KR100871984B1 - Multipotent Stem Cell Derived from Placenta Tissue and Cellular Therapeutic Agents Comprising the Same - Google Patents

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Abstract

본 발명은 태반 조직 유래 다능성 줄기세포 및 이를 함유하는 세포치료제에 관한 것으로, 보다 구체적으로는, 세절한 양막, 장막, 기저탈락막 또는 태반 조직을 bFGF 함유 배지에서 배양한 다음 회수하는 것을 특징으로 하는, (a) CD29, CD44, CD73, CD90 및 CD105에 대하여 모두 양성의 면역학적 특성을 나타내고, CD31, CD34, CD45 및 HLA-DR에 대하여 모두 음성의 면역학적 특성을 나타냄; (b) Oct4 및 SSEA4에 대하여 양성의 면역학적 특성을 나타냄; (c) 플라스틱에 부착되어 성장하며, 둥근형태(round-shape) 또는 선형태(spindle-shape)의 형태학적 특성을 나타내고, SFM 배지(sphere-forming medium)에서 스피어(sphere)를 형성하여 미분화 상태로 장기간 유지가 가능함; 및 (d) 중배엽, 내배엽 및 외배엽 유래 세포로 분화하는 능력을 가지는 태반 줄기세포의 제조 방법 및 수득된 태반 줄기세포에 관한 것이다. 본 발명에 따른 다능성 줄기세포는 근세포, 혈관내피세포, 골형성 세포, 신경세포, 성상세포, 지방세포, 연골형성 세포, 골형성 세포, 또는 인슐린 분비 췌장 베타세포로 분화하는 능력을 가지고 있어, 근질환, 골다공증, 골관절염, 신경질환, 당뇨병 등의 치료에 효과적이고, 유방 조직 형성에 유용하다. The present invention relates to a placental tissue-derived pluripotent stem cell and a cell therapeutic agent containing the same, and more particularly, characterized in that the fine amnion, membrane, basal degeneration membrane or placental tissue is cultured in bFGF-containing medium and then recovered. (A) all showed positive immunological properties for CD29, CD44, CD73, CD90 and CD105, and all negative immunological properties for CD31, CD34, CD45 and HLA-DR; (b) exhibits positive immunological properties for Oct4 and SSEA4; (c) attached to plastic and grown, exhibits morphological characteristics of round- or spindle-shape, and forms a sphere in SFM medium (sphere-forming medium) to form micronized Long-term maintenance; And (d) a method for producing placental stem cells having the ability to differentiate into mesoderm, endoderm and ectoderm derived cells, and obtained placental stem cells. Pluripotent stem cells according to the present invention have the ability to differentiate into myocytes, vascular endothelial cells, osteoblasts, neurons, astrocytes, adipocytes, chondrocytes, osteoblasts, or insulin secreting pancreatic beta cells, It is effective in the treatment of muscle diseases, osteoporosis, osteoarthritis, neurological diseases, diabetes and the like, and useful for forming breast tissue.

태반 조직, 태반 줄기세포, 분화, 세포치료제 Placental tissue, placental stem cells, differentiation, cell therapy

Description

태반 조직 유래 다능성 줄기세포 및 이를 함유하는 세포치료제 {Multipotent Stem Cell Derived from Placenta Tissue and Cellular Therapeutic Agents Comprising the Same}Multipotent Stem Cell Derived from Placenta Tissue and Cellular Therapeutic Agents Comprising the Same}

도 1은 태반 유래 중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cell, MSC)의 형태(morphology)에 대한 현미경 사진이다.1 is a micrograph of the morphology of placental mesenchymal stem cells (MSCs).

도 2는 유세포 분석기(FACS)를 이용하여 기저탈락막 유래 MSC의 표면항원들을 분석한 결과이다.Figure 2 shows the results of analyzing the surface antigens of basal decidual membrane-derived MSC using flow cytometry (FACS).

도 3은 유세포 분석기(FACS)를 이용하여 양막 유래 MSC의 표면항원들을 분석한 결과이다.Figure 3 shows the results of analyzing the surface antigens of the amniotic membrane-derived MSC using flow cytometry (FACS).

도 4의 A는 SFM배지에서 3일간 배양한 1계대째 양막의 스피어 형성사진이고, B는 SFM배지에서 7일간 배양한 1계대째 기저탈락막의 스피어 형성사진이다.FIG. 4A is a sphere formation photograph of the first passage amniotic membrane cultured in SFM medium for 3 days, and B is a sphere formation photograph of the first passage basal drop membrane cultured in SFM medium for 7 days.

도 5는 근세포로의 분화(Myogenesis)에 있어서, MM-3160배지(근육세포 분화용 SKBM 배지)에서 10일간 유도한 양막(A) 및 기저탈락막(B) 유래 줄기세포에 대한 면역조직화학검사(αMyosin-FITC)의 현미경 사진이다FIG. 5 shows immunohistochemistry for amnion (A) and basal degeneration membrane (B) derived stem cells induced in MM-3160 medium (SKBM medium for muscle cell differentiation) for 10 days in myogenesis. (αMyosin-FITC) is a micrograph

도 6은 신경세포로의 분화(Neurogenesis)에 있어서, DMEM배지 및 NM3229배지(신경세포 분화용 배지)에서 10일간 유도한 양막(A) 및 기저탈락막(B) 유래 줄기세포에 대한 면역조직화학검사(αGFAP-FITC)의 현미경 사진이다.FIG. 6 shows immunohistochemistry for stem cells derived from amnion (A) and basal shedding membrane (B) induced in DMEM medium and NM3229 medium (neural cell differentiation medium) for 10 days in neuronal differentiation. Micrograph of the test (αGFAP-FITC).

도 7은 골세포로의 분화(Osteogenesis)에 있어서, 양막(B) 및 기저탈락막(C) 유래 줄기세포에 대하여 Alizarin red S염색법으로 염색한 사진이다[A:대조군; B:골세포 분화조건 하의 양막 유래 줄기세포; C:골세포 분화조건 하의 기저탈락막 유래 줄기세포].7 is a photograph stained by Alizarin red S staining for stem cells derived from amnion (B) and basal decidual membrane (C) in osteoblast differentiation (Osteogenesis) [A: control group; B: amnion derived stem cells under osteoblast differentiation conditions; C: basal decidual stem cells under osteoblast differentiation conditions].

도 8은 지방조직세포로의 분화(Adipogenesis)에 있어서, 양막(B) 및 기저탈락막(A) 유래 줄기세포에 대하여 Oil red O 염색법로 염색한 사진이다FIG. 8 is a photograph stained by oil red O staining of stem cells derived from amnion (B) and basal decidual membrane (A) in adipogenesis.

도 9는 OCT4에 대한 RT-PCR결과이다[레인 1:마커; 레인 2: RT-reaction control; 레인 3: 양막 줄기세포; 레인 4:기저탈락막 줄기세포; 레인 5:PCR-reaction control].9 shows RT-PCR results for OCT4 [lane 1: marker; Lane 2: RT-reaction control; Lane 3: amnion stem cells; Lane 4: basal decidual stem cells; Lane 5: PCR-reaction control].

도 10은 각각에 표기된 특정 항체를 이용한 면역조직화학검사 결과사진이다[A:OCT4; B:SSEA4; C:CD44, CD54 및 대조군].10 is a photograph of immunohistochemistry using specific antibodies indicated in each [A: OCT4; B: SSEA4; C: CD44, CD54 and control.

도 11은 기저탈락막 유래 줄기세포에 대한 계대수에 따른 축적집단 배가정도(cumulative population doubling level, CPDL)를 나타낸 그래프이다.FIG. 11 is a graph showing cumulative population doubling level (CPDL) according to passage number for basal decidual-derived stem cells. FIG.

도 12는 양막 유래 줄기세포에 대한 계대수에 따른 축적집단 배가정도(CPDL)를 나타낸 그래프이다.12 is a graph showing accumulation group doubling degree (CPDL) according to passage number for amnion derived stem cells.

본 발명은 태반 조직 유래 다능성 줄기세포 및 이를 함유하는 세포치료제에 관한 것으로, 본 발명은 (a) CD29, CD44, CD73, CD90 및 CD105에 대하여 모두 양성의 면역학적 특성을 나타내고, CD31, CD34, CD45 및 HLA-DR에 대하여 모두 음성의 면역학적 특성을 나타냄; (b) Oct4 및 SSEA4에 대하여 양성의 면역학적 특성을 나타냄; (c) 플라스틱에 부착되어 성장하며, 둥근형태(round-shape) 또는 선형태(spindle-shape)의 형태학적 특성을 나타내고, SFM 배지에서 스피어(sphere)를 형성하여 미분화 상태로 장기간 유지가 가능함; 및 (d) 중배엽, 내배엽 및 외배엽 유래 세포로 분화하는 능력을 가지는 특성을 나타내는 태반 줄기세포에 관한 것이다.The present invention relates to a placental tissue-derived pluripotent stem cells and cell therapies containing the same, the present invention (a) CD29, CD44, CD73, CD90 and CD105 all show positive immunological properties, CD31, CD34, Both show negative immunological properties for CD45 and HLA-DR; (b) exhibits positive immunological properties for Oct4 and SSEA4; (c) adhered to plastic and grown, exhibit morphological properties of round- or spine-shape, and form spheres in SFM media to allow long-term maintenance in undifferentiated state; And (d) placental stem cells exhibiting the ability to differentiate into mesoderm, endoderm and ectoderm derived cells.

21세기의 생명공학은 인간복지를 최종목표로 식량, 환경, 건강 문제에 새로운 해결책의 가능성을 제시하고 있으며, 최근에 줄기세포의 이용기술은 난치병 치료의 새로운 장으로 떠오르고 있다. 이전까지는 인간의 난치병 치료를 위해 장기이식이나 유전자 치료 등이 제시되었으나, 면역거부와 공급 장기 부족, 벡터개발이나 질환유전자에 대한 지식부족으로 효율적인 실용화가 미진하였다. Biotechnology in the 21st century presents the possibility of new solutions to food, environment and health problems as the final goal of human welfare. Recently, the use of stem cells has emerged as a new chapter in the treatment of intractable diseases. Previously, organ transplantation and gene therapy have been suggested for the treatment of intractable disease in humans. However, due to the lack of immunity, lack of supply organs, lack of knowledge on vector development and disease genes, efficient practical use has been insufficient.

이에 줄기세포연구에 대한 관심이 고조되어, 증식과 분화를 통해 모든 기관을 형성할 능력을 가진 만능 줄기세포가 대부분의 질병 치료는 물론 장기 훼손을 근원적으로 해결할 수 있는 것으로 인식되었다. 또한, 많은 과학자가 인체의 거의 모든 장기 재생은 물론 난치병이었던 파킨슨병, 각종 암, 당뇨병과 척수손상등의 치료에 이르기까지 다양하게 줄기세포의 적용 가능성을 제시해 왔다. As interest in stem cell research increased, pluripotent stem cells with the ability to form all organs through proliferation and differentiation were found to be capable of fundamentally solving long-term damage as well as treating most diseases. In addition, many scientists have suggested the possibility of applying stem cells to treatment of almost all organs of the human body as well as treatment of Parkinson's disease, various cancers, diabetes and spinal cord injury.

