RU2272638C1 - Biotransplant, method for its preparing and method for treatment of chronic hepatitis and liver cirrhosis (variants) - Google Patents
Biotransplant, method for its preparing and method for treatment of chronic hepatitis and liver cirrhosis (variants) Download PDFInfo
- Publication number
- RU2272638C1 RU2272638C1 RU2004125094/15A RU2004125094A RU2272638C1 RU 2272638 C1 RU2272638 C1 RU 2272638C1 RU 2004125094/15 A RU2004125094/15 A RU 2004125094/15A RU 2004125094 A RU2004125094 A RU 2004125094A RU 2272638 C1 RU2272638 C1 RU 2272638C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- liver
- treatment
- fetal
- cells
- chronic hepatitis
- Prior art date
Links
Landscapes
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к химико-фармацевтической промышленности и биотехнологии и касается получения культур генетически немодифицированных мезенхимальных стволовых клеток, гепатоцитов и способа лечения хронических гепатитов и циррозов печени.The invention relates to the pharmaceutical industry and biotechnology, and for the production of genetically unmodified mesenchymal stem cell cultures, hepatocytes and a method for the treatment of chronic hepatitis and liver cirrhosis.
Рост заболеваемости при различных патологиях печени и тяжелые последствия в виде циррозов, хронических гепатитов, печеночной недостаточности и др. обуславливает актуальность поиска новых более эффективных способов лечения. Только в нашей стране количество больных с печеночно-клеточной недостаточностью достигает 200000 человек в год, при этом использование стандартных терапевтических приемов не позволяет достичь удовлетворительных результатов и смертность сохраняется на уровне 80-90%.The increase in the incidence of various liver pathologies and the grave consequences in the form of cirrhosis, chronic hepatitis, liver failure, etc. determine the relevance of the search for new, more effective treatments. Only in our country the number of patients with hepatic cell failure reaches 200,000 people per year, while the use of standard therapeutic methods does not allow satisfactory results and mortality remains at the level of 80-90%.
В структуре заболеваний печени среди хронических гепатитов и циррозов можно выделить заболевания, развившиеся вследствие воздействия гепатотропных вирусов, токсического фактора (алкоголь, лекарства, промышленные вещества и др.), метаболических нарушений (гемохроматоз, болезнь Вильсона-Коновалова, недостаточность α1-антитрипсина; гликогеноз IV типа, галактоземия, наследственный тирозиноз, наследственные гипербилирубинемии), аутоиммунных заболеваний (первичный билиарный цирроз, первичный склерозирующий холангит, аутоиммунный гепатит) и многих других факторов.In the structure of liver diseases among chronic hepatitis and cirrhosis, it is possible to distinguish diseases that developed as a result of exposure to hepatotropic viruses, toxic factors (alcohol, drugs, industrial substances, etc.), metabolic disorders (hemochromatosis, Wilson-Konovalov’s disease, α 1 antitrypsin deficiency; glycogenosis Type IV, galactosemia, hereditary tyrosinosis, hereditary hyperbilirubinemia), autoimmune diseases (primary biliary cirrhosis, primary sclerosing cholangitis, autoimmune hepatitis ) and many other factors.
В настоящее время, в связи с развитием клеточной биологии в медицине изучаются альтернативные пересадке печени, экстракорпоральной детоксикации методы клеточной заместительной терапии, направленные на стимуляцию процессов регенерации и нормализации функции печени [Н. Mali, S. Gupta, 2001].Currently, in connection with the development of cell biology in medicine, alternative liver transplantation, extracorporeal detoxification methods of cell replacement therapy aimed at stimulating the processes of regeneration and normalization of liver function are being studied [N. Mali, S. Gupta, 2001].
Как метод трансплантация клеток печени имеет ряд преимуществ. Клеточная трансплантация, в отличие от сложной хирургической операции пересадки печени, технически проще выполнима, не требует массивной иммуносупрессивной терапии, в связи с чем вероятность развития осложнений минимальна. Кроме того, выделение и культивирование клеток печени из одного донорского органа позволяет обеспечить лечение нескольких пациентов.As a method, liver cell transplantation has several advantages. Cell transplantation, unlike a complicated surgical operation of a liver transplant, is technically simpler and does not require massive immunosuppressive therapy, and therefore the likelihood of complications is minimal. In addition, the isolation and cultivation of liver cells from one donor organ allows the treatment of several patients.
По мнению некоторых авторов истинными региональными стволовыми клетками печени являются так называемые овальные клетки, располагающиеся в пространствах Диссе, которые могут дифференцироваться в клетки печени различного фенотипа. Однако до настоящего момента эти клетки не были выделены и охарактеризованы в культуре. В ряде работ последних лет было показано, что для заместительной клеточной терапии могут быть использованы гепатоциты, клетки дуктулярного эпителия, мезенхимальные стволовые клетки стромы печени, мезенхимальные стволовые клетки костного мозга (гемопоэтические и мезенхимальные) [Xin Wang, Eugenio Montini, Mushen Al-Dhalimy et al. 2002]. Получены достоверные данные о возможности дифференцировки мезенхимальных стволовых клеток из разных источников в гепатоциты и дуктулярный эпителий, как in vivo, так и in vitro.According to some authors, the true regional stem cells of the liver are the so-called oval cells located in Disse spaces, which can differentiate into liver cells of various phenotypes. However, to date, these cells have not been isolated and characterized in culture. In a number of works of recent years, it has been shown that hepatocytes, ductular epithelial cells, liver stromal mesenchymal stem cells, bone marrow mesenchymal stem cells (hematopoietic and mesenchymal) can be used for cell replacement therapy [Xin Wang, Eugenio Montini, Mushen Al-Dhalimy et al. 2002]. Reliable data have been obtained on the possibility of differentiating mesenchymal stem cells from different sources into hepatocytes and a duocellular epithelium, both in vivo and in vitro.
