KR100871984B1 - Multipotent Stem Cell Derived from Placenta Tissue and Cellular Therapeutic Agents Comprising the Same - Google Patents

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KR100871984B1
KR100871984B1 KR20070007139A KR20070007139A KR100871984B1 KR 100871984 B1 KR100871984 B1 KR 100871984B1 KR 20070007139 A KR20070007139 A KR 20070007139A KR 20070007139 A KR20070007139 A KR 20070007139A KR 100871984 B1 KR100871984 B1 KR 100871984B1
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김봉휘
김효은
라정찬
박한나
우상규
이항영
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주식회사 알앤엘바이오
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Abstract

본 발명은 태반 조직 유래 다능성 줄기세포 및 이를 함유하는 세포치료제에 관한 것으로, 보다 구체적으로는, 세절한 양막, 장막, 기저탈락막 또는 태반 조직을 bFGF 함유 배지에서 배양한 다음 회수하는 것을 특징으로 하는, (a) CD29, CD44, CD73, CD90 및 CD105에 대하여 모두 양성의 면역학적 특성을 나타내고, CD31, CD34, CD45 및 HLA-DR에 대하여 모두 음성의 면역학적 특성을 나타냄; The present invention is a placental derived pluripotent stem cells, and relates to a cell therapeutic agent containing the same, and more specifically, the three appropriate membranes, tents, basal decidua or placental tissue is characterized in that the following number of cultured in bFGF-containing medium to, (a) CD29, CD44, CD73, CD90 and CD105 with respect to both indicate the immunological properties of the positive, CD31, CD34, CD45, and both with respect to the HLA-DR represents the immunological characteristics of the voice; (b) Oct4 및 SSEA4에 대하여 양성의 면역학적 특성을 나타냄; (B) represents the immunological properties of the positive for Oct4 and SSEA4; (c) 플라스틱에 부착되어 성장하며, 둥근형태(round-shape) 또는 선형태(spindle-shape)의 형태학적 특성을 나타내고, SFM 배지(sphere-forming medium)에서 스피어(sphere)를 형성하여 미분화 상태로 장기간 유지가 가능함; (C) is attached to the plastic growth, round shape (round-shape), or represents a morphological characteristic of a line shape (spindle-shape), SFM medium (sphere-forming medium) undifferentiated state to form a sphere (sphere) from long-term maintenance is possible to; 및 (d) 중배엽, 내배엽 및 외배엽 유래 세포로 분화하는 능력을 가지는 태반 줄기세포의 제조 방법 및 수득된 태반 줄기세포에 관한 것이다. And (d) relates to the mesoderm, endoderm, and the placental stem cells, obtained in the production method and ectoderm placental stem cells having the ability to differentiate into cells derived. 본 발명에 따른 다능성 줄기세포는 근세포, 혈관내피세포, 골형성 세포, 신경세포, 성상세포, 지방세포, 연골형성 세포, 골형성 세포, 또는 인슐린 분비 췌장 베타세포로 분화하는 능력을 가지고 있어, 근질환, 골다공증, 골관절염, 신경질환, 당뇨병 등의 치료에 효과적이고, 유방 조직 형성에 유용하다. Pluripotent stem cells are according to the invention has got the ability to differentiate into muscle cells, vascular endothelial cells, osteogenic cells, nerve cells, astrocytes, fat cells, cartilage forming cells, osteogenic cells, or insulin-secreting pancreatic beta cells, effect on muscle diseases, osteoporosis, treatment of osteoarthritis, neurological diseases, diabetes, and is useful in the formation of breast tissue.
태반 조직, 태반 줄기세포, 분화, 세포치료제 Placental tissue, placental stem cells, differentiation, cell therapy

Description

태반 조직 유래 다능성 줄기세포 및 이를 함유하는 세포치료제 {Multipotent Stem Cell Derived from Placenta Tissue and Cellular Therapeutic Agents Comprising the Same} Placenta-derived multipotent stem cells and cell therapy containing the same {Multipotent Stem Cell Derived from Placenta Tissue and Cellular Therapeutic Agents Comprising the Same}

도 1은 태반 유래 중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cell, MSC)의 형태(morphology)에 대한 현미경 사진이다. Figure 1 is a photomicrograph of the shape (morphology) of placenta-derived mesenchymal stem cells (mesenchymal stem cell, MSC).

도 2는 유세포 분석기(FACS)를 이용하여 기저탈락막 유래 MSC의 표면항원들을 분석한 결과이다. Figure 2 shows the results of using a flow cytometer (FACS) analysis of basal decidual surface antigen derived from the MSC.

도 3은 유세포 분석기(FACS)를 이용하여 양막 유래 MSC의 표면항원들을 분석한 결과이다. Figure 3 shows the result of analyzing the surface antigens of the amnion-derived MSC using a flow cytometer (FACS).

도 4의 A는 SFM배지에서 3일간 배양한 1계대째 양막의 스피어 형성사진이고, B는 SFM배지에서 7일간 배양한 1계대째 기저탈락막의 스피어 형성사진이다. A of Fig. 4 is a three days spheres of first-generation of membranes were incubated in a picture forming SFM medium, B is a seven days a first-generation base film dropped spheres cultured in SFM medium formed picture.

도 5는 근세포로의 분화(Myogenesis)에 있어서, MM-3160배지(근육세포 분화용 SKBM 배지)에서 10일간 유도한 양막(A) 및 기저탈락막(B) 유래 줄기세포에 대한 면역조직화학검사(αMyosin-FITC)의 현미경 사진이다 Figure 5 is a, MM-3160 medium (muscle cells SKBM medium for differentiation) 10 days induced amniotic membrane (A) and basal decidua (B) immunohistochemistry on-derived stem cells in the differentiation of muscle cells (Myogenesis) a photomicrograph of a (αMyosin-FITC)

도 6은 신경세포로의 분화(Neurogenesis)에 있어서, DMEM배지 및 NM3229배지(신경세포 분화용 배지)에서 10일간 유도한 양막(A) 및 기저탈락막(B) 유래 줄기세포에 대한 면역조직화학검사(αGFAP-FITC)의 현미경 사진이다. 6 is in the differentiation (Neurogenesis) of a nerve cell, DMEM medium and NM3229 medium induced 10 days (for neuronal differentiation medium) the amnion (A) and basal decidua (B) Immunohistochemistry for Derived Stem Cells inspection of a photomicrograph (αGFAP-FITC).

도 7은 골세포로의 분화(Osteogenesis)에 있어서, 양막(B) 및 기저탈락막(C) 유래 줄기세포에 대하여 Alizarin red S염색법으로 염색한 사진이다[A:대조군; Figure 7 is in the differentiation (Osteogenesis) to the bone cells, amniotic membrane (B) and a picture stained by Alizarin red S staining with respect to the base decidua (C) derived stem cells [A: control group; B:골세포 분화조건 하의 양막 유래 줄기세포; B: bone cells derived from amniotic stem cells under differentiation conditions; C:골세포 분화조건 하의 기저탈락막 유래 줄기세포]. C: basal decidua-derived stem cells under osteogenic differentiation conditions.

도 8은 지방조직세포로의 분화(Adipogenesis)에 있어서, 양막(B) 및 기저탈락막(A) 유래 줄기세포에 대하여 Oil red O 염색법로 염색한 사진이다 8 is in the differentiation (Adipogenesis) to the fat tissue, amnion (B) and basal decidua (A) is a picture stained with Oil red O staining method with respect to stem cells derived from

도 9는 OCT4에 대한 RT-PCR결과이다[레인 1:마커; 9 is an RT-PCR results for OCT4 [lane 1: marker; 레인 2: RT-reaction control; Lane 2: RT-reaction control; 레인 3: 양막 줄기세포; Lane 3: amniotic stem cells; 레인 4:기저탈락막 줄기세포; Lane 4: decidua basal stem cells; 레인 5:PCR-reaction control]. Lane 5: PCR-reaction control].

도 10은 각각에 표기된 특정 항체를 이용한 면역조직화학검사 결과사진이다[A:OCT4; 10 is an immunohistochemistry using a specific antibody resulting picture displayed on the respective [A: OCT4; B:SSEA4; B: SSEA4; C:CD44, CD54 및 대조군]. C: CD44, CD54 and control groups.

도 11은 기저탈락막 유래 줄기세포에 대한 계대수에 따른 축적집단 배가정도(cumulative population doubling level, CPDL)를 나타낸 그래프이다. Figure 11 is a graph showing the accumulated group doubled degree (cumulative population doubling level, CPDL) corresponding to the number of passages for the underlying decidua derived stem cells.

도 12는 양막 유래 줄기세포에 대한 계대수에 따른 축적집단 배가정도(CPDL)를 나타낸 그래프이다. 12 is a graph corresponding to the number of times the accumulated group of passages for amnion-derived stem cells showing a level (CPDL).

본 발명은 태반 조직 유래 다능성 줄기세포 및 이를 함유하는 세포치료제에 관한 것으로, 본 발명은 (a) CD29, CD44, CD73, CD90 및 CD105에 대하여 모두 양성의 면역학적 특성을 나타내고, CD31, CD34, CD45 및 HLA-DR에 대하여 모두 음성의 면역학적 특성을 나타냄; The present invention relates to a cell therapeutic agent containing placental derived pluripotent stem cells, and this, the present invention comprises (a) both with respect to CD29, CD44, CD73, CD90 and CD105 represent the immunological properties of the positive, CD31, CD34, CD45 and HLA-DR with respect to both indicate the immunological characteristics of the voice; (b) Oct4 및 SSEA4에 대하여 양성의 면역학적 특성을 나타냄; (B) represents the immunological properties of the positive for Oct4 and SSEA4; (c) 플라스틱에 부착되어 성장하며, 둥근형태(round-shape) 또는 선형태(spindle-shape)의 형태학적 특성을 나타내고, SFM 배지에서 스피어(sphere)를 형성하여 미분화 상태로 장기간 유지가 가능함; (C) is attached to the plastic growth, show the morphological characteristics of the round (round-shape) or a line shape (spindle-shape), to form a sphere (sphere) in SFM medium a long-term maintenance is possible in undifferentiated state; 및 (d) 중배엽, 내배엽 및 외배엽 유래 세포로 분화하는 능력을 가지는 특성을 나타내는 태반 줄기세포에 관한 것이다. And (d) relates to a placental stem cells showing the characteristics having the ability to differentiate into mesoderm, endoderm and ectoderm-derived cells.

21세기의 생명공학은 인간복지를 최종목표로 식량, 환경, 건강 문제에 새로운 해결책의 가능성을 제시하고 있으며, 최근에 줄기세포의 이용기술은 난치병 치료의 새로운 장으로 떠오르고 있다. Biotechnology in the 21st century has presented the possibility of new solutions to the food, the environment, health human welfare as the ultimate goal, recently the use of stem cell technology has emerged as a new chapter in the treatment of incurable diseases. 이전까지는 인간의 난치병 치료를 위해 장기이식이나 유전자 치료 등이 제시되었으나, 면역거부와 공급 장기 부족, 벡터개발이나 질환유전자에 대한 지식부족으로 효율적인 실용화가 미진하였다. Previously been suggested, such as organ transplantation or gene therapy to treat incurable diseases in humans, the effective commercialization was secluded to a lack of knowledge about immune rejection and long-term supply shortages, vector development or genetic diseases.

이에 줄기세포연구에 대한 관심이 고조되어, 증식과 분화를 통해 모든 기관을 형성할 능력을 가진 만능 줄기세포가 대부분의 질병 치료는 물론 장기 훼손을 근원적으로 해결할 수 있는 것으로 인식되었다. The stem cells heightened interest in the study, it was recognized that the pluripotent stem cells with the ability to form all the organs through the proliferation and differentiation can be fundamental to solve most of the diseases as well as long-term damage. 또한, 많은 과학자가 인체의 거의 모든 장기 재생은 물론 난치병이었던 파킨슨병, 각종 암, 당뇨병과 척수손상등의 치료에 이르기까지 다양하게 줄기세포의 적용 가능성을 제시해 왔다. In addition, many scientists have presented the possibility of applying a wide variety, ranging from the treatment of almost every organ of the human body, as well as play was incurable Parkinson's disease, various cancers, diabetes and spinal cord injury stem cells.

