RS56739B1

RS56739B1 - Aminoglikozidi i njihova upotreba u tretiranju genetskih poremećaja

Info

Publication number: RS56739B1
Application number: RS20180029A
Authority: RS
Inventors: Timor Baasov; Dana Atia-Glikin; Jeyakumar Kandasamy; Valery Belakhov
Original assignee: Technion Res & Dev Foundation
Priority date: 2010-11-18
Filing date: 2011-11-17
Publication date: 2018-03-30
Also published as: WO2012066546A1; US20190224226A9; US9616079B2; US20210228608A1; NO2640734T3; CA2816789A1; SI2640734T1; EP2640734A1; US20170182078A1; IL266495A; PT2640734T; HUE036248T2; IL284067B; SMT201800019T1; CA2816789C; IL284067A; ES2833938T3; US11865128B2; JP2018123135A; HK1248709A1

Description

Opis

OBLAST PRONALASKA I STANJE TEHNIKE

[0001] Ovaj pronalazak, u nekim od njegovih realizacija, se odnosi na novu klasu aminoglkozida, odreĊenije, ali ne i iskljuĉivo, na nove aminoglikozide sa poboljšanom efikasnošću u tretmanu genetskih poremećaja.

[0002] Mnogi humani genetski poremećaji su posledica besmislenih mutacija, u kojima jedan od tri zaustavna kodona (UAA, UAG ili UGA) zamenjuje kodon koji kodira aminokiselina, što dovodi do prevremene terminacije translacije i konaĉno do skraćenih, neaktivnih proteina. Danas je poznato na stotine ovakvih besmislenih mutacija, a za nekoliko je pokazano da su odgovorne za neke sluĉajeve fatalnih bolesti, ukljuĉujući cistiĉnu fibrozu (CF), Duchenne-ovu mišićnu distrofiju (DMD), ataksijatelangiektaziju, Hurler-ov sindrom, hemofiliju A, hemofiliju B, Tay-Sachs i druge. Za mnoge od ovih bolesti danas ne postoji efikasan tretman, pa iako se genska terapija ĉini potencijalno mogućim rešenjem za genetske poremećaje, još uvek postoje mnoge kritiĉne teškoće koje treba rešiti, pre nego što bi ova tehnika mogla da se upotebljava za humana bića.

[0003] Pokazano je da neki aminoglikozidi poseduju terapeutsku vrednost u tretmanu nekoliko genetskih bolesti, zbog njihove sposobnosti da indukuju ribozome za proĉitavnje mutacije na zaustavnom kodonu, generišući proteine ĉitave duţine, iz dela molekula mRNK.

[0004] Tipiĉno, aminoglikozidi su veoma snaţni antibiotici širokog spektra, koji se obiĉno koriste u tretmanu infekcija koje ugroţavaju ţivot. Prihvaćeno je da mehanizam delovanja aminoglikozidnih antibiotika, kao što je paromomicin, ukljuĉen u interakciju sa prokariotskim ribozomom, a specifiĉnije, da je ukljuĉen u vezivanje na dekodirajuću A-poziciju 16S ribozomalne RNK, što dovodi do inhibicije translacije proteina i interferencije sa autentiĉnošću translacije.

Paromomicin

[0005] Nekoliko dostignuća u odreĊivanju strukture bakterijskog ribozoma, kao i sa kristalnim i NMR strukturama bakterijskog A-mesta na modelu oligonukleotida, pruţilo je korisne informacije za razumevanje mehanizma dekodiranja u prokariotskim ćelijama i razumevanja kako aminoglikozidi primenjuju njihovo štetno i pogrešno proĉitavanje genetskog koda. Ova i druga ispitivanja su dovela do hipoteze da afinitet A-mesta prema nesrodnom mRNK-tRNK kompleksu raste nakon vezivanja aminoglikozida, spreĉavajući ribozom da efikasno prepozna razliku izmeĊu nesrodnih i srodnih kompleksa.

