкции, которые обладают высокой степенью плотности клеток в конечном виде.Another objective of the present invention is to provide macroscopic tissue-like constructs that have a high degree of final cell density.

Еще одна цель настоящего изобретения состоит в том, чтобы предложить подобную ткани организацию клеток и макроскопические подобные ткани конструкции, которые можно получить без необходимости в определенных компонентах сложных сред.Another objective of the present invention is to provide tissue-like cell organization and macroscopic tissue-like constructs that can be obtained without the need for specific components of complex media.

Еще одна цель настоящего изобретения состоит в том, чтобы предложить подобную ткани организацию клеток и макроскопические подобные ткани конструкции, свойства которых можно модулировать, чтобы включать необходимые свойства при помощи подходящей замены/замен в среде для роста и/или в образующей ткань среде.Another objective of the present invention is to provide tissue-like cell organization and macroscopic tissue-like constructs, the properties of which can be modulated to include the necessary properties by suitable substitution / substitutions in the growth medium and / or in the tissue-forming medium.

Еще одна цель настоящего изобретения состоит в том, чтобы предложить подобную ткани организацию клеток и макроскопические подобные ткани конструкции, которые можно получить при культивировании макромассы на различных совместимых поверхностях роста в зависимости от необходимости.Another objective of the present invention is to provide tissue-like cell organization and macroscopic tissue-like constructs that can be obtained by culturing macromass on various compatible growth surfaces, depending on the need.

Еще одна цель настоящего изобретения состоит в том, чтобы предложить макроскопические подобные ткани конструкции, которые можно масштабировать до больших размеров при помощи простого воспроизведения с увеличением в двух измерениях способа, используемого для их получения, то есть, культивирования макромассы.Another objective of the present invention is to provide macroscopic tissue-like structures that can be scaled to large sizes by simple reproduction with an increase in two dimensions of the method used to obtain them, that is, cultivation of macromass.

Другая цель данного изобретения состоит в том, чтобы создать трехмерную подобную ткани организацию на микроскопическом уровне.Another objective of the present invention is to create a three-dimensional tissue-like organization at the microscopic level.

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯDESCRIPTION OF THE INVENTION

В настоящем изобретении предложен способ объединения клеток в трехмерную подобную ткани организацию при помощи культивирования макромассы и новый способ культивирования макромассы. Предложены макроскопические трехмерные подобные ткани конструкции, которые гистологически компетентны, полученные при макромассовом культивировании клеток. Настоящее изобретение относится к инженерии ткани. Более определенно, данное изобретение относится к получению трехмерной подобной ткани конструкции для возможной имплантации в организм человека в качестве терапии болезненных состояний или состояний при повреждении тканей. Данное изобретение предлагает способ для организации клеток в трехмерные подобные ткани формы и описывает сами подобные ткани формы.The present invention provides a method for combining cells into a three-dimensional tissue-like organization using macromass culture and a new method for cultivating macromass. Macroscopic three-dimensional tissue-like constructs are proposed that are histologically competent obtained by macromass cell culture. The present invention relates to tissue engineering. More specifically, this invention relates to the production of a three-dimensional tissue-like construct for possible implantation into the human body as a treatment for disease states or conditions for tissue damage. The present invention provides a method for organizing cells into three-dimensional tissue-like forms and describes the tissue-like forms themselves.

Получение ткани представляет собой цель, важную для реплантации поврежденных тканей организма человека. Предпринимаются усилия для того, чтобы исследовать и закрепить способности клеток формировать ткани для инженерии ткани.Obtaining tissue is an important goal for the replantation of damaged tissues of the human body. Efforts are being made to investigate and consolidate the ability of cells to form tissues for tissue engineering.

Способ инженерии ткани клеточных трансплантатов включает следующие ниже две (2) основные стадии:A method for tissue cell transplant tissue engineering includes the following two (2) main steps:

i. подготовка клеток из подходящих источников. Для подготовленных клеток может потребоваться подходящая предварительная обработка, такая как дифференцирование в необходимый тип клетки.i. preparing cells from suitable sources. Prepared cells may require appropriate pre-treatment, such as differentiation into the desired cell type.

ii. создание ткани, с использованием подходящим образом обработанных клеток для получения различных продуктов инженерии ткани.ii. creating tissue using suitably processed cells to produce various tissue-engineered products.

Настоящее изобретение относится к второй из данных стадий. Авторы изобретения разработали простой и эффективный способ для получения трехмерной подобной ткани организации клеток и формирования жизнеспособных, клеточных, предполагаемых заменителей тканей.The present invention relates to the second of these steps. The inventors have developed a simple and effective way to obtain a three-dimensional tissue-like organization of cells and the formation of viable, cellular, putative tissue substitutes.

Подобные ткани конструкции по настоящему изобретению обладают когезионной прочностью, позволяющей противостоять физической манипуляции и переносу, как это требовалось бы для процедуры переноса их хирургическим путем в необходимый участок организма из контейнера, содержащих их, при помощи соответствующих поддерживающих устройств и устройств или инструментов для переноса.Such tissue constructs of the present invention have a cohesive strength that can withstand physical manipulation and transfer, as would be required for the procedure of transferring them surgically to the desired area of the body from the container containing them, using appropriate supporting devices and devices or tools for transferring.

Существенный объем работы был проведен до настоящего времени при создании заменителей ткани, которые представляют собой заменители на основе каркаса - они содержат каркас в качестве важного структурного и часто функционального компонента. Такой каркас должен обладать свойствами биологической совместимости, способности к биодеградации (так, чтобы в конечном счете в организме оставалась только природная ткань) и предоставления окружающей среды, допускающей осуществление оптимальной клеточной функции. Разработка каркасов, которые идеальны во всевозможных отношениях, остается сложной задачей. Настоящее изобретение имеет преимущество в том, что оно преодолевает необходимость внедрения каркаса, поскольку трехмерные подобные ткани конструкции, полученные по настоящему изобретению, изготовлены без помощи каркаса. Формирование гистологически компетентных подобных ткани конструкций макромассовым способом по настоящему изобретению не требует наличия каркаса. Таким образом, подобные ткани конструкции по настоящему изобретению также устраняют любые неблагоприятные эффекты или недостатки, которые могли бы быть связаны с использованием каркаса, который не идеален в каком-либо отношении. В настоящем изобретении, внеклеточный матрикс синтезируется непосредственно самими клетками, не используются никакие чужеродные компоненты матрикса. Формирование ткани осуществляется просто высеванием клеток при высокой степени плотности клеток на единицу площади или пространства сосуда для культивирования. Такой способ обозначили как культивирование «макромассы», которое обозначают как систему культивирования трехмерного подобного ткани образования или организации клеток, в которой клетки высевают при высокой степени плотности на единицу площади или пространства сосуда для культивирования в диапазоне, охватывающем интервал около 10⁶ клеток на см², и нет никакой необходимости в наличии любых других средств, которые способствуют формированию ткани. Более широкое определение культивирования макромассы представляет собой способ получения трехмерной подобной ткани организации, макроскопической или микроскопической, из клеток посредством высевания клеток при высокой степени плотности, приводящей к расположению клеток в непосредственной близости при определенном благоприятном диапазоне высоких степеней плотности клеток в трехмерном пространстве, которое благоприятствует когезивной интеграции клеток в трехмерное подобное ткани состояние, причем без необходимости в наличии любых других средств, которые способствуют формированию ткани. Определенной высокой плотности высевания клеток в благоприятном диапазоне необходимо достичь в пределах данного пространства. В макромассовом диапазоне благоприятных высоких степеней плотности высевания клеток, когда клетки расположены вместе в трехмерном пространстве, которое занято клетками на дне сосуда для культивирования, они достигают состояния непосредственной близости друг с другом, которое запускает или передает им сигнал о переходе в режим формирования ткани, посредством которого они когезивно интегрируются. (Можно отметить, что макромассового диапазона плотности высевания клеток можно достичь в сосуде с плоским или закругленным дном). Результатом использования сосуда для культивирования диаметром приблизительно 0,75 см или более для культивирования макромассы является формирование макроскопических трехмерных подобных ткани конструкций, где "макроскопические" обозначает, что размер ткани составляет, по меньшей мере, такой размер, что его можно легко визуально рассматривать нормальным человеческим глазом без вспомогательных устройств.A significant amount of work has been done to date in the creation of tissue substitutes, which are framework-based substitutes — they contain the framework as an important structural and often functional component. Such a framework must possess the properties of biocompatibility, biodegradability (so that ultimately only natural tissue remains in the body) and provide an environment that allows optimal cellular function to be realized. Designing frameworks that are perfect in every way possible remains a challenge. The present invention has the advantage that it overcomes the need to introduce a carcass, since the three-dimensional tissue-like structures obtained by the present invention are made without the aid of a carcass. The formation of histologically competent tissue-like structures by the macromass method of the present invention does not require a framework. Thus, the tissue-like constructs of the present invention also eliminate any adverse effects or disadvantages that might be associated with the use of a framework that is not ideal in any way. In the present invention, the extracellular matrix is synthesized directly by the cells themselves, no foreign matrix components are used. The formation of tissue is carried out simply by seeding cells with a high degree of cell density per unit area or space of the vessel for cultivation. This method was designated as cultivation of "macromass", which is referred to as a system for culturing a three-dimensional tissue-like formation or organization of cells in which cells are seeded at a high degree of density per unit area or space of a culture vessel in a range spanning about 10 ⁶ cells per cm ² , and there is no need for any other agents that contribute to tissue formation. A broader definition of macromass cultivation is a method for producing a three-dimensional similar tissue organization, macroscopic or microscopic, from cells by plating cells at a high degree of density, leading to the arrangement of cells in close proximity with a certain favorable range of high degrees of cell density in three-dimensional space, which favors cohesive integration of cells into a three-dimensional tissue-like state, without the need for any x other agents that promote the formation of tissue. A certain high cell seeding density in a favorable range must be achieved within a given space. In the macro-mass range of favorable high degrees of cell seeding density, when the cells are located together in a three-dimensional space occupied by the cells at the bottom of the culture vessel, they reach a state of close proximity to each other, which triggers or sends them a signal about the transition to tissue formation mode, by whom they cohesively integrate. (It can be noted that the macromass range of cell seeding density can be achieved in a vessel with a flat or rounded bottom). The result of using a culture vessel with a diameter of about 0.75 cm or more for macromass cultivation is the formation of macroscopic three-dimensional tissue-like structures, where “macroscopic” means that the size of the tissue is at least such a size that it can be easily visually viewed as normal human eye without assistive devices.