줄기세포(stem cell)란 자기 복제 능력을 가지면서 두 개 이상의 세포로 분화하는 능력을 갖는 세포를 말하며, 만능 줄기세포(totipotent stem cell), 전능성(전분화능) 줄기세포(pluripotent stem cells), 다능성(다분화능) 줄기세포(multipotent stem cells)로 분류할 수 있다.Stem cells are cells that have the ability to self-replicate and differentiate into two or more cells, totipotent stem cells, pluripotent stem cells, and c. It can be classified as multipotent stem cells.

만능 줄기세포(totipotent stem cells)는 하나의 완전한 개체로 발생해 나갈 수 있는 만능의 성질을 가진 세포로 난자와 정자의 수정 이후 8세포기까지의 세포가 이러한 성질을 가지며 이 세포를 분리하여 자궁에 이식하면 하나의 완전한 개체로 발생해 나갈 수 있다. 전분화능 줄기세포(pluripotent stem cells)는 외배엽, 중배엽, 내배엽층 유래의 다양한 세포와 조직으로 발생할 수 있는 세포로서, 수정 4-5일 후 나타나는 배반포(blastocyst)의 안쪽에 위치한 내세포괴(inner cell mass)에서 유래하며, 이를 배아 줄기 세포라 하며 다양한 다른 조직 세포로 분화되지만 새로운 생명체를 형성하지는 못한다. 다능성(다능성) 줄기세포(multipotent stem cells)는 이 세포가 포함되어 있는 조직 및 기관을 형성하는 특이적인 세포로만 분화할 수 있는 줄기세포이다.Pluripotent stem cells are pluripotent cells that can develop into a complete individual. Cells up to the eighth cell after fertilization of eggs and sperm have this property. Transplantation can result in one complete individual. Pluripotent stem cells are cells that can develop into a variety of cells and tissues derived from ectoderm, mesoderm, and endodermal layer. The inner cell mass located inside the blastocyst after 4-5 days of fertilization. It is called embryonic stem cells and differentiates into a variety of other tissue cells but does not form new life. Pluripotent (multipotent) stem cells are stem cells that can only differentiate into specific cells that form the tissues and organs that contain them.

다능성 줄기세포는 성체 골수에서 최초로 분리되었고(Y. Jiang et al., Nature, 418:41, 2002), 그 후 다른 여러 성체 조직에서도 확인되었다(C.M. Verfaillie, Trends Cell Biol., 12:502, 2002). 다시 말해, 골수는 가장 널리 알려진 줄기 세포의 소스이지만, 다능성 줄기세포는 피부, 혈관, 근육 및 뇌로부터도 확인되었다(J.G. Toma et al., Nat. Cell Biol., 3:778, 2001; M. Sampaolesi et al, Science, 301:487, 2003; Y. Jiang et al., Exp. Hematol., 30:896, 2002). 그 러나, 골수와 같은 성체 조직내의 줄기 세포는 매우 드물게 존재하고, 이러한 세포들은 분화유도 하지 않고 배양하기 어려워서, 특이적으로 스크린된 배지들이 없으면 그 세포들을 배양하기 어렵다. 즉, 줄기 세포들을 분리하여 체외에서 보존하기가 매우 어렵다는 단점이 있다.Pluripotent stem cells were first isolated from adult bone marrow (Y. Jiang et al., Nature , 418: 41, 2002) and subsequently identified in other adult tissues (CM Verfaillie, Trends Cell Biol. , 12: 502, 2002). In other words, bone marrow is the most widely known source of stem cells, but pluripotent stem cells have also been identified from skin, blood vessels, muscle and brain (JG Toma et al., Nat. Cell Biol ., 3: 778, 2001; M Sampaolesi et al, Science , 301: 487, 2003; Y. Jiang et al., Exp. Hematol. , 30: 896, 2002). However, stem cells in adult tissues such as bone marrow are very rare, and these cells are difficult to culture without induction of differentiation, making them difficult to culture without specifically screened media. That is, it is very difficult to separate stem cells and preserve them in vitro.

이에 대해, 최근, 지방 조직이 다능성 줄기세포의 새로운 소스임이 밝혀졌다(B.Cousin et al., BBRC., 301:1016, 2003; A. Miranville et al., Circulation, 110:349, 2004; S. Gronthos et al., J. Cell Physiol., 189:54, 2001; M.J.Seo et al., BBRC., 328:258, 2005). 즉, 지방흡입(liposuction)에 의해 얻어진 인간 지방조직에 미분화 세포군이 포함되어 있고, 이것은 in vitro상에서 지방세포, 골형성세포, 근원세포 및 연골모세포로의 분화능을 갖는 세포라는 사실이 보고되었다(P.A.Zuk et al., Tissue Eng., 7:211, 2001; A.M Rodriguez et al., BBRC., 315:255, 2004). 이러한 지방 조직은 대량으로 추출할 수 있다는 장점이 있어, 기존의 단점을 보완하는 새로운 줄기세포의 소스로 주목받고 있는 것이다. 또한, 최근 연구에서는 지방 조직 유래 세포가 근육 재생능 및 신경혈관분화를 촉진하는 능력이 있음이 동물 모델 실험을 통하여 알려짐으로써, 줄기세포의 새로운 소스로서 두각을 나타내고 있다. In response, it has recently been found that adipose tissue is a new source of pluripotent stem cells (B. Cousin et al., BBRC ., 301: 1016, 2003; A. Miranville et al., Circulation, 110: 349, 2004; S. Gronthos et al., J. Cell Physiol ., 189: 54, 2001; MJSeo et al., BBRC ., 328: 258, 2005). In other words, it has been reported that human adipose tissue obtained by liposuction contains undifferentiated cell populations, which are cells that have differentiation ability into adipocytes, osteoblasts, myoblasts and chondrocytes in vitro (PAZuk). et al., Tissue Eng. , 7: 211, 2001; AM Rodriguez et al., BBRC ., 315: 255, 2004). These adipose tissues have the advantage of being able to be extracted in large quantities, and are attracting attention as a source of new stem cells to supplement the existing disadvantages. In addition, recent studies have shown that adipose tissue-derived cells have the ability to promote muscle regeneration and neurovascular differentiation through animal model experiments, and have emerged as a new source of stem cells.

최근 이러한 인간 줄기세포의 동정, 격리 및 발생에 대한 관심이 크다. 인간 줄기세포는 다양한 성인 세포 계통을 발생시킬 수 있는 전능성(totipotential) 또는 만능성(pluripotential) 전구체 세포이다. 이 능력은 기관 및 조직 발달에 필요한 세포의 분화와 특수화를 위한 기초로서 작용한다. 최근, 이러한 줄기세포 이식 이 성공함에 따라, 질환, 독성 화학물질 및/또는 방사선으로의 노출로 인한 골융해(myeloablation) 이후 골수를 재구성하고/하거나 보충하는 신규한 임상 도구가 제공되었다. 줄기세포가 다수의 조직을 모두는 아니지만 재증식시키고 생리학적 및 해부학적 기능을 회복시키는데 사용될 수 있음을 입증하는 추가의 증거가 존재한다. 또한, 조직 공학, 유전자 치료 분만 및 세포 치료제에서의 줄기세포의 적용이 급속도로 진행되고 있다. 따라서 현재 당업계에서는 줄기세포에 대한 관심이 증대되면서, 다양한 조직으로부터 줄기세포의 개발 및 제조가 절실히 요구되고 있는 상황이다. Recently, there is a great interest in the identification, isolation and development of such human stem cells. Human stem cells are totipotential or pluripotential precursor cells capable of generating a variety of adult cell lineages. This ability serves as the basis for the differentiation and specialization of cells required for organ and tissue development. Recently, with the success of such stem cell transplantation, new clinical tools have been provided to reconstruct and / or supplement bone marrow after myeloablation due to exposure to disease, toxic chemicals and / or radiation. There is additional evidence to demonstrate that stem cells can be used to repopulate many, but not all, tissues and restore physiological and anatomical function. In addition, the application of stem cells in tissue engineering, gene therapy delivery and cell therapy products is rapidly progressing. Therefore, as the interest in stem cells increases in the art, there is an urgent need for the development and manufacture of stem cells from various tissues.

이에 본 발명자들은 다양한 조직에서 줄기세포를 제조하고자 예의 노력한 결과, 태반 조직을 이용하여 태반 줄기 세포를 제조하는 경우, 기존의 지방 조직을 이용하여 줄기세포를 제조하는 것과 비교해서, 이하와 같은 면역학적 더 효율적으로 생산할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다. Accordingly, the present inventors have made efforts to prepare stem cells in various tissues. As a result, when preparing placental stem cells using placental tissues, compared to preparing stem cells using conventional adipose tissue, It was confirmed that the production can be more efficient, and completed the present invention.

본 발명의 목적은 세절한 양막, 장막, 기저탈락막 또는 태반 조직을 bFGF(Basic Fibroblast Growth Factor) 함유 배지에서 배양한 다음 회수하는 것을 특징으로 하는, (a) CD29, CD44, CD73, CD90 및 CD105에 대하여 모두 양성의 면역학적 특성을 나타내고, CD31, CD34, CD45 및 HLA-DR에 대하여 모두 음성의 면역학적 특성을 나타냄; (b) Oct4 및 SSEA4에 대하여 양성의 면역학적 특성을 나타냄; (c) 플라스틱에 부착되어 성장하며, 둥근형태(round-shape) 또는 선형태(spindle- shape)의 형태학적 특성을 나타내고, SFM 배지에서 스피어(sphere)를 형성하여 미분화 상태로 장기간 유지가 가능함; 및 (d) 중배엽, 내배엽 및 외배엽 유래 세포로 분화하는 능력을 가지는 태반 줄기세포의 제조 방법 및 수득된 태반 줄기세포를 제공하는데 있다. An object of the present invention is characterized in that the fine amnion, membrane, basal decidual or placental tissues are recovered after culturing in bFGF (Basic Fibroblast Growth Factor) containing medium, and (a) CD29, CD44, CD73, CD90 and CD105. All show positive immunological properties, and all show negative immunological properties for CD31, CD34, CD45 and HLA-DR; (b) exhibits positive immunological properties for Oct4 and SSEA4; (c) adhered to plastic and grown, exhibiting morphological properties of round-shape or spine-shape, forming spheres in SFM media and allowing long-term maintenance in undifferentiated state; And (d) a method for producing placental stem cells having the ability to differentiate into mesoderm, endoderm and ectoderm derived cells, and obtained placental stem cells.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 다능성 태반 줄기세포로부터 근세포, 신경세포, 골형성 세포, 지방조직세포, 연골 세포 및 췌장 베타세포로의 분화방법 및 상기 분화된 세포 또는 상기 태반 줄기세포를 함유하는 골관절염, 골다공증 및 당뇨병 등의 치료용 세포치료제와 유방 조직 형성용 세포 치료제를 제공하는데 있다. Another object of the present invention is a method for differentiating from pluripotent placental stem cells to myocytes, neurons, osteoblasts, adipocytes, chondrocytes and pancreatic beta cells and containing the differentiated cells or the placental stem cells To provide a cell therapy for the treatment of osteoarthritis, osteoporosis and diabetes, and a cell therapy for the formation of breast tissue.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 세절한 양막, 장막, 기저탈락막 또는 태반 조직을 콜라게나아제 및 bFGF 함유 배지에서 배양한 다음 회수하는 단계를 포함하는, (a) CD29, CD44, CD73, CD90 및 CD105에 대하여 모두 양성의 면역학적 특성을 나타내고, CD31, CD34, CD45 및 HLA-DR에 대하여 모두 음성의 면역학적 특성을 나타냄; (b) Oct4 및 SSEA4에 대하여 양성의 면역학적 특성을 나타냄; (c) 플라스틱에 부착되어 성장하며, 둥근형태(round-shape) 또는 선형태(spindle-shape)의 형태학적 특성을 나타내고, SFM 배지에서 스피어(sphere)를 형성하여 미분화 상태로 장기간 유지가 가능함; 및 (d) 중배엽, 내배엽 및 외배엽 유래 세포로 분화하는 능력을 가지는 특성을 나타내는 태반 줄기세포의 제조방법 및 이에 의해 수득되는 태반 줄기세포를 제공한다.In order to achieve the above object, the present invention comprises the step of culturing the recovered amnion, membranes, basal decidual or placental tissue in the collagenase and bFGF-containing medium, and then recovering (a) CD29, CD44, CD73, Both show positive immunological properties for CD90 and CD105 and all show negative immunological properties for CD31, CD34, CD45 and HLA-DR; (b) exhibits positive immunological properties for Oct4 and SSEA4; (c) adhered to plastic and grown, exhibit morphological properties of round- or spine-shape, and form spheres in SFM media to allow long-term maintenance in undifferentiated state; And (d) provides a method for producing placental stem cells and the placenta stem cells obtained thereby having the ability to differentiate into mesoderm, endoderm and ectoderm derived cells.