[0006] Poboljšanje u supresiji terminacije pomoću aminoglikozida kod eukariota, smatra se da se dešava po sliĉnom mehanizmu aktivnosti aminoglikozida kod prokariota, mešanjem u autentiĉnost translacije tokom sinteze proteina, naime vezivanjem nekih aminoglikozida na A-mesto ribozoma, verovatno se indukuju konformacione promene, koje stabilizuju blisko srodne mRNK-tRNK komplekse, umesto da insertuju faktor oslobaĊanja. Pokazano je da aminoglikozidi suzbijaju razne zaustavne kodone, sa primetno znaĉajno razliĉitim efikasnostima (UGA > UAG > UAA), a delotvornost ove supresije zavisi još od identiteta ĉetvrtog nukleotida neposredno posle zaustavnog kodona (C > U > A ≥ g), kao i od konteksta lokalne sekvence u okolini zaustavnog kodona.

[0007] Ţeljene karakteristike efikasnog proĉitavanja leka bile bi oralno ordiniranje i mali ili nikakav bakterijski efekat. Antimikrobna aktivnost prilikom proĉitavanja leka je nepoţeljna, kao i bilo koja nepotrebna upotreba antibiotika, naroĉito u pogledu gastrointestinalnog (GI) biota, zbog štetnih efekata izazvanih sa poremećajem ravnoteţe GI biota i potrebe za rezistentnošću. U tom pogledu, pored gore pomenutih ograniĉenja, većina kliniĉkih aminoglikozida je veoma selektivna protiv bakterijskih ribozoma, i ne ispoljava znaĉajan efekat na citoplazmiĉne ribozome humanih ćelija.

[0008] U nastojanju da se izbegnu gore pomenuta ograniĉenja, biofarmaceutika traţi nove lekove za zaustavljanje i supresiju mutacija, traţeći u velikim hemijskim bibliotekama besmislena proĉitavanja aktivnosti. Korišćenjem ovakvog pristupa, otkriveno je ne-aminoglikozidno jedinjenje, 3-[5-(2-fluorofenil)-1,2,4-oksadiazol-3-il]benzoeva kiselina (PTC124). Ĉinjenica da je objavljeno da PTC124 nema antibakterijsku aktivnost, a neobjavljenu toksiĉnost, sugeriše da je njen mehanizam delovanja na ribozom razliĉiti od onog za aminoglikozide.

[0009] Ĉinjenicu da aminoglikozidi mogu da suzbiju prevremene besmislene mutacije u ćelijama sisara, prvi su pokazali Burke i Mogg in 1985, koji su takoĊe zapazili terapeutski potencijal ovih lekova u tretmanu genetskih poremećaja. Prva ispitivana genetska bolest bila je cistiĉna fibroza (CF), dominantan autozomalni recesivni poremećaj kod stanovništva Kavkaza, koja ugroţava jednu od 2,500 beba. Uzrok CF su mutacije u provodnosti regulatora transmembrane proteina cistiĉne fibroze CFTR (od engleski cystic fibrosis transmembrane regulator). Do sada je identiifikovano više od 1,000 razliĉitih mutacija koje izazivaju CF, na genu CFTR, a 5-10 % ovih mutacija ĉine prevremeni zaustavni kodoni. Kod Jevreja Aškenazija, mutacija W1282X i druge besmislene mutacije ĉine 64 % svih CFTR mutant alela.

[0010] Pvi eksperimenti supresije CFTR mutacija posredovani sa aminoglikozidom, su pokazali da prevremeno zaustavljanje mutacija, koje je naĊeno na genu CFTR, moţe da se suzbije sa ĉlanovima familije gentamicina i sa geniticinom (G-418), koje je mereno preko pojave funkcioanlnog CFTR ĉitave duţine u sojevima ćelija bronijalnog epitela.

Familija gentamicina

Gentamicin (G-418)

[0011] Eksperimenti supresije u intestinalnim tkivima, na mutantima transgenih miševa CFTR-/-, koji su nosili humani transgen CFTRG542X, pokazali su da tretman sa gentamicinom, a u manjoj meri sa tobramicinom, dovodi do pojave humanog CFTR proteina na ţlezdama tretiranih miševa. Najznaĉajnije je da su kliniĉka ispitivanja, koja su koristila dvostruko-slepe, placebo kontrolisane, ukrštene testove, pokazala da gentamicin moţe da suzbije zaustavne mutacije kod ugroţenih pacijenata, i da je tretman sa gentamicinom poboljšao provodnost transmembrane u sluzokoţi nosa, u grupi sa 19 pacijenata, koji su nosili CFTR zaustavne mutacije. Drugi genetski poremećaji, na kojima je ispitivan terapeutski potencijal aminoglikozida, testiran je u sistemima in vitro, sa kultivisanim sojevima ćelija, ili na animalnom modelu, su DMD, Hurler-ov sindrom, nefrogeni diajbetes insipidus, nefropatski cistinozitis, retinitis pigmentoza i ataksija-telangiektazija.