Ранее известную систему культивирования ткани, культуру микромассы высокой плотности использовали для хондрогенной дифференцировки клеток, и объем такой культуры был ограничен до составляющих от 10 до 20 мкл пятен клеточной суспензии (Yoon et al, 2000). Классически, мезенхимальные клетки конечностей, при культивировании in vitro в качестве культуры микромассы, подвергаются формированию уплотнений или агрегатов предхряща, которые присутствуют в качестве отдельных узлов, покрывающие площадь микромассового пятна (Ahrens et al., 1977). Сформированные таким образом клеточные узлы отделены друг от друга клетками, не сформированными в узлы между ними, и клеточные узлы являются микроскопическими. Большие, но все же микроскопические сфероидальные структуры, в которых все клетки объединены для формирования одного скопления, получены с необходимостью наличия определенных компонентов, добавленных к среде культивирования, таких как факторы роста, как далее упомянуто в тексте. Тем не менее, подобные ткани массы, полученные авторами настоящего изобретения, являются макроскопическими (и сформированы без помощи какого-либо определенного средства, которое способствует формированию ткани) и таким образом обладают желательным качеством размера, необходимым, чтобы обладать потенциалом в качестве заменителей ткани для организма человека. В подобной ткани организации макромассовой культуры по настоящему изобретению все клетки становятся частью интегрированной подобной ткани организации, которая является таким образом целостной; нет никаких отдельных узлов. Ранее обнаружено, что микромассовым культивированием мезенхимальные клетки предхряща ноги привели к появлению узлового паттерна (Downie & Newman, 1994). Хотя мезенхимальные клетки предхряща руки привели к появлению паттерна пласта при культивировании микромассы; это произошло в бессывороточной системе культивирования в отличие от системы культивирования макромассы по настоящему изобретению. Кроме того, мезенхимальные клетки предхряща ноги могли привести к появлению подобного пласту патерна, но это происходило после обработки TGFβl в бессывороточной среде, опять же в отличие от макромассового культивирования, где нет необходимости в определенных средствах, которые способствуют формированию ткани при образовании подобного ткани пласта, и нет необходимости в бессывороточных условиях.The previously known tissue culture system, a high-density micromass culture was used for chondrogenic differentiation of cells, and the volume of such culture was limited to 10 to 20 μl of cell suspension spots (Yoon et al, 2000). Classically, mesenchymal limb cells, when cultured in vitro as a micromass culture, undergo the formation of seals or aggregates of the cartilage, which are present as separate nodes covering the area of the micromass spot (Ahrens et al., 1977). The cellular nodes thus formed are separated from each other by cells that are not formed into nodes between them, and the cellular nodes are microscopic. Large, but nevertheless microscopic, spheroidal structures in which all cells are combined to form a single cluster, were obtained with the need for certain components added to the culture medium, such as growth factors, as further mentioned in the text. However, tissue-like masses obtained by the inventors of the present invention are macroscopic (and formed without the aid of any specific means that promotes tissue formation) and thus have the desired size quality necessary to have potential as tissue substitutes for the body person. In a tissue-like tissue organization of a macromass culture of the present invention, all cells become part of an integrated tissue-like organization of organization, which is thus holistic; there are no separate nodes. It was previously found that micromassage cultivation of mesenchymal cells of the cartilage of the leg led to the appearance of a nodular pattern (Downie & Newman, 1994). Although the mesenchymal cells of the cartilage of the hand led to the appearance of a reservoir pattern during micromass cultivation; this happened in a serum-free cultivation system, in contrast to the macromass culture system of the present invention. In addition, mesenchymal cells of the cartilage of the leg could lead to the appearance of a layer-like pattern, but this happened after treatment with TGFβl in serum-free medium, again, unlike macromass cultivation, where there is no need for certain agents that promote tissue formation during the formation of such tissue of the layer, and there is no need for serum-free conditions.

До настоящего времени остается неисследованным вопрос, будет ли иметь место межклеточная агрегация, приводящая к образованию целостной подобной ткани массы посредством культивирования при высокой степени плотности высевания клеток без определенных средств, которые способствуют формированию ткани в среде. Тем не менее, работа авторов настоящего изобретения относится к данному вопросу, и настоящее изобретение позволяет ответить на него утвердительно.Until now, the question remains unanswered whether there will be intercellular aggregation leading to the formation of an integral tissue-like mass by culturing at a high degree of cell seeding density without specific means that contribute to tissue formation in the medium. However, the work of the authors of the present invention relates to this question, and the present invention allows to answer in the affirmative.

Культуру с высокой плотностью клеток использовали для инициации хондрогенеза с формированием микроскопических отдельных узлов, но она пока не была оценена в большем по размеру макроскопическом масштабе для создания макроскопических тканей для реплантации в организм человека. И даже в микроскопическом масштабе, как упомянуто выше, целостные агрегаты получали только при помощи определенных средств в отличие от культивирования макромассы по настоящему изобретению.A culture with a high density of cells was used to initiate chondrogenesis with the formation of microscopic individual nodes, but it has not yet been evaluated on a larger macroscopic scale to create macroscopic tissues for replantation into the human body. And even on a microscopic scale, as mentioned above, integral aggregates were obtained only by certain means, in contrast to the cultivation of macromass of the present invention.

Хотя термин «макромасса» при первом восприятии, как может показаться, означает простое расширение понятия «микромассы», он фактически отличается в важном аспекте, в том, что микромассу получали в качестве способа для хондрогенной дифференцировки клеток, и также он охватывает определенные сложные требования к среде даже для образования микроскопического целостного сфероидального агрерата (как упомянуто ниже), в то время как макромасса представляет собой способ получения трехмерной подобной ткани организации клеток и макроскопических подобных ткани конструкций и без определенных сложных требований к среде для их образования.Although the term "macromass" at first perception, as it might seem, means a simple extension of the concept of "micromass", it actually differs in an important aspect, in that micromass was obtained as a method for chondrogenic differentiation of cells, and it also covers certain complex requirements for even for the formation of a microscopic holistic spheroidal aggregate (as mentioned below), while macromass is a way to obtain three-dimensional tissue-like cell organization and macroscopic fabric-like designs and without certain complex environmental requirements for their formation.

До настоящего времени предпринимались попытки создания клеточных агрегатов, результатами которых были микроскопические массы, называемые сфероидами. Сфероиды представляют собой трехмерные клеточные структуры, которые получали из гепатоцитов и других клеток при помощи разнообразных средств, которые способствуют формированию подобных ткани структур, таких как не прилипающие чашки (Takezawa et al., 1993), культивирование в центрифужной пробирке (Abu-Absi et al., 2002), полимерные вещества наподобие эудрагита (Yamada et al., 1998), матригель (Lang et al, 2001), чашки Primaria (Hamamoto et al., 1998), покрытые поли-D-лизином чашки (Hamamoto et al., 1998), протеогликановое покрытие (Shinji et al., 1988), поток среды культивирования (Pollok et a.l, 1998), чередующиеся культуры (Furukawa et al., 2001), способ с жидким верхним слоем (Davies et al., 2002), факторы, увеличивающие межклеточную адгезию, такие как инсулин, дексаметазон и фактор роста фибробластов (Furukawa et al., 2001), поддерживающих агрегацию конъюгатов полимеров с пептидами (Baldwin & Saltzman, 2001), биореактор со вращающимися стенками (Baldwin & Saltzman, 2001) и так далее. В отличие от данных сфероидов массы ткани, полученные по настоящему изобретению, получены без помощи какого-либо такого средства, которое способствует формированию подобных ткани структур. Упомянутые выше сфероиды намного меньше, находясь, главным образом, в микрометровом или субмиллиметровом диапазоне. Так как можно получить макроскопические массы ткани при культивировании макромассы, как описано в настоящем изобретении, данные массы ткани обладают явным преимуществом перед сфероидами для размещения в необходимых участках организма человека.So far, attempts have been made to create cell aggregates, the results of which were microscopic masses called spheroids. Spheroids are three-dimensional cell structures that were obtained from hepatocytes and other cells using a variety of means that promote the formation of tissue-like structures, such as non-adherent cups (Takezawa et al., 1993), centrifuge tube culture (Abu-Absi et al ., 2002), polymeric substances like eudragit (Yamada et al., 1998), matrigel (Lang et al, 2001), Primaria cups (Hamamoto et al., 1998), coated with poly-D-lysine cups (Hamamoto et al. , 1998), proteoglycan coating (Shinji et al., 1988), flow of cultivation medium (Pollok et al, 1998), alternating cu seals (Furukawa et al., 2001), a liquid topcoat method (Davies et al., 2002), factors that increase intercellular adhesion, such as insulin, dexamethasone and fibroblast growth factor (Furukawa et al., 2001), supporting aggregation conjugates of polymers with peptides (Baldwin & Saltzman, 2001), a bioreactor with rotating walls (Baldwin & Saltzman, 2001) and so on. In contrast to these spheroids, the masses of tissue obtained according to the present invention were obtained without the aid of any such agent that promotes the formation of tissue-like structures. The spheroids mentioned above are much smaller, being mainly in the micrometer or submillimeter range. Since macroscopic tissue masses can be obtained by culturing macromass, as described in the present invention, these tissue masses have a distinct advantage over spheroids for placement in necessary areas of the human body.

Самый большой из сфероидов (приблизительно 1 мм в диаметре), который авторы настоящего изобретения обнаружили в опубликованных литературных источниках, был сформирован при высокоплотном культивировании кусочков ткани (Mackay et al., 1998). Его формирование происходило в присутствии определенной бессывороточной среды, содержащей TGF-β3, дексаметазон, 2-фосфат аскорбата и добавки инсулин-трансферин-селен, где также нет необходимости в определенной бессывороточной среде для получения ткани культивированием макромассы. В предыдущем сообщении, использующем культивирование кусочков ткани костного мозга, полученных из мезенхимальных клеток-предшественников, обнаружили, что формирование сфероидального агрегата не имело место в кусочках ткани, инкубированных с DMEM + 10% FCS (Johnstone et al., 1998), в то время как подобные ткани конструкции при культивировании макромассы формируются в DMEM + 10%-ый FCS. Сообщали об образовании сфероида при культивировании микромассы мультипотентных мезенхимальных клеток; здесь снова формирование сфероидального агрегата имело место только после обработки микромассы TGFβ1 или экстрактом бычьей кости (Denker et al., 1995). Микроскопические сфероиды клеток кости, как сообщали, формировались в присутствии бессывороточной среды, содержащей TGFβ1 (Kale et al., 2000; заявка на патент США № 20020127711), и культивирование клеток в отсутствие сыворотки и в присутствии TGFβ1, как сообщают, существенно для формирования сфероида клетки кости в данном способе. В упомянутой выше работе, плотности клеточной культуры от примерно 1×10³ клеток/см² до 1×10⁶ клеток/см² были описаны как благоприятные для формирования сфероида. В дополнение к другим характерным особенностям подобных ткани конструкций по настоящему изобретению, которые отличают его от упомянутой выше работы, а именно, будучи макроскопическими, не требующими отсутствия сыворотки и не требующими присутствия TGFβ1 для формирования, благоприятные диапазоны плотности высевания клеток также отличаются. В настоящем изобретении подобные ткани конструкции не имеют место при плотности 1×10⁵ клеток/см² или ниже, тогда как 1×10³ клеток/см² в указанной выше работе в 100 раз ниже. Получали клеточные агрегаты или узлы остеогенных эмбриональных стволовых клеток (Buttery et al., 2001), но опять же, данные узлы были микроскопическим и не формировались при культивировании клеток с высокой плотностью высевания, как описано в настоящем изобретении. Массы ткани по настоящему изобретению, которые можно получить при культивировании макромассы, когда осуществляют его в большом масштабе, являются макроскопическими, следовательно, размеры их намного больше, чем любые сфероиды, которые были получены, и не имеют таких определенных сложных требований к среде для формирования. Простая среда, такая как DMEM + 10% FCS, достаточна для формирования подобной ткани конструкции при помощи культивирования макромассы. Ранее из хондрогенных клеток получали когезионные закупоривающие массы клеток (патент США № 5723331), но для этого строго необходима переделанная лунка, имеющая поверхность, которая препятствует присоединению клеток и, таким образом, не допускает закрепления клеток, тогда как в настоящем изобретении нет никакой необходимости в такой поверхности для формирования подобной ткани конструкции.The largest of the spheroids (approximately 1 mm in diameter) that the authors of the present invention found in published literature was formed by high-density cultivation of tissue pieces (Mackay et al., 1998). Its formation took place in the presence of a certain serum-free medium containing TGF-β3, dexamethasone, ascorbate 2-phosphate and insulin-transferrin-selenium supplements, where there is also no need for a certain serum-free medium to obtain tissue by culturing macromass. In a previous report using cultivation of pieces of bone marrow tissue obtained from mesenchymal progenitor cells, it was found that spheroidal aggregation did not occur in pieces of tissue incubated with DMEM + 10% FCS (Johnstone et al., 1998) at that time how similar tissue structures during macromass cultivation are formed in DMEM + 10% FCS. The formation of a spheroid during the cultivation of micromass of multipotent mesenchymal cells was reported; here again, the formation of a spheroidal aggregate took place only after treatment with TGFβ1 micromass or bovine bone extract (Denker et al., 1995). Microscopic spheroids of bone cells have been reported to form in the presence of a serum-free medium containing TGFβ1 (Kale et al., 2000; US patent application No. 20020127711), and cell culture in the absence of serum and in the presence of TGFβ1 has been reported to be essential for spheroid formation bone cells in this method. In the above work, cell culture densities of from about 1 × 10 ³ cells / cm ² to 1 × 10 ⁶ cells / cm ² were described as favorable for spheroid formation. In addition to other characteristic features of the tissue-like constructs of the present invention that distinguish it from the aforementioned work, namely, being macroscopic, not requiring the absence of serum and not requiring the presence of TGFβ1 for formation, favorable cell density ranges are also different. In the present invention, such tissue constructs do not occur at a density of 1 × 10 ⁵ cells / cm ² or lower, while 1 × 10 ³ cells / cm ² in the above work is 100 times lower. Cell aggregates or nodes of osteogenic embryonic stem cells were obtained (Buttery et al., 2001), but again, these nodes were microscopic and did not form when culturing cells with a high seeding density, as described in the present invention. The tissue masses of the present invention, which can be obtained by culturing macromass when they are carried out on a large scale, are macroscopic, therefore, they are much larger than any spheroids that have been obtained and do not have such specific complex requirements for the formation medium. A simple medium, such as DMEM + 10% FCS, is sufficient to form a tissue-like structure by culturing macromass. Previously, cohesive clogging masses of cells were obtained from chondrogenic cells (US Pat. No. 5,723,331), but a reworked well having a surface that interferes with cell attachment and thus does not allow cell attachment is strictly required, while the present invention does not need such a surface to form a tissue-like structure.

