JP2005287479A - Method for extracting tissue stem cell and device using the method - Google Patents

Method for extracting tissue stem cell and device using the method Download PDF

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JP2005287479A JP2004134826A JP2004134826A JP2005287479A JP 2005287479 A JP2005287479 A JP 2005287479A JP 2004134826 A JP2004134826 A JP 2004134826A JP 2004134826 A JP2004134826 A JP 2004134826A JP 2005287479 A JP2005287479 A JP 2005287479A
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Kazuhisa Maeda
和久 前田
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Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a method for easily extracting tissue stem cells, and to provide a device using the method. <P>SOLUTION: The method for obtaining specific tissue stem cells from tissue pieces extracted from a biological tissue with a puncturing needle comprises, in a closed system, the step (1) of passing the tissue pieces through a filter 200-300 μm in pore size to remove a hemocyte component therefrom, the step (2) of cleansing the resultant tissue pieces with an antibiotic-containing phosphate buffer solution, the step (3) of subjecting the resultant tissue pieces to enzyme treatment into a cell suspension, the step (4) of separating the aimed cells from cells of smaller specific gravity by making the lighter cells float, the step (5) of passing a suspension containing the aimed cells through a filter 250-300 μm in pore size again, the step (6) of further passing the suspension through a filter 20-40 μm in pore size, and the step (7) of either centrifuging or passing the suspension through a filter 400-500 nm in pore size to obtain the objective cells from the cell suspension. <P>COPYRIGHT: (C)2006,JPO&NCIPI

Description

本発明は、生物学、医学等の分野における培養細胞を用いた組織幹細胞採取方法、及びそれを利用した装置に関する。  The present invention relates to a tissue stem cell collection method using cultured cells in fields such as biology and medicine, and an apparatus using the same.

再生医療は、従来は不可能或いは困難と考えられてきたさまざまな疾病や外傷などで大きく損傷したり或いは失われた人体の細胞や組織を、元通りに修復し、その機能を回復させる画期的な医療として、現在大きな注目を受けており、その早期実用化が強く望まれている。しかし、ES細胞には医療への応用にいくつかの大きな技術的のみならず倫理的な問題点を克服する必要がある。一方、あらゆる臓器や組織の構成細胞には幹細胞が存在する可能性が示唆されており、それらの幹細胞を同定して自在に複製増殖し、応用することが期待されている。  Regenerative medicine is an epoch-making process that restores and restores the functions of human cells and tissues that have been greatly damaged or lost due to various diseases and traumas that were previously considered impossible or difficult. As a medical treatment, it is currently receiving great attention, and its early practical application is strongly desired. However, ES cells need to overcome some major technical as well as ethical problems for medical applications. On the other hand, there is a possibility that stem cells exist in the constituent cells of all organs and tissues, and it is expected that these stem cells can be identified, freely replicated, and applied.

なかでも脂肪組織は、発明者は脂肪組織中に幹細胞が存在し、非常に多くの蛋白質を分泌する極めて再生能力の高いと予想される組織であることを報告してきた(Maeda K、et al.、Gene.1997 May 6;190(2):227−35、前田和久 他 Annual Review 2004 内分泌、代謝p15−19)。加えて、脂肪吸引術自体は全世界でもっとも頻繁に行われる手術のひとつであり、脂肪採取時の合併症や本人への痛みも全くない理想的な組織摘出術である。  Among them, the adipose tissue has been reported that the inventor has stem cells in the adipose tissue and is expected to have a very high regenerative ability to secrete a large amount of protein (Maeda K, et al. Gene May 1997; 190 (2): 227-35, Kazuhisa Maeda et al. Annual Review 2004 Endocrine, Metabolism p15-19). In addition, liposuction itself is one of the most frequently performed operations in the world, and it is an ideal tissue extraction without any complications or pain to the person.

しかし、脂肪組織は採取してより後のハンドリングが極めて困難であり、これまで研究や臨床的な見地から扱われることがほとんどなく、革新的な技術が強く望まれていた。  However, adipose tissue has been extremely difficult to handle after collection, and so far it has been rarely treated from a research and clinical standpoint, and innovative techniques have been strongly desired.

そのような中、特開2002−80377号公報では、生体から採取した細胞浮遊液から不織布を用いて目的とする細胞を回収し、組織再生用細胞として利用する方法が開示されているが、この技術では骨髄液のような細胞が浮遊している系で利用されていること、また分離が開放系で利用されていること等から、さらに簡便な効率良い細胞採取方法の開発が強く望まれていた。  Under such circumstances, Japanese Patent Application Laid-Open No. 2002-80377 discloses a method of recovering target cells from a cell suspension collected from a living body using a nonwoven fabric and using them as cells for tissue regeneration. The technology is used in systems where cells such as bone marrow are floating, and separation is used in an open system. Therefore, development of simpler and more efficient cell collection methods is strongly desired. It was.

本発明は、上記のような従来技術の問題点を解決することを意図してなされたものである。すなわち、本発明は、従来技術と全く異なった発想からの新規な組織幹細胞採取方法を提供することを目的とする。また、本発明は、それを利用した装置を提供することを目的とする。  The present invention has been made with the intention of solving the problems of the prior art as described above. That is, an object of the present invention is to provide a novel tissue stem cell collection method based on an idea completely different from the prior art. Moreover, an object of this invention is to provide the apparatus using it.

本発明者らは、上記課題を解決するために、種々の角度から検討を加えて、研究開発を行った。その結果、驚くべくことに、(1)脂肪吸引法に用いるシリンジそのものにフィルターを装置することにより効率よく混入した赤血球を洗浄除去しうる閉鎖系回路を確立し、(2)さらに閉鎖系回路自身を倒立させることにより浮遊せしめた成熟脂肪細胞から幹細胞の分離が行えることを発見した。本発明はかかる知見に基づいて完成されたものである。  In order to solve the above-mentioned problems, the present inventors have studied and developed from various angles. As a result, surprisingly, (1) a closed system circuit that can efficiently wash out and remove mixed red blood cells by establishing a filter on the syringe itself used in the liposuction method, and (2) the closed system circuit itself is established. It was discovered that stem cells can be separated from matured adipocytes suspended by inversion. The present invention has been completed based on such findings.

すなわち、生体組織から穿刺針を用いて採取した組織片から特定の組織幹細胞を得る際、閉鎖系で
(1)細孔径250〜300μmフィルターに通過させることで組織片から血球成分を除去する工程、
(2)抗生物質を含有したリン酸緩衝液で洗浄する工程、
(3)得られた組織片に酵素処理を施し細胞懸濁液とする工程、
(4)比重の軽い細胞を浮かせることで目的の細胞と分離させる工程、
(5)その目的の細胞の懸濁液を再び、細孔径250〜300μmフィルターを通過させる工程、
(6)さらに細孔径8〜25μmフィルターに通過させる工程、
遠心分離、及びまたは450〜500nmフィルターを通過させることで細胞懸濁液より目的の細胞を得る工程、を経ることを特徴とする組織幹細胞採取方法を提供する。
また、本発明は、その組織幹細胞採取方法を利用した組織幹細胞採取装置を提供する。
That is, when obtaining a specific tissue stem cell from a tissue piece collected from a biological tissue using a puncture needle, (1) a step of removing blood cell components from the tissue piece by passing through a filter having a pore diameter of 250 to 300 μm in a closed system;
(2) a step of washing with a phosphate buffer containing an antibiotic,
(3) A step of subjecting the obtained tissue piece to enzyme treatment to obtain a cell suspension,
(4) a process of separating cells of low specific gravity from the target cells by floating;
(5) a step of passing the target cell suspension again through a filter having a pore size of 250 to 300 μm;
(6) a step of further passing through a filter having a pore size of 8 to 25 μm,
There is provided a tissue stem cell collection method characterized by undergoing centrifugation and / or a step of obtaining a target cell from a cell suspension by passing through a 450-500 nm filter.
The present invention also provides a tissue stem cell collection device using the tissue stem cell collection method.

