MD1015Z

MD1015Z - Method for decellularization of liver in experimental animals

Info

Publication number: MD1015Z
Application number: MDS20150065A
Authority: MD
Inventors: Александру УРСУ; Виорел НАКУ; Марианна ЖИАН; Ольга МАКАГОНОВА; Адриан КОЧУГ; Виорика САРМАНЮК; Ольга ИГНАТОВ
Original assignee: ОП ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ И ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ им. НИКОЛАЯ ТЕСТЕМИЦАНУ РЕСПУБЛИКИ МОЛДОВА
Priority date: 2015-05-12
Filing date: 2015-05-12
Publication date: 2016-10-31
Also published as: MD1015Y

Abstract

Invenţia se referă la biologia moleculară, în special la o metodă de decelularizare a ficatului la animalele experimentale.Conform invenţiei, animalele experimentale se eutanasiază în camera cu bioxid de carbon cu concentraţia de 5%, se fixează pe masa de lucru, se delimitează câmpul operator, se deschide cavitatea abdominală prin incizia liniei mediane a corpului, se mobilizează vena portă şi se ligaturează la capătul ei proximal, se canulează cu un cateter, prin care se perfuzează o soluţie ce conţine apă distilată în volum de 1…1,5 L şi 63 mL de citrat fosfat dextroză timp de 4…6 ore, apoi se perfuzează o soluţie de dodecilsulfat de sodiu cu concentraţia de 0,25% în volum de 2…3 L, timp de 12…15 ore, după care se perfuzează o soluţie tampon fosfat cu concentraţia de 1% în volum de 1,5 L, timp de 2…3 ore.The invention relates to molecular biology, in particular to a method of decellularization of the liver in experimental animals. , the abdominal cavity is opened by incision of the midline of the body, the portal vein is mobilized and ligated at its proximal end, cannulated with a catheter, through which a solution containing 1 ... 1.5 L distilled water is infused and 63 mL of dextrose citrate phosphate for 4 ... 6 hours, then a solution of sodium dodecylsulfate with 0.25% concentration by volume of 2 ... 3 L is infused, for 12 ... 15 hours, after which a solution is infused phosphate buffer with a concentration of 1% by volume of 1.5 L, for 2 ... 3 hours.

Description

Invenţia se referă la biologia moleculară, în special la o metodă de decelularizare a ficatului la animalele experimentale. The invention relates to molecular biology, in particular to a method of decellularization of the liver in experimental animals.

Este cunoscută metoda de decelularizare a ficatului ce presupune deschiderea cavităţii abdominale prin incizia liniei mediane a corpului, identificarea venei portă care este ligaturată la capătul proximal şi canulată, după care se iniţiază perfuzia ficatului prin vena portă cu 6...10 L apă distilată, urmată de perfuzia ficatului cu 20 L soluţie de dodecilsulfat de sodiu de 0,25% şi progresiv cu 40 L soluţie de dodecilsulfat de sodiu de 0,5% pentru a muta proteinele citoplasmatice [1]. The method of liver decellularization is known, which involves opening the abdominal cavity through an incision in the midline of the body, identifying the portal vein which is ligated at the proximal end and cannulated, after which liver perfusion is initiated through the portal vein with 6...10 L of distilled water, followed by liver perfusion with 20 L of 0.25% sodium dodecyl sulfate solution and progressively with 40 L of 0.5% sodium dodecyl sulfate solution to move cytoplasmic proteins [1].

Dezavantajul acestei metode constă în aceea că prevenirea generării trombilor sangvini nu se realizează, în special, fiind cunoscut faptul că în ficat sunt sintetizaţi factorii de coagulare a sângelui ce favorizează formarea rapidă a cheagurilor. The disadvantage of this method is that it does not prevent the generation of blood clots, especially since it is known that blood clotting factors that favor the rapid formation of clots are synthesized in the liver.

Problema pe care o rezolvă invenţia constă în elaborarea unei metode care permite decelularizarea mai efectivă şi optimală a ficatului şi a altor organe sau ţesuturi, favorizând un acces bun pentru perfuzie prin vena portă, micşorarea timpului şi efortului aplicat. The problem solved by the invention consists in developing a method that allows for more effective and optimal decellularization of the liver and other organs or tissues, favoring good access for perfusion through the portal vein, reducing the time and effort applied.