В одном осуществлении данного изобретения подобный ткани пласт формируется из фибробластов кожи человека в качестве потенциального заменителя кожи. Фибробласты кожи могут иметь аллогенное происхождение, так как известно, что фибробласты кожи человека являются относительно неиммуногенными при передаче аллогенному реципиенту (патент США № 5460939). Такой подобный ткани пласт обладает потенциалом, чтобы стать кожным эквивалентом, материалы для которого легко доступны, который не содержит никакого синтетического или природного чужеродного матрикса, который мог бы вызвать воспалительную реакцию у некоторых пациентов, который является клеточным с тем, чтобы он мог продуцировать факторы роста и другие белки, который можно получить в относительно более короткое время и получение которого технологически просто так, что продукт более экономичен по затратам.In one embodiment of the invention, a tissue-like layer is formed from fibroblasts of human skin as a potential skin substitute. Skin fibroblasts can be of allogeneic origin, since it is known that human skin fibroblasts are relatively non-immunogenic when transmitted to an allogeneic recipient (US Patent No. 5,460,939). Such a tissue-like layer has the potential to become a skin equivalent, materials for which are readily available, which does not contain any synthetic or natural foreign matrix, which could cause an inflammatory response in some patients, which is cellular so that it can produce growth factors and other proteins, which can be obtained in a relatively shorter time and the production of which is technologically simple so that the product is more economical in cost.

В другом осуществлении данного изобретения при культивировании макромассы подобную ткани массу с подобными кости свойствами получают из остеогенных клеток, полученных из жировых стромальных клеток, в качестве предполагаемого заместителя ткани, который может обладать возможностью инициировать заживление небольших несоединимых разрывов при переломах кости. Это может быть аутогенной терапией. Такая подобная ткани масса может обладать возможностью представлять собой экономичный по затратам клеточный имплантат, лишенный чужеродного каркаса, который может инициировать заживление небольших разрывов в кости. В данном изобретении подобную ткани конструкцию также получали из остеобластов, полученных из кости.In another embodiment of the present invention, when cultivating macromass, tissue-like mass with bone-like properties is obtained from osteogenic cells derived from fat stromal cells as an alleged tissue substitute that may have the ability to initiate healing of small, unconnectable fractures in bone fractures. This may be an autogenous therapy. Such a tissue-like mass may be able to be a cost-effective cell implant devoid of a foreign framework that can initiate the healing of small tears in the bone. In the present invention, a tissue-like construct was also obtained from osteoblasts derived from bone.

В еще одном осуществлении изобретения, подобный ткани пласт получали из хондроцитов человека в качестве предполагаемого имплантата, индуцирующего восстановление хряща у пациентов с повреждением хряща сустава. Аутогенные хондроциты можно использовать для такой терапии ткани, поскольку хондроциты можно получить из небольших биопсий хряща. Такой подобный ткани пласт может обладать потенциалом представлять собой предварительно сформированную ткань, которая могла бы эффективно начать восстановление хряща при имплантации в участок поражения и который также был бы экономичным по затратам.In yet another embodiment of the invention, a tissue-like layer was obtained from human chondrocytes as a putative implant inducing cartilage repair in patients with joint cartilage damage. Autogenic chondrocytes can be used for such tissue therapy, since chondrocytes can be obtained from small cartilage biopsies. Such a tissue-like layer may have the potential to be a pre-formed tissue that could effectively start the restoration of cartilage upon implantation into the lesion site and which would also be cost-effective.

В дополнительном осуществлении данного изобретения микроскопическую трехмерную подобную ткани организацию получают при помощи культивирования макромасс в желатиновом пористом материале.In a further embodiment of the invention, a microscopic three-dimensional tissue-like organization is obtained by culturing macromasses in a gelatinous porous material.

В заключение, подобные ткани конструкции по настоящему изобретению, полученные культивированием макромассы, могут обладать потенциалом представлять собой жизнеспособные, клеточные заменители ткани, которые не содержат каркаса и чужеродного внеклеточного матрикса и которые технологически просто получить и, следовательно, которые были бы экономичными по затратам. Подобные ткани конструкции по настоящему изобретению, подробно описанные в качестве заменителей ткани в терапевтических целях, могли бы также найти другие области применения, такие как тестирование лекарственных препаратов in vitro и тому подобное.In conclusion, the tissue-like constructs of the present invention obtained by culturing macromass may have the potential to be viable, cellular tissue substitutes that do not contain a scaffold and foreign extracellular matrix and which are technologically simple to produce and therefore would be cost-effective. Similar tissue constructs of the present invention, described in detail as tissue substitutes for therapeutic purposes, could also find other applications, such as in vitro drug testing and the like.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙBRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS

Предпочтительные осуществления настоящего изобретения далее проиллюстрированы в сопутствующих фигурах, как описано ниже.Preferred embodiments of the present invention are further illustrated in the accompanying figures, as described below.

ФИГ.1. Фотографии, демонстрирующие макроскопические подобные ткани конструкции, сформированные при культивировании макромассы в чашках диаметром 3,5 см из (a) фибробластов кожи, (b) жировых стромальных клеток, (c) хондроцитов, (d) остеобластов.FIG. 1. Photographs showing macroscopic tissue-like structures formed by culturing macromass in 3.5 cm diameter dishes from (a) skin fibroblasts, (b) fat stromal cells, (c) chondrocytes, (d) osteoblasts.

ФИГ.2. Процесс межклеточной адгезии, приводящий к формированию подобной ткани конструкции, имеющей место при культивировании макромассы жировых стромальных клеток (a) через один час после начала культивирования макромассы, (b) через шесть часов после начала культивирования макромассы.FIG. 2. The process of intercellular adhesion leading to the formation of a tissue-like structure that occurs during the cultivation of macromass of fat stromal cells (a) one hour after the start of cultivation of macromass, (b) six hours after the start of cultivation of macromass.

ФИГ.3. Гистологическое исследование тканевого пласта, сформированного при культивировании макромассы фибробластов кожи (a) окрашивание гематоксилином и эозином показывает трехмерную организацию, (b) окрашивание трихром по Массону показывает синтез коллагена.FIG. 3. Histological examination of the tissue layer formed by culturing macromass of skin fibroblasts (a) staining with hematoxylin and eosin shows three-dimensional organization, (b) Masson staining with trichrome shows collagen synthesis.

ФИГ 4. Гистологическое исследование подобной ткани конструкции, сформированной при культивировании макромассы остеогенных клеток, полученных из жировых стромальных клеток (a) окрашивание гематоксилином и эозином показывает трехмерную организацию, (b) окрашивание трихром по Массону.FIG 4. Histological examination of a tissue-like structure formed by culturing macromass of osteogenic cells obtained from fat stromal cells (a) staining with hematoxylin and eosin shows three-dimensional organization, (b) Masson trichrome staining.

ФИГ.5. Гистологическое исследование подобной ткани конструкции, сформированной при культивировании макромассы хондроцитов (a) окрашивание гематоксилином и эозином показывает трехмерную организацию, (b) окрашивание трихром по Массону.FIG. 5. Histological examination of a tissue-like structure formed by culturing chondrocyte macromass (a) staining with hematoxylin and eosin shows three-dimensional organization, (b) Masson staining with trichrome.

ФИГ.6. Иммунное окрашивание коллагена типа I гистологического среза подобной ткани конструкции, полученной из фибробластов кожи, показывающее положительное обнаружение коллагена типа I.FIG.6. Immune staining of type I collagen in a histological section of a tissue-like construct derived from skin fibroblasts showing a positive detection of type I collagen.

ФИГ.7. Клетки, повторно выращенные от отделенного пласта ткани, полученного из фибробластов кожи при культивировании макромассы для того, чтобы оценить их жизнеспособность.FIG. 7. Cells re-grown from a separated tissue layer obtained from skin fibroblasts by culturing macromass in order to assess their viability.

ФИГ.8. Анализ экспрессии генов тканевого пласта, полученного из фибробластов кожи при культивировании макромассы, проанализированные при помощи PCR с обратной транскриптазой. Продукты RT-PCR, соответствующие различным генам, которые, как известно, важны для процесса заживления ран кожи, показаны в виде разделенных электрофорезом в 2% агарозном геле (M) маркеров молекулярного веса ДНК, (1) коллагена I типа, (2) синдекана 2, (3) танасцина-C, (4) васкулярного эндотелиального фактора роста, (5) коллагена III типа, (6) фибронектина, (7) фактора роста кератиноцитов, (8) трансформирующего фактора роста 1β.FIG. 8. Analysis of gene expression of tissue layer obtained from skin fibroblasts during macromass cultivation, analyzed by reverse transcriptase PCR. RT-PCR products corresponding to various genes that are known to be important for the healing process of skin wounds are shown as DNA molecular weight markers separated by 2% agarose gel electrophoresis, (1) type I collagen, (2) syndecan 2, (3) tanascin-C, (4) vascular endothelial growth factor, (5) type III collagen, (6) fibronectin, (7) keratinocyte growth factor, (8) transforming growth factor 1β.

ФИГ.9. Экспрессия генов в подобной ткани конструкции, созданной из остеогенных клеток, полученных из жировых стромальных клеток. Продукты RT-PCR показаны в виде разделенных электрофорезом в 2% агарозном геле (M) маркеров молекулярного веса ДНК, (1) коллагена типа I, (2) остеопонтина, (3) рецептора паратиреоидного гормона, (4) формообразующего кость белка 2, (5) формообразующего кость белка 4, (6) рецептора формообразующего кость белка IA, (7) рецептора формообразующего кость белка IB.FIG. 9. Gene expression in a tissue-like construct created from osteogenic cells derived from fat stromal cells. RT-PCR products are shown as DNA molecular weight markers separated by 2% agarose gel electrophoresis, (1) type I collagen, (2) osteopontin, (3) parathyroid hormone receptor, (4) bone-forming protein 2, ( 5) bone-forming protein 4, (6) receptor bone-forming protein IA, (7) receptor bone-forming protein IB.

ФИГ.10. Экспрессия генов в подобной ткани конструкции, созданной из хондроцитов. Продукты RT-PCR показаны в виде разделенных электрофорезом в 2% агарозном геле (M) маркеров молекулярного веса ДНК, (1) аггрекана, (2) коллагена типа II, (3) коллагена типа X.FIG. 10. Gene expression in a tissue-like construct made from chondrocytes. RT-PCR products are shown as DNA molecular weight markers, (1) aggrecan, (2) collagen type II, (3) collagen type X, separated by 2% agarose gel electrophoresis.

ФИГ.11. Гистологический анализ подобной ткани конструкции, созданной из остеогенных клеток, полученных из жировых стромальных клеток в присутствии кондиционированной остеогенной среды, показывающий (a) фокальное фактическое формирование кости в подобной ткани конструкции (трихром по Массону) и (b) фокальное отложение кальция (Von Kossa), демонстрирующий, что свойства подобных ткани конструкций, полученных при культивировании макромассы, можно модулировать при помощи изменений среды.FIG. 11. Histological analysis of a tissue-like construct made from osteogenic cells derived from fat stromal cells in the presence of an conditioned osteogenic environment, showing (a) focal actual bone formation in a tissue-like construct (Masson trichrome) and (b) focal calcium deposition (Von Kossa) , demonstrating that the properties of tissue-like structures obtained by culturing macromass can be modulated by environmental changes.