[0012] MeĊutim, jedno od glavnih ograniĉenja u upotrebi aminoglikozida kao farmaceutskih agenasa, predstavlja njihova visoka toksiĉnost prema sisarima, koja se tipiĉno pokazuje na bubrezima (nefrotoksiĉnost) i bolestima povezanim sa uhom (ototoksiĉnost). Predpostavlja se da poreklo ove toksiĉnosti potiĉe od kombinacije razliĉitih faktora i mehanizama, kao što su interakcije sa fosfolipidima, inhibicija fosfolipaza i stvaranje slobodnih radikala. Mada se smatraju selektivnim prema bakterijskim ribozomima, većina aminoglikozida se vezuje takoĊe za eukariotsko A-mesto, ali sa niţim afinitetima nego za bakterijsko A-mesto. Inhibicija translacije u ćelijama sisara takoĊe je jedan od mogućih uzroka visoke toksiĉnosti ovih agenasa. Sledeći faktor koji dorinosi njihovoj citotoksiĉnosti je njihovo vezivanje za 12S rRNK A-mesta mitohondrijalnog ribozoma, ĉija sekvenca je veoma bliska bakterijskom A-mestu.

[0013] U mnogim ispitivanjima je pokušano da se shvate i ponude drugi putevi za ublaţavanje ove toksiĉnosti povezane sa aminoglikozidima, ukljuĉujući i upotrebu antioksidanata za smanjivanje sadrţaja slobodnih radikala, kao i upotrebu poli-L-asparaginata i daptomicina, za umanjivanje sposobnosti aminoglikozida da stupaju u interakciju sa fosfolipidima. Nedavno je demonstrirana uloga megalina (multiligandni endocitni receptor, koji je naroĉito obilan u proksimalnim tubulama bubrega, i u srednjem uhu) u upijanju aminoglikozida. Ordiniranje agonista, koji se nadmeću sa vezivanjem aminoglikozida za megalin, takoĊe je dalo za rezultat smanjenje upijanja aminoglikozida i toksiĉnosti. Pored toga, ispitivana je izmena šeme ordiniranja i/ili naĉina na koji se aminoglikozidi ordiniraju, kao naĉini za smanjivanje toksiĉnosti.

[0014] Uprkos ekstenzivnim naporima za smanjivanje toksiĉnosti aminoglikozida, mekoliko rezultata je prešlo u standardnu kliniĉku praksu i procedure za ordiniranje aminoglikozida da bi se suzbile zaustavne mutacije, a razlikuju se prema izmenama sheme ordiniranja. Na primer, upotreba sub-toksiĉnih doza gentamicina u kliniĉkim probama, verovatno je prouzrokovala smanjenje efikasnosti, dobijene u eksperimentima in vivo, u poreĊenju sa sistemima in-vitro. Aminoglikozid geneticin<®>(G-418 sulfat) pokazao je najbolju aktivnost u supresiji terminacije u translacionotranskripcionim sistemima in-vitro, meĊutim, njegova upotreba kao terapeutskog agensa nije moguća, zato što je letalan, ĉak i pri vrlo niskim koncentracijama. Na primer, LD50za G-418, protiv humanih ćelija fibroplasta, je 0.04 mg/mL, u poreĊenju sa 2.5-5.0 mg/mL za gentamicin, neomicin i kanamicin.

[0015] Povećana osetljivost eukariotskih ribozoma prema nekim lekovima aminoglikozida, kao što su G-418 i gentamicin, je intrigantna, ali se do danas ne moţe racionalno objasniti, zbog nedostatka dovoljno strukturnih podataka o njihovoj interakciji sa eukariotskim ribozomima. Pošto je G-418 ekstremno toksiĉan, ĉak i pri vrlo niskim koncentracijama, za sada je gentamicin jedini aminoglikozid koji je testiran u raznim animanim modelima i kliniĉkim ispitivanjima. Mada su neka ispitivanja to pokazala, usled njihove relativno niske toksiĉnosti u kultivisanim ćelijama, amikacin i paromomicin mogu da predstavljaju alternative za gentamicin, u terapiji supresije zaustavljanja mutacije, tako da još uvek nisu objavljena kliniĉka ispitivanja sa ovim aminoglikozidima.