При трансплантации клетки по портальной системе проникают в синусоиды, где происходит экстравазация их в паренхиму печени. Клеточные биологи последние годы дискутируют на тему - способны ли стволовые клетки (в частности, костного мозга) непосредственно дифференцироваться в другой тип клеток, или это происходит только путем клеточного слияния. Существует мнение, что гепатоциты, происходящие из костного мозга, образуются путем клеточного слияния, а не прямой дифференцировки. Последние работы свидетельствуют о возможностях прямой дифференцировки стволовых клеток костного мозга в клетки других типов [Martin Korbling, Ruth L. Katz, Abha Khana et al. 2001]. Причем в ряде исследований ученые специально акцентируют внимание на отсутствие слияния стволовых клеток при их дифференцировке in vivo или in vitro. Таким образом, стволовые клетки способны образовывать новый тип клеток путем прямой дифференцировки и клеточного слияния. Интеграция трансплантируемых клеток в паренхиме печени приводит к физиологической регуляции экспрессии генов донорских и клеток реципиента. Донорские клетки активно пролиферируют и синтезируют различные факторы роста, гормоны, цитокины, стимулирующие регенерацию клеток печени хозяина, участвуют в морфогенезе печеночных долек, биллиарных протоков, синусоидов.During transplantation, cells through the portal system penetrate into sinusoids, where they are extravasated into the liver parenchyma. In recent years, cell biologists have been discussing whether stem cells (in particular, bone marrow) are able to directly differentiate into another type of cell, or whether this happens only through cell fusion. It is believed that hepatocytes originating from the bone marrow are formed by cell fusion rather than direct differentiation. Recent work indicates the possibility of direct differentiation of bone marrow stem cells into cells of other types [Martin Korbling, Ruth L. Katz, Abha Khana et al. 2001]. Moreover, in a number of studies, scientists specifically focus on the absence of stem cell fusion during their differentiation in vivo or in vitro. Thus, stem cells are able to form a new type of cell through direct differentiation and cell fusion. The integration of transplanted cells in the liver parenchyma leads to physiological regulation of the expression of donor and recipient cells. Donor cells actively proliferate and synthesize various growth factors, hormones, cytokines that stimulate the regeneration of host liver cells, are involved in the morphogenesis of hepatic lobules, biliary ducts, sinusoids.
В экспериментальных работах по трансплантации клеток при наследственных [Moscioni AD, Rozga J, Chen S et al. 1996] и моделированных [Vogels BA, Maas MA, Bosma A et al. 1996] заболеваниях печени у животных получены достоверные данные о выживаемости, пролиферации, дифференцировки донорских клеток in situ и стимуляции регенерации поврежденной ткани печени.In experimental works on cell transplantation in hereditary [Moscioni AD, Rozga J, Chen S et al. 1996] and simulated [Vogels BA, Maas MA, Bosma A et al. 1996] liver diseases in animals obtained reliable data on the survival, proliferation, differentiation of donor cells in situ and stimulate the regeneration of damaged liver tissue.
Mito et al. впервые в 1992 г. осуществил пересадку гепатоцитов группе пациентов с хроническими заболеваниями печени (10 пациентов с циррозом печени и хроническим гепатитом). В дальнейшем накоплен значительный опыт трансплантации клеток печени при метаболических заболеваниях, вирусных острых и хронических гепатитах, токсических поражениях печени (Strom SC et al. 1999., Bilir BM et al. 1997). Описаны случаи эффективной трансплантации гепатоцитов человека группе пациентов с фульминантной печеночной недостаточностью (Habibullah CM et al. 1994). Проводились клинические исследования с использованием как ауто-, так и аллогенных клеток печени. Трансплантация генетически модифицированных гепатоцитов при наследственных заболеваниях печени является эффективным способом коррекции метаболических нарушений (Grossman M et. al 1995). По результатам этих работ получена достоверная положительная динамика клинико-лабораторных показателей цитолиза, холестаза и синтетической функции печени. В 1998 году Fox IJ et al. описали случай трансплантации гепатоцитов пациентке с синдромом Клиглера - Найяра I типа, после трансплантации наблюдалось длительное снижение уровня билирубина.Mito et al. For the first time in 1992, he transplanted hepatocytes to a group of patients with chronic liver diseases (10 patients with cirrhosis and chronic hepatitis). Subsequently, considerable experience has been gained in liver cell transplantation in metabolic diseases, viral acute and chronic hepatitis, and toxic liver lesions (Strom SC et al. 1999., Bilir BM et al. 1997). Cases of effective transplantation of human hepatocytes to a group of patients with fulminant liver failure have been described (Habibullah CM et al. 1994). Clinical studies have been conducted using both auto- and allogeneic liver cells. Transplantation of genetically modified hepatocytes in hereditary liver diseases is an effective way to correct metabolic disorders (Grossman M et. Al 1995). Based on the results of these studies, reliable positive dynamics of clinical and laboratory parameters of cytolysis, cholestasis and synthetic liver function was obtained. In 1998, Fox IJ et al. described a case of hepatocyte transplantation in a patient with Kligler – Nayyar type I syndrome; after transplantation, a prolonged decrease in bilirubin level was observed.