ФИГ.12. Гистологические срезы (окрашивание толуидином синим) подобных ткани конструкций, созданных из хондроцитов в присутствии (a) DMEM + 10% FCS, (b) хондрогенной среды, показывающие формирование специфичного для хряща внеклеточного матрикса в (b), демонстрирующих, что свойства подобных ткани конструкций, полученных при культивировании макромассы, можно модулировать при помощи изменений среды.FIG. 12. Histological sections (toluidine blue staining) of tissue-like constructs created from chondrocytes in the presence of (a) DMEM + 10% FCS, (b) chondrogenic medium, showing the formation of cartilage-specific extracellular matrix in (b), demonstrating that the properties of tissue-like constructs obtained by culturing macromass can be modulated by changes in the environment.

ФИГ.13. Гистологический срез (окрашивание трихромом по Массону) сложного объекта, состоящего из подобного ткани пласта, полученного из фибробластов кожи и геля коллаген + фибрин, демонстрирующий, что подобная ткани организация клеток, полученная при культивировании макромассы, может представлять собой компонент объекта.FIG.13. A histological section (Masson trichrome staining) of a complex object consisting of a similar tissue layer obtained from skin fibroblasts and collagen + fibrin gel, demonstrating that tissue-like cell organization obtained by culturing macromass can be a component of the object.

ФИГ.14. Гистологический срез (окрашивание гематоксилином и эозином) культуры макромассы в желатиновом пористом материале, показывающий сформированные кластеры микроскопических трехмерных подобных ткани организаций.FIG. 14. A histological section (stained with hematoxylin and eosin) of the macromass culture in a gelatinous porous material, showing formed clusters of microscopic three-dimensional tissue-like organizations.

Различные другие аспекты изобретения дополнительно подробно описаны в следующих ниже разделах.Various other aspects of the invention are further described in detail in the following sections.

МАТЕРИАЛЫ И СПОСОБЫMATERIALS AND METHODS

Авторами настоящего изобретения разъяснено, что по всему описанию данного изобретения и в приложенной формуле изобретения, хотя площадь сосуда для культивирования упомянута в терминах диаметра круглого сосуда для культивирования, описываемый фактически аспект включает сосуд для культивирования любой формы, причем его площадь представляет собой ту же самую площадь, что и для круглого сосуда для культивирования упомянутого диаметра. Также, культивирование макромассы можно осуществить в сосуде для культивирования с плоским или неплоским дном, хотя работа, представленная в настоящем описании, относится к сосудам с плоским дном.The authors of the present invention explained that throughout the description of the present invention and in the attached claims, although the area of the culture vessel is mentioned in terms of the diameter of the round culture vessel, the described aspect actually includes a culture vessel of any shape, and its area is the same area as for a round vessel for culturing the said diameter. Also, the cultivation of macromass can be carried out in a vessel for cultivation with a flat or non-flat bottom, although the work presented in the present description relates to vessels with a flat bottom.

Выделение клеток, среда и культураCell isolation, medium and culture

В настоящем изобретении фибробласты кожи человека выделяли из биопсий кожи человека. Дерму отделяли от эпидермиса обработкой диспазой (Sigma, St. Louis, США).In the present invention, human skin fibroblasts were isolated from biopsies of human skin. The dermis was separated from the epidermis by treatment with dispase (Sigma, St. Louis, USA).

Дерму крошили и расщепляли с использованием 0,01% коллагеназы в смеси DMEM + 10% FCS в течение ночи и затем позволяли клеткам прикрепиться. Клетки культивировали в DMEM + 10% FCS при 37°C в 5% CO₂ и пересевали, используя раствор трипсин-ЭДТА. Жировые стромальные клетки выделяли из полученного при отсасывании жира материала человека согласно протоколу, описанному Zuk et al. (2001). Данные клетки содержали в DMEM + 10% FCS. Данные клетки вовлекали в остеогенное дифференцирование согласно протоколу, описанному Zuk et al. (2001). Хондроциты выделяли из фрагмента хряща человека, разрушая хрящ и обрабатывая его коллагеназой перед инкубированием в поддерживающей среде из DMEM + 10% FCS. Остеобласты выделяли из кости человека похожим способом и сохраняли в среде DMEM + 10% FCS, содержащей 50 мкг/мл аскорбиновой кислоты. Кондиционированную остеогенную среду готовили, используя среду, в которой росли остеогенные жировые стромальные клетки, в качестве части остеогенной среды для тех же самых клеток в следующей пересеянной культуре. Хондрогенную среду готовили согласно описанию Zuk et al. (2001).The dermis was crushed and digested with 0.01% collagenase in a mixture of DMEM + 10% FCS overnight and then allowed the cells to adhere. Cells were cultured in DMEM + 10% FCS at 37 ° C in 5% CO ₂ and subcultured using a trypsin-EDTA solution. Fat stromal cells were isolated from human material obtained by suctioning fat according to the protocol described by Zuk et al. (2001). These cells were contained in DMEM + 10% FCS. These cells were involved in osteogenic differentiation according to the protocol described by Zuk et al. (2001). Chondrocytes were isolated from a fragment of human cartilage, destroying the cartilage and treating it with collagenase before incubation in a maintenance medium from DMEM + 10% FCS. Osteoblasts were isolated from human bone in a similar manner and stored in DMEM + 10% FCS containing 50 μg / ml ascorbic acid. A conditioned osteogenic medium was prepared using the medium in which the osteogenic fat stromal cells grew as part of the osteogenic medium for the same cells in the next seeded culture. Chondrogenic medium was prepared as described by Zuk et al. (2001).

Получение подобной ткани конструкцииObtaining a similar construction fabric

Получение подобной ткани конструкции осуществляли при помощи культивирования макромассы, которое представляет собой новый способ по настоящему изобретению, ранее описанный в настоящем описании изобретения.Obtaining such a tissue construct was carried out using cultivation of macromass, which is a new method of the present invention, previously described in the present description of the invention.

Культивируемые клетки собирали, используя трипсин-ЭДТА. Их ресуспендировали в подходящем объеме среды и высевали в чашки для культивирования с диаметром лунки 3,5 см при плотности высевания приблизительно 10⁶ клеток на см² или в макромассовом подходящем диапазоне плотностей формирующих ткань клеток. Таким образом, предпочтительно, приблизительно всего 10⁷ клеток высевали в отдельную лунку шестилуночного планшета (площадь 9,6 см²) для образования отдельной ткани. Для меньших или больших по размеру подобных ткани конструкций общее количество высеянных клеток изменяли так, чтобы достичь плотности высевания, благоприятной для подобной ткани организации.Cultured cells were harvested using trypsin-EDTA. They were resuspended in a suitable volume of medium and plated in culture plates with a hole diameter of 3.5 cm at a seeding density of approximately 10 ⁶ cells per cm ² or in a suitable macromass density range for tissue-forming cells. Thus, preferably, approximately 10 ⁷ cells were plated in a separate well of a six-well plate (9.6 cm ^{2 area} ) to form a separate tissue. For smaller or larger tissue-like structures, the total number of seeded cells was varied so as to achieve a seeding density favorable to the tissue-like organization.

Гистологический анализHistological analysis

После формирования подобные ткани конструкции фиксировали и обрабатывали для гистологического анализа. Окрашивание Von Kossa и окрашивание альциановым синим осуществляли на соответствующих конструкциях ткани по настоящему изобретению, согласно способам, описанным Zuk и другими (2001) и Bancroft и другими (1994). Окрашивание масляным красным O осуществляли способом, описанным Bancroft и другими (1994). Окрашивание толуидином синим осуществляли, как указано ниже - после депарафинизации и гидратации срезов, их окрашивали в течение 1 минуты в 2% водном растворе толуидина синего, затем промывали в воде в течение 2-3 мин. Срезы затем дегидратировали в двух циклах 100% ацетоном, очищали в ксилоле и приготавливали препарат для исследования.After formation, tissue-like constructs were fixed and processed for histological analysis. Von Kossa staining and Alcian blue staining was carried out on the respective fabric constructs of the present invention, according to the methods described by Zuk and others (2001) and Bancroft and others (1994). Oil red O staining was performed according to the method described by Bancroft et al. (1994). Toluidine blue staining was carried out as follows: after dewaxing and hydration of the sections, they were stained for 1 minute in a 2% aqueous solution of toluidine blue, then washed in water for 2-3 minutes. The slices were then dehydrated in two cycles with 100% acetone, purified in xylene and the preparation was prepared for the study.

Другие гистологические процедуры выполняли в лаборатории гистопатологии в Sir Hurkisondas Nurrotamdas Hospital & Research Centre, Мумбаи Индия.Other histological procedures were performed at the histopathology laboratory at Sir Hurkisondas Nurrotamdas Hospital & Research Center, Mumbai India.

ИммуногистохимияImmunohistochemistry

Иммуноокрашивание коллагена типа I проводили на срезах залитой в парафин ткани, используя козье антитело против коллагена типа I и систему окрашивания ABC Santa Cruz Biotechnology, Санта-Круз, США.Type I collagen immunostaining was performed on sections of paraffin-embedded tissue using a goat anti-collagen type I antibody and ABC staining system Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, USA.

Жизнеспособность клеток в сформированных подобных ткани конструкцияхCell viability in formed tissue-like constructs

Массы ткани по настоящему изобретению крошили, расщепляли коллагеназой в количестве 0,5 мг/мл в бессывороточной среде DMEM в течение 15 мин и высвобожденные клетки повторно ресуспендировали в среде роста. Аликвоту окрашивали трипановым синим. Клетки высевали в колбу для культур, чтобы оценить жинзнеспособность.The tissue masses of the present invention were crushed, cleaved with collagenase in an amount of 0.5 mg / ml in serum-free DMEM medium for 15 min, and the released cells were re-resuspended in the growth medium. An aliquot was stained with trypan blue. Cells were plated in a culture flask in order to evaluate zhinnozhnost.

Анализ экспрессии геновGene Expression Analysis

Экспрессию генов в подобных ткани конструкциях, полученных из фибробластов кожи, остеогенных жировых стромальных клеток и хондроцитов анализировали при PCR с обратной транскриптазой. РНК экстрагировали из подобной ткани конструкции, используя тризол (Gibco-BRL, Гранд-Айленд, США). RT-PCR проводили, используя праймеры, специфичные для соответствующих генов, и систему Titan One-Tube RT-PCR (Roche, Мангейм, Германия).Gene expression in tissue-like constructs derived from skin fibroblasts, osteogenic fat stromal cells, and chondrocytes was analyzed by reverse transcriptase PCR. RNA was extracted from a tissue-like construct using trizole (Gibco-BRL, Grand Island, USA). RT-PCR was performed using primers specific for the respective genes and the Titan One-Tube RT-PCR system (Roche, Mannheim, Germany).

Приготовление геля коллаген + фибринPreparation of gel collagen + fibrin

Для приготовления геля коллаген + фибрин смешивали 134 мкл коллагена типа I из хвоста мыши rat tail collagen type (Sigma, Сент-Луис, США) в количестве 3,33 мг/мл в 0,1 N уксусной кислоты, 8 мкл 4N NaOH, 165 мкл фибриногена в количестве 28,8 мг/мл в 1X DMEM и 210 мкл тромбина в количестве 1,48 мг/мл в 1,66X DMEM. Смеси давали превратиться в гель в течение 2 часов при 37°C.To prepare the collagen + fibrin gel, 134 μl of type I collagen from rat tail collagen type mouse tail (Sigma, St. Louis, USA) was mixed in an amount of 3.33 mg / ml in 0.1 N acetic acid, 8 μl 4N NaOH, 165 μl of fibrinogen in an amount of 28.8 mg / ml in 1X DMEM and 210 μl of thrombin in an amount of 1.48 mg / ml in 1.66X DMEM. The mixture was allowed to gel for 2 hours at 37 ° C.