組織由来の幹細胞を臨床応用すること自体非常に新しい分野であるが、また、従来は仮に脂肪組織の扱いに慣れた者が一連の操作を行ったにしても、手術場から取り出した組織を清潔な容器などに保管して、クリーンベンチの整った実験室(現在の厚生省の考えではCPCが必須である)に持ち運び、細胞分離を行ってきた。従来の技術は、いわば心臓移植の際に心臓を移送するのと同じ程度の清潔度が必要であった。本発明は、この脂肪組織よりの脂肪採取を容易にし、血液などの混入物除去、脂肪細胞の分解、脂肪組織由来幹細胞の単離を一本のチューブで行いうるようにし、雑菌などのコンタミを全く起こらないようにする画期的な方法である。今後予想される、再生医療分野での組織よりの細胞抽出に本システムを用いれば、安全かつ清潔に組織幹細胞を抽出することが可能となる。さらに本システムを用いれば、移送手段や実験室での分離が容易となり、診療所レベルで細胞分離もできるようになる。  Although clinical application of tissue-derived stem cells is a very new field, even if a person who has become accustomed to handling adipose tissue has performed a series of operations in the past, the tissue removed from the operating field should be cleaned. It has been stored in a clean container and carried to a laboratory equipped with a clean bench (CPC is essential in the current Ministry of Health and Welfare's idea) and cell separation has been performed. The prior art required the same level of cleanliness as transporting the heart during a heart transplant. The present invention facilitates the collection of fat from the adipose tissue, enables removal of contaminants such as blood, decomposition of adipocytes, and isolation of adipose tissue-derived stem cells in a single tube. This is an epoch-making way to prevent it from happening at all. If this system is used for cell extraction from tissue in the field of regenerative medicine, which is expected in the future, tissue stem cells can be extracted safely and cleanly. Furthermore, if this system is used, separation in a transfer means or a laboratory is facilitated, and cell separation can be performed at the clinic level.

以下、本発明を説明する。本明細書の全体にわたり、単数形の表現は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。従って、単数形の冠詞(例えば、英語の場合は「a」、「an」、「the」など)は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。また、本明細書において使用される用語は、特に言及しない限り、当該分野で通常用いられる意味で用いられることが理解されるべきである。したがって、他に定義されない限り、本明細書中で使用される全ての専門用語および科学技術用語は、本発明の属する分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。矛盾する場合、本明細書(定義を含めて)が優先する。  The present invention will be described below. Throughout this specification it should be understood that the singular forms also include the plural concept unless specifically stated otherwise. Thus, it should be understood that singular articles (eg, “a”, “an”, “the”, etc. in the case of English) also include the plural concept unless otherwise stated. In addition, it is to be understood that the terms used in the present specification are used in the meaning normally used in the art unless otherwise specified. Thus, unless defined otherwise, all technical and scientific terms used herein have the same meaning as commonly understood by one of ordinary skill in the art to which this invention belongs. In case of conflict, the present specification, including definitions, will control.

(用語の定義)
以下に本明細書において特に使用される用語の定義を列挙する。
(Definition of terms)
Listed below are definitions of terms particularly used in the present specification.

本明細書において「脂肪細胞」とは、脂肪の貯蔵組織の総称である。疎性結合組織のうち、特に脂肪の多いもの、皮下脂肪組織などがある。各脂肪細胞は格子繊維によって囲まれ,細胞間に毛細血管が密に分布し、脂肪体を形成することがおおい。本明細書では、どのような脂肪組織も供給源とすることができる。脂肪体は、他の組織から独立してほぼ一定した塊状もしくは房状の脂肪組織であり、脊椎動物では腎臓や生殖腺に接して腹腔内に存在する。白色、黄色または橙色をしていることが多い。  As used herein, “adipocyte” is a general term for fat storage tissues. Among the loose connective tissues, there are particularly fatty ones and subcutaneous fat tissues. Each fat cell is surrounded by lattice fibers, and capillaries are densely distributed between the cells to form a fat body. As used herein, any adipose tissue can be a source. A fat body is an almost constant mass or tufted adipose tissue independent of other tissues, and in vertebrates, it exists in the abdominal cavity in contact with the kidneys and gonads. Often white, yellow or orange.

本明細書において使用される「細胞」は、当該分野において用いられる最も広義の意味と同様に定義され、多細胞生物の組織の構成単位であって、外界を隔離する膜構造に包まれ、内部に自己再生能を備え、遺伝情報およびその発現機構を有する生命体をいう。本発明の方法においては、どのような細胞でも対象とされ得る。本発明で使用される「細胞」の数は、光学顕微鏡を通じて計数することができる。光学顕微鏡を通じて計数する場合は、核の数を数えることにより計数を行う。当該組織を組織切片スライスとし、ヘマトキシリン−エオシン(HE)染色を行うことにより細胞外マトリクス(例えば、エラスチンまたはコラーゲン)および細胞に由来する核を色素によって染め分ける。この組織片を光学顕微鏡にて検鏡し、特定の面積(例えば、200μm×200μm)あたりの核の数を細胞数と見積って計数することができる。本明細書において使用される細胞は、天然に存在する細胞であっても、人工的に改変された細胞(例えば、融合細胞、遺伝子改変細胞)であってもよい。細胞の供給源としては、例えば、単一の細胞培養物であり得、あるいは、正常に成長したトランスジェニック動物の胚、血液、または体組織、または正常に成長した細胞株由来の細胞のような細胞混合物が挙げられるがそれらに限定されない。また、このような供給源をそのまま細胞として用いることもできる。  As used herein, a “cell” is defined in the same way as the broadest meaning used in the art, and is a structural unit of a tissue of a multicellular organism that is enclosed in a membrane structure that isolates the outside world, Refers to a living organism having self-regenerative ability and having genetic information and its expression mechanism. Any cell can be targeted in the method of the present invention. The number of “cells” used in the present invention can be counted through an optical microscope. When counting through an optical microscope, counting is performed by counting the number of nuclei. The tissue is used as a tissue slice, and hematoxylin-eosin (HE) staining is performed, whereby the extracellular matrix (for example, elastin or collagen) and the nucleus derived from the cells are dyed with a dye. This tissue piece can be examined with an optical microscope, and the number of nuclei per specific area (for example, 200 μm × 200 μm) can be estimated and counted. The cells used herein may be naturally occurring cells or artificially modified cells (eg, fusion cells, genetically modified cells). The source of cells can be, for example, a single cell culture, or such as cells from a normally grown transgenic animal embryo, blood, or body tissue, or a normally grown cell line Examples include but are not limited to cell mixtures. Moreover, such a supply source can also be used as a cell as it is.

本発明において使用される細胞は、脂肪細胞またはその対応物がある限り、どの生物由来の細胞(例えば、メクラウナギ類、ヤツメウナギ類、軟骨魚類、硬骨魚類、両生類、爬虫類、鳥類、哺乳動物など)でも用いることができる。好ましくは、そのような細胞は、哺乳動物(例えば、単孔類、有袋類、貧歯類、皮翼類、翼手類、食肉類、食虫類、長鼻類、奇蹄類、偶蹄類、管歯類、有鱗類、海牛類、クジラ目、霊長類、齧歯類、ウサギ目など)由来の細胞が用いられる。1つの実施形態では、霊長類(例えば、チンパンジー、ニホンザル、ヒト)由来の細胞、特にヒト由来の細胞が用いられるがそれに限定されない。  The cell used in the present invention may be a cell derived from any organism (for example, larvae, lampreys, cartilaginous fish, teleosts, amphibians, reptiles, birds, mammals, etc.) as long as there are adipocytes or their counterparts. Can be used. Preferably, such cells are mammalian (eg, monoporous, marsupial, rodent, winged, winged, carnivorous, carnivorous, long-nosed, odd-hoofed, cloven-hoofed , Rodents, scales, sea cattle, cetaceans, primates, rodents, rabbits, etc.). In one embodiment, cells derived from primates (eg, chimpanzees, Japanese monkeys, humans), particularly cells derived from humans, are used, but are not limited thereto.

