RU2744732C1

RU2744732C1 - Biocomposite spheroid for bone repair and method of its preparation

Info

Publication number: RU2744732C1
Application number: RU2020113665A
Authority: RU
Inventors: Алексей Вячеславович Ковалев; Ольга Сергеевна Зайцева; Михаил Михайлович Сморчков; Сергей Александрович Родионов
Priority date: 2020-06-05
Filing date: 2020-06-05
Publication date: 2021-03-15

Abstract

FIELD: medicine.

SUBSTANCE: group of inventions relates to the field of medicine and namely to tissue engineering and regenerative medicine. A method for producing a graft based on cell spheroids and a graft for repair of a person's bone obtained in accordance with the method are disclosed. The method includes the isolation of cells from the bone marrow of a person, their cultivation in an adhesive culture, followed by transfer to agarose wells simultaneously with the obtained partially demineralized allogeneic bone particles, where the cells aggregate around the demineralized allogeneic bone particles into biocomposite-containing cell spheroids.

EFFECT: inventions provide a graft in the form of tissue spheroids from autologous multipotent mesenchymal stromal cells of the bone marrow of a person with a fragment of crushed partially demineralized allogeneic bone in the center of this tissue-engineered structure having pronounced regenerative potential and osteinductive properties for bone repair.

12 cl, 1 dwg, 1 ex

Description

Область техникиTechnology area

Изобретение относится к области медицины, а именно к тканевой инженерии, регенеративной медицине, пластической хирургии, стоматологии, травматологии и ортопедии.The invention relates to medicine, namely to tissue engineering, regenerative medicine, plastic surgery, dentistry, traumatology and orthopedics.

Уровень техникиState of the art

Одной из актуальных проблем медицины является костная регенерация, особый практический интерес представляют дефекты костей превышающие критические размеры - это тот объем утраченной ткани, который организм человека не способен самостоятельно регенерировать. Трансплантация костной ткани или костнопластических материалов стоит на втором месте после переливания крови. Регенерация по трансплантату или костнопластическому материалу является длительным процессом, растягивающимся на многие месяцы и годы, требующим длительной и болезненной стабилизации костных отломков, часто иммобилизации конечности, для восстановления функций поврежденной части опорно-двигательного аппарата требуется много времени и далеко не всегда удается добиться полной реабилитации и избежать инвалидизации пациента.One of the urgent problems of medicine is bone regeneration; bone defects exceeding critical dimensions are of particular practical interest - this is the volume of lost tissue that the human body is not able to regenerate on its own. Transplantation of bone tissue or osteoplastic materials is in second place after blood transfusion. Regeneration using a graft or bone graft material is a long process, stretching for many months and years, requiring long-term and painful stabilization of bone fragments, often immobilization of a limb, it takes a lot of time to restore the functions of the damaged part of the musculoskeletal system and it is not always possible to achieve complete rehabilitation and avoid patient disability.

Одной из стратегий клеточной терапии является использование мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток костного мозга или собственных стромальных клеток костного мозга. Человеческие клетки относительно легко получить из аспирата костного мозга, сама аспирация костного мозга - малотравматичное вмешательство, которое может производиться без разрезов и под местной анестезией. Эти клетки относительно легко размножаются в культуре в условиях, при которых они сохраняют возможность к дифференцировке в клеточные линии, состоящие из остеобластов, адипоцитов, хондробластов. Одним из важнейших условий экспансии этих клеток является быстрая пролиферация с максимальным сохранением своей мультипотентности - пассирование распластанных на дне флакона клеток в малой плотности монослоя. Известно, что несмотря на большой пролиферативный потенциал, клетки стромы костного мозга при культивировании в стандартных условиях, при использовании ксеногенных, в том числе фетальных сывороток, постепенно утрачивают свои пролиферативные способности и способности к дифференцировке прежде всего в адипоциты и хондроциты. One of the strategies of cell therapy is the use of multipotent mesenchymal bone marrow stromal cells or bone marrow's own stromal cells. Human cells are relatively easy to obtain from bone marrow aspirates; bone marrow aspiration itself is a low-traumatic intervention that can be performed without incisions and under local anesthesia. These cells multiply relatively easily in culture under conditions under which they retain the ability to differentiate into cell lines consisting of osteoblasts, adipocytes, chondroblasts. One of the most important conditions for the expansion of these cells is rapid proliferation with maximum preservation of their multipotency - passage of cells spread out on the bottom of the bottle in a low monolayer density. It is known that, despite the large proliferative potential, the cells of the bone marrow stroma, when cultured under standard conditions, when using xenogenic, including fetal sera, gradually lose their proliferative abilities and the ability to differentiate primarily into adipocytes and chondrocytes.

Клеточная терапия при костной патологии предлагает персонифицированное лечение для устранения дефектов скелетных тканей, возникающих в результате травм, неэффективного заживления повреждений или врожденных дефектов. Тем не менее, большинство методов клеточной терапии достигли ограниченного успеха на сегодняшний день. Обычно вводимые в растворе в виде монодисперсных клеток (суспензии), трансплантированные клетки быстро гибнут или недостаточно долго задерживаются в месте трансплантации, иногда мигрируя в окружающие мягкие ткани, поэтому их предполагаемые эффекты ограничиваются несколькими днями. Cellular therapy for bone pathology offers personalized treatment for the elimination of defects in skeletal tissue resulting from trauma, ineffective healing of injuries or birth defects. However, most cell therapies have met with limited success to date. Usually introduced in solution in the form of monodisperse cells (suspensions), the transplanted cells die quickly or do not stay long enough at the transplantation site, sometimes migrating into the surrounding soft tissues, so their expected effects are limited to a few days.

Для систем открытой трансплантации стромальных клеток костного мозга (СККМ) необходимым компонентом успешного остеогенеза является использование трансплантационного носителя и его определенные характеристики. Точно установлено, что остеогенез не происходит при инъецировании суспензии костного мозга подкожно и внутримышечно и при имплантации ММСК КМ (мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток костного мозга) в виде агрегатов клеток без носителя (Goshima J, Goldberg VM, Caplan Al (1991). The osteogenic potential of culture expanded rat marrow mesenchymal cells assayed in vivo in calcium phosphate ceramic blocks. Clin Orthop 262:298-311. Yoshikawa T, Ohgushi H, Tamai S (1996). Immediate bone forming capability of prefabricated osteogenic hydroxyapatite. I Biomed Mater Res 32:481-492).For systems of open transplantation of bone marrow stromal cells (BMSC), a necessary component of successful osteogenesis is the use of a transplant carrier and its specific characteristics. It has been clearly established that osteogenesis does not occur when a bone marrow suspension is injected subcutaneously and intramuscularly and when MMSC BM (multipotent mesenchymal bone marrow cells) are implanted in the form of cell aggregates without a carrier (Goshima J, Goldberg VM, Caplan Al (1991). The osteogenic potential of culture expanded rat marrow mesenchymal cells assayed in vivo in calcium phosphate ceramic blocks. Clin Orthop 262: 298-311. Yoshikawa T, Ohgushi H, Tamai S (1996). Immediate bone forming capability of prefabricated osteogenic hydroxyapatite. I Biomed Mater Res 32 : 481-492).

Крайне важно, для образования кости трансплантированным СККМ требуется наличие организованного субстрата, с которым они могут взаимодействовать - прикрепляться и пролиферировать в течение достаточно длительного периода для обеспечения дифференцировки и остеогенеза. Подчеркнем, что для успешного формирования кости из культивированных стромальных клеток костного мозга, необходимо обеспечить контакт с носителем - деминерализованным костным матриксом или кристаллами гидроксиаппатита не менее нескольких недель, чтобы обеспечить адекватное распространение и дифференциацию необходимую для начала остеогенеза. Из используемых на сегодня носителей для трансплантации СККМ наиболее успешными оказались конструкции на основе гидроксиапатита (Krebsbach PH, Kuznetsov SA, Robey BP, Robey PG Bone Marrow Stromal Cells: Characterization and Clinical Application // Critical Reviews in Oral Biology & Medicine. - 1999. - V. 10, N. 2. - p. 165-181).It is extremely important that for bone formation, transplanted BSCs require an organized substrate with which they can interact - attach and proliferate for a sufficiently long period to ensure differentiation and osteogenesis. We emphasize that for successful bone formation from cultured bone marrow stromal cells, it is necessary to provide contact with the carrier - demineralized bone matrix or hydroxyapatite crystals for at least several weeks in order to ensure adequate distribution and differentiation necessary for the onset of osteogenesis. Hydroxyapatite-based constructs proved to be the most successful of the carriers used for SCBM transplantation (Krebsbach PH, Kuznetsov SA, Robey BP, Robey PG Bone Marrow Stromal Cells: Characterization and Clinical Application // Critical Reviews in Oral Biology & Medicine. - 1999. - V. 10, N. 2. - p. 165-181).