또한, 상기의 수득된 태반 줄기 세포로부터, 근세포, 골형성 세포, 신경세포, 지방세포, 연골세포 또는 췌장 베타세포로 분화시키는 방법을 제공한다. Also provided is a method of differentiating muscle cells, osteogenic cells, neurons, adipocytes, chondrocytes, or pancreatic beta cells from the obtained placental stem cells.

또한, 본 발명은 상기의 수득된 태반 줄기 세포 또는 이로부터 분화된 세포를 유효 성분으로 함유하는 세포치료제를 제공한다.The present invention also provides a cell therapeutic agent containing the obtained placental stem cells or cells differentiated therefrom as an active ingredient.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다. Hereinafter, the present invention will be described in detail.

1. 용어의 정의1. Definition of terms

본 발명에서 사용된 용어 '태반 줄기세포'는 포배낭의 내부 세포 덩어리로부터 유도되지 않은 세포를 지칭한다. 태반으로부터 수득될 수 있는 줄기세포는 태반 줄기세포, 만능성 세포, 다능성 세포 및 수임 전구(progenitor) 세포를 포함한다. As used herein, the term 'placental stem cell' refers to a cell that is not derived from the inner cell mass of the blastocyst. Stem cells that can be obtained from the placenta include placental stem cells, pluripotent cells, pluripotent cells, and progenitor cells.

본 발명에서 사용된 용어 '다능성 세포'는 포유류 신체의 약 260개 세포 유형의 임의의 하위세트로의 성장능력을 갖는 세포를 지칭한다. 만능성 세포와 달리, 다능성 세포는 모든 세포 유형을 형성하려는 능력을 갖지 않는다.As used herein, the term 'pluripotent cell' refers to a cell that has the ability to grow into any subset of about 260 cell types of the mammalian body. Unlike pluripotent cells, pluripotent cells do not have the ability to form all cell types.

본 발명에서 사용된 용어 '전구세포'는 특정 유형의 세포로 분화되거나 특정 유형의 조직을 형성하도록 된 세포를 지칭한다.As used herein, the term 'progenitor cell' refers to a cell that is intended to differentiate into a specific type of cell or form a specific type of tissue.

본 발명에서 사용된 용어 '줄기세포'는 조직 및 기관의 특수화된 세포를 형성하도록 비제한적으로 재생할 수 있는 마스터 세포를 지칭한다. 줄기세포는 발달가능한 만능성 또는 다능성 세포이다. 줄기세포는 2개의 딸줄기세포, 또는 하나의 딸줄기세포와 하나의 유래('전이(transit)') 세포로 분열될 수 있으며, 이후에 조직의 성숙하고 완전한 형태의 세포로 증식된다.As used herein, the term 'stem cells' refers to master cells that can be regenerated without limitation to form specialized cells of tissues and organs. Stem cells are developable pluripotent or pluripotent cells. Stem cells can divide into two daughter cells, or one daughter cell and one derived ('transit') cell, and then proliferate into mature, fully formed cells of the tissue.

본 발명에서 사용된 용어 "분화(differentiation)"는 세포가 분열 증식하여 성장하는 동안에 서로 구조나 기능이 특수화하는 현상, 즉 생물의 세포, 조직 등이 각각에게 주어진 일을 수행하기 위하여 형태나 기능이 변해가는 것을 말한다. 일반적으로 비교적 단순한 계(系)가 둘 이상의 질적으로 다른 부분계(部分系)로 분리되는 현상이다. 예를 들면, 개체발생에서 처음에 동질적이었던 알 부분 사이에 머리나 몸통 등의 구별이 생기거나 세포에도 근세포라든가 신경세포 등의 구별이 생기는 것과 같이 처음에 거의 동질이었던 어떤 생물계의 부분 사이에 질적인 차이가 생기는 것, 또는 그 결과로서 질적으로 구별할 수 있는 부역 또는 부분계로 나누어져 있는 상태를 분화라고 한다.As used herein, the term "differentiation" refers to a phenomenon in which structures or functions are specialized while cells divide and proliferate and grow, that is, a cell or tissue of an organism has a shape or function to perform a task given to each. It means to change. Generally, a relatively simple system is divided into two or more qualitatively different sub systems. For example, qualitatively between parts of a living organism that were almost homogeneous in the first place, such as head or torso distinctions between eggs that were initially homogenous in the development, or cells such as muscle cells or neurons. Phosphorus difference, or as a result, is a state divided into subclasses or subclasses that can be distinguished qualitatively.

본 발명에서 사용된 용어 '세포치료제'는 사람으로부터 분리, 배양 및 특수한 저작을 통해 제조된 세포 및 조직으로 치료, 진단 및 예방 의 목적으로 사용되는 의약품(미국 FDA규정)으로서, 세포 혹은 조직의 기능을 복원시키기 위하여 살아있는 자가, 동종, 또는 이종세포를 체외에서 증식ㅇ선별하거나 다른 방법으로 세포의 생물학적 특성을 변화시키는 등의 일련의 행위를 통하여 치료, 진단 및 예방의 목적으로 사용되는 의약품을 지칭한다. 세포치료제는 세포의 분화정도에 따라 크게 체세포치료제, 줄기세포치료제로 분류되며 본 발명은 특히 줄기세포치료제에 관한 것이다.As used herein, the term 'cell therapeutic agent' is a medicinal product (US FDA regulation) used for the purpose of treatment, diagnosis, and prevention of cells and tissues prepared through isolation, culture, and special chewing from humans, and functions of cells or tissues. Refers to a drug used for therapeutic, diagnostic and prophylactic purposes through a series of actions, such as the proliferation and selection of living autologous, allogeneic, or heterologous cells in vitro or by altering the biological characteristics of the cell in order to restore the . Cell therapy agents are largely classified into somatic cell therapy and stem cell therapy according to the degree of differentiation of cells, and the present invention relates in particular to stem cell therapy.

2. 태반 줄기세포의 분리 및 정제2. Isolation and Purification of Placental Stem Cells

태반(placenta)은 임신 중에 태아를 위해 만들어지는 것으로 무게 500g, 지름 15~20cm, 두께 2~3cm 정도의 원반 형태로 되어있다. 태반의 한쪽은 모체와 닿아 있고 다른 한쪽은 태아와 맞닿아 있으며 그 사이 공간에 모체의 혈액이 담겨 있어 태아에게 영양분을 공급하게 된다. 태반은 양막, 장막, 탈락막의 3층으로 구성되어 있다. 또한, 양막은 태아를 둘러싸고 있는 얇고 투명한 막으로, 양수가 들어 있으며, 양막에는 태아의 줄기세포가 존재한다. 탈락막은 수정란이 자궁에 착상되기 위해 자궁의 상피세포가 변형되어 형성된 막으로써 모체의 줄기세포가 존재한다. 태반에 들어있는 줄기세포의 양은 아주 풍부하며 증식이 잘되고 다른세포로 분화도 가능하다. The placenta is made for the fetus during pregnancy, and has a disc shape of 500g in weight, 15-20cm in diameter, and 2-3cm in thickness. One side of the placenta is in contact with the mother and the other is in contact with the fetus, and the space between the mother's blood contains the nourishment to the fetus. The placenta is composed of three layers of amnion, mesentery and decidual membrane. In addition, the amniotic membrane is a thin transparent membrane surrounding the fetus, which contains amniotic fluid, and the amnion contains fetal stem cells. The decidual membrane is a membrane formed by deforming the epithelial cells of the uterus so that the fertilized egg is implanted in the uterus. The amount of stem cells in the placenta is very abundant, proliferates and can differentiate into other cells.

본 발명에 따른 인간 태반조직(human term placenta)에서 분리된 탈락막(decidua) 또는 양막(amnion) 유래 줄기세포는 성인의 자가성 성체줄기세포로 분류되고, 태반조직을 사용하므로 윤리적으로 문제가 되지 않는다.Decidua or amnion-derived stem cells isolated from human term placenta according to the present invention are classified as adult human stem cells and are not ethically problematic because they use placental tissue. Do not.

통상 다음과 같은 방법을 통하여, 태반 조직으로부터 다능성 줄기세포를 분리 및 정제한다. 본 발명은 포유류의 태반, 바람직하게는 인간의 태반에 관한 것으로, 이는 자궁으로부터의 만출 후, 처리 및 배양되어 다능성 줄기세포, 태반 줄기세포 및 다른 생체 물질을 생성한다. 태반 줄기세포는 자궁으로부터 만출된 태반으로부터 수득된다. 바람직한 실시양태에서, 태반은 성장 인자[예: bFGF (Basic Fibroblast Growth Factor) 및 EGF(Epidermal Growth Factor)]의 존재하에서 배양된다.Usually, the following methods are used to isolate and purify pluripotent stem cells from placental tissue. The present invention relates to the placenta of mammals, preferably to the placenta of humans, which after treatment from the uterus are treated and cultured to produce pluripotent stem cells, placental stem cells and other biological materials. Placental stem cells are obtained from the placenta, which is removed from the uterus. In a preferred embodiment, the placenta is cultured in the presence of growth factors such as Basic Fibroblast Growth Factor (bFGF) and Epidermal Growth Factor (EGF).

본 발명에서는 우선, 태반을 고려대학교병원 임상시험윤리위원회지침서에 따라 고려대학교 부속 구로병원에서 정상 분만과 조산 분만에서 수집하고, 다음과 같은 방법을 통하여, 인간 태반 조직으로부터 다분화능 줄기세포를 분리 및 정제하였다. In the present invention, first, the placenta is collected from normal and preterm labor at Guro Hospital, affiliated with Korea University Hospital, according to the guidelines of the Institutional Review Board of Korea University Hospital. Purified.

