RU2586952C1 - Method of treating hepatic failure - Google Patents

Method of treating hepatic failure Download PDF

Info

Publication number
RU2586952C1
RU2586952C1 RU2015129466/14A RU2015129466A RU2586952C1 RU 2586952 C1 RU2586952 C1 RU 2586952C1 RU 2015129466/14 A RU2015129466/14 A RU 2015129466/14A RU 2015129466 A RU2015129466 A RU 2015129466A RU 2586952 C1 RU2586952 C1 RU 2586952C1
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
liver
matrix
cells
bone marrow
autologous
Prior art date
Application number
RU2015129466/14A
Other languages
Russian (ru)
Inventor
Сергей Владимирович Готье
Мурат Юнусович Шагидулин
Нина Андреевна Онищенко
Михаил Евгеньевич Крашенинников
Алла Олеговна Никольская
Людмила Валентиновна Башкина
Виктор Иванович Севастьянов
Original Assignee
Федеральное государственное бюджетное учреждение "Федеральный научный центр трансплантологии и искусственных органов имени академика В.И. Шумакова" Министерства здравоохранения Российской Федерации
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Федеральное государственное бюджетное учреждение "Федеральный научный центр трансплантологии и искусственных органов имени академика В.И. Шумакова" Министерства здравоохранения Российской Федерации filed Critical Федеральное государственное бюджетное учреждение "Федеральный научный центр трансплантологии и искусственных органов имени академика В.И. Шумакова" Министерства здравоохранения Российской Федерации
Priority to RU2015129466/14A priority Critical patent/RU2586952C1/en
Application granted granted Critical
Publication of RU2586952C1 publication Critical patent/RU2586952C1/en

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
    • A61L27/3604—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix characterised by the human or animal origin of the biological material, e.g. hair, fascia, fish scales, silk, shellac, pericardium, pleura, renal tissue, amniotic membrane, parenchymal tissue, fetal tissue, muscle tissue, fat tissue, enamel
    • A61L27/3633—Extracellular matrix [ECM]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
    • A61L27/3604—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix characterised by the human or animal origin of the biological material, e.g. hair, fascia, fish scales, silk, shellac, pericardium, pleura, renal tissue, amniotic membrane, parenchymal tissue, fetal tissue, muscle tissue, fat tissue, enamel
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
    • A61L27/38—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells
    • A61L27/3804—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells characterised by specific cells or progenitors thereof, e.g. fibroblasts, connective tissue cells, kidney cells
    • A61L27/3834—Cells able to produce different cell types, e.g. hematopoietic stem cells, mesenchymal stem cells, marrow stromal cells, embryonic stem cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61B—DIAGNOSIS; SURGERY; IDENTIFICATION
    • A61B17/00—Surgical instruments, devices or methods, e.g. tourniquets
    • A61B2017/00969—Surgical instruments, devices or methods, e.g. tourniquets used for transplantation
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L2430/00—Materials or treatment for tissue regeneration
    • A61L2430/26—Materials or treatment for tissue regeneration for kidney reconstruction

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Oral & Maxillofacial Surgery (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Materials For Medical Uses (AREA)

Abstract

FIELD: medicine.
SUBSTANCE: matrix of decellularised donor liver of mammal in amount of 1:1 for 8-12 hours at temperature of 4 °C is incubated in solution with pH of 7.4. Composition of solution: 138 mM NaCl, 2.67 mM KCl, 1.47 mM KH2PO4, 8.1 mM Na2HPO4, fibronectin and laminin at 10 mcg/ml, distilled water up to 1 l. One performs hepatocytes and bone marrow stem cells coculture for 2-4 days in amount of 2×106-15×106 per 1 cm of matrix. Matrix with cells volume of not less than 0.05 cm3 is mixed with collagen-containing hydrogel in amount of 3:1. Particle size of matrix from 200 to 700 mcm, not more than 50 mcm, porosity is 70-85 %. Obtained cell-engineering structure is implanted in liver parenchyma. Anticoagulants used in preventive dosage.
EFFECT: method enables improving effects of treating patient with hepatic failure due to activation of two-way interactions between implanted cell-engineering structure and recipient injured liver parenchyma.
4 cl, 3 dwg

Description

Изобретение относятся к регенеративной медицине, трансплантологии, а именно к клеточной трансплантологии, и может быть использовано при коррекции и лечении печеночной недостаточности. Предлагаемый способ может быть использован в специализированных отделениях, занимающихся лечением и коррекцией печеночной недостаточности.The invention relates to regenerative medicine, transplantology, namely to cell transplantology, and can be used in the correction and treatment of liver failure. The proposed method can be used in specialized departments involved in the treatment and correction of liver failure.

В настоящее время известно, что для повышения эффективности лечения поврежденной печени следует использовать приемы тканевой инженерии, предполагающие создание имплантируемых клеточно-инженерных конструкций (КИК).Currently, it is known that in order to increase the effectiveness of the treatment of damaged liver, tissue engineering techniques should be used, involving the creation of implantable cell-engineering structures (CFCs).

Известны способы лечения печеночной недостаточности, основанные на использовании КИК, состоящих из изолированных аутологичных клеток печени и аутологичных мезенхимальных стволовых клеток костного мозга, адгезированных на биосовместимом биодеградируемом трехмерном матриксе из биодеградируемого бактериального сополимера β-оксибутирата и β-оксивалерата и полиэфира (Эластопоб) либо на биосовместимом биодеградируемом биополимерном гетерогенном коллагенсодержащем гидрогеле (Сферогель) (Патенты РФ на изобретение №2425648 C1, №2425645, C1), которые имплантируют в ткань печени или в брыжейку тонкой кишки.Known methods for treating liver failure based on the use of CICs consisting of isolated autologous liver cells and autologous mesenchymal bone marrow stem cells adhered to a biocompatible biodegradable three-dimensional matrix of a biodegradable bacterial copolymer of β-hydroxybutyrate and β-hydroxyvalerate and polyester biodegradable biopolymer heterogeneous collagen-containing hydrogel (Spherogel) (RF patents for the invention No. 2425648 C1, No. 2425645, C1), cat rye implanted in liver tissue or in the mesentery of the small intestine.

Также известны способы лечения печеночной недостаточности с помощью КИК, в которых для иммобилизации клеточного материала и пролонгирования выживания заключенных в них клеток использованы биосинтетические или синтетические матриксы [Kulig К.М.&Vacanti J.P. Hepatic tissue engineering. // Transpl. Immunol. - 2004. - Vol. 12, - p. 303-310].Also known are methods of treating liver failure using CIC, in which biosynthetic or synthetic matrices are used to immobilize cellular material and prolong the survival of the cells enclosed in them [Kulig K.M. & Vacanti J.P. Hepatic tissue engineering. // Transpl. Immunol. - 2004. - Vol. 12, - p. 303-310].

В качестве прототипа нами выбран известный способ лечения печеночной недостаточности, в котором использовались трансплантаты, содержащие изолированные гепатоциты и мезенхимальные стволовые клетки костного мозга (МСК КМ) на биополимерном гетерогенном коллагенсодержащем гидрогеле (Сферогель) для вспомогательной поддержки КИК печени и восполнения дезинтоксикационной и биорегуляторной функции поврежденной печени, а также для активизации восстановительных процессов в ней (Патент РФ на изобретение №2425645 C1).As a prototype, we chose a well-known method of treating liver failure, which used transplants containing isolated hepatocytes and mesenchymal stem cells of the bone marrow (MSC KM) on a biopolymer heterogeneous collagen-containing hydrogel (Spherogel) to support liver KIK and replenish detoxification and bioregulatory function of the liver , as well as to enhance the recovery processes in it (RF Patent for the invention No. 2425645 C1).

К недостаткам использования известных способов, в том числе и прототипа, предполагающих внутрипеченочную имплантацию КИК на основе биоматрикса, относят недостаточный объем регуляторных возможностей используемых матриксов и, следовательно, недостаточную выраженность процессов регуляции восстановительных процессов в печени с использованием предложенных КИК.The disadvantages of using known methods, including the prototype, involving intrahepatic implantation of CICs based on biomatrix, include the insufficient amount of regulatory capabilities of the used matrices and, therefore, the insufficient severity of the processes of regulation of restoration processes in the liver using the proposed CIC.

Используемые в КИК матриксы:KIK matrices used:

- не обладают тканеспецифичностью и биоидентичностью, которые необходимы для активного взаимодействия адгезированных клеток с самим матриксом, так как он не представляет собой активной живой регуляторной структуры;- do not possess tissue specificity and bioidentity, which are necessary for the active interaction of adhered cells with the matrix itself, since it does not represent an active living regulatory structure;

- не участвуют в неогенезе гепатоподобных структур;- do not participate in the neogenesis of hepatoid structures;

- имеют низкую (не оптимальную) плотность прикрепления клеток;- have a low (not optimal) cell attachment density;

- не предотвращают гибель большого количества изолированных гепатоцитов;- do not prevent the death of a large number of isolated hepatocytes;

- не оптимизируют сроки жизнедеятельности КИК и эффективность их регуляторного воздействия на поврежденную печень.- do not optimize the life span of CFCs and the effectiveness of their regulatory effects on the damaged liver.

Задачей изобретения является разработка способа, повышающего эффективность лечения печеночной недостаточности за счет пролонгирования сроков выживания и большей плотности прикрепления клеток печени (КП) и МСК КМ в составе имплантируемых КИК, а также повышения ими регенераторной (восстановительной) активности ткани поврежденной печени (клетки печени и ее внеклеточный матрикс) путем имплантации КИК, в которых клетки в виде ассоциатов адгезированы на предварительно инкубированном тканеспецифическом мелкодисперсном матриксе из децеллюляризированной донорской печени млекопитающих.The objective of the invention is to develop a method that improves the treatment of liver failure by prolonging the survival time and a higher density of attachment of liver cells (KP) and MSC KM in implantable KIK, as well as increasing their regenerative (restoration) activity of damaged liver tissue (liver cells and its extracellular matrix) by KIK implantation, in which cells in the form of associates are adhered to a pre-incubated tissue-specific finely dispersed matrix of decells lyarizirovannoy donor mammalian liver.

