MD1015Z

MD1015Z - Metodă de decelularizare a ficatului la animalele experimentale

Info

Publication number: MD1015Z
Application number: MDS20150065A
Authority: MD
Inventors: Александру УРСУ; Виорел НАКУ; Марианна ЖИАН; Ольга МАКАГОНОВА; Адриан КОЧУГ; Виорика САРМАНЮК; Ольга ИГНАТОВ
Original assignee: ОП ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ И ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ им. НИКОЛАЯ ТЕСТЕМИЦАНУ РЕСПУБЛИКИ МОЛДОВА
Priority date: 2015-05-12
Filing date: 2015-05-12
Publication date: 2016-10-31
Also published as: MD1015Y

Abstract

Invenţia se referă la biologia moleculară, în special la o metodă de decelularizare a ficatului la animalele experimentale.Conform invenţiei, animalele experimentale se eutanasiază în camera cu bioxid de carbon cu concentraţia de 5%, se fixează pe masa de lucru, se delimitează câmpul operator, se deschide cavitatea abdominală prin incizia liniei mediane a corpului, se mobilizează vena portă şi se ligaturează la capătul ei proximal, se canulează cu un cateter, prin care se perfuzează o soluţie ce conţine apă distilată în volum de 1…1,5 L şi 63 mL de citrat fosfat dextroză timp de 4…6 ore, apoi se perfuzează o soluţie de dodecilsulfat de sodiu cu concentraţia de 0,25% în volum de 2…3 L, timp de 12…15 ore, după care se perfuzează o soluţie tampon fosfat cu concentraţia de 1% în volum de 1,5 L, timp de 2…3 ore.

Description

Invenţia se referă la biologia moleculară, în special la o metodă de decelularizare a ficatului la animalele experimentale.

Este cunoscută metoda de decelularizare a ficatului ce presupune deschiderea cavităţii abdominale prin incizia liniei mediane a corpului, identificarea venei portă care este ligaturată la capătul proximal şi canulată, după care se iniţiază perfuzia ficatului prin vena portă cu 6...10 L apă distilată, urmată de perfuzia ficatului cu 20 L soluţie de dodecilsulfat de sodiu de 0,25% şi progresiv cu 40 L soluţie de dodecilsulfat de sodiu de 0,5% pentru a muta proteinele citoplasmatice [1].

Dezavantajul acestei metode constă în aceea că prevenirea generării trombilor sangvini nu se realizează, în special, fiind cunoscut faptul că în ficat sunt sintetizaţi factorii de coagulare a sângelui ce favorizează formarea rapidă a cheagurilor.

Problema pe care o rezolvă invenţia constă în elaborarea unei metode care permite decelularizarea mai efectivă şi optimală a ficatului şi a altor organe sau ţesuturi, favorizând un acces bun pentru perfuzie prin vena portă, micşorarea timpului şi efortului aplicat.

Problema se rezolvă prin aceea că animalele experimentale se eutanasiază în camera cu bioxid de carbon cu concentraţia de 5%, se fixează pe masa de lucru, se delimitează câmpul operator, se deschide cavitatea abdominală prin incizia liniei mediane a corpului, se mobilizează vena portă şi se ligaturează la capătul ei proximal, se canulează cu un cateter, prin care se perfuzează o soluţie ce conţine apă distilată în volum de 1…1,5 L şi 63 mL de citrat fosfat dextroză timp de 4…6 ore, apoi se perfuzează o soluţie de dodecilsulfat de sodiu cu concentraţia de 0,25% în volum de 2…3 L, timp de 12…15 ore, după care se perfuzează o soluţie tampon fosfat cu concentraţia de 1% în volum de 1,5 L, timp de 2…3 ore.

Avantajul acestei metode constă în faptul că utilizarea anticoagulantului citrat fosfat dextroză permite înlăturarea sângelui proaspăt şi previne formarea trombilor, decurgerea procesului de decelularizare fiind mai rapidă, precum şi obţinerea unei matrice decelularizate cât mai calitative, cu un conţinut minim şi chiar nul de acizi nucleici.

Rezultatul constă în operativitatea, eficacitatea, calitatea mult mai înaltă şi lejeritatea procesului de decelularizare a ţesutului hepatic şi a altor organe.