줄기세포(stem cell)란 자기 복제 능력을 가지면서 두 개 이상의 세포로 분화하는 능력을 갖는 세포를 말하며, 만능 줄기세포(totipotent stem cell), 전능성(전분화능) 줄기세포(pluripotent stem cells), 다능성(다분화능) 줄기세포(multipotent stem cells)로 분류할 수 있다. Stem cells (stem cell) is magnetic while having the ability to replicate refers to cells having the ability to differentiate into at least two cells, pluripotent stem cells (totipotent stem cell), omnipotence (all multipotent) stem cells (pluripotent stem cells) is, functional (C multipotential) can be broken down into stem cells (multipotent stem cells).

만능 줄기세포(totipotent stem cells)는 하나의 완전한 개체로 발생해 나갈 수 있는 만능의 성질을 가진 세포로 난자와 정자의 수정 이후 8세포기까지의 세포가 이러한 성질을 가지며 이 세포를 분리하여 자궁에 이식하면 하나의 완전한 개체로 발생해 나갈 수 있다. Pluripotent stem cells (totipotent stem cells) are in the womb and has an up to the cell with the versatile that you can continue to occur as a complete object properties after the modification of the egg and sperm 8 three cells of these properties separate the two cells If the transplant may continue to occur as one complete object. 전분화능 줄기세포(pluripotent stem cells)는 외배엽, 중배엽, 내배엽층 유래의 다양한 세포와 조직으로 발생할 수 있는 세포로서, 수정 4-5일 후 나타나는 배반포(blastocyst)의 안쪽에 위치한 내세포괴(inner cell mass)에서 유래하며, 이를 배아 줄기 세포라 하며 다양한 다른 조직 세포로 분화되지만 새로운 생명체를 형성하지는 못한다. I multipotential stem cells (pluripotent stem cells) are located within the cell mass on the inside of the ectoderm, mesoderm, as a cell that can occur in a variety of cells and tissues of endodermal layer derived from the blastocyst (blastocyst) that appears after a modification 4 to 5 (inner cell mass ), and derived from, Sephora, but it stem and differentiate into various other tissue cells do not form a new organism. 다능성(다능성) 줄기세포(multipotent stem cells)는 이 세포가 포함되어 있는 조직 및 기관을 형성하는 특이적인 세포로만 분화할 수 있는 줄기세포이다. Multipotent (pluripotent) stem cells (multipotent stem cells) are stem cells capable of differentiating only specific cells to form the tissues and organs containing these cells.

다능성 줄기세포는 성체 골수에서 최초로 분리되었고(Y. Jiang et al., Nature , 418:41, 2002), 그 후 다른 여러 성체 조직에서도 확인되었다(CM Verfaillie, Trends Cell Biol. , 12:502, 2002). Pluripotent stem cells were first isolated from adult marrow (Y. Jiang et al, Nature, 418:. 41, 2002), it has since been confirmed in several other adult tissues (CM Verfaillie, Trends Cell Biol, 12:. 502, 2002). 다시 말해, 골수는 가장 널리 알려진 줄기 세포의 소스이지만, 다능성 줄기세포는 피부, 혈관, 근육 및 뇌로부터도 확인되었다(JG Toma et al., Nat. Cell Biol ., 3:778, 2001; M. Sampaolesi et al, Science , 301:487, 2003; Y. Jiang et al., Exp. Hematol. , 30:896, 2002). In other words, the bone marrow is, but the source of the stem cells, the most widely known pluripotent stem cells has been confirmed also from the skin, blood vessels, muscles and brain (JG Toma et al, Nat Cell Biol, 3:... 778, 2001; M . Sampaolesi et al, Science, 301 : 487, 2003; Y. Jiang et al, Exp Hematol, 30:... 896, 2002). 그 러나, 골수와 같은 성체 조직내의 줄기 세포는 매우 드물게 존재하고, 이러한 세포들은 분화유도 하지 않고 배양하기 어려워서, 특이적으로 스크린된 배지들이 없으면 그 세포들을 배양하기 어렵다. However, stem cells in adult tissues such as bone marrow and is rarely present, these cells are difficult to culture without inducing differentiation, unless they screened medium specifically difficult to culture those cells. 즉, 줄기 세포들을 분리하여 체외에서 보존하기가 매우 어렵다는 단점이 있다. That is, by separating the stem cells, there is a drawback is very difficult to preserve in vitro.

이에 대해, 최근, 지방 조직이 다능성 줄기세포의 새로운 소스임이 밝혀졌다(B.Cousin et al., BBRC ., 301:1016, 2003; A. Miranville et al., Circulation, 110:349, 2004; S. Gronthos et al., J. Cell Physiol ., 189:54, 2001; MJSeo et al., BBRC ., 328:258, 2005). In recent years, the local organization is to be a new source of pluripotent stem cells has been found (B.Cousin et al, BBRC, 301 against: 1016, 2003; A. Miranville et al, Circulation, 110:... 349, 2004; S. Gronthos et al, J. Cell Physiol , 189:.. 54, 2001; MJSeo et al, BBRC, 328:.. 258, 2005). 즉, 지방흡입(liposuction)에 의해 얻어진 인간 지방조직에 미분화 세포군이 포함되어 있고, 이것은 in vitro상에서 지방세포, 골형성세포, 근원세포 및 연골모세포로의 분화능을 갖는 세포라는 사실이 보고되었다(PAZuk et al., Tissue Eng. , 7:211, 2001; AM Rodriguez et al., BBRC ., 315:255, 2004). That is, the liposuction include undifferentiated human adipose tissue obtained by (liposuction) cell population, which was reported by the fact that cells with multipotential to the fat cells, osteogenic cells, the origin cells, and cartilage cells on in vitro (PAZuk et al, Tissue Eng, 7: 211, 2001; AM Rodriguez et al, BBRC, 315:.... 255, 2004). 이러한 지방 조직은 대량으로 추출할 수 있다는 장점이 있어, 기존의 단점을 보완하는 새로운 줄기세포의 소스로 주목받고 있는 것이다. These local organizations have the advantage of being able to extract a large amount, but that is attracting attention as a new source of stem cells that complement the existing shortcomings. 또한, 최근 연구에서는 지방 조직 유래 세포가 근육 재생능 및 신경혈관분화를 촉진하는 능력이 있음이 동물 모델 실험을 통하여 알려짐으로써, 줄기세포의 새로운 소스로서 두각을 나타내고 있다. In addition, recent research shows stand out as a new source of known that the ability of adipose tissue-derived cells to promote muscle regeneration capacity and neurovascular differentiation through animal model experiments, stem cells.

최근 이러한 인간 줄기세포의 동정, 격리 및 발생에 대한 관심이 크다. Recently great interest in this identification, isolation and generation of human stem cells. 인간 줄기세포는 다양한 성인 세포 계통을 발생시킬 수 있는 전능성(totipotential) 또는 만능성(pluripotential) 전구체 세포이다. Human stem cells are capable of generating various omnipotence of adult cell lines (totipotential) or universal Province (pluripotential) precursor cells. 이 능력은 기관 및 조직 발달에 필요한 세포의 분화와 특수화를 위한 기초로서 작용한다. This ability to act as a basis for differentiation and specialization of cells required for organ and tissue development. 최근, 이러한 줄기세포 이식 이 성공함에 따라, 질환, 독성 화학물질 및/또는 방사선으로의 노출로 인한 골융해(myeloablation) 이후 골수를 재구성하고/하거나 보충하는 신규한 임상 도구가 제공되었다. Recently, it was providing a new clinical tool for reconstructing after bone marrow and / or supplement bone fusion (myeloablation) due to exposure to diseases, toxic chemicals and / or radiation such as stem cell transplant is successful. 줄기세포가 다수의 조직을 모두는 아니지만 재증식시키고 생리학적 및 해부학적 기능을 회복시키는데 사용될 수 있음을 입증하는 추가의 증거가 존재한다. The number of stem cells, both proliferation and re-organization, but there is additional evidence that proves that it can be used to restore the physiological and anatomical features. 또한, 조직 공학, 유전자 치료 분만 및 세포 치료제에서의 줄기세포의 적용이 급속도로 진행되고 있다. In addition, the application of tissue engineering, gene therapy delivery, and cell stem cells in drug has been going on at a rapid pace. 따라서 현재 당업계에서는 줄기세포에 대한 관심이 증대되면서, 다양한 조직으로부터 줄기세포의 개발 및 제조가 절실히 요구되고 있는 상황이다. Therefore, as per the current industry increased interest in stem cells, a situation which is the urgent need for the development and production of stem cells from various tissues.

이에 본 발명자들은 다양한 조직에서 줄기세포를 제조하고자 예의 노력한 결과, 태반 조직을 이용하여 태반 줄기 세포를 제조하는 경우, 기존의 지방 조직을 이용하여 줄기세포를 제조하는 것과 비교해서, 이하와 같은 면역학적 더 효율적으로 생산할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다. The present inventors have found that to prepare stem cells in various tissues example efforts result, in the case of producing a placental stem cells using placental tissue, immune, such as compared with that by using the existing adipose tissue production of stem cells, and less chemical verify that you can produce more efficiently and thereby completing the present invention.

본 발명의 목적은 세절한 양막, 장막, 기저탈락막 또는 태반 조직을 bFGF(Basic Fibroblast Growth Factor) 함유 배지에서 배양한 다음 회수하는 것을 특징으로 하는, (a) CD29, CD44, CD73, CD90 및 CD105에 대하여 모두 양성의 면역학적 특성을 나타내고, CD31, CD34, CD45 및 HLA-DR에 대하여 모두 음성의 면역학적 특성을 나타냄; An object of the present invention is characterized by the following recovery culture at three appropriate membranes, tents, containing the basal decidua or placental tissue bFGF (Basic Fibroblast Growth Factor) medium, (a) CD29, CD44, CD73, CD90 and CD105 in respect both represents the immunological properties of the positive, CD31, CD34, CD45, and both with respect to the HLA-DR represents the immunological characteristics of the voice; (b) Oct4 및 SSEA4에 대하여 양성의 면역학적 특성을 나타냄; (B) represents the immunological properties of the positive for Oct4 and SSEA4; (c) 플라스틱에 부착되어 성장하며, 둥근형태(round-shape) 또는 선형태(spindle- shape)의 형태학적 특성을 나타내고, SFM 배지에서 스피어(sphere)를 형성하여 미분화 상태로 장기간 유지가 가능함; (C) is attached to the plastic growth, round shape (round-shape), or the line shape represents a morphological characteristic of the (spindle- shape), to form a sphere (sphere) in SFM medium is available as long-term maintenance undifferentiated state; 및 (d) 중배엽, 내배엽 및 외배엽 유래 세포로 분화하는 능력을 가지는 태반 줄기세포의 제조 방법 및 수득된 태반 줄기세포를 제공하는데 있다. And (d) to provide the mesoderm, endoderm and ectoderm production method of placental stem cells having the ability to differentiate into cells derived from placenta, and the resultant stem cells.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 다능성 태반 줄기세포로부터 근세포, 신경세포, 골형성 세포, 지방조직세포, 연골 세포 및 췌장 베타세포로의 분화방법 및 상기 분화된 세포 또는 상기 태반 줄기세포를 함유하는 골관절염, 골다공증 및 당뇨병 등의 치료용 세포치료제와 유방 조직 형성용 세포 치료제를 제공하는데 있다. From a further object of the present invention is the multi-functional placental stem cells, muscle cells, nerve cells, osteogenic cells, fat tissue cells, cartilage cells, and methods differentiation of pancreatic beta cells and containing said differentiated cells or said placental stem cells to provide an osteoarthritis, osteoporosis, and for cell therapy and for the treatment of breast tissue, such as diabetes form of cell therapy.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 세절한 양막, 장막, 기저탈락막 또는 태반 조직을 콜라게나아제 및 bFGF 함유 배지에서 배양한 다음 회수하는 단계를 포함하는, (a) CD29, CD44, CD73, CD90 및 CD105에 대하여 모두 양성의 면역학적 특성을 나타내고, CD31, CD34, CD45 및 HLA-DR에 대하여 모두 음성의 면역학적 특성을 나타냄; In order to achieve the above object, the present invention provides three appropriate membranes, tents, cultured in basal decidua or containing placental tissue collagenase and bFGF medium, and then a step of recovering, (a) CD29, CD44, CD73, all against CD90 and CD105 represent the immunological properties of the positive, CD31, CD34, CD45, and both with respect to the HLA-DR represents the immunological characteristics of the voice; (b) Oct4 및 SSEA4에 대하여 양성의 면역학적 특성을 나타냄; (B) represents the immunological properties of the positive for Oct4 and SSEA4; (c) 플라스틱에 부착되어 성장하며, 둥근형태(round-shape) 또는 선형태(spindle-shape)의 형태학적 특성을 나타내고, SFM 배지에서 스피어(sphere)를 형성하여 미분화 상태로 장기간 유지가 가능함; (C) is attached to the plastic growth, show the morphological characteristics of the round (round-shape) or a line shape (spindle-shape), to form a sphere (sphere) in SFM medium a long-term maintenance is possible in undifferentiated state; 및 (d) 중배엽, 내배엽 및 외배엽 유래 세포로 분화하는 능력을 가지는 특성을 나타내는 태반 줄기세포의 제조방법 및 이에 의해 수득되는 태반 줄기세포를 제공한다. And (d) the mesoderm, endoderm, and manufacturing method of the placental stem cells showing the characteristics having the ability to differentiate into ectoderm-derived cells, and placental stem cells obtained by this.