인간 태반 조직샘플로부터 양막 및 탈락막을 분리하여 각각 PBS로 세척한다. 세척된 양막 및 탈락막 조직을 잘게 자른다. 잘게 자른 양막과 탈락막 조직은 100 mm 디쉬로 옮긴후 콜라게나아제 (1mg/ml)을 첨가한 DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium, Gibco) 배지를 이용해 37℃에서 1시간 동안 화학적 분해 작업을 한다. Amniotic and decidual membranes are separated from human placental tissue samples and washed with PBS, respectively. Finely cut washed amnion and decidual tissue. Finely chopped amniotic and decidual tissues are transferred to 100 mm dishes and subjected to chemical degradation for 1 hour at 37 ° C using DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium, Gibco) medium with collagenase (1 mg / ml).

화학적 분해된 조직들을 100㎛ 메쉬(mesh)에 필터링하여 분해되지 않은 조직을 제거후 1200rpm에서 1~10분간 원심분리하였다. 상층액은 석션(suction)하고 바닥에 남은 펠렛은 PBS로 세척한 후 1200rpm으로 1~10분간 원심분리하였다. 바닥에 있는 펠렛을 단일세포로 잘 부유시킨 후 bFGF가 함유되어 있는 DMEM배지에서 배양한다. 이때, 중간엽 줄기세포의 경우는 바닥에 부착이 되고 이외의 세포들은 부유하여 있다. The chemically decomposed tissues were filtered through a 100 μm mesh to remove the undecomposed tissues, followed by centrifugation for 1 to 10 minutes at 1200 rpm. The supernatant was suctioned and the pellet remaining on the bottom was washed with PBS and centrifuged for 1-10 minutes at 1200 rpm. The pellet at the bottom is well suspended in single cells, and then cultured in a DMEM medium containing bFGF. At this time, the mesenchymal stem cells are attached to the bottom and the other cells are floating.

이러한 줄기세포는 플라스틱에 부착되어 성장하며, 둥근형태(round-shape) 또는 선형태(spindle-shape)의 형태학적 특성을 나타낸다. 이틀이 지난 후 디쉬 바닥에 붙지 않은 세포들은 PBS로 세척하고, 배지를 2~3일마다 교체하면서 배양하여 인간 태반에서 분리한 양막 또는 탈락막 유래 다분화능 줄기세포액을 수득하였다. These stem cells adhere to and grow on plastics and exhibit morphological properties of round-shape or spindle-shape. After two days, the cells that did not adhere to the bottom of the dish were washed with PBS, and cultured while replacing the medium every two to three days to obtain amnion or decidual-derived multipotent stem cell fluid isolated from the human placenta.

상기 분리된 태반 유래 다능성 줄기세포의 증식율을 조사하면, 계대 수(passage number)가 12에 이르기까지, CPDL이 점진적으로 증가하여 우수한 증식율을 가진다는 것을 알 수 있다(도 11 및 12).Examining the proliferation rate of the isolated placenta-derived pluripotent stem cells, it can be seen that until the passage number (passage number) up to 12, CPDL gradually increases to have an excellent proliferation rate (Figs. 11 and 12).

수득한 줄기세포는 SFM 배지에서 스피어(sphere)를 형성하여 미분화 상태로 장기간 유지가 가능하다(도 4). 본 발명에서 사용 가능한 SFM 배지의 하나로 10 μM, 1 x antibiotic antimycotic solution, 1 μg/ml hydrocortisone, 5 μg/ml Insuline, 20 ng/ml EGF, 40 ng/ml FGF, B27, β-mercaptoethanol을 함유하는 MEBM (Mammary Epithelial Basal Medium) 배지를 들 수 있다.Stem cells obtained can form a sphere in the SFM medium (sphere) can be maintained in an undifferentiated state for a long time (Fig. 4). One of the SFM medium usable in the present invention contains 10 μM, 1 x antibiotic antimycotic solution, 1 μg / ml hydrocortisone, 5 μg / ml Insuline, 20 ng / ml EGF, 40 ng / ml FGF, B27, β-mercaptoethanol MEBM (Mammary Epithelial Basal Medium) medium is mentioned.

증식된 세포의 갯수 및 유형은 유동 세포측정, 세포 분류, 면역세포화학(예를 들어, 조직 특이성 또는 세포-표지 특이적 항체로 염색시킴), 형광 활성화 세포 분류(fluorescence activated cell sorting, FACS), 자기 활성화 세포 분류(magnetic activated cell sorting, MACS)와 같은 표준 세포 검출 기술을 사용하는 형태 및 세포의 표면 표지에서의 변화를 측정하거나, 광학 현미경 또는 공초점(confocal) 현미경을 사용하여 세포의 형태를 검사하거나, 또는 PCR 및 유전자 발현 프로파일링(profiling)과 같이 당해 분야에 잘 공지된 기술을 사용하여 유전자 발현에서의 변화를 측정함으로써 쉽게 모니터링될 수 있다.The number and type of proliferated cells can be determined by flow cytometry, cell sorting, immunocytochemistry (eg staining with tissue specific or cell-label specific antibodies), fluorescence activated cell sorting (FACS), Morphology using standard cell detection techniques such as magnetic activated cell sorting (MACS) and measuring changes in the cell's surface label, or by using optical or confocal microscopy Or can be easily monitored by measuring changes in gene expression using techniques well known in the art such as PCR and gene expression profiling.

바람직한 실시양태에서, 태반에서 배양된 세포는 당해 분야에 공지된 기법, 예를 들어 밀도 구배 원심분리, 자석 세포분리, 유세포분석기, 또는 다른 세포 분리법을 사용하여, 또는 당해 분야에 공지된 분류 방법을 사용하여 분류된다. In a preferred embodiment, the cells cultured in the placenta are subjected to techniques known in the art, such as density gradient centrifugation, magnetic cell separation, flow cytometry, or other cell separation methods, or to methods known in the art. Are classified using.

일례로, 수득한 태반 유래 줄기세포액으로부터 목적의 표면항원을 발현하고 있는 다능성 줄기세포를 수득하는 방법으로서는 소팅 기능을 가진 플로우 사이토미터를 사용한 FACS 법(Int. Immunol., 10(3):275, 1998), 자기 비즈를 사용하는 방법, 다능성 줄기세포를 특이적으로 인식하는 항체를 사용한 패닝법(J. Immunol., 141(8):2797, 1998) 등이 있다. 또한, 대량의 배양액 등으로부터 다능성 줄기세포를 수득하는 방법으로서는, 세포의 표면에 발현되어 분자(이하, 표면 항원이라 칭함)를 특이적으로 인식하는 항체를 단독 또는 조합하여 이를 칼럼으로서 사용하는 방법이 있다. For example, the FACS method using a flow cytometer with a sorting function ( Int. Immunol. , 10 (3): 275) is a method for obtaining a pluripotent stem cell expressing the target surface antigen from the obtained placental stem cell fluid . , 1998), a method using magnetic beads, and a panning method using an antibody that specifically recognizes pluripotent stem cells ( J. Immunol. , 141 (8): 2797, 1998). In addition, as a method for obtaining pluripotent stem cells from a large amount of culture solution or the like, a method in which an antibody that is expressed on the surface of a cell and specifically recognizes a molecule (hereinafter referred to as a surface antigen) is used alone or in combination and used as a column. There is this.

플로우 사이토미터 소팅 방식으로서는, 수적하전 방식, 셀캡쳐 방식 등을 들 수 있다. 한 실시양태에서, 세포 표면 표지-특이적 항체 또는 리간드는 분명한 형광 라벨로 표지된다. 세포는 세포 분류기를 통해 처리되어 그들의 사용된 항체에 대한 결합능력에 기초하여 세포가 분리된다. FACS-분류된 입자는 96웰 또는 384웰 플레이트의 개별 웰(well)내에 직접 침착되어 분리 및 클로닝을 촉진시킬 수 있다.Examples of the flow cytometer sorting method include a water charge method, a cell capture method, and the like. In one embodiment, the cell surface label-specific antibody or ligand is labeled with a clear fluorescent label. The cells are processed through a cell sorter to separate the cells based on their ability to bind to the antibodies used. FACS-sorted particles can be deposited directly into individual wells of 96-well or 384-well plates to facilitate separation and cloning.

어떠한 방법으로도 세포의 표면항원을 특이적으로 인식하는 항체를 형광으로 표지하고, 표지된 항체와 항원의 결합체에 대한 형광을 측정하여 형광 강도를 전기 신호로 변환함으로서 세포의 항원 발현량을 정량할 수 있다. 또한, 사용하는 형광물질의 종류를 조합함으로서, 복수의 표면 항원을 발현하고 있는 세포를 분리하는 것도 가능하다. 여기에 사용가능한 형광물질로는, FITC(fluorescein isothiocyanate), PE(phycoerythrin), APC(allo-phycocyanin), TR(TexasRed), Cy3, CyChrome, Red613, Red670, TRI-Color, QuantumRed 등이 있다. By any method, the antibody that specifically recognizes the surface antigen of the cell is labeled with fluorescence, the fluorescence of the conjugate of the labeled antibody and antigen is measured, and the fluorescence intensity is converted into an electrical signal to quantify the antigen expression level of the cell. Can be. In addition, by combining the kinds of fluorescent materials to be used, it is possible to separate cells expressing a plurality of surface antigens. Fluorescent materials usable here include FITC (fluorescein isothiocyanate), PE (phycoerythrin), APC (allo-phycocyanin), TR (TexasRed), Cy3, CyChrome, Red613, Red670, TRI-Color, QuantumRed and the like.

본 발명에서 사용 가능한 하나의 방법인 플로우 사이토미터를 사용한 FACS 법으로서는, 상기에서 수득한 줄기세포용액을 수집하고, 원심분리 등의 방법으로 세포를 분리한 후, 직접 항체로 염색하는 방법과 한번 적당한 배지 중에서 배양, 증식을 실시한 후에 항체를 염색하는 방법을 이용할 수 있다. 세포의 염색은 우선, 표면 항원을 인식하는 일차항체와 목적 세포 샘플을 혼합하고, 얼음 위에서 30분 내지 1시간 인큐베이션한다. 일차 항체가 형광으로 표지되어 있는 경우에는 세정 후 플로우 사이토미터로 분리를 실시한다. 일차 항체가 형광 표지되어 있지 않는 경우에는 세정 후 일차 항체에 대해서 결합 활성을 갖는 형광 표지된 이차 항체와 일차 항체가 반응한 세포를 혼합하고, 다시 얼음물에서 30분 내지 1시간 인큐베이션한다. 세정 후, 일차 항체와 이차 항체에서 염색된 세포를 플로우 사이토미터로 분리를 실시한다. As a FACS method using a flow cytometer, which is one method that can be used in the present invention, the stem cell solution obtained above is collected, the cells are separated by centrifugation, etc., and then stained directly with an antibody. After culturing and propagating in a medium, the method of staining an antibody can be used. To stain the cells, firstly, the primary antibody recognizing the surface antigen and the desired cell sample are mixed and incubated for 30 minutes to 1 hour on ice. If the primary antibody is labeled with fluorescence, it is separated by a flow cytometer after washing. In the case where the primary antibody is not fluorescently labeled, after washing, the fluorescently labeled secondary antibody having a binding activity to the primary antibody and the cells reacted with the primary antibody are mixed and incubated in ice water for 30 minutes to 1 hour. After washing, the cells stained with the primary antibody and the secondary antibody are separated by flow cytometry.