Технический результат, достигаемый при осуществлении заявляемого способа, заключается в:The technical result achieved by the implementation of the proposed method is:

- более интенсивном и эффективном лечении печеночной недостаточности путем активизации: детоксикационных, синтетических и регенерационных (восстановительных) процессов в поврежденной печени, за счет более активно функционирующих КИК, имплантированных в поврежденную печень;- a more intensive and effective treatment of liver failure by activating: detoxification, synthetic and regeneration (recovery) processes in the damaged liver, due to more actively functioning CICs implanted in the damaged liver;

- создании тканеспецифического каркаса, предназначенного для прикрепления клеток и формирования в КИК тканеподобных структур (ассоциаты клеток печени на тканеспецифическом матриксе), обеспечивающих физиологичные условия функционирования и взаимодействия находящихся в них клеток с матриксом;- creating a tissue-specific framework designed for cell attachment and the formation of tissue-like structures in the CIC (liver cell associates on a tissue-specific matrix) that provide physiological conditions for the functioning and interaction of the cells in them with the matrix;

- активизации процессов прикрепления и повышения плотности прикрепления клеток на тканеспецифическом матриксе, за счет предварительного инкубирования (подготовки) этого матрикса in vitro в среде, содержащей растворимые компоненты внеклеточного (нативного) матрикса;- activating the processes of attachment and increasing the density of attachment of cells on a tissue-specific matrix, due to preliminary incubation (preparation) of this matrix in vitro in a medium containing soluble components of the extracellular (native) matrix;

- пролонгировании сроков выживания клеточного материала в составе КИК с активизацией пролиферации в них клеток печени за счет активизации взаимодействия клеток печени и МСК КМ в результате их предварительного сокультивирования in vitro на тканеспецифическом матриксе с образованием клеточных ассоциатов;- prolongation of the survival time of cellular material in the composition of KIK with the activation of proliferation of liver cells in them due to the activation of the interaction of liver cells and MSC KM as a result of their preliminary co-cultivation in vitro on a tissue-specific matrix with the formation of cell associates;

- пролонгировании жизнеспособности КИК после имплантации, но до иинтеграции ее тканями печени за счет погружения КИК в биополимерный гетерогенный коллагенсодержащий гидрогель, являющийся эквивалентом внутри и внеклеточного матрикса;- prolonging the viability of KIK after implantation, but before its integration by the liver tissues due to immersion of KIK in a biopolymer heterogeneous collagen-containing hydrogel, which is the equivalent of an intracellular matrix;

- создании условий для прорастания в тканеспецифический каркас сосудов, диффузии питательных веществ, кислорода и факторов тканевой дифференцировки к иммобилизированным печеночным клеткам и МСК КМ, обеспечивающих образование в зонах имплантации КИК новых дополнительных центров устойчивой регенерации печени, повышающих терапевтический эффект;- creating conditions for germination into the tissue-specific framework of blood vessels, diffusion of nutrients, oxygen and tissue differentiation factors to immobilized liver cells and KMC MSCs, ensuring the formation of new additional centers of stable liver regeneration in the KIK implantation zones that increase the therapeutic effect;

- отсутствии отторжения имплантата (используемый нативный матрикс тканеспецифичен, но видонеспецифичен).- the absence of implant rejection (the native matrix used is tissue-specific, but species-specific).

Достоинствами предложенного способа и имплантата для лечения печеночной недостаточности являются:The advantages of the proposed method and implant for the treatment of liver failure are:

- создание с помощью предварительно подготовленного тканеспецифического матрикса культуральных условий для прикрепления и пролиферации клеток в пространстве КИК и формирования в нем дополнительной «тканеподобной» длительно функционирующей структуры (ассоциаты клеток печени, МСК КМ и нативного матрикса);- creating, with the help of a previously prepared tissue-specific matrix, culture conditions for attachment and proliferation of cells in the KIK space and the formation of an additional “tissue-like” long-functioning structure (associates of liver cells, MSC KM and native matrix);

- создание физиологических условий для диффузии оксигенированной межтканевой жидкости и прорастания сосудов через тканеспецифический матрикс, что пролонгирует адекватные условия жизнеобеспечения и взаимодействия адгезированных клеток, матрикса и окружающей ткани печени;- the creation of physiological conditions for the diffusion of oxygenated interstitial fluid and the germination of blood vessels through a tissue-specific matrix, which prolongs adequate living conditions and the interaction of adherent cells, matrix and surrounding liver tissue;

- формирование КИК с длительно функционирующей тканеподобной структурой, что создает в поврежденной печени центры для ее устойчивой восстановительной регенерации, обеспечивающей выраженный лечебный эффект;- the formation of CFC with a long-functioning tissue-like structure, which creates centers in the damaged liver for its stable regenerative regeneration, which provides a pronounced therapeutic effect;

- использование в составе КИК аутологичных клеток предотвращает активацию иммунной системы после имплантации КИК и позволяет этой системе не участвовать в иммунном ответе, но оказывать длительное биорегуляторное воздействие на регенераторные процессы в поврежденной печени.- the use of autologous cells in the composition of the CIC prevents the activation of the immune system after CIC implantation and allows this system not to participate in the immune response, but to have a long bioregulatory effect on the regenerative processes in the damaged liver.

В предлагаемом изобретении не используются ткани и/или клеточный материал эмбрионов человека. Использован клеточный материал взрослых доноров.The present invention does not use tissue and / or cellular material of human embryos. Used cellular material of adult donors.

Сокультивирование клеток печени и МСК КМ на предварительно подготовленном in vitro тканеспецифическом матриксе перед имплантацией позволяет активизировать трехсторонние взаимодействия (клетки печени, МСК КМ и тканеспецифический матрикс) и дополнительно повышать функциональную активность гепатоцитов и МСК КМ, способствуя формированию сосудов и прорастанию их в матрикс за счет дифференцировки МСК КМ в эндотелиоциты.Co-cultivation of liver cells and MSCs KM on a pre-prepared in vitro tissue-specific matrix before implantation allows activation of trilateral interactions (liver cells, MSCs KM and tissue-specific matrix) and additionally increase the functional activity of hepatocytes and MSCs KM, contributing to the formation of blood vessels and their germination into the matrix due to differentiation MSCs CM in endotheliocytes.

Это процедура сокультивирования клеток печени и МСК КМ на предварительно подготовленном тканеспецифическом матриксе способствует более быстрой интеграции имплантата (КИК печени) в систему кровообращения поврежденной печени и доставки в нее по вновь образованным и проросшим сосудам кислорода и питательных веществ, создающих более адекватные условия для жизнеобеспечения клеток в составе КИК.This procedure of co-cultivation of liver cells and KMC MSCs on a previously prepared tissue-specific matrix facilitates faster integration of the implant (KIK of the liver) into the circulatory system of the damaged liver and delivery of oxygen and nutrients into it through newly formed and sprouted vessels, creating more adequate conditions for cell support in composition of the CFC.

Предлагаемый способ позволяют пролонгировано и более интенсивно лечить хроническую печеночную недостаточность за счет более эффективного и пролонгированного функционирования КИК, которое достигается путем обеспечения физиологичного взаимодействия, предварительно инкубированного тканеспецифического матрикса с гликопротеинами (фибронектин, ламинин) и последующей посадки на этот матрикс и сокультивирования на нем клеток печени и МСК КМ с образованием ассоциатов, а также их индукционного воздействия на ткань поврежденной печени. Имплантация аутологичных клеток в составе КИК позволяет исключить осложнения, связанные с реакцией отторжения. Предлагаемое изобретение позволяет также:The proposed method allows prolonged and more intensive treatment of chronic liver failure due to a more efficient and prolonged functioning of the CIC, which is achieved by providing physiological interaction, pre-incubated tissue-specific matrix with glycoproteins (fibronectin, laminin) and subsequent landing on this matrix and co-cultivation of liver cells on it and MSC KM with the formation of associates, as well as their induction effect on the tissue of the damaged liver. Implantation of autologous cells as part of the KIK allows to exclude complications associated with the rejection reaction. The invention also allows:

1. Создавать условия не только для прикрепления клеток печени и МСК КМ к трехмерному биосовместимому тканеспецифическому матриксу печени, но и создавать условия для их трехстороннего контактного и метаболического взаимодействия, которое активизирует пролиферацию и регуляторную активность клеток в составе КИК. Последнее поддерживается диффузией через тканеспецифический матрикс питательных веществ и кислорода, а так же различных регуляторных пептидов и факторов, которые поддерживают в КИК метаболизм и функцию не только клеток, но так же и самого матрикса.1. Create conditions not only for the attachment of liver cells and KMC MSCs to a three-dimensional biocompatible tissue-specific matrix of the liver, but also create conditions for their trilateral contact and metabolic interaction, which activates the proliferation and regulatory activity of cells in the composition of KIK. The latter is supported by diffusion through the tissue-specific matrix of nutrients and oxygen, as well as various regulatory peptides and factors that support the metabolism and function of CFCs not only in cells, but also in the matrix itself.

2. Создать каркас на основе трехмерного биосовместимого тканеспецифического матрикса печени, полностью повторяющего пространственную структуру архитектоники печени для тканеобусловленного прикрепления аутологичных клеток печени и МСК КМ и формирования в КИК гепатоподобных структурных единиц.2. To create a framework based on a three-dimensional biocompatible tissue-specific matrix of the liver, which repeats the spatial structure of the architectonics of the liver for tissue-related attachment of autologous liver cells and MSCs to CMs and the formation of hepatike structural units in the CIC.

3. Создать условия для формирования и прорастания в этот нативный тканеспецифический каркас сосудов для питания прикрепленных клеток и ускоренной интеграции КИК с тканями поврежденной печени.3. To create conditions for the formation and germination of vascular tissue-specific skeleton into this native tissue frame for the nutrition of attached cells and the accelerated integration of KIK with the tissues of the damaged liver.

4. Создать условия, препятствующие клеточной инфильтрации имплантата и поддерживающие сформированные клеточные ассоциаты в жизнеспособном состоянии за счет использования антикоагулянтов и антиагрегантов.4. To create conditions that impede the cell infiltration of the implant and maintain the formed cell associates in a viable state through the use of anticoagulants and antiplatelet agents.

5. Ускорить процесс реализации биорегуляторного и восстановительного воздействия КИК на поврежденную печень после имплантации за счет предварительного in vitro сокультивирования клеток печени и МСК КМ на мелкодисперсных частицах тканеспецифического матрикса, что позволяет имплантировать КИК в виде готовых жизнеспособных конструкций клеточных ассоциатов.5. Accelerate the process of implementing the bioregulatory and restorative effect of KIK on the damaged liver after implantation due to preliminary in vitro co-cultivation of liver cells and KMK MSCs on fine particles of a tissue-specific matrix, which allows KKK to be implanted in the form of ready-made viable designs of cell associates.

Предварительная обработка тканеспецифического матрикса гликопротеинами нативного внеклеточного матрикса повышает его адгезивные свойства, способствует повышению плотности посадки клеток и обеспечивает восстановление межклеточных и клеточно-матриксных взаимодействий, необходимых для интеграции КИК в поврежденную ткань печени.Pretreatment of the tissue-specific matrix with glycoproteins of the native extracellular matrix increases its adhesive properties, helps to increase cell density and ensures the restoration of intercellular and cell-matrix interactions necessary for the integration of KIK into damaged liver tissue.