Клеточная трансплантация обладает рядом важных преимуществ по сравнению с пересадкой целого органа (печени):Cell transplantation has several important advantages compared with transplantation of a whole organ (liver):
заместительная клеточная терапия позволяет культуральными методами избавиться от примеси сверхантигенных донорских клеток, которые в первую очередь вовлекаются в процесс иммунного отторжения;cell replacement therapy allows cultural methods to get rid of the admixture of superantigenic donor cells, which are primarily involved in the process of immune rejection;
подсадку клеток можно регулировать по дозам и многократно повторять;cell grafting can be adjusted in doses and repeated many times;
стоимость клеточной трансплантации значительно ниже, чем пересадки органа.the cost of cell transplantation is significantly lower than organ transplantation.
Большинство исследователей предпочитают аутогенные клетки (костный мозг, клетки периферической крови). Преимущества аутотрансплантатов не вызывают сомнений, однако имеется ряд ограничений по их применению. В частности, длительность выращивания клеточных культур - более 2 месяцев - может являться критической для ряда пациентов;Most researchers prefer autologous cells (bone marrow, peripheral blood cells). The advantages of autografts are not in doubt, but there are a number of restrictions on their use. In particular, the duration of cell culture growth - more than 2 months - may be critical for a number of patients;
клетки, полученные от пожилых и тяжелобольных людей обладают низкой способностью к пролиферации и самообновлению.cells obtained from elderly and seriously ill people have a low ability to proliferate and self-renew.
В сравнении с аутологичным клеточным трансплантационным материалом донорские (в том числе фетальные) клетки обладают рядом преимуществ:In comparison with autologous cell transplantation material, donor (including fetal) cells have several advantages:
фетальные клетки имеют больший потенциал роста и пролиферации, выраженную способность к дифференцировке и функционально более активны, продуцируют факторы роста и регенерации;fetal cells have a greater growth and proliferation potential, a pronounced ability to differentiate and are functionally more active; they produce growth and regeneration factors;
пересаженные фетальные клетки стимулируют ангиогенез;transplanted fetal cells stimulate angiogenesis;
фетальные клетки и ткани лучше переносят гипоксию и холодовую консервацию;fetal cells and tissues better tolerate hypoxia and cold preservation;
культуры донорских клеток могут быть приготовлены заранее и использоваться по первому требованию.donor cell cultures can be prepared in advance and used on demand.
Наиболее выраженным терапевтическим потенциалом при патологиях печени обладают генетически немодифицированные гепатоциты и мезенхимальные стволовые клетки.The most pronounced therapeutic potential in liver pathologies is possessed by genetically unmodified hepatocytes and mesenchymal stem cells.
Мезенхимальные стволовые клетки, в основном, получают из донорского костного мозга, однако существуют и другие источники - скелетные мышцы, подкожная жировая ткань, фетальные органы гемопоэза (печень, тимус, селезенка). Описанные методики выращивания МСК из костного мозга и липоаспиратов позволяют получить гетерогенные популяции клеток стромы, лишь небольшой процент которых являются стволовыми. Клетки зрелой стромы не обладают свойством дифференцироваться в различные клеточные линии и, таким образом, терапевтически неэффективны. После трансплантации стромальные клетки мигрируют преимущественно в соединительную ткань и там накапливаются.Mesenchymal stem cells are mainly derived from donor bone marrow, but there are other sources - skeletal muscle, subcutaneous adipose tissue, fetal organs of hematopoiesis (liver, thymus, spleen). The described methods for growing MSCs from bone marrow and lipoaspirates make it possible to obtain heterogeneous populations of stromal cells, only a small percentage of which are stem cells. The cells of the mature stroma do not possess the property of differentiating into different cell lines and, thus, are therapeutically ineffective. After transplantation, stromal cells migrate mainly to the connective tissue and accumulate there.
При стандартном пассировании в высоких посевных дозах доля зрелых стромальных клеток быстро увеличивается.With standard passage at high inoculum doses, the proportion of mature stromal cells increases rapidly.
Использование в качестве трансплантата гомогенной (не менее 80%) популяции плюрипотентных МСК позволяет повысить эффективность лечения, увеличить воспроизводимость результатов и избежать нежелательных эффектов.The use of a homogeneous (at least 80%) population of pluripotent MSCs as a transplant allows to increase the effectiveness of treatment, increase the reproducibility of the results and avoid undesirable effects.
В настоящее время существуют несколько способов трансплантации клеток печени: введение в вены портальной системы, в паренхиму селезенки [Rosental RJ, Chen SC, Hewitt W et al. 1996], интраперитонеально. Преимущества методов введения определяются простотой выполнения и обеспечением выживаемости трансплантируемых клеток.Currently, there are several methods of transplantation of liver cells: the introduction into the veins of the portal system, into the spleen parenchyma [Rosental RJ, Chen SC, Hewitt W et al. 1996], intraperitoneally. The advantages of administration methods are determined by the ease of implementation and the survival of the transplanted cells.
Задачей настоящего изобретения является получение биотрансплантата для наиболее эффективного (комплексного) воздействия на пораженную печень человека и разработка наиболее эффективного способа введения при хронических гепатитах и циррозах.The objective of the present invention is to obtain a biograft for the most effective (comprehensive) effects on the affected human liver and the development of the most effective method of administration in chronic hepatitis and cirrhosis.
Для решения поставленной задачи предложена группа изобретений, объединенная общим изобретательским замыслом.To solve this problem, a group of inventions is proposed, united by a common inventive concept.