Функции мезенхимальных стромальных клеток костного мозга, изучаются в сформированных из них сфероидах (C.S. Ong, X. Zhou, J. Han, C.Y. Huang, A. Nashed, S. Khatri, G. Mattson, T. Fukunishi, H. Zhang, N. Hibino, In vivo therapeutic applications of cell spheroids, Biotechnol Adv 36(2) (2018) 494-505).The functions of bone marrow mesenchymal stromal cells are studied in the spheroids formed from them (CS Ong, X. Zhou, J. Han, CY Huang, A. Nashed, S. Khatri, G. Mattson, T. Fukunishi, H. Zhang, N. Hibino, In vivo therapeutic applications of cell spheroids, Biotechnol Adv 36 (2) (2018) 494-505).

Эти клетки обычно культивируют в остеогенных или хондрогенных средах, когда желательно нарастить массу остеобластов или хондроцитов для восстановления костной или хрящевой тканей. Есть мнение, что культивирование в условиях гипоксии увеличивает выживаемость и приживление сфероидов при пересадке реципиенту, что приводит к более эффективному остеогенезу (S.S. Ho, B.P. Hung, N. Heyrani, M.A. Lee, J.K. Leach, Hypoxic preconditioning of mesenchymal stem cells with subsequent spheroid formation accelerates repair of segmental bone defects, Stem Cells 36(9) (2018) 1393-1403). These cells are usually cultured in osteogenic or chondrogenic media when it is desired to increase the mass of osteoblasts or chondrocytes for bone or cartilage repair. It is believed that cultivation under hypoxic conditions increases the survival rate and engraftment of spheroids during transplantation to a recipient, which leads to more effective osteogenesis (SS Ho, BP Hung, N. Heyrani, MA Lee, JK Leach, Hypoxic preconditioning of mesenchymal stem cells with subsequent spheroid formation accelerates repair of segmental bone defects, Stem Cells 36 (9) (2018) 1393-1403).

После агрегации клеток в сфероиды часто используются добавки в питательные среды для 3D культур - различные цитокины или индукторы дифференцировки в течение продолжительного периода времени культивирования для получения и последующей трансплантации сфероидов, состоящих из дифференцированных клеток. Клетки внутри сфероидов демонстрируют больший остеогенный потенциал, по сравнению с индукцией органотипических признаков у клеток 2D однослойных культуры и только с последующим образованием из них сфероидов (S.S. Ho, A.T. Keown, B. Addison, J.K. Leach, Cell migration and bone formation from mesenchymal stem cell spheroids in alginate hydrogels are regulated by adhesive ligand density, Biomacromolecules 18(12) (2017) 4331-4340.]. В этом примере сфероиды выращивались следующим способом. МСК индуцировали остеогенно либо в монослое, либо в виде сфероидов. Для индукции монослоя, МСК были высеяны в количестве 5000 клеток/см² в колбах с культурой и поддерживались в остеогенных средах (среды роста, содержащие стандартные остеогенные добавки 10 мМ бета-глицерофосфат, 50 мкм г/мл аскорбат-2-фосфат, и 100 нМа дексаметазон) в течение 12 дней. Затем МСК были трипсинизированы и сформированы в сфероиды из 15000 МСК в остеогенной среде с использованием метода принудительной агрегации. Планшеты выдерживали в неподвижном состоянии в стандартном инкубаторе в течение 48 часов, чтобы обеспечить агрегацию клеток в сфероиды. Для индукции костных признаков МСК сначала формировали в сфероиды в остеогенной среде и переносили в 6-луночные планшеты, содержащие 2 мл 1,5% агарозы, для предотвращения адгезии к пластику для тканевых культур. Сфероиды культивировали в остеогенной среде в течение дополнительных 12 дней, в результате чего общий период остеоиндукции составлял 14 дней для обоих состояний. Однако, у описанного метода биофабрикации сфероидов есть целый ряд недостатков. Во-первых, более крупные растворимые молекулы, такие как факторы роста, не проникают равномерно через весь сфероид из-за радиальных различий в клеточном фенотипе и накоплении внеклеточного матрикса, что приводит к неравномерной дифференцировке клеток в составе сфероида. Во-вторых, после того, как сфероиды удалены из питательных сред, в составе которых эти цитокины, костный фенотип теряется в течение нескольких дней. After cell aggregation into spheroids, additives are often used in nutrient media for 3D cultures - various cytokines or differentiation inducers for an extended period of cultivation time to obtain and subsequent transplantation of spheroids consisting of differentiated cells. The cells inside the spheroids show a greater osteogenic potential compared to the induction of organotypic traits in 2D monolayer culture cells and only with the subsequent formation of spheroids from them (SS Ho, AT Keown, B. Addison, JK Leach, Cell migration and bone formation from mesenchymal stem cell spheroids in alginate hydrogels are regulated by adhesive ligand density, Biomacromolecules 18 (12) (2017) 4331-4340.] In this example, spheroids were grown in the following manner: MSCs were induced osteogenically either in a monolayer or as spheroids. For monolayer induction, MSCs were seeded at 5000 cells / cm ² in culture flasks and maintained in osteogenic media (growth media containing standard osteogenic additives 10 mM beta-glycerophosphate, 50 μm g / ml ascorbate-2-phosphate, and 100 nMa dexamethasone) for 12 days Then MSCs were trypsinized and formed into spheroids of 15000 MSCs in an osteogenic medium using the forced aggregation method. immobile in a standard incubator for 48 hours to allow the cells to aggregate into spheroids. To induce bone signs, MSCs were first formed into spheroids in an osteogenic medium and transferred to 6-well plates containing 2 ml of 1.5% agarose to prevent adhesion to tissue culture plastic. The spheroids were cultured in osteogenic medium for an additional 12 days, resulting in a total osteoinduction period of 14 days for both conditions. However, the described method of biofabrication of spheroids has a number of disadvantages. First, larger soluble molecules, such as growth factors, do not evenly penetrate the entire spheroid due to radial differences in cellular phenotype and extracellular matrix accumulation, which leads to uneven differentiation of cells within the spheroid. Second, after the spheroids are removed from the nutrient media containing these cytokines, the bone phenotype is lost within a few days.

Для устранения этих недостатков в состав сфероидов включали микрочастицы, нагруженные факторами роста, которые постепенно выделяются в межклеточную среду. Чтобы решить эту проблему, была разработана система доставки факторов роста на основе микрочастиц для обеспечения эндохондрального окостенения в агрегатах мезенхимальных стволовых клеток (hMSC), полученных из костного мозга человека. Постепенное высвобождение растворимых трансформирующего фактора роста-β1 (TGF-β1) и костного морфогенетического белка-2 (BMP-2) из микрочастиц при различных определенных временных параметрах приводил к различным степеням выраженности хондрогенеза и остеогенеза, что доказывалось изменением содержания специфическим для хряща гликозаминогликаном и кальция - для костной ткани. Время, в течение которого лучше всего индуцировалась эндохондральная оссификация, использовалось для разработки системы контролируемой доставки на основе микрочастиц для TGF-β1 и BMP-2. Желатиновые микрочастицы, способные к относительно быстрому высвобождению TGF-β1, и микрочастицы гидроксиапатита с минеральным покрытием, обеспечивающие более длительное высвобождение BMP-2, затем включали в агрегаты человеческих МСК и культивировали в течение 5 недель после заранее определенного временного курса для последовательного действия этих цитокинов. По сравнению с клетками в 2D культуре, сфероидами, обработанные экзогенными факторами роста, сфероиды с включенными в них микрочастицами, нагруженными TGF-β1 и BMP-2, демонстрировали усиление хондрогенеза и активность щелочной фосфатазы на второй неделе и большую степень минерализации к пятой неделе. Для подтверждения признаков костной и хрящевой ткани осуществляли окрашивание для коллагена типов I и II, остеопонтин и остеокальцин доказали наличие хряща и кости. Эта система, включенная в микрочастицы, имеет потенциал в качестве легко имплантируемой терапии для заживления дефектов кости без необходимости длительного хондрогенного праймирования in vitro (Dang PN, Dwivedi N, Phillips LM, Yu X, Herberg S, Bowerman C, Solorio LD, Murphy WL, Alsberg E. Controlled Dual Growth Factor Delivery From Microparticles Incorporated Within Human Bone Marrow-Derived Mesenchymal Stem Cell Aggregates for Enhanced Bone Tissue Engineering via Endochondral Ossification. Stem Cells Translational Medicine, 23 Dec 2015, 5(2):206-217).To eliminate these shortcomings, microparticles loaded with growth factors, which are gradually released into the intercellular environment, were included in the composition of the spheroids. To address this problem, a microparticle-based growth factor delivery system has been developed to provide endochondral ossification in human bone marrow-derived mesenchymal stem cell (hMSC) aggregates. The gradual release of soluble transforming growth factor-β1 (TGF-β1) and bone morphogenetic protein-2 (BMP-2) from microparticles at different specific time parameters led to different degrees of chondrogenesis and osteogenesis, which was proved by a change in the content of cartilage-specific glycosaminoglycan and calcium - for bone tissue. The time during which endochondral ossification was best induced was used to develop a microparticle controlled delivery system for TGF-β1 and BMP-2. Gelatin microparticles capable of relatively rapid release of TGF-β1 and mineral-coated hydroxyapatite microparticles providing longer release of BMP-2 were then incorporated into human MSC aggregates and cultured for 5 weeks after a predetermined time course for sequential action of these cytokines. Compared to cells in 2D culture, spheroids treated with exogenous growth factors, spheroids with incorporated microparticles loaded with TGF-β1 and BMP-2 showed increased chondrogenesis and alkaline phosphatase activity in the second week and a greater degree of mineralization by the fifth week. To confirm the signs of bone and cartilage tissue, staining was performed for collagen types I and II, osteopontin and osteocalcin proved the presence of cartilage and bone. This microparticulate system has the potential as an easily implantable therapy for healing bone defects without the need for long-term chondrogenic priming.in vitro (Dang PN, Dwivedi N, Phillips LM, Yu X, Herberg S, Bowerman C, Solorio LD, Murphy WL, Alsberg E. Controlled Dual Growth Factor Delivery From Microparticles Incorporated Within Human Bone Marrow-Derived Mesenchymal Stem Cell Aggregates for Enhanced Bone Tissue Engineering via Endochondral Ossification. Stem Cells Translational Medicine, 23 Dec 2015, 5 (2): 206-217).

