RU2510276C1 - Method for preparing cells for replacement cell therapy of hepatic pathology - Google Patents
Method for preparing cells for replacement cell therapy of hepatic pathology Download PDFInfo
- Publication number
- RU2510276C1 RU2510276C1 RU2012140913/10A RU2012140913A RU2510276C1 RU 2510276 C1 RU2510276 C1 RU 2510276C1 RU 2012140913/10 A RU2012140913/10 A RU 2012140913/10A RU 2012140913 A RU2012140913 A RU 2012140913A RU 2510276 C1 RU2510276 C1 RU 2510276C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- cells
- liver
- differentiation
- cell
- hepatocytic
- Prior art date
Links
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к области регенеративной медицины и клеточных технологий, в частности, к получению клеточного материала для заместительной клеточной терапии широкого спектра острых и хронических патологий печени, в том числе для лечения циррозов, острой и хронической печеночной недостаточности, возникающей вследствие вирусных, химических, медикаментозных и иных повреждений печени, а также для восстановления генетических дефектов тканей и органов энтодермального происхождения.The invention relates to the field of regenerative medicine and cell technology, in particular, to the production of cellular material for cell replacement therapy of a wide range of acute and chronic liver pathologies, including for the treatment of cirrhosis, acute and chronic liver failure resulting from viral, chemical, drug and other damage to the liver, as well as to restore genetic defects of tissues and organs of endodermal origin.
Репарация тканевых дефектов с помощью трансплантации клеток представляет собой комплексный многостадийный процесс восстановления структуры и функции ткани, носящий универсальный характер. Эффективность замещения дефектов тканей, способность стимулировать собственную регенерацию органа, отсутствие опасностей возникновения фиброзов при применении заместительной клеточной терапии главным образом зависят от используемых в терапии клеток.The repair of tissue defects using cell transplantation is a complex multi-stage process of restoring the structure and function of tissue, which is universal in nature. The efficiency of replacing tissue defects, the ability to stimulate one’s own organ regeneration, and the absence of dangers of fibrosis when using cell replacement therapy mainly depend on the cells used in therapy.
Известно, что к трансдифференцировке в гепатоцитарном направлении способны в той или иной степени несколько типов клеток, однако, получить полноценно функционально активные клетки, выполняющие функции гепатоцитов, так и не удалось (Sarah Snykers, Tom Henkens, Evelien De Rop, Mathieu Vinken, Joanna Fraczek, Joery De Kock, Evi De Prins, Albert Geerts, Vera Rogiers, Tamara Vanhaecke. Role of epigenetics in liver-specific gene transcription, hepatocyte differentiation and stem cell reprogrammation // Journal of Hepatology, 51 (2009), pp.187-211).It is known that several types of cells are capable of transdifferentiation in the hepatocytic direction to one degree or another, however, it was not possible to obtain fully functionally active cells that perform the functions of hepatocytes (Sarah Snykers, Tom Henkens, Evelien De Rop, Mathieu Vinken, Joanna Fraczek , Joery De Kock, Evi De Prins, Albert Geerts, Vera Rogiers, Tamara Vanhaecke, Role of epigenetics in liver-specific gene transcription, hepatocyte differentiation and stem cell reprogrammation // Journal of Hepatology, 51 (2009), pp. 187-211 )
В настоящее время наиболее изученными источниками клеток для заместительной клеточной терапии заболеваний печени являются эмбриональные стволовые клетки (Rambhatia L, Chiu CP, Kundu P, Peng Y, Carpenter MK. Generation of hepatocyte-like cells from human embryonic stem cells // Cell Transplant., 2003, 12 (1), pp.1-11), мезенхимные клетки костного мозга (Snykers S, Vanhaecke T, De Becker A, Papeleu P, Vinken M, Van Riet I, Rogiers V. Chromatin remodeling agent trichostatin A: a key-factor in the hepatic differentiation of human mesenchymal stem cells derived of adult bone marrow // BMC Dev Biol,. 2007, Apr 2, pp.7-24), жировой ткани (Seo MJ, Suh SY, Bae YC, Jung JS. Differentiation of human adipose stromal cells into hepatic lineage in vitro and in vivo // Biochem. Biophys. Res. Commun., 2005, 328, pp.25 8-264) и клетки амниотической жидкости (Dawn M. Delo, Paolo De Coppi, Georg Bartsch, JR., Anthony Atala. Amniotic Fluid and Placental Stem Cells // Methods in Enzymology, Vol.419, 2006).Currently, the best-studied cell sources for substitutive cell therapy for liver diseases are embryonic stem cells (Rambhatia L, Chiu CP, Kundu P, Peng Y, Carpenter MK. Generation of hepatocyte-like cells from human embryonic stem cells // Cell Transplant., 2003, 12 (1), pp. 1-11), bone marrow mesenchymal cells (Snykers S, Vanhaecke T, De Becker A, Papeleu P, Vinken M, Van Riet I, Rogiers V. Chromatin remodeling agent trichostatin A: a key -factor in the hepatic differentiation of human mesenchymal stem cells derived of adult bone marrow // BMC Dev Biol, 2007, Apr 2, pp. 7-24), adipose tissue (Seo MJ, Suh SY, Bae YC, Jung JS. Differentiation of human adipose stromal cells into hepatic lineage in vitro and in vivo // Biochem. Biophys. Res. Commun., 2005, 328, pp.25 8-264) amniotic fluid cells (Dawn M. Delo, Paolo De Coppi, Georg Bartsch, JR., Anthony Atala. Amniotic Fluid and Placental Stem Cells // Methods in Enzymology, Vol.419, 2006).
Однако во всех исследовательских работах показана лишь частичная трансдифференцировка стволовых клеток и не достигнуто функционально активное состояние гепатоцитов, поэтому разработка надежных методов направленной дифференцировки стволовых клеток в функционально активные гепатоцитоподобные клетки и получение этих клеток в достаточном для трансплантации количестве представляет собой ключевую и первостепенную задачу современной клеточной биологии.However, in all the research works only partial transdifferentiation of stem cells was shown and the functionally active state of hepatocytes was not achieved, therefore, the development of reliable methods for the differentiation of stem cells into functionally active hepatocyte-like cells and obtaining these cells in sufficient quantities for transplantation is a key and primary task of modern cell biology .