Формирование ткани при культивировании макромассы в желатиновом пористом материалеThe formation of tissue during the cultivation of macromass in a gelatinous porous material

Используемый желатиновый пористый материал представлял собой AbGel (Sri Gopal Krishna Labs. Pvt. Ltd, Мумбаи, Индия).The porous gelatin material used was AbGel (Sri Gopal Krishna Labs. Pvt. Ltd, Mumbai, India).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕRESULTS AND DISCUSSION

Формирование трехмерной подобной ткани организации и макроскопических подобных ткани конструкцийThe formation of three-dimensional tissue-like organization and macroscopic tissue-like designs

При культивировании макромассы формировали подобные ткани массы (ФИГ. 1) из фибробластов кожи в присутствии DMEM + 10% FCS в форме пласта, который либо самопроизвольно отделялся от поверхности роста, либо при аккуратном очищении тупым инструментом. Жировые стромальные клетки также формировали подобную ткани массу в DMEM + 10%-ый FCS, которая была отрицательно в отношении липидов окрашена масляным красным О. Так как это имело место, то для того чтобы получить возможно применимую ткань из жировых стромальных клеток, их дифференцировали в остеогенные клетки, которые после культивирования макромассы формировали схожий пласт, который может сжиматься в плотную массу после дополнительной инкубации после отсоединения. Хондроциты, выделенные из хряща человека, также формировали тканевой пласт при культивировании макромассы в DMEM + 10% FCS. Остеобласты, выделенные из кости человека, также формировали подобную ткани конструкцию при культивировании макромассы в DMEM + 10% FCS, после промывания от поддерживающей среды, содержащей аскорбиновую кислоту. Объединение клеток, по-видимому, играет важную роль при таком формировании подобной ткани конструкции, как замечено при расширенном формировании прироста из клеток и клеточной интеграции, показанной на ФИГ.2. Когда культуру макромассы фибробластов кожи увеличивали в размере, высевая клетки при упомянутой плотности отбора в чашку Петри диаметром 8,5 см, получали намного больший пласт. Таким образом, по-видимому, культуру макромассы можно непосредственно увеличить в размере по площади, чтобы получить настолько большую ткань, насколько необходимо. Фибробласты кожи также формировали пласт при культивировании макромассы в бессывороточной среде DMEM, но время формирования было больше, чем для DMEM, содержащей 10% FCS, в течение ночи по сравнению с 3-4 часами в среде, содержащей сыворотку. В среде, содержащей сыворотку, время формирования ткани из фибробластов кожи, из жировых стромальных клеток и остеогенных клеток, полученных из них, составляло приблизительно 4 часа и из хондроцитов составляло приблизительно 18 часов. Остеогенные клетки, полученные из жировых стромальных клеток, формировали подобную ткани массу в остеогенной среде, а также и в DMEM + 10% FCS, после промывания клеток для удаления остеогенной среды, содержащей аскорбиновую кислоту. Получение подобных ткани конструкций при культивировании макромассы успешно проводили в сосудах для культивирования диаметром от 0,75 см до 8,5 см. Можно экстраполировать, что культивирование макромассы в сосудах для культивирования с диаметром меньшим, чем 0,75 см, и большим, чем 8,5 см, привело бы к формированию меньших или больших подобных ткани конструкций, соответственно. Таким образом, размеры трехмерных подобных ткани конструкций можно варьировать.During the cultivation of macromass, similar tissue masses were formed (FIG. 1) from skin fibroblasts in the presence of DMEM + 10% FCS in the form of a layer, which either spontaneously separated from the growth surface, or with careful cleaning with a blunt instrument. Fat stromal cells also formed a tissue-like mass in DMEM + 10% FCS, which was negative for lipids stained with oil red O. Since this was the case, in order to obtain possibly usable tissue from fat stromal cells, they were differentiated into osteogenic cells, which after culturing macromass formed a similar layer, which can be compressed into a dense mass after additional incubation after disconnection. Chondrocytes isolated from human cartilage also formed a tissue layer during macromass cultivation in DMEM + 10% FCS. Osteoblasts isolated from human bones also formed a tissue-like construct when macromass was cultured in DMEM + 10% FCS, after washing from a support medium containing ascorbic acid. The cell association, apparently, plays an important role in such formation of a tissue-like construct, as seen in the expanded formation of cell growth and cell integration shown in FIG. 2. When the macromass culture of skin fibroblasts was increased in size, plating the cells at the mentioned density of selection in a Petri dish with a diameter of 8.5 cm, received a much larger layer. Thus, apparently, the macromass culture can be directly increased in size over the area to obtain as large a tissue as necessary. Skin fibroblasts also formed a layer during macromass cultivation in serum-free DMEM, but the formation time was longer than for DMEM containing 10% FCS overnight compared to 3-4 hours in serum-containing medium. In a serum-containing medium, the formation time of tissue from skin fibroblasts, from fat stromal cells and osteogenic cells obtained from them was approximately 4 hours and from chondrocytes was approximately 18 hours. Osteogenic cells derived from fat stromal cells formed a tissue-like mass in an osteogenic medium, as well as in DMEM + 10% FCS, after washing the cells to remove the osteogenic medium containing ascorbic acid. The preparation of tissue-like structures during the cultivation of macromass was successfully carried out in cultivation vessels with a diameter of 0.75 cm to 8.5 cm. It can be extrapolated that the cultivation of macromass in culture vessels with a diameter of less than 0.75 cm and greater than 8 , 5 cm, would result in the formation of smaller or larger fabric-like structures, respectively. Thus, the dimensions of three-dimensional fabric-like structures can be varied.

Хотя такие подобные ткани конструкции представляют собой не полностью сформированные ткани, они могут оказаться способными к стимулированию и участию в процессе заживления в организме, способом, аналогичным для полученных данных, что имплантация даже стволовых клеток или частично дифференцированных клеток (которые представляют собой не полностью сформированную ткань, но находятся в самом начале формирования ткани), может привести к восстановлению и регенерации (Kaji & Leiden, 2001).Although such tissue-like constructs are not fully formed tissues, they may be able to stimulate and participate in the healing process in the body, in a manner similar to the data obtained that implantation of even stem cells or partially differentiated cells (which are not fully formed tissue , but are at the very beginning of tissue formation), can lead to restoration and regeneration (Kaji & Leiden, 2001).

Было обнаружено, что явление формирования трехмерной подобной ткани массы при культивировании макромассы зависит от плотности высевания клеток. Для того чтобы исследовать, имело ли место формирование ткани при всех высоких плотностях или нет, фибробласты кожи высевали в диапазоне различных плотностей клеток на единицу площади. Обнаружено, что ощутимое формирование пласта имело место при примерно 3,33×10⁵ клеток на см², в то время как при плотности высевания 6,66×10⁴ клеток на см² (в пять раз меньше) или ниже, пласт ткани не формировался. Кроме того, формирование пласта ткани происходило при плотности высевания 3×10⁶ клеток на см², но не при 7×10⁶ клеток на см² или выше; при последней плотности высевания клеток только образовались кластеры на большом расстоянии друг от друга, но не формировалось когезивной массы ткани. Таким образом, формирование пласта ткани имело место при 3,33×10⁵ клеток на см² и при 3×10⁶ клеток на см², так же как и при всех величинах плотности, лежащих между данными двумя проверенными показателями. При проверенных величинах плотности выше или ниже данного диапазона не происходило формирование ткани. Подобные эксперименты были сделаны с нативными жировыми стромальными клетками и с хондроцитами, и результаты приведены в таблице. Как и в случае с фибробластами кожи, также существовала минимальная и максимальная плотность высевания для формирования подобной ткани конструкции для данных типов клеток, подобная плотности для фибробластов кожи. Такие данные указывают, что существует минимальная и максимальная плотность высевания клеток на единицу площади для формирования ткани при культивировании макромассы. Диапазон высоких значений плотности клеток, при которых происходит формирование ткани при культивировании макромассы, может отличаться для других непроверенных типов клеток.It was found that the phenomenon of the formation of a three-dimensional similar tissue mass during the cultivation of macromass depends on the density of seeding cells. In order to investigate whether tissue formation occurred at all high densities or not, skin fibroblasts were seeded in the range of different cell densities per unit area. It was found that a noticeable formation formation took place at about 3.33 × 10 ⁵ cells per cm ² , while at a seeding density of 6.66 × 10 ⁴ cells per cm ² (five times less) or lower, the tissue layer did not formed. In addition, the formation of a tissue layer occurred at a seeding density of 3 × 10 ⁶ cells per cm ² , but not at 7 × 10 ⁶ cells per cm ² or higher; at the last cell seeding density, only clusters were formed at a great distance from each other, but no cohesive tissue mass was formed. Thus, the formation of a tissue layer occurred at 3.33 × 10 ⁵ cells per cm ² and at 3 × 10 ⁶ cells per cm ² , as well as for all density values lying between these two tested indicators. At verified density values above or below this range, tissue formation did not occur. Similar experiments were done with native fat stromal cells and with chondrocytes, and the results are shown in the table. As with skin fibroblasts, there was also a minimum and maximum seeding density to form a tissue-like construct for these cell types, similar to that for skin fibroblasts. Such data indicate that there is a minimum and maximum density of cell seeding per unit area for tissue formation during macromass cultivation. The range of high cell densities at which tissue formation occurs during macromass cultivation may differ for other unverified cell types.

Более низкие плотности высевания клеток, используемые как показано в таблице, приводили к более тонким подобным ткани конструкциям, то есть имеющим более мелкие размеры в трех измерениях, в то время как используемые более высокие плотности высевания приводили к более толстым подобным ткани конструкциям, то есть имеющим большие размеры в трех измерениях. Таким образом, размеры трехмерных подобных ткани конструкций можно варьировать.The lower cell sowing densities used as shown in the table led to thinner tissue-like designs, i.e. having smaller dimensions in three dimensions, while the higher sowing densities used resulted in thicker tissue-like designs, i.e. having Large sizes in three dimensions. Thus, the dimensions of three-dimensional fabric-like structures can be varied.

Зависимость образования трехмерной подобной ткани конструкции от плотности высевания клетокDependence of the formation of a three-dimensional similar tissue structure on the seeding density of cells Общее количество клеток, помещен-ных на см² The total number of cells placed per cm ² Фибробласты кожиSkin fibroblasts Жировые стромальные клеткиFat stromal cells ХондроцитыChondrocytes 1,3x10⁴ 1.3x10 ⁴ -- -- -- 6,0x10⁴ 6.0x10 ⁴ -- -- -- 1x10⁵ 1x10 ⁵ -- -- 3,0x10⁵ 3.0x10 ⁵ ++ ++ +/-(очень слабо)+/- (very weak) 7x10⁵ 7x10 ⁵ ++ ++ ++ 1x10⁶ 1x10 ⁶ ++ ++ ++ 3x10⁶ 3x10 ⁶ ++ +/-(менее когезивные)+/- (less cohesive) ++ 7x10⁶ 7x10 ⁶ -- -- -- 10x10⁶ 10x10 ⁶ -- -- --

Гистология (фиг.3, 4, 5)Histology (figures 3, 4, 5)

Окрашивание гематоксилином и эозином срезов различных подобных ткани конструкций по настоящему изобретению показывает формирование трехмерной структурной организации и внеклеточного матрикса. Окрашивание трихромом по Массону конструкций, сформированных из фибробластов кожи, а также и нативных стромальных клеток и остеогенных стромальных клеток показывало синтез коллагена. Иммуноокрашивание коллагена типа I подобной ткани конструкции, полученной из фибробластов кожи, инкубированных в течение 10 дней, показывало положительное окрашивание для коллагена типа I (фиг.6). Таким образом, формирование внеклеточного матрикса, по-видимому, имеет место при формировании подобной ткани конструкции при использовании способа культивирования макромассы.Hematoxylin and eosin staining of sections of various tissue-like structures of the present invention shows the formation of a three-dimensional structural organization and extracellular matrix. Masson trichrome staining of structures formed from skin fibroblasts, as well as native stromal cells and osteogenic stromal cells, showed collagen synthesis. Immunostaining of type I collagen with a tissue-like construct obtained from skin fibroblasts incubated for 10 days showed positive staining for type I collagen (Fig. 6). Thus, the formation of the extracellular matrix, apparently, takes place during the formation of a similar tissue structure using the method of cultivation of macromass.