Чтобы продлить остеогенную дифференцировку, адсорбировали рекомбинантный человеческий костный морфогенетический белок-2 (BMP-2) на наночастицах гидроксиапатита (HAp) и включили их в сфероиды. В этих условиях сфероиды проявляли более пространственно однородную остеогенную дифференцировку по всему сфероиду и сохраняли их дифференцировку после удаления растворимых сигналов [J. Whitehead, A. Kothambawala, J. Kent Leach, Morphogen delivery by osteoconductive nanoparticles instructs stromal cell spheroid phenotype, Advanced Biosystems 0(0) (2019) 1900141].To prolong osteogenic differentiation, recombinant human bone morphogenetic protein-2 (BMP-2) was adsorbed onto hydroxyapatite (HAp) nanoparticles and incorporated into spheroids. Under these conditions, spheroids showed more spheroidally homogeneous osteogenic differentiation throughout the spheroid and retained their differentiation after removal of soluble signals [J. Whitehead, A. Kothambawala, J. Kent Leach, Morphogen delivery by osteoconductive nanoparticles instructs stromal cell spheroid phenotype, Advanced Biosystems 0 (0) (2019) 1900141].

Известно также, что загружали биоминерализованные полимерные микрочастицы адсорбированным BMP-2, чтобы стимулировать остеогенную дифференцировку, или микрочастицы, нагружали TGF-1, чтобы способствовать формированию хрящевого фенотипа. Включение биоматериалов в сфероиды является перспективным методом для равномерного и постоянного действия дифференцирующих факторов на клетки в составе сфероидов (P.N. Dang, N. Dwivedi, L.M. Phillips, X.H. Yu, S. Herberg, C. Bowerman, L.D. Solorio, W.L. Murphy, E. Alsberg, Controlled dual growth factor delivery from microparticles incorporated within human bone marrow-derived mesenchymal stem cell aggregates for enhanced bone tissue engineering via endochondral ossification, Stem Cell Transl Med 5(2) (2016) 206-217).It is also known to load biomineralized polymer microparticles with adsorbed BMP-2 to stimulate osteogenic differentiation, or microparticles loaded with TGF-1 to promote cartilage phenotype formation. The inclusion of biomaterials in spheroids is a promising method for the uniform and constant action of differentiating factors on cells in spheroids (PN Dang, N. Dwivedi, LM Phillips, XH Yu, S. Herberg, C. Bowerman, LD Solorio, WL Murphy, E. Alsberg , Controlled dual growth factor delivery from microparticles incorporated within human bone marrow-derived mesenchymal stem cell aggregates for enhanced bone tissue engineering via endochondral ossification, Stem Cell Transl Med 5 (2) (2016) 206-217).

Еще одной важной тенденцией в последнее десятилетие стало фокусирование внимания иммуномодуляции взаимодействий биоматериал-хозяин, что имеет решающее значение для повышения эффективности костнопластических материалов. Если оставить немодулированные воспалительные реакции, определяющие свойства межклеточной среды хозяина (локальная среда регенерации), обычно инициируется каскад клеточных и тканевых реакций, приводящих к местным реакциям на инородное тело, которые проявляются как воспаление, образование гигантских клеток, фиброз и, в, конечном итоге, подвергаются полному рассасыванию костнопластических материалов раньше, чем они успеют проявить свои остеоиндуктивные и остеокондуктивные свойства, иногда наблюдается и повреждение окружающих тканей хозяина. Another important trend in the last decade has been the focus on immunomodulation of biomaterial-host interactions, which is critical for improving the effectiveness of bone grafting materials. If unmodulated inflammatory reactions are left that determine the properties of the intercellular environment of the host (local regeneration environment), a cascade of cellular and tissue reactions is usually initiated, leading to local reactions to a foreign body, which manifest themselves as inflammation, the formation of giant cells, fibrosis and, ultimately, undergo complete resorption of osteoplastic materials before they have time to show their osteoinductive and osteoconductive properties, sometimes damage to the surrounding host tissues is observed.

Текущие ограничения для клинического использования сфероидов включают выбор источника клеток, есть две широкие категории: аллогенные или аутологичные. Аллогенные клетки являются предпочтительными, когда необходимо большое количество клеток, и предполагается воздействие на иммунный ответ организма реципиента. Использование аллогенных клеток является наиболее подходящим, если технология подготовки клеточного материала включает значительные манипуляции с клетками ex vivo, что позволяет тратить много времени на подготовку конструкции. Подобно анализу донорской крови в банках крови, коллекции аллогенных клеток могут быть хорошо охарактеризованы, дифференцированы и отсортированы по назначенным клиническим применениям на основании их способности к дифференцировке и регенерации. Тем не менее, вероятность отторжения тканеинженерной конструкции, даже при тщательном подборе совместимого донора, довольно высока, и объем финансовых затрат, связанных с длительной подготовкой трансплантата ex vivo, потенциально является чрезмерно дорогостоящим в крупном масштабе. С другой стороны, источники аутологичных клеток сталкиваются со многими из тех же ограничений, что и современные методы клеточной терапии, такие как ограниченный объем забора собственного материала (ограниченные собственные донорские ресурсы аутологичных тканей), боль и болезненность в донорских местах, а также увеличение времени и затрат, связанных с подготовкой клеточного материала или конструктов в тканеинженерных лабораториях ex vivo. Тем не менее, улучшения технологий забора клеток, их экспансии и формирования сфероидов плюс применение технологий искусственного изменения локальной среды регенерации in situ могут иметь решающее значение, позволяя более эффективно использовать аутологичные клетки для сборки достаточного количества сфероидов, пригодных для клинического использования.Current limitations for the clinical use of spheroids include the choice of cell source, there are two broad categories: allogeneic or autologous. Allogeneic cells are preferred when a large number of cells are needed and an effect on the immune response of the recipient is expected. The use of allogeneic cells is most suitable if the technology for preparing the cell material involves significant manipulations with cells ex vivo , which allows a lot of time to be spent on preparing the construct. Similar to the analysis of donated blood in blood banks, collections of allogeneic cells can be well characterized, differentiated and sorted according to their intended clinical uses based on their ability to differentiate and regenerate. Nevertheless, the likelihood of rejection of a tissue-engineered construct, even with careful selection of a compatible donor, is quite high, and the amount of financial costs associated with long-term ex vivo graft preparation is potentially prohibitively expensive on a large scale. On the other hand, the sources of autologous cells face many of the same limitations as modern cell therapy methods, such as a limited amount of self-sampling (limited autologous tissue donor's own resources), pain and soreness at donor sites, and an increase in time and costs associated with the preparation of cellular material or constructs in tissue engineering laboratories ex vivo . Nevertheless, improvements in cell harvesting, expansion and spheroid formation technologies plus the use of technologies for artificially altering the local regeneration environment in situ can be critical, allowing more efficient use of autologous cells to assemble a sufficient number of spheroids suitable for clinical use.

