RU2539918C1 - Method for preparing tissue-specific matrix for tissue engineering of parenchymal organ - Google Patents
Method for preparing tissue-specific matrix for tissue engineering of parenchymal organ Download PDFInfo
- Publication number
- RU2539918C1 RU2539918C1 RU2013152894/15A RU2013152894A RU2539918C1 RU 2539918 C1 RU2539918 C1 RU 2539918C1 RU 2013152894/15 A RU2013152894/15 A RU 2013152894/15A RU 2013152894 A RU2013152894 A RU 2013152894A RU 2539918 C1 RU2539918 C1 RU 2539918C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- organ
- matrix
- perfusion
- cells
- tissue
- Prior art date
Links
Images
Landscapes
- Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к медицине, а именно к регенеративной медицине и клеточной трансплантологии, может быть использовано при изготовлении и трансплантации тканеинженерных конструкций (ТИК) для коррекции или лечения недостаточности паренхиматозных органов. При этом на предлагаемом нативном тканеспецифическом матриксе может быть иммобилизован тканеспецифический клеточный материал для получения имплантируемых тканевых эквивалентов соответствующих паренхиматозных органов.The invention relates to medicine, namely to regenerative medicine and cell transplantology, can be used in the manufacture and transplantation of tissue engineering structures (TECs) for the correction or treatment of insufficiency of parenchymal organs. Moreover, tissue-specific cellular material can be immobilized on the proposed native tissue-specific matrix to obtain implantable tissue equivalents of the corresponding parenchymal organs.
Предлагаемый способ может быть использован в специализированных отделениях, занимающихся регенеративной медициной при лечении или коррекции недостаточности функций печени, почек, легких, поджелудочной железы и других паренхиматозных органов путем индукции и поддержания в поврежденных органах процессов восстановительной регенерации.The proposed method can be used in specialized departments involved in regenerative medicine in the treatment or correction of insufficiency of the liver, kidneys, lungs, pancreas and other parenchymal organs by inducing and maintaining regenerative regeneration processes in damaged organs.
В настоящее время для длительной компенсации функции поврежденного органа используются приемы тканевой инженерии, предполагающие создание имплантируемых ТИК. Ключевым вопросом создания эффективных ТИК является разработка матриксов (каркасов), позволяющих доставлять специфические клетки в орган, требующий коррекции, и обеспечивать их длительное функционирование в нем.Currently, tissue engineering techniques involving the creation of implantable TECs are used for long-term compensation of the function of a damaged organ. A key issue in creating effective TECs is the development of matrices (scaffolds) that allow the delivery of specific cells to the organ requiring correction and ensure their long-term functioning in it.
Известны неспецифические биосинтетические или синтетические матриксы для иммобилизации клеточного материала и пролонгирования сроков выживания изолированных ассоциатов тканеспецифических клеток [Kulig K.M. & Vacanti J.P. Hepatic tissue engineering. // Transpl. Immunol. - 2004. - Vol.12. - p.303-310].Non-specific biosynthetic or synthetic matrices are known for immobilizing cellular material and prolonging the survival time of isolated tissue-specific cell associates [Kulig K.M. & Vacanti J.P. Hepatic tissue engineering. // Transpl. Immunol. - 2004 .-- Vol.12. - p.303-310].
Отсутствие биологически совершенных как биосинтетических, так и синтетических матриксов для доставки жизнеспособных тканеспецифических клеток в поврежденный орган, удержания их там и обеспечения условий нормального и длительного функционирования первичной культуры специализированных клеток заставляет разрабатывать новые технологии получения матриксов, удовлетворяющих этим требованиям [Севастьянов В.И., Перова Н.В., Немец Е.А., Сургученко В.А., Пономарева А.С. Примеры экспериментально-клинического применения биосовместимых материалов в регенеративной медицине. В книге: Биосовместимые материалы (учебное пособие). Под ред. В.И. Севастьянова и М.П. Кирпичникова // МИА. - М. - 2011 г., Часть II, глава 3, с.237-252].The lack of biologically perfect both biosynthetic and synthetic matrices for delivering viable tissue-specific cells to the damaged organ, keeping them there and ensuring the conditions for normal and long-term functioning of the primary culture of specialized cells forces us to develop new technologies for producing matrices that meet these requirements [V. Sevastyanov, Perova N.V., Nemets E.A., Surguchenko V.A., Ponomareva A.S. Examples of experimental and clinical use of biocompatible materials in regenerative medicine. In the book: Biocompatible materials (study guide). Ed. IN AND. Sevastyanova and M.P. Kirpichnikova // MIA. - M. - 2011, Part II, chapter 3, p.237-252].
Среди матриксов предпочтение отдается полимерам природного происхождения (биополимерам) и их производным: альгинаты, коллаген, желатин, хитозан, гиалуроновая кислота, полиэфиры бактериального происхождения [Волова Т.Г., Севастьянов В.И., Шишацкая Е.И. Полиоксиалканоаты - биоразрушаемые полимеры для медицины: Монография. 2-е изд., дополн. и переработ. - Красноярск, «Платина» 2006. - 288]; спидроинам-белкам каркасной нити пауков [Moisenovich М.М., Pustovalova О.L., Arhipova A.Yu., Vasiljeva Т.V., Sokolova О.S., Bogush V.G., Debabov V.G., Sevastianov V.I., Kirpichnikov М.P., Agapov I.I. In vitro and in vivo biocompatibility studies of a recombinant analogue of spidroin 1 scaffolds // Journal of biomedical materials research. - 2011. - Vol.96. - p.125-131].Among the matrices, preference is given to polymers of natural origin (biopolymers) and their derivatives: alginates, collagen, gelatin, chitosan, hyaluronic acid, polyesters of bacterial origin [Volova TG, Sevastyanov VI, Shishatskaya E.I. Polyoxyalkanoates - Biodegradable Polymers for Medicine: Monograph. 2nd ed. and recycling. - Krasnoyarsk, "Platinum" 2006. - 288]; spidroin proteins of the spider carcass [Moisenovich M.M., Pustovalova O.L., Arhipova A.Yu., Vasiljeva T.V., Sokolova O.S., Bogush VG, Debabov VG, Sevastianov VI, Kirpichnikov M.P. ., Agapov II In vitro and in vivo biocompatibility studies of a recombinant analogue of
Эти матриксы наряду с высокотехнологичными свойствами обладают в разной степени выраженности биосовместимостью, механической прочностью, эластичностью, биодеградабельностью, отсутствием иммуногенности. Однако эти матриксы не обладают тканеспецифической каркасностью и потому нуждаются в декорировании (дополнительном покрытии) или модифицировании их поверхности путем введения структур - сайтов для адгезии клеток.These matrices, along with high-tech properties, have varying degrees of biocompatibility, mechanical strength, elasticity, biodegradability, and lack of immunogenicity. However, these matrices do not have a tissue-specific framework and therefore need decoration (additional coating) or surface modification by introducing structures - sites for cell adhesion.
Известны способы изготовления нативного матрикса различных паренхиматозных органов, обеспечивающие изготовление тканеспецифического объемного матрикса - каркаса целого органа с сохранением архитектоники ткани и микроциркуляторного русла путем децеллюляризации органа: почек [Karina H., Nakayama B.S., Batchelder С.А., Lee С.I., Tarantal A.F. Decellularized Rhesus Monkey Kidney as a Three-Dimensional Scaffold for Renal Tissue Engineering. // Tissue Engineering. - 2010. - Part A. Vol.16. - p.2207-2216], сердца [Ott H.C., Matthiesen T.S., Goh S.K. et al. Perfusion-decellularized matrix: using nature's platform to engineer a bioartificial heart. // Nat. Med. - 2008. Vol.14(2). - p.213-221], легких [Petersen Т.Н., Calle E.A., Colehour M.B., Niklason L.E. Matrix composition and mechanics of decellularized lung scaffolds. // Cells Tissues Organs. - 2012. - Vol.195(3). - p.222-231], печени [Badylak S. Decellularized liver for repair of tissue and treatment of organ deficiency // Patent US 2004/0176855 A1. - September 9. - 2004, Baptista P.M., Siddiqui M.M., Lozier G. et al. The use of whole organ decellularization for the generation of a vascularized liver organoid. // Hepatology. - 2011. Vol.53(2). - p.604-617] и других органов [Arenas-Herrera J.E., Ко I.K., Atala A., Yoo J.J. Decellularization for whole organ bioengineering. //Biomed Mater. - 2013. Vol.8(1): 014106. Park K.M., Woo H.M. Systemic decellularization for multi-organ scaffolds in rats. // Transplant. Proc. - 2012. - Vol.44(4). - p.1151-1154].Known methods for the manufacture of the native matrix of various parenchymal organs, providing the manufacture of tissue-specific volumetric matrix - the frame of the whole organ while maintaining the architectonics of the tissue and the microvasculature through the decellularization of the organ: kidney [Karina H., Nakayama BS, Batchelder S.A., Lee C.I., Tarantal af Decellularized Rhesus Monkey Kidney as a Three-Dimensional Scaffold for Renal Tissue Engineering. // Tissue Engineering. - 2010 .-- Part A. Vol. 16. - p.2207-2216], hearts [Ott H.C., Matthiesen T.S., Goh S.K. et al. Perfusion-decellularized matrix: using nature's platform to engineer a bioartificial heart. // Nat. Med. - 2008. Vol.14 (2). - p.213-221], lungs [Petersen T.N., Calle E.A., Colehour M.B., Niklason L.E. Matrix composition and mechanics of decellularized lung scaffolds. // Cells Tissues Organs. - 2012 .-- Vol. 195 (3). - p.222-231], liver [Badylak S. Decellularized liver for repair of tissue and treatment of organ deficiency // Patent US 2004/0176855 A1. - September 9. - 2004, Baptista P.M., Siddiqui M.M., Lozier G. et al. The use of whole organ decellularization for the generation of a vascularized liver organoid. // Hepatology. - 2011. Vol. 53 (2). - p.604-617] and other organs [Arenas-Herrera J.E., Co. I.K., Atala A., Yoo J.J. Decellularization for whole organ bioengineering. // Biomed Mater. - 2013. Vol.8 (1): 014106. Park K.M., Woo H.M. Systemic decellularization for multi-organ scaffolds in rats. // Transplant. Proc. - 2012 .-- Vol.44 (4). - p.1151-1154].