3. 태반으로부터 수득된 태반 줄기세포의 특성3. Characteristics of Placental Stem Cells Obtained from Placenta

태반으로부터 단리된 줄기세포는 균질하고 멸균성이다. 또한, 줄기세포는 인간에게 투여되기 적합한 형태(즉, 약학적 등급)로 용이하게 수득된다.Stem cells isolated from the placenta are homogeneous and sterile. In addition, stem cells are readily obtained in a form suitable for human administration (ie, pharmaceutical grade).

장기간 배양 후 세포들을 표면 CD 시리즈 항원 마커들, 예를 들어 CD29 (mononuclear cell marker), CD31(endothelial cell and stem cell marker), CD34, CD44(hematopoietic cell marker), CD90(mononuclear stem cell marker), CD73(T-cell and B-cell marker) CD105(endothelial cell marker), CD45(hematopoietic cell marker), 들로 캐릭터라이제이션하여 FACS 분석에 적용할 수 있다.After prolonged incubation, the cells were treated with surface CD series antigen markers such as CD29 (mononuclear cell marker), CD31 (endothelial cell and stem cell marker), CD34, CD44 (hematopoietic cell marker), CD90 (mononuclear stem cell marker), CD73 (T-cell and B-cell marker) Characterized with CD105 (endothelial cell marker), CD45 (hematopoietic cell marker), and can be applied to FACS analysis.

본 발명의 방법에 의해 수득된 바람직한 태반 줄기세포는 하기 세포 표면 표지의 존재에 의해 규명될 수 있다: CD29, CD44, CD54, CD73, CD90 및 CD105에 대하 여 모두 양성의 면역학적 특성을 나타내고, CD31, CD34, CD45 및 HLA-DR에 대하여 모두 음성의 면역학적 특성을 나타낸다. 이러한 세포 표면 표지는 당해 분야에 익히 공지된 방법에 따라, 예를 들어 유세포분석기에 의해 일괄적으로 측정된 후 세척하고, 항-세포 표면 표지 항체로 착색된다.Preferred placental stem cells obtained by the method of the present invention can be characterized by the presence of the following cell surface markers: all show positive immunological properties for CD29, CD44, CD54, CD73, CD90 and CD105, , CD34, CD45 and HLA-DR all show negative immunological properties. Such cell surface labels are measured collectively, for example, by flow cytometry, washed according to methods well known in the art, and stained with anti-cell surface labeled antibodies.

또한, 본 발명의 태반 줄기세포는 미분화상태의 세포 마커라고 할 수 있는 Oct4 또는 SSEA4의 마커를 이용하여 확인할 수 있다(도 9). Oct4는 줄기세포에서 미분화상태 표지인자로써 잘 알려져 있고, 기술분야에서는 대한민국특허출원 제10-2004-0105716호 "인간 배아줄기세포에 특이적인 단일클론항체", 대한민국특허출원 제10-2004-0096780호 "포유류 배아 및 줄기세포의 미분화 상태 유지 Oct4 유전자 발현 억제용 이중나선 RNA", 대한민국특허출원 제10-2006-0092128호 "파골세포 기반 적소 유사 구조에 의해 증식능이 증가된 인간 제대혈 유래 다분화능 줄기 세포 및 그 제조방법" 등에서 나타난 바와 같이, 미분화상태의 줄기세포임을 입증하기 위한 실험으로 Oct4 발현능 실험을 하는 것이 통상이다. 또한, SSEA4 (Stage Specific Embryonic Antigen 4)가 인간 배아줄기세포의 표면에 존재한다는 것도 당업자에게 이미 알려져있는 사실이다.In addition, placental stem cells of the present invention can be identified using a marker of Oct4 or SSEA4, which can be said to be an undifferentiated cell marker (FIG. 9). Oct4 is well known as an undifferentiated state marker in stem cells, and in the art, Korean Patent Application No. 10-2004-0105716 "monoclonal antibody specific for human embryonic stem cells", Korean Patent Application No. 10-2004-0096780 "Double-stranded RNA for inhibiting Oct4 gene expression in maintaining undifferentiated state of mammalian embryos and stem cells," Korean Patent Application No. 10-2006-0092128 And the method for the preparation thereof, etc., in order to prove that the stem cells are in an undifferentiated state, it is common to perform an Oct4 expression test. In addition, it is also known to those skilled in the art that SSEA4 (Stage Specific Embryonic Antigen 4) is present on the surface of human embryonic stem cells.

Oct4 및 SSEA4의 발현은 RT-PCR(Reverase Transcriptase-Polymerase Chain Reaction)을 이용한다. RT-PCR의 방법은 당분야에 공지되어 있는 기술이다. RT-PCR은 특정 부위의 RNA를 주형(template)로 하여 이에 상응하는 cDNA를 합성한 다음, 이를 이용하여 PCR 증폭을 시행하는 기술이며, 실험과정은 (1) 역전사효소(reverse transcriptase)를 이용하여 RNA로부터 cDNA를 제조하는 과정과 (2) cDNA를 이용하 여 특정부위를 증폭시키는 과정으로 이루어지며 (2)과정은 게놈(genomic) DNA로부터 특정 유전자 부위를 증폭시키는 방법과 같다. 이 방법은 노던 블롯 하이브리다이제이션과 같은 방법을 통해 가능하던 RNA 분석보다 실험방법이 더욱 간단할 뿐만 아니라, 유전자의 염기서열 결정이 가능하기 때문에 주로 mRNA의 염기서열 및 전사량을 연구할 때 크게 도움이 되는 기술이다.Expression of Oct4 and SSEA4 uses RT-PCR (Reverase Transcriptase-Polymerase Chain Reaction). The method of RT-PCR is a technique known in the art. RT-PCR is a technique of synthesizing a corresponding cDNA using a template of RNA of a specific site, and then PCR amplification using the same, the experimental process (1) using reverse transcriptase The process consists of preparing cDNA from RNA and (2) amplifying a specific region using cDNA. (2) process is the same as amplifying a specific gene region from genomic DNA. This method is not only simpler than the RNA analysis that was possible through methods such as Northern blot hybridization, but also helps in the study of mRNA sequencing and transcription, since the gene sequence can be determined. This is the technology.

본 발명의 태반 줄기세포는 Oct4와 SSEA4의 발현에 대해 양성 반응을 나타낸다(도 9).Placental stem cells of the present invention show a positive response to the expression of Oct4 and SSEA4 (FIG. 9).

4. 태반 줄기세포의 분화4. Differentiation of Placental Stem Cells

본 발명의 방법에 의해 수득된 태반 줄기세포는 중배엽, 내배엽 및 외배엽 유래 세포로 분화하는 능력을 가지고 있다. 지방세포분화, 연골세포 분화, 골아세포 분화, 조혈세포 분화, 근세포 분화, 혈관세포 분화, 신경세포 분화, 간세포 분화를 비롯한, 특정 세포 계통을 따라 분화하도록 유도될 수 있다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 방법에 따라 수득된 태반 줄기세포는 이식 및 생체외 처리 프로토콜에서의 사용을 위해 분화하도록 유도된다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 방법에 따라 수득된 태반 줄기세포는 특정 세포 유형으로 분화하도록 유도되고 치유 유전자 생성물을 제공하도록 유전자적으로 설계된다. Placental stem cells obtained by the method of the present invention have the ability to differentiate into mesoderm, endoderm and ectoderm derived cells. It can be induced to differentiate along specific cell lineages, including adipocyte differentiation, chondrocyte differentiation, osteoblast differentiation, hematopoietic cell differentiation, myocyte differentiation, vascular cell differentiation, neuronal differentiation, hepatocyte differentiation. In certain embodiments, placental stem cells obtained according to the methods of the present invention are induced to differentiate for use in transplantation and ex vivo treatment protocols. In certain embodiments, placental stem cells obtained according to the methods of the invention are induced to differentiate into specific cell types and are genetically designed to provide a healing gene product.

특정 실시양태에서, 본 발명의 방법에 의해 수득된 태반 줄기세포는 분화되도록 유도되는 생체외 화합물과 함께 항온 처리된 후 분화된 세포는 실험대상으로 직접 이식된다. 따라서, 본 발명은 표준 배양 매지를 사용하여 인간 태반 줄기세포 를 분화시키는 방법을 포함한다. 따라서, 본 발명에 따른 다능성 태반 줄기세포는 근세포, 신경세포, 성상세포, 골형성세포, 연골세포, 지방세포 및 인슐린 분비 췌장 베타세포로 분화시키는 방법을 포함한다.In certain embodiments, the placental stem cells obtained by the methods of the invention are incubated with an ex vivo compound that is induced to differentiate and then the differentiated cells are transplanted directly into the subject. Thus, the present invention includes a method of differentiating human placental stem cells using standard culture media. Thus, pluripotent placental stem cells according to the present invention include a method of differentiating myocytes, neurons, astrocytes, osteoblasts, chondrocytes, adipocytes and insulin secreting pancreatic beta cells.

줄기세포의 특정 세포 유형으로의 분화 측정은 당해 분야에 익히 공지된 방법에 의해 수행될 수 있으며, 예를 들어, (1) 태반 줄기세포를 하루 동안 아자사이티딘(azacytidine)을 전처리 한 후 SKBM 배지(cambrex, co.)에서 근세포로의 분화를 유도할 수 있고, (2) 태반 줄기세포를 BME (beta-mercaptoethanol) 및 FBS(Fetal Bovine Serum)를 함유한 DMEM 배지에 전배양 하고, 상기 전배양액을 DMSO(Dimethyl sulfoxide) 및 BHA(Butylated hydroxyanisole)로 처리하여 신경분화를 유도할 수 있고, (3) 태반줄기세포를 TCP(Tricalcium phosphate)와 혼합하여 이소이식하여 골형성 세포로 분화시킬 수 있고, (4) 태반 줄기세포를 덱사메타손(dexamethasone), 인도메타신 (indomethacin), 인슐린 및 IBMX (3-isobutyl-1-methylxanthine)를 함유한 α-MEM배지에 배양하여 지방세포로 분화시킬 수 있다.Determination of the differentiation of stem cells into specific cell types can be performed by methods well known in the art, for example, (1) SKBM medium after placenta stem cells are pretreated with azacytidine for one day. (cambrex, co.) can induce differentiation into myocytes, (2) placental stem cells are pre-cultured in DMEM medium containing BME (beta-mercaptoethanol) and FBS (Fetal Bovine Serum), and the preculture Can be treated with DMSO (dimethyl sulfoxide) and BHA (Butylated hydroxyanisole) to induce neuronal differentiation, (3) placental stem cells can be mixed with TCP (Tricalcium phosphate) and isotransplanted to differentiate into osteoblasts, (4) Placental stem cells can be differentiated into adipocytes by culturing in α-MEM medium containing dexamethasone, indomethacin, insulin and IBMX (3-isobutyl-1-methylxanthine).

또한, 상기 분화들은 유세포 분석 또는 면역세포화학과 같은 기법을 사용하여 세포 표면 표지(예를 들어 조직-특이적 또는 세포-표지 특이적 항체로 세포를 염색함) 및 형태의 변화를 측정하면서, 광학 현미경 또는 공초점 현미경을 사용하여 세포의 형태를 조사함으로써, 또는 PCR 및 유전자-발현 프로파일과 같은 당해 분야에 익히 공지된 기법을 사용하여 유전자 발현상의 변화를 측정함으로써 확인될 수 있다.The differentiation may also be performed using techniques such as flow cytometry or immunocytochemistry to measure cell surface labeling (e.g., staining cells with tissue-specific or cell-labeling specific antibodies) and morphological changes, Or by examining the morphology of the cells using confocal microscopy, or by measuring changes in gene expression using techniques well known in the art such as PCR and gene-expression profiles.