Известен способ получения популяции клеток, обогащенной жизнеспособными клетками печени человека, в том числе печеночными стволовыми клетками/клетками-предшественниками, где указанная популяция клеток содержит функционально активные гепатоциты и билиарные клетки, экспрессирующие цитокератин 19 (СК19) и не экспрессирующие альбумин, а также печеночные стволовые клетки/клетки-предшественники, имеющие диаметр в диапазоне от 9 до 13 мкм и экспрессирующие маркеры ЕР-САМ, CD 133 или оба, предусматривающий расщепление целой печени человека или ее резецированной части препаратом протеолитических ферментов; механическую диссоциацию расщепленной целой печени человека или ее резецированной части для обеспечения клеточной суспензии; суспендирование суспензии клеток в растворе 25% (мас./об.) иодиксанола; градиентное центрифугирование смеси для получения по меньшей мере одной полосы, обогащенной жизнеспособными клетками печени человека; и сбор, по меньшей мере, одной полосы для получения целевой популяции клеток (RU №2346981, C12N 5/00, опубл. 20.02.2009).A known method of obtaining a population of cells enriched in viable human liver cells, including hepatic stem cells / progenitor cells, where this population of cells contains functionally active hepatocytes and biliary cells expressing cytokeratin 19 (SK19) and not expressing albumin, as well as hepatic stem precursor cells having a diameter in the range of 9 to 13 μm and expressing EP-CAM, CD 133 markers or both, involving cleavage of the whole human liver or its ezetsirovannoy portion preparation proteolytic enzymes; mechanical dissociation of the split whole human liver or its resected part to provide a cell suspension; suspending a cell suspension in a solution of 25% (w / v) iodixanol; gradient centrifugation of the mixture to obtain at least one band enriched in viable human liver cells; and collecting at least one band to obtain a target population of cells (RU No. 2346981, C12N 5/00, publ. 02.20.2009).
Существенным ограничением данного способа является недостаток донорских органов, короткое время жизни выделенных клеток и плохая выживаемость клеток после криохранения, а также невозможность получения клеток в достаточном для трансплантации количестве, т.к. отсутствует этап культивирования in vitro.A significant limitation of this method is the lack of donor organs, the short lifetime of the isolated cells and poor cell survival after cryopreservation, as well as the inability to obtain cells in an amount sufficient for transplantation, because there is no stage of in vitro cultivation.
Известен способ получения печеночных стволовых клеток для клеточной терапии и для создания искусственных органов, включающий выделение из ткани печени человека примитивных печеночных стволовых клеток человека, экспрессирующих Ер-САМ, АС133 и альбумин, культивирование данной смеси клеток в условиях, способствующих селекции примитивных печеночных стволовых клеток человека, в том числе в бессывороточной среде, содержащей регулятор углеводного метаболизма, переносчик железа и мембранообразующий фактор, при этом образуются колонии, включающие примитивные печеночные стволовые клетки человека, являющиеся предшественниками проксимальных печеночных стволовых клеток, предшественников гепатоцитов или предшественников желчных протоков (RU №2327479, A61K 35/407, опубл. 27.06.2008).A known method of producing hepatic stem cells for cell therapy and for the creation of artificial organs, including the isolation of primitive human hepatic stem cells expressing Ep-CAM, AC133 and albumin from human liver tissue, culturing this mixture of cells under conditions conducive to the selection of primitive human hepatic stem cells , including in a serum-free medium containing a regulator of carbohydrate metabolism, an iron carrier and a membrane-forming factor, colonies are formed, including primitive human hepatic stem cells, which are the precursors of proximal hepatic stem cells, hepatocyte precursors or bile duct precursors (RU No. 2237479, A61K 35/407, publ. 06/27/2008).
Недостаток известного способа заключается в том, что источниками клеток является либо донорская печень, из которой изъятие клеток представляет собой болезненную процедуру для донора, либо ткань печени из трупов новорожденных младенцев или трупов детей, которая малодоступна для широкого применения в клинике, и кроме того, полученный клеточный материал плохо приживается и при трансплантации вызывает ряд серьезных осложнений.The disadvantage of this method is that the source of the cells is either the donor liver, from which the removal of cells is a painful procedure for the donor, or liver tissue from the corpses of newborn babies or corpses of children, which is inaccessible for widespread use in the clinic, and in addition, the obtained cellular material does not take root well and causes a number of serious complications during transplantation.
В патенте RU №2272638 описан способ получения клеток для заместительной клеточной терапии при хроническом гепатите и циррозе печени, включающий выделение мезенхимных стволовых клеток из фетальных (костный мозг, тимус, печень, жировая ткань эмбрионов человека 1-го триместра беременности), донорских (костный мозг, жировая ткань, тимус, печень) или аутологичных (костный мозг и жировая ткань) тканей, при этом ткань ферментативно дезагрегируют, полученную клеточную суспензию ресуспендируют в ростовой среде DMEM/F12, содержащей 15% эмбриональной телячьей сыворотки и 2 мМ глутамина, далее высевают при плотности посева 1-20 млн. мононуклеарных клеток на 1 см2 и инкубируют при 37°C в атмосфере 5% CO2, по достижении культурой 50% конфлуентности клетки трипсинизируют и пересевают с плотностью 10-30 клеток на 1 см2 в ростовой среде, содержащей 10 мкг/мл трансферрина, 1 мкг/мл инсулина, 10 нг/мл фактора роста фибробластов - 2 и 8 ЕД/мл гепарина и с увеличением посевной дозы культивирование ведут до накопления в культуре зрелой стромы (RU №2272638, A61K 35/407, опубл. 27.03.2006).RU patent No. 2272638 describes a method for producing cells for cell replacement therapy for chronic hepatitis and liver cirrhosis, including the isolation of mesenchymal stem cells from fetal (bone marrow, thymus, liver, adipose tissue of human embryos of the 1st trimester of pregnancy), donor (bone marrow , adipose tissue, thymus, liver) or autologous (bone marrow and adipose tissue) tissues, the tissue is enzymatically disaggregated, the resulting cell suspension is resuspended in DMEM / F12 growth medium containing 15% fetal calf serum and 2 mM glutamine, then seeded at a seeding density of 1-20 million mononuclear cells per cm2 and incubated at 37 ° C in an atmosphere of 5% CO2, after the culture reaches 50% confluence, the cells are trypsinized and reseeded with a density of 10-30 cells per 1 cm2 in a growth medium containing 10 μg / ml transferrin, 1 μg / ml insulin, 10 ng / ml fibroblast growth factor - 2 and 8 U / ml heparin, and with an increase in the inoculative dose, cultivation is carried out until mature stroma is accumulated in the culture (RU No. 2272638, A61K 35/407, publ. 03/27/2006).
Недостатком аналога является то, что клетки зрелой стромы не обладают свойством дифференцироваться в гепатоцитоподобные клетки, поэтому практически не удается получить клетки, выполняющие функции гепатоцитов и, таким образом, полученные клетки терапевтически неэффективны. Кроме того, использование фетальных органов связано с этическими проблемами и не является легко доступным источником клеток.The disadvantage of the analogue is that the cells of the mature stroma do not have the ability to differentiate into hepatocyte-like cells; therefore, it is practically impossible to obtain cells that perform the functions of hepatocytes and, thus, the obtained cells are therapeutically ineffective. In addition, the use of fetal organs is associated with ethical issues and is not an easily accessible source of cells.
Известно также использование для лечения хронического гепатита или цирроза печени мононуклеарных клеток пуповинной крови донора, имеющих набор антигенов HLA-A, HLA-B, HLA-DR, отличный от набора антигенов HLA-A, HLA-B, HLA-DR реципиента не менее, чем по четырем антигенам (RU №2295351, A61K 35/14, опубл. 27.03.2007).It is also known to use donor cord mononuclear cells for the treatment of chronic hepatitis or cirrhosis of the liver, having a set of HLA-A, HLA-B, HLA-DR antigens different from the set of recipients HLA-A, HLA-B, HLA-DR of a recipient of at least than four antigens (RU No. 2295351, A61K 35/14, publ. 03/27/2007).