Каркасные белки нативных матриксов интегративно содержат в своем составе остатки тканевых структур (гликопротеиды внеклеточного вещества, структурные белки межклеточных контактов и факторы прикрепления клеток), которые позволяют оптимизировать условия для пролонгированной жизнедеятельности прикрепившихся клеток.The framework proteins of native matrices integratively contain the remnants of tissue structures (extracellular substance glycoproteins, structural proteins of intercellular contacts and cell attachment factors), which allow optimizing conditions for prolonged vital activity of attached cells.
Децеллюляризированные органные матриксы предназначены для их последующей рецеллюляризации (ревитализации) и изготовления рецеллюляризованных (ревитализированных) трансплантатов целых органов путем их реинженеринга [Barakat О., Abbasi S., Rodriguez G., Rios J., Wood R.P., Ozaki C., Holley L.S., Gauthier P.K. Use of decellularized porcine liver for engineering humanized liver organ. // J. Surg. Res. - 2012. Vol.173(1). - p.11-25].Decellularized organ matrices are intended for their subsequent recellularization (revitalization) and the manufacture of recellularized (revitalized) transplants of whole organs by their reengineering [Barakat O., Abbasi S., Rodriguez G., Rios J., Wood RP, Ozaki C., Holley LS, Gauthier PK Use of decellularized porcine liver for engineering humanized liver organ. // J. Surg. Res. - 2012. Vol. 173 (1). - p.11-25].
В качестве прототипа предлагаемого способа нами выбран известный способ изготовления децеллюляризированного матрикса паренхиматозного органа, например печени. [Baptista P.M., Vyas D., Moran E., Wang Z., Soker S. Human Liver Bioengineering Using a Whole Liver Decellularized Bioscaffold. // Methods Mol. Biol. - 2013. - Vol.1001, - p.289-298].As a prototype of the proposed method, we have chosen a well-known method of manufacturing a decellularized matrix of a parenchymal organ, such as the liver. [Baptista P.M., Vyas D., Moran E., Wang Z., Soker S. Human Liver Bioengineering Using a Whole Liver Decellularized Bioscaffold. // Methods Mol. Biol. - 2013. - Vol. 1001, - p. 289-298].
Сущность способа-прототипа заключается в следующем.The essence of the prototype method is as follows.
Для получения тканеспецифического матрикса печени используют донорскую печень человека. Путем перфузии сосудистого русла органа специальными децеллюляризирующими составами получают изолированный цельный децеллюляризированный орган, состоящий из внеклеточных белков, сохраняющих внутреннюю архитектонику органа, которая при засеве клеток позволяет прикрепляться различным типам специализированных клеток, обеспечивающих его специализированную функцию.To obtain a tissue-specific matrix of the liver, a human donor liver is used. By perfusion of the vascular bed of an organ with special decellularizing formulations, an isolated whole decellularized organ is obtained, consisting of extracellular proteins that preserve the internal architectonics of the organ, which, when inoculated with cells, allows various types of specialized cells to adhere, providing its specialized function.
К недостаткам прототипа, предполагающего использование децеллюляризированного органного матрикса, относятся:The disadvantages of the prototype, which involves the use of a decellularized organ matrix, include:
- высокий процент неполной децеллюляризации трупных донорских трансплантатов из-за возникающих в нем нарушений микроциркуляции;- a high percentage of incomplete decellularization of cadaveric donor grafts due to microcirculation disturbances arising in it;
- сложность полноценного заселения клетками всего объема органных децеллюляризированных матриксов;- the complexity of the full-fledged population of cells with the entire volume of organ decellularized matrices;
- сложность доставки кислорода и питательных веществ ко всем прикрепленным донорским клеткам, особенно в глубине органного матрикса;- the complexity of the delivery of oxygen and nutrients to all attached donor cells, especially in the depths of the organ matrix;
- сложность и низкая эффективность рецеллюляризации и реинженеринга децеллюляризированных органных матриксов;- the complexity and low efficiency of recellularization and reengineering of decellularized organ matrices;
- отсутствие надежного и точного контроля объема и глубины заселения матриксов клеточным материалом при рецеллюляризации;- the lack of reliable and accurate control of the volume and depth of population of the matrices with cellular material during recellularization;
- сложность надежного и точного контроля формирования межклеточных взаимоотношений в рецеллюляризированной структуре, что соответственно не позволяет точно контролировать биологические функции вновь созданной ткани (органа);- the complexity of reliable and accurate control of the formation of intercellular relationships in the recellularized structure, which accordingly does not allow precise control of the biological functions of the newly created tissue (organ);
- отсутствие индивидуальных режимов и стандартизированных сроков культивационного перфузирования при рецеллюляризации нативных органных матриксов для формирования адекватной биологической функции вновь созданной ткани (органа).- the lack of individual modes and standardized periods of cultivation perfusion during the recellularization of native organ matrices to form an adequate biological function of the newly created tissue (organ).
Нами поставлена задача разработать доступный, дешевый и универсальный способ получения матрикса, сохраняющего нативные свойства и тканеспецифичность, который может быть использован для изготовления имплантируемых ТИК паренхиматозных органов.We set the task to develop an affordable, cheap and universal way to obtain a matrix that retains the native properties and tissue specificity, which can be used for the manufacture of implantable TECs of parenchymal organs.
Технический результат, достигаемый при осуществлении заявляемого способа, заключается в одновременномThe technical result achieved by the implementation of the proposed method is to simultaneously
- повышении полноты децеллюляризации за счет профилактики нарушений микроциркуляции в донорском органе;- increasing the completeness of decellularization due to the prevention of microcirculation disorders in the donor organ;
- упрощениии реинженеринга матрикса, обеспечении увеличения плотности и равномерности рецеллюляризации всего объема матрикса и упрощении контроля за ней за счет увеличения площади адгезивных поверхностей матрикса для контакта с засеваемыми клетками путем получения его в форме порошка (микрогранул);- simplification of matrix reengineering, ensuring an increase in the density and uniformity of the recellularization of the entire matrix volume and simplification of control over it by increasing the area of the adhesive surfaces of the matrix for contact with seeded cells by obtaining it in the form of a powder (microgranules);
- обеспечении удобства при хранении полученного матрикса в условиях бытового холодильника за счет последовательного применения оригинального режима процедур: механического измельчения, замораживания, дополнительного измельчения замороженного матрикса донорского органа, высушивания его и стерилизации;- providing convenience during storage of the obtained matrix in a domestic refrigerator due to the consistent application of the original mode of procedures: mechanical grinding, freezing, additional grinding of the frozen matrix of the donor organ, drying it and sterilization;
- сохранении тканеспецифичности матрикса за счет сохранения нативных свойств его структурных белков, межклеточных контактов и факторов прикрепления клеток.- preservation of tissue specificity of the matrix by preserving the native properties of its structural proteins, intercellular contacts and cell attachment factors.
Таким образом, измельчение матрикса до порошкообразного состояния (до получения микрогранул) позволяет не только увеличить его поверхность для контакта с клетками при рецеллюляризации, что в свою очередь обеспечивает надежность прикрепления тканеспецифического клеточного материала, но также визуально контролировать процесс сокультивирования матрикса и клеток.Thus, grinding the matrix to a powder state (until microbeads are obtained) allows not only to increase its surface for contact with cells during recellularization, which in turn ensures reliable attachment of tissue-specific cellular material, but also visually control the process of co-cultivation of the matrix and cells.
При использовании полученного с помощью патентуемого способа матрикса можно визуально контролировать рецеллюляризацию, подбирать соотношение площади матрикса и количества засеваемых клеток для повышения эффективности пролиферации последних при создании и имплантации ТИК.When using the matrix obtained using the patented method, it is possible to visually control the recellularization, to select the ratio of the matrix area and the number of seeded cells to increase the proliferation of the latter when creating and implanting TECs.
Предлагаемый способ позволяет создать адекватные условия для прорастания сосудов через полученные матриксы (на отдельных участках матрикс сам может представлять собой стенку сосуда), что создает условия для пролонгированной жизнедеятельности посаженных на них клеток.The proposed method allows you to create adequate conditions for the germination of blood vessels through the obtained matrixes (in some sections, the matrix itself can be a vessel wall), which creates the conditions for prolonged vital activity of the cells planted on them.
Заявляемый способ позволяет отказаться от необходимости применения дополнительного покрытия (декорирования, модифицирования) поверхности матрикса внеклеточными тканевыми структурными белками для усиления клеточной адгезии тканеспецифических клеток.The inventive method eliminates the need for additional coating (decoration, modification) of the matrix surface with extracellular tissue structural proteins to enhance cell adhesion of tissue-specific cells.
Еще одним достоинством предложенного способа получения биологического матрикса является возможность его длительного хранения перед применением с сохранением тканеспецифичности. При этом с помощью предлагаемого способа матриксы для ТИК паренхиматозных органов могут быть получены как в трансплантационных центрах, так и централизованно, что при возможности длительного хранения матрикса создает удобство для его применения. Централизованная заготовка матриксов для ТИК может быть исключена.Another advantage of the proposed method for producing a biological matrix is the possibility of its long-term storage before use while maintaining tissue specificity. Moreover, using the proposed method, matrices for TECs of parenchymal organs can be obtained both in transplant centers and centrally, which, if possible, long-term storage of the matrix creates convenience for its use. Centralized matrix procurement for TECs can be eliminated.
В предлагаемом изобретении не используются ткани и/или клеточный материал эмбрионов человека. Использован донорский материал только взрослых доноров.The present invention does not use tissue and / or cellular material of human embryos. Donor material used only by adult donors.
Сущность изобретения заключается в следующем.The invention consists in the following.