Сущность изобретения заключается в следующем.The invention consists in the following.

Способ лечения печеночной недостаточности включает имплантацию в паренхиму печени клеточно-инженерной конструкци (КИК) с последующим назначением антикоагулянтов и антиагрегентов в профилактической дозе. При этом сначала в течение 8-12 часов при температуре 4°C инкубируют матрикс из децеллюляризированной донорской печени млекопитающего в физиологическом растворе, забуференном фосфатами. Физиологический раствор, забуференный фосфатами, имеет следующий состав: 138 мМ NaCl, 2,67 мМ KCl, 1,47 мМ KH2PO4, 8,1 мМ Na2HPO4, дистиллированная вода до 1 л и содержит гликопротеины - фибронектин и ламинин по 10 мкг/мл, имеет рН 7,4. Соотношение объемов матрикса и забуференного фосфатами физиологического раствора составляет 1:1. Затем на подготовленном матриксе в течение 2-4 суток проводят сокультивирование свежевыделенных аутологичных клеток печени и предварительно культивированных аутологичных мезенхимальных стволовых клеток костного мозга при соотношении клеток костного мозга к клеткам печени - от 1:1 до 1:10, обеспечивая прикрепление клеток в количестве 2×106-15×106 на 1 см3 матрикса в виде ассоциатов. При этом общий объем матрикса с прикрепленными клетками составляет не менее 0,05 см3. Перед имплантацией получают КИК, смешивая матрикс с прикрепленными к нему клетками и биополимерный гетерогенный коллагенсодержащий гидрогель в объемном соотношении 3:1.A method for treating liver failure involves implanting a cellular engineering construct (CIC) into the liver parenchyma, followed by the administration of anticoagulants and antiplatelet agents in a prophylactic dose. At the same time, the matrix from the decellularized donor liver of the mammal is incubated in physiological saline buffered with phosphates for 8-12 hours at a temperature of 4 ° C. The phosphate buffered saline has the following composition: 138 mM NaCl, 2.67 mM KCl, 1.47 mM KH 2 PO 4 , 8.1 mM Na 2 HPO 4 , distilled water up to 1 L and contains glycoproteins - fibronectin and laminin 10 μg / ml, has a pH of 7.4. The ratio of the volumes of the matrix and phosphate buffered saline is 1: 1. Then, on the prepared matrix, co-cultivation of freshly isolated autologous liver cells and previously cultured autologous mesenchymal stem cells of the bone marrow is carried out for 2-4 days at a ratio of bone marrow to liver cells from 1: 1 to 1:10, providing cell attachment in an amount of 2 × 10 6 -15 × 10 6 per 1 cm 3 of the matrix in the form of associates. Moreover, the total volume of the matrix with attached cells is at least 0.05 cm 3 . Before implantation, KIK is obtained by mixing the matrix with cells attached to it and a biopolymer heterogeneous collagen-containing hydrogel in a volume ratio of 3: 1.

В частном случае матрикс получают из децеллюляризированной донорской печени человека.In a particular case, the matrix is obtained from the decellularized human donor liver.

В частном случае матрикс имеет размеры частиц от 200 до 700 мкм, размеры пор не более 50 мкм и суммарную пористость 70-85%.In a particular case, the matrix has particle sizes from 200 to 700 microns, pore sizes of not more than 50 microns and a total porosity of 70-85%.

В качестве биополимерного гетерогенного коллагенсодержащего гидрогеля может быть использован Сферогель.As a biopolymer heterogeneous collagen-containing hydrogel, Spherogel can be used.

Способ осуществляют следующим образом, и включает в себя несколько последовательных этапов:The method is as follows, and includes several successive steps:

1). Выделение аутологичных мезенхимальных стволовых клеток костного мозга.one). Isolation of autologous bone marrow mesenchymal stem cells.

Выделение мезенхимальных стволовых клеток костного мозга осуществляют по традиционной методике (Шумаков В.И., Онищенко Н.А., Крашенинников М.Е. и др. Костный мозг как источник получения мезенхимальных клеток для восстановления терапии поврежденных органов. // Вестник трансплантологии и иск. органов 2002, 4, с. 3-6; Шумаков В.И., Онищенко Н.А. и соавт. Биологические резервы клеток костного мозга и коррекция органных дисфункций. //Москва, Лавр. 2009. - С. 61-67). За 4-7 дней до основного оперативного вмешательства под местным обезболиванием пунктируют подвздошную кость пациента и забирают костный мозг в объеме 40-150 мл в стерильную емкость с раствором Хенкса, содержащим: 200 мкг/мл гентамицина; 10,0 мкг/мл инсулина; 0,25 мкМ дексамезатона; 250 ед/мл гепарина. Суспензию клеток центрифугируют 5 мин при 1500 об/мин, осадок клеток ресуспендируют в лизирующем растворе (114 мМ NH4Cl; 7,5 мМ KHCO3; 100 мкМ EDTA), в соотношении 1:4 от исходного объема аспирата, в течение 5-10 мин и центрифугируют 3 мин при 1500 об/мин при комнатной температуре. Гемолизированный суспернатант полностью удаляют отсасыванием. Добиваются полного лизиса эритроцитов, для чего процедуру лизирования проводят трижды с последующим отмыванием клеток центрифугированием. Клеточный осадок, свободный от эритроидных и тромбоцитарных форм, ресуспендируют в ростовой среде.The selection of mesenchymal stem cells of the bone marrow is carried out according to the traditional method (Shumakov V.I., Onishchenko N.A., Krasheninnikov M.E. et al. Bone marrow as a source for obtaining mesenchymal cells to restore therapy for damaged organs. // Bulletin of Transplantology and lawsuit organs 2002, 4, pp. 3-6; Shumakov V.I., Onishchenko N.A. et al. Biological reserves of bone marrow cells and correction of organ dysfunctions // Moscow, Lavr. 2009. - P. 61-67 ) 4-7 days before the main surgery, the patient’s iliac bone is punctured under local anesthesia and the bone marrow is taken in a volume of 40-150 ml in a sterile container with a Hanks solution containing: 200 μg / ml gentamicin; 10.0 μg / ml insulin; 0.25 μM dexamezatone; 250 units / ml of heparin. The cell suspension is centrifuged for 5 min at 1500 rpm, the cell pellet is resuspended in a lysis solution (114 mm NH 4 Cl; 7.5 mm KHCO 3 ; 100 μm EDTA), in a ratio of 1: 4 from the initial volume of aspirate, for 5- 10 min and centrifuged for 3 min at 1500 rpm at room temperature. The hemolyzed suspension is completely removed by suction. A complete lysis of red blood cells is achieved, for which the lysis procedure is carried out three times with subsequent washing of the cells by centrifugation. A cell pellet free of erythroid and platelet forms is resuspended in a growth medium.

2). Культивирование аутологичных мезенхимальных стволовых клеток костного мозга in vitro.2). In vitro cultivation of autologous mesenchymal bone marrow stem cells.

Культивирование мезенхимальных стволовых клеток костного мозга осуществляют по традиционной методике (Шумаков В.И., Онищенко Н.А., Крашенинников М.Е. и др. Костный мозг как источник получения мезенхимальных клеток для восстановления терапии поврежденных органов. //Вестник трансплантологии и иск. органов. 2002, 4, с. 3-6; Шумаков В.И., Онищенко Н.А. и соавт. Биологические резервы клеток костного мозга и коррекция органных дисфункций. // Москва, Лавр. 2009. - С. 77-100). Частично очищенные мезенхимальные стволовые клетки костного мозга высевают для культивирования на чашки Петри d=60 мм в количестве 1,5-2,0 млн. клеток/мл. Культивируют при 37°C в CO2-инкубаторе, атмосфера 5% CO2 и 95% влажности в течение 7 суток с однократной сменой среды на третьи сутки. Через неделю, культура клеток костного мозга содержала до 10% прикрепившихся к пластику распластанных фибробластоподобных и моноцитарных клеток и до 90% свободно плавающих в суспензии, округлых не прикрепившихся клеток (гемопоэтические клетки). Не прикрепившиеся к пластику мезенхимальные стволовые клетки костного мозга отбирали и затем использовали для иммобилизации на мелкодисперсный тканеспецифический матрикс вместе со свежевыделенными клетками печени.The cultivation of mesenchymal stem cells of the bone marrow is carried out according to the traditional method (Shumakov V.I., Onishchenko N.A., Krasheninnikov M.E. et al. Bone marrow as a source for obtaining mesenchymal cells to restore therapy for damaged organs. // Bulletin of Transplantology and lawsuit organs. 2002, 4, pp. 3-6; Shumakov V.I., Onishchenko N.A. et al. Biological reserves of bone marrow cells and correction of organ dysfunctions // Moscow, Laurel. 2009. - P. 77- one hundred). Partially purified bone marrow mesenchymal stem cells are seeded for cultivation on Petri dishes d = 60 mm in an amount of 1.5-2.0 million cells / ml. Cultivated at 37 ° C in a CO 2 incubator, an atmosphere of 5% CO 2 and 95% humidity for 7 days with a single change of medium on the third day. After a week, the bone marrow cell culture contained up to 10% of flattened fibroblast-like and monocytic cells attached to the plastic and up to 90% freely floating in suspension, rounded non-attached cells (hematopoietic cells). Bone marrow-free mesenchymal stem cells were selected and then used for immobilization on a finely divided tissue-specific matrix together with freshly isolated liver cells.

3). Предварительная подготовка мелкодисперсного тканеспецифического матрикса для посадки клеток.3). Preliminary preparation of a finely divided tissue-specific matrix for planting cells.

Мелкодисперсный тканеспецифический матрикс из децеллюляризированной донорской печени млекопитающих, изготовленный по патенту РФ №2539918 от 27.01.2015 г. «Способ получения тканеспецифического матрикса для тканевой инженерии паренхиматозного органа», инкубируют in vitro в течение 8-12 часов при температуре 4°C в физиологическом растворе, забуференном фосфатами. Фосфатный буфер имеет следующий состав: 138 мМ NaCl, 2,67 мМ KCl, 1,47 мМ KH2PO4, 8,1 мМ Na2HPO4, дистиллированная вода до 1 л, рН 7,4 с добавлением в него гликопротеинов (например, фибронектина и ламинина по 10 мкг/мл), причем матрикс и физиологический раствор, забуференный фосфатами, используется для инкубации в равных объемах, соотношении 1:1.A finely dispersed tissue-specific matrix from a decellularized donor liver of mammals, made according to the patent of the Russian Federation No. 2539918 dated January 27, 2015. “A method for producing a tissue-specific matrix for tissue engineering of the parenchymal organ”, incubated in vitro for 8-12 hours at a temperature of 4 ° C in physiological solution phosphate buffered. The phosphate buffer has the following composition: 138 mM NaCl, 2.67 mM KCl, 1.47 mM KH 2 PO 4 , 8.1 mM Na 2 HPO 4 , distilled water up to 1 L, pH 7.4 with the addition of glycoproteins ( for example, fibronectin and laminin at 10 μg / ml), moreover, the matrix and physiological saline buffered with phosphates are used for incubation in equal volumes, in a ratio of 1: 1.