Недостатком способа является обязательное HLA-типирование и трудность подбора донора, т.к. для достижения клинического эффекта стволовые клетки пуповинной крови донора должны отличаться от клеток реципиента не менее чем по четырем антигенам из набора антигенов HLA-A, HLA-B, HLA-DR. Кроме того, эффективность данных клеток не доказана.The disadvantage of this method is the mandatory HLA typing and the difficulty of selecting a donor, because to achieve a clinical effect, donor cord blood stem cells must differ from the recipient cells in at least four antigens from the set of antigens HLA-A, HLA-B, HLA-DR. In addition, the effectiveness of these cells has not been proven.
Наиболее близким аналогом является способ получения клеток для лечения дисфункций печени, включающий выделение стволовых клеток из слюнной подчелюстной железы человека с помощью ферментативной обработки коллагеназой и гиалуронидазой, а затем - диспазой, с последующей магнитной селекцией по маркеру CD49f и культивирование выделенных клеток in vitro в течение 2-3 недель в присутствии ростовых факторов: эпидермального фактора роста (EGF) и основного фактора роста фибробластов (bFGF). После этого в течение недели проводится сфероидное культивирование клеток на 96 луночной плате с неадгезивной поверхностью в присутствии факторов направленной дифференцировки:The closest analogue is a method for producing cells for the treatment of liver dysfunctions, including the isolation of stem cells from the salivary submandibular gland of a person by enzymatic treatment with collagenase and hyaluronidase, and then with dispase, followed by magnetic selection by the CD49f marker and culturing the isolated cells in vitro for 2 -3 weeks in the presence of growth factors: epidermal growth factor (EGF) and primary fibroblast growth factor (bFGF). After this, a spheroidal cell culture is carried out for a week on a 96 well plate with a non-adhesive surface in the presence of directed differentiation factors:
В-27, N-2, фактора роста фибробластов 4 (FGF4) и фактора ингибирования лейкемии (LIF) с последующим выделением клеток, инициированных к дифференциации в гепатоцитарном направлении, которые характеризуются наличием маркеров HNF-3α, альфа-фетопротеина и альбумина (US №7659121, C12N 5/00, опубл. 09.02.2010).B-27, N-2, fibroblast growth factor 4 (FGF4) and leukemia inhibition factor (LIF), followed by isolation of cells initiated to hepatocyte differentiation, which are characterized by the presence of markers HNF-3α, alpha-fetoprotein and albumin (US No. 7659121, C12N 5/00, publ. 02/09/2010).
В ближайшем аналоге в качестве исходного источника клеток при получении клеток для заместительной клеточной терапии дисфункций печени используют протоковые клетки подчелюстной слюнной железы человека, которые представляют собой эпителиальные клетки энтодермального происхождения и являются родственными по своему типу и филогенетическому происхождению с функционально активными клетками печени и экзокринными клетками поджелудочной железы. В отличие от эмбриональных стволовых клеток эти клетки не обладают туморогенной и тератогенной активностью и не вызывают риск онкотрансформации. Протоковые клетки подчелюстной слюнной железы обладают бипотентным потенциалом дифференцировки и могут быть дифференцированы как в гепатоцитоподобные клетки, так и в клетки желчных протоков. Кроме того, эти клетки активно синтезируют инсулин и могут быть направлены в бета - клетки поджелудочной железы. Биопсия протоковых клеток подчелюстной слюнной железы не связана со сложной полостной операцией и с травматизацией донора, поэтому может быть проведена легко и без последствий для донора, и, кроме того, взятие такого клеточного материала снимает этические ограничения, которые возникают при использовании эмбриональных клеток и фетальных тканей.In the closest analogue, human submandibular duct cells, which are endodermal epithelial cells and are related in type and phylogenetic origin with functionally active liver cells and exocrine pancreatic cells, are used as the initial source of cells for cell replacement for liver dysfunction. glands. Unlike embryonic stem cells, these cells do not have tumorigenic and teratogenic activity and do not cause a risk of oncotransformation. The ductal cells of the submandibular salivary gland have a bipotent potential for differentiation and can be differentiated both into hepatocyte-like cells and into bile duct cells. In addition, these cells actively synthesize insulin and can be sent to the beta cells of the pancreas. A biopsy of the duct cells of the submandibular salivary gland is not associated with complex abdominal surgery and donor trauma, therefore it can be done easily and without consequences for the donor, and, in addition, taking such cellular material removes the ethical restrictions that arise when using embryonic cells and fetal tissues .
Однако ближайшему аналогу присущи и серьезные недостатки: известная технология получения клеток является длительной, многостадийной, трудоемкой и технически неосуществимой в промышленном масштабе. Кроме того, известный способ не дает стабильно воспроизводимого результата дифференцировки клеток до функционально активных гепатоцитоподобных клеток из-за неустойчивой индукции дифференцировки исходной популяции стволовых клеток в гепатоцитарном направлении, а также не обеспечивает возможности получения целевых клеток в количестве, достаточном для проведения их эффективной трансплантации в терапевтических целях.However, the closest analogue also has serious drawbacks: the well-known technology for producing cells is long-term, multi-stage, labor-intensive and technically unfeasible on an industrial scale. In addition, the known method does not give a stably reproducible result of the differentiation of cells to functionally active hepatocyte-like cells due to the unstable induction of differentiation of the initial stem cell population in the hepatocyte direction, and also does not provide the possibility of obtaining target cells in an amount sufficient for efficient transplantation into therapeutic purposes.
Задачей изобретения является разработка способа получения клеток для заместительной клеточной терапии патологий печени с использованием легкодоступного источника исходных клеток - энтодермальных стволовых клеток подчелюстной слюнной железы, и обеспечивающего их устойчивую индукцию дифференцировки в заданном гепатоцитарном направлении, а также позволяющего получать целевой клеточный материал с высокой биологической активностью и в количестве, достаточном для проведения эффективной трансплантации в терапевтических целях.The objective of the invention is to develop a method for producing cells for cell replacement therapy of liver pathologies using an easily accessible source of source cells — endodermal stem cells of the submandibular salivary gland, and ensuring their stable induction of differentiation in a given hepatocytic direction, and also allowing to obtain target cell material with high biological activity and in an amount sufficient to conduct effective transplantation for therapeutic purposes.
Технический результат изобретения заключается в упрощении технологии получения целевых клеток, увеличении гарантированно высокого процента (до 90%) функционально активных гепатоцитоподобных клеток из исходных стволовых клеток за счет повышения стабильности и воспроизводимости процесса дифференциации, а также повышение выхода целевых клеток.The technical result of the invention is to simplify the technology for producing target cells, increase the guaranteed high percentage (up to 90%) of functionally active hepatocyte-like cells from the original stem cells by increasing the stability and reproducibility of the differentiation process, as well as increasing the yield of target cells.