6. 태반 줄기세포 및 이의 분화세포의 이용6. Use of placental stem cells and their differentiated cells

본 발명의 태반 줄기세포는, 신체의 조직 또는 기관이 목적하는 세포 군집, 예를 들어 줄기세포 또는 유래세포군집의 생착, 이식 또는 주입에 의해 강화, 치료 또는 대체되는 다양한 종류의 치료 프로토콜에 사용될 수 있다. 상기 본 발명의 태반 줄기세포는 존재하는 조직을 대체 또는 강화시켜, 새롭거나 변화된 조직이 되게 하거나 생물학적 조직 또는 구조와 결합시킬 수 있다. 또한, 전형적으로 배아 줄기세포가 사용되는 치료 프로토콜에서 배아 줄기세포는 본 발명의 태반 줄기세포로 대체될 수 있다. 일례로, 본 발명의 태반 줄기세포 또는 이의 분화된 세포를 함유하는 알츠하이머, 파킨슨씨 병 등의 신경질환, 진행성 근이영양증, 루게릭 병 등의 근질환, 골관절염, 골다공증의 골질환 및 당뇨병 등의 치료용 세포치료제와 유방 조직 형성용 세포 치료제 등에 사용될 수 있다.Placental stem cells of the present invention can be used in various types of therapeutic protocols in which tissues or organs of the body are enriched, treated or replaced by engraftment, transplantation or infusion of the desired cell population, for example stem cells or derived cell populations. have. The placental stem cells of the present invention can replace or enhance existing tissue, resulting in new or changed tissue, or bind to biological tissue or structure. In addition, embryonic stem cells may typically be replaced with placental stem cells of the invention in therapeutic protocols in which embryonic stem cells are used. For example, Alzheimer's disease containing placental stem cells or differentiated cells of the present invention, neurological diseases such as Parkinson's disease, progressive muscular dystrophy, muscular diseases such as Lou Gehrig's disease, osteoarthritis, osteoporosis bone diseases and diabetes treatment cells It can be used for therapeutic agents and cell therapies for forming breast tissue.

본 발명의 바람직한 실시양태에서, 태반으로부터의 태반 줄기세포 및 기타 줄기세포는 적합 및 부적합 HLA형조혈 이식을 포함하는, 자가 및 동종 조혈 이식에 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 태반 줄기세포는 치료학적 이식 프로토콜, 예를 들어 간, 췌장, 신장, 폐, 신경계, 근육계, 뼈, 골수, 흉선, 비장, 점막밑 조직, 생식선 또는 모발의 줄기세포 또는 유래세포를 강화 또는 대체시키는데 사용될 수 있다.In a preferred embodiment of the invention, placental stem cells and other stem cells from the placenta can be used for autologous and allogeneic hematopoietic transplantation, including suitable and incompatible HLA type hematopoietic transplantation. For example, the placental stem cells of the present invention may be used in therapeutic transplantation protocols such as liver, pancreas, kidney, lung, nervous system, muscular system, bone, bone marrow, thymus, spleen, submucosal tissue, gonads or hair stem cells or It can be used to enhance or replace derived cells.

태반 줄기세포는, 전형적으로 유래세포가 사용되는 치료 또는 연구 프로토콜에서 특정한 부류의 전구세포 (예를들어, 연골세포, 줄기세포, 조혈세포, 췌장 실질세포, 신경줄기세포 및 근육 유래세포 등) 대신 사용될 수 있다. Placental stem cells are typically used in place of certain classes of progenitor cells (eg, chondrocytes, stem cells, hematopoietic cells, pancreatic parenchymal cells, neural stem cells, and muscle derived cells, etc.) in the therapeutic or research protocol in which the derived cells are used. Can be.

본 발명의 태반 줄기세포는 연골, 건 또는 인대의 강화, 치료 또는 대체에 사용될 수 있다. 예를 들어, 특정 실시양태에서는, 인공보철물(예를 들어, 둔부 인공보철물)이 본 발명의 태반 줄기세포로부터 성장한 대체 연골조직 구조물로 피복된다. 다른 실시양태에서는, 관절(예를 들어, 무릎)이 태반 줄기세포로부터 성장한 연골조직 구조물로 재구성된다. 또한, 연골조직 구조물은 주로 상이한 유형의 관절의 재구성 수술에 사용될 수 있다(예를 들어, 문헌[Resnick, D. et al, Diagnosis of Bone and Joint Disorders, 2d, 1988]에서의 프로토콜).Placental stem cells of the present invention can be used to strengthen, treat or replace cartilage, tendons or ligaments. For example, in certain embodiments, prostheses (eg, buttock prostheses) are coated with replacement cartilage structures grown from placental stem cells of the invention. In other embodiments, the joint (eg, knee) is reconstituted with cartilage structures grown from placental stem cells. In addition, cartilage structures can be used primarily for reconstructive surgery of different types of joints (eg, the protocol in Resnick, D. et al, Diagnosis of Bone and Joint Disorders, 2d, 1988).

본 발명의 태반 줄기세포는 질병으로부터 야기된 조직 및 기관의 손상을 복구하는데 사용될 수 있다. 이러한 실시양태에서는, 환자에게 태반 줄기세포가 투여되어 질병의 결과로서 손상된 조직 또는 기관을 재생 또는 회복시킬 수 있다(예를 들어, 화학요법 또는 방사선 이후의 면역계를 향상시키고, 심근경색 이 후의 심장조직을 복구한다).Placental stem cells of the present invention can be used to repair damage to tissues and organs resulting from disease. In such embodiments, the placenta stem cells may be administered to the patient to regenerate or repair the damaged tissues or organs as a result of the disease (eg, to improve the immune system following chemotherapy or radiation, and cardiac tissue after myocardial infarction). To recover).

또한 본 발명의 태반 줄기세포는 주사가능물질(예를 들어, 본원의 참조문헌으로 인용되는 국제특허 공개공보 제 WO 96/39101 호)로서 제형화될 수 있다. 다른 실시양태에서, 본 발명의 세포 및 조직은 미국특허 제 5,709,854 호; 제 5,516,532 호; 제 5,654,381 호(모두 본원의 참조문헌으로 인용됨)에 기술된 바와 같은 중합성 또는 가교성 하이드로겔을 사용하여 제형화될 수 있다The placental stem cells of the present invention can also be formulated as injectables (eg, WO 96/39101, incorporated herein by reference). In other embodiments, the cells and tissues of the present invention are described in U.S. Patents 5,709,854; 5,516,532; 5,516,532; It may be formulated using polymerizable or crosslinkable hydrogels as described in US Pat. No. 5,654,381, all of which are incorporated herein by reference.

이하 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.Through the following examples will be described the present invention in more detail. These examples are only for illustrating the present invention, it will be apparent to those skilled in the art that the scope of the present invention is not to be construed as being limited by these examples.

실시예 1: 태반 조직의 준비 및 분리Example 1 Preparation and Separation of Placental Tissues

태반은 고려대학교병원 임상시험윤리위원회지침서에 따라 고려대학교 부속 구로병원에서 정상 분만과 조산분만에서 수집되어 연구용으로 사용하였다. 태반 조직은 항생제가 포함되어 있는 생리 식염수에 넣어서 연구실까지 옮겼다. Placenta was collected from normal and preterm labor at Guro Hospital, Korea University, according to the guidelines of the Institutional Review Board of Korea University. Placental tissues were transferred to the lab in physiological saline containing antibiotics.

연구실로 옮긴 태반 조직은 PBS를 이용하여 세척하여 혈구세포들과 여러 조직의 잔해들을 제거하거나 조직을 용혈버퍼(hemolysis buffer)를 이용하여 혈구세포들을 제거 하거나 태반을 구성하고 있는 양막(amnion), 장막(chorion), 기저탈락막(decidua) 및 태반(placenta bad)조직을 각각 포셋을 이용하여 조심스럽게 분리하였다. Placental tissues that have been transferred to the laboratory are washed with PBS to remove blood cells and debris from various tissues, or tissues are removed using hemolysis buffer to remove blood cells or amnion and membranes that make up the placenta. (chorion), decidual (decidua) and placenta bad tissues were carefully separated using a facet, respectively.

실시예 2: 태반 유래 줄기세포의 분리 및 배양Example 2: Isolation and Culture of Placental Stem Cells

분리된 각각의 조직들은 100mm 디쉬에 놓고 멸균된 메쉬를 이용해 1~2mm 크기로 잘게 세절하였다. 그 후, 콜라게나제가 포함된 배지에 놓고 37℃의 배양기에서 최소 1 시간에서 최대 4시간 동안 반응시킨 다음 100 와이어 직물체를 이용해 콜라게나제가 처리된 조직을 걸렀다. 이렇게 분리한 세포들은 100mm 디쉬에 37℃, 5% CO2 조건하 bFGF 함유 DMEM배지에서 배양하였다. Each tissue was separated into 100mm dishes and chopped into 1 ~ 2mm size using a sterile mesh. Thereafter, it was placed in the culture medium containing collagenase and reacted for at least 1 hour up to 4 hours in an incubator at 37 ° C., and the collagenase-treated tissue was filtered using 100 wire fabrics. The cells thus isolated were incubated in a 100 mm dish in DMEM medium containing bFGF under 37 ° C. and 5% CO 2 .

비교예 1: 태반 조직 및 지방 조직 유래 줄기세포 배양 효율 비교Comparative Example 1: Comparison of Stem Cell Culture Efficiency of Placental and Adipose Tissues

5g의 지방 조직으로부터 줄기세포를 분리, 배양할 경우 두 번의 계대 배양 후 천만개 이상의 세포를 획득할 수 있었으나 약 3g의 태반 조직의 경우 최초의 계대 배양 후 천만개 이상의 세포를 획득할 수 있었다. 이를 통해, 태반 조직을 이용하여 줄기세포를 배양하는 경우, 기존의 지방 조직을 이용하여 줄기세포를 배양하는 경우보다 훨씬 효율적인 것을 알 수 있었다. When stem cells were separated and cultured from 5 g of adipose tissue, more than 10 million cells were obtained after two passages, but about 3 g of placental tissues were able to obtain more than 10 million cells after the first passage. Through this, it was found that culturing stem cells using placental tissue was much more efficient than culturing stem cells using conventional adipose tissue.

실시예 3: 태반조직 유래 줄기세포의 증식율 조사Example 3 Investigation of Proliferation Rate of Placental Tissue-Derived Stem Cells

상기 분리된 인간 태반 조직 유래 다능성 줄기세포의 증식방법에 따라 수득된 줄기세포의 증식율을 조사하였다. 각각 다른 인간 개체의 태반조직 샘플로부터 가져온 태반 줄기세포를 실시예 1 내지 3과 같은 분리방법을 거쳐 얻은 후, 75-flask에 2x105씩 씨딩(seeding)하였다. The proliferation rate of the stem cells obtained according to the proliferation method of the isolated human placental tissue-derived pluripotent stem cells was investigated. Placental stem cells obtained from placental tissue samples of different human subjects were obtained through the isolation method as in Examples 1 to 3, and then seeded by 2 × 10 5 by 75-flask.