Способ получения тканеспецифического матрикса для тканевой инженерии паренхиматозного органа включает профилактику внутрисосудистой агрегации клеточных элементов крови и нарушений микроциркуляции за 60-120 минут до перфузионной отмывки донорского органа путем внутримышечного или внутривенного введения донору дезагреганта или дезагрегантов. Затем проводят перфузионную отмывку донорского органа, далее извлекают (эксплантируют) одноименный (соответствующий) донорский паренхиматозный орган человека и затем проводят децеллюляризацию. Так, для получения тканеспецифического матрикса для тканевой инженерии, например, печени используют донорскую печень человека, для получения тканеспецифического матрикса для тканевой инженерии, например, почки используют донорскую почку человека, для получения тканеспецифического матрикса для тканевой инженерии, например, поджелудочной железы используют донорскую поджелудочную железу человека. При этом после процедуры децеллюляризации осуществляют перфузию децеллюляризированного органа путем введения в его сосудистое русло физиологического раствора забуференного фосфатами, который получен из следующего состава: 138 мМ NaCl, 2,67 мМ KCl, 1,47 мМ КН2РО4, 8,1 мМ Na2HPO4, дистиллированная вода до 1 л, и содержит 1% сывороточного альбумина и 10-15% глицерина или 10-15% диметилсульфоксида. Используемый перфузионный раствор имеет рН 7,4. Объем вводимого перфузионного раствора равен двойному объему сосудистого русла органа. При проведении перфузии обеспечивают перфузионное давление в артериальной системе децеллюляризированного органа 100-120 мм ртутного столба. Затем децеллюляризированный орган измельчают с образованием частиц размером (до размера частиц) от 0,5 мм до 4 мм. Измельченные фрагменты разделяют на порции по 5-10 г. Замораживают каждую порцию путем погружения в жидкий азот на 5-10 минут. Далее замороженные порции измельчают повторно с образованием частиц размером (до размера частиц) не более 600 мкм. После чего проводят размораживание каждой порции путем ресуспендирования (погружения) в 30-70 мл физиологического раствора забуференного фосфатами с рН 7,4, полученного из состава, содержащего 138 мМ NaCl, 2,67 мМ KCl, 1,47 мМ KH2PO4, 8,1 мМ Na2HPO4, дистиллированную воду до 1 л, при комнатной температуре. Из полученной суспензии отделяют (удаляют) частицы размером менее 200 мкм. После чего полученную фракцию частиц подвергают лиофильному высушиванию и стерилизации и получают образцы искомого матрикса.A method for producing a tissue-specific matrix for tissue engineering of a parenchymatous organ involves the prevention of intravascular aggregation of blood cell elements and microcirculation disorders 60-120 minutes before perfusion washing of a donor organ by intramuscular or intravenous administration of a disaggregant or disaggregants to the donor. Then, a donor organ is perfused, then a human donated parenchymal organ of the same name is extracted (explanted) and then decellularization is performed. So, to obtain a tissue-specific matrix for tissue engineering, for example, the liver using a human donor liver, to obtain a tissue-specific matrix for tissue engineering, for example, the kidneys use a human donor kidney, to obtain a tissue-specific matrix for tissue engineering, for example, the pancreas, use a donor pancreas person. In this case, after the decellularization procedure, the decellularized organ is perfused by introducing into its vascular bed a physiological phosphate buffered saline solution obtained from the following composition: 138 mM NaCl, 2.67 mM KCl, 1.47 mM KH 2 PO 4 , 8.1 mM Na 2 HPO 4, distilled water up to 1 liter, and contains 1% serum albumin and 10-15% glycerol or 10-15% dimethyl sulfoxide. The perfusion solution used has a pH of 7.4. The volume of injected perfusion solution is equal to the double volume of the vascular bed of the organ. When performing perfusion, perfusion pressure is provided in the arterial system of the decellularized organ of 100-120 mmHg. Then the decellularized organ is crushed to form particles with a size (up to particle size) from 0.5 mm to 4 mm. The crushed fragments are divided into portions of 5-10 g. Each portion is frozen by immersion in liquid nitrogen for 5-10 minutes. Next, the frozen portions are crushed again with the formation of particles with a size (up to particle size) of not more than 600 microns. Then, each portion is thawed by resuspension (immersion) in 30-70 ml of physiological phosphate buffered saline with a pH of 7.4, obtained from a composition containing 138 mM NaCl, 2.67 mM KCl, 1.47 mM KH 2 PO 4 , 8.1 mm Na 2 HPO 4 , distilled water to 1 l, at room temperature. Particles smaller than 200 microns are separated (removed) from the resulting suspension. After that, the obtained fraction of particles is subjected to freeze drying and sterilization to obtain samples of the desired matrix.
В частном случае образцы стерилизуют γ-облучением в дозе 15 кГр.In the particular case, the samples are sterilized by γ-radiation at a dose of 15 kGy.
Образцы хранят при температуре 4-6°C.Samples are stored at 4-6 ° C.
В качестве дезагрегантов могут быть использованы трентал и гепарин.As disaggregants, trental and heparin can be used.
Нами установлено, что патентуемый способ может быть использован для получения ТИК различных паренхиматозных органов, учитывая общие принципы их анатомического строения и функционирования.We found that the patented method can be used to obtain TECs of various parenchymal organs, taking into account the general principles of their anatomical structure and functioning.
Способ осуществляется следующим образом.The method is as follows.
Патентуемый способ изготовления нативного порошкообразного матрикса может быть использован для получения ТИК различных паренхиматозных органов. Особенности способа при получении матрикса того или иного паренхиматозного органа сводятся к особенностям техники проведения инициальной перфузионной отмывки соответствующего донорского органа, которая является традиционной процедурой и известна специалистам [Онищенко Н.А., Шагидулин М.Ю. Консервация органов и тканей // Трансплантология. Под редакцией В.И. Шумакова. - М.: МИА. - 2006. - С.62-83.].A patented method of manufacturing a native powdered matrix can be used to obtain TECs of various parenchymal organs. The features of the method upon receipt of the matrix of one or another parenchymal organ are reduced to the features of the technique of initial perfusion washing of the corresponding donor organ, which is a traditional procedure and is known to specialists [Onishchenko N.A., Shagidulin M.Yu. Preservation of organs and tissues // Transplantology. Edited by V.I. Shumakova. - M .: MIA. - 2006. - S. 62-83.].
Способ включает следующие этапы:The method includes the following steps:
1. Медикаментозную защиту микроциркуляторного русла соответствующего (одноименного) донорского органа и профилактику внутрисосудистой агрегации клеточных элементов крови и улучшение микроциркуляции органов проводят перед эксплантацией (забором) органа за 60-120 минут до начала его перфузионной отмывки от крови с помощью внутримышечного или внутривенного введения донору дезагрегантов. При этом вводят, например, трентал в дозе 5-10 мг/кг массы донора и гепарин в дозе 25000 ME.1. The drug protection of the microcirculatory bed of the corresponding (same) donor organ and the prevention of intravascular aggregation of cellular blood elements and the improvement of organ microcirculation are carried out before organ explantation (sampling) 60-120 minutes before its perfusion washing from blood using intramuscular or intravenous administration of disaggregant donor . In this case, for example, trental is introduced in a dose of 5-10 mg / kg of the donor mass and heparin in a dose of 25000 ME.
2. Перфузионной отмывке донорского органа предшествует канюляция его приносящего сосуда с созданием физиологических параметров перфузии: артериальное давление 100-120 мм ртутного столба и венозное давление 8-12 мм ртутного столба.2. The perfusion washing of the donor organ is preceded by cannulation of its delivery vessel with the creation of physiological parameters of perfusion: blood pressure of 100-120 mm Hg and venous pressure of 8-12 mm Hg.
Например, для перфузионной отмывки печени канюлируют бедренную артерию двухпросветным катетером и воротную вену; для перфузионной отмывки почек канюлируют бедренную артерию двухпросветным катетером.For example, for perfusion washing the liver, the femoral artery is cannulated with a double-lumen catheter and portal vein; for perfusion washing of the kidneys, the femoral artery is cannulated with a double-lumen catheter.
При перфузионной отмывке, например, печени человека проводят перфузию физиологическим раствором забуференным фосфатами, полученным из следующего состава: 138 мМ NaCl, 2,67 мМ KCl, 1,47 мМ KH2PO4, 8,1 мМ Na2HPO4, дистиллированная вода до 1 л, с рН 7,4 (PBS) с гепарином в дозе 3500 ME. В качестве PBS может быть использован, например, раствор фирмы Invitrogen/Gibco, полученный из состава, содержащего 138 мМ NaCl, 2,67 мМ KCl, 1,47 мМ KH2PO4, 8,1 мМ Na2HPO4, дистиллированную воду до 1 л. Объем перфузионного раствора - 5000 мл. При этом перфузию выполняют следующим образом: 1000 мл раствора PBS с гепарином в дозе 700 ME вводят по артериальной системе со скоростью 220-260 мл/мин, создавая давление 120 мм ртутного столба; и 4000 мл раствора PBS с гепарином в дозе 2800 ME вводят по венозной системе со скоростью 900 мл/мин, создавая давление 8 мм ртутного столба. Затем осуществляют эксплантацию (изъятие) донорской печени.When perfusion washing, for example, the human liver, perfusion is carried out with physiological saline buffered phosphates obtained from the following composition: 138 mm NaCl, 2.67 mm KCl, 1.47 mm KH 2 PO 4 , 8.1 mm Na 2 HPO 4 , distilled water up to 1 l, with a pH of 7.4 (PBS) with heparin at a dose of 3500 ME. As PBS can be used, for example, Invitrogen / Gibco solution obtained from a composition containing 138 mM NaCl, 2.67 mM KCl, 1.47 mM KH 2 PO 4 , 8.1 mM Na 2 HPO 4 , distilled water up to 1 liter The volume of the perfusion solution is 5000 ml. In this case, perfusion is performed as follows: 1000 ml of a solution of PBS with heparin in a dose of 700 ME is administered through the arterial system at a rate of 220-260 ml / min, creating a pressure of 120 mmHg; and 4000 ml of a solution of PBS with heparin at a dose of 2800 ME is administered through the venous system at a rate of 900 ml / min, creating a pressure of 8 mm Hg. Then carry out the explantation (removal) of the donor liver.