4). Выделение аутологичных клеток печени.four). Isolation of autologous liver cells.

Производят резекцию 2-4×2-4×1-2 см ткани печени у пациентов с печеночной недостаточностью для получения клеток печени. Выделение аутологичных клеток печени осуществляют по традиционной методике (Fontaine М, Schloo В, Jenkins R, Uyama S, Hansen L, Vacanti J.P. Human hepatocyte isolation and transplantation into an athymic rat, using prevascularized cell polymer constructs. // Pediatr. Surg. -1995. - vol. 30 (l). - P. 56-60; Hang H, Shi X, Gu G, Wu Y, Ding Y. A simple isolation and cryopreservation method for adult human hepatocytes // Int J Artif Organs. 2009 Oct; 32 (10). - P. 720-7; Lehec S.C, Hughes RD, Mitry R.R, Graver M.A, Verma A, Wade J.J, Dhawan A. Experience of microbiological screening of human hepatocytes for clinical transplantation. // Cell Transplant. 2009; 18 (8). - P. 941-947; Seglen O. Preparation of isolated rat liver cells. // Methods. Cell. Biol. 1976. - vol. 13. - P. 29-83).Resection of 2-4 × 2-4 × 1-2 cm of liver tissue is performed in patients with liver failure to obtain liver cells. The selection of autologous liver cells is carried out according to the traditional method (Fontaine M, Schloo B, Jenkins R, Uyama S, Hansen L, Vacanti JP Human hepatocyte isolation and transplantation into an athymic rat, using prevascularized cell polymer constructs. // Pediatr. Surg. -1995 . - vol. 30 (l). - P. 56-60; Hang H, Shi X, Gu G, Wu Y, Ding Y. A simple isolation and cryopreservation method for adult human hepatocytes // Int J Artif Organs. 2009 Oct ; 32 (10). - P. 720-7; Lehec SC, Hughes RD, Mitry RR, Graver MA, Verma A, Wade JJ, Dhawan A. Experience of microbiological screening of human hepatocytes for clinical transplantation. // Cell Transplant. 2009; 18 (8). - P. 941-947; Seglen O. Preparation of isolated rat liver cells. // Methods. Cell. Biol. 1976. - vol. 13. - P. 29-83).

Выделение аутологичных клеток печени производят из резецированного участка печени путем 3-кратной отмывки кусочка печени от крови и измельчения его на холоду (t=4°C) в чашке Петри, с 3-кратной отмывкой образовавшейся взвеси буферным раствором без кальция [1000 мл дистиллированной воды, 8.3 г NaCl, 0.5 г KCl, 2.38 г HEPES, рН 7,4, 37°C] в течение 7 минут. После этого мелкие кусочки печени инкубируются 3 раза раствором коллагеназы [1000 мл дистиллированной воды, 8.3 г NaCl, 0.5 г KCl, 0.7 г CaCl2, 2.38 г HEPES, 7.5 мг ингибитор трипсина и 500 мг коллагеназы Тип IV-S (>125 CDU/mg), рН 7,3; 37°C] в течение 6-8 минут с последующей заменой ферментного раствора с использованием центрифугирования 500 об/мин в течение 1 минуты при t=37°C. Полученный материал переносят на сито с ячейками 200 мкм и фильтруют промыванием питательной средой William′s Е с 10% фетальной бычьей сыворотки, после чего суспензию отдельных клеток и небольших агрегатов переносят в центрифужную пробирку и центрифугируют при 500 об/мин при 4°C в течение 1 минуты. Супернатант удаляют, осадок ресуспендируют в такой же свежей среде и опять центрифугируют. Процедуру повторяют 3 раза. Жизнеспособность клеток оценивают методом окрашивания трипановым синим. Добиваются получения количества клеток в пределах от 3,0×108 до 4,0×108 гепатоцитов на 12-15 г веса ткани печени. Клеточная суспензия должна содержать: гепатоциты, непаренхиматозные клетки печени, которые определяют при световой микроскопии. Разделение паренхиматозных и непаренхиматозных клеток не выполняют. Взвесь клеток печени концентрируют в 1-2 мл физиологического раствора.Autologous liver cells are isolated from the resected liver by 3 times washing a piece of the liver from the blood and grinding it in the cold (t = 4 ° C) in a Petri dish with 3 times washing the resulting suspension with a buffer solution without calcium [1000 ml of distilled water , 8.3 g of NaCl, 0.5 g of KCl, 2.38 g of HEPES, pH 7.4, 37 ° C] for 7 minutes. After that, small pieces of the liver are incubated 3 times with a collagenase solution [1000 ml of distilled water, 8.3 g NaCl, 0.5 g KCl, 0.7 g CaCl 2 , 2.38 g HEPES, 7.5 mg trypsin inhibitor and 500 mg collagenase Type IV-S (> 125 CDU / mg), pH 7.3; 37 ° C] for 6-8 minutes, followed by replacement of the enzyme solution using centrifugation at 500 rpm for 1 minute at t = 37 ° C. The resulting material was transferred to a sieve with 200 μm cells and filtered by washing with William′s E nutrient medium with 10% fetal bovine serum, after which a suspension of individual cells and small aggregates was transferred to a centrifuge tube and centrifuged at 500 rpm at 4 ° C for 1 minutes The supernatant is removed, the precipitate is resuspended in the same fresh medium and centrifuged again. The procedure is repeated 3 times. Cell viability is evaluated by trypan blue staining. Achieve the number of cells in the range from 3.0 × 10 8 to 4.0 × 10 8 hepatocytes per 12-15 g of liver tissue weight. The cell suspension should contain: hepatocytes, non-parenchymal liver cells, which are determined by light microscopy. Separation of parenchymal and non-parenchymal cells is not performed. A suspension of liver cells is concentrated in 1-2 ml of saline.

5). Посадка (иммобилизация) аутологичных клеток печени и аутологичных мезенхимальных стволовых клеток костного мозга на мелкодисперсный тканеспецифический, предварительно подготовленный матрикс печени для создания КИК печени.5). Planting (immobilization) of autologous liver cells and autologous mesenchymal bone marrow stem cells on a finely divided tissue-specific, pre-prepared liver matrix to create a liver CIC.

Посадку (иммобилизацию) клеточного материала осуществляют по традиционной методике (Mooney D.J., Sano K., Kaufmann P.M., Majahod K., Schloo В., Vacanti J.P., Langer R. Long-term engraftment of hepatocytes transplanted о biodegradable polymer sponges // J. Biomed. Mater. Res. - 1997. - Vol .5. - P. 413-420).Planting (immobilization) of cellular material is carried out according to a traditional technique (Mooney DJ, Sano K., Kaufmann PM, Majahod K., Schloo B., Vacanti JP, Langer R. Long-term engraftment of hepatocytes transplanted about biodegradable polymer sponges // J. Biomed. Mater. Res. - 1997. - Vol. 5. - P. 413-420).

Аутологичные клетки печени и аутологичные мезенхимальные стволовые клетки костного мозга клетки костного мозга ресуспендировали в ростовой среде [William′s Е с заменой аргинина на орнитин, с добавлением фетальной бычьей сыворотки, фактора роста гепатоцитов, эпидермального фактора роста, β-субъединицы холерного токсина, дексамезатона, этаноламина, селенита натрия, глюкагона, инсулина, инсулино-подобного фактора роста-I, аскорбиновой кислоты, линолеивой и линоливой жирных кислот] в концентрации 2,0-4,0×106 клеток печени/мл и 2,0-4,0×106 мезенхимальных стволовых клеток костного мозга клеток клеток костного мозга/мл. Суммарную клеточную суспензию наносили на предварительно подготовленный матрикс в концентрации 2×106-15×106 на 1 см3.Autologous liver cells and autologous mesenchymal bone marrow stem cells, bone marrow cells were resuspended in growth medium [William′s E with the replacement of arginine with ornithine, with the addition of fetal bovine serum, hepatocyte growth factor, epidermal growth factor, cholera toxin β-subunit, dexamezatone, ethanolamine, sodium selenite, glucagon, insulin, insulin-like growth factor-I, ascorbic acid, linoleic and linoleic fatty acids] at a concentration of 2.0-4.0 × 10 6 liver cells / ml and 2.0-4.0 × 10 June mezenhimal 's bone marrow stem cells of bone marrow cells cells / ml. The total cell suspension was applied to a pre-prepared matrix at a concentration of 2 × 10 6 -15 × 10 6 per 1 cm 3 .

В качестве матрикса может быть использован, например, биоматериал, созданный из децеллюляризированной печени млекопитающих - трехмерный биосовместимый тканеспецифический матрикс печени (Готье С.В. и соавт. патент на изобретение №2539918 от 21.01.2015 г.), предварительно подготовленный по вышеописанному способу (пункт №3).As a matrix, for example, biomaterial created from the decellularized liver of mammals can be used — a three-dimensional biocompatible tissue-specific matrix of the liver (Gauthier S.V. et al. Patent for invention No. 2539918 of January 21, 2015), previously prepared by the above method ( paragraph number 3).

6). Сокультивирование in vitro аутологичных мезенхимальных стволовых клеток костного мозга и аутологичных клеток печени на предварительно подготовленном мелкодисперсном матриксе из децеллюляризированной печени млекопитающих.6). In vitro co-cultivation of autologous bone marrow mesenchymal stem cells and autologous liver cells on a pre-prepared, finely divided matrix of mammalian decellularized liver.