[0016] Do danas, skoro svi eksperimenti supresije obavljeni su sa kliniĉkim, komercijalno dostupnim aminoglikozidima, meĊutim, samo ograniĉen broj aminoglikozida, ukljuĉujući gentamicin, amikacin i tobramicin, nalaze se u kliniĉkoj upotrebi, kao antibiotici za internalno ordiniranje humanim bićima. MeĊu ovima, tobramicin nema aktivnost za supresiju zaustavne mutacije, a gentamicin je jedini aminoglikozid koji je testiran na aktivnost supresije zaustavne mutacije na animalnim modelima i u kliniĉkim ispitivanjima. Nedavno je pokazan skup neaminskih derivata za promovisanje proĉitavanja SMN proteina u fibroblastima, izveden iz pacijenata sa spinalnom mišićnom atrofijom (SPA); meĊutim, za ova jedinjenja, koja su prvobitno oznaĉena kao antibiotici, nema zakljuĉaka u pogledu daljeg poboljšanja aktivnosti proĉitavanja ovih derivata.

[0017] U dokumentu WO 2007/113841, neki od ovih pronalazaĉa su prikazali jednu klasu aminoglikozida izvedenu iz paromomicina, koja je specifiĉno dizajnirana da pokaţe visoku aktivnost za preuranjeno proĉitavanje mutacija zaustavnih kodona, sa ispoljavanjem niske cirotoksiĉnosti u ćelijama sisara i niske antimikrobne aktivnosti, pa se stoga ista moţe upotrebiti u tretmanu genetskih bolesti. Ova klasa aminoglikozida, izvedena iz paromomicina, dizajnirana je uvoĊenjem izvesnih manipulacija u jezgru paromamina, što je dovelo do aktivnosti proĉitavanja i smanjene toksiĉnosti i antimikrobne aktivnosti. Manipulacije su obavljene na nekoliko pozicija paromaminskog jezgra.

Prsten I

Paromamin

[0018] Jedna takva manipulacija paromaminskog jezgra, koja je opisana u dokumentu WO 2007/113841, je odreĊivanje benefitne uloge hidroksilne grupe na poziciji 6’ aminoglikozidnog jezgra (videti, na primer, NB30 i NB54 niţe).

[0019] Sledeća manipulacija paromaminskog jezgra, koja je definisana i prikazana u dokumentu WO 2007/113841, je uvoĊenje jednog ili više monosaharidnih ostataka ili nekog ostatka oligosaharida na poziciju 3’, 5 i/ili 6 aminoglikozidnog jezgra. Ova manipulacija je prikazana kao "Prsten III", u egzemplarnim jedinjenjima NB30 i NB54 prikazanim gore.

[0020] Dodatna manipulacija paromaminskog jezgra, koja je definisana i prikazana u dokumentu WO 2007/113841, je uvoĊenje ostatka (S)-4-amino-2-hidroksibutiril (AHB) u poloţaju 1 paromaminskog jezgra. Ova manipulacija je prikazana u egzemplarnom jedinjenju NB54, prikazanom gore. Pokazano je da ovakvo uvoĊenje ostatka AHB obezbeĊuje poboljšano proĉitavanje aktivnosti i smanjenu toksiĉnost.

[0021] Sledeća manipulacija promaminskog jezgra, koja je opisana u dokumentu WO 2007/113841, je supstitucija vodonika na poziciji 6’ sa nekim alkilom, kao što je metil supstituent. Ova manipulacija je data kao primer u derivatu jedinjenja NB30 i NB54, a navedena je kao NB74 i NB84, respektivno.

[0022] Nudelman, I., et al., Bioorg Med Chem, 2010. 18(11): p. 3735-46, takoĊe su povezani sa jedinjenjima oznaĉenim kao NB74 i NB84, a opisuju njihovu smanjenu toksiĉnost i superiorno proĉitavanje efikasnosti, u poreĊenju sa gentamicinom.