Предложен биотрансплантат для лечения хронического гепатита и цирроза печени, который содержит культуру фетальных гепатоцитов человека из печени эмбрионов человека 1-2-го триместра беременности, селективно размноженных в условиях культивирования, и представляет собой суспензию клеточной культуры в физиологическом растворе с концентрацией клеточных элементов 1-15 млн. клеток на 1 кг веса пациента. Биотрансплантат содержит свежеприготовленную культуру. Предложен способ получения биотрансплантата для лечения хронического гепатита и цирроза печени, заключающийся в том, что ткань печени эмбрионов человека 1-2-го триместра беременности измельчают, дезагрегируют, полученную суспензию первичных диссоциированных клеток культивируют в ростовой среде RPMI+F12 (1:1), содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 1% ИТС (1 мкг/мл инсулина, 10 мкг/мл трансферрина, селенит), 10 мкг/мл гентамицина, 5 мкг/мл амфотерицина В с добавлением дексаметазона 0.00125 мл/мл и глутамина 0.11 мг/мл, до достижения клеточной культуры конфлюэнтного состояния.A biograft is proposed for the treatment of chronic hepatitis and liver cirrhosis, which contains a culture of human fetal hepatocytes from the liver of human embryos of the 1-2 trimester of pregnancy, selectively propagated under culturing conditions, and is a suspension of cell culture in physiological solution with a concentration of cell elements 1-15 million cells per 1 kg of patient weight. The biograft contains a freshly prepared culture. A method for producing a biograft for the treatment of chronic hepatitis and cirrhosis of the liver is proposed, namely, the liver tissue of human embryos of the 1-2 trimester of pregnancy is crushed, disaggregated, the resulting suspension of primary dissociated cells is cultivated in RPMI + F12 growth medium (1: 1), containing 10% fetal calf serum, 1% ITS (1 μg / ml insulin, 10 μg / ml transferrin, selenite), 10 μg / ml gentamicin, 5 μg / ml amphotericin B with dexamethasone 0.00125 ml / ml and glutamine 0.11 mg / ml, before reaching the cell cult cheers of a confluent state.
Для дезагрегации измельченную ткань печени инкубируют в ферментном растворе, содержащем 0.25% раствор диспазы и 0.05% раствор коллагеназы в соотношении 1:1 в течение 30-40 минут с последующим измельчением ткани путем многократного пипетирования до получения одноклеточной суспензии, далее последнюю трижды отмывают центрифугированием при 700 об/мин.For disaggregation, the crushed liver tissue is incubated in an enzyme solution containing a 0.25% dispase solution and a 0.05% collagenase solution in a 1: 1 ratio for 30-40 minutes, followed by grinding the tissue by repeated pipetting to obtain a unicellular suspension, then wash the last three times by centrifugation at 700 rpm
Предложен также биотрансплантат для лечения хронического гепатита и цирроза печени, заключающийся в том, что он содержит мезенхимальные стволовые клетки (МСК), полученные из фетального, донорского или аутологичного материала путем дезагрегации ткани с последующим культивированием на ростовой среде, содержащей трансферин, инсулин, фактор роста фибробластов и гепарин до накопления гомогенной клеточной культуры с содержанием агрекан- и коллаген П экспрессирующих клеток не менее 80%, и представляет собой суспензию указанных клеток в физиологическом растворе с концентрацией клеточных элементов 1-15 млн. клеток на 1 кг веса пациента.A biotransplant is also proposed for the treatment of chronic hepatitis and cirrhosis of the liver, which consists in the fact that it contains mesenchymal stem cells (MSCs) obtained from fetal, donor or autologous material by tissue disaggregation, followed by cultivation on growth medium containing transferrin, insulin, growth factor fibroblasts and heparin before the accumulation of a homogeneous cell culture with an aggregan- and collagen P content of expressing cells of at least 80%, and is a suspension of these cells in physi ogicheskom solution with a concentration of cellular elements 1-15 million. cells per 1 kg of patient weight.
В качестве фетального материала используют ткани: костный мозг, тимус, печень, жировая ткань эмбрионов человека 1-го триместра беременности.The following tissues are used as fetal material: bone marrow, thymus, liver, adipose tissue of human embryos of the 1st trimester of pregnancy.
В качестве донорского материала используют ткани: костный мозг, тимус, печень, жировая ткань.The following tissues are used as donor material: bone marrow, thymus, liver, adipose tissue.
В качестве аутологичного материала используют ткани: костный мозг, жировая ткань.The following tissues are used as autologous material: bone marrow, adipose tissue.
Предложен способ получения биотрансплантата для лечения хронического гепатита и цирроза печени, заключающийся в том, что мезенхимальные стволовые клетки (МСК), полученные из фетального, донорского или аутологичного материала ферментативно дезагрегируют, полученную клеточную суспензию ресуспендируют в ростовой среде DMEM/F12, содержащей 15% эмбриональной телячьей сыворотки и 2 мМ глутамина, далее высевают при плотности посева 1-20 млн. мононуклеарных клеток на 1 см2 и инкубируют при 37°С в атмосфере 5% СО2, по достижении культурой 50% конфлуентности монослой трипсинизируют и пересевают с плотностью 10-30 клеток на 1 см2 на ростовую среду, содержащую 10 мкг/мл трансферрина, 1 мкг/мл инсулина, 10 нг/мл фактора роста фибробластов - 2 и 8 ЕД/мл гепарина и с увеличением посевной дозы культивирование ведут до накопления в культуре зрелой стромы.A method for producing a biograft for the treatment of chronic hepatitis and cirrhosis of the liver is proposed, which consists in the fact that mesenchymal stem cells (MSCs) obtained from fetal, donor or autologous material are enzymatically disaggregated, the resulting cell suspension is resuspended in DMEM / F12 growth medium containing 15% embryonic calf serum and 2 mM glutamine, hereinafter seeded at a seeding density of 1-20 million. mononuclear cells per 1 cm 2 and incubated at 37 ° C under 5% CO 2, culture reaches 50% confluence ti monolayer were trypsinized and replated at a density of 10-30 cells per 1 cm 2 in growth medium containing 10 ug / ml transferrin, 1 microgram / ml insulin, 10 ng / ml fibroblast growth factor - 2 and 8 units / mL heparin, and with increasing the inoculum dose is cultured until mature stroma is accumulated in the culture.