Технический результат достигается за счет использования в качестве исходного источника клеток выделенной из подчелюстной слюнной железы популяции энтодермальных протоковых стволовых клеток, экспрессирующей маркеры CD49f и ЕрСАМ, и разработанного оптимального способа культивирования данной популяции клеток для индукции гепатоцитарной дифференциации, позволяющего создать и поддерживать стандартные условия для дифференцировки полученной популяции стволовых клеток, необходимые для осуществления терминальных стадий гепатоцитарной дифференцировки, и обеспечивающие получение целевых клеток - гепатоцитоподобных функционально активных клеток в количестве, достаточном для проведения эффективной трансплантации в терапевтических целях.The technical result is achieved through the use of a population of endodermal ductal stem cells expressing CD49f and EpCAM markers isolated from the submandibular salivary gland as an initial source of cells, and an optimal method for culturing this population of cells to induce hepatocytic differentiation, which allows creating and maintaining standard conditions for differentiation of the obtained stem cell populations necessary for terminal stages of hepatocyte d fferentsirovki, and provides the desired cell - gepatotsitopodobnyh functionally active cells in an amount sufficient for effective transplantation for therapeutic purposes.
Все указанное позволит повысить качество лечения дефектов печени различной этиологии, сократить сроки лечения и риски возникновения осложнений за счет устранения фиброзных реакций организма и восполнения недостатка функционирующих клеток печени. Сущность изобретения заключается в следующем: в способе получения клеток для заместительной клеточной терапии патологий печени, включающем выделение протоковых стволовых клеток из подчелюстной слюнной железы и их последующее культивирование в присутствии факторов направленной дифференцировки до получения целевой клеточной культуры, отличающемся тем, что из протоковых стволовых клеток подчелюстной слюнной железы выделяют популяцию стволовых клеток, экспрессирующую маркеры CD49f и ЕрСАМ, выделенные клетки инкубируют в течение 4-6 дней в среде, содержащей вальпроевую кислоту в концентрации 0,1-40 мМ, культивирование в присутствии факторов направленной дифференцировки проводят в гепатоцитарной ростовой среде в три стадии: сначала в присутствии ингибитора γ-секретазы и витамина D3, затем - в присутствии онкостатина М и дексаметазона, и далее в среду добавляют интерлейкин 6 (I1-6) и стимулятор дифференцировки гормональной природы для завершения дифференцировки, а целевую культуру идентифицируют по экспрессии маркеров 1ААТ, РЕРСК, G6P, TDO, специфических для печени цитохромов Р450, альбумина и по способности синтезировать мочевину. В качестве гепатоцитарной ростовой среды используют среду, содержащую ростовую среду DMEM/F12, 7-20% фетальной телячьей сыворотки, 2 мМ глутамина, 1% ИТС (инсулин-трансферрин-селенит), 0,03 мМ никотинамида, 5-60 нг/мл гепатоцитарного ростового фактора (HGF) и 5-80 нг/мл эпидермального ростового фактора (EGF).All of the above will improve the quality of treatment of liver defects of various etiologies, reduce the treatment time and the risks of complications by eliminating the fibrous reactions of the body and compensating for the lack of functioning liver cells. The invention consists in the following: in a method for producing cells for replacement cell therapy of liver pathologies, including the isolation of ductal stem cells from the submandibular salivary gland and their subsequent cultivation in the presence of directed differentiation factors to obtain the target cell culture, characterized in that from the submandibular ductal cells salivary glands isolate a stem cell population expressing CD49f and EpCAM markers, isolated cells are incubated for 4-6 days in a medium containing valproic acid in a concentration of 0.1-40 mm, cultivation in the presence of directed differentiation factors is carried out in a hepatocytic growth medium in three stages: first in the presence of a γ-secretase inhibitor and vitamin D3, then in the presence of oncostatin M and dexamethasone, and then on Wednesday, interleukin 6 (I1-6) and a hormonal differentiation stimulator are added to complete the differentiation, and the target culture is identified by the expression of markers 1AAT, PERSK, G6P, TDO, liver specific cytochromes P450, and bumina and ability to synthesize urea. As a hepatocytic growth medium, a medium containing DMEM / F12 growth medium, 7-20% fetal calf serum, 2 mM glutamine, 1% ITS (insulin-transferrin-selenite), 0.03 mM nicotinamide, 5-60 ng / ml is used hepatocytic growth factor (HGF) and 5-80 ng / ml epidermal growth factor (EGF).
Источником исходных стволовых клеток служит подчелюстная слюнная железа взрослого донора, в том числе для аутологичной или аллогенной трансплантации. Взятие клеточного материала может быть проведено легко, без последствий для донора и не связано с этическими проблемами, которые возникают при использовании эмбриональных клеток и различных фетальных тканей.The source of the original stem cells is the submandibular salivary gland of an adult donor, including for autologous or allogeneic transplantation. The capture of cellular material can be carried out easily, without consequences for the donor and is not associated with ethical problems that arise when using embryonic cells and various fetal tissues.
Выделенные по изобретению стволовые клетки слюнной железы, экспрессирующие маркеры CD49f (маркер протоковых клеток) и ЕрСАМ (маркер адгезии эпителиальных клеток) представляют собой уникальную клеточную популяцию стволовых клеток энтодермального происхождения, отличающую ее от клеток, используемых в ближайшем аналоге. Уникальность выделенной популяции клеток по настоящему изобретению заключается в том, что в условиях культивирования согласно изобретения только клетки указанного фенотипа (CD49f+/EpCAM+) достоверно способны к дифференцировке в гепатоцитоподобные клетки с высокой биологической активностью.Isolated salivary gland stem cells expressing CD49f (ductal cell marker) and EpCAM (epithelial cell adhesion marker) markers are a unique cell population of endodermal stem cells that distinguishes them from cells used in the closest analogue. The uniqueness of the isolated cell population of the present invention lies in the fact that under cultivation conditions according to the invention only cells of the indicated phenotype (CD49f + / EpCAM +) are reliably capable of differentiation into hepatocyte-like cells with high biological activity.
Выделенную популяцию клеток инкубируют в течение 4-6 дней в ростовой среде, содержащей вальпроевую кислоту в концентрации 0,1-40 мМ. Добавление вальпроевой кислоты приводит к трансформации клеток в менее дифференцированное состояние и позволяет приблизить их к общему с гепатоцитами клеточному предшественнику. При этом, как было впервые установлено заявителем на моделях in vitro, повышается уровень экспрессии гена Tb×3, необходимого для гепатоцитарной дифференцировки, что обеспечивает упрощение и ускорение процессов последующей трансдифференцировки в гепатоцитарном направлении. Уже на 5-й день инкубации в клетках значительно возрастает синтез альфафетопротеина - вещества, которое синтезируется в гепатобластах. Полученные изменения в экспрессии генов, происходящие от применения вальпроевой кислоты, уникальны и характерны для выделенной популяции энтодермальных клеток, и не характерны для клеток иного происхождения. Этот результат является неочевидным для специалистов в данной области.The selected cell population is incubated for 4-6 days in a growth medium containing valproic acid at a concentration of 0.1-40 mm. The addition of valproic acid leads to the transformation of cells into a less differentiated state and allows them to be brought closer to the cellular precursor common with hepatocytes. Moreover, as was first established by the applicant in in vitro models, the expression level of the Tb × 3 gene necessary for hepatocytic differentiation is increased, which simplifies and accelerates the processes of subsequent transdifferentiation in the hepatocytic direction. Already on the 5th day of incubation in cells, the synthesis of alpha-fetoprotein, a substance that is synthesized in hepatoblasts, increases significantly. The resulting changes in gene expression resulting from the use of valproic acid are unique and characteristic of the selected population of endoderm cells, and are not characteristic of cells of a different origin. This result is not obvious to specialists in this field.