Выживаемость клеток в полученных подобных ткани конструкцияхCell survival in tissue-like constructs obtained

Клетки, повторно выделенные из тканей, полученных из фибробластов кожи и хондроцитов, обладали жизнеспособностью большей чем 98% по окрашиванию трипановым синим; клетки из тканевой массы из жировых стромальных клеток составляли примерно 90% жизнеспособных. Выделенные клетки и агрегаты помещали в планшеты, чтобы оценить повторный рост, и, как было обнаружено, они были жизнеспособны в каждом случае, как показано на фиг. 7, демонстрирующей клеточный рост агрегатов отделенного тканевого пласта фибробластов кожи.Cells re-isolated from tissues derived from skin fibroblasts and chondrocytes had a viability greater than 98% by trypan blue staining; cells from tissue mass from fat stromal cells accounted for approximately 90% of viable. Isolated cells and aggregates were placed on plates to evaluate re-growth, and were found to be viable in each case, as shown in FIG. 7, showing cell growth of aggregates of a separated tissue layer of skin fibroblasts.

Анализ экспрессии в подобных ткани конструкцияхAnalysis of expression in tissue-like constructs

Чтобы оценить, обладает ли пласт ткани, сформированный из фибробластов кожи, потенциалом в качестве заменителя кожи, анализировали экспрессию генов, которые, как известно, играют важную роль в процессе заживления раны кожи (фиг. 8). Коллаген I типа, коллагена III типа, фактор роста кератиноцитов, TGFβ1, фибронектин, васкулярный эндотелиальный фактор роста, танасцин-C и синдекан-2, как обнаружили, экспрессировались в пласте ткани, таким образом демонстрируя, что данный подобный ткани пласт, полученный из фибробластов кожи, обладает потенциалом в качестве заменителя кожи. Чтобы оценить, обладает ли подобная ткани конструкция, полученная из жировых стромальных клеток, потенциалом в качестве заменителя подобной кости ткани, анализировали экспрессию специфичных для кости генов. Подобная ткани конструкция, как было обнаружено, экспрессировала коллаген I типа, остеопонтин, рецептор паратиреоидного гормона, формообразующий кость белок 2, формообразующий кость белок 4, рецепторы формообразующего кость белка IA, IB и II, таким образом демонстрируя подобные кости свойства (фиг.9), в дополнение к фокальной кальцификации и фактическому формированию обломка кости, упомянутого ниже. Аналогичным образом подобную ткани конструкцию, полученную из хондроцитов, оценивали в отношении ее потенциала в качестве заменителя ткани хряща. Специфичные для хряща гены коллагена II типа, аггрекана и коллагена X типа, как обнаружили, экспрессировались, таким образом демонстрируя подобные хрящу свойства (фиг.10), в дополнение к формированию специфичного для хряща внеклеточного матрикса, как упомянуто ниже.To assess whether a tissue layer formed from skin fibroblasts has a potential as a substitute for the skin, the expression of genes, which are known to play an important role in the healing process of skin wounds, was analyzed (Fig. 8). Type I collagen, type III collagen, keratinocyte growth factor, TGFβ1, fibronectin, vascular endothelial growth factor, tanascin-C and syndecan-2 were found to be expressed in the tissue layer, thus demonstrating that this tissue-like layer derived from fibroblasts skin, has the potential as a substitute for skin. In order to evaluate whether a tissue-like construct derived from fatty stromal cells has potential as a substitute for bone-like tissue, expression of bone-specific genes was analyzed. A tissue-like construct was found to express type I collagen, osteopontin, parathyroid hormone receptor, bone-forming protein 2, bone-forming protein 4, bone-forming protein receptors IA, IB, and II, thus exhibiting bone-like properties (Fig. 9) , in addition to focal calcification and the actual formation of a bone fragment, mentioned below. Similarly, a tissue-like construct derived from chondrocytes was evaluated for its potential as a substitute for cartilage tissue. Cartilage specific genes of type II collagen, aggrecan, and type X collagen were found to be expressed, thus showing cartilage-like properties (Fig. 10), in addition to the formation of cartilage-specific extracellular matrix, as mentioned below.

Модуляция свойств подобных ткани конструкций посредством трансформирования формирующей ткань средыModulation of the properties of tissue-like structures by transforming the tissue-forming environment

При культивировании макромассы возможно заранее подогнать свойства ткани, полученной добавлением соответствующих компонентов среды или изменяя среду, поскольку, насколько было проверено, формирование ткани не зависит от условий среды, пока что-нибудь, что ингибирует организацию подобной ткани макромассы, не добавят в среду. Данный факт очевиден из формирования пласта ткани фибробластами кожи как в содержащий сыворотку, так и бессыворотчной среде, а также и из формирования ткани жировых стромальных клеток как в DMEM + FCS, так и в остеогенной среде, которая содержит дексаметазон и β-глицерофосфат. Таким образом, свойства формируемой ткани можно модулировать для того, чтобы придать необходимые свойства, изменяя формирующую ткань среду и/или питательную среду для клеток. Например, как представлено в данном изобретении, подобные кости свойства в виде фактического формирования кости были индуцированы в ткани, полученной из жировых стромальных клеток, при культивировании клеток и формировании подобной ткани конструкции в кондиционированной остеогенной среде по сравнению с одной только остеогенной средой, где не наблюдали никакого фактического формирования спикулы кости (фиг.11). Окрашивание Von Kossa тканевой массы, полученной из остеогенных стромальных клеток в присутствии кондиционированной остеогенной среды, показало фокальные области кальцификации, демонстрируя таким образом подобные кости свойства, тогда как конструкция, полученная из остеогенных стромальных клеток в некондиционированной остеогенной среде, не показало таких свойств.When cultivating macromass, it is possible to pre-adjust the properties of the tissue obtained by adding the appropriate components of the medium or changing the environment, since, as far as it has been verified, the formation of tissue does not depend on environmental conditions, until something that inhibits the organization of such tissue, macromass is added to the medium. This fact is obvious from the formation of a tissue layer by skin fibroblasts in both serum-containing and serum-free media, as well as from the formation of adipose stromal tissue tissue in both DMEM + FCS and in an osteogenic medium that contains dexamethasone and β-glycerophosphate. Thus, the properties of the formed tissue can be modulated in order to impart the necessary properties by changing the tissue-forming environment and / or the nutrient medium for the cells. For example, as presented in this invention, bone-like properties in the form of actual bone formation were induced in tissue derived from adipose stromal cells by culturing cells and forming a tissue-like structure in an air-conditioned osteogenic environment compared to an osteogenic environment alone, where no no actual bone spicule formation (FIG. 11). Von Kossa staining of tissue mass obtained from osteogenic stromal cells in the presence of conditioned osteogenic medium showed focal calcification regions, thus demonstrating bone-like properties, while a construct obtained from osteogenic stromal cells in an unconditioned osteogenic medium did not show such properties.

Другой пример такой модуляции представляет собой образование подобных ткани конструкций из хондроцитов в присутствии DMEM + 10% FCS или в присутствии хондрогенной среды, которая содержит 1% FCS и инсулин; и TGFβ1 в качестве индуцирующего образование хряща средства. Свойство наличия внеклеточного матрикса, характеристичного для фенотипа хряща, получили в подобной ткани конструкции, полученной в хондрогенной среде, в то время как конструкции, полученные в DMEM + 10% FCS, не обладали таким свойством. Это показано при окрашивании толуидином синим на фиг.12. Таким образом, даже если остается тот факт, что формирование ткани при культивировании макромассы не имеет определенных сложных требований к среде, такие определенные компоненты можно использовать в среде для того, чтобы модулировать свойства формируемой ткани. Это также следует из упомянутых выше результатов, что подобная ткани организация и макроскопические подобные ткани конструкции можно получить в присутствии различных сред культивирования, причем различные среды, представленные здесь, представляют собой примеры и не ограничивают настоящее изобретение данными примерами.Another example of such modulation is the formation of tissue-like structures from chondrocytes in the presence of DMEM + 10% FCS or in the presence of a chondrogenic medium that contains 1% FCS and insulin; and TGFβ1 as a cartilage inducing agent. The property of the presence of an extracellular matrix characteristic of the cartilage phenotype was obtained in a similar tissue construct obtained in a chondrogenic medium, while the construct obtained in DMEM + 10% FCS did not have this property. This is shown by staining with toluidine blue in Fig. 12. Thus, even if the fact remains that the formation of tissue during the cultivation of macromass does not have certain complex environmental requirements, such specific components can be used in the medium in order to modulate the properties of the formed tissue. It also follows from the above results that tissue-like organization and macroscopic tissue-like constructs can be obtained in the presence of different cultivation media, and the various media presented here are examples and do not limit the present invention to these examples.

Поверхность роста для культуры макромассыGrowth surface for macromass culture

Подобные ткани пласты, сформированные из клеток, размещенных на пластмассовой поверхности, имели тенденцию самопроизвольно отделяться и виться или свертываться, что нежелательно, так как однажды скатанный пласт не выправляется. Для ткани, создаваемой в качестве возможного заменителя кожи, необходимо оставаться прямой. Для этого культуру макромассы фибробластов кожи получали на фильтре Hybond-N (Amersham Pharmacia Biotech, Бакингемшир, Великобритания), помещенном в пластмассовую чашку. С таким изменением пласт, который сформировался, оставался прямым и прикрепленным к фильтру, так что, в будущем, его можно было бы применять на пораженной коже со стороны фильтра. Данный эксперимент демонстрирует, что возможно осуществить формирование ткани при культивировании макромассы на различных совместимых поверхностях для роста. Таким образом, в этом случае, пласт, полученный при культивировании макромассы, становится компонентом предполагаемого имплантата, который содержит нейлоновый фильтр, который служит поддерживающим слоем, и необходимость в нем не является необходимостью в качестве каркаса для подобной ткани организации клеток. Данный поддерживающий слой разработан не для того, чтобы интегрироваться в организм наряду с подобным коже пластом, и таким образом это не каркас, который стал бы частью организма, а поддерживающее устройство для манипуляций для использования подобного коже пласта. Такой поддерживающий слой был бы удален после заживления.Tissue-like formations formed from cells placed on a plastic surface tend to spontaneously separate and curl or curl, which is undesirable since once the rolled-up formation does not straighten. For tissue created as a possible substitute for the skin, it is necessary to remain straight. For this, a macromass culture of skin fibroblasts was obtained on a Hybond-N filter (Amersham Pharmacia Biotech, Buckinghamshire, UK), placed in a plastic cup. With this change, the layer that formed remained straight and attached to the filter, so that, in the future, it could be applied to the affected skin from the side of the filter. This experiment demonstrates that it is possible to carry out tissue formation by culturing macromass on various compatible growth surfaces. Thus, in this case, the layer obtained by culturing macromass becomes a component of the proposed implant, which contains a nylon filter that serves as a support layer, and the need for it is not necessary as a scaffold for such tissue organization cells. This support layer is not designed to integrate into the body along with a skin-like layer, and thus it is not a skeleton that would become part of the body, but a support device for manipulations to use a skin-like layer. Such a support layer would be removed after healing.

Подобная ткани конструкция в качестве компонента объектаFabric-like construction as a component of an object

Для того чтобы продемонстрировать, что подобную ткани конструкцию можно включить в состав объекта, чтобы она стала компонентом или частью (большего) объекта, фибробласты кожи высевали при культивировании макромассы, чтобы сформировать подобный ткани пласт, и затем после удаления среды культивирования, его покрывали гелевой смесью коллагена и фибрина. Затем позволяли осуществиться образованию геля. Затем, гель можно было поднять с подобным ткани пластом, прикрепленным к его одной стороне. Гистологический срез данного состава, в котором подобная ткани конструкция является компонентом, показан на фиг.13. Кроме гелей и пластов, другие матриксы, такие как пористые материалы или мембраны также могут поддерживать подобные ткани конструкции с одной стороны, прикрепляя их. Таким образом, подобную ткани организацию и макроскопические подобные ткани конструкции можно объединять с различными объектами, например, пластом или мембраной, гелем, пористым материалом или другими матриксами.In order to demonstrate that a tissue-like construct can be included in an object so that it becomes a component or part of a (larger) object, skin fibroblasts were seeded during macromass cultivation to form a tissue-like layer, and then after removing the culture medium, it was coated with a gel mixture collagen and fibrin. Then allowed the formation of the gel. Then, the gel could be raised with a tissue-like layer attached to one side of it. A histological section of this composition, in which a tissue-like construct is a component, is shown in FIG. In addition to gels and formations, other matrices such as porous materials or membranes can also support tissue-like structures on one side by attaching them. Thus, tissue-like organization and macroscopic tissue-like structures can be combined with various objects, for example, a layer or membrane, gel, porous material, or other matrices.