Выполняли сокультивирование аутологичных клеток печени и мезенхимальных стволовых клеток костного мозга по общепринятой методике (Kaufmann P.M., Sano K., Uyama S., Breuer C.K., Organ G.M., Schloo B.L., Kluth D., Vacanti J.P. Evaluation of Methods of Hepatotrophic Stimulation in Rat Heterotopic Hepatocyte Transplantation Using Polymers // J. of Pediatric Surgeru. - 1999. - Vol. 34. - P.1118-1123; Uyama S., Kaufmann P.M., Takeda Т., Vacanti J.P. Delivery of whole liver equivalent hepatocyte mass using polymer devices and hepatotrophic stimulation 935), используя соотношение клеток печени к МСК КМ от 1:1 до 1:10.Autologous liver cells and bone marrow mesenchymal stem cells were co-cultured according to the generally accepted methodology (Kaufmann PM, Sano K., Uyama S., Breuer CK, Organ GM, Schloo BL, Kluth D., Vacanti JP Evaluation of Methods of Hepatotrophic Stimulation in Rat Heterotopic Hepatocyte Transplantation Using Polymers // J. of Pediatric Surgeru. - 1999. - Vol. 34. - P.1118-1123; Uyama S., Kaufmann PM, Takeda T., Vacanti JP Delivery of whole liver equivalent hepatocyte mass using polymer devices and hepatotrophic stimulation 935), using the ratio of liver cells to MSCs KM from 1: 1 to 1:10.

Это позволяло обеспечить возникновение трехсторонних взаимодействий (клетки печени, МСК КМ и предварительно подготовленный матрикс из децеллюляризированной печени млекопитающих) и до имплантации КИК в печень повысить жизнеспособность в них клеток печени и мезенхимальных стволовых клеток костного мозга и способность их к формированию печеночноподобных структур, способных выполнять не только специфические функции, но и способствовать формированию из МСК КМ (эндотелиоцитов) сосудов и желчных протоков и их прорастанию как в КИК, так и в ткань печени.This made it possible to ensure the occurrence of trilateral interactions (liver cells, KMC MSCs and a pre-prepared matrix from the decellularized liver of mammals) and, prior to implantation of CFCs in the liver, increase the viability of liver cells and bone marrow mesenchymal stem cells and their ability to form liver-like structures capable of not only specific functions, but also contribute to the formation of MSCs from the MSC (endotheliocytes) of blood vessels and bile ducts and their germination both in the CIC and in liver tissue.

Тканеспецифический матрикс печени с клетками помещали в стерильную камеру для инкубации in vitro в ростовой среде [William′s Е с заменой аргинина на орнитин, с добавлением фетальной бычьей сыворотки, фактора роста гепатоцитов, эпидермального фактора роста, Р-субъединицы холерного токсина, дексамезатона, этаноламина, селенита натрия, глюкагона, инсулина, инсулино-подобного фактора роста-I, аскорбиновой кислоты, линолиевой и линоленовой жирных кислот] на 2-4 суток.A tissue-specific liver matrix with cells was placed in a sterile chamber for in vitro incubation in growth medium [William′s E with the replacement of arginine with ornithine, with the addition of fetal bovine serum, hepatocyte growth factor, epidermal growth factor, cholera toxin P subunit, dexamezatone, ethanolamine , sodium selenite, glucagon, insulin, insulin-like growth factor-I, ascorbic acid, linoleic and linolenic fatty acids] for 2-4 days.

7). Подготовка КИК печени для имплантации.7). Preparation of liver CIC for implantation.

Полученные КИК (предварительно подготовленный тканеспецифический матрикс печени с иммобилизированными аутологичными клетками печени и мезенхимальными стволовыми клетками костного мозга с образованием клеточных ассоциатов) ресуспендировали из ростовой среды и смешивали с коллагенсодержащим гидрогелем, например, с биополимерным гетерогенным коллагенсодержащим гидрогелем - Сферогель(СфероГЕЛЬ®) в соотношении объемов 3:1 для оптимизации массобмена между КИК и тканью печени до ее интеграции после имплантации.Obtained CIC (previously prepared tissue-specific matrix liver with immobilized autologous cells of the liver and bone marrow mesenchymal stem cells to form a cell associates) are resuspended in growth medium and mixed with a collagen hydrogel, e.g., a biopolymer heterogeneous collagen hydrogel - Sferogel (SferoGEL ®) in a volume ratio of 3: 1 to optimize mass transfer between CIC and liver tissue before its integration after implantation.

8). Имплантация КИК печени (предварительно подготовленный тканеспецифический матрикс печени с предварительно иммобилизированными аутологичными клетками печени и мезенхимальными стволовыми клетками костного мозга в паренхиму поврежденной печени).8). Implantation of liver CIC (pre-prepared tissue-specific liver matrix with pre-immobilized autologous liver cells and bone marrow mesenchymal stem cells into the parenchyma of the damaged liver).

Имплантацию КИК печени (тканеспецифичный матрикс с иммобилизированными аутологичными клетками печени и аутологичными мезенхимальными стволовыми клетками костного мозга в виде ассоциатов) осуществляют пациентам с печеночной недостаточностью в поврежденную печень.Implantation of liver CIC (tissue-specific matrix with immobilized autologous liver cells and autologous mesenchymal bone marrow stem cells in the form of associates) is performed in patients with hepatic insufficiency in a damaged liver.

9). Использование антикоагулянтов и антиагрегантов.9). The use of anticoagulants and antiplatelet agents.

После имплантации КИК печени (предварительно подготовленный тканеспецифический матрикс с иммобилизированными аутологичными клетками печени и аутологичными мезенхимальными стволовыми клетками костного мозга в виде ассоциатов пациентам назначают антикоагулянты в профилактической дозе, например: гепарин 5000 ME каждые 12 часов в течение 7-10 дней под контролем свертывающей системы крови и антиагреганты, например, трентал из расчета 45 мг/м2 поверхности тела каждые 12 часов в течение 30-90 дней.After implantation of a liver CIC (a pre-prepared tissue-specific matrix with immobilized autologous liver cells and autologous mesenchymal bone marrow stem cells in the form of associates), patients are prescribed anticoagulants in a preventive dose, for example: heparin 5000 ME every 12 hours for 7-10 days under the control of the blood coagulation system and antiplatelet agents, for example, trental at the rate of 45 mg / m 2 of the body surface every 12 hours for 30-90 days.

Предложенный имплантат (КИК печени) для лечения печеночной недостаточности, состоит из предварительно подготовленного тканеспецифического матрикса печени млекопитающих и посаженых на него аутологичных мезенхимальных стволовых клеток костного мозга и аутологичных клеток печени с образованием ассоциатов до имплантации.The proposed implant (CIC of the liver) for the treatment of liver failure consists of a previously prepared tissue-specific matrix of the liver of mammals and autologous bone marrow mesenchymal stem cells and autologous liver cells planted on it with the formation of associates before implantation.

Для доказательства возможности достижения заявленного назначения и достижения указанного технического результата приводим следующие данные.To prove the possibility of achieving the stated purpose and achieving the specified technical result, we present the following data.

Пример осуществления предлагаемого способа с использованием предлагаемого имплантата в эксперименте.An example implementation of the proposed method using the proposed implant in the experiment.

Моделирование хронической печеночной недостаточности у животных (крысы) осуществляли по признанной и адекватной модели (Фишер А. Физиология и экспериментальная патология печени. // А. Фишер. - Будапешт, 1961, - 230 с; Колпащикова И.Ф. Влияние трансплантации клеток тимуса, костного мозга и селезенки на восстановительные процессы в патологически измененной печени. // Бюл. эксперим. биол. и мед., - 1979, №10. - С. 477-480; Колпащикова И.Ф. Общие и местные изменения в организме при экспериментальном повреждении печени и ее регенерация. // Автореф. докт. дисс - 1982, Казань. - 41 с.) путем введения 60% раствора CCl4, первые два введения по 0,5 мл на 100 г массы, последующие по 0,3 мл на 100 г массы тела. Курс введения 6 недель с частотой - 2 введения в неделю.Modeling of chronic liver failure in animals (rats) was carried out according to a recognized and adequate model (Fisher A. Physiology and experimental pathology of the liver. // A. Fisher. - Budapest, 1961, - 230 s; Kolpashchikova I.F. Effect of thymus cell transplantation, bone marrow and spleen on restoration processes in a pathologically altered liver. // Bull. experimental biol. and honey., 1979, No. 10. - P. 477-480; Kolpashchikova I.F. General and local changes in the body during experimental damage to the liver and its regeneration. // Author. Doctoral diss. - 1982, Ka lesson - 41 s.) by introducing a 60% solution of CCl 4 , the first two injections of 0.5 ml per 100 g of mass, followed by 0.3 ml per 100 g of body weight. The course of administration is 6 weeks with a frequency of 2 injections per week.

1). Осуществляли по традиционной методике выделение аутологичных мезенхимальных стволовых клеток костного мозга.one). Autologous bone marrow mesenchymal stem cells were isolated by a traditional technique.

Получали клеточный аспират из костномозгового канала большеберцовых костей (крысы) путем промывания полости фосфатно-буферным раствором, содержащим 50 ед/мл гепарина и 0,25 мг/л гентамицина с помощью иглы 18G, насаженной на шприц. Суспензию клеток центрифугировали, осадок клеток ресуспендировали в лизирующем растворе при комнатной температуре в течение 3 мин и снова центрифугировали 3-5 мин при 1500 об/мин. Гемолизированный супернатант полностью удаляли отсасыванием, а клеточный осадок, содержащий мезенхимальные стволовые клетки костного мозга ресуспендировали в ростовой среде. Интерфазу с мононуклеарными клетками собирали с поверхности эритроидного осадка и ресуспендировали в лизирующем растворе, в соотношении 1:4, в течение 5-8 мин и центрифугировали 5 мин при 1500 об/мин при комнатной температуре. Гемолизированный супернатант полностью удаляли. Добивались полного лизиса эритроцитов, для чего процедуру лизирования проводили дважды или трижды с последующим отмыванием клеток центрифугированием. Клеточный осадок, свободный от эритроидных и тромбоцитарных форм, в количестве 60-150×106 клеток объединяли с осадком клеток, полученным из плазмы, и далее ресуспендировали в ростовой среде для стимуляции роста клеток.A cell aspirate was obtained from the medullary canal of the tibia (rat) by washing the cavity with a phosphate-buffered solution containing 50 u / ml heparin and 0.25 mg / l gentamicin using an 18G needle inserted into the syringe. The cell suspension was centrifuged, the cell pellet was resuspended in a lysis solution at room temperature for 3 minutes, and again centrifuged for 3-5 minutes at 1500 rpm. The hemolyzed supernatant was completely removed by suction, and the cell pellet containing bone marrow mesenchymal stem cells was resuspended in a growth medium. Interphase with mononuclear cells was collected from the surface of the erythroid sediment and resuspended in a lysis solution, in the ratio 1: 4, for 5-8 minutes and centrifuged for 5 minutes at 1500 rpm at room temperature. The hemolyzed supernatant was completely removed. A complete lysis of erythrocytes was achieved, for which the lysis procedure was carried out twice or thrice, followed by washing the cells by centrifugation. The cell pellet, free of erythroid and platelet forms, in the amount of 60-150 × 10 6 cells was combined with a cell pellet obtained from plasma, and then resuspended in growth medium to stimulate cell growth.