또한, 상기의 수득된 태반 줄기 세포로부터, 근세포, 골형성 세포, 신경세포, 지방세포, 연골세포 또는 췌장 베타세포로 분화시키는 방법을 제공한다. It also provides a method of differentiating into from the placenta of the obtained stem cells, muscle cells, osteogenic cells, nerve cells, fat cells, cartilage cells or pancreatic beta cells.

또한, 본 발명은 상기의 수득된 태반 줄기 세포 또는 이로부터 분화된 세포를 유효 성분으로 함유하는 세포치료제를 제공한다. Further, the present invention provides a cell therapeutic agent containing the cell differentiation from a placental stem cell, or which give the above, as an active ingredient.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다. Hereinafter, the present invention will be described in detail.

1. 용어의 정의 1. Definitions

본 발명에서 사용된 용어 '태반 줄기세포'는 포배낭의 내부 세포 덩어리로부터 유도되지 않은 세포를 지칭한다. The term "placental stem cell" as used herein refers to a cell that is not derived from the inner cell mass of the backpack fabric. 태반으로부터 수득될 수 있는 줄기세포는 태반 줄기세포, 만능성 세포, 다능성 세포 및 수임 전구(progenitor) 세포를 포함한다. Stem cells that can be obtained from the placenta include placental stem cells, all-purpose sex cells, pluripotent cells, and ordination bulb (progenitor) cells.

본 발명에서 사용된 용어 '다능성 세포'는 포유류 신체의 약 260개 세포 유형의 임의의 하위세트로의 성장능력을 갖는 세포를 지칭한다. The terms used in the present invention, the functional cells "refers to cells having the ability to grow to approximately 260 cell types, any subset of the mammalian body. 만능성 세포와 달리, 다능성 세포는 모든 세포 유형을 형성하려는 능력을 갖지 않는다. Unlike universal sex cells, pluripotent cells do not have the ability to form all cell types.

본 발명에서 사용된 용어 '전구세포'는 특정 유형의 세포로 분화되거나 특정 유형의 조직을 형성하도록 된 세포를 지칭한다. The term "precursor cells" as used herein refers to a cell to differentiate into a specific type of cell or to form a particular type of tissue.

본 발명에서 사용된 용어 '줄기세포'는 조직 및 기관의 특수화된 세포를 형성하도록 비제한적으로 재생할 수 있는 마스터 세포를 지칭한다. The term "stem cell" as used herein refers to a master cell that can be played but not limited to form specialized cells of tissues and organs. 줄기세포는 발달가능한 만능성 또는 다능성 세포이다. Stem cells are a possible all-round development of gender or pluripotent cells. 줄기세포는 2개의 딸줄기세포, 또는 하나의 딸줄기세포와 하나의 유래('전이(transit)') 세포로 분열될 수 있으며, 이후에 조직의 성숙하고 완전한 형태의 세포로 증식된다. Stem cells are proliferating into two daughter stem cells, or one daughter stem cell and one of the stems ( 'transitions (transit)') cells mature and complete form of tissue cells after, can be divided into.

본 발명에서 사용된 용어 "분화(differentiation)"는 세포가 분열 증식하여 성장하는 동안에 서로 구조나 기능이 특수화하는 현상, 즉 생물의 세포, 조직 등이 각각에게 주어진 일을 수행하기 위하여 형태나 기능이 변해가는 것을 말한다. The form and function in order to perform the term "differentiation (differentiation)" phenomenon, that is days cells, tissues, etc. of organisms given to each of the another structure or function specialization while the cells are in division and proliferation growth used in the present invention He says that to change. 일반적으로 비교적 단순한 계(系)가 둘 이상의 질적으로 다른 부분계(部分系)로 분리되는 현상이다. A phenomenon which is generally separated by a relatively simple system (系) two or more qualitatively different portions based (部分 系). 예를 들면, 개체발생에서 처음에 동질적이었던 알 부분 사이에 머리나 몸통 등의 구별이 생기거나 세포에도 근세포라든가 신경세포 등의 구별이 생기는 것과 같이 처음에 거의 동질이었던 어떤 생물계의 부분 사이에 질적인 차이가 생기는 것, 또는 그 결과로서 질적으로 구별할 수 있는 부역 또는 부분계로 나누어져 있는 상태를 분화라고 한다. For example, the quality between the portion of a biological system that was nearly homogeneous at the beginning, as the distinction between such head and body animation between homogeneous was seen portion initially in ontogeny or radeunga in muscle cells produced are distinguished, such as nerve cells as to a difference occurs, or as a result is referred to as differentiation becomes a state in which the quality distinction divided to step statute labor or parts that can be made.

본 발명에서 사용된 용어 '세포치료제'는 사람으로부터 분리, 배양 및 특수한 저작을 통해 제조된 세포 및 조직으로 치료, 진단 및 예방 의 목적으로 사용되는 의약품(미국 FDA규정)으로서, 세포 혹은 조직의 기능을 복원시키기 위하여 살아있는 자가, 동종, 또는 이종세포를 체외에서 증식ㅇ선별하거나 다른 방법으로 세포의 생물학적 특성을 변화시키는 등의 일련의 행위를 통하여 치료, 진단 및 예방의 목적으로 사용되는 의약품을 지칭한다. The term "cell therapy" is separated from the person, culture and specialized writing the cells and drugs to be used for the purposes of treatment, diagnosis and prevention of tissue prepared in (US FDA regulations), as a cell or a function of the tissue used in the present invention in order to restore; it refers to a living self, allogeneic, or xenogeneic cells to proliferate in vitro o drug is selected or used for the purpose of a series of treatment, diagnosis and prevention through the actions, such as to change the biological properties of the cells in different ways . 세포치료제는 세포의 분화정도에 따라 크게 체세포치료제, 줄기세포치료제로 분류되며 본 발명은 특히 줄기세포치료제에 관한 것이다. Cell therapy is the present invention greatly depending on the degree of differentiation of the cell is classified as a somatic treatment, stem cell therapy is directed to a particular stem cell therapy.

2. 태반 줄기세포의 분리 및 정제 2. Isolation and Purification of placental stem cells

태반(placenta)은 임신 중에 태아를 위해 만들어지는 것으로 무게 500g, 지름 15~20cm, 두께 2~3cm 정도의 원반 형태로 되어있다. Placenta (placenta) is a disc in the form of weight 500g, diameter 15 ~ 20cm, a thickness of about 2 ~ 3cm to be made to the fetus during pregnancy. 태반의 한쪽은 모체와 닿아 있고 다른 한쪽은 태아와 맞닿아 있으며 그 사이 공간에 모체의 혈액이 담겨 있어 태아에게 영양분을 공급하게 된다. One side of the placenta in contact with the matrix and the other end contact with the fetus and it is contained in the maternal blood in the interspace to supply nutrients to the fetus. 태반은 양막, 장막, 탈락막의 3층으로 구성되어 있다. Placenta consists of amniotic membrane, curtain, falling off the film layer 3. 또한, 양막은 태아를 둘러싸고 있는 얇고 투명한 막으로, 양수가 들어 있으며, 양막에는 태아의 줄기세포가 존재한다. In addition, amniotic membrane has a thin, transparent film that surrounds the fetus, and a positive example, the membranes, there is the embryonic stem cell. 탈락막은 수정란이 자궁에 착상되기 위해 자궁의 상피세포가 변형되어 형성된 막으로써 모체의 줄기세포가 존재한다. Elimination of the matrix film and the stem cells are present as a film formed of the uterine epithelium is modified to become fertilized egg is implanted in the uterus. 태반에 들어있는 줄기세포의 양은 아주 풍부하며 증식이 잘되고 다른세포로 분화도 가능하다. The amount is very rich in stem cells contained in placental growth and well-being are possible differentiation into other cells.

본 발명에 따른 인간 태반조직(human term placenta)에서 분리된 탈락막(decidua) 또는 양막(amnion) 유래 줄기세포는 성인의 자가성 성체줄기세포로 분류되고, 태반조직을 사용하므로 윤리적으로 문제가 되지 않는다. Human placenta (human term placenta) the decidua (decidua) or amniotic membrane (amnion) derived stem cells isolated in accordance with the present invention are classified into self-sex adult stem cells in adults, because it uses placental not a problem ethical no.

통상 다음과 같은 방법을 통하여, 태반 조직으로부터 다능성 줄기세포를 분리 및 정제한다. Typically through the following method, and separating and purifying multipotent stem cells from placental tissue. 본 발명은 포유류의 태반, 바람직하게는 인간의 태반에 관한 것으로, 이는 자궁으로부터의 만출 후, 처리 및 배양되어 다능성 줄기세포, 태반 줄기세포 및 다른 생체 물질을 생성한다. The present invention relates to a mammalian placenta that is, preferably human placenta, which generates after manchul from the uterus, and the culture process is the pluripotent stem cells, placental stem cells and other biological material. 태반 줄기세포는 자궁으로부터 만출된 태반으로부터 수득된다. Placental stem cells are obtained from the placenta from the uterus manchul. 바람직한 실시양태에서, 태반은 성장 인자[예: bFGF (Basic Fibroblast Growth Factor) 및 EGF(Epidermal Growth Factor)]의 존재하에서 배양된다. In a preferred embodiment, the placenta growth factor: is cultured in the presence of EXAMPLE bFGF (Basic Fibroblast Growth Factor) and EGF (Epidermal Growth Factor)].

본 발명에서는 우선, 태반을 고려대학교병원 임상시험윤리위원회지침서에 따라 고려대학교 부속 구로병원에서 정상 분만과 조산 분만에서 수집하고, 다음과 같은 방법을 통하여, 인간 태반 조직으로부터 다분화능 줄기세포를 분리 및 정제하였다. In the present invention, first, at Korea University Guro Hospital, according to the Korea University Hospital Clinical Trial Ethics Committee guidelines placenta collected from normal labor and preterm birth, and through the following ways, and from human placental tissue separating the multipotent stem cells and It was purified.