Таким образом, несмотря на имеющиеся способы восстановления костей, все они характеризуются рядом недостатков и ограничений, а также остается много препятствий, связанных с производством и трансплантацией сфероидов, поэтому сохраняется необходимость в разработке и создании новых способов и подходов к решению указанных проблем.Thus, despite the existing methods of bone restoration, all of them are characterized by a number of disadvantages and limitations, and there are also many obstacles associated with the production and transplantation of spheroids; therefore, there remains a need to develop and create new methods and approaches to solving these problems.

Раскрытие изобретенияDisclosure of invention

Задача настоящего изобретения состоит в разработке нового трансплантата на основе клеточных сфероидов для эффективного восстановления костей и способа получения указанного трансплантата. The object of the present invention is to develop a new graft based on cell spheroids for effective bone restoration and a method for producing said graft.

Техническим результатом данного изобретения является разработка и получение трансплантата для эффективного восстановления костей на основе клеточных сфероидов, обладающих выраженным регенеративным потенциалом и характеризующихся наличием костного матрикса с остеиндукционными свойствами. При этом получение сфероидов в неадгезивных агарозных лунках осуществляют из смеси измельченной деминерализованной кости и суспензии культуры клеток (аутологичных мультипотентных стромальных клеток костного мозга), в результате частица деминирализованной кости упаковывается внутрь образованного сфероида. В агарозной лунке (лунка 800 мкм диаметром, глубиной 2000 мкм в микроформованном агарозном геле) суспензия клеток устойчиво формирует «оболочку» из клеток и синтезированного ими внеклеточного матрикса, которая как бы упаковывает внутри кусочек деминерализованного костного матрикса. Вне агарозной лунки такого размера сформировать такой конструкт невозможно.The technical result of this invention is the development and production of a graft for effective bone restoration based on cellular spheroids with a pronounced regenerative potential and characterized by the presence of a bone matrix with osteinduction properties. In this case, the production of spheroids in non-adhesive agarose wells is carried out from a mixture of crushed demineralized bone and a cell culture suspension (autologous multipotent bone marrow stromal cells), as a result, a particle of demineralized bone is packed inside the formed spheroid. In an agarose well (a well with a diameter of 800 µm, a depth of 2000 µm in a microformed agarose gel), a cell suspension stably forms a "shell" of cells and the extracellular matrix synthesized by them, which, as it were, packs a piece of demineralized bone matrix inside. It is impossible to form such a construct outside an agarose well of this size.

Технический результат настоящего изобретения заключается также в том, что способ по изобретению исключает необходимость использования любых дифференцирующих сред, замедляющих наращивание клеточной биомассы. Кроме того, настоящее изобретение обеспечивает снижение травматичности субъекта, забор костного мозга субъекта проводится путем пункции и аспирации костного мозга в амбулаторных условиях под местной анестезией.The technical result of the present invention also lies in the fact that the method according to the invention eliminates the need to use any differentiating media that slow down the growth of cell biomass. In addition, the present invention provides a decrease in the trauma of the subject, the bone marrow is collected from the subject by puncture and aspiration of the bone marrow on an outpatient basis under local anesthesia.

Дополнительно, способ по изобретению позволяет получить сфероиды из мультипотентных стромальных клеток костного мозга достаточно быстро. При образовании сфероида большая часть его центра представлена частицей костного матрикса (измельченной деминерализованной кости человека). Клетки костного мозга согласно способу по изобретению за 3-7 суток не только окружают частицу кости, но и образуют собственный матрикс, образующий кокон из волокон, удерживающий клетки на фрагменте деминерализованного аллогенного костного матрикса. Репаративная регенерация кости у реципиента происходит за счет внесенных источников регенерации, остеоиндуктивных материалов с большой удельной поверхностью (измельченная кость), защищенных от реакций на инородное тело. Такой трансплантат стимулирует также еще один способ регенерации кости - трансплантационную регенерацию кости. Собственные ткани реципиента активируются и более интенсивно врастают в трансплантат, включая сосуды и нервные волокна.Additionally, the method according to the invention makes it possible to obtain spheroids from multipotent bone marrow stromal cells rather quickly. When a spheroid is formed, most of its center is represented by a particle of bone matrix (crushed demineralized human bone). According to the method according to the invention, the bone marrow cells not only surround the bone particle in 3-7 days, but also form their own matrix, which forms a cocoon of fibers that holds the cells on a fragment of demineralized allogeneic bone matrix. Reparative bone regeneration in the recipient occurs due to the introduced sources of regeneration, osteoinductive materials with a large specific surface (crushed bone), protected from reactions to a foreign body. Such a graft also stimulates another method of bone regeneration - graft bone regeneration. The recipient's own tissues are activated and more intensively grow into the graft, including blood vessels and nerve fibers.

Достижение указанного технического результата обеспечивается при осуществлении способа получения трансплантата на основе клеточных сфероидов для восстановления кости субъекта на основе аутологичных мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток костного мозга и измельченной частично деминерализованной аллогенной кости, включающий следующие этапы:Achievement of the specified technical result is ensured by the implementation of the method of obtaining a transplant based on cellular spheroids for bone restoration of a subject based on autologous multipotent mesenchymal stromal cells of bone marrow and crushed partially demineralized allogeneic bone, including the following steps:

а) выделение клеток из собственного костного мозга субъекта; a) isolation of cells from the subject's own bone marrow;

б) культивирование выделенных на стадии а) клеток в адгезивной культуре в питательной культуральной среде без индукторов дифференцировки; b) culturing the cells isolated at stage a) in an adhesive culture in a nutrient culture medium without differentiation inducers;

в) получение частично деминерализованных частиц аллогенной кости; c) obtaining partially demineralized particles of allogeneic bone;

г) перенесение клеток, полученных на стадии б), и частиц частично деминерализованной кости, полученной на стадии в), в лунки агарозного планшета; d ) transferring the cells obtained in step b) and particles of partially demineralized bone obtained in step c) into the wells of an agarose plate;

д) агрегация клеток вокруг частиц деминерализованной аллогенной кости в биокомпозитсодержащие клеточные сфероиды. e) aggregation of cells around particles of demineralized allogeneic bone into biocomposite-containing cell spheroids.

В частных вариантах воплощения изобретения субъект представляет собой человека.In particular embodiments of the invention, the subject is a human.

В частных вариантах воплощения изобретения культивирование клеток на стадии б) осуществляется в течение 20-30 дней. В частных вариантах воплощения изобретения перенесение клеток на стадии г) осуществляется из расчета 8 000-12000 клеток на 1 лунку агарозного планшета.In particular embodiments of the invention, the culturing of the cells in step b) is carried out for 20-30 days. In particular embodiments of the invention, the transfer of cells in step d) is carried out at the rate of 8,000-12,000 cells per 1 well of an agarose plate.

В частных вариантах воплощения изобретения размер сфероидов составляет 250 до 600 мкм.In particular embodiments, the spheroids are 250 to 600 microns in size.

В частных вариантах воплощения изобретения диаметр частиц частично деминерализованной аллогенной кости составляет от 50 до 250 мкм.In particular embodiments of the invention, the particle diameter of the partially demineralized allogeneic bone is from 50 to 250 μm.

В частных вариантах воплощения изобретения культуральная питательная среда представляет собой среду на основе ксеногенных сывороток животных, среду на основе аутологичной и аллогенной сывороток человека тромболизатов крови человека, бессывороточную среду и/или синтетическую среду, дополнительна среда может включать добавки для выращивания клеток.In particular embodiments of the invention, the culture medium is a medium based on xenogenic animal sera, a medium based on autologous and allogeneic human sera of human blood thrombolysates, a serum-free medium and / or a synthetic medium, the additional medium may include additives for growing cells.

В частных вариантах воплощения изобретения агрегация клеток в клеточные сфероиды вокруг фрагмента деминерализованной кости осуществляется в агарозных лунках, где клетки в виде клеточных агрегатов пребывают до 8 дня.In particular embodiments of the invention, the aggregation of cells into cell spheroids around a fragment of demineralized bone is carried out in agarose wells, where cells in the form of cell aggregates remain for up to 8 days.

В частных вариантах воплощения изобретения степень деминерализации аллогенной кости составляет не более 30 %.In particular embodiments of the invention, the degree of demineralization of the allogeneic bone is not more than 30%.