2). Осуществляли по традиционной методике культивирование мезенхимальных стволовых клеток костного мозга.2). The bone marrow mesenchymal stem cells were cultured according to the traditional method.

Частично очищенные мезенхимальные стволовые клетки костного мозга высевали для культивирования в количестве 1,5-2,0 млн. клеток/мл. Культивировали при 37°C в CO2-инкубаторе, атмосфере 5% CO2 и 95% влажности в течение 7 суток с однократной сменой среды на третьи сутки.Partially purified bone marrow mesenchymal stem cells were seeded for cultivation in an amount of 1.5-2.0 million cells / ml. Cultivated at 37 ° C in a CO 2 incubator, an atmosphere of 5% CO 2 and 95% humidity for 7 days with a single change of medium on the third day.

3). Мелкодисперсный тканеспецифический матрикс из децеллюляризированной донорской печени крысы, изготовленный по патенту №2539918 от 21.01.2015 г. «Способ получения тканеспецифического матрикса для тканевой инженерии паренхиматозного органа», инкубируется in vitro в течение 8-12 часов при температуре 4°C в физиологическом растворе, забуференном фосфатами, который имеет следующий состав: 138 мМ NaCl, 2,67 мМ KCl, 1,47 мМ KH2PO4, 8,1 мМ Na2HPO4, дистиллированная вода до 1 л, рН 7,4 с добавлением в него гликопротеинов (например, фибронектина и ламинина по 10 мкг/мл), причем матрикс и физиологический раствор, забуференный фосфатами, используется для инкубации в равных объемах, например в соотношении 1:1.3). A finely dispersed tissue-specific matrix from a decellularized donor rat liver, made according to patent No. 2539918 dated January 21, 2015. “A method for producing a tissue-specific matrix for tissue engineering of the parenchymal organ”, is incubated in vitro for 8-12 hours at a temperature of 4 ° C in physiological solution, phosphate-buffered, which has the following composition: 138 mm NaCl, 2.67 mm KCl, 1.47 mm KH 2 PO 4 , 8.1 mm Na 2 HPO 4 , distilled water to 1 l, pH 7.4 with the addition of it glycoproteins (for example, fibronectin and laminin at 10 μg / ml), and Trix and physiological saline buffered by phosphates are used for incubation in equal volumes, for example, in a ratio of 1: 1.

4). Выделение аутологичных клеток печени осуществляли по традиционной методике.four). The selection of autologous liver cells was carried out according to the traditional method.

Выделение аутологичных клеток печени из резецированного участка печени (1×1×0,5 см у крыс) производилось путем 3-кратной отмывки от крови и измельчения его на холоду (t=4°C), с 3-кратной отмывкой образовавшейся взвеси буферным раствором без кальция в течение 7 минут. После этого мелкие кусочки печени были проинкубированы 3 раза раствором коллагеназы в течение 6-8 минут с последующей заменой ферментного раствора с использованием центрифугирования 500 об/мин в течение 1 минуты при t=37°C. Полученный материал переносился на сито с ячейками 200 мкм и фильтровался промыванием питательной средой William′s Е с 10% фетальной бычьей сыворотки, после чего суспензию клеток центрифугировали при 500 об/мин при 4°C в течение 1 минуты. Супернатант удаляли, осадок ресуспендировали в такой же свежей среде и опять центрифугировали. Процедуру повторяли 3 раза. Жизнеспособность клеток, колебавшуюся в пределах от 83 до 95%, оценивали методом окрашивания трипановым синим. Количество клеток колебалось в пределах от 3,0×108 до 4,0×108 гепатоцитов на 15 г веса ткани печени. Клеточная суспензия содержала: гепатоциты ~95÷98%, и ~5÷2% непаренхиматозных клеток печени, которые были определены при световой микроскопии. Разделение паренхиматозных и непаренхиматозных клеток не выполнялось. Взвесь клеток печени концентрировали в 1-2 мл физиологического раствора.Autologous liver cells were isolated from the resected liver region (1 × 1 × 0.5 cm in rats) by washing 3 times from blood and grinding it in the cold (t = 4 ° C), washing the resulting suspension 3 times with buffer solution without calcium for 7 minutes. After that, small pieces of the liver were incubated 3 times with a collagenase solution for 6-8 minutes, followed by replacement of the enzyme solution using centrifugation at 500 rpm for 1 minute at t = 37 ° C. The resulting material was transferred to a sieve with 200 μm cells and filtered by washing with William′s E nutrient medium with 10% fetal bovine serum, after which the cell suspension was centrifuged at 500 rpm at 4 ° C for 1 minute. The supernatant was removed, the pellet was resuspended in the same fresh medium and centrifuged again. The procedure was repeated 3 times. Cell viability, ranging from 83 to 95%, was evaluated by trypan blue staining. The number of cells ranged from 3.0 × 10 8 to 4.0 × 10 8 hepatocytes per 15 g of liver tissue weight. The cell suspension contained: hepatocytes ~ 95 ÷ 98%, and ~ 5 ÷ 2% non-parenchymal liver cells, which were determined by light microscopy. Separation of parenchymal and non-parenchymal cells was not performed. A suspension of liver cells was concentrated in 1-2 ml of saline.

5). Аутологичные клетки печени и аутологичные мезенхимальные стволовые клетки костного мозга ресуспендировали в ростовой среде [William′s Е с заменой аргинина на орнитин, с добавлением фетальной бычьей сыворотки, фактора роста гепатоцитов, эпидермального фактора роста, β-субъединицы холерного токсина, дексамезатона, этаноламина, селенита натрия, глюкагона, инсулина, инсулино-подобного фактора роста-I, аскорбиновой кислоты, линоленовой и линолиевой жирных кислот] в концентрации 2,0-4,0×106 клеток печени/мл и 2,0-4,0×106 мезенхимальных стволовых клеток костного мозга клеток костного мозга/мл. Суммарную клеточную суспензию наносили на предварительно подготовленный матрикс в концентрации 2×106-15×106 на 1 см3.5). Autologous liver cells and autologous mesenchymal bone marrow stem cells were resuspended in growth medium [William′s E with replacement of arginine with ornithine, supplemented with fetal bovine serum, hepatocyte growth factor, epidermal growth factor, cholera toxin β-subunit, dexamezatone, ethanolamine, selenite sodium, glucagon, insulin, insulin-like growth factor-I, ascorbic acid, linolenic and linoleic fatty acids] at a concentration of 2.0-4.0 × 10 6 liver cells / ml and 2.0-4.0 × 10 6 mesenchymal stem cells bone marrow bone marrow cells / ml. The total cell suspension was applied to a pre-prepared matrix at a concentration of 2 × 10 6 -15 × 10 6 per 1 cm 3 .

6). Выполняли in vitro сокультивирование аутологичных клеток печени и мезенхимальных стволовых клеток костного мозга. Для этого предварительно подготовленный тканеспецифический матрикс печени с клетками помещали в стерильную камеру для инкубации in vitro в ростовой среде [William′s Е с заменой аргинина на орнитин, с добавлением фетальной бычьей сыворотки, фактора роста гепатоцитов, эпидермального фактора роста, β-субъединицы холерного токсина, дексамезатона, этаноламина, селенита натрия, глюкагона, инсулина, инсулино-подобного фактора роста-1, аскорбиновой кислоты, линоленовой и линолиевой жирных кислот] на 2-4 суток для формирования КИК (предварительно подготовленный тканеспецифический матрикс с адгезированными клетками в виде ассоциатов).6). In vitro co-cultivation of autologous liver cells and bone marrow mesenchymal stem cells was performed. For this, a pre-prepared tissue-specific liver matrix with cells was placed in a sterile chamber for in vitro incubation in growth medium [William′s E with the replacement of arginine with ornithine, with the addition of fetal bovine serum, hepatocyte growth factor, epidermal growth factor, cholera toxin β-subunit , dexamezatone, ethanolamine, sodium selenite, glucagon, insulin, insulin-like growth factor-1, ascorbic acid, linolenic and linoleic fatty acids] for 2-4 days for the formation of CIC (preliminary preparation etched tissue-specific matrix with adherent cells in the form of associates).

В качестве матрикса был использован, например, предварительно подготовленный тканеспецифический матрикс печени крысы.As a matrix, for example, a previously prepared tissue-specific matrix of rat liver was used.

7). Полученные КИК (предварительно подготовленный тканеспецифический матрикс печени с иммобилизированными аутологичными клетками печени и мезенхимальными стволовыми клетками костного мозга с образованием клеточных ассоциатов) ресуспендировали из ростовой среды и смешивали с коллагенсодержащим гидрогелем, например, с гетерогенным биосовместимым биодеградируемым гидрогелем - Сферогель в соотношении объемов 3:1.7). The obtained CICs (pre-prepared tissue-specific liver matrix with immobilized autologous liver cells and bone marrow mesenchymal stem cells with the formation of cell associates) were resuspended from the growth medium and mixed with a collagen-containing hydrogel, for example, with heterogeneous biocompatible biodegradable hydrogel: volume ratio 3.

8). Имплантацию КИК печени (предварительно подготовленный тканеспецифичный матрикс с иммобилизированными аутологичными клетками печени и аутологичными мезенхимальными стволовыми клетками костного мозга в виде ассоциатов) осуществляли крысам с печеночной недостаточностью в поврежденную печень на 7 сутки после окончания затравки ССl4 (затравка в течении 42 суток).8). Liver CFC implantation (a pre-prepared tissue-specific matrix with immobilized autologous liver cells and autologous mesenchymal bone marrow stem cells in the form of associates) was performed in rats with hepatic insufficiency in the damaged liver 7 days after the end of CCl 4 seeding (seeding for 42 days).

9). После имплантации КИК печени (предварительно подготовленный тканеспецифический матрикс с иммобилизированными аутологичными клетками печени и аутологичными мезенхимальными стволовыми клетками костного мозга в виде ассоциатов крысам назначали антикоагулянты в профилактической дозе, например: гепарин 500 ME каждые 12 часов в течение 7-10 дней под контролем свертывающей системы крови и антиагреганты, например, трентал из расчета 45 мг/м2 поверхности тела каждые 12 часов в течение 30-90 дней.9). After implantation of a liver CIC (a pre-prepared tissue-specific matrix with immobilized autologous liver cells and autologous mesenchymal bone marrow stem cells in the form of associates in rats, anticoagulants were prescribed in a prophylactic dose, for example: heparin 500 ME every 12 hours for 7-10 days under the control of the blood coagulation system and antiplatelet agents, for example, trental at the rate of 45 mg / m 2 of the body surface every 12 hours for 30-90 days.