인간 태반 조직샘플로부터 양막 및 탈락막을 분리하여 각각 PBS로 세척한다. Separation membranes and membrane eliminated from human placental tissue sample, wash with PBS, respectively. 세척된 양막 및 탈락막 조직을 잘게 자른다. Finely cut the washed membranes and decidua tissue. 잘게 자른 양막과 탈락막 조직은 100 mm 디쉬로 옮긴후 콜라게나아제 (1mg/ml)을 첨가한 DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium, Gibco) 배지를 이용해 37℃에서 1시간 동안 화학적 분해 작업을 한다. Chopped membranes and decidual tissue during use and then transferred to 100 mm dishes collagenase (1mg / ml) a DMEM was added (Dulbecco's Modified Eagle Medium, Gibco) culture medium for one hour at 37 ℃ and the decomposition operation.

화학적 분해된 조직들을 100㎛ 메쉬(mesh)에 필터링하여 분해되지 않은 조직을 제거후 1200rpm에서 1~10분간 원심분리하였다. After the chemically degraded tissue in 100㎛ filtering mesh (mesh) to remove the undissolved tissue was isolated 1-10 minutes and centrifuged at 1200rpm. 상층액은 석션(suction)하고 바닥에 남은 펠렛은 PBS로 세척한 후 1200rpm으로 1~10분간 원심분리하였다. The supernatant was separated with suction (suction) and 1-10 minutes centrifuged at 1200rpm and then the remaining pellet was washed with PBS on the floor. 바닥에 있는 펠렛을 단일세포로 잘 부유시킨 후 bFGF가 함유되어 있는 DMEM배지에서 배양한다. Incubate the pellet at the bottom in DMEM medium which is containing the bFGF was well suspended with a single cell. 이때, 중간엽 줄기세포의 경우는 바닥에 부착이 되고 이외의 세포들은 부유하여 있다. At this time, when the mesenchymal stem cell is a cell other than being attached to the bottom and are suspended.

이러한 줄기세포는 플라스틱에 부착되어 성장하며, 둥근형태(round-shape) 또는 선형태(spindle-shape)의 형태학적 특성을 나타낸다. These stem cells, and growth is attached to the plastic, it shows the morphological characteristics of the round (round-shape) or a line shape (spindle-shape). 이틀이 지난 후 디쉬 바닥에 붙지 않은 세포들은 PBS로 세척하고, 배지를 2~3일마다 교체하면서 배양하여 인간 태반에서 분리한 양막 또는 탈락막 유래 다분화능 줄기세포액을 수득하였다. The last two days, the cells did not adhere to the bottom dish then are washed and the medium replaced every 2-3 days and incubated with the membranes or decidua derived isolated from human placenta with PBS to give the multipotential stem sepoaek.

상기 분리된 태반 유래 다능성 줄기세포의 증식율을 조사하면, 계대 수(passage number)가 12에 이르기까지, CPDL이 점진적으로 증가하여 우수한 증식율을 가진다는 것을 알 수 있다(도 11 및 12). The irradiated with a separate placenta derived jeungsikyul of the pluripotent stem cells, passage number (passage number) is down to 12, it can be seen that CPDL was gradually increased to have excellent jeungsikyul (Figs. 11 and 12).

수득한 줄기세포는 SFM 배지에서 스피어(sphere)를 형성하여 미분화 상태로 장기간 유지가 가능하다(도 4). The obtained stem cells to form a sphere (sphere) in SFM medium is maintained long period of time which is available in the undifferentiated state (Fig. 4). 본 발명에서 사용 가능한 SFM 배지의 하나로 10 μM, 1 x antibiotic antimycotic solution, 1 μg/ml hydrocortisone, 5 μg/ml Insuline, 20 ng/ml EGF, 40 ng/ml FGF, B27, β-mercaptoethanol을 함유하는 MEBM (Mammary Epithelial Basal Medium) 배지를 들 수 있다. One of SFM medium that can be used in the present invention 10 μM, 1 x antibiotic antimycotic solution, 1 μg / ml hydrocortisone, 5 μg / ml Insuline, 20 ng / ml EGF, 40 ng / ml FGF, B27, containing β-mercaptoethanol MEBM (Mammary Epithelial Basal medium) can be given a badge.

증식된 세포의 갯수 및 유형은 유동 세포측정, 세포 분류, 면역세포화학(예를 들어, 조직 특이성 또는 세포-표지 특이적 항체로 염색시킴), 형광 활성화 세포 분류(fluorescence activated cell sorting, FACS), 자기 활성화 세포 분류(magnetic activated cell sorting, MACS)와 같은 표준 세포 검출 기술을 사용하는 형태 및 세포의 표면 표지에서의 변화를 측정하거나, 광학 현미경 또는 공초점(confocal) 현미경을 사용하여 세포의 형태를 검사하거나, 또는 PCR 및 유전자 발현 프로파일링(profiling)과 같이 당해 분야에 잘 공지된 기술을 사용하여 유전자 발현에서의 변화를 측정함으로써 쉽게 모니터링될 수 있다. The number and type of proliferative cells is flow cytometry, cell sorting, immunocytochemistry (e.g., tissue-specific or cell-Sikkim stained with labeled specific antibody), the classification fluorescence-activated cell (fluorescence activated cell sorting, FACS), in the form of a magnetic activated cell sorting (magnetic activated cell sorting, MACS) and the cell using the measured change in the surface cover, or an optical microscope or confocal (confocal) microscopy of forms and cells using standard cell detection techniques such as by using the inspection, or well known in the art, such as PCR and gene expression profiling (profiling) techniques measure changes in gene expression it may be easily monitored.

바람직한 실시양태에서, 태반에서 배양된 세포는 당해 분야에 공지된 기법, 예를 들어 밀도 구배 원심분리, 자석 세포분리, 유세포분석기, 또는 다른 세포 분리법을 사용하여, 또는 당해 분야에 공지된 분류 방법을 사용하여 분류된다. In a preferred embodiment, the cells cultured in the placenta is the techniques, such as density gradient centrifugation, magnet cell separation, flow cytometry, or using a different cell separation method, or the classification method known in the art known in the art use is classified.

일례로, 수득한 태반 유래 줄기세포액으로부터 목적의 표면항원을 발현하고 있는 다능성 줄기세포를 수득하는 방법으로서는 소팅 기능을 가진 플로우 사이토미터를 사용한 FACS 법( Int. Immunol. , 10(3):275, 1998), 자기 비즈를 사용하는 방법, 다능성 줄기세포를 특이적으로 인식하는 항체를 사용한 패닝법( J. Immunol. , 141(8):2797, 1998) 등이 있다. In one example, as the method for obtaining pluripotent stem cells which express a surface antigen of the target from a placenta-derived stem sepoaek obtained FACS method using a flow cytometer with sorting function (Int Immunol, 10 (3) :.. 275 , 1998), how to use the magnetic beads, the panning method using an antibody that recognizes the pluripotent stem cells with specific (. J. Immunol, 141 (8 ): and the like 2797, 1998). 또한, 대량의 배양액 등으로부터 다능성 줄기세포를 수득하는 방법으로서는, 세포의 표면에 발현되어 분자(이하, 표면 항원이라 칭함)를 특이적으로 인식하는 항체를 단독 또는 조합하여 이를 칼럼으로서 사용하는 방법이 있다. In addition, a method for A method for obtaining multipotent stem cells from the culture broth of the mass or the like, is expressed on the cell surface alone or in combination of antibodies that specifically recognize a molecule (hereinafter referred to as surface antigen) and used it as a column there is.

플로우 사이토미터 소팅 방식으로서는, 수적하전 방식, 셀캡쳐 방식 등을 들 수 있다. As the flow cytometer sorting scheme, there may be mentioned water droplet charge method, a cell capture method, etc. 한 실시양태에서, 세포 표면 표지-특이적 항체 또는 리간드는 분명한 형광 라벨로 표지된다. In one embodiment, cell surface marker-specific antibodies or ligands are labeled with distinct fluorescent labels. 세포는 세포 분류기를 통해 처리되어 그들의 사용된 항체에 대한 결합능력에 기초하여 세포가 분리된다. Cells are processed through the cell sorter cells are separated based on their binding capacity for the used antibodies. FACS-분류된 입자는 96웰 또는 384웰 플레이트의 개별 웰(well)내에 직접 침착되어 분리 및 클로닝을 촉진시킬 수 있다. FACS- Classified particles are directly deposited in an individual well (well) of a 96-well or 384-well plate may facilitate separation and cloning.

어떠한 방법으로도 세포의 표면항원을 특이적으로 인식하는 항체를 형광으로 표지하고, 표지된 항체와 항원의 결합체에 대한 형광을 측정하여 형광 강도를 전기 신호로 변환함으로서 세포의 항원 발현량을 정량할 수 있다. In any way be labeled antibodies that recognize the surface antigens of the cells, specifically by fluorescence, and measuring the fluorescence of the conjugate of the labeled antibody and the antigen to the determination of antigen expression level of the cell, by converting the fluorescence intensity to an electrical signal can. 또한, 사용하는 형광물질의 종류를 조합함으로서, 복수의 표면 항원을 발현하고 있는 세포를 분리하는 것도 가능하다. Further, by combining the type of fluorophore to be used, it is also possible to remove the cells that express a plurality of surface antigens. 여기에 사용가능한 형광물질로는, FITC(fluorescein isothiocyanate), PE(phycoerythrin), APC(allo-phycocyanin), TR(TexasRed), Cy3, CyChrome, Red613, Red670, TRI-Color, QuantumRed 등이 있다. Possible fluorescent substance used herein include, FITC (fluorescein isothiocyanate), PE (phycoerythrin), APC (allo-phycocyanin), TR (TexasRed), Cy3, CyChrome, Red613, Red670, TRI-Color, QuantumRed.

본 발명에서 사용 가능한 하나의 방법인 플로우 사이토미터를 사용한 FACS 법으로서는, 상기에서 수득한 줄기세포용액을 수집하고, 원심분리 등의 방법으로 세포를 분리한 후, 직접 항체로 염색하는 방법과 한번 적당한 배지 중에서 배양, 증식을 실시한 후에 항체를 염색하는 방법을 이용할 수 있다. As a FACS method using a potential, a method of flow cytometer used in the present invention, after collecting a stem cell solution obtained above, and separating the cells by methods such as centrifugation, a method for directly staining with an antibody and one suitable the medium may be used a method of dyeing the antibody after performing the incubation, the proliferation. 세포의 염색은 우선, 표면 항원을 인식하는 일차항체와 목적 세포 샘플을 혼합하고, 얼음 위에서 30분 내지 1시간 인큐베이션한다. Staining of cells, first, mixing the primary antibody and the target cell sample to recognize a surface antigen, and incubated on ice for 30 minutes to 1 hour. 일차 항체가 형광으로 표지되어 있는 경우에는 세정 후 플로우 사이토미터로 분리를 실시한다. If the primary antibody is labeled with a fluorescent light it is to carry out separation by flow cytometer after washing. 일차 항체가 형광 표지되어 있지 않는 경우에는 세정 후 일차 항체에 대해서 결합 활성을 갖는 형광 표지된 이차 항체와 일차 항체가 반응한 세포를 혼합하고, 다시 얼음물에서 30분 내지 1시간 인큐베이션한다. If the primary antibody does not have fluorescence-labeled by mixing a fluorescent-labeled secondary antibody and the cells of the primary antibody response that has the binding activity for the primary antibody, washed, and again incubated for 30 minutes to 1 hour in the ice water. 세정 후, 일차 항체와 이차 항체에서 염색된 세포를 플로우 사이토미터로 분리를 실시한다. Carried out the separation of the stained cells after washing, primary antibody and secondary antibody to the flow cytometer.