После инкубирования с вальпроевой кислотой полученные клетки подвергают трандифференцировке в гепатоцитарном направлении. Для этого клетки культивируют в три стадии в гепатоцитарной ростовой среде, содержащей факторы дифференциации: сначала в течение 5-6 дней в среде в присутствии ингибитора γ-секретазы и витамина D3, затем - в течение 5-6 дней в присутствии онкостатина М и дексаметазона, и далее в среду добавляют для завершения дифференцировки интерлейкин 6 (I1-6) и стимулятор дифференцировки гормональной природы, например, экстракты тимуса, которые содержатся, например, в коммерческих добавках N2 и В27 (Invitrogen).After incubation with valproic acid, the obtained cells are subjected to hepatocytic transdifferentiation. For this, cells are cultured in three stages in a hepatocyte growth medium containing differentiation factors: first, for 5-6 days in the medium in the presence of a γ-secretase inhibitor and vitamin D3, then for 5-6 days in the presence of oncostatin M and dexamethasone, and then, on Wednesday, interleukin 6 (I1-6) and a hormonal differentiation stimulant, for example, thymus extracts, which are contained, for example, in commercial additives N2 and B27 (Invitrogen), are added to complete the differentiation.
Через 20 дней культивирования в полученной клеточной культуре содержится не менее 90% дифференцированных клеток, экспрессирующих характерные для гепатоцитов маркеры 1ААТ, РЕРСК, G6P, TDO, специфические для печени цитохромы Р450, альбумин, а также синтезирующих мочевину, при этом экспрессия альбумина возрастает более чем в 17 раз по сравнению с исходной культурой, не подвергавшейся дифференцировке.After 20 days of cultivation, the resulting cell culture contains at least 90% of differentiated cells expressing hepatocyte-specific markers 1AAT, PEPCK, G6P, TDO, liver specific cytochrome P450, albumin, as well as synthesizing urea, while the expression of albumin increases by more than 17 times compared with the original culture, not subjected to differentiation.
Изобретение позволяет за короткий период времени (за 14-30 дней) вырастить значительное количество целевых клеток (108-109), которые могут быть использованы в терапевтических целях. Высокое содержание терминально дифференцированных в гепатоцитарном направлении клеток позволяет эффективно использовать их при трансплантации в качестве альтернативы трансплантации донорской печени для восполнения недостаточности функций гепатоцитов пациента.The invention allows for a short period of time (14-30 days) to grow a significant number of target cells (10 8 -10 9 ), which can be used for therapeutic purposes. The high content of terminally differentiated cells in the hepatocyte direction allows their efficient use in transplantation as an alternative to donor liver transplantation to compensate for the deficiency of the patient’s hepatocyte functions.
Разработанная технология, включающая получение энтодермальных стволовых клеток из тканей слюнной железы и их трансдифференцировку в процессе культивирования в присутствии факторов дифференцировки, является стабильно воспроизводимой и высокоэффективной, позволяющей обеспечить получение целевых клеток - функционально активных гепатоцитоподобных клеток в количестве, достаточном для проведения эффективной трансплантации в терапевтических целях и восполнения недостаточности функций гепатоцитов.The developed technology, including the production of endodermal stem cells from the tissues of the salivary gland and their transdifferentiation during cultivation in the presence of differentiation factors, is stably reproducible and highly effective, which allows to obtain the target cells - functionally active hepatocyte-like cells in an amount sufficient for efficient transplantation for therapeutic purposes and make up for hepatocyte deficiency.
Изобретение иллюстрируется следующими примерами.The invention is illustrated by the following examples.
Пример 1. Получение клеток для заместительной клеточной терапии патологий печени.Example 1. Obtaining cells for cell replacement therapy of liver pathologies.
Согласно изобретения технология получения клеток включает два этапа.According to the invention, the technology for producing cells includes two stages.
Этап 1. Получение популяции энтодермальных стволовых клеток из подчелюстной слюнной железы.Stage 1. Obtaining a population of endodermal stem cells from the submandibular salivary gland.
Донорскую ткань (часть подчелюстной слюнной железы размером 0,5-2 см3) переносят в стерильную пробирку со средой DMEM/F12 и гентамицином (40 мкг/мл). Начиная с этого момента работают в стерильных условиях, отвечающих требованиям GMP (Good Manufacturing Practice). После удаления фиброзной капсулы и кровеносных сосудов, ткань измельчают, дважды промывают фосфатно-солевым буфером (DPBS), осаждают центрифугированием в течение 5 минут при 0,8 тыс. об/мин, инкубируют ткань с 4 мг/мл коллагеназы IV типа (всего - 1 мл на 0,5 см3 ткани) в среде DMEM/F12 60 минут при 37С.Donor tissue (part of the submandibular salivary gland with a size of 0.5-2 cm 3 ) is transferred into a sterile tube with DMEM / F12 medium and gentamicin (40 μg / ml). From this moment, they work under sterile conditions that meet the requirements of GMP (Good Manufacturing Practice). After removing the fibrous capsule and blood vessels, the tissue is crushed, washed twice with phosphate-buffered saline (DPBS), precipitated by centrifugation for 5 minutes at 0.8 thousand rpm, incubated with 4 mg / ml type IV collagenase (total - 1 ml per 0.5 cm 3 tissue) in DMEM / F12 medium for 60 minutes at 37 ° C.