По предложенному способу для коррекции и лечения хронической печеночной недостаточности нами проведено 25 экспериментов на крысах.According to the proposed method for the correction and treatment of chronic liver failure, we conducted 25 experiments on rats.

На фиг. 1 изображена динамика показателей цитолиза при моделированной хронической печеночной недостаточности в контроле и при лечении по способу прототипу и по предлагаемому способу, где: А-Б: аланинаминотрансфераза (АлАТ), В-Г: аспартатаминотрансфераза (АсАТ), Д-Е: щелочная фосфатаза (ЩФ). После завершения моделирования хронической печеночной недостаточности (на 42-е сутки от начала затравки) во всех группах нами было выявлено повышение уровня цитолитических ферментов - гипертрансфераземию. Так, уровень АлАТ и АсАТ повышался в 3-4,5 раза, а ЩФ в 5 раз. Из представленных данных следует, что в контрольной и экспериментальных группах динамика биохимических показателей, характеризующих печеночную недостаточность, на этапе затравки была сходной. В дальнейшем эти показатели постепенно начинали снижаться во всех исследуемых группах, но темп снижения в контрольной и исследуемых группах (по способу прототипу и по предлагаемому способу) был разным. Наиболее длительно гипертрансфераземия сохранялась в контрольной группе, где клеточный материал не применялся. Лечение хронической печеночной недостаточности с помощью КИК печени, содержащих КП и МСК КМ, по способу прототипу и по предлагаемому способу также сопровождалось цитолитическими процессами в паренхиматозных клетках печени. Однако эти показатели достигали нормальных значений уже к 30 суткам после имплантации КИК печени, тогда как в контроле нормализация показателей цитолитического синдрома наступала к 180 суткам исследования, а затем показатель АсАТ вновь повышался и не достигал нормальных значений вплоть до конца наблюдения. Динамика нормализации биохимических показателей уровня АлАТ, АсАТ и ЩФ в сыворотке крови крыс при лечении по способу прототипу и по предлагаемому способу достоверно различалась между собой на отдельных сроках наблюдения (более высокий темп нормализации показателей по предлагаемому способу), что свидетельствовало о более высокой степени активности клеток в составе КИК, изготовленному по предлагаемому способу. На фиг. 1. А, В, Д - срок наблюдения 28 суток; Б, Г, Е - срок наблюдения 365 суток; АлАТ для здоровых животных - до 40 ед/л; АсАТ для здоровых животных - до 60 ед/л; ЩФ для здоровых животных - до 350 ед/л.In FIG. 1 shows the dynamics of indicators of cytolysis in simulated chronic liver failure in the control and treatment according to the prototype method and the proposed method, where: A-B: alanine aminotransferase (AlAT), B-D: aspartate aminotransferase (AsAT), D-E: alkaline phosphatase ( Alkaline phosphatase). After modeling of chronic liver failure (on the 42nd day from the start of the seed) was completed, in all groups we revealed an increase in the level of cytolytic enzymes - hypertransferasemia. So, the level of AlAT and AsAT increased 3-4.5 times, and alkaline phosphatase 5 times. From the data presented it follows that in the control and experimental groups, the dynamics of biochemical parameters characterizing liver failure at the seed stage was similar. In the future, these indicators gradually began to decrease in all the studied groups, but the rate of decline in the control and the studied groups (according to the prototype method and the proposed method) was different. The most prolonged hypertransferasemia persisted in the control group, where cell material was not used. The treatment of chronic hepatic insufficiency with the help of liver KFK containing KP and MSC KM, according to the prototype method and according to the proposed method, was also accompanied by cytolytic processes in parenchymal liver cells. However, these indices reached normal values already by 30 days after implantation of the liver CIC, whereas in the control, normalization of cytolytic syndrome indices occurred by 180 days of the study, and then the AcAT index increased again and did not reach normal values until the end of the observation. The dynamics of normalization of biochemical indicators of the level of AlAT, AsAT and alkaline phosphatase in rat blood serum during treatment by the prototype method and the proposed method significantly differed from each other at separate observation periods (a higher rate of normalization of the indicators by the proposed method), which indicated a higher degree of cell activity as part of the CFC, manufactured by the proposed method. In FIG. 1. A, B, D - observation period of 28 days; B, D, E - observation period 365 days; AlAT for healthy animals - up to 40 units / l; AsAT for healthy animals - up to 60 units / l; Alkaline phosphatase for healthy animals - up to 350 u / l.

* - Различие достоверно по сравнению с уровнем ферментов в контроле; p<0,05.* - The difference is significant compared with the level of enzymes in the control; p <0.05.

На фиг. 2. представлены гистологические препараты печени в зоне имплантации КИК (КП: МСК КМ=5:1) в паренхиму поврежденной печени на сроке 90 суток после моделирования хронической печеночной недостаточности. Имплантированные КИК изготовлены по предлагаемому способу:In FIG. 2. histological preparations of the liver are presented in the implantation zone of the KIK (KP: MSC KM = 5: 1) in the parenchyma of the damaged liver for a period of 90 days after modeling of chronic liver failure. Implanted KIK made by the proposed method:

А - аутологичные клетки печени и мезенхимальные стволовые клетки костного мозга на тканеспецифическом матриксе из децеллюляризированной печени в составе КИК печени. Продукция желчи пересаженными гепатоцитами. Окраска гематоксилином и эозином. Увеличение микроскопа ×400.A - autologous liver cells and bone marrow mesenchymal stem cells on a tissue-specific matrix from a decellularized liver as part of the liver CIC. Production of bile by transplanted hepatocytes. Hematoxylin and eosin stain. Microscope magnification × 400.

Б - Жизнеспособные гепатоциты в структуре КИК печени. Иммуногистохимическое исследование с гепатоцитспецифическими антигенами (ОСН1ЕБ) - положительное гранулярное цитоплазматическое окрашивание. Увеличение микроскопа ×400.B - Viable hepatocytes in the structure of the CIC of the liver. Immunohistochemical study with hepatocyte-specific antigens (OCH1EB) - positive granular cytoplasmic staining. Microscope magnification × 400.

На фиг. 3. представлены гистологические препараты печени в зоне имплантации КИК (КП: МСК КМ=5:1) в паренхиму поврежденной печени на сроке 180 суток после моделирования хронической печеночной недостаточности: - аутологичные клетки печени и мезенхимальные стволовые клетки костного мозга на тканеспецифическом матриксе из децеллюляризированной печени сохраняются в составе КИК печени. Окраска по Массону. Увеличение микроскопа ×400.In FIG. 3. histological preparations of the liver in the area of CIC implantation (KP: MSC KM = 5: 1) into the parenchyma of the damaged liver for 180 days after modeling of chronic liver failure are presented: - autologous liver cells and bone marrow mesenchymal stem cells on a tissue-specific matrix from the decellularized liver stored as part of the CIC of the liver. Masson stain. Microscope magnification × 400.

На этом сроке аутологичные клетки печени, сокультивированные с мезенхимальными стволовыми клетками костного мозга и имплантированные в печень в виде КИК (ассоциаты клеток в составе тканеспецифического матрикса из децеллюляризированной печени), сохраняли свою жизнеспособность и функциональную активность в составе имплантированных КИК печени. Воспалительная реакция и признаки отторжения отсутствовали. Высокая степень сохранения жизнеспособности и функциональной активности клеток в КИК, адгезированных на тканеспецифическом матриксе из децеллюляризированной печени, а также отсутствие в ней выраженных признаков воспаления и отторжения на сроке 180 суток после имплантации, позволяет прийти к заключению, что состав КИК печени является оптимальным.At this time, autologous liver cells co-cultivated with bone marrow mesenchymal stem cells and implanted in the liver as KIK (cell associates in the tissue-specific matrix from the decellularized liver) retained their viability and functional activity as part of the implanted liver KIK. An inflammatory response and signs of rejection were absent. The high degree of preservation of the viability and functional activity of cells in the CIC adhered to the tissue-specific matrix from the decellularized liver, as well as the absence of pronounced signs of inflammation and rejection in it for 180 days after implantation, allows us to conclude that the composition of the CIC of the liver is optimal.

Во всех случаях был достигнут желаемый результат, а именно были получены данные, свидетельствующие о более эффективном лечении печеночной недостаточности с использованием КИК, изготовленных по предлагаемому способу. Способ позволяет улучшить результаты лечения печеночной недостаточности путем активизации двухсторонних взаимодействий между имплантированными КИК - готовыми гепатоподобными структурами (адгезированные клетки печени, МСК КМ на предварительно подготовленном матриксе из децеллюляризированной печени млекопитающих) и паренхимой поврежденной печени реципиента с ускоренной интеграцией их поврежденной печенью.In all cases, the desired result was achieved, namely, data were obtained that testify to a more effective treatment of liver failure using CFCs manufactured by the proposed method. The method allows to improve the results of the treatment of liver failure by activating two-way interactions between implanted CICs - ready hepatoid structures (adherent liver cells, MSCs of CMs on a previously prepared matrix from mammalian decellularized liver) and the parenchyma of the damaged recipient liver with accelerated integration of their damaged liver.

Кроме того, использование аутологичных клеток печени и мезенхимальных стволовых клеток костного мозга позволяет избегать применения иммуносупрессивной терапии, а длительная их жизнеспособность позволяет поддерживать гомеостаз.In addition, the use of autologous liver cells and bone marrow mesenchymal stem cells avoids the use of immunosuppressive therapy, and their long viability allows maintaining homeostasis.

Таким образом, приведенные данные четко свидетельствуют о том, что коррекция и лечение печеночной недостаточности происходит значительно быстрее и адекватнее при применении предлагаемого способа коррекции и лечения печеночной недостаточности. Кроме того, нами доказано длительное выживание клеток печени и появление вновь образованных сосудов и желчных протоков в имплантате спустя 90 и 180 дней после имплантации животному КИК печени (предварительно подготовленный тканеспецифический децеллюляризированный матрикс печени млекопитающих с аутологичными клетками печени и аутологичными мезенхимальными стволовыми клетками костного мозга в виде ассоциатов).Thus, the above data clearly indicate that the correction and treatment of liver failure occurs much faster and more adequately when using the proposed method for the correction and treatment of liver failure. In addition, we have proved the long-term survival of liver cells and the appearance of newly formed vessels and bile ducts in the implant 90 and 180 days after implantation of a liver CIC (pre-prepared tissue-specific decellularized mammalian liver matrix with autologous liver cells and autologous bone marrow mesenchymal stem cells in the form of associates).