本明細書において「幹細胞」とは、自己複製能を有し、多分化能(すなわち多能性)(「pluripotency」)を有する細胞をいう。幹細胞は通常、組織が傷害を受けたときにその組織を再生することができる。本明細書では幹細胞は、胚性幹(ES)細胞または組織幹細胞(組織性幹細胞、組織特異的幹細胞または体性幹細胞ともいう)であり得るがそれらに限定されない。また、上述の能力を有している限り、人工的に作製した細胞(たとえば、本明細書において記載される融合細胞、再プログラム化された細胞など)もまた、幹細胞であり得る。胚性幹細胞とは初期胚に由来する多能性幹細胞をいう。胚性幹細胞は、1981年に始めて樹立され、1989年以降ノックアウトマウス作製にも応用されている。1998年にはヒト胚性幹細胞が樹立されており、再生医学にも利用されつつある。組織幹細胞は、胚性幹細胞とは異なり、分化の方向が限定されている細胞であり、組織中の特定の位置に存在し、未分化な細胞内構造をしている。従って、組織幹細胞は多能性のレベルが低い。組織幹細胞は、核/細胞質比が高く、細胞内小器官が乏しい。組織幹細胞は、概して、多分化能を有し、細胞周期が遅く、個体の一生以上に増殖能を維持する。本明細書においては使用される場合は、幹細胞は好ましくは間葉系幹細胞のような組織幹細胞であり得るが、状況に応じて胚性幹細胞も使用され得る。  As used herein, “stem cell” refers to a cell having a self-renewal ability and having pluripotency (ie, “pluripotency”). Stem cells are usually able to regenerate the tissue when the tissue is damaged. As used herein, stem cells can be embryonic stem (ES) cells or tissue stem cells (also referred to as tissue stem cells, tissue-specific stem cells or somatic stem cells), but are not limited thereto. In addition, as long as it has the above-mentioned ability, an artificially produced cell (for example, a fusion cell described herein, a reprogrammed cell, etc.) can also be a stem cell. Embryonic stem cells refer to pluripotent stem cells derived from early embryos. Embryonic stem cells were established for the first time in 1981 and have been applied since 1989 to the production of knockout mice. In 1998, human embryonic stem cells were established and are being used in regenerative medicine. Unlike embryonic stem cells, tissue stem cells are cells in which the direction of differentiation is limited, are present at specific positions in the tissue, and have an undifferentiated intracellular structure. Therefore, tissue stem cells have a low level of pluripotency. Tissue stem cells have a high nucleus / cytoplasm ratio and poor intracellular organelles. Tissue stem cells generally have pluripotency, have a slow cell cycle, and maintain proliferative ability over the life of the individual. As used herein, stem cells can be tissue stem cells, preferably mesenchymal stem cells, although embryonic stem cells can also be used depending on the situation.

本明細書において幹細胞というときは、幹細胞を少なくとも一定量含む組織集合物をさすことが理解される。したがって、本明細書では、幹細胞は、例えば、コラゲナーゼ処理して脂肪細胞から採取した幹細胞(実施例において使用される幹細胞など)を用いることができるがそれらに限定されない。  In the present specification, the term “stem cell” refers to a tissue aggregate containing at least a certain amount of stem cells. Therefore, in this specification, for example, stem cells collected from adipocytes after collagenase treatment (such as stem cells used in the Examples) can be used as stem cells, but not limited thereto.

由来する部位により分類すると、組織幹細胞は、例えば、皮膚系、消化器系、骨髄系、神経系などに分けられる。皮膚系の組織幹細胞としては、表皮幹細胞、毛嚢幹細胞などが挙げられる。消化器系の組織幹細胞としては、膵(共通)幹細胞、肝幹細胞などが挙げられる。骨髄系の組織幹細胞としては、造血幹細胞、間葉系幹細胞などが挙げられる。神経系の組織幹細胞としては、神経幹細胞、網膜幹細胞などが挙げられる。  When classified by the site of origin, tissue stem cells are classified into, for example, the skin system, digestive system, myeloid system, nervous system, and the like. Examples of skin tissue stem cells include epidermal stem cells and hair follicle stem cells. Examples of digestive tissue stem cells include pancreatic (common) stem cells and hepatic stem cells. Examples of myeloid tissue stem cells include hematopoietic stem cells and mesenchymal stem cells. Examples of nervous system tissue stem cells include neural stem cells and retinal stem cells.

本明細書において「脂肪幹細胞」とは、脂肪組織に由来する幹細胞をいう。このような幹細胞の分離方法の一部は公知であり、例えば、脂肪幹細胞は、WO00/53795;WO03/022988;WO01/62901;Zuk,P.A.,et al.、Tissue Engineering,Vol.7,211−228、2001;Zuk,P.A.,et al.、Molecular Biologyof the Cell Vol.,13,4279−4295、2002などに記載される方法またはその改変を利用して調整することができる。具体的には例えば、(1)脂肪吸引物を分液漏斗を用いて生理食塩水で十分に洗浄し;(2)上層に脂肪吸引物、下層に生理食塩水が十分に分離したのを確認し、下層を捨てる。肉眼で見て生理食塩水がほぼ透明になるまでこれを繰り返し;(3)脂肪吸引物と同量の0.075%コラゲナーゼ/PBSを加え、37℃でよく攪拌しながら30分間インキュベートし;(4)上記の試料に等量の10%血清加DMEMを加え;(5)上記の試料を1200gで10分間遠心分離し;(6)ペレットにPBSを加えて懸濁し、室温で適宜(例えば、10〜l5分間)インキュベートし;(7)上記の試料を口径100μmのメッシュを用いて吸引ろ過し;および(8)ろ過物を1200gで5分間遠心分離することによって調整することができる。ここで、調整量に応じて、上記プロトコールをスケールアップまたはスケールダウンすることは、当業者の技術範囲内である  As used herein, “adipose stem cell” refers to a stem cell derived from an adipose tissue. Some of the methods for isolating such stem cells are known. For example, adipose stem cells can be obtained from WO00 / 53795; WO03 / 022988; WO01 / 62901; Zuk, P. et al. A. , Et al. Tissue Engineering, Vol. 7, 211-228, 2001; Zuk, P .; A. , Et al. , Molecular Biology of the Cell Vol. , 13, 4279-4295, 2002, or the like, or modifications thereof. Specifically, for example, (1) The lipoaspirate is sufficiently washed with physiological saline using a separatory funnel; (2) It is confirmed that the lipoaspirate is sufficiently separated in the upper layer and the physiological saline is sufficiently separated in the lower layer. And discard the lower layer. Repeat this until the saline is almost clear with the naked eye; (3) Add the same amount of 0.075% collagenase / PBS as the lipoaspirate and incubate for 30 minutes at 37 ° C. with good agitation; 4) Add an equal volume of 10% serum-added DMEM to the above sample; (5) Centrifuge the above sample at 1200 g for 10 minutes; (6) Add the PBS to the pellet and suspend it at room temperature as appropriate (eg, (7) The sample can be prepared by suction filtration using a 100 μm caliber mesh; and (8) Centrifugation of the filtrate at 1200 g for 5 minutes. Here, it is within the technical scope of those skilled in the art to scale up or down the protocol according to the adjustment amount.