Затем к клеткам добавляют 10 мл полной ростовой среды, содержащей DMEM/F12 1:1, эмбриональную телячью сыворотку (7-20%, оптимально 10%); + глутамин (2 мМ); + 1% инсулин-трансферрин-селенит (ИТС) и эпидермальный фактор роста (EGF) (5-80 нг/мл, оптимально 10-20 нг/мл). Взвесь клеток активно пипетируют в течение 5 минут, затем пропускают через нейлоновый фильтр с диаметром пор 40-100 мкм и осаждают клетки центрифугированием в течение 2 мин. при 0,8 тыс. об/мин.Then, 10 ml of a complete growth medium containing DMEM / F12 1: 1, fetal calf serum (7-20%, optimally 10%) was added to the cells; + glutamine (2 mM); + 1% insulin-transferrin-selenite (ITS) and epidermal growth factor (EGF) (5-80 ng / ml, optimally 10-20 ng / ml). A suspension of cells is actively pipetted for 5 minutes, then passed through a nylon filter with a pore diameter of 40-100 μm and the cells are pelleted by centrifugation for 2 minutes. at 0.8 thousand rpm
Далее проводят магнитную сепарацию по маркерам CD49f и ЕрСАМ, для чего полученную суспензию клеток ресуспендируют в 0,5 мл фосфатно-солевого буфера, инкубируют с первыми антителами (anti-human CD49f и anti-human ЕрСАМ) в течение 30 минут при 4С, концентрация антител - 1 мкг/106 клеток. Промывают 5 мл фосфатно-солевого буфера и инкубируют с вторыми антителами, (коньюгированными с магнитными частицами) в течение 20 минут, далее проводит магнитную сепарацию на колонках по инструкциям производителя. Отсортированные клетки осаждают центрифугированием (5 минут при 300 g), ресуспендируют в полной ростовой среде, подсчитывают. Рассаживают на покрытые коллагеном I типа культуральные чашки из расчета 5×103 клеток на см2. Клетки культивируют при температуре 37°С в атмосфере 5% CO2.Next, magnetic separation is carried out according to the CD49f and EpCAM markers, for which the resulting cell suspension is resuspended in 0.5 ml of phosphate-saline buffer, incubated with the first antibodies (anti-human CD49f and anti-human EpCAM) for 30 minutes at 4C, antibody concentration - 1 μg / 10 6 cells. Wash with 5 ml of phosphate-buffered saline and incubate with second antibodies (conjugated with magnetic particles) for 20 minutes, then conduct magnetic separation on columns according to the manufacturer's instructions. Sorted cells are pelleted by centrifugation (5 minutes at 300 g), resuspended in complete growth medium, counted. Plated on collagen type I coated culture dishes at the rate of 5 × 10 3 cells per cm 2 . Cells are cultured at a temperature of 37 ° C in an atmosphere of 5% CO2.
При достижении нужного количества клеток (5×107-108) их переводят на гепатоцитарную ростовую среду DMEM/F12 1:1, содержащую фетальную телячью сыворотку (7-20%, оптимально 10%); глутамин (2 мМ); 1% инсулин-трансферрин-селенит (ИТС); 0,03 мМ никотинамид; гепатоцитарный ростовой фактор (HGF) (5-60 нг/мл, оптимально 15-20 нг/мл); эпидермальный ростовой фактор (EGF) (5-80 нг/мл, оптимально 10-20 нг/мл).Upon reaching the desired number of cells (5 × 10 7 -10 8 ) they are transferred to hepatocyte growth medium DMEM / F12 1: 1 containing fetal calf serum (7-20%, optimally 10%); glutamine (2 mM); 1% insulin-transferrin-selenite (ITS); 0.03 mM nicotinamide; hepatocytic growth factor (HGF) (5-60 ng / ml, optimally 15-20 ng / ml); epidermal growth factor (EGF) (5-80 ng / ml, optimally 10-20 ng / ml).
В гепатоцитарную ростовую среду добавляют вальпроевую кислоту в концентрации 0,1-40 мМ, (оптимально 1 мМ) и культивируют в течение 4-6 дней (оптимально 5 дней). Влияние вальпроевой кислоты на дифференцировку стволовых клеток в гепатоцитарном направлении оценивают с использованием методов иммуноцитохимии и количественной ПЦР. Обработка вальпроевой кислотой приводила к пятикратному увеличению экспрессии гена Tb×3, необходимого для гепатоцитарной дифференцировки.Valproic acid is added to the hepatocytic growth medium at a concentration of 0.1-40 mM (optimally 1 mM) and cultured for 4-6 days (optimally 5 days). The effect of valproic acid on the differentiation of stem cells in the hepatocytic direction is evaluated using methods of immunocytochemistry and quantitative PCR. Treatment with valproic acid resulted in a five-fold increase in the expression of the Tb × 3 gene necessary for hepatocytic differentiation.
В результате получают популяцию клеток, характеризующуюся повышенной экспрессией маркера Tb×3, которую подвергают трансдифференцировке в гепатоцитарном направлении.The result is a cell population characterized by increased expression of the Tb × 3 marker, which is transdifferentiated in the hepatocytic direction.
Этап 2. Индукция дифференцировки энтодермальных стволовых клеток слюнной железы в гепатоцитарном направлении.Stage 2. Induction of differentiation of endodermal stem cells of the salivary gland in the hepatocytic direction.
Для индукции гепатоцитарной дифференцировки к культуре клеток, после обработки вальпроевой кислотой, добавляют ингибитор γ-секретазы и витамин D3 (1-30 нг/мл, оптимально 20 нг/мл) инкубируют клетки 4-7 дней, предпочтительно в течение 5 дней. После этого реагенты удаляют, добавляют онкостатин М и дексаметазон в количествах 1-40 нг/мл онкостатина М (оптимально 10 нг/мл) и 0,05-0,3 мкМ дексаметазона (оптимально 0,1 мкМ), инкубируют 4-7 дней (оптимально 5 дней). Удаляют онкостатин М, добавляют интерлейкин 6 (I1-6) и стимулятор дифференцировки гормональной природы, например, экстракты тимуса, которые содержатся, например, в коммерческих добавках N2 и В27 (Invitrogen) (до 1%) и инкубируют еще 3-10 дней (оптимально 5 дней).To induce hepatocytic differentiation, a γ-secretase inhibitor and vitamin D3 (1-30 ng / ml, optimally 20 ng / ml) are added to the cell culture, after treatment with valproic acid, for 4-7 days, preferably for 5 days. After this, the reagents are removed, oncostatin M and dexamethasone are added in amounts of 1-40 ng / ml oncostatin M (optimally 10 ng / ml) and 0.05-0.3 μM dexamethasone (optimally 0.1 μM), incubated for 4-7 days (optimally 5 days). They remove oncostatin M, add interleukin 6 (I1-6) and a hormonal differentiation stimulator, for example, thymus extracts, which are contained, for example, in commercial additives N2 and B27 (Invitrogen) (up to 1%) and incubated for another 3-10 days ( optimally 5 days).
Дифференцированные клетки идентифицируют по морфологическим характеристикам и наличию экспрессии маркеров 1ААТ, PEPCK, G6P, TDO, специфических для печени цитохромов Р450 и альбумина. Помимо этого функциональную активность полученных клеток оценивают по способности синтезировать мочевину.Differentiated cells are identified by morphological characteristics and the presence of the expression of markers 1AAT, PEPCK, G6P, TDO, liver specific cytochromes P450 and albumin. In addition, the functional activity of the obtained cells is evaluated by the ability to synthesize urea.
Таким образом, в течение 2-3 недель получают дифференцированные в гепатоцитарном направлении клетки.Thus, within 2-3 weeks receive differentiated in the hepatocytic direction of the cell.
Полученные культуры дифференцированных в гепатоцитарном направлении клеток используют в качестве клеточного компонента в тканевых эквивалентах (биоискусственной) печени или в качестве самостоятельного клеточного препарата для лечения дисфункций печени.The obtained cultures of hepatocytic differentiated cells are used as a cellular component in tissue equivalents of a (bioartificial) liver or as an independent cell preparation for treating liver dysfunctions.