CPDL(cumulative population doubling level)은 세포의 증식율을 나타내는 지수로서, Cumulative population doubling level (CPDL) is an index indicating the proliferation rate of cells.

CPDL=ln(Nf/Ni)/ln2CPDL = ln (Nf / Ni) / ln2

(Ni=초기 seeding한 세포수, Nf=최종 세포수)(Ni = initial seeded cell number, Nf = final cell number)

의 식으로 나타낼 수 있다.It can be expressed as

기저탈락막 유래 줄기세포 및 양막 유래 줄기세포의 CPDL을 계대수(passage number)에 따라 관찰한 결과 계대수 가 12일때 약 30에 달하는 CPDL 값을 나타낸다 (도 11 및 12). 이러한 CPDL 값은 인간 지방 조직 유래 줄기세포( Lin et al., stem cells and development, 14:92, 2005; Zuk et al., Tissue eng., 7:211, 2001)의 그 값과 유사하며 이 결과로부터 본 발명에 따른 성체 줄기세포는 증식율이 매우 우수하다는 것을 알 수 있었다. CPDL values of basal decidual-derived stem cells and amnion-derived stem cells were observed according to passage numbers, and when the passage number was 12, the CPDL values reached approximately 30 (FIGS. 11 and 12). These CPDL values are similar to those of human adipose tissue derived stem cells (Lin et al., Stem cells and development, 14:92, 2005; Zuk et al., Tissue eng., 7: 211, 2001). From the adult stem cells according to the present invention was found that the proliferation rate is very excellent.

실시예 4: 태반 유래 다능성 줄기세포의 면역학적 특성Example 4: Immunological Characteristics of Placental Pluripotent Stem Cells

실시예 3에서 수득한 태반조직 유래 다능성 줄기세포를 PBS로 세척하고, 트립신 처리한 뒤 세포를 수거하여 5분 동안 1000rpm으로 원심분리하였다. 상층액을 버린 후 5% FBS 및 PBS의 혼합액을 넣어서 세척한 후 1000rpm으로 5분동안 원심분리하였다. 상층액을 버린 후 세포를 PBS에 부유시켜 샘플수 만큼 1x105 cell을 분주하였다. 각 웰(well)에 항체(R-phycoerythrin-conjugated mouse anti-human monoclonal antibody)를 넣고, 얼음에 40분 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션후에 1000rpm으로 5분동안 원심분리하였다. 상층액을 제거한 뒤 PBS로 세척하고 1000rpm으로 5분 동안 원심분리하였다. 다시 한번, 상기 상층액 제거후 PBS로 세척하고 1000rpm에서 5분 동안 원심분리하는 과정을 반복하였다. 상층액을 제거한 후 1% 파라포름알데히드(paraformaldehyde)을 넣어서 싱글(single)화 하고, 플로우 사이토미터를 이용해 분석하였다. 그 결과, 아래에 표 1에서 나타난 바와 같이, 본 발명의 태반조직 유래 태반 줄기세포는 CD29, CD44, CD73, CD90 및 CD105에 대하여 모두 양성의 면역학적 특성을 나타내고, CD31, CD34, CD45 및 HLA-DR에 대하여 모두 음성의 면역학적 특성을 나타냄을 알 수 있었다. Placental tissue-derived pluripotent stem cells obtained in Example 3 were washed with PBS, trypsinized, and the cells were harvested and centrifuged at 1000 rpm for 5 minutes. The supernatant was discarded, washed with 5% FBS and PBS mixed, and centrifuged at 1000 rpm for 5 minutes. After discarding the supernatant, the cells were suspended in PBS and 1 × 10 5 cells were dispensed as many as the number of samples. In each well, an antibody (R-phycoerythrin-conjugated mouse anti-human monoclonal antibody) was added and incubated on ice for 40 minutes. After incubation it was centrifuged at 1000 rpm for 5 minutes. The supernatant was removed, washed with PBS and centrifuged at 1000 rpm for 5 minutes. Once again, the supernatant was removed and washed with PBS and centrifuged for 5 minutes at 1000 rpm. After the supernatant was removed, 1% paraformaldehyde was added and singled, and analyzed using a flow cytometer. As a result, as shown in Table 1 below, placental tissue-derived placental stem cells of the present invention showed positive immunological properties for CD29, CD44, CD73, CD90 and CD105, and CD31, CD34, CD45 and HLA-. It can be seen that all of the DRs showed negative immunological characteristics.

태반유래 줄기세포의 표면항원분석(FACS analysis)Surface antigen analysis of placental stem cells AntigenAntigen AD-MSCsAD-MSCs CD29CD29 ++ CD31CD31 -- CD44CD44 ++ CD90CD90 ++ CD105CD105 ++ CD34CD34 -- CD45CD45 -- CD73CD73 ++ CD34CD34 -- HLA-DRHLA-DR --

실시예 5: 태반 유래 다능성 줄기세포의 Oct4 및 SSEA발현 분석Example 5 Analysis of Oct4 and SSEA Expression in Placental Pluripotent Stem Cells

상기 실시예 3에서 수득된 태반 유래 줄기세포를 PBS로 세 번 세척하고, 4% paraformaldehyde을 함유한 PBS로 30분간 고정하였다. PBS로 세 번 세척한 후, 0.1% Triton-X100을 함유한 PBS로 10분간 침투(permeabilization)시킨다. PBS로 세 번 세척한 후, Blocking buffer (5% goat serum)를 처리하여 4 ℃에서 한 시간 동안 반응시키고, 일차항체를 함유한 Blocking buffer에 하룻밤동안 반응시킨다. PBS로 3회 세척하고, 이차항체로 암실에서 1시간동안 반응시켰다. PBS로 세 번 세척한 후, mounting하였다. 그 결과, 도 9에 나타난 바와 같이, 본 발명에 따른 분화능 줄기세포는 인간 배아 줄기세포의 마커인 Oct4와 SSEA에 대하여 양성반응을 나타내었다(도 10).Placental stem cells obtained in Example 3 were washed three times with PBS, and fixed for 30 minutes with PBS containing 4% paraformaldehyde. After washing three times with PBS, it is permeabilized with PBS containing 0.1% Triton-X100 for 10 minutes. After washing three times with PBS, the reaction was treated with Blocking buffer (5% goat serum) for 1 hour at 4 ℃, overnight to the blocking buffer containing the primary antibody. Washed three times with PBS, and reacted with a secondary antibody in the dark for 1 hour. After washing three times with PBS, it was mounted. As a result, as shown in Figure 9, the differentiating stem cells according to the present invention showed a positive response to Octa and SSEA markers of human embryonic stem cells (Fig. 10).

또한, RT-PCR을 이용하여 Oct4의 발현을 확인하였다, RT-반응은 37℃에서 50분간, 70℃에서 10분간 행하였으며, PCR-반응은 95℃에서 5분간, 그리고 95℃에서 30초/ 58℃에서 40초/72℃에서 1분으로 40회의 사이클(cycles)을 행한 후, 72℃에서 10분간 수행하였다. 그 결과, 도 9에 나타나 있는 것처럼 기저탈락막 유래 줄기세포 및 양막 유래 줄기세포의 경우 800bp에서 발현되어 있음을 확인할 수 있었다.In addition, the expression of Oct4 was confirmed using RT-PCR. RT-reaction was performed at 37 ° C. for 50 minutes, 70 ° C. for 10 minutes, and PCR-reaction was performed at 95 ° C. for 5 minutes, and at 95 ° C. for 30 seconds / 40 cycles were performed at 58 ° C. for 40 seconds / 72 ° C. for 1 minute, followed by 10 minutes at 72 ° C. As a result, as shown in Figure 9 it can be confirmed that the basal decidual-derived stem cells and amnion-derived stem cells are expressed at 800bp.

실시예 6: 태반조직 다능성 줄기세포의 근세포로의 분화Example 6: Differentiation of Placental Pluripotent Stem Cells into Myocytes

실시예 3에서 수득한 태반조직 유래 다능성 줄기세포를 10 ng/ml 피브로넥틴(fibronectin)이 코팅되어 있는 플라스크에 분주한 후 10 μM 5'-아자사이티딘(azacytidine)을 이용하여 24시간 동안 전처리를 한다. 전처리 후 SKBM 배지(Cambrex, Co.)를 이용하여 10 일 동안 배양한 후 면역 염색을 실시하였다. Placental tissue-derived pluripotent stem cells obtained in Example 3 were dispensed into 10 ng / ml fibronectin-coated flasks and pretreated for 24 hours using 10 μM 5′-azacytidine. do. After pretreatment, the cells were incubated for 10 days using SKBM medium (Cambrex, Co.), followed by immunostaining.

그 결과, 본 발명에 따른 인간 태반조직 유래 다능성 줄기세포는 근육세포의 특이항원인 미오신에 대하여 양성반응을 나타냈다. 이 결과로부터 본 발명에 따른 인간 태반조직 유래 다능성 줄기세포가 근육세포로 분화된 것을 확인할 수 있었다As a result, human placental tissue-derived pluripotent stem cells according to the present invention showed a positive response to myosin, a specific antigen of muscle cells. From these results, it was confirmed that the human placental tissue-derived pluripotent stem cells according to the present invention were differentiated into muscle cells.

실시예 7: 태반조직 다능성 줄기세포의 신경세포로의 분화Example 7: Differentiation of Placental Tissue Pluripotent Stem Cells into Neurons

실시예 3에서 수득한 태반조직 유래 다능성 줄기세포를 1mM BME 및 10% FBS 를 첨가한 DMEM 배지를 사용해 1일 동안 전배양(preincubation)하였다. 전배양 후 1% DMSO 및 100μM BHA를 함유한 신경세포 분화 유도 배지에서 신경세포로의 분화를 유도하였다. 신경분화유도 배지를 첨가하고 9일 후, 면역염색을 실시하였다. Placental tissue-derived pluripotent stem cells obtained in Example 3 were preincubated for 1 day using DMEM medium containing 1 mM BME and 10% FBS. Differentiation into neurons was induced in neuronal differentiation induction medium containing 1% DMSO and 100 μM BHA after preculture. Nine days after the addition of neuronal differentiation induction medium, immunostaining was performed.

그 결과, 본 발명에 따른 인간 태반조직 유래 다능성 줄기세포는 신경계 성상세포의 특이항원인 GFAP(glial fibrillary acidic protein)에 대하여 양성반응을 나타냈다. 이 결과로부터 본 발명에 따른 인간 태반조직 유래 다능성 줄기세포가 신경세포로 분화된 것을 확인할 수 있었다(도 6). As a result, human placental tissue-derived pluripotent stem cells according to the present invention showed a positive response to GFAP (glial fibrillary acidic protein), which is a specific antigen of neural astrocytes. From these results, it was confirmed that the human placental tissue-derived pluripotent stem cells according to the present invention were differentiated into neurons (FIG. 6).