Предложен способ лечения хронического гепатита и цирроза печени, заключающийся в том, что используют ранее указанные биотрансплантаты, при этом суспензию мезенхимальных стволовых или фетальных гепатоцитов или их комбинацию вводят в виде суспензии в физиологическом растворе с концентрацией клеточных элементов 1-15 млн. клеток на 1 кг веса пациента.A method for the treatment of chronic hepatitis and liver cirrhosis is proposed, which consists in using the previously mentioned biografts, while a suspension of mesenchymal stem or fetal hepatocytes or a combination thereof is administered as a suspension in physiological solution with a concentration of cellular elements of 1-15 million cells per 1 kg patient weight.
Мезенхимальные стволовые клетки и фетальные гепатоциты берут в соотношениях от 1:1 до 1:15.Mesenchymal stem cells and fetal hepatocytes are taken in ratios from 1: 1 to 1:15.
Указанные биотрансплантаты вводят: с помощью венозного катетера или пункционно в вены портальной системы; с помощью артериального катетера в селезеночную артерию; пункционно в паренхиму селезенки; интраперитониально; пункционно в большой сальник.These biografts are administered: using a venous catheter or puncture into the veins of the portal system; using an arterial catheter into the splenic artery; puncture in the parenchyma of the spleen; intraperitoneally; puncture in a large omentum.
Способ может быть использован при лечении хронического гепатита и цирроза печени, развившихся вследствие воздействия гепатотропных вирусов, а именно вирус гепатита В, С, D, G, F, TTV, CMV, EBV; токсического фактора, такого как алкоголь, лекарства, промышленные вещества и др.; метаболических нарушений вследствие гемохроматоза, болезни Вильсона-Коновалова, недостаточности α1-антитрипсина, гликогеноз IV типа, галактоземии, наследственного тирозиноза, наследственных гипербилирубинемий; аутоиммунных заболеваний (первичный билиарный цирроз, первичный склерозирующий холангит, аутоиммунный гепатит).The method can be used in the treatment of chronic hepatitis and cirrhosis of the liver, developed as a result of exposure to hepatotropic viruses, namely hepatitis B, C, D, G, F, TTV, CMV, EBV; a toxic factor such as alcohol, drugs, industrial substances, etc .; metabolic disorders due to hemochromatosis, Wilson-Konovalov disease, α 1 -antitripsin deficiency, type IV glycogenosis, galactosemia, hereditary tyrosinosis, hereditary hyperbilirubinemia; autoimmune diseases (primary biliary cirrhosis, primary sclerosing cholangitis, autoimmune hepatitis).
Возможность использования биоматериала достигается на следующих сроках гестации: печень - 5-8 недель, тимус - 18-20 недель, костный мозг - 17-20 недель, подкожная жировая ткань - 17-19 недель. Если выделение клеток производится не из аспиратов (костный мозг, липоаспират), а из плотных тканей, например тимуса, орган предварительно измельчают и ферментативно дезагрегируют. Суспензию фильтруют через мелкоячеистое сито из нержавеющей стали. Клеточную суспензию (аспират) разводят 1:1 солевым раствором Хэнкса, центрифугируют в режиме 1500×g, 10 минут и ресуспендируют в ростовой среде DMEM/F12, содержащей 15% эмбриональной телячьей сыворотки, селектированной для выращивания клеток в низкой плотности, 2 мМ глутамина. Суспензию клеток высевают на пластиковые чашки Петри с диаметром 100 мм. Плотность посева первичной клеточной суспензии составляет 1-20 миллионов мононуклеарных клеток на 1 см2 в зависимости от источника выделения. Через 1 сутки неприкрепившиеся клетки удаляют, ростовую среду заменяют. Культуры инкубируют при 37°С в атмосфере 5% СО2. Через 6 дней наблюдают рост гетерогенных клеточных популяций. По достижении культурой 50% конфлуентности монослой трипсинизируют и пересевают на новые чашки с плотностью 10-30 клеток на 1 см2 в ростовой среде, дополнительно содержащей 10 мкг/мл трансферрина, 1 мкг/мл инсулина, 10 нг/мл фактора роста фибробластов - 2 и 8 ЕД/мл гепарина. Через 7-10 дней отбирают плотные колонии мелких клеток (диаметром 7-10 мкм) с большим количеством митозов. Отобранные колонии рассевают в новые чашки с плотностью 20 клеток/см2 и выращивают до состояния преконфлуентности. Замену среды производят через каждые 2 дня. Последующие пассажи производят в том же режиме. Увеличение посевной дозы или изменение состава ростовой среды приводят к быстрому накоплению в культуре клеток зрелой стромы.The possibility of using biomaterial is achieved at the following gestational periods: liver - 5-8 weeks, thymus - 18-20 weeks, bone marrow - 17-20 weeks, subcutaneous adipose tissue - 17-19 weeks. If the cells are not extracted from aspirates (bone marrow, lipoaspirate), but from dense tissues, such as the thymus, the organ is preliminarily crushed and enzymatically disaggregated. The suspension is filtered through a fine mesh stainless steel sieve. The cell suspension (aspirate) is diluted 1: 1 with Hanks saline, centrifuged at 1500 × g for 10 minutes and resuspended in DMEM / F12 growth medium containing 15% fetal calf serum, selected for cell growth in low density, 2 mM glutamine. A cell suspension is plated on plastic Petri dishes with a diameter of 100 mm. The seeding density of the primary cell suspension is 1-20 million mononuclear cells