3. 태반으로부터 수득된 태반 줄기세포의 특성 3. The properties of the placental stem cells, obtained from placenta

태반으로부터 단리된 줄기세포는 균질하고 멸균성이다. The stem cells isolated from the placenta are homogenous, and sterile. 또한, 줄기세포는 인간에게 투여되기 적합한 형태(즉, 약학적 등급)로 용이하게 수득된다. In addition, the stem cells are readily obtained in a suitable form (i. E., Pharmaceutical grade) to be administered to a human.

장기간 배양 후 세포들을 표면 CD 시리즈 항원 마커들, 예를 들어 CD29 (mononuclear cell marker), CD31(endothelial cell and stem cell marker), CD34, CD44(hematopoietic cell marker), CD90(mononuclear stem cell marker), CD73(T-cell and B-cell marker) CD105(endothelial cell marker), CD45(hematopoietic cell marker), 들로 캐릭터라이제이션하여 FACS 분석에 적용할 수 있다. Long period of time in culture after cell surface CD series antigen markers of, for example, CD29 (mononuclear cell marker), CD31 (endothelial cell and stem cell marker), CD34, CD44 (hematopoietic cell marker), (mononuclear stem cell marker) CD90, CD73 Localization and character with (T-cell and B-cell marker) (endothelial cell marker), (hematopoietic cell marker) CD45 CD105, can be applied to FACS analysis.

본 발명의 방법에 의해 수득된 바람직한 태반 줄기세포는 하기 세포 표면 표지의 존재에 의해 규명될 수 있다: CD29, CD44, CD54, CD73, CD90 및 CD105에 대하 여 모두 양성의 면역학적 특성을 나타내고, CD31, CD34, CD45 및 HLA-DR에 대하여 모두 음성의 면역학적 특성을 나타낸다. Preferred placental stem cells obtained by the method of the invention can be identified by the presence of the following cell surface markers: by treating a CD29, CD44, CD54, CD73, CD90 and CD105 all represents the immunological properties of the positive, CD31 shows the immunological characteristics of the sound with respect to all of CD34, CD45 and HLA-DR. 이러한 세포 표면 표지는 당해 분야에 익히 공지된 방법에 따라, 예를 들어 유세포분석기에 의해 일괄적으로 측정된 후 세척하고, 항-세포 표면 표지 항체로 착색된다. This cell surface marker according to methods well known in the art, such as washing after the measurement in bulk by flow cytometry, and the anti-cell surface stained with labeled antibody.

또한, 본 발명의 태반 줄기세포는 미분화상태의 세포 마커라고 할 수 있는 Oct4 또는 SSEA4의 마커를 이용하여 확인할 수 있다(도 9). In addition, placental stem cells of the invention can be identified using a marker of Oct4 or SSEA4 it can be said of the undifferentiated cell markers (Fig. 9). Oct4는 줄기세포에서 미분화상태 표지인자로써 잘 알려져 있고, 기술분야에서는 대한민국특허출원 제10-2004-0105716호 "인간 배아줄기세포에 특이적인 단일클론항체", 대한민국특허출원 제10-2004-0096780호 "포유류 배아 및 줄기세포의 미분화 상태 유지 Oct4 유전자 발현 억제용 이중나선 RNA", 대한민국특허출원 제10-2006-0092128호 "파골세포 기반 적소 유사 구조에 의해 증식능이 증가된 인간 제대혈 유래 다분화능 줄기 세포 및 그 제조방법" 등에서 나타난 바와 같이, 미분화상태의 줄기세포임을 입증하기 위한 실험으로 Oct4 발현능 실험을 하는 것이 통상이다. Oct4 is well known as an undifferentiated state markers in stem cells, the art in the Republic of Korea Patent Application No. 10-2004-0105716 call "specific monoclonal antibody to human embryonic stem cells", the Republic of Korea Patent Application No. 10-2004-0096780 No. "mammalian embryonic and undifferentiated state of the stem cell maintenance Oct4 gene expression, the double stranded RNA inhibiting", the Republic of Korea Patent Application No. 10-2006-0092128 No. "the osteoclast-based place the proliferative capacity is increased by the structure similar to the human cord blood-derived multipotent stem cells, and, as shown, etc. the production method ", it is usual that the Oct4 expressing ability test in experiments to demonstrate that the undifferentiated stem cells. 또한, SSEA4 (Stage Specific Embryonic Antigen 4)가 인간 배아줄기세포의 표면에 존재한다는 것도 당업자에게 이미 알려져있는 사실이다. It is also true that to those skilled in the art is known SSEA4 (Stage Specific Embryonic Antigen 4) that is present on the surface of human embryonic stem cells.

Oct4 및 SSEA4의 발현은 RT-PCR(Reverase Transcriptase-Polymerase Chain Reaction)을 이용한다. The expression of Oct4 and SSEA4 uses a RT-PCR (Reverase Transcriptase-Polymerase Chain Reaction). RT-PCR의 방법은 당분야에 공지되어 있는 기술이다. The method of RT-PCR is a technique well known in the art. RT-PCR은 특정 부위의 RNA를 주형(template)로 하여 이에 상응하는 cDNA를 합성한 다음, 이를 이용하여 PCR 증폭을 시행하는 기술이며, 실험과정은 (1) 역전사효소(reverse transcriptase)를 이용하여 RNA로부터 cDNA를 제조하는 과정과 (2) cDNA를 이용하 여 특정부위를 증폭시키는 과정으로 이루어지며 (2)과정은 게놈(genomic) DNA로부터 특정 유전자 부위를 증폭시키는 방법과 같다. RT-PCR was used to synthesize cDNA equivalent to the RNA of the specific region as a template (template), and then, a technique to enforce PCR amplified using this, experimental procedure (1) a reverse transcriptase (reverse transcriptase) It made of a process for amplifying a specific region take advantage over the process and (2) cDNA to prepare a cDNA from the RNA (2) the process is the same as the method for amplifying a specific gene region from the genomic (genomic) DNA. 이 방법은 노던 블롯 하이브리다이제이션과 같은 방법을 통해 가능하던 RNA 분석보다 실험방법이 더욱 간단할 뿐만 아니라, 유전자의 염기서열 결정이 가능하기 때문에 주로 mRNA의 염기서열 및 전사량을 연구할 때 크게 도움이 되는 기술이다. This is very helpful when mainly study the nucleotide sequences and a transcription amount of mRNA, as well as experimental method than RNA analysis was possible by a method such as hybridization Northern blot hive Localization is further simplified, since it is possible the sequencing of the gene this is a technique that.

본 발명의 태반 줄기세포는 Oct4와 SSEA4의 발현에 대해 양성 반응을 나타낸다(도 9). Placental stem cells of the present invention show a positive response for the expression of Oct4 and SSEA4 (Figure 9).

4. 태반 줄기세포의 분화 4. Differentiation of Placental Stem Cells

본 발명의 방법에 의해 수득된 태반 줄기세포는 중배엽, 내배엽 및 외배엽 유래 세포로 분화하는 능력을 가지고 있다. The placental stem obtained by the method of the invention cells have the ability to differentiate into mesoderm, endoderm and ectoderm-derived cells. 지방세포분화, 연골세포 분화, 골아세포 분화, 조혈세포 분화, 근세포 분화, 혈관세포 분화, 신경세포 분화, 간세포 분화를 비롯한, 특정 세포 계통을 따라 분화하도록 유도될 수 있다. Including adipocyte differentiation, cartilage cell differentiation, osteoblast differentiation, stem cell differentiation, differentiated muscle cells, vascular cell differentiation, neuronal differentiation, stem cell differentiation it can be induced to differentiate along specific cell lines. 특정 실시양태에서, 본 발명의 방법에 따라 수득된 태반 줄기세포는 이식 및 생체외 처리 프로토콜에서의 사용을 위해 분화하도록 유도된다. In certain embodiments, the placental stem obtained according to the process of the present invention cells are induced to differentiate for use in transplantation and ex vivo treatment protocols. 특정 실시양태에서, 본 발명의 방법에 따라 수득된 태반 줄기세포는 특정 세포 유형으로 분화하도록 유도되고 치유 유전자 생성물을 제공하도록 유전자적으로 설계된다. In certain embodiments, the placental stem cells obtained according to the process of the present invention is designed to be genetically induced to differentiate into specific cell types and provides a healing gene product.

특정 실시양태에서, 본 발명의 방법에 의해 수득된 태반 줄기세포는 분화되도록 유도되는 생체외 화합물과 함께 항온 처리된 후 분화된 세포는 실험대상으로 직접 이식된다. In certain embodiments, the placental stem cell obtained by the method of the present invention includes a differentiation after in vitro with the compound to be induced to differentiate incubated cells are transplanted directly to the test subject. 따라서, 본 발명은 표준 배양 매지를 사용하여 인간 태반 줄기세포 를 분화시키는 방법을 포함한다. Accordingly, the present invention includes a method of differentiating the human placental stem cells using standard culturing Magister. 따라서, 본 발명에 따른 다능성 태반 줄기세포는 근세포, 신경세포, 성상세포, 골형성세포, 연골세포, 지방세포 및 인슐린 분비 췌장 베타세포로 분화시키는 방법을 포함한다. Accordingly, placental multipotent stem cells according to the invention comprises a method of differentiating into muscle cells, nerve cells, astrocytes, osteogenic cells, cartilage cells, fat cells and insulin-secreting pancreatic beta cells.

줄기세포의 특정 세포 유형으로의 분화 측정은 당해 분야에 익히 공지된 방법에 의해 수행될 수 있으며, 예를 들어, (1) 태반 줄기세포를 하루 동안 아자사이티딘(azacytidine)을 전처리 한 후 SKBM 배지(cambrex, co.)에서 근세포로의 분화를 유도할 수 있고, (2) 태반 줄기세포를 BME (beta-mercaptoethanol) 및 FBS(Fetal Bovine Serum)를 함유한 DMEM 배지에 전배양 하고, 상기 전배양액을 DMSO(Dimethyl sulfoxide) 및 BHA(Butylated hydroxyanisole)로 처리하여 신경분화를 유도할 수 있고, (3) 태반줄기세포를 TCP(Tricalcium phosphate)와 혼합하여 이소이식하여 골형성 세포로 분화시킬 수 있고, (4) 태반 줄기세포를 덱사메타손(dexamethasone), 인도메타신 (indomethacin), 인슐린 및 IBMX (3-isobutyl-1-methylxanthine)를 함유한 α-MEM배지에 배양하여 지방세포로 분화시킬 수 있다. Differentiation measurement of stem cells into specific cell types can be carried out by methods well known in the art, for example, (1) after the placental stem cells pretreated tidin (azacytidine) between aza the day SKBM medium it is possible to induce differentiation of muscle cells in the (cambrex, co.), (2) pre-culture, wherein the pre-culture of placental stem cells in DMEM medium containing BME (beta-mercaptoethanol) and FBS (Fetal Bovine Serum) the can was treated with DMSO (Dimethyl sulfoxide) and BHA (Butylated hydroxyanisole) induce neuronal differentiation, (3) to the placental stem cells mixed with TCP (Tricalcium phosphate), it is possible to differentiate into bone forming cells, isopropyl transplantation, (4) culturing the placental stem cells, dexamethasone (dexamethasone), the indomethacin (indomethacin), a α-MEM medium containing insulin and IBMX (3-isobutyl-1-methylxanthine) can be differentiated into adipocytes.