[0023] Dodatni podaci iz prethodnog stanja tehnike su kao što sledi, Nudelman, I., et al., Bioorg Med Chem Lett, 2006. 16(24): p. 6310-5; Hobbie, S.N., et al., Nucleic Acids Res, 2007. 35(18): p. 6086-93; Kondo, J., et al., Chembiochem, 2007. 8(14): p. 1700-9; Rebibo-Sabbah, A., et al., Hum Genet, 2007. 122(3-4): p. 373-81; Azimov, R., et al., Am J Physiol Renal Physiol, 2008. 295(3):p. F633-41; Hainrichson, M., et al., Org Biomol Chem, 2008.6(2): p.227-39; Hobbie, S.N., et al., Proc Natl Acad Sci USA, 2008.105(52): p.20888-93; Hobbie, S.N., et al., Proc Natl Acad Sci USA, 2008. 105(9): p. 3244-9; Nudelman, I., et al., Adv. Synth. Catal., 2008. 350: p.1682-1688; Nudelman, I., et al., J Med Chem, 2009.52(9): p.2836-45; Venkataraman, N., et al., PLoS Biol, 2009. 7(4): p. e95; Brendel, C., et al., J Mol Med (Berl), 2010. 89(4): p. 389-98; Goldmann, T., et al., Invest Ophthalmol Vis Sci, 2010. 51(12): p. 6671-80; Malik, V., et al., Ther Adv Neurol Disord, 2010. 3(6): p.

379-89; Warchol, M.E., Curr Opin Otolaryngol Head Neck Surg, 2010. 18(5): p. 454-8; Lopez-Novoa, J.M., et al., Kidney Int, 2011. 79(1): p. 33-45; Rowe, S.M., et al., J Mol Med (Berl), 2011. 89(11): p. 1149-61; i Vecsler, M., et al., PloS One, 2011.6(6): p. e20733.

IZLAGANJE SUŠTINE PRONALASKA

[0024] Ovaj pronalazak se odnosi na jednu novu klasu pseudo-trisaharidnih aminoglikozida, koja se moţe korisno upotrebiti u tretmanu genetskih bolesti, kao što je cistiĉna fibroza, tako što ispoljavaju visoko preuranjeno proĉitavanje aktivnosti mutacija zaustavnim kodonima, uz ispoljavanje niske toksiĉnosti u ćelijama sisara i niske antimikrobne aktivnosti. Ovde opisane aminoglikozide karakteriše struktura jezgra, zasnovana na Prstenovima I, II i III paromomicina, uz dodatak nekog alkila na poziciji 5" u Prstenu III.

[0025] Prema tome, u skladu sa jednim aspektom nekih realizacija ovog pronalaska, daje se jedinjenje koje ima opštu formulu I:

ili neka njegova farmaceutski prihvatljiva so, gde su:

R1je neki alkil, koji ima 1-4 atoma ugljenika;

R2je vodonik ili (S)-4-amino-2-hidroksibutiril (AHB);

R3se bira iz grupe koju ĉine vodonik i neki alkil, koji ima 1-4 atoma ugljenika; a

[0026] stereo-konfiguracija svake pozicije 6’ i pozicije 5" predstalja nezavisno, R konfiguracija ili S konfiguracija.

[0027] U skladu sa nekim realizacijama ovog pronalaska, alkil predstavlja metil.

[0028] U skladu sa nekim realizacijama ovog pronalaska, svaki R2i R3je vodonik.

[0029] U skladu sa nekim realizacijama ovog pronalaska, R2je AHB, a R3je vodonik.

[0030] U skladu sa nekim realizacijama ovog pronalaska, R2je vodonik, a R3je neki alkil, koji ima 1-4 atoma ugljenika.

[0031] U skladu sa nekim realizacijama ovog pronalaska, R2je AHB, a R3je neki alkil, koji ima 1-4 atoma ugljenika.

[0032] U skladu sa nekim realizacijama ovog pronalaska, alkil predstavlja metil.

[0033] U skladu sa nekim realizacijama ovog pronalaska, jedinjenja koja su ovde data biraju se iz grupe koju ĉine jedinjenja NB118, NB119, NB122, NB123, NB124, NB125, NB127 i NB128.

[0034] U skladu sa nekim realizacijama ovog pronalaska, jedinjenja koja su ovde data karakteriše to što pokazuju odnos IC50inhibicije translacije u eukariotima, prema IC50inhibicije translacije u prokariotima, koji je niţi od 15. U skladu sa nekim realizacijama ovog pronalaska, ovaj odnos je niţi od 1.

[0035] U skladu sa nekim realizacijama ovog pronalaska, jedinjenja koja se ovde daju karakteriše MIC u Gram-negativnim bakterijama veći od 200 µM, a MIC u Gram-pozitivnim bakterijama veći od 20 µM.