Настоящее изобретение также относится к трансплантату для восстановления кости субъекта, включающему клеточные сфероиды на основе культивированных аутологичных мультипотентных стромальных клеток костного мозга субъекта, содержащие частицы измельченной аллогенной деминерализованной кости, и полученных способом по изобретению.The present invention also relates to a graft for bone restoration of a subject, comprising cell spheroids based on cultured autologous multipotent bone marrow stromal cells of a subject, containing particles of minced allogeneic demineralized bone, and obtained by the method of the invention.

В частных вариантах воплощения изобретения степень деминерализации аллогенной кости составляет не более 30 %, более конкретно 10 - 30 %.In particular embodiments of the invention, the degree of demineralization of the allogeneic bone is not more than 30%, more specifically 10-30%.

В частных вариантах воплощения изобретения трансплантат включает сфероиды с размером 250 до 600 мкм.In particular embodiments, the graft comprises spheroids ranging in size from 250 to 600 μm.

В частных вариантах воплощения изобретения трансплантат включает сфероиды, содержащие частицы аллогенной деминерализованной кости с диаметром от 50 до 250 мкм.In particular embodiments of the invention, the graft comprises spheroids containing allogeneic demineralized bone particles with a diameter of 50 to 250 μm.

В частных вариантах воплощения изобретения трансплантат включает дополнительный компонент, в частности, альгинатный гель с индукторами остеогенеза.In particular embodiments of the invention, the graft comprises an additional component, in particular, an alginate gel with osteogenesis inducers.

Технический результат настоящего изобретения также достигается за счет применения аутологичных мультипотентных стромальных клеток костного мозга и кусочков измельченной аллогенной деминерализованной кости субъекта для получения трансплантата в виде биокомпозитных клеточных сфероидов.The technical result of the present invention is also achieved through the use of autologous multipotent bone marrow stromal cells and pieces of crushed allogeneic demineralized bone of a subject to obtain a graft in the form of biocomposite cell spheroids.

Краткое описание чертежей.Brief description of the drawings.

Фигура 1. Микрофотография гистологического среза биокомпозитного сфероида по изобретению (окраска по Маллори). В центре фрагмент деминерализованной аллокости, вокруг микроткань, сформированная ММСК КМ. Figure 1. Micrograph of a histological section of a biocomposite spheroid according to the invention (Mallory stain). In the center is a fragment of demineralized allograft, around the microtissue formed by MMSC BM.

Определение и термины Definition and terms

Различные термины, относящиеся к объектам настоящего изобретения, используются выше и также в описании и в формуле изобретения. Если иное не оговаривается, все технические и научные термины, используемые в данной заявке, имеют то же самое значение, которое понятно для специалистов в данной области. Ссылки на методики, используемые при описании данного изобретения, относятся к хорошо известным методам, включая изменения этих методов и замену их эквивалентными методами, известными специалистам.Various terms related to the objects of the present invention are used above and also in the description and in the claims. Unless otherwise specified, all technical and scientific terms used in this application have the same meaning as understood by those skilled in the art. References to techniques used in describing the present invention refer to well known techniques, including modifying these techniques and replacing them with equivalent techniques known to those skilled in the art.

В описании данного изобретения термины «включает» и «включающий» интерпретируются как означающие «включает, помимо всего прочего». Указанные термины не предназначены для того, чтобы их истолковывали как «состоит только из».In the description of this invention, the terms "includes" and "including" are interpreted as meaning "includes, among other things". These terms are not intended to be construed as “consists only of”.

В описании данного изобретения термин «ткань» относится к системе клеток и неклеточных структур, обладающих общностью строения, в ряде случаев общностью происхождения, и специализированные на выполнении определенных функций.In the description of this invention, the term " tissue " refers to a system of cells and non-cellular structures that have a common structure, in some cases a common origin, and specialized in performing certain functions.

Адгезивная культура - клеточная культура, состоящая из пластик-адгезивных клеток, способных посредством своих рецепторов прикрепляться к культуральному пластику или стеклу. Adhesive culture is a cell culture consisting of plastic-adhesive cells capable of attaching to culture plastic or glass through their receptors.

Мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки (ММСК) костного мозга - мультипотентные клетки мезодермального происхождения в костном мозге взрослого организма, способные дифференцироваться в несколько типов клеток соединительной ткани - остеобласты (клетки костной ткани), хондроциты и адипоциты. Bone marrow multipotent mesenchymal stromal cells (MMSCs) are multipotent cells of mesodermal origin in the bone marrow of an adult organism, capable of differentiating into several types of connective tissue cells - osteoblasts (bone tissue cells), chondrocytes and adipocytes.

Используемый в данном документе термин «дефект» относится к костной ткани, если она отсутствует, уменьшено ее количество или она иначе повреждена. Дефект костей может быть результатом заболевания, лечения заболевания или травмы. As used herein, the term " defect " refers to bone tissue if it is absent, reduced in quantity, or otherwise damaged. A bone defect can be the result of illness, treatment for a disease, or injury.

Термин «среда» относится к питательной культуральной среде, предназначенной для культивирования сфероидов по изобретению, к примеру среда может быть выбрана из сред на основе ксеногенных сывороток животных, аутологичной и аллогенной сывороток человека тромболизатов крови человека, различных бессывороточных коммерческих сред.The term " medium " refers to a nutrient culture medium for culturing the spheroids of the invention, for example, the medium can be selected from media based on xenogenic animal sera, autologous and allogeneic human sera, human blood thrombolysates, various serum-free commercial media.

Используемый в данной заявке термин «трансплантат» относится к сфероидам, а термин «трансплантация» - это процесс пересадки указанных сфероидов в организм субъекта, как правило, для устранения дефекта кости.As used in this application, the term "graft" refers to spheroids, and the term "transplant" is the process of transplanting said spheroids into a subject, typically to repair a bone defect.

Используемый в данной заявке термин «сфероиды» относится к плотно упакованным клеточным агрегатам шарообразной формы, сформированных путем трехмерного культивирования. Их важным свойством является способность к взаимной адгезии и последующему тканевому слиянию, а также к адгезии к элементам внеклеточного матрикса реципиента. Тканевые (клеточные) сфероиды имеют тканеподобное строение - часто называют трехмерными микротканями, максимизирующими межклеточные взаимодействия.Used in this application, the term "spheroids" refers to tightly packed ball-shaped cell aggregates formed by three-dimensional cultivation. Their important property is the ability for mutual adhesion and subsequent tissue fusion, as well as for adhesion to the elements of the recipient's extracellular matrix. Tissue (cellular) spheroids have a tissue-like structure - often referred to as three-dimensional micro-tissues that maximize intercellular interactions.

Трансплантат по изобретению включает сфероиды из аутологичных мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток костного мозга, полученные согласно способу по изобретения, наряду с этим трансплантат опционально включает, по меньшей мере, один дополнительны компонент. Так, в частности, таким компонентом может быть альгинатный гель или гель на основе гиалуроновой кислоты (указанный гель может быть получен, в частности, способом описанным в Molly M. Stevens, Robert P. Marini et al/ In vivo engineering of organs: The bone bioreactor/ PNAS August 9, 2005 102 (32) 11450-11455; https://doi.org/10.1073/pnas.0504705102). В частности, гелеобразование может быть инициировано путем смешивания 2% (вес/объем) альгината натрия (FMC BioPolymer) в 30 мМ Hepes, содержащем 150 мМ NaCl и 10 мМ KCl, с равным объемом раствора, содержащего 75 мМ CaCl₂ в 10 мМ Hepes, содержащего 150 мМ NaCl и 10 мМ KCl с использованием стерильного Y-образного смесителя. Гель отверждается в течение 1 мин и имеет модуль Юнга 0,17 МПа. В состав геля может быть добавлены факторы роста (TGF-β1 и FGF-2, R & D Systems), включены в состав в концентрации 10 нг/мл. В частных вариантах, гель на основе ГК, HA (Genzyme) химически модифицировали так, чтобы он содержал альдегидные группы (HA-ALD) путем реакции с периодатом натрия и гидразидными группами (HA-ADH) путем взаимодействия с адипиновым дигидразидом. Гидрогели ГА получают смешиванием равных объемов 2% (мас./об.) водных растворов HA-ALD и HA-ADH. Сурамин (Bayer, Леверкузен, Германия) включают в количестве (0,4 моль/литр) во время гелеобразования. Кроме того, трансплантат, может содержать физиологически приемлемый носитель, который, в частности, представляет собой Ham's F12 культуральная среда, базовая, CLS. В частных вариантах воплощения изобретения трансплантат может содержать комплекс NCTF® (компания LABORATOIRES FILORGA).The graft according to the invention comprises spheroids from autologous multipotent mesenchymal bone marrow stromal cells obtained according to the method according to the invention, and the graft optionally includes at least one additional component. So, in particular, such a component can be an alginate gel or a gel based on hyaluronic acid (this gel can be obtained, in particular, by the method described in Molly M. Stevens, Robert P. Marini et al / In vivo engineering of organs: The bone bioreactor / PNAS August 9, 2005 102 (32) 11450-11455; https://doi.org/10.1073/pnas.0504705102). In particular, gelation can be initiated by mixing 2% (w / v) sodium alginate (FMC BioPolymer) in 30 mM Hepes containing 150 mM NaCl and 10 mM KCl with an equal volume of a solution containing 75 mM CaCl ₂ in 10 mM Hepes containing 150 mM NaCl and 10 mM KCl using a sterile Y-shaped mixer. The gel cures within 1 min and has a Young's modulus of 0.17 MPa. Growth factors (TGF-β1 and FGF-2, R & D Systems) can be added to the gel, included in the composition at a concentration of 10 ng / ml. In particular variants, the HA-based gel, HA (Genzyme), was chemically modified to contain aldehyde groups (HA-ALD) by reaction with sodium periodate and hydrazide groups (HA-ADH) by interaction with adipic dihydrazide. HA hydrogels are prepared by mixing equal volumes of 2% (w / v) aqueous solutions of HA-ALD and HA-ADH. Suramin (Bayer, Leverkusen, Germany) is included in an amount (0.4 mol / liter) during gelation. In addition, the graft may contain a physiologically acceptable carrier, which, in particular, is Ham's F12 culture medium, basic, CLS. In particular embodiments, the graft may contain an NCTF® complex (LABORATOIRES FILORGA).