その細胞マーカーとしては、例えば、CD4、CD13、CD34、CD36、CD49d、CD71、CD90、CD105、CD117、CD151;あるいは、CD105、CD73、CD29、CD44およびSca−1からなる群より選択される細胞表面マーカーが挙げられるがそれらに限定されない。あるいは、間葉系幹細胞の表面抗原は、CD105(+)、CD73(+)、CD29(+)、CD44(+)、CD14(−)、CD34(−)、CD45(−)であるとされており、少なくともこのいずれか一つ、好ましくはその2以上、より好ましくはそのすべての性質を示す細胞が本発明において使用される細胞として好ましいことが理解される。  Examples of the cell marker include CD4, CD13, CD34, CD36, CD49d, CD71, CD90, CD105, CD117, CD151; or a cell surface selected from the group consisting of CD105, CD73, CD29, CD44 and Sca-1 Examples include, but are not limited to, markers. Alternatively, the surface antigens of mesenchymal stem cells are considered to be CD105 (+), CD73 (+), CD29 (+), CD44 (+), CD14 (−), CD34 (−), CD45 (−). It is understood that cells that exhibit at least any one of these, preferably two or more, more preferably all of these properties are preferred as the cells used in the present invention.

本システムにより分離された幹細胞は多系統の細胞に分化するのみならず、現在その臨床応用が検討されている角膜シート再生培養のフィーダー細胞への応用も期待されている。なぜなら従来なら角膜細胞のフィーダーにはマウスの線維芽細胞が用いられていたが、本システムが実用化されると、自己の脂肪組織から容易に幹細胞すなわち線維芽細胞が分離できるため、自己細胞移植としても極めてニーズが高いと考えられる。  Stem cells isolated by this system are not only differentiated into multi-lineage cells, but are also expected to be applied to feeder cells in corneal sheet regeneration culture, which is currently being studied for clinical application. This is because mouse fibroblasts were conventionally used as a feeder for corneal cells, but when this system is put to practical use, stem cells or fibroblasts can be easily separated from their own adipose tissue. However, the needs are considered to be extremely high.

本明細書において「線維芽細胞」とは、支持組織の繊維成分を供給し、繊維性結合組織の重要な成分をなす細胞をいう。組織切片図では、扁平で長目の外形をもち、不規則な突起を示すことが多い。細胞質は、ミトコンドリア、ゴルジ体、中心体、小脂肪球などを含むが、そのほかに特殊な分化は示さない。核は楕円形をしており、しばしば膠原繊維に密接して存在する。脂肪組織から分離された線維芽細胞は、幹細胞をよく含むといわれている。  As used herein, “fibroblast” refers to a cell that supplies the fiber component of the supporting tissue and forms an important component of the fibrous connective tissue. Tissue sections have a flat, long outline and often show irregular protrusions. The cytoplasm includes mitochondria, Golgi apparatus, centrosome, small fat globules, etc., but does not show special differentiation. The nucleus is elliptical and often exists in close proximity to the collagen fibers. It is said that fibroblasts isolated from adipose tissue often contain stem cells.

本明細書において「分化(した)細胞」とは、機能および形態が特殊化した細胞(例えば、筋細胞、神経細胞など)をいい、幹細胞とは異なり、多能性はないか、またはほとんどない。分化した細胞としては、例えば、表皮細胞、膵実質細胞、膵管細胞、肝細胞、血液細胞、心筋細胞、骨格筋細胞、骨芽細胞、骨格筋芽細胞、神経細胞、血管内皮細胞、色素細胞、平滑筋細胞、脂肪細胞、骨細胞、軟骨細胞などが挙げられる。本発明において用いられる場合、分化細胞は、集団または組織の形態であってもよい。  As used herein, “differentiated cells” refers to cells with specialized functions and morphology (eg, muscle cells, nerve cells, etc.), and unlike stem cells, there is no or almost no pluripotency. . Examples of differentiated cells include epidermal cells, pancreatic parenchymal cells, pancreatic duct cells, hepatocytes, blood cells, cardiomyocytes, skeletal muscle cells, osteoblasts, skeletal myoblasts, neurons, vascular endothelial cells, pigment cells, Examples include smooth muscle cells, fat cells, bone cells, chondrocytes. As used in the present invention, the differentiated cells may be in the form of a population or tissue.

本発明の細胞は、細胞の維持または所望の分化細胞へ分化する限り、任意の培養液を用いることができる。そのような培養液としては、例えば、DMEM、P199、MEM、HBSS、Ham‘s F12、BME、RPMI1640、MCDB104、MCDB153(KGM)およびそれらの混合物などが挙げられるがそれらに限定されない。このような培養液には、デキサメタゾンなどの副腎皮質ステロイド、インスリン、グルコース、インドメタシン、イソブチル−メチルキサンチン(IBMX)、アスコルベート−2−ホスフェート、アスコルビン酸およびその誘導体、グリセロホスフェート、エストロゲンおよびその誘導体、プロゲステロンおよびその誘導体、アンドロゲンおよびその誘導体、aFGF、bFGF、EGF、IGF、TGFβ、ECGF、BMP、PDGFなどの増殖因子、下垂体エキス、松果体エキス、レチノイン酸、ビタミンD、甲状腺ホルモン、ウシ胎仔血清、ウマ血清、ヒト血清、ヘパリン、炭酸水素ナトリウム、HEPES、アルブミン、トランスフェリン、セレン酸(亜セレン酸ナトリウムなど)、リノレン酸、3−イソブチル−1−メチルキサンチン、5−アザンシチジンなどの脱メチル化剤、トリコスタチンなどのヒストン脱アセチル化剤、アクチビン、LIF、IL−2・IL−6などのサイトカイン、ヘキサメチレンビスアセトアミド(HMBA)、ジメチルアセトアミド(DMA)、ジブチルcAMP(dbcAMP)、ジメチルスルホキシド(DMSO)、ヨードデオキシウリジン(IdU)、ヒドロキシウレア(HU)、シトシンアラビノシド(AraC)、マイトマイシンC(MMC)、酪酸ナトリウム(NaBu)、ポリブレン、セレニウム、コレラトキシンなどを1つまたはその組み合わせとして含ませておいてもよい。  Any culture solution can be used for the cells of the present invention as long as the cells are maintained or differentiated into desired differentiated cells. Examples of such a culture solution include, but are not limited to, DMEM, P199, MEM, HBSS, Ham's F12, BME, RPMI 1640, MCDB104, MCDB153 (KGM), and mixtures thereof. Such cultures include corticosteroids such as dexamethasone, insulin, glucose, indomethacin, isobutyl-methylxanthine (IBMX), ascorbate-2-phosphate, ascorbic acid and its derivatives, glycerophosphate, estrogen and its derivatives, Progesterone and its derivatives, Androgen and its derivatives, aFGF, bFGF, EGF, IGF, TGFβ, ECGF, BMP, PDGF and other growth factors, pituitary extract, pineal extract, retinoic acid, vitamin D, thyroid hormone, fetal bovine Serum, horse serum, human serum, heparin, sodium bicarbonate, HEPES, albumin, transferrin, selenate (such as sodium selenite), linolenic acid, 3-isobutyl-1-methyl chloride Demethylating agents such as Nthin and 5-Azancytidine, histone deacetylating agents such as trichostatin, cytokines such as activin, LIF and IL-2 / IL-6, hexamethylenebisacetamide (HMBA), dimethylacetamide (DMA) , Dibutyl cAMP (dbcAMP), dimethyl sulfoxide (DMSO), iododeoxyuridine (IdU), hydroxyurea (HU), cytosine arabinoside (AraC), mitomycin C (MMC), sodium butyrate (NaBu), polybrene, selenium, Cholera toxin and the like may be included as one or a combination thereof.