Пример 2. Приготовление клеточного препарата для лечения дисфункций печени.Example 2. Preparation of a cellular preparation for the treatment of liver dysfunctions.
За 24 часа до инъекции полученные по примеру 1 клетки переводят на бессывороточную среду: DMEM/F12 + 2 мМ глутамин; + 1% инсулин-трансферрин-селенит (ИТС); + 10 нг/мл эпидермальный фактор роста (EGF). Клетки снимают с пластика трипсином, переносят в центрифужные пробирки и осаждают 5 минут при 300 g. Супернатант удаляют, к клеткам добавляют эквивалентный объем стерильного физраствора, пипетируют и осаждают 5 минут при 300. Процедуру повторяют еще два раза. Затем клетки ресуспендируют в физиологическом растворе в нужной для конкретного случая концентрации (около 5×105 клеток на 100 мкл физраствора). Приготовленную клеточную суспензию держат при температуре 20-25C, используют для трансплантации в течение 4 часов.24 hours before the injection, the cells obtained in Example 1 are transferred to serum-free medium: DMEM / F12 + 2 mM glutamine; + 1% insulin-transferrin-selenite (ITS); + 10 ng / ml epidermal growth factor (EGF). Cells are removed from the plastic with trypsin, transferred to centrifuge tubes and pelleted for 5 minutes at 300 g. The supernatant is removed, an equivalent volume of sterile saline is added to the cells, pipetted and pelleted for 5 minutes at 300. The procedure is repeated two more times. Then the cells are resuspended in physiological saline in the concentration necessary for a particular case (about 5 × 10 5 cells per 100 μl of saline). The prepared cell suspension is kept at a temperature of 20-25C, used for transplantation for 4 hours.
Инъекции производят по 100 мкл в паренхиму органа, из расчета 106-109 клеток на пациента в зависимости от характера дефекта; либо вводят в воротную вену с помощью венозного катетера или пункционно в вены портальной системы, с помощью артериального катетера в селезеночную артерию, интраперитонеально, пункционно в большой сальник.Injections produce 100 μl into the organ parenchyma, at the rate of 10 6 -10 9 cells per patient, depending on the nature of the defect; either injected into the portal vein using a venous catheter or puncture into the veins of the portal system, using an arterial catheter into the splenic artery, intraperitoneally, puncture into the greater omentum.
В случае если клетки не планируется вводить сразу - их подвергают криозаморозке и криохранению. Для этого клетки разводят в криоконсервирующей среде в концентрации 106-109 на мл (оптимально 5×105) и охлаждают в программном замораживателе со скоростью 1C в минуту. Затем помещают в жидкой азот, хранят до возникновения потребности в трансплантации.If the cells are not planned to be administered immediately, they are subjected to cryogenic freezing and cryopreservation. For this, the cells are diluted in a cryopreservation medium at a concentration of 10 6 -10 9 per ml (optimally 5 × 10 5 ) and cooled in a program freezer at a speed of 1C per minute. Then placed in liquid nitrogen, stored until the need for transplantation.
Пример 3. Оценка эффективности полученных клеток при репарации дефектов печени.Example 3. Evaluation of the effectiveness of the obtained cells in the repair of liver defects.
Способность полученных по примеру 1 клеток к репарации дефектов печени оценивалась на лабораторной модели: на мышах линии С57 Black, у которых с помощью внутрибрюшинных инъекций четыреххлористого углерода экспериментально была вызвана печеночная недостаточность.The ability of the cells obtained in Example 1 to repair liver defects was evaluated in a laboratory model: in C57 Black mice, in which liver failure was experimentally caused by intraperitoneal injections of carbon tetrachloride.
Формируют две группы животных: одну экспериментальную и одну контрольную - в качестве положительного эталона сравнения в которой используют универсальный индикатор гепатоцитарной дифференцировки - прогениторные клетки печени.Two groups of animals are formed: one experimental and one control — in which a universal indicator of hepatocytic differentiation — progenitor cells of the liver — is used as a positive reference standard.
Мышам экспериментальной группы трансплантируют клетки, полученные по примеру 1, которые несут метку зеленого флуоресцентного белка (GFP) в количестве 5×106 трансплантируемых клеток на мышь. Трансплантируемые в данном случае клетки несли ген GFP и могли быть детектированы с помощью флуоресцентной микроскопии. Трансплантацию клеток осуществляют путем инъекции в паренхиму печени.The mice of the experimental group are transplanted with the cells obtained in Example 1, which carry the label of green fluorescent protein (GFP) in the amount of 5 × 10 6 transplanted cells per mouse. The cells transplanted in this case carried the GFP gene and could be detected using fluorescence microscopy. Cell transplantation is carried out by injection into the liver parenchyma.
Контрольной группе животных в качестве положительного контроля подсаживают прогениторные клетки печени мыши, несущие метку GFP, в количестве 5×106 клеток на мышь.In the control group of animals, progenitor mouse liver cells bearing the GFP tag were added as a positive control in the amount of 5 × 10 6 cells per mouse.
Оценку эффективности трансплантированных клеток проводят по способности введенных клеток встраиваться в строму печени реципиента и производить альбумин.The effectiveness of transplanted cells is assessed by the ability of the introduced cells to integrate into the recipient's stroma and produce albumin.
Уже через 5 дней в печени мышей были задетектированы положительные по GFP клетки, которые встроились в структуру печени, были способны к синтезу альбумина и цитохромов P450. Причем, значительных различий между опытной и контрольной группами не наблюдалось. Это означает, что дифференцированные указанным способом в гепатоцитарном направлении клетки подчелюстной слюнной железы способны встраиваться в печень и выполнять гепатоцитарные функции на уровне сопоставимом со стволовыми клетками печени.After 5 days in the liver of mice, GFP-positive cells that were integrated into the structure of the liver were detected and were capable of synthesizing albumin and cytochrome P450. Moreover, significant differences between the experimental and control groups were not observed. This means that the submandibular salivary gland cells differentiated by this method in the hepatocytic direction are able to integrate into the liver and perform hepatocytic functions at a level comparable to liver stem cells.
Представленные результаты свидетельствуют, что полученные по изобретению клетки при трансплантации могут замещать дефекты тканей и восполнять недостаточность функций гепатоцитов. Клетки также активно синтезируют широкий спектр биологически активных веществ, в том числе фактор роста нервов, эпидермальный фактор роста, фактор роста эндотелия и др., что может оказывать стимулирующее действие на собственные клетки реципиента. Важно, что в данном случае используются именно клетки того же зародышевого листка - энтодермального, так как другие источники клеток (по литературным данным) не могут дифференцироваться в гепатоцитарном направлении с достаточной эффективностью.The presented results indicate that the cells obtained according to the invention during transplantation can replace tissue defects and make up for the insufficiency of hepatocyte functions. Cells also actively synthesize a wide range of biologically active substances, including nerve growth factor, epidermal growth factor, endothelial growth factor, etc., which can have a stimulating effect on the recipient's own cells. It is important that in this case, it is the cells of the same germinal leaf, the endoderm, that are used, since other cell sources (according to the literature) cannot differentiate in the hepatocytic direction with sufficient efficiency.