또한, 상기 분화들은 유세포 분석 또는 면역세포화학과 같은 기법을 사용하여 세포 표면 표지(예를 들어 조직-특이적 또는 세포-표지 특이적 항체로 세포를 염색함) 및 형태의 변화를 측정하면서, 광학 현미경 또는 공초점 현미경을 사용하여 세포의 형태를 조사함으로써, 또는 PCR 및 유전자-발현 프로파일과 같은 당해 분야에 익히 공지된 기법을 사용하여 유전자 발현상의 변화를 측정함으로써 확인될 수 있다. In addition, the differentiation may use a technique such as flow cytometry or immune cell chemistry and cell surface marker (e. G. Tissue-specific or cell-marker specific antibodies also stain the cells) while measuring and type of change, the optical microscope or by using a confocal microscope examine the morphology of the cells, or PCR and the gene by using the well known techniques in the art, such as expression profile can be identified by measuring changes in gene expression.

6. 태반 줄기세포 및 이의 분화세포의 이용 6. placental stem cells and the use of its differentiated cells

본 발명의 태반 줄기세포는, 신체의 조직 또는 기관이 목적하는 세포 군집, 예를 들어 줄기세포 또는 유래세포군집의 생착, 이식 또는 주입에 의해 강화, 치료 또는 대체되는 다양한 종류의 치료 프로토콜에 사용될 수 있다. Placental stem of the present invention the cells, cell clusters to the tissue or organ of the body object, such as stem cells or derived cell engraftment in the cluster, transplantation, or may be used in a variety of treatment protocols that are reinforced, the treatment or replaced by injection have. 상기 본 발명의 태반 줄기세포는 존재하는 조직을 대체 또는 강화시켜, 새롭거나 변화된 조직이 되게 하거나 생물학적 조직 또는 구조와 결합시킬 수 있다. The placental stem cells of the invention to replace or enhance existing tissue, to be a new or altered tissue, or can be combined with biological tissues or structures. 또한, 전형적으로 배아 줄기세포가 사용되는 치료 프로토콜에서 배아 줄기세포는 본 발명의 태반 줄기세포로 대체될 수 있다. In addition, typically the embryonic stem cells in the treatment protocol to the embryonic stem cells used may be replaced by placental stem cells of the present invention. 일례로, 본 발명의 태반 줄기세포 또는 이의 분화된 세포를 함유하는 알츠하이머, 파킨슨씨 병 등의 신경질환, 진행성 근이영양증, 루게릭 병 등의 근질환, 골관절염, 골다공증의 골질환 및 당뇨병 등의 치료용 세포치료제와 유방 조직 형성용 세포 치료제 등에 사용될 수 있다. In one example, neurological disorders such as Alzheimer's, Parkinson's disease containing the placental stem cells, or differentiated cells thereof of the present invention, progressive muscular dystrophy, Lou Gehrig's disease, etc. of myopathy, osteoarthritis, cells for the treatment of osteoporosis bone disease, and diabetes or the like may be used for treatment and breast tissue forming cell therapy.

본 발명의 바람직한 실시양태에서, 태반으로부터의 태반 줄기세포 및 기타 줄기세포는 적합 및 부적합 HLA형조혈 이식을 포함하는, 자가 및 동종 조혈 이식에 사용될 수 있다. In a preferred embodiment of the invention, the placental stem cells, and other stem cells from the placenta it may be used for, and the self-same type hematopoietic transplants, including suitable and not suitable HLA type hematopoietic transplants. 예를 들어, 본 발명의 태반 줄기세포는 치료학적 이식 프로토콜, 예를 들어 간, 췌장, 신장, 폐, 신경계, 근육계, 뼈, 골수, 흉선, 비장, 점막밑 조직, 생식선 또는 모발의 줄기세포 또는 유래세포를 강화 또는 대체시키는데 사용될 수 있다. For example, placental stem cells of the invention are therapeutic transplantation protocols, e.g., liver, pancreas, kidneys, lungs, the nervous system, musculature, bone, bone marrow, thymus, spleen, submucous tissue, gonads, or hair stem cells or It can be used to enhance or replace the derived cells.

태반 줄기세포는, 전형적으로 유래세포가 사용되는 치료 또는 연구 프로토콜에서 특정한 부류의 전구세포 (예를들어, 연골세포, 줄기세포, 조혈세포, 췌장 실질세포, 신경줄기세포 및 근육 유래세포 등) 대신 사용될 수 있다. Placental stem cells, typically a precursor cell of a particular class in the treatment or research protocols are derived from the cells used be used instead (e.g., chondrocytes, stem cells, hematopoietic cells, pancreatic parenchymal cells, neural stem cells, and muscle-derived cells, etc.) can.

본 발명의 태반 줄기세포는 연골, 건 또는 인대의 강화, 치료 또는 대체에 사용될 수 있다. Placental stem cells of the invention can be used in cartilage, tendon or ligament strengthening, therapy or replaced. 예를 들어, 특정 실시양태에서는, 인공보철물(예를 들어, 둔부 인공보철물)이 본 발명의 태반 줄기세포로부터 성장한 대체 연골조직 구조물로 피복된다. For example, in certain embodiments, prostheses (e.g., hip prostheses) are coated with replacement cartilage tissue structures grown from the placental stem cells of the present invention. 다른 실시양태에서는, 관절(예를 들어, 무릎)이 태반 줄기세포로부터 성장한 연골조직 구조물로 재구성된다. In other embodiments, joints (e.g., knee) are reconstructed with cartilage tissue structures grown from placental stem cells. 또한, 연골조직 구조물은 주로 상이한 유형의 관절의 재구성 수술에 사용될 수 있다(예를 들어, 문헌[Resnick, D. et al, Diagnosis of Bone and Joint Disorders, 2d, 1988]에서의 프로토콜). In addition, the cartilage structure can mainly be used for surgical reconstruction of a different type of joint (e.g., a protocol in the literature [Resnick, D. et al, Diagnosis of Bone and Joint Disorders, 2d, 1988]).

본 발명의 태반 줄기세포는 질병으로부터 야기된 조직 및 기관의 손상을 복구하는데 사용될 수 있다. Placental stem cells of the present invention can be used to repair damage of tissues and organs resulting from disease. 이러한 실시양태에서는, 환자에게 태반 줄기세포가 투여되어 질병의 결과로서 손상된 조직 또는 기관을 재생 또는 회복시킬 수 있다(예를 들어, 화학요법 또는 방사선 이후의 면역계를 향상시키고, 심근경색 이 후의 심장조직을 복구한다). In such embodiments, it is the placental stem cells administered to a patient can be regenerated or restored to the damaged tissue or organ as a result of disease (e.g., enhance the chemotherapeutic or immune system after the radiation and, heart tissue after a heart attack to recover).

또한 본 발명의 태반 줄기세포는 주사가능물질(예를 들어, 본원의 참조문헌으로 인용되는 국제특허 공개공보 제 WO 96/39101 호)로서 제형화될 수 있다. In addition, placental stem cells of the invention (e. G., International Patent Publication, which is incorporated by reference herein in the claim No. WO 96/39101), injectable materials can be formulated as. 다른 실시양태에서, 본 발명의 세포 및 조직은 미국특허 제 5,709,854 호; In another embodiment, the cells and tissues of the present invention is U.S. Patent No. 5,709,854; 제 5,516,532 호; No. 5,516,532 call; 제 5,654,381 호(모두 본원의 참조문헌으로 인용됨)에 기술된 바와 같은 중합성 또는 가교성 하이드로겔을 사용하여 제형화될 수 있다 No. 5,654,381 call may be formulated using polymerizable or crosslinkable hydrogels, such as those described in (all herein incorporated by reference in the present application)

이하 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. It will be described in more detail the present invention to the following embodiments. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다. These embodiments will provide for only illustrative of the present invention, self-evident to a person of ordinary skill in the art, the scope of the present invention that is to be construed as being limited to these examples.

실시예 1: 태반 조직의 준비 및 분리 Example 1: Preparation and isolation of placental tissue

태반은 고려대학교병원 임상시험윤리위원회지침서에 따라 고려대학교 부속 구로병원에서 정상 분만과 조산분만에서 수집되어 연구용으로 사용하였다. The placenta in Korea University Guro Hospital, Korea University Hospital, according to clinical trials ethics committee guidelines are collected in the normal labor and preterm birth were used for research. 태반 조직은 항생제가 포함되어 있는 생리 식염수에 넣어서 연구실까지 옮겼다. Placental tissue is put in normal saline containing the antibiotic were transferred to the laboratory.

연구실로 옮긴 태반 조직은 PBS를 이용하여 세척하여 혈구세포들과 여러 조직의 잔해들을 제거하거나 조직을 용혈버퍼(hemolysis buffer)를 이용하여 혈구세포들을 제거 하거나 태반을 구성하고 있는 양막(amnion), 장막(chorion), 기저탈락막(decidua) 및 태반(placenta bad)조직을 각각 포셋을 이용하여 조심스럽게 분리하였다. Placental tissue transferred to laboratory and washed with PBS blood cells and the removal of debris of various tissues, or by using a tissue hemolysis buffer (hemolysis buffer) membranes, which remove blood cells or configure the placenta (amnion), tents (chorion), the basal decidua (decidua), and placenta (placenta bad) each tissue was separated carefully by using a Fawcett.

실시예 2: 태반 유래 줄기세포의 분리 및 배양 Example 2: Isolation and culture of the placenta-derived stem cells

분리된 각각의 조직들은 100mm 디쉬에 놓고 멸균된 메쉬를 이용해 1~2mm 크기로 잘게 세절하였다. Separate each tissue were finely sejeol 1 ~ 2mm in size using a sterile mesh placed on a 100mm dish. 그 후, 콜라게나제가 포함된 배지에 놓고 37℃의 배양기에서 최소 1 시간에서 최대 4시간 동안 반응시킨 다음 100 와이어 직물체를 이용해 콜라게나제가 처리된 조직을 걸렀다. Then, the collagenase placed on the medium containing I a reaction for up to 4 hours at least one hour in an incubator of 37 ℃ then using a 100 wire object straight reotda make the organization of collagenase I treatment. 이렇게 분리한 세포들은 100mm 디쉬에 37℃, 5% CO 2 조건하 bFGF 함유 DMEM배지에서 배양하였다. The thus separated cells were cultured in DMEM medium containing 37 ℃, 5% CO 2 conditions, a 100mm dish and bFGF.

비교예 1: 태반 조직 및 지방 조직 유래 줄기세포 배양 효율 비교 Comparative Example 1: Comparison of placental tissue and adipose tissue-derived stem cells efficiency

5g의 지방 조직으로부터 줄기세포를 분리, 배양할 경우 두 번의 계대 배양 후 천만개 이상의 세포를 획득할 수 있었으나 약 3g의 태반 조직의 경우 최초의 계대 배양 후 천만개 이상의 세포를 획득할 수 있었다. Remove the stem cells from fat tissue of 5g, it was able to acquire more than when cultured after two subcultures were able to obtain more than ten million cases of placental tissue cells of approximately 3g after the first subculture ten million cells. 이를 통해, 태반 조직을 이용하여 줄기세포를 배양하는 경우, 기존의 지방 조직을 이용하여 줄기세포를 배양하는 경우보다 훨씬 효율적인 것을 알 수 있었다. If doing this, using placental tissue culturing stem cells, it was found that much more efficient than in the case of culturing stem cells by using existing local organizations.

실시예 3: 태반조직 유래 줄기세포의 증식율 조사 Example 3: jeungsikyul of placenta-derived stem cell investigation

상기 분리된 인간 태반 조직 유래 다능성 줄기세포의 증식방법에 따라 수득된 줄기세포의 증식율을 조사하였다. The jeungsikyul of stem cells obtained by the growth method of the isolation of human placenta-derived multipotent stem cells was examined. 각각 다른 인간 개체의 태반조직 샘플로부터 가져온 태반 줄기세포를 실시예 1 내지 3과 같은 분리방법을 거쳐 얻은 후, 75-flask에 2x10 5 씩 씨딩(seeding)하였다. Each after the placental stem cells obtained from placental tissue samples from different human object obtained through the separation process as in Example 1-3, were seeded (seeding) per 2x10 5 to 75-flask.