本明細書において「生体内」または「インビボ」(in vivo)とは、生態の内部をいう。特定の文脈において、「生体内」は、目的とする組織または器官が配置されるべき位置をいう。  As used herein, “in vivo” or “in vivo” refers to the interior of an organism. In a particular context, “in vivo” refers to the location where the target tissue or organ is to be placed.

本明細書において「インビトロ」(in vitro)とは、種々の研究目的のために生体の一部分が「生体外に」(例えば、試験管内に)摘出または遊離されている状態をいう。インビボと対照をなす用語である。  As used herein, “in vitro” refers to a state in which a part of a living body is removed or released “in vitro” (eg, in a test tube) for various research purposes. A term that contrasts with in vivo.

本明細書において「エキソビボ」とは、遺伝子導入を行うための標的細胞を被験体より抽出し、インビトロで治療遺伝子を導入した後に、再び同一被験体に戻す場合、一連の動作をエキソビボという。  In the present specification, “ex vivo” refers to a series of operations ex vivo when a target cell for gene transfer is extracted from a subject, a therapeutic gene is introduced in vitro, and then returned to the same subject again.

1つの実施形態において、本発明の再生治療法における培養の条件、および本発明において使用される所望の臓器、組織または細胞の一部またはそれに分化し得る幹細胞の培養の提供の条件は、その細胞、組織または臓器を培養するために通常用いられるものであれば、用いることができる。そのような培養条件の例としては、例えば、培養条件は通常、37℃、5%COを利用することができる。使用する培地もまた、任意のものを利用することができ、例えば、DMEM/Ham12(1:1)、10%FCS、インスリン・コレトキシンなどを含む培地を利用することができる。また、必要に応じて、分化因子(例えば、EGF(10ng/ml)を予め含めた培養液を使用してもよいがそれらに限定されない。In one embodiment, the conditions for culturing in the regenerative treatment method of the present invention, and the conditions for providing a culture of a desired organ, tissue or cell part used in the present invention or a stem cell capable of differentiating into the cells are the cells. Any of those usually used for culturing tissues or organs can be used. As an example of such culture conditions, for example, the culture conditions can usually use 37 ° C. and 5% CO 2 . Any medium can be used as the medium to be used. For example, a medium containing DMEM / Ham12 (1: 1), 10% FCS, insulin / colotoxin and the like can be used. Further, if necessary, a culture solution containing differentiation factors (for example, EGF (10 ng / ml) in advance) may be used, but is not limited thereto.

1つの好ましい実施形態において、本発明の方法における培養のために、分化因子を加えることができる。そのような分化因子としては、例えば、DNA脱メチル化剤(5−アザシチジンなど)、ヒストン脱アセチル化剤(トリコスタチンなど)、核内レセプターリガンド(例えば、レチノイン酸(ATRA),ビタミンD、T3など)、細胞増殖因子(アクチビン、IGF−1、FGF、PDGF、TGF−β、BMP2/4など)、サイトカイン(LIF、IL−2、IL−6など)ヘキサメチレンビスアセトアミド、ジメチルアセトアミド、ジブチルcAMP、ジメチオルスルホキシド、ヨードデオキシウリジン、ヒドロキシル尿素、シトシンアラボノシド、マイトマイシンC、酪酸ナトリウム、アフィディコリン、フルオロデオキシウリジン、ポリブレン、セシンなどが挙げられるが、それらに限定されない。角膜への分化には、EGFという分化因子を加えることができる。他の分化細胞についてもまた、本明細書において記載される任意の分化因子を使用することができる。In one preferred embodiment, differentiation factors can be added for culturing in the methods of the invention. Examples of such differentiation factors include DNA demethylating agents (such as 5-azacytidine), histone deacetylating agents (such as trichostatin), nuclear receptor ligands (such as retinoic acid (ATRA), vitamin D 3 , T3 etc.), cell growth factor (activin, IGF-1, FGF, PDGF, TGF-β, BMP2 / 4 etc.), cytokine (LIF, IL-2, IL-6 etc.) hexamethylenebisacetamide, dimethylacetamide, dibutyl Examples include, but are not limited to, cAMP, dimethylthiol sulfoxide, iododeoxyuridine, hydroxylurea, cytosine arabonoside, mitomycin C, sodium butyrate, aphidicolin, fluorodeoxyuridine, polybrene, sesin and the like. For differentiation into the cornea, a differentiation factor called EGF can be added. Any other differentiation factor described herein can also be used for other differentiated cells.

再生医療分野は数年後に数十兆円の規模になるといわれている。現在、自己細胞治療ソースとして、骨髄が最も頻繁に使われているが、他にも多くのヒト組織がこれに代替しうるソースとして名乗りを上げている。しかし、残念ながらこれら幹細胞ソースの多くは1)限られた体積しか有さない、2)何らかの痛みを伴う処置が必要、3)さらにこれらのソースから得られる幹細胞の産生量自体に限界がある。したがって理想的な幹細胞のソースとして求められるのは1)簡単に培養できるもの、2)豊富であるも、3)苦痛なく採取できることなどがあげられる。脂肪組織はこの条件を満たす最有力な組織と考えられる。  The regenerative medicine field is said to reach a scale of several tens of trillions in a few years. Currently, bone marrow is most frequently used as an autologous cell therapy source, but many other human tissues have been named as alternative sources. Unfortunately, however, many of these stem cell sources have 1) limited volume, 2) some painful treatment is required, and 3) the amount of stem cells produced from these sources is itself limited. Therefore, what is required as an ideal source of stem cells is 1) easy culturing, 2) abundant 3) collection without pain, etc. Adipose tissue is considered to be the most powerful tissue that satisfies this condition.

欧米においては美容整形外科の普及により多くの脂肪吸引術が行われており、通常、最低でも数リットル、多いときで数十リットルのヒト由来間葉系細胞を含んだ脂肪組織が取り除かれ、現在全世界において最も頻繁に行われる手術のひとつである。もちろん、この術式自体は人体から望まれない不要な脂肪組織を取り除くために行われたものであるが、実は細胞ベースのティッシューエンジニアリングには自己再生組織を培養する理想的な方法なのである。本法により分離された脂肪由来幹細胞は1)骨髄由来の間葉系細胞と違い成長に特別の血清等を必要としない。2)数回の継代後も安定した増殖能を有する。3)簡単に得られる。局所麻酔と最低限の処置で、数リットルから数ミリリットルまで簡単に手に入れることができる。4)250から500ミリリットルのLPAで100万個以上の細胞が通常得ることができる。5)さらに、遺伝子導入後も安定した多分化能を有している。  In Europe and the United States, many liposuctions have been performed due to the spread of cosmetic surgery. Usually, at least a few liters and a few tens of liters of adipose tissue containing human-derived mesenchymal cells are removed. It is one of the most frequent surgeries in the world. Of course, this procedure itself was performed to remove unwanted fat tissue from the human body, but it is actually an ideal method for culturing self-regenerating tissue for cell-based tissue engineering. The adipose-derived stem cells isolated by this method do not require special serum or the like for growth, unlike 1) bone marrow-derived mesenchymal cells. 2) Stable proliferation ability after several passages. 3) Easy to obtain. With local anesthesia and minimal treatment, it can be easily obtained from several liters to several milliliters. 4) Over 1 million cells can usually be obtained with 250 to 500 milliliters of LPA. 5) Furthermore, it has stable multipotency even after gene introduction.

脂肪組織よりの再生医療ソースが確立した暁には、その簡便性から本システムの市場性は計り知れない。また骨髄バンクならぬ脂肪バンクが誕生し、例えば幼少年期に腹部より脂肪組織由来幹細胞を採取して壮年老年期の組織修復に備えるために蓄えておくことなどが簡単に行えるようになるかもしれない。  The marketability of this system is immeasurable due to its simplicity in the rehabilitation medical source established from adipose tissue. In addition, a fat bank that is not a bone marrow bank is born, and it may be possible to easily collect adipose tissue-derived stem cells from the abdomen during childhood and store them in preparation for tissue repair in the middle age. Absent.