3. Далее осуществляют децеллюляризацию изолированного донорского органа, например печени, используя перфузию через воротную вену и печеночную артерию растворов детергента с объемной скоростью перфузии через печень 40-80 мл/100 г органа/мин с постепенно повышающейся концентрацией:3. Then, an isolated donor organ, for example, a liver, is decellularized using perfusion through the portal vein and the hepatic artery of detergent solutions with a volume perfusion through the liver of 40-80 ml / 100 g of organ / min with a gradually increasing concentration:
а) 500-800 мл PBS, содержащего 1% Triton X 100 и 0,1% натриевой соли додецилсульфата (SDS) с дувукратной заменой раствора на свежий раствор того же состава через каждые 3 часа перфузии в рециркуляционном режиме;a) 500-800 ml of PBS containing 1% Triton X 100 and 0.1% sodium salt of dodecyl sulfate (SDS) with a double replacement of the solution with a fresh solution of the same composition every 3 hours of perfusion in recirculation mode;
b) 500-800 мл PBS, содержащего 2% Triton X 100 и 0,1% SDS с дувукратной заменой раствора на свежий раствор того же состава через каждые 3 часа перфузии в рециркуляционном режиме;b) 500-800 ml of PBS containing 2% Triton X 100 and 0.1% SDS with two-fold replacement of the solution with a fresh solution of the same composition every 3 hours of perfusion in recirculation mode;
с) 500-800 мл PBS, содержащего 3% Triton X 100 и 0,1% SDS с дувукратной заменой раствора на свежий раствор того же состава через каждые 3 часа перфузии в рециркуляционном режиме.c) 500-800 ml of PBS containing 3% Triton X 100 and 0.1% SDS with two-fold replacement of the solution with a fresh solution of the same composition every 3 hours of perfusion in recirculation mode.
Затем проводят отмывку децеллюляризированного органа от детергентов путем перфузии 500-800 мл PBS, с трехкратной заменой раствора на свежий раствор того же состава через каждый час перфузии в рециркуляционном режиме, создавая давление в артерии 100-120 мм ртутного столба и давление в вене 8-12 мм ртутного столба.Then, the decellularized organ is washed from detergents by perfusion of 500-800 ml of PBS, with a three-fold replacement of the solution with a fresh solution of the same composition after each hour of perfusion in recirculation mode, creating a pressure in the artery of 100-120 mm Hg and a pressure in the vein of 8-12 mmHg.
4. Пропитывание децеллюляризированного органа криопротектором осуществляют следующим образом. Сосудистое русло децеллюляризированного органа (матрикс) перфузируют криопротекторным раствором - PBS с рН 7,4, содержащим 1% сывороточного альбумина и 10-15% глицерина или 10-15% диметилсульфоксида (DMSO). Объем вводимого криопротектора равен двойному объему сосудистого русла децеллюляризированного органа.4. Impregnation of a decellularized organ with a cryoprotectant is as follows. The vascular bed of the decellularized organ (matrix) is perfused with a cryoprotective solution - PBS with a pH of 7.4, containing 1% serum albumin and 10-15% glycerol or 10-15% dimethyl sulfoxide (DMSO). The volume of the introduced cryoprotectant is equal to the double volume of the vascular bed of the decellularized organ.
Двойной объем сосудистого русла децеллюляризированного органа, например, для печени человека составляет 3000 мл, для почек человека - 600 мл.The double volume of the vascular bed of a decellularized organ, for example, for a human liver is 3000 ml, for a human kidney - 600 ml.
5. Механическое размельчение децеллюляризированного органа на фрагменты проводят до образования частиц размером от 0,5 мм до 4 мм. Для проведения данного механического измельчения могут быть использованы хирургический скальпель или медицинские ножницы. Полученные фрагменты разделяют на порции массой 5-10 г.5. Mechanical grinding of the decellularized organ into fragments is carried out until particles from 0.5 mm to 4 mm are formed. To perform this mechanical grinding, a surgical scalpel or medical scissors can be used. The resulting fragments are divided into portions weighing 5-10 g.
6. Осуществляют замораживание каждой полученной порции путем ее погружения в жидкий азот при температуре «-196°C» на 5-10 минут.6. Freeze each portion obtained by immersing it in liquid nitrogen at a temperature of “-196 ° C” for 5-10 minutes.
7. Замороженные фрагменты децеллюляризированного матрикса повторно механически измельчают в фарфоровой ступке до получения массы порошкообразной консистенции с образованием частиц не более 600 мкм. Для получения частиц с указанным размером также может быть использовано сито с квадратными ячейками с размером ячейки 200×200 мкм (40 mesh). Использование сита позволяет удалить крупные фрагменты с размером более 600 мкм.7. Frozen fragments of the decellularized matrix are again mechanically crushed in a porcelain mortar to obtain a mass of powdery consistency with the formation of particles of not more than 600 microns. To obtain particles with the specified size can also be used a sieve with square cells with a mesh size of 200 × 200 μm (40 mesh). Using a sieve allows you to remove large fragments with a size of more than 600 microns.
8. Проводят размораживание каждой порции полученных фрагментов путем ресуспендирования (погружения) в 30-70 мл раствора PBS при комнатной температуре. Обычно для размораживания требуется 3-5 минут.8. Thawing of each portion of the obtained fragments is carried out by resuspension (immersion) in 30-70 ml of PBS solution at room temperature. It usually takes 3-5 minutes to defrost.
9. Отделяют частицы размером менее 200 мкм путем фильтрования полученного материала через сито с размером ячеек 130×130 мкм (60 mesh).9. Separate particles less than 200 microns in size by filtering the resulting material through a sieve with a mesh size of 130 × 130 microns (60 mesh).
Общая масса частиц матрикса, выделенных из одной печени человека, составляет от 500 до 850 г.The total mass of matrix particles isolated from a single human liver ranges from 500 to 850 g.
10. Проводят лиофилизацию полученных частиц: сначала замораживают частицы матрикса (массой до 10 г матрикса) в сублимационной камере в течение 8 часов при температуре «-35°C»; затем их высушивают в вакууме при давлении от 2 до 100 Па при температуре нагрева не выше 35°C в течение 2 суток.10. The obtained particles are lyophilized: first, the particles of the matrix (weighing up to 10 g of the matrix) are frozen in a sublimation chamber for 8 hours at a temperature of “-35 ° C”; then they are dried in vacuum at a pressure of from 2 to 100 Pa at a heating temperature of not higher than 35 ° C for 2 days.
11. Проводят стерилизацию образцов γ-облучением в дозе 15 кГр.11. Sterilize the samples with γ-radiation at a dose of 15 kGy.
12. Длительно хранят стерильный децеллюляризированный порошкообразный матрикс при температуре 4-6°C до рецеллюляризации клетками, выделенными из идентичных донорских органов.12. For a long time, sterile decellularized powder matrix is stored at a temperature of 4-6 ° C until cellulization is recovered by cells isolated from identical donor organs.
Для получения матрикса печени в качестве исходного материала используют соответствующий донорский орган - донорскую печень; для матрикса почки - донорскую почку и т.д.To obtain a liver matrix, the corresponding donor organ, the donor liver, is used as a source material; for a kidney matrix, a donor kidney, etc.
Для доказательства возможности достижения заявленного назначения и достижения указанного технического результата - пригодности децеллюляризированных тканеспецифических порошкообразных матриксов для посадки на них специализированных клеток приводим следующие данные.To prove the feasibility of achieving the stated purpose and achieving the technical result — the suitability of decellularized tissue-specific powder matrices for planting specialized cells on them, we present the following data.
Пример 1.Example 1
Получение нативного матрикса из печени крысы по предложенному способу:Obtaining native matrix from rat liver according to the proposed method:
1. Проводили медикаментозную защиту микроциркуляторного русла печени крысы за 60 минут до начала его перфузионной отмывки с помощью дезагрегантов, при этом использовали трентал в дозе 5 мг/кг массы экспериментального животного и гепарин в дозе 1000 ME, которые вводили внутривенно.1. Medical protection of the microvasculature of the rat liver was carried out 60 minutes before the start of its perfusion washing with disaggregants. Trental was used at a dose of 5 mg / kg of the experimental animal and heparin at a dose of 1000 ME, which was administered intravenously.
2. Для перфузионной отмывки (удаления элементов крови из сосудистого и микрососудистого русла печени крысы) канюлировали воротную вену и осуществляли перфузию раствором PBS в объеме 30 мл с гепарином в дозе 500 ME со скоростью 150 мл/ч. Затем орган с канюлей эксплантировали.2. For perfusion washing (removal of blood elements from the vascular and microvascular beds of rat liver), the portal vein was cannulated and perfusion was performed with PBS in a volume of 30 ml with heparin at a dose of 500 ME at a speed of 150 ml / h. Then the organ with the cannula was explanted.
3. Далее осуществляли децеллюляризацию печени крысы, используя перфузию через воротную вену растворами детергентов со скоростью 150 мл/ч с постепенно повышающейся концентрацией:3. Next, rat liver was decellularized using perfusion through the portal vein with detergent solutions at a rate of 150 ml / h with a gradually increasing concentration:
а) 500 мл PBS, содержащего 1% Triton X 100 и 0,1% SDS;a) 500 ml of PBS containing 1% Triton X 100 and 0.1% SDS;
b) 500 мл PBS, содержащего 2% Triton X 100 и 0,1% SDS;b) 500 ml of PBS containing 2% Triton X 100 and 0.1% SDS;
с) 500 мл PBS, содержащего 3% Triton X 100 и 0,1% SDS.c) 500 ml of PBS containing 3% Triton X 100 and 0.1% SDS.
4. Проводили отмывку децеллюляризированной печени от детергентов путем перфузии 300 мл PBS со скоростью 150 мл/ч.4. Washed the decellularized liver from detergents by perfusion of 300 ml of PBS at a rate of 150 ml / h.
На рисунке №1 представлена децеллюляризированная печень крысы.Figure 1 shows the decellularized rat liver.
5. Осуществляли пропитывание децеллюляризированной печени (матрикса) криопротекторным раствором - PBS с рН 7,4, содержащим 1% сывороточного альбумина и 15% глицерина, путем его перфузии через сосудистое русло децеллюляризированной печени с объемной скоростью перфузии 150 мл/ч. Объем перфузионного раствора - 10 мл;5. The decellularized liver (matrix) was impregnated with a cryoprotective solution - PBS with a pH of 7.4, containing 1% serum albumin and 15% glycerol, by perfusion through the vascular bed of the decellularized liver with a volume perfusion rate of 150 ml / h. The volume of the perfusion solution is 10 ml;
6. Осуществляли механическое размельчение децеллюляризированного матрикса на фрагменты размером от 0,5 до 4 мм.6. Carried out mechanical grinding of the decellularized matrix into fragments from 0.5 to 4 mm in size.