«Композиты» - это материалы-конструкции, они конструируются из двух, трех или более материалов, обладающих различными свойствами и достаточно надежно соединенных друг с другом, чтобы обеспечить работу полученной системы как единого целого. Биокомпозиты - это конструкции, созданные природой."Composites" are materials of construction, they are constructed from two, three or more materials with different properties and reliably enough connected to each other to ensure the operation of the resulting system as a whole. Biocomposites are structures created by nature.

«Кость» - орган опорно-двигательного аппарата, построенный преимущественно из костной ткани. Кость с позиции материаловедения - это биокомпозит или полимерный композит. Исследованиями их свойств интенсивно занимаются специалисты в области композитов. Известно, что костная ткань содержит три основных компонента - минеральное вещество гидроксилапатит (~70 %), органическое вещество на основе белка коллагена (~20 %) и воду (~10 %)."Bone " is an organ of the musculoskeletal system, built predominantly of bone tissue. From the point of view of materials science, bone is a biocomposite or a polymer composite. Experts in the field of composites are intensively studying their properties. It is known that bone tissue contains three main components - the mineral substance hydroxylapatite (~ 70%), organic matter based on collagen protein (~ 20%) and water (~ 10%).

Частицы деминерализованной кости по изобретению, в частности, представляют собой костнопластический материал Перфоост.Particles of demineralized bone according to the invention, in particular, are bone grafting material Perfoost.

Добавка к питательной среде - это продукт, который используется для оптимизации базовых рецептур сред, а именно для поддержания роста и дифференцировки различных стволовых клеток и клеток-предшественников, а также первичных клеток, или для дифференцировки клеток в определенном направлении.A nutrient medium supplement is a product that is used to optimize basic media formulations, namely to support the growth and differentiation of various stem and progenitor cells, as well as primary cells, or to differentiate cells in a specific direction.

Синтетическая среда - культуральная питательная среда, которую готовят из определённых химически чистых органических и неорганических соединений, взятых в точно указанных концентрациях и растворённых в дважды дистиллированной воде.Synthetic medium is a culture medium that is prepared from certain chemically pure organic and inorganic compounds taken in precisely specified concentrations and dissolved in double-distilled water.

Подробное раскрытие изобретениеDetailed disclosure of the invention

Сфероиды, которые представляют собой плотные трехмерные клеточные агрегаты, усиливают известные полезные эффекты клеточной терапии, при этом увеличивая и продлевая время передачи сигналов от клетки к клетке и клеточному матриксу. Сфероиды из мультипотентных стромальных клеток костного мозга не только демонстрируют свою повышенную выживаемость, даже в центре многоклеточных агрегатов, но и важно, что при этом сохраняют остеогенные потенции, а также продуцируют обширный набор секретируемых белков, которые способствуют ангиогенезу, снижают воспаление, активируют и привлекают собственные - эндогенные клетки реципиента для участия в костной регенерации. Spheroids, which are dense, three-dimensional cell aggregates, enhance the known beneficial effects of cell therapy while increasing and prolonging the time of cell-to-cell signaling and cell matrix. Spheroids from multipotent bone marrow stromal cells not only demonstrate their increased survival rate, even in the center of multicellular aggregates, but it is also important that they maintain osteogenic potencies and produce a wide range of secreted proteins that promote angiogenesis, reduce inflammation, activate and attract their own - endogenous cells of the recipient to participate in bone regeneration.

Важно отметить, что сохранение внеклеточного матрикса в тканевых сфероидах является критическим условием для успешной и пролонгируемой выживаемости клеток в суровых условиях посттрансплантационного приживления в организме реципиента, клетки в сфероиде более длительно сохраняют способность к секреции трофических факторов, по сравнению с диссоциированными клетками. Благодаря наличию собственного внеклеточного матрикса, а также частице деминерализованной аллогенной кости внутри сфероида и улучшенным межклеточным взаимодействиям, сфероиды при трансплантации создают локальное микроокружение, благоприятное для органотипической регенерации кости. It is important to note that the preservation of the extracellular matrix in tissue spheroids is a critical condition for the successful and prolonged survival of cells in the harsh conditions of post-transplant engraftment in the recipient's body; the cells in the spheroid retain the ability to secrete trophic factors for a longer time than dissociated cells. Due to the presence of their own extracellular matrix, as well as a particle of demineralized allogeneic bone inside the spheroid and improved intercellular interactions, spheroids during transplantation create a local microenvironment favorable for organotypic bone regeneration.

В качестве источника остеогенных клеток для производства сфероидов согласно настоящему изобретению используется костный мозг самого пациента, который является источником мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток костного мозга. При этом, в настоящем изобретении биоматериал, то есть частицы деминерализованной кости субъекта, заключены в оболочку из собственных клеток, то есть мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток костного мозга. С одной стороны клетки биокомпозитного сфероида взаимодействую с индуктором их дифференцировки, с другой защищают биокомпозит - аллогенную кость от быстрого лизиса, реакции организма на инородное тело. As a source of osteogenic cells for the production of spheroids according to the present invention, the patient's own bone marrow is used, which is a source of multipotent mesenchymal bone marrow stromal cells. At the same time, in the present invention, the biomaterial, that is, the particles of the demineralized bone of the subject, are enclosed in a membrane of their own cells, that is, the multipotent mesenchymal stromal cells of the bone marrow. On the one hand, the cells of the biocomposite spheroid interact with the inducer of their differentiation, on the other hand, they protect the biocomposite - allogeneic bone from rapid lysis, the body's reaction to a foreign body.

Суспензия частиц измельченной аллогенной деминерализованной кости получали путем измельчения готовых деминерализованных костных блоков, подготовленных для клинического применения в виде костных блоков - костнопластического материала. A suspension of particles of crushed allogeneic demineralized bone was obtained by grinding ready-made demineralized bone blocks, prepared for clinical use in the form of bone blocks - osteoplastic material.