尚、本システムは研究段階から脂肪組織のみに用いてきたが、他の組織より幹細胞を分離することも可能である。加えて、幹細胞を必ずしもすぐに培養する必要がない場合は、そのまま保存することも可能である。逆に美容外科領域では、とりだした幹細胞のみを除去した脂肪部分に再注入することにより、健康的な脂肪吸引術(幹細胞を取らずに、脂肪のみが取り除くことができると言う意味で)を行うことも可能となる。  Although this system has been used only for adipose tissue from the research stage, it is also possible to isolate stem cells from other tissues. In addition, if the stem cells do not necessarily have to be cultured immediately, they can be stored as they are. Conversely, in the cosmetic surgery field, a healthy liposuction (in the sense that only fat can be removed without removing stem cells) is performed by reinjecting the extracted fat cells into the fat portion. It is also possible.

本発明は、生体組織から採取した組織片をまず、細孔径200〜300μmフィルターに通過させることで組織片から血液成分、及びその他の細胞、物質を除去するために実施する。その際、細孔径は200〜300μmが良く、好ましくは200〜280μm、さらに好ましくは250〜270μmが良い。200μm以下であると除去したいものを十分分けられず、逆に300μm以上であると目的とする細胞が通過してしまい効率良くなく好ましくない。フィルターの材質は特に制約されるものではないが、例えば通常使われるセルロース、テフロン、親水性テフロン、ポリエチレンテレフタレート、ポリカーボネート等が挙げられる。  In the present invention, a tissue piece collected from a living tissue is first passed through a filter having a pore size of 200 to 300 μm to remove blood components, other cells, and substances from the tissue piece. At that time, the pore diameter is preferably 200 to 300 μm, preferably 200 to 280 μm, more preferably 250 to 270 μm. If it is 200 μm or less, it is not possible to sufficiently divide what is to be removed, and conversely if it is 300 μm or more, the target cell passes and is not efficient and not preferable. The material of the filter is not particularly limited, and examples thereof include usually used cellulose, Teflon, hydrophilic Teflon, polyethylene terephthalate, and polycarbonate.

本発明では、その後、得られた組織片に酵素処理を施し細胞懸濁液とする。その酵素とは特に限定されるものではないが、例えば通常使われるトリプシン、ディスパーゼ、コラゲナーゼ、ペプシン等の蛋白質分解酵素が挙げられる。懸濁する方法も特に限定されるものでなく、常法に従えば良い。  In the present invention, thereafter, the obtained tissue piece is subjected to an enzyme treatment to obtain a cell suspension. The enzyme is not particularly limited, and examples thereof include commonly used proteolytic enzymes such as trypsin, dispase, collagenase, and pepsin. The method for suspending is not particularly limited, and may be followed by a conventional method.

本発明では、こうして得られた細胞懸濁液を再び、細孔径200〜300μmフィルターを通過させ目的外の細胞をろ別する。その際のフィルターは上述したものと同一のもので良い。  In the present invention, the cell suspension thus obtained is again passed through a filter having a pore size of 200 to 300 μm to filter out undesired cells. The filter at that time may be the same as described above.

本発明では、さらに細孔径20〜40μmフィルターに通過させ、目的外の細胞をろ別する。その際、細孔径は20〜40μmが良く、好ましくは25〜35μm、さらに好ましくは25〜30μmが良い。20μm以下であると目的とする細胞を通過させられず、逆に40μm以上であると目的外の細胞が通過してしまい効率良くなく好ましくない。フィルターの材質は特に制約されるものではないが、例えば通常使われるセルロース、テフロン、親水性テフロン、ポリエチレンテレフタレート、ポリカーボネート等が挙げられる。  In the present invention, the cells are further passed through a filter having a pore size of 20 to 40 μm, and undesired cells are filtered out. At that time, the pore diameter is preferably 20 to 40 μm, preferably 25 to 35 μm, more preferably 25 to 30 μm. If it is 20 μm or less, the target cell cannot be passed, and if it is 40 μm or more, the non-target cell passes and is not preferable because it is not efficient. The material of the filter is not particularly limited, and examples thereof include usually used cellulose, Teflon, hydrophilic Teflon, polyethylene terephthalate, and polycarbonate.

本発明では、こうして得られた細胞懸濁液から目的の細胞を得るものである。その際、細胞を濃縮する方法は特に限定されるものでなく、例えば遠心分離する方法、或いは400〜500nmフィルターを通過させる方法等が挙げられる。  In the present invention, target cells are obtained from the cell suspension thus obtained. At that time, the method for concentrating the cells is not particularly limited, and examples thereof include a method of centrifuging, a method of passing through a 400 to 500 nm filter, and the like.

本発明は、また、上述した方法に従う組織幹細胞採取装置も示す。その装置とは採取装置と分離装置からなり、その際、装置は閉鎖系であることが望ましい。  The present invention also shows a tissue stem cell collection device according to the method described above. The device comprises a collection device and a separation device, wherein the device is preferably a closed system.

その採取装置とは、生体組織から組織を採取できるものなら、その形態、機構は特に制約されないが、例えば生体組織から組織片を採取する穿刺針と細孔径200〜300μmフィルターが装着された注射器様装置が簡便で持ち運びが容易であり好ましい。その際の装置の材質は特に限定されないが、通常利用されるポリエチレン、ポリプロピレン、ポリエチレンテレフタレート、ポリカーボネート等が挙げられる。  The collection device is not particularly limited in its form and mechanism as long as it can collect tissue from a biological tissue. For example, a syringe like a puncture needle for collecting a tissue piece from a biological tissue and a filter having a pore diameter of 200 to 300 μm is attached. The apparatus is preferable because it is simple and easy to carry. The material of the apparatus at that time is not particularly limited, and examples thereof include commonly used polyethylene, polypropylene, polyethylene terephthalate, and polycarbonate.

本発明の分離装置も目的とする細胞を回収させられるものであれば特に限定されないが、遠心分離菅様装置で開口側に細孔径200〜300μmフィルターが装着され、その下部に細孔径20〜40μmフィルターが装着されたものが簡便で持ち運びが容易であり好ましい。その際の装置の材質は特に限定されないが、通常利用されるポリエチレン、ポリプロピレン、ポリエチレンテレフタレート、ポリカーボネート等が挙げられる。  The separation device of the present invention is not particularly limited as long as the target cells can be recovered, but a centrifuge-like device is equipped with a pore diameter 200-300 μm filter on the opening side, and a pore diameter 20-40 μm below it. A filter-mounted one is preferable because it is simple and easy to carry. The material of the apparatus at that time is not particularly limited, and examples thereof include commonly used polyethylene, polypropylene, polyethylene terephthalate, and polycarbonate.

本発明の分離装置には、目的の細胞を回収するために上述した細孔径20〜40μmフィルターの下部にさらに細孔径400〜500nmフィルターを装着させても良い。その際、細孔径は400〜500μmが良く、好ましくは420〜480nm、さらに好ましくは450〜470nmが良い。400nm以下であると除去したいものを十分分けられず、逆に500nm以上であると目的とする細胞が通過してしまい効率良くなく好ましくない。フィルターの材質は特に制約されるものではないが、例えば通常使われるセルロース、テフロン、親水性テフロン、ポリエチレンテレフタレート、ポリカーボネート等が挙げられる。  In the separation apparatus of the present invention, a filter having a pore diameter of 400 to 500 nm may be further attached to the lower part of the above-mentioned pore diameter 20 to 40 μm filter in order to collect target cells. At that time, the pore diameter is preferably 400 to 500 μm, preferably 420 to 480 nm, and more preferably 450 to 470 nm. If the thickness is 400 nm or less, it is not possible to sufficiently separate what is desired to be removed. Conversely, if the thickness is 500 nm or more, the target cell passes and is not efficient and is not preferable. The material of the filter is not particularly limited, and examples thereof include usually used cellulose, Teflon, hydrophilic Teflon, polyethylene terephthalate, and polycarbonate.