7. Проводили замораживание полученной порции децеллюляризированного матрикса путем погружения в жидкий азот при температуре -196°C. При этом погружали материал в жидкий азот на 10 минут.7. Spent the freezing of the obtained portion of the decellularized matrix by immersion in liquid nitrogen at a temperature of -196 ° C. At the same time, the material was immersed in liquid nitrogen for 10 minutes.
8. Замороженные фрагменты децеллюляризированного матрикса повторно механически измельчали в фарфоровой ступке до получения массы порошкообразной консистенции.8. Frozen fragments of the decellularized matrix were re-mechanically ground in a porcelain mortar to obtain a powdery mass.
9. Проводили просеивание замороженных фрагментов через сито с размером ячеек 200×200 мкм (40 mesh) для удаления крупных фрагментов размером более 600 мкм.9. Sifting of the frozen fragments through a sieve with a mesh size of 200 × 200 μm (40 mesh) was carried out to remove large fragments larger than 600 μm.
10. Проводили размораживание полученной порции просеянных фрагментов путем погружения и перемешивания в 50 мл раствора PBS с рН 7,4 при комнатной температуре в течение 5 минут до получения однородной суспензии.10. The obtained portion of sifted fragments was thawed by immersion and stirring in 50 ml of PBS solution with pH 7.4 at room temperature for 5 minutes until a homogeneous suspension was obtained.
11. Отделяли и удаляли частицы размером менее 200 мкм путем фильтрования через сито с размером ячеек 130×130 мкм (60 mesh).11. Particles smaller than 200 μm were separated and removed by filtration through a sieve with a mesh size of 130 × 130 μm (60 mesh).
Масса частиц матрикса, выделенных из одной печени крысы, составила 0,8 г.The mass of matrix particles isolated from one rat liver was 0.8 g.
12. Проводили лиофилизацию: для чего сначала замораживали частицы матрикса (0,8 г) в сублимационной камере в течение 8 часов при температуре «-35°C», затем их высушивали в вакууме при давлении 27 Па при температуре нагрева не выше 35°C в течение 2 суток.12. Lyophilization was carried out: for which the matrix particles (0.8 g) were first frozen in a sublimation chamber for 8 hours at a temperature of “-35 ° C”, then they were dried in vacuum at a pressure of 27 Pa at a heating temperature of no higher than 35 ° C within 2 days.
13. Проводили стерилизацию полученных образцов γ-облучением в дозе 15 кГр.13. The samples were sterilized with γ-radiation at a dose of 15 kGy.
14. Хранили стерильный децеллюляризованный порошкообразный матрикс при температуре 4-6°C в течение 1 месяца до рецеллюляризации клетками.14. A sterile decellularized powder matrix was stored at a temperature of 4-6 ° C for 1 month until the cells were recellularized.
На рисунке 2 представлены лиофилизированные децеллюляризированные матриксы печени крысы.Figure 2 shows lyophilized decellularized rat liver matrices.
Размеры пор децеллюляризированного нативного матрикса печени крысы, полученного в виде сухого порошка, были не более 50 мкм. Суммарная пористость полученного матрикса не превышала 80%. Приведенные характеристики полученного децеллюляризированного нативного порошкообразного матрикса свидетельствуют о его пригодности для рецеллюляризации клетками.The pore sizes of the decellularized native rat liver matrix obtained in the form of a dry powder were not more than 50 μm. The total porosity of the obtained matrix did not exceed 80%. The above characteristics of the obtained decellularized native powder matrix indicate its suitability for cellularization.
Пример 2.Example 2
Для доказательства сохранения тканеспецифических свойств матрикса, полученного по предложенному способу, приводим результаты сравнительного изучения адгезии различных типов клеток на этом матриксе.To prove the conservation of tissue-specific properties of the matrix obtained by the proposed method, we present the results of a comparative study of the adhesion of various types of cells on this matrix.
На матрикс, полученный по предлагаемому способу из донорской печени (см. пример 1), осуществляли посадку клеток аллогенной печени, клеток линии HepG2, MMCK КМ и клеток почечного эпителия.On the matrix obtained by the proposed method from a donor liver (see example 1), cells of allogeneic liver, HepG 2 , MMCK KM cells and renal epithelial cells were planted.
Выделение аллогенных клеток печени осуществляли по традиционной методике [Шагидулин М.Ю., Онищенко Н.А., Крашенинников М.Е., Ильинский И.М., Можейко Н.П., Шмерко Н.П., Севастьянов В.И., Готье С.В. Выживание клеток печени, иммобилизированных на 3-D матриксах при моделировании печеночной недостаточности // Вестник трансплантологии и искусственных органов. - 2011. - №3. - Т.XIII. - с.59-66.].Allogenic liver cells were isolated according to the traditional method [Shagidulin M.Yu., Onishchenko N.A., Krasheninnikov M.E., Ilyinsky I.M., Mozheiko N.P., Shmerko N.P., Sevastyanov V.I. , Gauthier S.V. Survival of liver cells immobilized on 3-D matrices for modeling liver failure // Bulletin of transplantology and artificial organs. - 2011. - No. 3. - T.XIII. - p. 59-66.].
Заселение частиц сухого порошкообразного децеллюляризированного матрикса аллогенными клетками печени и клетками других типов осуществляли по традиционной методике [Шагидулин М.Ю., Онищенко Н.А., Крашенинников М.Е., Ильинский И.М., Можейко Н.П., Шмерко Н.П., Севастьянов В.И., Готье С.В. Выживание клеток печени, иммобилизированных на 3-D матриксах при моделировании печеночной недостаточности // Вестник трансплантологии и искусственных органов. - 2011. - №3. - Т.XIII. - с.59-66.].Particles of a dry powdery decellularized matrix were populated by allogeneic liver cells and other types of cells by the traditional method [Shagidulin M.Yu., Onishchenko N.A., Krasheninnikov M.E., Ilinsky I.M., Mozheiko N.P., Shmerko N. .P., Sevastyanov V.I., Gauthier S.V. Survival of liver cells immobilized on 3-D matrices for modeling liver failure // Bulletin of transplantology and artificial organs. - 2011. - No. 3. - T.XIII. - p. 59-66.].
250 мкл влажного децеллюляризированного матрикса, содержащего от 3,5 до 3,8×1012 частиц матрикса, смешивали с 1 мл суспензии клеток (1×106 клеток/мл). Матриксы из печени с четырьмя типами клеток (аллогенные клетки печени, клетки линии HepG2, MMCK KM и клетки почечного эпителия) помещали в отдельные стерильные чашки Петри (d=90 мм) для инкубации in vitro в ростовой среде DMEM/Ham F-12 (Dulbecco's Modified Eagle's Vedium/Nutrient Mixture F-12 Ham или среда Игла, модефицированная Дульбеко, смешанная со средой Ham F-12), с добавлением фетальной бычьей сыворотки, фактора роста гепатоцитов, эпидермального фактора роста, дексаметазона, этаноламина, селенита натрия, инсулина в объеме 10 мл.250 μl of wet decellularized matrix containing from 3.5 to 3.8 × 10 12 matrix particles were mixed with 1 ml of a cell suspension (1 × 10 6 cells / ml). Liver matrices with four cell types (allogeneic liver cells, HepG 2 , MMCK KM cells and renal epithelial cells) were placed in separate sterile Petri dishes (d = 90 mm) for in vitro incubation in DMEM / Ham F-12 growth medium ( Dulbecco's Modified Eagle's Vedium / Nutrient Mixture F-12 Ham or Dulbeco Modified Eagle Medium mixed with Ham F-12) supplemented with fetal bovine serum, hepatocyte growth factor, epidermal growth factor, dexamethasone, ethanolamine, sodium selenite, insulin in volume of 10 ml.
Полученные суспензии различных типов клеток с частицами децеллюляризованного матрикса инкубировали при стандартных культуральных условиях в течение 5 суток.The resulting suspensions of various types of cells with particles of the decellularized matrix were incubated under standard culture conditions for 5 days.
Изучение результатов прикрепления и пролиферации клеток на матриксах осуществляли на 5 сутки сокультивирования без замены питательной среды.The results of cell attachment and proliferation on the matrices were studied on day 5 of co-cultivation without changing the nutrient medium.
Полученные результаты представлены на рисунках 3, 4, 5, 6, 7.The results are presented in figures 3, 4, 5, 6, 7.
На рисунке 3 представлены клетки линии HepG2 на децеллюляризованном матриксе печени крысы, полученном по предложенному способу, где 1 - децеллюляризированный матрикс печени, 2 - клетки линии HepG2; фазовый контраст, ув.микроскопа×400.Figure 3 shows the cells of the HepG 2 line on the decellularized matrix of the rat liver, obtained by the proposed method, where 1 is the decellularized matrix of the liver, 2 - cells of the HepG 2 line; phase contrast, UV microscope × 400.
На рисунке 4 представлены клетки ММСК КМ на децеллюляризированном матриксе печени крысы, полученном по предложенному способу, где 1 - децеллюляризированный матрикс печени, 2 - клетки ММСК КМ, фазовый контраст, ув.микроскопа×400.Figure 4 shows MMSC cells KM on the decellularized matrix of the rat liver obtained by the proposed method, where 1 is the decellularized matrix of the liver, 2 cells of the MMSC KM, phase contrast, UV microscope × 400.
На рисунке 5 представлены клетки печени, адгезированные на матриксе «Цитодекс-3» (контроль матрикса), где 1 - Цитодекс-3, 2 - клетки печени, микроскопия по Номарскому, ув.микроскопа×630.Figure 5 shows liver cells adhered to the Cytodex-3 matrix (matrix control), where 1 is Cytodex-3, 2 are liver cells, Nomarsky microscopy, UV microscope × 630.
Клетки во всех опытах были посажены в одинаковой дозе и на одинаковое количество матриксных частиц децеллюляризованного матрикса из печени и полимерного матрикса Цитодекс 3.Cells in all experiments were planted in the same dose and on the same number of matrix particles of the decellularized matrix from the liver and the polymer matrix Cytodex 3.