Metoda se efectuează în modul următor:

Eutanasierea animalelor experimentale se efectuează în camera cu bioxid de carbon, la concentraţia de 5%. Animalele experimentale se fixează pe masa de lucru, se delimitează câmpul operator. Pentru iniţierea decelularizării, vena portă se canulează cu ,,fluturaş” (butterfly), având lungimea acului de 2 cm. Decelularizarea începe cu montarea şi umplerea sistemului de perfuzie cu soluţie de apă distilată în volum de 1 L, la care se adaugă 63 mL soluţie anticoagulant ce conţine în componenţa sa citrat fosfat dextroză, pentru înlăturarea sângelui proaspăt şi prevenirea formării trombilor, din cauza sintezei în ficat a factorilor de coagulare. Perioada de perfuzare cu apă distilată este de 4 ore. Imediat după perfuzarea ficatului cu apă distilată şi anticoagulant, se iniţiază perfuzia cu soluţie de dodecilsulfat de sodiu (SDS) 0,25% în volum de 2 L timp de 12 ore. La o concentraţie de 0,25%, detergentul elimină excelent celulele, în timp ce dimensiunile generale tisulare se conservă. Ulterior se iniţiază perfuzia ţesutului hepatic cu soluţie SDS 0,5% în volum de 2 L, timp de 12 ore. După aceasta se continuă perfuzia cu soluţie tampon fosfat (PBS) 1% în volum de 1 L, timp de 2 ore, pentru înlăturarea detergentului şi conservarea matricei extracelulare.

Exemplu

În calitate de obiect de studiu au servit 10 şobolani linia Wistar de culoare albă, cu masa corporală cuprinsă între 175...230 g. Eutanasierea animalelor experimentale a fost realizată în camera cu bioxid de carbon, concentraţia căruia era de 5%. După eutanasiere, şobolanii au fost fixaţi pe masa de lucru, s-a delimitat câmpul operator, s-a efectuat incizia pe linia mediană a corpurilor şobolanilor, s-a pătruns în cavitatea abdominală, a fost identificată vena portă, care ulterior a fost ligaturată şi detaşată împreună cu ficatul din cavitatea abdominală. Debutul decelularizării a început cu montarea şi umplerea sistemului de perfuzie cu soluţie de apă distilată în volum de 1 L, la care s-au adăugat 63 mL soluţie anticoagulant ce conţine în componenţa sa citrat fosfat dextroză, pentru înlăturarea sângelui proaspăt şi prevenirea formării trombilor, din cauza sintezei în ficat a factorilor de coagulare. Perioada de perfuzare cu apă distilată a fost de 4 ore, timp în care ţesutul hepatic şi-a schimbat conformaţia şi culoarea. Imediat după perfuzarea ficatului cu apă distilată s-a iniţiat perfuzia cu soluţie SDS 0,25% în volum de 2 L, perioada de perfuzie fiind de 12 ore. La o concentraţie de 0,25%, detergentul a eliminat excelent celulele, în timp ce dimensiunile generale tisulare s-au conservat. Apoi s-a iniţiat perfuzia ţesutului hepatic cu soluţie SDS 0,5% în volum de 2 L, timp de 12 ore. La asemenea concentraţie are loc mutarea proteinelor citoplasmatice. După 12 ore de perfuzare cu SDS 0,5% , s-a continuat perfuzia cu soluţie PBS 1% în volum de 1 L, timp de 2 ore, pentru înlăturarea detergentului şi conservarea matricei extracelulare.

Metoda propusă asigură o decelularizare mai efectivă, lejeră şi operativă şi mult mai calitativă prin utilizarea anticoagulantului citrat fosfat dextroză.

Metoda dată a fost aplicată cu rezultate bune în 10 cazuri în cadrul laboratorului şi catedrelor Universităţii.

1. Omar Barakat, Shahrzad Abbasi, Gabriela Rodriguez, Jessi Rios et al. Use of decellularized porcine liver for engineering humanized liver organ. Journal of surgical research, 2012, 173(1), p. 11-25

Claims

Metodă de decelularizare a ficatului la animalele experimentale care constă în aceea că ele se eutanasiază în camera cu bioxid de carbon cu concentraţia de 5%, se fixează pe masa de lucru, se delimitează câmpul operator, se deschide cavitatea abdominală prin incizia liniei mediane a corpului, se mobilizează vena portă şi se ligaturează la capătul ei proximal, se canulează cu un cateter, prin care se perfuzează o soluţie ce conţine apă distilată în volum de 1…1,5 L şi 63 mL de citrat fosfat dextroză timp de 4…6 ore, apoi se perfuzează o soluţie de dodecilsulfat de sodiu cu concentraţia de 0,25% în volum de 2…3 L timp de 12…15 ore, după care se perfuzează o soluţie tampon fosfat cu concentraţia de 1% în volum de 1,5 L, timp de 2…3 ore.