[0036] U skladu sa sledećim aspektom nekih od realizacija iz ovog pronalaska, daje se farmaceutska kompozicija koja sadrţii bilo koje od jedinjenja datih ovde i neki farmaceutski prihvatljiv nosaĉ.

[0037] U skladu sa nekim realizacijama ovog pronalaska, farmaceutska kompozicija je upakovana u neki materijal za pakovanje sa štampanom identifikacijom, u ili na materijalu za pakovanje, za upotrebu u tretmanu nekog genetskog poremećaja.

[0038] U skladu sa nekim realizacijama ovog pronalaska, jedinjenja koja su ovde data su za upotrebu u tretmanu nekog genetskog poremećaja.

[0039] U skladu sa sledećim aspektom nekih od realizacija ovog pronalaska, daje se upotreba, bilo kog od jedinjenja koja su ovde data, u proizvodnji nekog medikamenta za tretiranje nekog genetskog poremećaja.

[0040] U skladu sa nekim realizacijama ovog pronalaska, genetski poremećaj je povezan sa preuranjenom mutacijom zaustavnog kodona i/ili raskidanjem fenotipa protona.

[0041] U skladu sa nekim realizacijama ovog pronalaska, genetski poremećaj se bira iz grupe koju ĉine: cistiĉna fibroza (CF), Duchenne-ova mišićna distrofija (DMD), ataksija-telagiektazija, Hurler-ov sindrom, hemofilija A, hemofilija B, Usher-ov sindrom i Tay-Sachs.

[0042] U skladu sa nekim realizacijama ovog pronalaska, genetski poremećaj predstavlja cistiĉna fibroza.

[0043] U skladu sa sledećim aspektom nekih od realizacija ovog pronalaska, daje se jedan postupak za dobijanje ovde datih jedinjenja, postupak koji se ostvaruje kroz:

(a) dobijanje donorskog jedinjenja, koje ima opštu Formulu II:

gde su:

R1je neki alkil, koji ima 1-4 atoma ugljenika;

R4je vodonik ili neki donor amino-zaštitne grupe;

R5je donor amino-zaštitne grupe ako je R4vodonik, ili vodonik ako je R4neki donor amino-zaštitne grupe; a svaki HPd je neki donor hidroksilne-zaštitne grupe; i

L je odlazeća grupa;

(b) kuplovanje donorskog jedinjenja sa nekim akceptorskim jedinjenjem koje ima opštu Formulu III:

gde su:

isprekidana linija prikazuje R konfiguraciju ili S konfiguraciju;

R3se bira iz grupe koju ĉine vodonik i neki alkil, koji ima 1-4 atoma ugljenika;

R6je neki akceptor amino-zaštitne grupe, ili (S)-4-azido-2-O-acetil-1-butiril;

HPa je neki akceptor hidroksilne-zaštitne grupe; a

APa je neki akceptor amino-zaštitne grupe; i

(c) uklanjanje svake od amino-zaštitnih grupa i hidroksilne-zaštitne grupe, ĉime se dobija ovo jedinjenje.

[0044] U skladu sa nekim realizacijama ovog pronalaska, odlazeća grupa je trihloroacetimidat.

[0045] U skladu sa nekim realizacijama ovog pronalaska, donor hidroksilne-zaštitne grupe je O-benzoil, a donor amino-zaštitne grupe je azido.

[0046] U skladu sa nekim realizacijama ovog pronalaska, akceptor hidroksilnezaštitne grupe je O-acetil, a akceptor amino-zaštitne grupe je azido.

[0047] Ukoliko se drugaĉije ne definiše, svi tehniĉki i/ili nauĉni termini koji se ovde koriste, imaju isto znaĉenje, koje obiĉno razume onaj ko je verziran u stanju tehnike kojoj pripada ovaj pronalazak. Mada se u praktikovanju i testiranju realizacija ovog pronalaska mogu koristiti postupci i materijali koji su sliĉni ili ekvivalentni ovima koji su ovde opisani, egzemplarni postupci i/ili materijali su opisani u nastavku. U sluĉaju nesporazuma, kontrolu preuzima ova patentna prijava, ukljuĉujući definicije. Pored toga, adicija, materijali, postupci i primeri su samo ilustrativni i nije im namera da budu neophodno ograniĉavajući.