CPDL(cumulative population doubling level)은 세포의 증식율을 나타내는 지수로서, CPDL (cumulative population doubling level) is a figure showing a cell of jeungsikyul,

CPDL=ln(Nf/Ni)/ln2 CPDL = ln (Nf / Ni) / ln2

(Ni=초기 seeding한 세포수, Nf=최종 세포수) (Ni = initial seeding number of cells, Nf = final number of cells)

의 식으로 나타낼 수 있다. Of it can be expressed by the following formula.

기저탈락막 유래 줄기세포 및 양막 유래 줄기세포의 CPDL을 계대수(passage number)에 따라 관찰한 결과 계대수 가 12일때 약 30에 달하는 CPDL 값을 나타낸다 (도 11 및 12). The number of passages of the bottom CPDL decidua derived cells and the amniotic membrane-derived stem cells (passage number) represents a result CPDL value of up to passage number 12 when the 30 observation in accordance with the (11 and 12). 이러한 CPDL 값은 인간 지방 조직 유래 줄기세포( Lin et al., stem cells and development, 14:92, 2005; Zuk et al., Tissue eng., 7:211, 2001)의 그 값과 유사하며 이 결과로부터 본 발명에 따른 성체 줄기세포는 증식율이 매우 우수하다는 것을 알 수 있었다. These CPDL value of human adipose tissue-derived stem cells;: similar to the value of (Lin et al, stem cells and development, 14:92, 2005 Zuk et al, Tissue eng, 7... 211, 2001) have result from adult stem cells in accordance with the present invention it was found that jeungsikyul is very good.

실시예 4: 태반 유래 다능성 줄기세포의 면역학적 특성 Example 4: Placenta derived from the immunological properties of pluripotent stem cells

실시예 3에서 수득한 태반조직 유래 다능성 줄기세포를 PBS로 세척하고, 트립신 처리한 뒤 세포를 수거하여 5분 동안 1000rpm으로 원심분리하였다. Carried out by washing the placental derived pluripotent stem cells obtained in Example 3 with PBS, and harvested after trypsinization cells were centrifuged at 1000rpm for 5 minutes. 상층액을 버린 후 5% FBS 및 PBS의 혼합액을 넣어서 세척한 후 1000rpm으로 5분동안 원심분리하였다. After the supernatant was lost after washing by inserting a mixture of 5% FBS and PBS and centrifuged with 1000rpm for 5 minutes. 상층액을 버린 후 세포를 PBS에 부유시켜 샘플수 만큼 1x10 5 cell을 분주하였다. It was suspended after the abandoned cell supernatant in PBS was dispensed to 1x10 5 cell number of the sample. 각 웰(well)에 항체(R-phycoerythrin-conjugated mouse anti-human monoclonal antibody)를 넣고, 얼음에 40분 동안 인큐베이션하였다. Into the antibody (R-phycoerythrin-conjugated mouse anti-human monoclonal antibody) to the well (well), and incubated for 40 min on ice. 인큐베이션후에 1000rpm으로 5분동안 원심분리하였다. Centrifuged for 5 minutes at 1000rpm after incubation. 상층액을 제거한 뒤 PBS로 세척하고 1000rpm으로 5분 동안 원심분리하였다. Washed with PBS after removal of the supernatant, which was centrifuged for 5 minutes at 1000rpm. 다시 한번, 상기 상층액 제거후 PBS로 세척하고 1000rpm에서 5분 동안 원심분리하는 과정을 반복하였다. After again removing the supernatant, repeat the step of washing with PBS and centrifuged for 5 minutes at 1000rpm. 상층액을 제거한 후 1% 파라포름알데히드(paraformaldehyde)을 넣어서 싱글(single)화 하고, 플로우 사이토미터를 이용해 분석하였다. After removing the supernatant by inserting a 1% para-formaldehyde (paraformaldehyde) were analyzed with the screen, and flow cytometer single (single). 그 결과, 아래에 표 1에서 나타난 바와 같이, 본 발명의 태반조직 유래 태반 줄기세포는 CD29, CD44, CD73, CD90 및 CD105에 대하여 모두 양성의 면역학적 특성을 나타내고, CD31, CD34, CD45 및 HLA-DR에 대하여 모두 음성의 면역학적 특성을 나타냄을 알 수 있었다. As a result, as shown in Table 1 below, placental tissue derived placental stem cells of the present invention denotes an immunological characteristics of all positive with respect to CD29, CD44, CD73, CD90 and CD105, CD31, CD34, CD45 and HLA- with respect to all DR was found to represent the immunological characteristics of the voice.

태반유래 줄기세포의 표면항원분석(FACS analysis) Surface antigen analysis of placenta-derived stem cells (FACS analysis)

Antigen Antigen AD-MSCs AD-MSCs
CD29 CD29 + +
CD31 CD31 - -
CD44 CD44 + +
CD90 CD90 + +
CD105 CD105 + +
CD34 CD34 - -
CD45 CD45 - -
CD73 CD73 + +
CD34 CD34 - -
HLA-DR HLA-DR - -

실시예 5: 태반 유래 다능성 줄기세포의 Oct4 및 SSEA발현 분석 Example 5: The placenta-derived Oct4 and SSEA expression analysis of pluripotent stem cells

상기 실시예 3에서 수득된 태반 유래 줄기세포를 PBS로 세 번 세척하고, 4% paraformaldehyde을 함유한 PBS로 30분간 고정하였다. The exemplary wash Example 3 three times a placenta-derived stem cells obtained in PBS and were fixed for 30 minutes at a PBS containing 4% paraformaldehyde. PBS로 세 번 세척한 후, 0.1% Triton-X100을 함유한 PBS로 10분간 침투(permeabilization)시킨다. After washing with PBS three times, the penetration (permeabilization) 10 minutes in a PBS containing 0.1% Triton-X100. PBS로 세 번 세척한 후, Blocking buffer (5% goat serum)를 처리하여 4 ℃에서 한 시간 동안 반응시키고, 일차항체를 함유한 Blocking buffer에 하룻밤동안 반응시킨다. After washing three times with PBS, by processing the Blocking buffer (5% goat serum) and reacted for and reacted for one hour at 4 ℃, overnight at a Blocking buffer containing primary antibody. PBS로 3회 세척하고, 이차항체로 암실에서 1시간동안 반응시켰다. It washed three times with PBS and allowed to react for 1 hour in the dark with the secondary antibody. PBS로 세 번 세척한 후, mounting하였다. After washing with PBS three times, and mounting. 그 결과, 도 9에 나타난 바와 같이, 본 발명에 따른 분화능 줄기세포는 인간 배아 줄기세포의 마커인 Oct4와 SSEA에 대하여 양성반응을 나타내었다(도 10). As a result, as shown in FIG. 9, the multipotent stem cells according to the invention showed a positive response against a marker of Oct4 and SSEA of human embryonic stem cells (FIG. 10).

또한, RT-PCR을 이용하여 Oct4의 발현을 확인하였다, RT-반응은 37℃에서 50분간, 70℃에서 10분간 행하였으며, PCR-반응은 95℃에서 5분간, 그리고 95℃에서 30초/ 58℃에서 40초/72℃에서 1분으로 40회의 사이클(cycles)을 행한 후, 72℃에서 10분간 수행하였다. Further, by using the RT-PCR confirmed the expression of Oct4, RT- reaction was for 50 minutes at 37 row ℃, at 70 ℃ 10 bungan, PCR- reaction in 5 minutes at 95 ℃, and 95 ℃ 30 sec / On the 58 ℃ 40 sec / in 72 ℃ to one minute, subjected to 40 cycles (cycles), it was carried out at 72 ℃ 10 minutes. 그 결과, 도 9에 나타나 있는 것처럼 기저탈락막 유래 줄기세포 및 양막 유래 줄기세포의 경우 800bp에서 발현되어 있음을 확인할 수 있었다. As a result, it was confirmed that also in the base, as shown in Expression 9 decidua For derived cells and the amniotic membrane-derived stem cells 800bp.

실시예 6: 태반조직 다능성 줄기세포의 근세포로의 분화 Example 6: differentiation of pluripotent stem cells of placental tissue muscle

실시예 3에서 수득한 태반조직 유래 다능성 줄기세포를 10 ng/ml 피브로넥틴(fibronectin)이 코팅되어 있는 플라스크에 분주한 후 10 μM 5'-아자사이티딘(azacytidine)을 이용하여 24시간 동안 전처리를 한다. Carried out after the frequency division to a placenta derived pluripotent stem cells obtained in Example 3 in a flask that is 10 ng / ml of fibronectin (fibronectin) is coated using a 10 μM 5'- aza cytidine (azacytidine) pretreated for 24 hours do. 전처리 후 SKBM 배지(Cambrex, Co.)를 이용하여 10 일 동안 배양한 후 면역 염색을 실시하였다. After the pre-treatment after using SKBM medium (Cambrex, Co.) were cultured for 10 days were subjected to immunostaining.

그 결과, 본 발명에 따른 인간 태반조직 유래 다능성 줄기세포는 근육세포의 특이항원인 미오신에 대하여 양성반응을 나타냈다. As a result, the human placenta-derived multipotent stem cells according to the present invention showed a positive response against the specific antigen of myosin muscle cells. 이 결과로부터 본 발명에 따른 인간 태반조직 유래 다능성 줄기세포가 근육세포로 분화된 것을 확인할 수 있었다 Human placental-derived multipotent stem cells according to the invention from this result that it was confirmed that the differentiated into muscle cells

실시예 7: 태반조직 다능성 줄기세포의 신경세포로의 분화 Example 7: Differentiation of placental tissue are nerve cells of the multipotent stem cells

실시예 3에서 수득한 태반조직 유래 다능성 줄기세포를 1mM BME 및 10% FBS 를 첨가한 DMEM 배지를 사용해 1일 동안 전배양(preincubation)하였다. Carried out using a placental derived is added to the pluripotent stem cells 1mM BME and 10% FBS DMEM medium obtained in Example 3 was pre-culture (preincubation) for one day. 전배양 후 1% DMSO 및 100μM BHA를 함유한 신경세포 분화 유도 배지에서 신경세포로의 분화를 유도하였다. In the pre-culture after 1% DMSO, and differentiation-induced neural cells containing 100μM BHA medium to induce differentiation into nerve cells. 신경분화유도 배지를 첨가하고 9일 후, 면역염색을 실시하였다. Adding a differentiation-inducing medium, and care was performed after 9 days, immunostaining.

그 결과, 본 발명에 따른 인간 태반조직 유래 다능성 줄기세포는 신경계 성상세포의 특이항원인 GFAP(glial fibrillary acidic protein)에 대하여 양성반응을 나타냈다. As a result, the human placenta-derived multipotent stem cells according to the present invention showed a positive response against the GFAP (glial fibrillary acidic protein) antigen of the nervous system, astrocytes. 이 결과로부터 본 발명에 따른 인간 태반조직 유래 다능성 줄기세포가 신경세포로 분화된 것을 확인할 수 있었다(도 6). Human placental-derived multipotent stem cells according to the invention from this result that it was confirmed that the differentiation into nerve cells (Fig. 6).