Микроскопическая трехмерная организация при культивировании макромассMicroscopic three-dimensional organization in the cultivation of macromass

Фибробласты кожи высевали на желатиновом пористом материале диаметром 3,5 см при плотности высевания примерно 2,5 × 10⁶ клеток на см² площади пористого материала в DMEM + 10% FCS. Такое применение способа культивирования макромассы при высокой плотности высевания клеток в отношении желатинового пористого материала привело к формированию микроскопических групп трехмерных подобных ткани организаций в пористом материале, как замечено при гистологической секции губки, показанной на фиг.14. Таким образом, способ культивирования макромассы можно использовать для того, чтобы также получить трехмерную подобную ткани организацию клеток на микроскопическом уровне, подобные ткани организации, становящиеся компонентом целостной структуры.Skin fibroblasts were seeded on a gelatinous porous material with a diameter of 3.5 cm at a seeding density of approximately 2.5 × 10 ⁶ cells per cm ² area of the porous material in DMEM + 10% FCS. Such application of the method of culturing macromass at a high cell seeding density with respect to a gelatinous porous material has led to the formation of microscopic groups of three-dimensional tissue-like organizations in the porous material, as seen in the histological section of the sponge shown in Fig. 14. Thus, the method of culturing macromass can be used to also obtain a three-dimensional tissue-like organization of cells at the microscopic level, similar tissue organization, becoming a component of a holistic structure.

ЗАКЛЮЧЕНИЕCONCLUSION

Новизна настоящего изобретения состоит в том факте, что культивирование при высокой плотности высевания клеток может привести к образованию целостной трехмерной подобной ткани организации клеток без каких-либо определенных средств, которые способствуют формированию ткани, чтобы инициировать такую организацию, и можно увеличить ее по площади, чтобы получить макроскопические трехмерные подобные ткани конструкции различных типов, кроме того в других важных характеристиках, таких как тот факт, что каркасный материал не используется или что нет необходимости в наличии определенных средств, которые способствуют формированию ткани/сложного состава среды, как подробно описано в данном описании. Авторы настоящего изобретения являются первыми, кто сообщил, что целостную трехмерную подобную ткани организацию клеток и макроскопические трехмерные подобные ткани конструкции различных типов можно получить при одном только культивировании при высокой плотности высевания клеток.The novelty of the present invention lies in the fact that cultivation at a high cell seeding density can lead to the formation of a holistic three-dimensional tissue-like cell organization without any specific means that contribute to the formation of tissue to initiate such organization, and you can increase its area so that to obtain macroscopic three-dimensional similar tissue designs of various types, in addition to other important characteristics, such as the fact that the frame material is not used or that there is no need for certain agents that contribute to the formation of tissue / complex composition of the medium, as described in detail in this description. The authors of the present invention are the first to report that a holistic three-dimensional tissue-like cell organization and macroscopic three-dimensional tissue-like constructs of various types can be obtained by culturing alone at a high cell seeding density.

Возможно, что другие мезодермальные клетки или клетки эндодермального или эктодермального происхождения могут также сформировать такую подобную ткани организацию при культивировании макромассы. Следовательно, подобная ткани организация и макроскопические подобные ткани конструкции, полученные при культивировании макромассы любого типа клеток млекопитающих, если они возможны, находятся в объеме данного изобретения, причем определяющая характеристика состоит в подобной ткани организации, достигнутой способом культивирования макромассы.It is possible that other mesodermal cells or cells of endodermal or ectodermal origin can also form such a tissue-like organization during macromass cultivation. Therefore, tissue-like organization and macroscopic tissue-like constructs obtained by culturing macromass of any type of mammalian cell, if possible, are within the scope of this invention, the defining characteristic being the tissue-like organization achieved by the method of cultivating macromass.

Тогда как макроскопические подобные ткани конструкции представляют собой предпочтительное осуществление данного изобретения, очевидно, что культура макромасы в меньшем масштабе, который составляет по площади культуры сколько-нибудь меньше, чем диаметр приблизительно 0,75 см, привела бы к меньшим подобным ткани организациям, уменьшающимся в размере до микроскопических размеров, поскольку масштаб культуры макромассы уменьшен. Микроскопическая подобная ткани организация при культивировании макромассы с высокой плотностью высевания клеток в упомянутой выше форме или в другой форме, такой как желатиновый пористый материал, описанный ранее, также находится, таким образом в объеме данного изобретения. Аналогично, подобные ткани конструкции можно получить при культивировании макромассы в сосудах для культивирования, с диаметром большим чем 8,5 см.While macroscopic tissue-like constructs are a preferred embodiment of the present invention, it will be appreciated that a macro-scale culture on a smaller scale, which is slightly smaller in size than about 0.75 cm in diameter, would result in smaller tissue-like organizations decreasing in size. size to microscopic dimensions, as the scale of the macromass culture is reduced. A microscopic tissue-like organization during the cultivation of macromass with a high density of seeding cells in the aforementioned form or in another form, such as the gelatinous porous material described previously, is also thus within the scope of this invention. Similarly, similar tissue structures can be obtained by culturing macromass in culture vessels with a diameter greater than 8.5 cm.

Таким образом, в предшествующем описании описаны определенные осуществления данного изобретения: представлены примеры, в отношении аспектов использования различных типов клеток, использования альтернативной поверхности для роста, использования изменений в среде, чтобы модулировать свойства формируемой ткани, увеличения объемов формирования ткани, размеров сосудов для культивирования, диапазона высоких значений плотности клеток при формировании ткани и получения предполагаемого имплантата, ткань которого, полученная при культивировании макромассы, является частью целого. Хотя, ясно показаны только описанные осуществления, они служат только в качестве примера или иллюстрации и не ограничивают изобретение.Thus, in the foregoing description, certain embodiments of the present invention are described: examples are presented with respect to aspects of using different types of cells, using an alternative surface for growth, using changes in the medium to modulate the properties of the tissue being formed, increasing the volume of tissue formation, the size of the culture vessels, the range of high values of cell density during tissue formation and obtaining the intended implant, the tissue of which obtained by culturing The development of macromass is part of the whole. Although only the described embodiments are clearly shown, they serve only as an example or illustration and do not limit the invention.

Следует понимать, что можно сделать различные модификации или замены по данному изобретению, которые будут находиться в рамках настоящего изобретения. Например, как предполагают авторы изобретения, одна такая модификация представляла бы собой захват или инкапсуляцию масс ткани, полученных при культивировании макромассы, в подходящий гель или матрикс, или другая такая модификация представляла бы собой конструкцию, в которой множество подобных ткани масс или пластов присоединяются или прикрепляются друг к другу при помощи некоторых средств. В таких конструкциях, подобная ткани конструкция, полученная при культивировании макромассы, в этом случае была бы компонентом целого заменителя. Упомянутое выше представляет собой другие способы, чем способы, представленные в результатах, которыми подобная ткани организация и конструкции, полученные при культивировании макромассы, могут являться компонентом объекта. Как демонстрируется в результатах, даже когда сохраняется, что подобная ткани организация клеток при культивировании макромассы не требует наличия никакого каркаса и также гистологически компетентные подобные ткани конструкции, полученные без помощи каркаса, каркас можно приложить для культивирования макромассы, например, в качестве альтернативной поверхности для роста, такой, что каркас становится частью целостного заменителя. Таким образом, трехмерная подобная ткани организация и гистологически компетентные подобные ткани конструкции данного изобретения можно создать без каркаса, но можно их комбинировать с подходящим каркасом, если это придает благоприятные свойства или преимущества относительно одной только подобной ткани конструкции. Другие модификации представляли бы собой использование других типов клеток, которые обладают свойством формировать подобную ткани массу при культивировании макромассы, использование другой совместимой поверхности для роста, чем описанные поверхности, другие изменения среды для модуляции и другие размеры при увеличении масштаба и так далее. Следовательно, данное описание настоящего изобретения не предназначено для того, чтобы ограничить данное изобретение точными иллюстративными описанными осуществлениями.It should be understood that various modifications or replacements of the present invention can be made, which will be within the scope of the present invention. For example, as the inventors suggest, one such modification would be the capture or encapsulation of tissue masses obtained by culturing macromasses in a suitable gel or matrix, or another such modification would be a structure in which a plurality of tissue-like masses or layers are attached or attached to each other using some means. In such structures, a tissue-like structure obtained by culturing macromass would be a component of the whole substitute in this case. The aforementioned are other methods than the methods presented in the results by which tissue-like organization and structures obtained by culturing macromass can be a component of an object. As demonstrated in the results, even when it is maintained that tissue-like cell organization during macromass cultivation does not require any scaffold and also histologically competent tissue-like constructs obtained without scaffold, the scaffold can be applied for macromass cultivation, for example, as an alternative surface for growth , such that the frame becomes part of a complete substitute. Thus, a three-dimensional tissue-like organization and histologically competent tissue-like constructs of the present invention can be created without a carcass, but can be combined with a suitable carcass if this confers favorable properties or advantages with respect to the fabric-like construction alone. Other modifications would be the use of other types of cells that have the property of forming a tissue-like mass during the cultivation of macromass, using a different compatible surface for growth than the described surfaces, other changes in the modulation medium and other sizes when zoomed out and so on. Therefore, this description of the present invention is not intended to limit the invention to the exact illustrative embodiments described.

УПОМЯНУТЫЕ ССЫЛКИMENTIONED LINKS

ПАТЕНТНЫЕ ДОКУМЕНТЫ СШАUS PATENT DOCUMENTS

54893045489304 Февраль 1996February 1996 Orgill и другиеOrgill and others 54609395460939 Октябрь 1995October 1995 Hansbrough и другиеHansbrough and others 56139825613982 Март 1997March 1997 GoldsteinGoldstein 2002012771120020127711 Сентябрь 2002September 2002 Kale и другиеKale and others 57233315723331 Март 1998March 1998 Tubo и другиеTubo and others

ДРУГИЕ ССЫЛКИOTHER LINKS

Abu-Absi SF, Friend JR, Hansen LK, Hu W (2002) Structural polarity and functional bile canaliculi in rat hepatocyte spheroids. Experimental Cell Research 274, 56-67.Abu-Absi SF, Friend JR, Hansen LK, Hu W (2002) Structural polarity and functional bile canaliculi in rat hepatocyte spheroids. Experimental Cell Research 274, 56-67.

Ahrens PB, Solursh M, Reiter RS (1977) Stage-related capacity for limb chondrogenesis in cell culture. Developmental Biology 60, 69-82.Ahrens PB, Solursh M, Reiter RS (1977) Stage-related capacity for limb chondrogenesis in cell culture. Developmental Biology 60, 69-82.

Baldwin SP, Saltzman WM (2001) Aggregation enhances catecholamine secretion in cultured cells. Tissue Engineering 7(2) 179-190.Baldwin SP, Saltzman WM (2001) Aggregation enhances catecholamine secretion in cultured cells. Tissue Engineering 7 (2) 179-190.

Bancroft JD, Cook HC (1994) Manual of Histological Techniques and their Diagnostic Application, Churchill Livingstone, Edinburgh, UK.Bancroft JD, Cook HC (1994) Manual of Histological Techniques and their Diagnostic Application, Churchill Livingstone, Edinburgh, UK.

Buttery LDK, Bourne S, Xynos JD, Wood H, Hughes FJ, Hughes SPF, Episkopou V, Polak JM (2001) Differentiation of osteoblasts and in vitro bone formation from murine embryonic stem cells. Tissue Engineering 7(1) 89-99.Buttery LDK, Bourne S, Xynos JD, Wood H, Hughes FJ, Hughes SPF, Episkopou V, Polak JM (2001) Differentiation of osteoblasts and in vitro bone formation from murine embryonic stem cells. Tissue Engineering 7 (1) 89-99.

Davies CdeL, Berk DA, Pluen A, Jain RK (2002) Comparison of IgG diffusion and extracellular matrix composition in rhabdomyosarcomas grown in mice versus in vitro as spheroids reveals the role of host stromal cells. British Journal of Cancer 86, 1639-1644.Davies CdeL, Berk DA, Pluen A, Jain RK (2002) Comparison of IgG diffusion and extracellular matrix composition in rhabdomyosarcomas grown in mice versus in vitro as spheroids reveals the role of host stromal cells. British Journal of Cancer 86, 1639-1644.