per 1 cm 2 depending on the source of excretion. After 1 day, non-adherent cells are removed, the growth medium is replaced. The cultures are incubated at 37 ° C in an atmosphere of 5% CO 2 . After 6 days, growth of heterogeneous cell populations is observed. Once the culture reaches 50% confluency, the monolayer is trypsinized and replanted onto new plates with a density of 10-30 cells per 1 cm 2 in a growth medium additionally containing 10 μg / ml transferrin, 1 μg / ml insulin, 10 ng / ml fibroblast growth factor - 2 and 8 U / ml heparin. After 7-10 days, dense colonies of small cells (7-10 microns in diameter) with a large number of mitoses are selected. The selected colonies are seeded in new plates with a density of 20 cells / cm 2 and grown to a state of pre-confluency. The medium is replaced every 2 days. Subsequent passages are made in the same mode. An increase in the seeding dose or a change in the composition of the growth medium leads to the rapid accumulation of mature stroma cells in the culture.
Экспериментально подобранные условия, объединяющие критерии отбора исходного биоматериала и режим культивирования, являются оптимальными для достижения следующих результатов.Experimentally selected conditions, combining the criteria for selecting the initial biomaterial and the cultivation mode, are optimal for achieving the following results.
Система последовательной ферментативной дезагрегации исходной ткани позволяет получать максимальное количество жизнеспособных клеток одинакового фенотипа с незначительной примесью гетеротопных клеток.The system of sequential enzymatic disaggregation of the original tissue allows you to get the maximum number of viable cells of the same phenotype with a small admixture of heterotopic cells.
Режим культивирования и селективные культуральные среды позволяют максимально наращивать количество, аггрекан- и коллаген II-экспресирующих клеток.The cultivation mode and selective culture media allow the maximum increase in the number of aggrecan and collagen II-expressing cells.
Режим культивирования и селективные культуральные среды позволяют получать гомогенную клеточную культуру с содержанием аггрекан- и коллаген II-экспресирующих клеток не менее 80%.The cultivation mode and selective culture media make it possible to obtain a homogeneous cell culture containing at least 80% aggrecan and collagen II-expressing cells.
Режим культивирования и селективные культуральные среды позволяют при многократном пассировании максимально наращивать гомогенную клеточную культуру недифференцированных клеток.The cultivation mode and selective culture media allow for repeated passage to maximize the homogeneous cell culture of undifferentiated cells.
Режим культивирования и селективные культуральные среды позволяют сохранить плюрипотентность клеточных культур.The cultivation mode and selective culture media allow to preserve the pluripotency of cell cultures.
Режим культивирования и селективные культуральные среды позволяют получить большое количество клеток для трансплантации (серию), что обеспечивает воспроизводимость результатов лечения.The cultivation mode and selective culture media allow to obtain a large number of cells for transplantation (series), which ensures reproducibility of treatment results.
В качестве биотрансплантата используют свежеполученную клеточную культуру или после ее криоконсервации. В качестве криопротектора используют 7% диметилсульфоксид.As a biograft use freshly obtained cell culture or after cryopreservation. As cryoprotectant use 7% dimethyl sulfoxide.
Для приготовления биотрансплантата, содержащего культуру фетальных гепатоцитов, используют фетальный абортивный материал (ткань печени эмбрионов человека 1-2 триместра беременности), полученный при искусственном прерывании беременности у здоровых, предварительно обследованных на наличие вирусных и бактериальных инфекций женщин. Фетальный материал переносят в стерильный сосуд с раствором Хэнкса и гентамицина (80 мг/л). Дальнейшая работа производится в стерильных условиях ламинарного бокса. Выделенная с помощью хирургических инструментов ткань печени тщательно отмывается от сгустков крови, максимально отделяется соединительнотканная капсула и ее перемычки. Полученную ткань печени измельчают до кусочков не менее 1 мм. куб. Затем подвергают ферментативной и механической дезагрегации - освобождение клеточных элементов от тканевого матрикса.For the preparation of a biograft containing a culture of fetal hepatocytes, fetal abortive material (liver tissue of human embryos of 1-2 trimesters of pregnancy) obtained by artificial termination of pregnancy in healthy women previously examined for viral and bacterial infections is used. Fetal material is transferred into a sterile vessel with a solution of Hanks and gentamicin (80 mg / l). Further work is done under sterile conditions in a laminar box. The liver tissue extracted using surgical instruments is thoroughly washed from blood clots, and the connective tissue capsule and its lintels are maximally separated. The resulting liver tissue is crushed to pieces of at least 1 mm. cube Then subjected to enzymatic and mechanical disaggregation - the release of cellular elements from the tissue matrix.