Problema se rezolvă prin aceea că animalele experimentale se eutanasiază în camera cu bioxid de carbon cu concentraţia de 5%, se fixează pe masa de lucru, se delimitează câmpul operator, se deschide cavitatea abdominală prin incizia liniei mediane a corpului, se mobilizează vena portă şi se ligaturează la capătul ei proximal, se canulează cu un cateter, prin care se perfuzează o soluţie ce conţine apă distilată în volum de 1…1,5 L şi 63 mL de citrat fosfat dextroză timp de 4…6 ore, apoi se perfuzează o soluţie de dodecilsulfat de sodiu cu concentraţia de 0,25% în volum de 2…3 L, timp de 12…15 ore, după care se perfuzează o soluţie tampon fosfat cu concentraţia de 1% în volum de 1,5 L, timp de 2…3 ore. The problem is solved by euthanizing the experimental animals in a 5% carbon dioxide chamber, fixing them on the work table, delimiting the operating field, opening the abdominal cavity through an incision in the midline of the body, mobilizing the portal vein and ligating it at its proximal end, cannulating it with a catheter, through which a solution containing distilled water in a volume of 1…1.5 L and 63 mL of citrate phosphate dextrose is perfused for 4…6 hours, then a solution of sodium dodecyl sulfate with a concentration of 0.25% in a volume of 2…3 L is perfused for 12…15 hours, after which a phosphate buffer solution with a concentration of 1% in a volume of 1.5 L is perfused for 2…3 hours.

Avantajul acestei metode constă în faptul că utilizarea anticoagulantului citrat fosfat dextroză permite înlăturarea sângelui proaspăt şi previne formarea trombilor, decurgerea procesului de decelularizare fiind mai rapidă, precum şi obţinerea unei matrice decelularizate cât mai calitative, cu un conţinut minim şi chiar nul de acizi nucleici. The advantage of this method is that the use of the anticoagulant citrate phosphate dextrose allows the removal of fresh blood and prevents the formation of thrombi, the decellularization process being faster, as well as obtaining a decellularized matrix of the highest quality, with a minimal or even zero content of nucleic acids.

Rezultatul constă în operativitatea, eficacitatea, calitatea mult mai înaltă şi lejeritatea procesului de decelularizare a ţesutului hepatic şi a altor organe. The result is efficiency, effectiveness, much higher quality and ease of the decellularization process of liver tissue and other organs.

Metoda se efectuează în modul următor: The method is performed in the following way:

Eutanasierea animalelor experimentale se efectuează în camera cu bioxid de carbon, la concentraţia de 5%. Animalele experimentale se fixează pe masa de lucru, se delimitează câmpul operator. Pentru iniţierea decelularizării, vena portă se canulează cu ,,fluturaş” (butterfly), având lungimea acului de 2 cm. Decelularizarea începe cu montarea şi umplerea sistemului de perfuzie cu soluţie de apă distilată în volum de 1 L, la care se adaugă 63 mL soluţie anticoagulant ce conţine în componenţa sa citrat fosfat dextroză, pentru înlăturarea sângelui proaspăt şi prevenirea formării trombilor, din cauza sintezei în ficat a factorilor de coagulare. Perioada de perfuzare cu apă distilată este de 4 ore. Imediat după perfuzarea ficatului cu apă distilată şi anticoagulant, se iniţiază perfuzia cu soluţie de dodecilsulfat de sodiu (SDS) 0,25% în volum de 2 L timp de 12 ore. La o concentraţie de 0,25%, detergentul elimină excelent celulele, în timp ce dimensiunile generale tisulare se conservă. Ulterior se iniţiază perfuzia ţesutului hepatic cu soluţie SDS 0,5% în volum de 2 L, timp de 12 ore. După aceasta se continuă perfuzia cu soluţie tampon fosfat (PBS) 1% în volum de 1 L, timp de 2 ore, pentru înlăturarea detergentului şi conservarea matricei extracelulare. The euthanasia of experimental animals is performed in a carbon dioxide chamber, at a concentration of 5%. The experimental animals are fixed on the work table, the operating field is delimited. To initiate decellularization, the portal vein is cannulated with a “butterfly” (butterfly), with a needle length of 2 cm. Decellularization begins with the assembly and filling of the perfusion system with a distilled water solution in a volume of 1 L, to which 63 mL of anticoagulant solution containing citrate phosphate dextrose is added, to remove fresh blood and prevent the formation of thrombi, due to the synthesis of coagulation factors in the liver. The perfusion period with distilled water is 4 hours. Immediately after perfusion of the liver with distilled water and anticoagulant, the perfusion with 0.25% sodium dodecyl sulfate (SDS) solution in a volume of 2 L is initiated for 12 hours. At a concentration of 0.25%, the detergent removes cells excellently, while the overall tissue dimensions are preserved. Subsequently, the liver tissue is perfusioned with 0.5% SDS solution in a volume of 2 L for 12 hours. After this, the perfusion is continued with 1% phosphate buffer solution (PBS) in a volume of 1 L for 2 hours, to remove the detergent and preserve the extracellular matrix.