本発明で示す技術を用いることで、ヒトの生体組織から組織幹細胞を簡便に得られるようになる。例えば、ヒト脂肪組織を対象とすれば種々の細胞へ分化できる脂肪組織幹細胞を得ることができる。こうして得られた幹細胞は遺伝子導入して再び体に戻すといった細胞遺伝子治療用細胞としても極めて有用なものである。  By using the technique shown in the present invention, tissue stem cells can be easily obtained from human biological tissue. For example, if human adipose tissue is targeted, adipose tissue stem cells that can differentiate into various cells can be obtained. The stem cells thus obtained are extremely useful as cells for cell gene therapy in which genes are introduced and returned to the body.

以下に、本発明を実施例に基づいて更に詳しく説明するが、これらは本発明を何ら限定するものではない。  Hereinafter, the present invention will be described in more detail based on examples, but these do not limit the present invention in any way.

以下に示した実施例において使用した試薬は、特に言及しない限り和光純薬、Sigmaから得た。ヒトを対象とする場合は、厚生労働省の基準に従い、事前に同意を得た上で実験を行った。  The reagents used in the following examples were obtained from Wako Pure Chemicals and Sigma unless otherwise specified. When human subjects were used, experiments were conducted after obtaining prior consent in accordance with the standards of the Ministry of Health, Labor and Welfare.

(組織幹細胞を含む細胞の調整)
本実施例では、まず、本実験に対して同意を示したヒトから細胞を脂肪組織から調整した。局所麻酔(1%Eキシロカインを生食で4倍に希釈した液を使用)後、14G針を装着したテルモ社製50ccシリンジに約20ccの生理食塩水を装てんし、約20ccの脂肪吸引を行った。
(Adjustment of cells including tissue stem cells)
In this example, cells were first prepared from adipose tissue from humans who gave consent to this experiment. After local anesthesia (using a solution obtained by diluting 1% E xylocaine 4 times with saline), approximately 20 cc of physiological saline was placed in a Terumo 50 cc syringe equipped with a 14G needle, and approximately 20 cc of liposuction was performed. .

採取した組織片を、図1に示すように、開放系バイオハザードキャビネット内にてクリーン度を保ちつつ、250μmフィルターに通過させることで組織片から液性成分を除去した。得られた物を生理食塩水で十分に洗浄した。肉眼で見て生理食塩水がほぼ透明になるまでこれを繰り返した。この実験例では、7回行った。  As shown in FIG. 1, the collected tissue piece was passed through a 250 μm filter while maintaining the cleanness in an open biohazard cabinet, thereby removing the liquid component from the tissue piece. The obtained product was thoroughly washed with physiological saline. This was repeated until the physiological saline was almost transparent with the naked eye. In this experimental example, the test was performed seven times.

その後、得られた組織片に同量の0.075%コラゲナーゼ/PBS(Gibco)を加え、37℃でよく攪拌しながら1時間インキュベートし、その懸濁液を再び、細孔径250μmフィルターを通過させた。  Thereafter, the same amount of 0.075% collagenase / PBS (Gibco) was added to the obtained tissue piece, and the mixture was incubated at 37 ° C. with good agitation for 1 hour. The suspension was again passed through a filter having a pore size of 250 μm. It was.

ろ過液を室温で遠心分離し、上清を廃棄した。さらに沈査にDMEMを加えてピペットで懸濁して、さらに細孔径25μmフィルターに通過させ、遠心分離することで細胞懸濁液より目的とする組織幹細胞を採取した。  The filtrate was centrifuged at room temperature and the supernatant was discarded. Further, DMEM was added to the precipitate, suspended with a pipette, passed through a filter with a pore size of 25 μm, and centrifuged to obtain a target tissue stem cell from the cell suspension.

(組織幹細胞を含む細胞の分化)
次に、実施例1において調整した細胞中の細胞を初代培養し、継代培養した後に成熟脂肪細胞へと分化させた。具体的にはコンフルエントまで増殖させた組織幹細胞を含む細胞を脂肪細胞分化用培地で2日おきに処理した。分化開始日と2日目には、0.5mM IBMX、1μMデキサメタゾン、1μMトリグリタゾン、5μg/mlインスリンを含んだ 10% CCS−DMEM培地で処理した。4日目には、トリグリタゾンとインスリンを含んだ 10% CCS−DMEM培地で、6日目以降は、500ng/mlインスリンを含んだ 10% CCS−DMEM培地で処理した。得られた結果を図2を示す。
(Differentiation of cells including tissue stem cells)
Next, the cells in the cells prepared in Example 1 were first cultured, subcultured, and then differentiated into mature adipocytes. Specifically, cells containing tissue stem cells grown to confluence were treated with an adipocyte differentiation medium every two days. On the first day of differentiation and on the second day, the cells were treated with 10% CCS-DMEM medium containing 0.5 mM IBMX, 1 μM dexamethasone, 1 μM triglitazone, 5 μg / ml insulin. On the 4th day, the cells were treated with 10% CCS-DMEM medium containing triglitazone and insulin, and after the 6th day, they were treated with 10% CCS-DMEM medium containing 500 ng / ml insulin. The obtained results are shown in FIG.

(組織幹細胞を含む細胞の脂肪以外の細胞への分化)
実施例1で用いた細胞群に対して、脂肪細胞以外の細胞に分化することを確かめた。神経細胞への分化は20%血清添加したDMEM培地に1mMのベータ・メルカプトエタノールを加えて24時間培養して、翌日、PBSで二回洗浄した後に血清無添加DMEM培地に5mMのベータ・メルカプトエタノールで培養した(Woodbury et al.,J Neurosci Res 61;364−370,2000)。
血管内皮への分化は実施例1で得られた細胞を抗PECAM−1抗体にて選択し、VEGFを含んだ培地で培養した。脂肪組織から得られた幹細胞をコラーゲンコートした培養皿の上でVEGF,FGF2,EGFを添加した培地で培養するとこの細胞群の一部が内皮細胞に分化した。別の報告では、この細胞群の3割がCD34陽性細胞、すなわち造血幹細胞(Hematopoietic Stem Cell)の特徴を持つこと、また平滑筋細胞のマーカーであるα−smooth muscle actine陽性細胞にも分化しうることが示されており血管再生に動員されうる細胞群と考えられる。またこの細胞群から血管内皮細胞増殖因子(VEGF)および肝細胞増殖因子(HGF)の分泌量は血管内皮および平滑筋細胞と比較しても極めて高い、血管内皮細胞との共培養系で、内皮細胞の増殖、遊走が有意に促進されることも明らかとなった。近年の骨髄細胞を用いた血管新生の機序として、間葉系幹細胞からの内皮増殖因子の分泌の寄与が重要であるという認識もなされており、いわゆる支持細胞としてもこの細胞群が機能しうることを示唆している。得られた結果を図2を示す。
(Differentiation of cells including tissue stem cells into cells other than fat)
The cell group used in Example 1 was confirmed to differentiate into cells other than fat cells. For differentiation into neurons, 1 mM beta-mercaptoethanol was added to DMEM medium supplemented with 20% serum and cultured for 24 hours. The next day, after washing twice with PBS, 5 mM beta-mercaptoethanol was added to serum-free DMEM medium. (Woodbury et al., J Neurosci Res 61; 364-370, 2000).
For differentiation into vascular endothelium, the cells obtained in Example 1 were selected with an anti-PECAM-1 antibody and cultured in a medium containing VEGF. When stem cells obtained from adipose tissue were cultured on a collagen-coated culture dish in a medium supplemented with VEGF, FGF2 and EGF, a part of this cell group differentiated into endothelial cells. According to another report, 30% of this cell group has the characteristics of CD34 positive cells, that is, hematopoietic stem cells, and can differentiate into α-smooth muscle actin positive cells, which are markers of smooth muscle cells. This is considered to be a group of cells that can be mobilized for revascularization. In addition, the secretion amount of vascular endothelial growth factor (VEGF) and hepatocyte growth factor (HGF) from this cell group is extremely high as compared with vascular endothelium and smooth muscle cells. It was also revealed that cell proliferation and migration were significantly promoted. It has been recognized that the contribution of endothelial growth factor secretion from mesenchymal stem cells is important as a mechanism of angiogenesis using bone marrow cells in recent years, and this cell group can also function as so-called support cells. Suggests that. The obtained results are shown in FIG.