실시예 8: 태반 유래 다능성 줄기세포의 골형성 세포로의 분화Example 8 Differentiation of Placental Pluripotent Stem Cells into Osteoblastic Cells

실시예 3에서 수득한 태반조직 유래 태반 줄기세포를 골형성 유도 배지 (0.1 μmol/L dexamethasone, 0.05 mmol/L ascorbic acid-2- phosphate, 및 10 mmol/L beta-glycophsphate, 5 ~ 30 % 인간 혈청 또는 플라즈마)에 희석하여 세포수를 센 다음, 플라스크에서 배양 (5% CO2, 37, 배지는 3 ~4일에 한번씩 교체)하여 골형성 세포로 분화를 유도하였다. 배양 시작 후 14일때 Alizalin red S 염색법을 이용하여 태반 유래 다능성 줄기세포가 골형성 세포로 분화되었음을 확인하였다 (도 7).Placental tissue-derived placental stem cells obtained in Example 3 were subjected to bone formation induction medium (0.1 μmol / L dexamethasone, 0.05 mmol / L ascorbic acid-2-phosphate, and 10 mmol / L beta-glycophsphate, 5-30% human serum). Or dilution in plasma) to count the cells, and then cultured in flasks (5% CO 2, 37, replacing the medium once every 3-4 days) to induce differentiation into osteogenic cells. At 14 days after the start of the culture, it was confirmed that the placental-derived pluripotent stem cells were differentiated into osteogenic cells using Alizalin red S staining (FIG. 7).

실시예 9: 태반조직 다능성 줄기세포의 지방세포로의 분화Example 9 Differentiation of Placental Tissue Pluripotent Stem Cells into Adipocytes

실시예 3에서 수득한 태반조직 유래 다능성 줄기세포를 5% FBS, 1μM Dexamethasone, 200μM Indomethacin, 10㎍/㎕ Insulin, 0.5mM IBMX(3-isobutyl-1-methylxanthine)을 함유한 α-MEM 배지에서 2주 동안 배양하여 다능성 줄기세포의 지방세포로의 분화를 유도하고, Oil red O 염색법을 이용하여 분석하였다. 그 결과, 본 발명에 따른 인간 태반 조직 유래 다능성 줄기세포가 지방세포로 분화된 것을 확인할 수 있었다(도 8).Placental tissue-derived pluripotent stem cells obtained in Example 3 were prepared in α-MEM medium containing 5% FBS, 1 μM Dexamethasone, 200 μM Indomethacin, 10 μg / μL Insulin, and 0.5 mM IBMX (3-isobutyl-1-methylxanthine). Cultured for 2 weeks to induce differentiation of pluripotent stem cells into adipocytes, and analyzed using Oil red O staining method. As a result, it was confirmed that the human placental tissue-derived pluripotent stem cells according to the present invention were differentiated into adipocytes (FIG. 8).

이상 상세히 기술한 바와 같이, 본 발명에 따른 태반 조직을 이용한 태반 줄기세포의 제조방법은 기존의 다른 조직으로부터 줄기세포를 제조하는 것과 비교해서, 더 효율적으로 생산할 수 있고, 본 발명에 따른 다능성 줄기세포는 근세포, 혈관내피세포, 골형성 세포, 신경세포, 성상세포, 지방세포, 연골형성 세포, 골형성 세포, 또는 인슐린 분비 췌장 베타세포 등으로 분화하는 능력을 가지고 있어, 간경변, 골다공증, 골관절염, 신경질환, 당뇨병 등의 치료에 효과적이고, 유방 조직 형성에 유용하다. As described above in detail, the method for producing placental stem cells using placental tissue according to the present invention can be produced more efficiently, compared to the production of stem cells from other existing tissues, and the pluripotent stem according to the present invention. The cells have the ability to differentiate into myocytes, vascular endothelial cells, osteoblasts, neurons, astrocytes, adipocytes, chondrocytes, osteoblasts, or insulin-secreting pancreatic beta cells, and thus, cirrhosis, osteoporosis, osteoarthritis, It is effective in the treatment of neurological diseases, diabetes and the like, and useful for forming breast tissue.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.Having described the specific part of the present invention in detail, it is obvious to those skilled in the art that such a specific description is only a preferred embodiment, thereby not limiting the scope of the present invention. something to do. Thus, the substantial scope of the present invention will be defined by the appended claims and their equivalents.

Claims (21)

인간 태반 조직의 양막, 장막, 기저탈락막 또는 태반 조직을 bFGF함유 배지에서 배양한 다음 회수하는 것을 특징으로 하는, 다음과 같은 특성을 나타내는 성체 줄기세포의 제조방법:: A method for the preparation of adult stem cells having the following characteristics, characterized in that the amnion, membranes, basal decidual membranes or placental tissues of human placental tissues are cultured in bFGF-containing medium and then recovered. (a) CD29, CD44, CD54, CD73, CD90 및 CD105에 대하여 모두 양성의 면역학적 특성을 나타내고, CD31, CD34, CD45 및 HLA-DR에 대하여 모두 음성의 면역학적 특성을 나타냄;(a) all showed positive immunological properties for CD29, CD44, CD54, CD73, CD90 and CD105 and all negative immunological properties for CD31, CD34, CD45 and HLA-DR; (b) Oct4 및 SSEA4에 대하여 양성의 면역학적 특성을 나타냄;(b) exhibits positive immunological properties for Oct4 and SSEA4; (c) 플라스틱에 부착되어 성장하며, 둥근형태(round-shape) 또는 선형태(spindle-shape)의 형태학적 특성을 나타내고, SFM 배지에서 스피어(sphere)를 형성하여 미분화 상태로 유지됨; 및 (c) adheres to plastic and grows, exhibits morphological characteristics of round-shape or spine-shape, and forms spheres in SFM medium to remain undifferentiated; And (d) 중배엽 또는 외배엽 유래 세포로 분화하는 능력을 가짐.(d) Has the ability to differentiate into mesoderm or ectoderm derived cells. 제1항의 방법에 의해 수득한, 다음과 같은 특성을 나타내는 태반 줄기세포: Placental stem cells obtained by the method of claim 1 having the following characteristics: (a) CD29, CD44, CD73, CD90 및 CD105에 대하여 모두 양성의 면역학적 특성을 나타내고, CD31, CD34, CD45 및 HLA-DR에 대하여 모두 음성의 면역학적 특성을 나타냄;(a) all positive immunological properties for CD29, CD44, CD73, CD90 and CD105, and all negative immunological properties for CD31, CD34, CD45 and HLA-DR; (b) Oct4 및 SSEA4에 대하여 양성의 면역학적 특성을 나타냄;(b) exhibits positive immunological properties for Oct4 and SSEA4; (c) 플라스틱에 부착되어 성장하며, 둥근형태(round-shape) 또는 선형태(spindle-shape)의 형태학적 특성을 나타내고, SFM 배지에서 스피어(sphere)를 형성하여 미분화 상태로 유지됨; 및 (c) adheres to plastic and grows, exhibits morphological characteristics of round-shape or spine-shape, and forms spheres in SFM medium to remain undifferentiated; And (d) 중배엽 또는 외배엽 유래 세포로 분화하는 능력을 가짐.(d) Has the ability to differentiate into mesoderm or ectoderm derived cells. 제2항에 있어서, 상기 중배엽 유래 세포는 골형성 세포, 연골세포, 근세포 또는 지방세포이고, 외배엽 유래 세포는 신경세포인 것을 특징으로 하는 태반 줄기세포. The placental stem cell according to claim 2, wherein the mesoderm-derived cells are osteoblasts, chondrocytes, myocytes or adipocytes, and the ectoderm-derived cells are neurons. 제2항의 태반 줄기세포를 하루 동안 아자사이티딘(azacytidine)을 전처리 한 후 SKBM 배지에서 배양하는 것을 특징으로 하는, 태반 줄기세포를 근세포로 분화시키는 방법.The method of differentiating placental stem cells into muscle cells, characterized in that the placental stem cells of claim 2 are pretreated with azacytidine for one day and then cultured in SKBM medium. 제4항의 방법에 의해 분화된 근세포를 유효성분으로 함유하는 근질환 치료용 세포 치료제.A cell therapeutic agent for the treatment of muscle diseases containing myocytes differentiated by the method of claim 4 as an active ingredient. 다음의 단계를 포함하는, 태반 줄기세포를 신경세포로 분화시키는 방법:A method of differentiating placental stem cells into neurons, comprising the following steps: (a) 제2항의 태반 줄기세포를 BME 및 FBS를 함유한 DMEM 배지에 전배양 하는 단계; 및(a) pre-culture of placental stem cells of claim 2 in DMEM medium containing BME and FBS; And (b) 상기 전배양액을 DMSO 및 BHA로 처리하여 신경분화를 유도하는 단계. (b) treating the preculture with DMSO and BHA to induce neuronal differentiation. 제6항의 방법에 의해 분화된 신경세포를 유효성분으로 함유하는 신경질환 치료용 세포 치료제.A cell therapeutic agent for the treatment of neurological diseases, comprising as an active ingredient neurons differentiated by the method of claim 6. 제2항의 태반 줄기세포를 TCP(Tricalcium phosphate)와 혼합하여 이소이식하는 것을 특징으로 하는, 태반 줄기세포를 골형성 세포로 분화시키는 방법.Placental stem cells of claim 2 is mixed with TCP (Tricalcium phosphate) is characterized in that the transplantation, placental stem cells differentiation into osteoblasts. 제8항의 방법에 의해 분화된 골형성세포를 유효성분으로 함유하는 골다공증 치료용 세포 치료제.Cell therapy for osteoporosis treatment containing osteogenic cells differentiated by the method of claim 8 as an active ingredient. 제2항의 태반 줄기세포를 덱사메타손(dexamethasone), 인도메타신(indomethacin), 인슐린 및 IBMX를 함유한 α-MEM배지에서 배양하는 것을 특징으 로 하는, 태반 줄기세포를 지방세포로 분화시키는 방법.The method of differentiating placental stem cells into adipocytes, wherein the placental stem cells of claim 2 are cultured in an α-MEM medium containing dexamethasone, indomethacin, insulin and IBMX. 제10항의 방법에 의해 분화된 지방세포를 유효성분으로 함유하는 유방 조직 형성용 세포 치료제.A cell therapeutic agent for forming breast tissue, comprising the adipocytes differentiated by the method of claim 10 as an active ingredient. 삭제delete 삭제delete 삭제delete 삭제delete 근세포로 분화되는 특성을 가지는 제2항의 태반 줄기세포를 유효성분으로 함유하는 근질환 치료용 세포 치료제.A cell therapeutic agent for the treatment of muscle diseases containing placental stem cells of claim 2, which has the property of differentiating into muscle cells. 신경세포로 분화되는 특성을 가지는 제2항의 태반 줄기세포를 유효성분으로 함유하는 신경질환 치료용 세포 치료제.Cell therapy agent for the treatment of neurological diseases, comprising placental stem cells of claim 2 having the characteristics of differentiating into nerve cells as an active ingredient. 연골세포로 분화되는 특성을 가지는 제2항의 태반 줄기세포를 유효성분으로 함유하는 골관절염 치료용 세포 치료제.Cell therapy for osteoarthritis, comprising placental stem cells of claim 2 having the characteristics of differentiating into chondrocytes as an active ingredient. 골형성 세포로 분화되는 특성을 가지는 제2항의 태반 줄기세포를 유효성분으 로 함유하는 골다공증 치료용 세포 치료제.A cell therapeutic agent for treating osteoporosis, comprising the placental stem cell of claim 2 as an active ingredient having the property of differentiating into osteogenic cells. 지방세포로 분화되는 특성을 가지는 제2항의 태반 줄기세포를 유효성분으로 함유하는 유방 조직 형성용 세포 치료제.A cell therapeutic agent for forming breast tissue, comprising the placental stem cell of claim 2, which has the property of differentiating into adipocytes, as an active ingredient. 삭제delete
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