Способ дезагрегации заключается в использовании 0,25% раствора диспазы, 0,05% раствора коллагеназы, в одномоментном инкубировании кусочков ткани печени в течение 30-40 мин в двухкомпонентном (1:1) ферментном растворе с последующим измельчением путем многократного пипетирования до получения одноклеточной суспензии. Полученная суспензия трижды отмывается путем центрифугирования при 700 оборотов в минуту. Суспензию первичных диссоциированных клеток печени, полученных из фетальной ткани печени, культивируют на непокрытых носителями культуральных чашках Петри в среде, содержащей ростовую среду RPMI+F12 (1:1), 10% эмбриональной телячьей сыворотки (НПП ПанЭко), 1% ИТС (1 мкг/мл инсулина, 10 мкг/мл трансферрина, селенит), 10 мкг/мл гентамицина, 5 мкг/мл амфотерицина В с добавлением дексаметазона 0.00125 мл/мл и глутамина 0.11 мг/мл, через 24-48 часов неприкрепленные клетки смывают с культуральных чашек и продолжают культивировать. Замену среды производят каждые 3 дня. При достижении клеточной культуры конфлюэнтного состояния следует криоконсервация. Пассирование не проводят вследствие изменения фенотипа получаемых клеток.The disaggregation method consists in using a 0.25% dispase solution, a 0.05% collagenase solution, in simultaneous incubation of pieces of liver tissue for 30-40 minutes in a two-component (1: 1) enzyme solution, followed by grinding by repeated pipetting to obtain a single-celled suspension . The resulting suspension is washed three times by centrifugation at 700 rpm. A suspension of primary dissociated liver cells obtained from fetal liver tissue is cultured on uncovered Petri culture plates in medium containing RPMI + F12 growth medium (1: 1), 10% fetal calf serum (NPE PanEco), 1% ITS (1 μg / ml insulin, 10 μg / ml transferrin, selenite), 10 μg / ml gentamicin, 5 μg / ml amphotericin B with the addition of dexamethasone 0.00125 ml / ml and glutamine 0.11 mg / ml, after 24-48 hours, non-adherent cells are washed off from culture dishes and continue to cultivate. The environment is replaced every 3 days. Upon reaching a cell culture of a confluent state, cryopreservation follows. Passaging is not carried out due to a change in the phenotype of the resulting cells.
Способ лечения хронических гепатитов и циррозов печени заключается в том, что ранее указанные биотрансплантаты вводят:A method for the treatment of chronic hepatitis and cirrhosis of the liver is that the previously mentioned biografts are administered:
с помощью венозного катетера или пункционно в вены портальной системы;using a venous catheter or puncture into the veins of the portal system;
с помощью артериального катетера в селезеночную артерию;using an arterial catheter into the splenic artery;
пункционно в паренхиму селезенки;puncture in the parenchyma of the spleen;
интраперитониально;intraperitoneally;
пункционно в большой сальник.puncture in a large omentum.
Биотрансплантаты вводят соответственно в виде суспензии в физиологическом растворе с концентрацией клеточных элементов 1-15 млн. клеток на 1 кг веса пациента.Biografts are respectively administered as a suspension in physiological saline with a concentration of cellular elements of 1-15 million cells per 1 kg of patient weight.
Мезенхимальные стволовые клетки и фетальные гепатоциты берут в соотношениях от 1:1 до 1:15.Mesenchymal stem cells and fetal hepatocytes are taken in ratios from 1: 1 to 1:15.
Эффективность предложенного способа подтверждается уменьшением проявлений синдромов цитолиза, холестаза, портальной гипертензии, достоверным улучшением функции печени по биохимическим показателям.The effectiveness of the proposed method is confirmed by a decrease in the manifestations of the syndromes of cytolysis, cholestasis, portal hypertension, a significant improvement in liver function according to biochemical parameters.
Данный способ лечения эффективен при хронических гепатитах и циррозах печени, развившихся вследствие воздействия гепатотропных вирусов (вирусы гепатита В, С, D, G, F, TTV, CMV, EBV), токсического фактора (алкоголь, лекарства, промышленные вещества и др.), метаболических нарушений (гемохроматоз, болезнь Вильсона-Коновалова, недостаточность α1-антитрипсина, гликогеноз IV типа, галактоземия, наследственный тирозиноз, наследственные гипербилирубинемии), аутоиммунных заболеваний (первичный билиарный цирроз, первичный склерозирующий холангит, аутоиммунный гепатит) и многих других факторов.This method of treatment is effective for chronic hepatitis and cirrhosis of the liver, developed as a result of exposure to hepatotropic viruses (hepatitis B, C, D, G, F, TTV, CMV, EBV viruses), toxic factor (alcohol, drugs, industrial substances, etc.), metabolic disorders (hemochromatosis, Wilson-Konovalov disease, α 1 -antitrypsin deficiency, type IV glycogenosis, galactosemia, hereditary tyrosinosis, hereditary hyperbilirubinemia), autoimmune diseases (primary biliary cirrhosis, primary sclerosing cholangitis, autoimm unions hepatitis) and many other factors.