Выделение и культивирование мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток костного мозга (ММСК КМ) осуществляют следующим образом. ММСК КМ были выделены из заднего подвздошного гребня здоровых мужчин-доноров (43 ± 5 лет) путем пункции аспирационной иглы и аспирации 25 мл костного мозга в шприц-контейнер. Аспират промывали модифицированной Дульбекко средой Игла с низким содержанием глюкозы с 10% предварительно протестированной фетальной бычьей сывороткой. Мононуклеарные клетки выделяли с использованием градиента плотности Percoll (Sigma-Aldrich), высевали на пластик для тканевой культуры с плотностью 1,8 × 10⁵ клеток на см².в среде, содержащей 10 нг/мл фактора роста фибробластов-2, и культивировали при 37°С с 5% СО₂. Неадгезивные клетки удаляли при смене культуральной среды через 4 дня. Адгезивные клетки, первичные ММСК КМ, культивировали в течение еще 10-14 дней со сменой среды каждые 3 дня. Затем их повторно высевали при 4×10³ клеток на см² и расширяли до 3-го пассажа: высевали в пластиковые флаконы с культуральной средой следующего состава: ДМЕМ (или ДМЕМ/Ф12) 450 мл, L-глутамин 292 мг, эмбриональная телячья сыворотка 50 мл, пенициллин 100 ед/мл, стрептомицин 100 мкг/мл, при 100% влажности, температуре 37°С, 5% СО₂ (данная среда и условия используются на всех этапах последующего культивирования).Isolation and cultivation of multipotent mesenchymal bone marrow stromal cells (MMSC BM) is carried out as follows. BM MMSCs were isolated from the posterior iliac crest of healthy male donors (43 ± 5 years old) by puncture of an aspiration needle and aspiration of 25 ml of bone marrow into a syringe container. The aspirate was washed with Dulbecco's modified low glucose Eagle's medium with 10% pre-tested fetal bovine serum. Mononuclear cells were isolated using a Percoll density gradient (Sigma-Aldrich), plated on tissue culture plastic at a density of 1.8 × 10 ⁵ cells per cm ^{2 in a} medium containing 10 ng / ml fibroblast growth factor-2, and cultured at 37 ° C with 5% CO ₂ . Non-adherent cells were removed by changing the culture medium after 4 days. Adhesive cells, primary MMSCs of BM, were cultured for another 10-14 days with a change of medium every 3 days. Then they were sown again at 4 × 10 ³ cells per cm ² and expanded to the 3rd passage: they were sown in plastic flasks with a culture medium of the following composition: DMEM (or DMEM / F12) 450 ml, L-glutamine 292 mg, fetal bovine serum 50 ml, penicillin 100 U / ml, streptomycin 100 μg / ml, at 100% humidity, 37 ° C, 5% CO ₂ (this medium and conditions are used at all stages of subsequent cultivation).

После третьего пассажа клетки снимают с пластиковых флаконов трипсином/ЭДТА. Полученную клеточную взвесь отмывают от трипсина/ЭДТА, в том числе с помощью среды ДМЕМ с 10% сывороткой с последующим центрифугированием (10 минут при 200g), клеточную суспензию смешивают с суспензией из 90 частиц измельченной деминерализованной аллогенной кости и переносят в 81-луночные агарозные планшеты с диаметром лунки 800 мкм в концентрации до 1,6 млн клеток на планшет, где в лунку как правило попадает одна частица кости, и приблизительно равные количества культивированных клеток костного мозга, внутри агарозных лунок начинают формироваться сфероиды, в центре которых оказывается частица аллогенной кости.After the third passage, cells are removed from plastic vials with trypsin / EDTA. The resulting cell suspension is washed from trypsin / EDTA, including using DMEM medium with 10% serum, followed by centrifugation (10 minutes at 200g), the cell suspension is mixed with a suspension of 90 particles of crushed demineralized allogeneic bone and transferred to 81-well agarose plates with a well diameter of 800 μm at a concentration of up to 1.6 million cells per plate, where one particle of bone usually falls into the well, and approximately equal numbers of cultured bone marrow cells, spheroids begin to form inside the agarose wells, in the center of which there is a particle of allogeneic bone.

Из культивированных аутологичных или аллогенных живых клеток костного мозга (мультипотентные стромальные клетки костного мозга) в условиях 3D культивирования внутри агарозных лунок диаметром 800 мкм формируются клеточные сфероиды диаметром от 250 до 600 мкм, причем в центре формирующегося сфероида оказывается частица измельченного деминерализованного костного матрикса диаметром от 50 до 250 мкм. From cultured autologous or allogeneic living cells of the bone marrow (multipotent stromal cells of the bone marrow) under 3D cultivation conditions inside agarose wells with a diameter of 800 μm, cell spheroids with a diameter of 250 to 600 μm are formed, and a particle of crushed demineralized bone matrix with a diameter of 50 up to 250 microns.

В лунку заливается суспензия живых культивированных клеток в смеси с суспензией измельченного частично деминерализованного аллогенного костного матрикса. В течение 3-7 суток в агарозной лунке в условиях трехмерного культивирования формируется тканевой сфероид из клеток и вновь синтезированного внеклеточного матрикса, в центральной части которого расположена частица деминерализованного костного матрикса. Клетки и матрикс окружают частицу кости и образуют тканеинженерный конструкт, устойчивый к механическим воздействиям. Осаждение клеток и костных частиц из суспензий происходит под действием сил гравитации в условиях трехмерного культивирования и при возможном недолгом покачивании культуральных чашек. A suspension of live cultured cells mixed with a suspension of crushed partially demineralized allogeneic bone matrix is poured into the well. Within 3-7 days in an agarose well under conditions of three-dimensional cultivation, a tissue spheroid is formed from cells and a newly synthesized extracellular matrix, in the central part of which there is a particle of demineralized bone matrix. The cells and matrix surround the bone particle and form a tissue-engineered construct that is resistant to mechanical stress. The sedimentation of cells and bone particles from suspensions occurs under the action of gravitational forces under conditions of three-dimensional cultivation and with a possible brief shaking of the culture dishes.

Следует отметить, что при таком способе культивирования внутри лунок происходит увеличение биомассы сфероидов за счет как клеточной пролиферации, так и синтеза нового внеклеточного матрикса. Поэтому более уместно говорить не о клеточном, а о тканевом сфероиде в этом случае, хотя часто клеточный и тканевой сфероид употребляются как синоним. Обычно в центральной части сфероида наблюдаются дистрофия, а иногда и апоптоз клеток. Измельченная кость замещает эту неблагоприятную зону, и является естественным остеоиндуктором.It should be noted that with this method of cultivation inside the wells, an increase in the biomass of spheroids occurs due to both cell proliferation and the synthesis of a new extracellular matrix. Therefore, it is more appropriate to speak not of a cellular, but of a tissue spheroid in this case, although the cellular and tissue spheroid are often used as a synonym. Usually, dystrophy and sometimes apoptosis of cells are observed in the central part of the spheroid. Shredded bone replaces this disadvantageous area and is a natural osteoinducer.

Благодаря дополнительному объему измельченных фрагментов аллогенной кости удается быстрее получить желаемые объемы пересаживаемого биоматериала и массы сфероидов - строительных блоков, которые могут быть использованы в виде биочернил для биопечати, либо, как трансплантат, несущий костнопластический материал для восстановления костных дефектов, проявления остеоиндукции, стимуляции репаративного остеогенеза и эффективного наращивания объема костной ткани при трансплантации in vivo. Thanks to the additional volume of crushed fragments of allogeneic bone, it is possible to quickly obtain the desired volumes of the transplanted biomaterial and the mass of spheroids - building blocks that can be used in the form of bio-ink for bioprinting, or as a graft carrying bone graft material to restore bone defects, manifest osteoinduction, stimulate reparative osteogenesis and effective growth of bone volume during in vivo transplantation.

Масса таких сфероидов может инициировать регенерацию собственных тканей и органов реципиента по типу трансплантационной регенерации, формируя живой каркас для ускоренной регенерации сосудов, нервов и собственных регенерирующих тканей реципиента.The mass of such spheroids can initiate the regeneration of the recipient's own tissues and organs by the type of transplant regeneration, forming a living framework for the accelerated regeneration of blood vessels, nerves and the recipient's own regenerating tissues.

Сфероидов пребывают в лунках на протяжении до 8 суток со сменой среды каждые 2-3 дня.Spheroids stay in the wells for up to 8 days with a change of medium every 2-3 days.

Для трансплантации сфероидов их собирают из планшетов и переносят в пробирку, где они осаждаются на дно без дополнительного центрифугирования. После этого сфероиды помещают в шприц и трансплантируют субъекту в зону дефекта через иглу или аппликатор, диаметром не менее 1 мм². Трансплантация может производиться эндоскопически.For transplantation of spheroids, they are collected from plates and transferred to a test tube, where they settle to the bottom without additional centrifugation. Thereafter, the spheroids are placed in a syringe and transplanted to the subject into the defect area through a needle or applicator with a diameter of at least 1 mm ² . Transplantation can be done endoscopically.

Примеры осуществление изобретенияExamples of implementation of the invention

Пример 1.Example 1.