Таким образом, полученные по изобретению клетки могут быть эффективно использованы для лечения хронических гепатитов и циррозов печени, развившихся вследствие гепатотропных вирусов (вирусы гепатита В, С, D, G, F, TTV, CMV, EBV), токсического фактора (алкоголь, лекарства, промышленные вещества и др.), метаболических нарушений (гемохроматоз, болезнь Вильсона-Коновалова, недостаточность α1-антитрипсина, гликогеноз IV типа, галактоземия, наследственный тирозиноз, наследственные гипербилирубинемии), аутоиммунных заболеваний (первичный билиарный цирроз, первичный склерозирующий холангит, аутоиммунный гепатит) и многих других факторов.Thus, the cells obtained according to the invention can be effectively used to treat chronic hepatitis and cirrhosis of the liver, which developed as a result of hepatotropic viruses (hepatitis B, C, D, G, F, TTV, CMV, EBV viruses), toxic factor (alcohol, drugs, industrial substances, etc.), metabolic disorders (hemochromatosis, Wilson-Konovalov’s disease, α1-antitrypsin deficiency, type IV glycogenosis, galactosemia, hereditary tyrosinosis, hereditary hyperbilirubinemia), autoimmune diseases (primary biliary cirro , Primary sclerosing cholangitis, autoimmune hepatitis), and many other factors.
Claims (2)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2012140913/10A RU2510276C1 (en) | 2012-09-25 | 2012-09-25 | Method for preparing cells for replacement cell therapy of hepatic pathology |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2012140913/10A RU2510276C1 (en) | 2012-09-25 | 2012-09-25 | Method for preparing cells for replacement cell therapy of hepatic pathology |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2012140913A RU2012140913A (en) | 2014-03-27 |
| RU2510276C1 true RU2510276C1 (en) | 2014-03-27 |
Family
ID=50342911
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2012140913/10A RU2510276C1 (en) | 2012-09-25 | 2012-09-25 | Method for preparing cells for replacement cell therapy of hepatic pathology |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2510276C1 (en) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2631005C1 (en) * | 2016-10-06 | 2017-09-15 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Российский национальный исследовательский медицинский университет им. Н.И. Пирогова" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБОУ ВО РНИМУ им. Н.И. Пирогова Минздрава России) | Method for human salivary gland cells cultivation |
| RU2661105C2 (en) * | 2016-01-21 | 2018-07-11 | Общество с ограниченной ответственностью Научно-технический центр "БиоКлиникум" | Method for producing spheroids of heparg cells in a medium without dimethyl sulphoxide |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN113106057B (en) * | 2020-12-23 | 2023-04-25 | 重庆医科大学附属儿童医院 | Autologous stem cell preparation for liver cell transplantation and preparation method thereof |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2272638C1 (en) * | 2004-08-18 | 2006-03-27 | ЗАО "РеМеТэкс" | Biotransplant, method for its preparing and method for treatment of chronic hepatitis and liver cirrhosis (variants) |
| US20070154463A1 (en) * | 2001-11-15 | 2007-07-05 | Fumio Endo | Stem cell originated from salivary gland duct epithelium and use of the same |
-
2012
- 2012-09-25 RU RU2012140913/10A patent/RU2510276C1/en active
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20070154463A1 (en) * | 2001-11-15 | 2007-07-05 | Fumio Endo | Stem cell originated from salivary gland duct epithelium and use of the same |
| RU2272638C1 (en) * | 2004-08-18 | 2006-03-27 | ЗАО "РеМеТэкс" | Biotransplant, method for its preparing and method for treatment of chronic hepatitis and liver cirrhosis (variants) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2661105C2 (en) * | 2016-01-21 | 2018-07-11 | Общество с ограниченной ответственностью Научно-технический центр "БиоКлиникум" | Method for producing spheroids of heparg cells in a medium without dimethyl sulphoxide |
| RU2631005C1 (en) * | 2016-10-06 | 2017-09-15 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Российский национальный исследовательский медицинский университет им. Н.И. Пирогова" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБОУ ВО РНИМУ им. Н.И. Пирогова Минздрава России) | Method for human salivary gland cells cultivation |
| WO2018067036A1 (en) * | 2016-10-06 | 2018-04-12 | Pirogov Russian National Research Medical University (Rnrmu) | Method of cultivation of human salivary gland cells |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| RU2012140913A (en) | 2014-03-27 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Fauza | Amniotic fluid and placental stem cells | |
| US10526581B2 (en) | Modulation of cardiac stem-progenitor cell differentiation, assays and uses thereof | |
| US9867854B2 (en) | Therapeutic method using cardiac tissue-derived pluripotent stem cells | |
| JP3934539B2 (en) | Adult or postnatal tissue progenitor cells derived from placenta | |
| US8945920B2 (en) | Method for culturing cells derived from the adipose tissue and uses thereof | |
| JP4745386B2 (en) | Transplantation of differentiated immature adipocytes and biodegradable scaffolds for tissue augmentation | |
| US8685724B2 (en) | In vitro techniques for use with stem cells | |
| Ghaedi et al. | Bioengineered lungs generated from human i PSC s‐derived epithelial cells on native extracellular matrix | |
| US20080152630A1 (en) | Method of generation and expansion of tissue-progenitor cells and mature tissue cells from intact bone marrow or intact umbilical cord tissue | |
| US20030211603A1 (en) | Reprogramming cells for enhanced differentiation capacity using pluripotent stem cells | |
| US20130224157A1 (en) | Stem cells for treating lung diseases | |
| JP6856586B2 (en) | Stem and pancreatic cells useful in the treatment of insulin-dependent diabetes | |
| US20060110825A1 (en) | Process for the preparation of stem cells from human muscle tissue and adipose tissue, and stem cell obtainable by this process | |
| JP2005523328A (en) | Placenta-derived stem cells and uses thereof | |
| CN113337458A (en) | Method for improving yield and purity of pluripotent stem cells directionally induced cardiac muscle cells | |
| US20110195054A1 (en) | Preparation And Use Of Stromal Cells For Treatment Of Cardiac Diseases | |
| WO2005123904A1 (en) | Method of producing vascular endothelial cells from primate embryonic stem cells | |
| RU2510276C1 (en) | Method for preparing cells for replacement cell therapy of hepatic pathology | |
| US20120064040A1 (en) | Serum free culture medium and supplement | |
| CN115361960A (en) | Methods for treating chronic graft versus host disease | |
| US20080241111A1 (en) | Pluripotent Stem Cell Derived from Cardiac Tissue | |
| KR102281535B1 (en) | Generation of liver organoid from stem cells for hemophilia A treatment | |
| JP2005287479A (en) | Method for extracting tissue stem cell and device using the method | |
| WO2002014469A2 (en) | Reprogramming cells for enhanced differentiation capacity using pluripotent stem cells | |
| US20060148079A1 (en) | Isolation and purification of human insulin producing cells for the treatment of insulin dependent diabetes |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PC43 | Official registration of the transfer of the exclusive right without contract for inventions |
Effective date: 20160328 |