Claims (13)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2004125094/15A RU2272638C1 (en) | 2004-08-18 | 2004-08-18 | Biotransplant, method for its preparing and method for treatment of chronic hepatitis and liver cirrhosis (variants) |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2004125094/15A RU2272638C1 (en) | 2004-08-18 | 2004-08-18 | Biotransplant, method for its preparing and method for treatment of chronic hepatitis and liver cirrhosis (variants) |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2272638C1 true RU2272638C1 (en) | 2006-03-27 |
Family
ID=36388835
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2004125094/15A RU2272638C1 (en) | 2004-08-18 | 2004-08-18 | Biotransplant, method for its preparing and method for treatment of chronic hepatitis and liver cirrhosis (variants) |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2272638C1 (en) |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2455701C1 (en) * | 2011-02-28 | 2012-07-10 | Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Красноярский государственный медицинский университет имени профессора В.Ф. Войно-Ясенецкого Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации" | Method for stimulating liver regeneration in fibrotic changes in experiment |
| WO2012154016A1 (en) * | 2011-05-11 | 2012-11-15 | Акционерное Общество "Национальный Научный Медицинский Центр" | Method for producing lyophilizate from human hepatocytes |
| RU2510276C1 (en) * | 2012-09-25 | 2014-03-27 | Московский Государственный Университет им. М.В. Ломоносова, Биологический факультет | Method for preparing cells for replacement cell therapy of hepatic pathology |
| RU2510833C1 (en) * | 2012-11-08 | 2014-04-10 | Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт Биологии Развития им. Н.К. Кольцова Российской Академии Наук | Cell product for treating and correcting hepatic impairment |
| RU2781448C1 (en) * | 2021-08-18 | 2022-10-12 | Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Иркутский научный центр Сибирского отделения Российской Академии наук (ИНЦ СО РАН) | Pharmaceutical composition for producing a lyophilisate of liver cell culture enriched with hepatocyte growth factor |
-
2004
- 2004-08-18 RU RU2004125094/15A patent/RU2272638C1/en not_active IP Right Cessation
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Xin Wang et al. Am.J.Pathol. 2002 Aug. 161 (2): 565-74. * |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2455701C1 (en) * | 2011-02-28 | 2012-07-10 | Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Красноярский государственный медицинский университет имени профессора В.Ф. Войно-Ясенецкого Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации" | Method for stimulating liver regeneration in fibrotic changes in experiment |
| WO2012154016A1 (en) * | 2011-05-11 | 2012-11-15 | Акционерное Общество "Национальный Научный Медицинский Центр" | Method for producing lyophilizate from human hepatocytes |
| RU2510276C1 (en) * | 2012-09-25 | 2014-03-27 | Московский Государственный Университет им. М.В. Ломоносова, Биологический факультет | Method for preparing cells for replacement cell therapy of hepatic pathology |
| RU2510833C1 (en) * | 2012-11-08 | 2014-04-10 | Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт Биологии Развития им. Н.К. Кольцова Российской Академии Наук | Cell product for treating and correcting hepatic impairment |
| RU2781448C1 (en) * | 2021-08-18 | 2022-10-12 | Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Иркутский научный центр Сибирского отделения Российской Академии наук (ИНЦ СО РАН) | Pharmaceutical composition for producing a lyophilisate of liver cell culture enriched with hepatocyte growth factor |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US6875605B1 (en) | Modular cell culture bioreactor and associated methods | |
| US6251383B1 (en) | Method for ex-vivo expansion of hematopoietic cells | |
| KR101613478B1 (en) | Composition comprising mesenchymal stem cell-hydrogel and preparation method thereof | |
| RU2323252C1 (en) | Method for culturing human mesenchymal stem cells ex vivo | |
| EP1999250B1 (en) | Method of cultivation of human mesenchymal stem cells, particularly for the treatment of non-healing fractures, and bioreactor for carrying out this cultivation method | |
| CN108004207B (en) | Method for obtaining large amount of adipose mesenchymal stem cells from fat | |
| CN106754674A (en) | Method and its application of amnion mesenchymal stem cell are prepared from Human plactnta amnion | |
| CN104263699A (en) | Culture method for large-scale preparation of clinical treatment level dermal multipotent stem cells for cell transplantation | |
| CN1571835A (en) | Keratinocytes which may be used as biologically active substances for the treatment of wounds | |
| CN105062959A (en) | Isolated culture method of human amnia mesenchymal stem cells | |
| CN105820998A (en) | Isolation extraction and culture method for human adipose-derived stem cells (ADSCs) for clinical back-transfusion grade cell therapy | |
| CN104312970A (en) | Preparation method of clinical treatment level epidermal stem cell for cell therapy by applying human extracellular matrix screening and mass culture | |
| US20190264179A1 (en) | Serum-free medium inducing differentiation of umbilical cord mesenchymal stem cell into insulin-secretion-like cell and preparation method and use thereof | |
| CN107858329B (en) | Method for separating adipose-derived mesenchymal stem cells from fat and test solution used in method | |
| CN104988110A (en) | Method for transforming umbilical cord mesenchymal stem cells into islet cells | |
| KR101585032B1 (en) | Composition comprising mesenchymal stem cell-hydrogel and preparation method thereof | |
| CN110812318B (en) | Method for preparing optimized fibroblast extract for cosmetic raw material | |
| CN106434557A (en) | Method for preparing CD34 positive cells from umbilical cord mesenchymal stem cells | |
| CN105663168A (en) | Cell preparation for repairing ovarian functions | |
| CN105255822A (en) | Method for screening and culturing extracellular hair follicle stem cell matrix for clinic treatment level cell therapy | |
| CN104263698A (en) | Screening and culturing methods for large-scale preparation of human extracellular matrix from fibroblasts for clinical treatment level cellular therapy | |
| CN107254431B (en) | Novel tissue engineering skin preparation method | |
| CN111849879A (en) | Cell culture medium and cell culture method | |
| CN106701670A (en) | Methods for enhancing bioactive factor secretion capacity of mesenchymal stem cells and extracting active factors in culture solution | |
| WO2009080794A1 (en) | Method for preparing cell-specific extracellular matrices |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20150819 |