Exemplu Example

În calitate de obiect de studiu au servit 10 şobolani linia Wistar de culoare albă, cu masa corporală cuprinsă între 175...230 g. Eutanasierea animalelor experimentale a fost realizată în camera cu bioxid de carbon, concentraţia căruia era de 5%. După eutanasiere, şobolanii au fost fixaţi pe masa de lucru, s-a delimitat câmpul operator, s-a efectuat incizia pe linia mediană a corpurilor şobolanilor, s-a pătruns în cavitatea abdominală, a fost identificată vena portă, care ulterior a fost ligaturată şi detaşată împreună cu ficatul din cavitatea abdominală. Debutul decelularizării a început cu montarea şi umplerea sistemului de perfuzie cu soluţie de apă distilată în volum de 1 L, la care s-au adăugat 63 mL soluţie anticoagulant ce conţine în componenţa sa citrat fosfat dextroză, pentru înlăturarea sângelui proaspăt şi prevenirea formării trombilor, din cauza sintezei în ficat a factorilor de coagulare. Perioada de perfuzare cu apă distilată a fost de 4 ore, timp în care ţesutul hepatic şi-a schimbat conformaţia şi culoarea. Imediat după perfuzarea ficatului cu apă distilată s-a iniţiat perfuzia cu soluţie SDS 0,25% în volum de 2 L, perioada de perfuzie fiind de 12 ore. La o concentraţie de 0,25%, detergentul a eliminat excelent celulele, în timp ce dimensiunile generale tisulare s-au conservat. Apoi s-a iniţiat perfuzia ţesutului hepatic cu soluţie SDS 0,5% în volum de 2 L, timp de 12 ore. La asemenea concentraţie are loc mutarea proteinelor citoplasmatice. După 12 ore de perfuzare cu SDS 0,5% , s-a continuat perfuzia cu soluţie PBS 1% în volum de 1 L, timp de 2 ore, pentru înlăturarea detergentului şi conservarea matricei extracelulare. The study subjects were 10 white Wistar rats, with a body mass between 175...230 g. The euthanasia of the experimental animals was performed in a carbon dioxide chamber, the concentration of which was 5%. After euthanasia, the rats were fixed on the work table, the operating field was delimited, an incision was made on the midline of the rats' bodies, the abdominal cavity was entered, the portal vein was identified, which was subsequently ligated and detached together with the liver from the abdominal cavity. The onset of decellularization began with the installation and filling of the perfusion system with a 1 L distilled water solution, to which 63 mL of anticoagulant solution containing citrate phosphate dextrose was added, to remove fresh blood and prevent the formation of thrombi, due to the synthesis of coagulation factors in the liver. The perfusion period with distilled water was 4 hours, during which the liver tissue changed its conformation and color. Immediately after the perfusion of the liver with distilled water, perfusion with 0.25% SDS solution in a volume of 2 L was initiated, the perfusion period being 12 hours. At a concentration of 0.25%, the detergent eliminated the cells excellently, while the overall tissue dimensions were preserved. Then, perfusion of the liver tissue with 0.5% SDS solution in a volume of 2 L was initiated, for 12 hours. At such a concentration, the movement of cytoplasmic proteins occurs. After 12 hours of perfusion with 0.5% SDS, perfusion with 1% PBS solution in a volume of 1 L was continued, for 2 hours, to remove the detergent and preserve the extracellular matrix.

Metoda propusă asigură o decelularizare mai efectivă, lejeră şi operativă şi mult mai calitativă prin utilizarea anticoagulantului citrat fosfat dextroză. The proposed method ensures a more effective, gentle and operative decellularization and much more qualitative by using the anticoagulant citrate phosphate dextrose.

Metoda dată a fost aplicată cu rezultate bune în 10 cazuri în cadrul laboratorului şi catedrelor Universităţii. This method was applied with good results in 10 cases within the University's laboratory and departments.

1. Omar Barakat, Shahrzad Abbasi, Gabriela Rodriguez, Jessi Rios et al. Use of decellularized porcine liver for engineering humanized liver organ. Journal of surgical research, 2012, 173(1), p. 11-25 1. Omar Barakat, Shahrzad Abbasi, Gabriela Rodriguez, Jessi Rios et al. Use of decellularized porcine liver for engineering humanized liver organ. Journal of surgical research, 2012, 173(1), p. 11-25

Claims

Method of decellularization of the liver in experimental animals, which consists in euthanizing them in a 5% carbon dioxide chamber, fixing them on the work table, delimiting the operating field, opening the abdominal cavity through an incision in the midline of the body, mobilizing the portal vein and ligating it at its proximal end, cannulating it with a catheter, through which a solution containing distilled water in a volume of 1…1.5 L and 63 mL of citrate phosphate dextrose is perfused for 4…6 hours, then a solution of sodium dodecyl sulfate with a concentration of 0.25% in a volume of 2…3 L is perfused for 12…15 hours, after which a phosphate buffer solution with a concentration of 1% in a volume of 1.5 L is perfused for 2…3 hours.