(組織幹細胞を含む細胞への遺伝子導入)
さらに実施例1の細胞に対して非ウイルスベクターのHVJ−E(センダイウイルス・エンヴェロープベクター、Mol Ther.2001)を用いての遺伝子導入に成功した。今回の発明であるシリンジを用いた採取単離装置では、最終段階の回収システムでHVJ−E(石原産業製GENOME−ONEなど)を用いて遺伝子導入キットを行うことも可能である。
(Gene transfer into cells including tissue stem cells)
In addition, the cells of Example 1 were successfully introduced using a non-viral vector HVJ-E (Sendai virus envelope vector, Mol Ther. 2001). In the collection and isolation device using the syringe according to the present invention, it is also possible to perform a gene introduction kit using HVJ-E (such as GENOME-ONE manufactured by Ishihara Sangyo Co., Ltd.) in the final collection system.

但し、HVJ−Eはヒトへの臨床応用を前提に開発されており、毒性が低い分、導入効率とくに生体内in vivoへの有効性の報告が皆無の状態であった。本発明は一旦、脂肪幹細胞にin vitroで遺伝子導入した後、生体内にずばり自己由来の免疫拒絶されない細胞を注入しうることを提案するものであり、HVJ−E自身の欠点を補うものとしても有効である。  However, HVJ-E has been developed on the premise of clinical application to humans, and because of its low toxicity, there has been no report of introduction efficiency, particularly in vivo efficacy. The present invention proposes that after in vitro gene introduction into adipose stem cells, it is possible to inject self-derived cells that are not immune-rejected in vivo, and to compensate for the drawbacks of HVJ-E itself. It is valid.

本発明に記載されている方法であれば、再生医療分野での組織よりの細胞抽出に本システムを用いれば、安全かつ清潔に組織幹細胞を抽出することが可能となる。さらに本システムを用いれば、移送手段や実験室での分離が容易となり、診療所レベルで細胞分離もできるようになる。従って本発明は医学、生物学等の分野におけるきわめて有用な発明である。  If the method described in the present invention is used to extract cells from tissues in the field of regenerative medicine, tissue stem cells can be extracted safely and cleanly. Furthermore, if this system is used, separation in a transfer means or a laboratory is facilitated, and cell separation can be performed at the clinic level. Therefore, the present invention is extremely useful in the fields of medicine, biology and the like.

実施例1に示す操作を模式的に示した図である。FIG. 6 is a diagram schematically showing the operation shown in the first embodiment. 実施例2、3に示す本発明に順ずる方法で単離された、脂肪組織幹細胞を含む細胞、及びそれらより分化誘導した、脂肪細胞、血管内皮細胞、神経細胞を示す図である。It is a figure which shows the fat cell, the vascular endothelial cell, and the nerve cell which were isolated by the method according to this invention shown in Example 2, 3, and contain the adipose tissue stem cell, and differentiation induction from them.

Claims (10)

生体組織から穿刺針を用いて採取した組織片から特定の組織幹細胞を得る際、閉鎖系で
(1)細孔径200〜300μmフィルターに通過させることで組織片から血球成分を除去する工程、
(2)抗生物質を含有したリン酸緩衝液で洗浄する工程、
(3)得られた組織片に酵素処理を施し細胞懸濁液とする工程、
(4)比重の軽い細胞を浮かせることで目的の細胞と分離させる工程、
(5)その目的の細胞の懸濁液を再び、細孔径250〜300μmフィルターを通過させる工程、
(6)さらに細孔径20〜40μmフィルターに通過させる工程、
(7)遠心分離、及びまたは400〜500nmフィルターを通過させることで細胞懸濁液より目的の細胞を得る工程、
を経ることを特徴とする組織幹細胞採取方法。
When obtaining specific tissue stem cells from a tissue piece collected from a living tissue using a puncture needle, (1) a step of removing blood cell components from the tissue piece by passing through a filter having a pore diameter of 200 to 300 μm in a closed system;
(2) a step of washing with a phosphate buffer containing an antibiotic,
(3) A step of subjecting the obtained tissue piece to enzyme treatment to obtain a cell suspension,
(4) a process of separating cells of low specific gravity from the target cells by floating;
(5) a step of passing the target cell suspension again through a filter having a pore size of 250 to 300 μm;
(6) a step of passing through a filter having a pore size of 20 to 40 μm,
(7) Step of obtaining the target cells from the cell suspension by centrifugation and / or passing through a 400-500 nm filter,
A tissue stem cell collection method characterized by passing through.
生体組織が脂肪組織、肝臓、筋肉である、請求項1記載の組織幹細胞採取方法。The tissue stem cell collection method according to claim 1, wherein the living tissue is adipose tissue, liver, or muscle. 特定の組織幹細胞が脂肪組織幹細胞である、請求項1、2いずれか1項記載の組織幹細胞採取方法。The method for collecting tissue stem cells according to any one of claims 1 and 2, wherein the specific tissue stem cells are adipose tissue stem cells. 細胞がヒトのものである、請求項1〜3いずれか1項記載の組織幹細胞採取方法。The method for collecting tissue stem cells according to any one of claims 1 to 3, wherein the cells are human. 請求項1〜4の組織幹細胞採取方法に従う、組織幹細胞採取装置。A tissue stem cell collection device according to the tissue stem cell collection method of claim 1. 装置が採取装置と分離装置からなる請求項5記載の組織幹細胞採取装置。The tissue stem cell collection device according to claim 5, wherein the device comprises a collection device and a separation device. 採取装置が生体組織から組織片を採取する穿刺針と細細孔径200〜300μmフィルターが装着された注射器様装置である、請求項6記載の組織幹細胞採取装置。The tissue stem cell collection device according to claim 6, wherein the collection device is a syringe-like device equipped with a puncture needle for collecting a tissue piece from a living tissue and a fine pore diameter 200-300 µm filter. 分離装置が遠心分離菅の開口側に細孔径200〜300μmフィルターが装着され、その下部に細孔径20〜40μmフィルターが装着され、さらにその下部に細孔径400〜500nmフィルターが装着されたものである請求項6記載の組織幹細胞採取装置。The separation device is a filter having a pore diameter of 200 to 300 μm attached to the opening side of the centrifugal separator, a pore diameter of 20 to 40 μm attached to the lower part thereof, and a pore diameter of 400 to 500 nm filter attached to the lower part thereof. The tissue stem cell collection device according to claim 6. 生体組織の脂肪細胞から脂肪組織幹細胞を採取することを目的とした請求項5〜8いずれか1項記載の組織幹細胞採取装置。The tissue stem cell collection device according to any one of claims 5 to 8, which is intended to collect adipose tissue stem cells from adipose cells of a living tissue. 細胞がヒトのものである、請求項5〜9いずれか1項記載の組織幹細胞採取装置。The tissue stem cell collection device according to any one of claims 5 to 9, wherein the cells are human.
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