Denker AE, Nicoll SB, Tuan RS (1995) Formation of cartilage-like spheroids by micromass cultures of murine C3H10T1/2 cells upon treatment with transforming growth factor-beta 1. Differentiation 59(1) 25-34.Denker AE, Nicoll SB, Tuan RS (1995) Formation of cartilage-like spheroids by micromass cultures of murine C3H10T1 / 2 cells upon treatment with transforming growth factor-beta 1. Differentiation 59 (1) 25-34.

Downie SA, Newman SA (1994) Morphogenetic differences between fore and hind limb precartilage mesenchyme: Relation to mechanisms of skeletal pattern formation. Developmental Biology 162, 195-208.Downie SA, Newman SA (1994) Morphogenetic differences between fore and hind limb precartilage mesenchyme: Relation to mechanisms of skeletal pattern formation. Developmental Biology 162, 195-208.

Eaglstein WH, Falanga V (1997) Tissue engineering and the development of Apligraf®, a human skin equivalent. Clinical Therapeutics 19(5) 894-905.Eaglstein WH, Falanga V (1997) Tissue engineering and the development of Apligraf®, a human skin equivalent. Clinical Therapeutics 19 (5) 894-905.

Furukawa KS, Ushida T, Sakai Y, Suzuki M, Tanaka J, Tateishi T (2001) Formation of human fibroblast aggregates (spheroids) by rotational culture. Cell Transplantation 10, 441-445.Furukawa KS, Ushida T, Sakai Y, Suzuki M, Tanaka J, Tateishi T (2001) Formation of human fibroblast aggregates (spheroids) by rotational culture. Cell Transplantation 10, 441-445.

Hamamoto R, Yamada K, Kamihira M, Iijima S (1998) Differentiation and proliferation of primary rat hepatocytes cultured as spheroids. Journal of Biochemistry 124, 972-979.Hamamoto R, Yamada K, Kamihira M, Iijima S (1998) Differentiation and proliferation of primary rat hepatocytes cultured as spheroids. Journal of Biochemistry 124, 972-979.

Johnstone B, Hering TM, Caplan AI, Goldberg VM, Yoo JU (1998) In vitro chondrogenesis of bone marrow-derived mesenchymal progenitor cells. Experimental Cell Research 238, 265-272.Johnstone B, HeringTM, Caplan AI, Goldberg VM, Yoo JU (1998) In vitro chondrogenesis of bone marrow-derived mesenchymal progenitor cells. Experimental Cell Research 238, 265-272.

Kaji EH, Leiden JM (2001) Gene and stem cell therapies. Journal of the American Medical Association 285(5) 545-550.Kaji EH, Leiden JM (2001) Gene and stem cell therapies. Journal of the American Medical Association 285 (5) 545-550.

Kale S, Biermann S, Edwards C, Tarnowski C, Morris M, Long MW (2000) Three-dimensional cellular development is essential for ex vivo formation of human bone. Nature Biotechnology 18, 954-958.Kale S, Biermann S, Edwards C, Tarnowski C, Morris M, Long MW (2000) Three-dimensional cellular development is essential for ex vivo formation of human bone. Nature Biotechnology 18, 954-958.

Kim HW, Han CD (2000) An overview of cartilage tissue engineering. Yonsei Medical Journal 41(6) 766-773.Kim HW, Han CD (2000) An overview of cartilage tissue engineering. Yonsei Medical Journal 41 (6) 766-773.

Lang SH, Stark M, Collins A, Paul AB, Stower MJ, Maitland NJ (2001) Experimental prostate epithelial morphogenesis in response to stroma and three-dimensional Matrigel culture. Cell Growth & Differentiation 12, 631-640.Lang SH, Stark M, Collins A, Paul AB, Stower MJ, Maitland NJ (2001) Experimental prostate epithelial morphogenesis in response to stroma and three-dimensional Matrigel culture. Cell Growth & Differentiation 12, 631-640.

L'Heureux N, Pâquet S, Labbe R, Germain L, Auger FA (1998) A completely biological tissue-engineered human blood vessel. FASEB Journal 12, 47-56.L'Heureux N, Pâquet S, Labbe R, Germain L, Auger FA (1998) A completely biological tissue-engineered human blood vessel. FASEB Journal 12, 47-56.

Mackay AM, Beck SC, Murphy JM, Barry FP, Chichester CO, Pittenger MF (1998) Chondrogenic differentiation of cultured human mesenchymal stem cells from marrow. Tissue Engineering 4(4) 415-428.Mackay AM, Beck SC, Murphy JM, Barry FP, Chichester CO, Pittenger MF (1998) Chondrogenic differentiation of cultured human mesenchymal stem cells from marrow. Tissue Engineering 4 (4) 415-428.

McPherson JM, Tubo R (2000) Articular cartilage injury. In Principles of Tissue Engineering, 2^nd Edition, Academic Press, San Diego, USA, p. 697-709.McPherson JM, Tubo R (2000) Articular cartilage injury. In Principles of Tissue Engineering, 2 ^nd Edition, Academic Press, San Diego, USA, p. 697-709.

Michel M, L'Heureux N, Pouliot R, Xu W, Auger FA, Germain L (1999) Characterization of a new tissue-engineered human skin equivalent with hair. In vitro Cellular & Developmental Biology - Animal 35, 318-326.Michel M, L'Heureux N, Pouliot R, Xu W, Auger FA, Germain L (1999) Characterization of a new tissue-engineered human skin equivalent with hair. In vitro Cellular & Developmental Biology - Animal 35, 318-326.

Pollok JM, Kluth D, Cusick RA, Lee H, Utsunomiya H, Ma PX, Langer R, Broelsch CE, Vacanti JP (1998) Formation of spheroidal aggregates of hepatocytes on biodegradable polymers under continuous flow bioreactor conditions. Journal of Pediatric Surgery 8, 195-199.Pollok JM, Kluth D, Cusick RA, Lee H, Utsunomiya H, Ma PX, Langer R, Broelsch CE, Vacanti JP (1998) Formation of spheroidal aggregates of hepatocytes on biodegradable polymers under continuous flow bioreactor conditions. Journal of Pediatric Surgery 8, 195-199.

Service RF (2000) Tissue engineers build new bone. Science 289, 1498-1500.Service RF (2000) Tissue engineers build new bone. Science 289, 1498-1500.

Shinji T, Koide N, Tsuji T (1988) Glycosaminoglycans partially substitute for proteoglycans in spheroid formation of adult rat hepatocytes in primary culture. Cell Structure & Function 13, 179-188.Shinji T, Koide N, Tsuji T (1988) Glycosaminoglycans partially substitute for proteoglycans in spheroid formation of adult rat hepatocytes in primary culture. Cell Structure & Function 13, 179-188.

Takezawa T, Mori Y, Yonaha T, Yoshizato К (1993) Characterization of morphology and cellular metabolism during the spheroid formation by fibroblasts. Experimental Cell Research 208, 430-441.Takezawa T, Mori Y, Yonaha T, Yoshizato K (1993) Characterization of morphology and cellular metabolism during the spheroid formation by fibroblasts. Experimental Cell Research 208, 430-441.

Yamada K, Kamihira M, Hamamoto R, Iijima S (1998) Efficient induction of hepatocyte spheroids in a suspension culture using a water-soluble synthetic polymer as an artificial matrix. Journal of Biochemistry 123, 1017-1023.Yamada K, Kamihira M, Hamamoto R, Iijima S (1998) Efficient induction of hepatocyte spheroids in a suspension culture using a water-soluble synthetic polymer as an artificial matrix. Journal of Biochemistry 123, 1017-1023.

Yoon Y, Oh C, Kim D, Lee Y, Park J, Huh T, Kang S, Chun J (2000) Epidermal growth factor negatively regulates chondrogenesis of mesenchymal cells by modulating the protein kinase C-α, Erk-1, and p38 МАРК signaling pathways. Journal of Biological Chemistry 275(16) 12353-12359.Yoon Y, Oh C, Kim D, Lee Y, Park J, Huh T, Kang S, Chun J (2000) Epidermal growth factor negatively regulates chondrogenesis of mesenchymal cells by modulating the protein kinase C-α, Erk-1, and p38 MARK signaling pathways. Journal of Biological Chemistry 275 (16) 12353-12359.

Zuk PA, Zhu M, Mizuno H, Huang J, Futrell JW, Katz AJ, Benhaim P, Lorenz HP, Hedrick MH (2001) Multilineage cells from human adipose tissue: implications for cell-based therapies. Tissue Engineering 7(2) 211-228.Zuk PA, Zhu M, Mizuno H, Huang J, Futrell JW, Katz AJ, Benhaim P, Lorenz HP, Hedrick MH (2001) Multilineage cells from human adipose tissue: implications for cell-based therapies. Tissue Engineering 7 (2) 211-228.

Claims

1. A method of obtaining a living organization of cells, similar to tissue, that is, a macromass culture, including three-dimensional structures like tissues, without the help of a framework or a foreign matrix, comprising:

a cultivation system in which cells are plated at a high density per unit area of a culture vessel in the range of 3.33 × 10 ⁵ to 3 × 10 ⁶ cells per cm ² , resulting in a three-dimensional tissue-like formation, or organization of cells, without the help of any tissue-promoting agents, including tissue-forming-inducing chemicals, tissue-forming-inducing growth factors, a substrate other than unmodified tissue culture plastic, alternating cultures; and

obtaining tissue-like constructs where the cells are mesodermal cells.

2. The method according to claim 1, in which the cells are selected from fibroblast cells, including skin fibroblasts, osteoblasts, fat stromal cells, osteogenic cells derived from fat stromal cells, and chondrocytes.

3. The method according to claim 2, in which the fibroblast cells are obtained from human skin tissue, chondrocytes are obtained from human cartilage tissue, osteoblasts are obtained from human bone tissue and fat stromal cells are obtained from human liposuction material.

4. The method according to claim 1, comprising:

the formation of a tissue-like formation from cells including human fibroblast cells of mesenchymal origin, and a tissue-like formation does not contain a synthetic or natural foreign matrix and is cellular, so that it is capable of producing growth factors and other proteins.

5. A tissue-like cell organization obtained by the method according to any one of claims 1 to 4, wherein all the seeded cells are combined into a single tissue-like organization without any separate nodules.

6. A tissue-like cell organization according to claim 5, including macroscopic three-dimensional structures for use as substitutes for tissue for implantation, for wound healing, as in vitro models for testing drugs and the like, obtained from cells of fibroblasts of mesenchymal origin, including:

a putative equivalent of skin derived from skin fibroblasts, a putative substitute with bone-like properties, obtained from osteogenic cells derived from fat stromal cells, and a putative cartilage replacement made from chondrocytes.

7. A tissue-like cell organization according to claim 5, which is three-dimensional in nature and encompasses three-dimensional macroscopic structures like tissues.

8. A tissue-like cell organization according to claim 6, obtained from various types of cells, including:

skin fibroblasts;

fat stromal cells;

osteogenic cells derived from fat stromal cells;

chondrocytes and osteoblasts.

9. A tissue-like cell organization according to claim 6, which is three-dimensional and which has flexibility with respect to sizes, including various sizes in three dimensions;

larger or smaller tissue-like constructs obtained by increasing or decreasing macromass cultivation; and a variable size or scale when changing the number of cells used to obtain the seeding density within the range favorable for macromass tissue-forming density values, with an increase or decrease in the cultivation of macromass.

10. The tissue-like cell organization of claim 6, having flexibility with respect to the culture medium used, wherein the tissue-like cell organization is formed in the presence of different culture media, different growth media and / or tissue formation media; and

the properties of a tissue-like cell organization are modulated by incorporating the components into the growth and / or tissue formation medium, provided that the addition of these components does not adversely affect tissue formation, or

the environment of the cells is subjected to changes, provided that this change in the environment does not negatively affect tissue formation.

11. The tissue-like cell organization of claim 6, wherein the tissue-like constructs are obtained in culture vessels of any shape with a flat or rounded bottom.

12. The tissue-like cell organization of claim 5, wherein the macroscopic three-dimensional structures are similar to a formation.

13. A tissue-like cell organization according to claim 5, wherein the macroscopic three-dimensional structure has a cell density ranging from 3.33 × 10 ⁵ to 3 × 10 ⁶ cells per cm ² .