Учитывая вышеизложенное, экстраполяция результатов проведенных экспериментов в клинику правомерна, предложенный метод, обеспечивая пролонгированную жизнедеятельность КИК печени, может быть использован для коррекции печеночной недостаточности.Given the above, the extrapolation of the results of the experiments to the clinic is legitimate, the proposed method, providing prolonged vital activity of the CIC of the liver, can be used to correct liver failure.

Claims (4)

1. Способ лечения печеночной недостаточности, включающий имплантацию в паренхиму печени клеточно-инженерной конструкции (КИК), содержащей аутологичные клетки печени, аутологичные мезенхимальные стволовые клетки костного мозга, биополимерный гетерогенный коллагенсодержащий гидрогель с последующим назначением антикоагулянтов и антиагрегентов в профилактической дозе, отличающийся тем, что сначала в течение 8-12 часов при температуре 4°C инкубируют матрикс из децеллюляризированной донорской печени млекопитающего в физиологическом растворе, забуференном фосфатами, имеющем следующий состав: 138 мМ NaCl, 2,67 мМ KCl, 1,47 мМ KH2PO4, 8,1 мМ Na2HPO4, дистиллированная вода до 1 л и содержащем фибронектин и ламинин по 10 мкг/мл, с pH 7,4, при этом соотношение объемов матрикса и физиологического раствора составляет 1:1; затем на подготовленном матриксе в течение 2-4 суток проводят сокультивирование свежевыделенных аутологичных клеток печени и предварительно культивированных аутологичных мезенхимальных стволовых клеток костного мозга при соотношении клеток костного мозга к клеткам печени - от 1:1 до 1:10, обеспечивая прикрепление клеток в количестве 2×106-15×106 на 1 см3 матрикса, при этом общий объем матрикса с прикрепленными клетками составляет не менее 0,05 см3; перед имплантацией получают КИК, смешивая матрикс с прикрепленными к нему клетками и биополимерный гетерогенный коллагенсодержащий гидрогель в объемном соотношении 3:1.1. A method of treating liver failure, including implantation in the liver parenchyma of a cellular engineering construct (CIC) containing autologous liver cells, autologous mesenchymal bone marrow stem cells, biopolymer heterogeneous collagen-containing hydrogel, followed by the appointment of anticoagulants and antiplatelet agents in a prophylactic dose, characterized in that first, for 8-12 hours at a temperature of 4 ° C, the matrix from the decellularized donor liver of a mammal is incubated in physiological growth Ore buffered phosphate having the following composition: 138 mM NaCl, 2,67 mM KCl, 1,47 mM KH 2 PO 4, 8.1 mM Na 2 HPO 4, distilled water to 1 liter and containing fibronectin and laminin at 10 ug / ml, with a pH of 7.4, while the ratio of the volumes of the matrix and physiological saline is 1: 1; then, on the prepared matrix, co-cultivation of freshly isolated autologous liver cells and pre-cultured autologous mesenchymal stem cells of the bone marrow is carried out for 2-4 days at a ratio of bone marrow to liver cells from 1: 1 to 1:10, providing cell attachment in an amount of 2 × 10 6 -15 × 10 6 per 1 cm 3 of matrix, while the total volume of the matrix with attached cells is at least 0.05 cm 3 ; Before implantation, CICs are obtained by mixing the matrix with cells attached to it and a biopolymer heterogeneous collagen-containing hydrogel in a volume ratio of 3: 1. 2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что матрикс получают из децеллюляризированной донорской печени человека.2. The method according to p. 1, characterized in that the matrix is obtained from a decellularized human donor liver. 3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что матрикс имеет размеры частиц от 200 до 700 мкм, размеры пор не более 50 мкм и суммарную пористость 70-85%.3. The method according to p. 1, characterized in that the matrix has a particle size of from 200 to 700 microns, pore sizes of not more than 50 microns and a total porosity of 70-85%. 4. Способ по п. 1, отличающийся тем, что в качестве биополимерного гетерогенного коллагенсодержащего гидрогеля используют Сферогель. 4. The method according to p. 1, characterized in that as a biopolymer heterogeneous collagen-containing hydrogel use Spherogel.
RU2015129466/14A 2015-07-20 2015-07-20 Method of treating hepatic failure RU2586952C1 (en)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2015129466/14A RU2586952C1 (en) 2015-07-20 2015-07-20 Method of treating hepatic failure

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2015129466/14A RU2586952C1 (en) 2015-07-20 2015-07-20 Method of treating hepatic failure

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RU2586952C1 true RU2586952C1 (en) 2016-06-10

Family

ID=56115712

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2015129466/14A RU2586952C1 (en) 2015-07-20 2015-07-20 Method of treating hepatic failure

Country Status (1)

Country Link
RU (1) RU2586952C1 (en)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2655528C1 (en) * 2017-08-08 2018-05-28 Федеральное государственное бюджетное учреждение "Федеральный научный центр трансплантологии и искусственных органов имени академика В.И. Шумакова" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБУ "ФНЦТИО им. ак. В.И. Шумакова" Минздрава России) Method of treating hepatic failure
RU2655761C1 (en) * 2017-08-08 2018-05-29 Федеральное государственное бюджетное учреждение "Федеральный научный центр трансплантологии и искусственных органов имени академика В.И. Шумакова" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБУ "ФНЦТИО им. ак. В.И. Шумакова" Минздрава России) Use of total ribonucleic acid (rna) from multipotent mesenchymal stromal cells of the mammal's bone marrow as method for correcting liver failure

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6528098B2 (en) * 1996-10-22 2003-03-04 Advanced Viral Research Corp. Preparation of a therapeutic composition
US7354749B2 (en) * 2001-05-24 2008-04-08 The University Leeds Decellularisation of matrices
US8470520B2 (en) * 2005-08-26 2013-06-25 Regents Of The University Of Minnesota Decellularization and recellularization of organs and tissues
RU2539918C1 (en) * 2013-11-29 2015-01-27 Федеральное государственное бюджетное учреждение "Федеральный научный центр трансплантологии и искусственных органов имени академика В.И. Шумакова" Министерства здравоохранения Российской Федерации Method for preparing tissue-specific matrix for tissue engineering of parenchymal organ

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6528098B2 (en) * 1996-10-22 2003-03-04 Advanced Viral Research Corp. Preparation of a therapeutic composition
US7354749B2 (en) * 2001-05-24 2008-04-08 The University Leeds Decellularisation of matrices
US8470520B2 (en) * 2005-08-26 2013-06-25 Regents Of The University Of Minnesota Decellularization and recellularization of organs and tissues
RU2539918C1 (en) * 2013-11-29 2015-01-27 Федеральное государственное бюджетное учреждение "Федеральный научный центр трансплантологии и искусственных органов имени академика В.И. Шумакова" Министерства здравоохранения Российской Федерации Method for preparing tissue-specific matrix for tissue engineering of parenchymal organ

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ГОТЬЕ С.В. и др., Коррекция хронической печеночной недостаточности при трансплантации клеток печени в виде суспензии и клеточно-инженерных конструкций (экспериментальное исследование). Актуальные вопросы трансплантологии. Вестник РАМН. 2013; 4:44-51. *
ЕФИМОВ А.Е. Исследование нано- и микроструктуры Биоматериалов для регенеративной медицины методом сканирующей зондовой нанотомографии. Вестник трансплантологии и искусственных органов. том XVI (3) 2014. HUSSEIN KH. Construction of a biocompatible decellularized porcine hepatic lobe for liver bioengineering. Int J Artif Organs. 2015 Feb;38(2):96-104. *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2655528C1 (en) * 2017-08-08 2018-05-28 Федеральное государственное бюджетное учреждение "Федеральный научный центр трансплантологии и искусственных органов имени академика В.И. Шумакова" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБУ "ФНЦТИО им. ак. В.И. Шумакова" Минздрава России) Method of treating hepatic failure
RU2655761C1 (en) * 2017-08-08 2018-05-29 Федеральное государственное бюджетное учреждение "Федеральный научный центр трансплантологии и искусственных органов имени академика В.И. Шумакова" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБУ "ФНЦТИО им. ак. В.И. Шумакова" Минздрава России) Use of total ribonucleic acid (rna) from multipotent mesenchymal stromal cells of the mammal's bone marrow as method for correcting liver failure

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP2024015176A (en) Decellularization and recellularization of organs and tissues
JP3808900B2 (en) Biological material composed of a three-dimensional biocompatible and biodegradable matrix comprising an effective culture of bone marrow stem cells partially or fully differentiated into connective tissue cells and a hyaluronic acid derivative
Török et al. Primary human hepatocytes on biodegradable poly (l‐lactic acid) matrices: A promising model for improving transplantation efficiency with tissue engineering
JP5717253B2 (en) Islet cell sheet, production method and use thereof
Yao et al. Biomimetic injectable HUVEC‐adipocytes/collagen/alginate microsphere co‐cultures for adipose tissue engineering
KR102417995B1 (en) Use of microparticles and endothelial cells with decellularized organs and tissues
US20080193421A1 (en) Multicellular Tissue and Organ Culture Systems
US20120171258A1 (en) Modular Assembly of Tissue Engineered Constructs
RU2539918C1 (en) Method for preparing tissue-specific matrix for tissue engineering of parenchymal organ
RU2425645C1 (en) Method and transplant for treatment of liver failure
Mahfouzi et al. Advances in bioreactors for lung bioengineering: From scalable cell culture to tissue growth monitoring
Parekh et al. Reconstruction and regeneration of corneal endothelium: a review on current methods and future aspects
CA2419923C (en) Vascularised tissue graft
RU2586952C1 (en) Method of treating hepatic failure
JP7105487B2 (en) Cryografts and methods of making cryografts
RU2618989C1 (en) Treatment method of live failure
CN1938419B (en) Tissue-like organization of cells and macroscopic tissue-like constructs, generated by macromass culture of cells, and the method of macromass culture
JP2023552425A (en) Thymus construct and its use
RU2425648C1 (en) Method and transplant for treatment of liver failure
RU2693432C2 (en) Tissue-specific matrix for tissue engineering of the parenchymal organ and a method for preparing it
RU2425646C1 (en) Method and transplant for treatment of liver failure
JPH05503930A (en) Low-temperature preservation of cultured epithelial cell sheets
US20200197572A1 (en) Three-dimensional (3d) tissue-like implant and preparation and application thereof
RU2425647C1 (en) Method and transplant for treatment of liver failure
RU2272638C1 (en) Biotransplant, method for its preparing and method for treatment of chronic hepatitis and liver cirrhosis (variants)

Legal Events

Date Code Title Description
PD4A Correction of name of patent owner