На рисунке 6 представлены клетки ММСК КМ на Цитодекс-3, где 1 - Цитодекс-3, 2 - клетки ММСК КМ, фазовый контраст, ув.микроскопа×200.Figure 6 shows MMSC cells KM on Cytodex-3, where 1 - Cytodex-3, 2 - cells MMSC KM, phase contrast, UV microscope × 200.
Проведенный анализ результатов позволил установить, что оба используемых матрикса (цитодекс 3 и матрикс из децеллюляризированной печени, полученный по предложенному способу) обладают адгезивными свойствами для всех типов используемых клеток. Однако клетки аллогеной печени прикреплялись и пролиферировали на частицах децеллюляризированного матрикса из печени в достоверно большем количестве (прикрепление клеток на цитодексе - контроль - 100%; прикрепление клеток печени 250%; ММСК КМ - 120%; HepG2 - эквивалент печеночных стволовых клеток - 210%; клетки почечного эпителия - 140%), что было подтверждено методом Mossman [Mosmann Т. Rapid Colorimetric Assay for Cellular Growth and Survival: Application to Proliferation and Cytotoxicity Assays // Journal of Immunological Methods. - 1983. - Vol.65, - p.55-63.] по активности митохондриального дыхания живых прикрепившихся клеток.The analysis of the results made it possible to establish that both used matrices (cytodex 3 and the matrix from the decellularized liver obtained by the proposed method) have adhesive properties for all types of cells used. However, allogeneic liver cells adhered and proliferated on particles of the decellularized matrix from the liver in a significantly larger amount (attachment of cells on the cytodex - control - 100%; attachment of liver cells 250%; MMSC KM - 120%; HepG 2 - equivalent of hepatic stem cells - 210% ; renal epithelial cells - 140%), which was confirmed by the Mossman method [Mosmann T. Rapid Colorimetric Assay for Cellular Growth and Survival: Application to Proliferation and Cytotoxicity Assays // Journal of Immunological Methods. - 1983. - Vol.65, - p.55-63.] On the activity of mitochondrial respiration of living adherent cells.
На рисунке 7 представлены клетки линии HepG2 на децеллюляризованном матриксе печени при реакции МТТ, где А - продукты реакции МТТ на месте ранее живой клетки, световая микроскопия, ув.х200.Figure 7 shows cells of the HepG 2 line on the decellularized matrix of the liver during the MTT reaction, where A is the MTT reaction products in place of a previously living cell, light microscopy, UV.x200.
Этот рисунок прикрепившихся клеток доказывает, что нативный децеллюляризированный порошкообразный матрикс из печени, полученный по предлагаемому способу, обладает адгезивными свойствами и пригоден для рецеллюляризации.This picture of attached cells proves that the native decellularized powdery matrix of the liver obtained by the proposed method has adhesive properties and is suitable for recellularization.
Таким образом, данные по изучению адгезивных свойств децеллюляризированного порошкообразного матрикса из печени доказывают сохранность его тканеспецифических свойств и наибольшую пригодность для использования в качестве матриксов для адгезии тканеспецифических клеток печени.Thus, data on the adhesive properties of the decellularized powdered matrix from the liver prove the preservation of its tissue-specific properties and are most suitable for use as matrices for adhesion of tissue-specific liver cells.
Пример 3.Example 3
Изготовление нативного матрикса из почки крысы по предложенному способу выполняли следующим образом:The manufacture of the native matrix of the kidney of a rat according to the proposed method was performed as follows:
1. Проводили медикаментозную защиту микроциркуляторного русла почки донора за 100 минут до начала его перфузионной отмывки с помощью дезагрегантов, использовали внутривенное введение гепарина в дозе 1000 ME и трентала в дозе 5 мг/кг массы тела животного.1. Medical protection of the microvasculature of the kidney of the donor was carried out 100 minutes before the start of its perfusion washing with antiplatelet agents, intravenous administration of heparin at a dose of 1000 ME and trental at a dose of 5 mg / kg of body weight of the animal was used.
2. Выполняли канюляцию аорты в грудном отделе и проводили перфузию раствором PBS в объеме 30 мл с гепарином в дозе 500 ME со скоростью 250 мл/ч для удаления элементов крови из сосудистого и микрососудистого русла почки крысы.2. Aortic cannulation was performed in the thoracic region and perfusion was performed with PBS in a volume of 30 ml with heparin at a dose of 500 IU at a rate of 250 ml / h to remove blood elements from the vascular and microvascular bed of the rat kidney.
3. Далее осуществляли децеллюляризацию почки крысы, проводя перфузию через аорту раствором детергента со скоростью 250 мл/ч с постепенно повышающейся концентрацией:3. Next, the rat kidney was decellularized by perfusion through the aorta with a detergent solution at a rate of 250 ml / h with a gradually increasing concentration:
а) 500 мл PBS, содержащего 1% Triton X 100 и 0,1% SDS;a) 500 ml of PBS containing 1% Triton X 100 and 0.1% SDS;
b) 500 мл PBS, содержащего 2% Triton X 100 и 0,1% SDS;b) 500 ml of PBS containing 2% Triton X 100 and 0.1% SDS;
с) 500 мл PBS, содержащего 3% Triton X 100 и 0,1% SDS.c) 500 ml of PBS containing 3% Triton X 100 and 0.1% SDS.
4. Проводили отмывку децеллюляризированной почки от детергентов путем перфузии со скоростью 250 мл/ч PBS в объеме 500 мл.4. The decellularized kidney was washed from detergents by perfusion at a rate of 250 ml / h of PBS in a volume of 500 ml.
На рисунке 8 представлены децеллюляризированные почки крысы.Figure 8 shows the decellularized rat kidneys.
5. Осуществляли пропитывание децеллюляризированной почки криопротекторным раствором (PBS с рН 7,4, содержащий 1% сывороточного альбумина и 15% диметилсульфоксида в объеме 10 мл) путем перфузии через сосудистое русло децеллюляризированной почки раствора указанного состава с объемной скоростью перфузии 150 мл/ч.5. The decellularized kidney was impregnated with a cryoprotective solution (PBS with a pH of 7.4, containing 1% serum albumin and 15% dimethyl sulfoxide in a volume of 10 ml) by perfusion through the vascular bed of the decellularized kidney of a solution of this composition with a perfusion volumetric rate of 150 ml / h.
6. Осуществляли размельчение матрикса на фрагменты размером от 0,5 до 4 мм.6. The matrix was crushed into fragments from 0.5 to 4 mm in size.
7. Осуществляли замораживание полученной порции децеллюляризированного матрикса путем погружения в жидкий азот при температуре -196°C. При этом проводят погружение в жидкий азот сроком на 10 минут.7. The obtained portion of the decellularized matrix was frozen by immersion in liquid nitrogen at a temperature of -196 ° C. At the same time, immersion in liquid nitrogen is carried out for a period of 10 minutes.
8. Замороженные фрагменты децеллюляризированного матрикса повторно механически измельчали в фарфоровой ступке до получения массы порошкообразной консистенции.8. Frozen fragments of the decellularized matrix were re-mechanically ground in a porcelain mortar to obtain a powdery mass.
9. Проводили просеивание замороженных фрагментов через сито с размером ячеек 200×200 мкм (40 mesh) для удаления крупных фрагментов размером более 600 мкм.9. Sifting of the frozen fragments through a sieve with a mesh size of 200 × 200 μm (40 mesh) was carried out to remove large fragments larger than 600 μm.
10. Проводили размораживание полученной порции просеянных фрагментов путем погружения в 40 мл раствора PBS с рН 7,4 при комнатной температуре в течение 4 минут.10. The obtained portion of sifted fragments was thawed by immersion in 40 ml of PBS solution with a pH of 7.4 at room temperature for 4 minutes.
11. Проводили отделение мелких частиц (менее 200 мкм) путем фильтрования через сито с размером ячеек 130×130 мкм (60 mesh).11. Small particles (less than 200 μm) were separated by filtration through a sieve with a mesh size of 130 × 130 μm (60 mesh).
Масса частиц матрикса, выделенных из одной почки крысы, составила 0,3 г.The mass of matrix particles isolated from one rat kidney was 0.3 g.
12. Проводили лиофилизацию: сначала замораживали частицы матрикса (0,3 г матрикса) в сублимационной камере в течение 8 часов при температуре «-35°C», затем их высушивали в вакууме при давлении 27 Па при температуре нагрева не выше 35°C в течение 2 суток.12. Lyophilization was carried out: first, the particles of the matrix (0.3 g of the matrix) were frozen in a sublimation chamber for 8 hours at a temperature of “-35 ° C”, then they were dried in vacuum at a pressure of 27 Pa at a heating temperature not exceeding 35 ° C in within 2 days.
13. Проводили стерилизацию образцов γ-облучением в дозе 15 кГр.13. The samples were sterilized with γ-radiation at a dose of 15 kGy.
14. Хранили стерильный децеллюляризированный порошкообразный матрикс при температуре 4-6°C в течение 1,5 месяцев до рецеллюляризации клетками.14. A sterile decellularized powder matrix was stored at a temperature of 4-6 ° C for 1.5 months until the cells were recellularized.
На рисунке 9 представлены лиофилизированные децеллюляризированные матриксы почек крысы.Figure 9 shows lyophilized decellularized rat kidney matrices.
Пример 4.Example 4
Для доказательства тканеспецифических свойств децеллюляризированных порошкообразных матриксов из почек наряду с аллогенными клетками почечного эпителия осуществляли посадку на этот матрикс и других типов клеток: клетки линии HepG2, MMCK КМ и клетки аллогенной печени.To prove the tissue-specific properties of decellularized powdered matrices from the kidneys, along with allogeneic cells of the renal epithelium, other types of cells were also planted on this matrix: HepG 2 cells, MMCK KM cells and allogeneic liver cells.