실시예 8: 태반 유래 다능성 줄기세포의 골형성 세포로의 분화 Example 8: Differentiation of the placenta-derived osteogenic cells in pluripotent stem cells

실시예 3에서 수득한 태반조직 유래 태반 줄기세포를 골형성 유도 배지 (0.1 μmol/L dexamethasone, 0.05 mmol/L ascorbic acid-2- phosphate, 및 10 mmol/L beta-glycophsphate, 5 ~ 30 % 인간 혈청 또는 플라즈마)에 희석하여 세포수를 센 다음, 플라스크에서 배양 (5% CO2, 37, 배지는 3 ~4일에 한번씩 교체)하여 골형성 세포로 분화를 유도하였다. Example 3 a placental derived placental stem cells to osteogenic induction medium obtained in (0.1 μmol / L dexamethasone, 0.05 mmol / L ascorbic acid-2- phosphate, and 10 mmol / L beta-glycophsphate, 5 ~ 30% human serum or plasma), and then count the number of cells, and cultured (5% CO2, 37, the medium is replaced every 3 to 4 days) in the flask was induced to differentiate into bone-forming cells was diluted to. 배양 시작 후 14일때 Alizalin red S 염색법을 이용하여 태반 유래 다능성 줄기세포가 골형성 세포로 분화되었음을 확인하였다 (도 7). The culture started after 14 when Alizalin red S staining placenta-derived pluripotent stem cells by using the identified that differentiate into bone-forming cells (Fig. 7).

실시예 9: 태반조직 다능성 줄기세포의 지방세포로의 분화 Example 9: differentiation of adipocytes of placental multipotent stem cells

실시예 3에서 수득한 태반조직 유래 다능성 줄기세포를 5% FBS, 1μM Dexamethasone, 200μM Indomethacin, 10㎍/㎕ Insulin, 0.5mM IBMX(3-isobutyl-1-methylxanthine)을 함유한 α-MEM 배지에서 2주 동안 배양하여 다능성 줄기세포의 지방세포로의 분화를 유도하고, Oil red O 염색법을 이용하여 분석하였다. Conduct a placenta-derived multipotent stem cells obtained in Example 3 5% FBS, 1μM Dexamethasone, 200μM Indomethacin, 10㎍ / ㎕ Insulin, 0.5mM IBMX (3-isobutyl-1-methylxanthine) in a α-MEM medium containing cultured for two weeks to induce the differentiation of adipocytes in the pluripotent stem cell, which was then analyzed using Oil red O staining. 그 결과, 본 발명에 따른 인간 태반 조직 유래 다능성 줄기세포가 지방세포로 분화된 것을 확인할 수 있었다(도 8). As a result, it was confirmed that the present invention derived from human placenta tissue according to the pluripotent stem cells differentiated into adipocytes (Fig. 8).

이상 상세히 기술한 바와 같이, 본 발명에 따른 태반 조직을 이용한 태반 줄기세포의 제조방법은 기존의 다른 조직으로부터 줄기세포를 제조하는 것과 비교해서, 더 효율적으로 생산할 수 있고, 본 발명에 따른 다능성 줄기세포는 근세포, 혈관내피세포, 골형성 세포, 신경세포, 성상세포, 지방세포, 연골형성 세포, 골형성 세포, 또는 인슐린 분비 췌장 베타세포 등으로 분화하는 능력을 가지고 있어, 간경변, 골다공증, 골관절염, 신경질환, 당뇨병 등의 치료에 효과적이고, 유방 조직 형성에 유용하다. Or more, as described in detail, by the manufacturing method of the placental stem cells using placental tissue according to the invention are compared with those for a stem cell from the other existing organizations, can be produced more efficiently, stem possibility is according to the invention cells are muscle cells, endothelial cells, and bone-forming cells, neurons, astrocytes, it has the ability to differentiate into fat cells, cartilage forming cells and bone-forming cells, or insulin-secreting pancreatic beta cells, such as liver cirrhosis, osteoporosis, osteoarthritis, effective in the treatment of neurological diseases such as diabetes and is useful in the formation of breast tissue.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. To a person of ordinary skill in the art over the bar hayeotneun described a preferred embodiment of the present invention the content, that this description is merely only yangtaeil preferred embodiment, whereby the dot is not to be limit the scope of the present invention are apparent something to do. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다. Thus, the substantial scope of the present invention will be defined by the appended claims and equivalents thereof.

Claims (21)

  1. 인간 태반 조직의 양막, 장막, 기저탈락막 또는 태반 조직을 bFGF함유 배지에서 배양한 다음 회수하는 것을 특징으로 하는, 다음과 같은 특성을 나타내는 성체 줄기세포의 제조방법:: Human amniotic membrane of the placenta, the tent, the bottom decidua or placental tissue to bFGF-containing cultured in a culture medium and then recovered, characterized in that, following the production method of the adult stem cells showing the following characteristics to:
    (a) CD29, CD44, CD54, CD73, CD90 및 CD105에 대하여 모두 양성의 면역학적 특성을 나타내고, CD31, CD34, CD45 및 HLA-DR에 대하여 모두 음성의 면역학적 특성을 나타냄; (A) CD29, CD44, CD54, CD73, CD90 and CD105 with respect to both indicate the immunological properties of the positive, CD31, CD34, CD45, and both with respect to the HLA-DR represents the immunological characteristics of the voice;
    (b) Oct4 및 SSEA4에 대하여 양성의 면역학적 특성을 나타냄; (B) represents the immunological properties of the positive for Oct4 and SSEA4;
    (c) 플라스틱에 부착되어 성장하며, 둥근형태(round-shape) 또는 선형태(spindle-shape)의 형태학적 특성을 나타내고, SFM 배지에서 스피어(sphere)를 형성하여 미분화 상태로 유지됨; (C) is attached to the plastic growth, round shape (round-shape), or represents a morphological characteristic of a line shape (spindle-shape), to form a sphere (sphere) in SFM medium is maintained in the undifferentiated state; And
    (d) 중배엽 또는 외배엽 유래 세포로 분화하는 능력을 가짐. (D) having the ability to differentiate into mesoderm or ectoderm-derived cells.
  2. 제1항의 방법에 의해 수득한, 다음과 같은 특성을 나타내는 태반 줄기세포: The placental stem cells, indicating the, following characteristics obtained by the method of claim 1:
    (a) CD29, CD44, CD73, CD90 및 CD105에 대하여 모두 양성의 면역학적 특성을 나타내고, CD31, CD34, CD45 및 HLA-DR에 대하여 모두 음성의 면역학적 특성을 나타냄; (A) CD29, CD44, CD73, CD90 and CD105 with respect to both indicate the immunological properties of the positive, CD31, CD34, CD45, and both with respect to the HLA-DR represents the immunological characteristics of the voice;
    (b) Oct4 및 SSEA4에 대하여 양성의 면역학적 특성을 나타냄; (B) represents the immunological properties of the positive for Oct4 and SSEA4;
    (c) 플라스틱에 부착되어 성장하며, 둥근형태(round-shape) 또는 선형태(spindle-shape)의 형태학적 특성을 나타내고, SFM 배지에서 스피어(sphere)를 형성하여 미분화 상태로 유지됨; (C) is attached to the plastic growth, round shape (round-shape), or represents a morphological characteristic of a line shape (spindle-shape), to form a sphere (sphere) in SFM medium is maintained in the undifferentiated state; And
    (d) 중배엽 또는 외배엽 유래 세포로 분화하는 능력을 가짐. (D) having the ability to differentiate into mesoderm or ectoderm-derived cells.
  3. 제2항에 있어서, 상기 중배엽 유래 세포는 골형성 세포, 연골세포, 근세포 또는 지방세포이고, 외배엽 유래 세포는 신경세포인 것을 특징으로 하는 태반 줄기세포. The method of claim 2, wherein the mesenchymal cells are derived from bone-forming cells, cartilage cells, muscle cells or adipocytes, and, ectoderm-derived cells, placenta stem cells, characterized in that the neurons.
  4. 제2항의 태반 줄기세포를 하루 동안 아자사이티딘(azacytidine)을 전처리 한 후 SKBM 배지에서 배양하는 것을 특징으로 하는, 태반 줄기세포를 근세포로 분화시키는 방법. After the pre-treatment for 2 of the placental stem cells, the tidin-aza between the day (azacytidine) a method for the differentiation, placental stem cells, which comprises culturing in a medium SKBM muscle cells.
  5. 제4항의 방법에 의해 분화된 근세포를 유효성분으로 함유하는 근질환 치료용 세포 치료제. Claim for the differentiated muscle cells by the method of claim 4 myopathy cell therapy for treatment which contains as an active ingredient.
  6. 다음의 단계를 포함하는, 태반 줄기세포를 신경세포로 분화시키는 방법: How to differentiate, placental stem cells comprising the steps of a neuron:
    (a) 제2항의 태반 줄기세포를 BME 및 FBS를 함유한 DMEM 배지에 전배양 하는 단계; (A) pre-culture step of the second term placental stem cells in DMEM medium containing BME and FBS; And
    (b) 상기 전배양액을 DMSO 및 BHA로 처리하여 신경분화를 유도하는 단계. (B) inducing neuronal differentiation was treated in the pre-culture with DMSO and BHA.
  7. 제6항의 방법에 의해 분화된 신경세포를 유효성분으로 함유하는 신경질환 치료용 세포 치료제. Claim the neural cells differentiated by the method of claim 6, neurological disorders of cell therapy for the treatment which contains as an active ingredient.
  8. 제2항의 태반 줄기세포를 TCP(Tricalcium phosphate)와 혼합하여 이소이식하는 것을 특징으로 하는, 태반 줄기세포를 골형성 세포로 분화시키는 방법. The second term by the placental stem cells mixed with TCP (Tricalcium phosphate) a method for differentiation of isopropyl transplantation, placental stem cells, characterized in that a bone-forming cells.
  9. 제8항의 방법에 의해 분화된 골형성세포를 유효성분으로 함유하는 골다공증 치료용 세포 치료제. The cellular therapeutic agent for the treatment of osteoporosis containing the osteogenic cells differentiated by the method of claim 8 as an active ingredient.
  10. 제2항의 태반 줄기세포를 덱사메타손(dexamethasone), 인도메타신(indomethacin), 인슐린 및 IBMX를 함유한 α-MEM배지에서 배양하는 것을 특징으 로 하는, 태반 줄기세포를 지방세포로 분화시키는 방법. A method of differentiating the second term placental stem cells, the dexamethasone (dexamethasone), indomethacin (indomethacin),, placental stem cells that lead to the characteristics of a cultured in α-MEM medium containing insulin and IBMX into adipocytes.
  11. 제10항의 방법에 의해 분화된 지방세포를 유효성분으로 함유하는 유방 조직 형성용 세포 치료제. Claim the adipocyte differentiation by the method of claim 10 for forming breast tissue cell therapy containing as an active ingredient.
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  16. 근세포로 분화되는 특성을 가지는 제2항의 태반 줄기세포를 유효성분으로 함유하는 근질환 치료용 세포 치료제. Myopathy cell therapy for the treatment containing the second term placental stem cells having the characteristics of differentiating into muscle cells as an active ingredient.
  17. 신경세포로 분화되는 특성을 가지는 제2항의 태반 줄기세포를 유효성분으로 함유하는 신경질환 치료용 세포 치료제. The second term placental stem cells for cell therapy for the treatment neurological diseases containing as an active ingredient, having the characteristics that differentiate into neurons.
  18. 연골세포로 분화되는 특성을 가지는 제2항의 태반 줄기세포를 유효성분으로 함유하는 골관절염 치료용 세포 치료제. The cellular therapeutic agent for treating osteoarthritis containing 2 of the placental stem cells as an active ingredient, having the characteristics that differentiate into chondrocytes.
  19. 골형성 세포로 분화되는 특성을 가지는 제2항의 태반 줄기세포를 유효성분으 로 함유하는 골다공증 치료용 세포 치료제. Osteoporosis cell therapy for the treatment containing the second term placental stem cells having the characteristics that differentiate into osteogenic cells to the active ingredient coming.
  20. 지방세포로 분화되는 특성을 가지는 제2항의 태반 줄기세포를 유효성분으로 함유하는 유방 조직 형성용 세포 치료제. Adipocytes second term placental stem cells, the therapeutic agent for forming breast tissue containing as an active ingredient, having the characteristics that differentiate into.
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