У пациента из гребня подвздошной кости под местной анестезией путем прокола аспирационной иглой кортикальной пластики кости из губчатового вещества было аспирировано 25 мл костного мозга. Забранный материал в стерильном шприце передавался в клеточную лабораторию. Аспират промывали модифицированной Дульбекко средой Игла с низким содержанием глюкозы с 10% предварительно протестированной фетальной бычьей сывороткой. Мононуклеарные клетки выделяли с использованием градиента плотности Percoll (Sigma-Aldrich), высевали на пластик для тканевой культуры с плотностью 1,8 × 10⁵ клеток на см².в среде, содержащей 10 нг/мл фактора роста фибробластов-2, и культивировали при 37°С с 5% СО₂. Неадгезивные клетки удаляли при смене культуральной среды через 4 дня. Адгезивные клетки, первичные ММСК КМ, культивировали в течение еще 10-14 дней со сменой среды каждые 3 дня. Затем их повторно высевали при 4×10³ клеток на см² и расширяли до 3-го пассажа: высевали в пластиковые флаконы с культуральной средой следующего состава: ДМЕМ (или ДМЕМ/Ф12) 450 мл, L-глутамин 292 мг, эмбриональная телячья сыворотка 50 мл, пенициллин 100 ед/мл, стрептомицин 100 мкг/мл, при 100% влажности, температуре 37°С, 5% СО₂ (данная среда и условия используются на всех этапах последующего культивирования).In a patient, 25 ml of bone marrow was aspirated from the spongy substance from the iliac crest under local anesthesia by puncturing cortical bone grafting with an aspiration needle. The collected material in a sterile syringe was transferred to the cell laboratory. The aspirate was washed with Dulbecco's modified low glucose Eagle's medium with 10% pre-tested fetal bovine serum. Mononuclear cells were isolated using a Percoll density gradient (Sigma-Aldrich), plated on tissue culture plastic at a density of 1.8 × 10 ⁵ cells per cm ^{2 in a} medium containing 10 ng / ml fibroblast growth factor-2, and cultured at 37 ° C with 5% CO ₂ . Non-adherent cells were removed by changing the culture medium after 4 days. Adhesive cells, primary MMSCs of BM, were cultured for another 10-14 days with a change of medium every 3 days. Then they were sown again at 4 × 10 ³ cells per cm ² and expanded to the 3rd passage: they were sown in plastic flasks with a culture medium of the following composition: DMEM (or DMEM / F12) 450 ml, L-glutamine 292 mg, fetal bovine serum 50 ml, penicillin 100 U / ml, streptomycin 100 μg / ml, at 100% humidity, 37 ° C, 5% CO ₂ (this medium and conditions are used at all stages of subsequent cultivation).

После третьего пассажа клетки снимают с пластиковых флаконов трипсином/ЭДТА. Полученную клеточную взвесь отмывают от трипсина/ЭДТА, в том числе с помощью среды ДМЕМ с 10% сывороткой с последующим центрифугированием (10 минут при 200g), клеточную суспензию смешивают с суспензией из 90-100 частиц измельченной деминерализованной аллогенной кости (костного аллоимплантанта) и переносят в 81-луночные агарозные планшеты с диаметром лунки 800 мкм в концентрации до 1,6 млн клеток на планшет, где в лунку как правило попадает одна частица кости, и приблизительно равные количества культивированных клеток костного мозга, внутри агарозных лунок начинают формироваться сфероиды, в центре которых оказывается частица аллогенной кости.After the third passage, cells are removed from plastic vials with trypsin / EDTA. The resulting cell suspension is washed from trypsin / EDTA, including using DMEM medium with 10% serum, followed by centrifugation (10 minutes at 200g), the cell suspension is mixed with a suspension of 90-100 particles of crushed demineralized allogenic bone (bone alloimplant) and transferred in 81-well agarose plates with a well diameter of 800 microns at a concentration of up to 1.6 million cells per plate, where one particle of bone is usually deposited into the well, and approximately equal numbers of cultured bone marrow cells, spheroids begin to form inside the agarose wells, in the center which turns out to be a particle of allogeneic bone.

Из культивированных аутологичных или аллогенных живых клеток костного мозга (мультипотентные стромальные клетки костного мозга) человека в условиях 3D культивирования внутри лунок в Микроформованном агарозном геле диаметром 800 мкм и глубиной 2000 мкм формируются клеточные сфероиды диаметром 500 мкм, причем в центре формирующегося сфероида оказывается частица измельченного деминерализованного костного матрикса диаметром 250 мкм (Фигура 1). Cell spheroids 500 μm in diameter are formed from cultured autologous or allogeneic living bone marrow cells (multipotent bone marrow stromal cells) of a person under conditions of 3D cultivation inside the wells in a Microformed agarose gel with a diameter of 800 μm and a depth of 2000 μm, with a particle of crushed demineralized bone matrix with a diameter of 250 μm (Figure 1).

В лунку заливается суспензия живых культивированных клеток в смеси с суспензией измельченного частично деминерализованного аллогенного костного матрикса. В течение 3-7 суток в агарозной лунке в условиях трехмерного культивирования формируется тканевой сфероид из клеток и вновь синтезированного внеклеточного матрикса, в центральной части которого расположена частица деминерализованного костного матрикса - измельченного в шаровой мельнице костного аллоимплантанта «Перфоост». Клетки и вновь образованный клетками матрикс окружают частицу кости и образуют тканеинженерный конструкт, устойчивый к внешним механическим воздействиям - микроткань образованную в 3D-культуре ММСК КМ с кусочком измельченного костного аллоимплантанта в центре. Осаждение клеток и костных частиц из суспензий происходит под действием сил гравитации в условиях трехмерного культивирования и при возможном недолгом покачивании культуральных чашек. A suspension of live cultured cells mixed with a suspension of crushed partially demineralized allogeneic bone matrix is poured into the well. Within 3-7 days in an agarose well under conditions of three-dimensional cultivation, a tissue spheroid is formed from cells and a newly synthesized extracellular matrix, in the central part of which there is a particle of demineralized bone matrix - bone alloimplant "Perfoost" crushed in a ball mill. The cells and the matrix newly formed by the cells surround the bone particle and form a tissue-engineered construct that is resistant to external mechanical influences - micro tissue formed in a 3D-culture of MMSC BM with a piece of crushed bone alloimplant in the center. The sedimentation of cells and bone particles from suspensions occurs under the action of gravitational forces under conditions of three-dimensional cultivation and with a possible brief shaking of the culture dishes.

Несмотря на то, что изобретение описано со ссылкой на раскрываемые варианты воплощения, для специалистов в данной области должно быть очевидно, что конкретные подробно описанные эксперименты приведены лишь в целях иллюстрирования настоящего изобретения и их не следует рассматривать как каким-либо образом ограничивающие объем изобретения. Должно быть понятно, что возможно осуществление различных модификаций без отступления от сути настоящего изобретения.Although the invention has been described with reference to the disclosed embodiments, it should be apparent to those skilled in the art that the specific experiments described in detail are provided for the purpose of illustrating the present invention only and should not be construed as in any way limiting the scope of the invention. It should be understood that various modifications are possible without departing from the spirit of the present invention.

Claims

1. A method of obtaining a transplant based on cellular spheroids based on autologous multipotent mesenchymal stromal cells of the bone marrow and crushed partially demineralized allogeneic bone for bone restoration of a subject, comprising the following steps:

a) isolation of cells from the subject's own bone marrow;

b) culturing the cells isolated at stage a) in an adhesive culture in a nutrient culture medium without differentiation inducers;

c) obtaining partially demineralized particles of allogeneic bone;

d) transferring the cells obtained in step b) and particles of partially demineralized bone obtained in step c) into the wells of an agarose plate;

e) aggregation of cells around particles of demineralized allogeneic bone into biocomposite-containing cell spheroids.

2. The method of claim 1, wherein the subject is a human.

3. The method according to claim 1, wherein the culturing of the cells in step b) is carried out for 20-30 days.

4. The method according to claim 1, in which the transfer of cells in step d) is carried out at the rate of 8,000-12,000 cells per 1 well of an agarose plate.

5. The method of claim 1, wherein the spheroids are 250 to 600 microns in size.

6. The method of claim 1, wherein the particle diameter of the partially demineralized allogeneic bone is 50 to 250 microns.

7. The method according to claim 1, wherein the culture medium is a medium based on xenogenic animal sera, a medium based on autologous and allogeneic human sera of human blood thrombolysates, a serum-free medium and / or a synthetic medium.

8. The method according to claim 1, in which the aggregation of cells in spheroids around a fragment of demineralized bone is carried out in agarose wells, where the cells in the form of cell aggregates stay for up to 8 days.

9. The method according to claim 1, wherein the degree of demineralization of the allogeneic bone is not more than 30%.

10. A graft for bone restoration of a subject, including spheroids, the size of which is 250 to 600 μm, based on autologous multipotent mesenchymal stromal cells of the bone marrow of a subject, containing particles of partially demineralized allogeneic bone, and obtained by the method according to claim 1, and the diameter of the particles of allogeneic demineralized bone is from 50 to 250 microns, the degree of demineralization of allogeneic bone is no more than 30%.

11. The graft of claim 10, wherein the subject is a human.

12. The graft according to claim 10, which further comprises an alginate gel with osteogenesis inducers.