Рецеллюляризацию частиц порошкообразного матрикса из почки, полученного патентуемым способом, аллогенными клетками печени и клетками других типов осуществляли по традиционной методике [Sagrinati С., Netti G.S.. Mazzinghi В., et all. Isolation and Characterization of Multipotent Progenitor Cells from the Bowman's Capsule of Adult Human Kidneys. // J Am Soc Nephrol. - 2006. Vol.17, - p.2443-2456,The recellarization of the powdered matrix particles from the kidney obtained by the patented method, allogeneic liver cells and other types of cells was carried out according to the traditional method [Sagrinati C., Netti G. S. .. Mazzinghi B., et all. Isolation and Characterization of Multipotent Progenitor Cells from the Bowman's Capsule of Adult Human Kidneys. // J Am Soc Nephrol. - 2006. Vol.17, - p.2443-2456,
Qi W., Johnson D. W, Vesey D. A et all. Isolation, propagation and characterization of primary tubule cell culture from human kidney (Methods in Renal Research). // Nephrology. - 2007. - Vol.12. - p.155-159].Qi W., Johnson D. W, Vesey D. A et all. Isolation, propagation and characterization of primary tubule cell culture from human kidney (Methods in Renal Research). // Nephrology. - 2007 .-- Vol.12. - p. 155-159].
Для этого 250 мкл влажного децеллюляризированного матрикса из почек, содержащего от 3,5 до 3,8×1012 частиц, смешивали с 1 мл суспензии клеток (1×106 клеток/мл). Матриксы из почек с четырьмя различными типами клеток (аллогенные клетки печени, клетки линии HepG2, ММСК КМ и клетки почечного эпителия) помещали в отдельные стерильные чашки Петри для инкубации in vitro в ростовой среде DMEM/Ham F-12, с добавлением фетальной бычьей сыворотки, фактора роста гепатоцитов, эпидермального фактора роста, дексаметазона, этаноламина, селенита натрия, инсулина. Полученные суспензии различных типов клеток с частицами децеллюляризированного матрикса инкубировали при стандартных культуральных условиях в течение 5 суток.For this, 250 μl of wet decellularized matrix from the kidneys containing from 3.5 to 3.8 × 10 12 particles was mixed with 1 ml of a cell suspension (1 × 10 6 cells / ml). Kidney matrices with four different cell types (allogeneic liver cells, HepG 2 cells, MMSC KM and renal epithelial cells) were placed in separate sterile Petri dishes for incubation in vitro in DMEM / Ham F-12 growth medium supplemented with fetal bovine serum , hepatocyte growth factor, epidermal growth factor, dexamethasone, ethanolamine, sodium selenite, insulin. The resulting suspensions of various types of cells with particles of a decellularized matrix were incubated under standard culture conditions for 5 days.
Посев клеток почечного эпителия крысы и клеток других клеточных линий (HepG2, ММСК КМ и клетки печени крысы, клетки почечного эпителия) осуществляли в одинаковой дозе на одинаковое количество децеллюляризованного матрикса из почек и полимерного матрикса Цитодекс 3 (контроль универсального матрикса) в количестве 1×106 клеток на 0,25 г влажной массы матриксных частиц для сравнения адгезивных свойств различных клеток.Inoculation of rat renal epithelial cells and cells of other cell lines (HepG 2 , MMSC KM and rat liver cells, renal epithelial cells) was carried out in the same dose for the same amount of decellularized matrix of kidneys and polymer matrix of Cytodex 3 (universal matrix control) in an amount of 1 × 10 6 cells per 0.25 g wet weight of matrix particles to compare the adhesive properties of different cells.
Изучение результатов прикрепления и пролиферации различных типов клеток на матриксах почек осуществляли на 5 сутки сокультивирования без замены питательной среды при стандартном режиме культивирования. В качестве контроля использовался матрикс Цитодекс-3.The results of the attachment and proliferation of various types of cells on kidney matrices were studied on the 5th day of co-cultivation without changing the nutrient medium under the standard cultivation regimen. As a control, a matrix of Cytodex-3 was used.
Проведенный сравнительный анализ позволил установить, что оба используемых матрикса (Цитодекс-3 и децеллюляризированный матрикс из почки, полученный по заявленному способу) обладают адгезивными свойствами для всех типов используемых клеток. Однако клетки почечного эпителия прикреплялись и пролиферировали на частицах децеллюляризированного матрикса из почек крысы в достоверно большем количестве (прикрепление клеток на цитодексе - контроль - 100%; прикрепление клеток печени 130%; ММСК КМ - 125%; HepG2 - эквивалент печеночных стволовых клеток - 120%; клетки почечного эпителия - 230%), что было подтверждено методом Mossman [Mosmann Т. Rapid Colorimetric Assay for Cellular Growth and Survival: Application to Proliferation and Cytotoxicity Assays // Journal of Immunological Methods. - 1983. - Vol.65, - p.55-63.] по активности митохондриального дыхания живых прикрепившихся клеток.A comparative analysis revealed that both used matrices (Cytodex-3 and the decellularized matrix from the kidney, obtained by the claimed method) have adhesive properties for all types of cells used. However, the cells of the renal epithelium were attached and proliferated on particles of the decellularized matrix from rat kidneys in a significantly larger amount (cell attachment on cytodex - control - 100%; liver cell attachment 130%; MMSC KM - 125%; HepG 2 - equivalent of hepatic stem cells - 120 %; renal epithelial cells - 230%), which was confirmed by the Mossman method [Mosmann T. Rapid Colorimetric Assay for Cellular Growth and Survival: Application to Proliferation and Cytotoxicity Assays // Journal of Immunological Methods. - 1983. - Vol.65, - p.55-63.] On the activity of mitochondrial respiration of living adherent cells.
Таким образом, данные по изучению адгезивных свойств децеллюляризированного порошкообразного матрикса из почек доказывают сохранность его тканеспецифических свойств и наибольшую пригодность для использования в качестве матриксов для адгезии тканеспецифических клеток почечного эпителия.Thus, the data on the adhesive properties of the decellularized powdered matrix from the kidneys prove the safety of its tissue-specific properties and are most suitable for use as matrices for adhesion of tissue-specific cells of the renal epithelium.
Полученные данные по изучению адгезивных свойств децеллюляризированных порошкообразных матриксов из печени и почек, полученных по разработанной нами технологии, подтверждают не только сохранность адгезивных свойств этих матриксов, но и сохранность и наибольшую выраженность тканеспецифических свойств матриксов, а также пригодность их для посадки (адгезии) клеток соответствующих органов.The data obtained on the study of the adhesive properties of decellularized powdered matrices from the liver and kidneys obtained by the technology developed by us confirm not only the preservation of the adhesive properties of these matrices, but also the safety and greatest severity of tissue-specific properties of the matrices, as well as their suitability for planting (adhesion) of cells of the corresponding organs.
Пример 5.Example 5
Имплантация предлагаемого тканеспецифического матрикса для тканевой инженерии паренхиматозного органа в составе ТИК.Implantation of the proposed tissue-specific matrix for tissue engineering of the parenchymal organ as part of the TEC.
У крысы создавали экспериментальную модель токсического повреждения печени с исходом в цирроз. Изготовление ТИК начинали с использования методики культивирования клеток донорской печени на влажных частицах децеллюляризированного матрикса из печени по методике, изложенной в примере 2. Далее на 6 сутки суспензию с чашек Петри переносили в пробирки, центрифугировали 5 минут при 1500 об/мин, надосадочную жидкость удаляли отстаиванием, осадок разводили 10 мл раствором PBS рН 7,4, полученную суспензию частиц с адгезированными клетками повторно центрифугировали, после чего надосадочную жидкость удаляли. Процедуру повторяли 3 раза. Осадок частиц с адгезированными клетками разводили в 0,5 мл раствора PBS рН 7,4 до получения равномерной суспензии, затем набирали суспензию ТИК в шприц и имплантировали в поврежденную печень крысы.An experimental model of toxic liver damage with an outcome in cirrhosis was created in rats. The production of TECs began with the use of the method of culturing donor liver cells on wet particles of a decellularized matrix from the liver according to the procedure described in Example 2. Then, on day 6, the suspension from Petri dishes was transferred to tubes, centrifuged for 5 minutes at 1500 rpm, the supernatant was removed by settling , the precipitate was diluted with 10 ml PBS pH 7.4, the resulting suspension of particles with adherent cells was re-centrifuged, after which the supernatant was removed. The procedure was repeated 3 times. The sediment of particles with adherent cells was diluted in 0.5 ml of PBS pH 7.4 until a uniform suspension was obtained, then a TIK suspension was collected in a syringe and implanted into a damaged rat liver.
Динамическое изучение редукции клинических и морфофункциональных проявлений хронической печеночной недостаточности выявило эффективность коррекции и лечения хронической печеночной недостаточности методом имплантации ТИК с использованием тканеспецифического печеночного матрикса для тканевой инженерии паренхиматозного органа, полученного с помощью патентуемого нами способа.A dynamic study of the reduction of clinical and morphofunctional manifestations of chronic liver failure revealed the effectiveness of the correction and treatment of chronic liver failure by TIK implantation using tissue-specific liver matrix for tissue engineering of the parenchymatous organ obtained using the method we patented.
Во всех случаях был достигнут желаемый результат, а именно был разработан доступный, дешевый и универсальный способ получения нативных децеллюляризированных тканеспецифических матриксов из паренхиматозных органов в виде стерильных порошков с нативными и тканеспецифическими свойствами за счет отработки условий подготовки донорских органов к децеллюляризации и отработки режимов их изготовления.In all cases, the desired result was achieved, namely, an affordable, cheap, and universal method was developed for producing native decellularized tissue-specific matrices from parenchymal organs in the form of sterile powders with native and tissue-specific properties by working out the conditions for preparing donor organs for decellularization and working out the modes of their manufacture.
Предложенный способ позволяет увеличить площади доступных адгезивных поверхностей, увеличить плотность и площадь контактов с засеваемыми клетками, увеличить надежность прикрепления тканеспецифичного клеточного материала, обеспечить визуальный контроль процессов сокультивирования матрикса и клеток и адгезии клеток, что облегчает и повышает качество процесса рецеллюляризации матрикса.The proposed method allows to increase the area of available adhesive surfaces, to increase the density and area of contacts with seeded cells, to increase the reliability of attachment of tissue-specific cellular material, to provide visual control of the processes of co-cultivation of the matrix and cells and cell adhesion, which facilitates and improves the quality of the process of cellularization of the matrix.
Экстраполяция результатов проведенных экспериментов в клинику правомерна, учитывая общие принципы строения и функционирования паренхиматозных органов человека и используемых лабораторных животных.The extrapolation of the results of the experiments to the clinic is legitimate, given the general principles of the structure and functioning of human parenchymal organs and laboratory animals used.
Предложенный метод обеспечивает физиологическое и тканеспецифическое прикрепление (адгезию) клеточного материала на матриксы, полученные из одноименного донорского органа.The proposed method provides physiological and tissue-specific attachment (adhesion) of cellular material to matrices obtained from the donor organ of the same name.
Claims (4)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2013152894/15A RU2539918C1 (en) | 2013-11-29 | 2013-11-29 | Method for preparing tissue-specific matrix for tissue engineering of parenchymal organ |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2013152894/15A RU2539918C1 (en) | 2013-11-29 | 2013-11-29 | Method for preparing tissue-specific matrix for tissue engineering of parenchymal organ |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2539918C1 true RU2539918C1 (en) | 2015-01-27 |
Family
ID=53286691
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2013152894/15A RU2539918C1 (en) | 2013-11-29 | 2013-11-29 | Method for preparing tissue-specific matrix for tissue engineering of parenchymal organ |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2539918C1 (en) |
Cited By (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2586952C1 (en) * | 2015-07-20 | 2016-06-10 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Федеральный научный центр трансплантологии и искусственных органов имени академика В.И. Шумакова" Министерства здравоохранения Российской Федерации | Method of treating hepatic failure |
| MD1015Z (en) * | 2015-05-12 | 2016-10-31 | ОП ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ И ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ им. НИКОЛАЯ ТЕСТЕМИЦАНУ РЕСПУБЛИКИ МОЛДОВА | Method for decellularization of liver in experimental animals |
| RU2606843C1 (en) * | 2015-10-22 | 2017-01-10 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Федеральный научный центр трансплантологии и искусственных органов имени академика В.И. Шумакова" Министерства здравоохранения Российской Федерации | Method of producing modified alginate microspheres |
| RU2618989C1 (en) * | 2016-03-09 | 2017-05-11 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова" (МГУ) | Treatment method of live failure |
| CN108030959A (en) * | 2017-09-12 | 2018-05-15 | 浙江大学 | The muscle of sustained release IGF-1 growth factors takes off cell material and preparation method thereof |
| WO2018093282A1 (en) * | 2016-11-16 | 2018-05-24 | Федеральное Государственное Бюджетное Учреждение "Федеральный Научный Центр Трансплантологии И Искуcственных Органов Имени Академика В.И. Шумакова" Министерства Здравоохранения Российской Федерации (Фгбу "Фнцтио Им. Ак. В.И. Шумакова" Минздрава России) | Tissue-specific matrix for tissue engineering of a parenchymatous organ and method for the production thereof |
| RU2816638C1 (en) * | 2023-10-30 | 2024-04-02 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Национальный медицинский исследовательский центр трансплантологии и искусственных органов имени академика В.И. Шумакова" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБУ "НМИЦ ТИО им. ак. В.И. Шумакова" Минздрава России) | Method of obtaining decellularized matrix from parenchymal organs for tissue engineering and regenerative medicine |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2009025398A1 (en) * | 2007-08-23 | 2009-02-26 | National University Corporation, Tokyo Medical And Dental University | Decellularizing solution, method of preparing decellularized tissue, graft and culture member |
| WO2012094255A2 (en) * | 2011-01-03 | 2012-07-12 | The Regents Of The University Of California | Decellularized liver transplantation composition and methods |
| RU2011143730A (en) * | 2009-03-31 | 2013-05-10 | Риджентс Оф Дзе Юниверсити Оф Миннесота | DECELLULARIZATION AND RECELLULARIZATION OF BODIES AND TISSUES |
-
2013
- 2013-11-29 RU RU2013152894/15A patent/RU2539918C1/en active
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2009025398A1 (en) * | 2007-08-23 | 2009-02-26 | National University Corporation, Tokyo Medical And Dental University | Decellularizing solution, method of preparing decellularized tissue, graft and culture member |
| RU2011143730A (en) * | 2009-03-31 | 2013-05-10 | Риджентс Оф Дзе Юниверсити Оф Миннесота | DECELLULARIZATION AND RECELLULARIZATION OF BODIES AND TISSUES |
| WO2012094255A2 (en) * | 2011-01-03 | 2012-07-12 | The Regents Of The University Of California | Decellularized liver transplantation composition and methods |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| UYGUN B.E. et al. Organ reengineering through development of a transplantable recellularized liver graft using decellularized liver matrix // Nat Med., 2010, Jul;16(7), pp.814-20. BAPTISTA P.M. et al. Human liver bioengineering using a whole liver decellularized bioscaffold // Methods Mol Biol. 2013;1001, abstract * |
Cited By (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| MD1015Z (en) * | 2015-05-12 | 2016-10-31 | ОП ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ И ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ им. НИКОЛАЯ ТЕСТЕМИЦАНУ РЕСПУБЛИКИ МОЛДОВА | Method for decellularization of liver in experimental animals |
| RU2586952C1 (en) * | 2015-07-20 | 2016-06-10 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Федеральный научный центр трансплантологии и искусственных органов имени академика В.И. Шумакова" Министерства здравоохранения Российской Федерации | Method of treating hepatic failure |
| RU2606843C1 (en) * | 2015-10-22 | 2017-01-10 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Федеральный научный центр трансплантологии и искусственных органов имени академика В.И. Шумакова" Министерства здравоохранения Российской Федерации | Method of producing modified alginate microspheres |
| RU2618989C1 (en) * | 2016-03-09 | 2017-05-11 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова" (МГУ) | Treatment method of live failure |
| WO2018093282A1 (en) * | 2016-11-16 | 2018-05-24 | Федеральное Государственное Бюджетное Учреждение "Федеральный Научный Центр Трансплантологии И Искуcственных Органов Имени Академика В.И. Шумакова" Министерства Здравоохранения Российской Федерации (Фгбу "Фнцтио Им. Ак. В.И. Шумакова" Минздрава России) | Tissue-specific matrix for tissue engineering of a parenchymatous organ and method for the production thereof |
| RU2693432C2 (en) * | 2016-11-16 | 2019-07-02 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Национальный медицинский исследовательский центр трансплантологии и искусственных органов имени академика В.И. Шумакова" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБУ "НМИЦ ТИО им. ак. В.И. Шумакова" Минздрава России) | Tissue-specific matrix for tissue engineering of the parenchymal organ and a method for preparing it |
| CN108030959A (en) * | 2017-09-12 | 2018-05-15 | 浙江大学 | The muscle of sustained release IGF-1 growth factors takes off cell material and preparation method thereof |
| RU2816638C1 (en) * | 2023-10-30 | 2024-04-02 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Национальный медицинский исследовательский центр трансплантологии и искусственных органов имени академика В.И. Шумакова" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБУ "НМИЦ ТИО им. ак. В.И. Шумакова" Минздрава России) | Method of obtaining decellularized matrix from parenchymal organs for tissue engineering and regenerative medicine |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP6089062B2 (en) | Decellularization and recellularization of organs and tissues | |
| JP2024015176A (en) | Decellularization and recellularization of organs and tissues | |
| RU2539918C1 (en) | Method for preparing tissue-specific matrix for tissue engineering of parenchymal organ | |
| RU2425645C1 (en) | Method and transplant for treatment of liver failure | |
| RU2586952C1 (en) | Method of treating hepatic failure | |
| RU2693432C2 (en) | Tissue-specific matrix for tissue engineering of the parenchymal organ and a method for preparing it | |
| RU2425646C1 (en) | Method and transplant for treatment of liver failure | |
| JF Patzer et al. | Clinical safety evaluation of excorp medical, inc. Bioartificial liver support system (BLSS) | |
| Sodian et al. | Application of stereolithography for scaffold fabrication for tissue engineering of heart valves | |
| Koball et al. | REMOVAL OF ALBUMIN BOUND TOXINS WITH THE MARSSYSTEM SHOWS PROTECTIVE EFFECTS ON HEPATOCYTES | |
| RU2425647C1 (en) | Method and transplant for treatment of liver failure | |
| Livingston et al. | Osteogenic activity of human mesenchymal stem cells in vivo on calcium phosphate ceramics | |
| Jockenhoevel et al. | CARDIOVASCULAR TISSUE ENGINEERING: A NEW LAMINAR FLOW CHAMBER FOR: IN VITRO: IMPROVEMENT OF MECHANICAL TISSUE PROPERTIES | |
| Donini et al. | TEMPORARY NEUROLOGICAL IMPROVEMENT AFTER BIOARTIFICIAL LIVER TREATMENT FOR ACUTE ON CHRONIC LIVER FAILURE | |
| Peszynski et al. | REMOVAL OF ALBUMIN BOUND DRUGS IN ALBUMIN DIALYSIS (MARS)-A NEW LIVER SUPPORT SYSTEM | |
| Jockenhoevel et al. | TISSUE ENGINEERING: EVALUTATION OF DIFFERENT BIODEGRADABLE SCAFFOLDS | |
| Klammt et al. | Impact of artificial liver support with albumin dialysis (MARS) on laboratory findings | |
| Ziemer et al. | Kardiovaskuläres “tissue engineering” | |
| Nasseri et al. | IMPACT OF CULTURE CONDITIONS ON PROLIFERATION AND SURVIVAL OF FETAL CARDIOMYOCYTES | |
| Matsumoto et al. | A GELATIN COATED COLLAGEN-POLYGLYCOLIC ACID (PGA) COMPOSITE MEMBRANE AS A DURAL SUBSTITUTE | |
| Jockenhoevel et al. | CARDIOVASCULAR TISSUE ENGINEERING WITH FIBRIN GEL IN MICROSTRUCTURED CULTURE PLATES | |
| Sato et al. | CELL SHEET ENGINEERING WITH CULTURE DISHES GRAFTED WITH A TEMPERATURE-RESPOSIVE POLYMER | |
| Tun et al. | EFFECTS OF GROWTH FACTORS ON HEMATOPOIETIC CELL GROWTH IN IN VITRO BONE MARROW CELL CULTURES USING THREE-DIMENSIONAL MATRIX SCAFFOLD | |
| Baccarani et al. | LIBERASE HI ENZYME VERSUS COLLAGENASE TYPE P FOR PORCINE HEPATOCYTES ISOLATION | |
| Liu et al. | MORPHOLOGY & FUNCTION OF THE HEPLIU CELL LINE IN LIVER ASSIST DEVICES |