KRATAK OPIS SLIKA NACRTA

[0048] Neke realizacije ovog pronalaska ovde su opisane samo kao primeri, pozivanjem na priloţene slike. Pozivajući se sada specifiĉno na detalje slika, napominje se da su tu prikazani podaci samo primeri i sluţe usvrhu ilustrativnog razmatranja realizacija ovog pronalaska. U tom pogledu, ovaj opis, uzet sa slikama, sluţi onima koji su verzirani u stanju tehnike, da shvate kako se mogu praktikovati te realizacije.

[0049] Na ovim slikama:

SLIKE. 1A-C predstavljaju put sinteze za dobijanje C5-dijastereomernih estara (R,X)-27 i (S,X)-28, u skladu sa nekim realizacijama ovog pronalaska, gde "a" predstavlja DCC, 4-DMAP, CSA, DCM, na sobnoj temperaturi (FIG. 1A);<1>H NMR spektri (R,X)-27 i (S,X)-28, gde su razlike u pomeranju (Δδ) izmeĊu pojedinih protona (R,X)-27 i (S,X)-28 naglašene vizuelno (SLIKA 1B); a naznaka apsolutne konfiguracije na 5-ugljeniku (oznaĉena je sa X) glavnog alkohola Jedinjenja 9, odreĊena je pomoću pravila Sector rule (SLIKA 1C); SLIKE. 2A-F daju rezultate proĉitavanja testa zaustavnog kodona, prikazivanjem komparativnih grafika nivoa supresije zaustavnog kodona in vitro, indukovanog sa ranije objavljenim referentnim primerom NB30 (oznaĉen otvorenim krugovima), sa egzemplarnim jedinjenjima, u skladu sa nekim realizacijama ovog pronalaska, sa NB118 (oznaĉen crnim trouglovima) i sa NB119 (oznaĉen otvorenim trouglovima), i sa kontrolnim lekom gentamicinom (oznaĉen crnim pravougaonicima) u seriji konstrukta, u kontekstu besmislene mutacije, predstavljanjem raznih genetskih bolesti (u zagradi), gde su rezultati koji se odnose na Konstrukt R3X (USH1) prikazani na SLICI 2A, za R245X (USH1) na SLICI 2B, za G542X (CF) na SLICI 2C, zs W1282X (CF) na SLICI 2D, zs Q70X (HS) na SLICI 2E, i za R3381X (DMD) na SLICI 2F;

SLIKE. 3A-F daju rezultate proĉitavanja testa zaustavnog kodona prikazivanjem komparativnih grafika nivoa supresije zaustavnog kodona in vitro, indukovanog sa ranije objavljenim referentnim primerom NB54 (oznaĉen crnim krugovima), sa egzemplarnim jedinjenjima u skladu sa nekim realizacijama ovog pronalaska, sa NB122 (oznaĉen crnim trouglovima) i sa NB123 (oznaĉen otvorenim trouglovima), i sa gentamicinom, kao kontrolnim lekom (oznaĉen crnim pravougaonicima) u seriji konstrukta, u kontekstu besmislene mutacije, predstavljanjem raznih genetskih bolesti (u zagradi), gde su rezultati koji se odnose na Konstrukt R3X (USH1) prikazani na SLICI 3A, na R245X (USH1) na SLICI 3B, na G542X (CF) na SLICI 3C, na W1282X (CF) na SLICI 3D, na Q70X (HS) na SLICI 3E, i na R3381X (DMD) na SLICI 3F;

SLIKE. 4A-D predstavljaju ex vivo supresiju PCDH15-R3X (SLIKA 4A), PCDH15-R245X (SLIKA 4B), IDUA-Q70X (SLIKA 4C), i CFTR-W1282X (SLIKA 4D) besmislenih mutacija, ostvarenih pomoću ranije objavljenog referentnog primera NB54 (oznaĉen crnim krugovima), sa egzemplarnim jedinjenjima u skladu sa nekim realizacijama ovog pronalaska, sa NB122 (oznaĉen crnim trouglovima) i sa NB123 (oznaĉen otvorenim trouglovima) i sa kontrolnim lekom gentamicinom (oznaĉen crnim pravougaonicima); SLIKE. 5A-D predstavljaju komparativne grafike in vitro testova supresije prevremene mutacije zaustavnog kodona za CFTR-G542X (SLIKA 5A i 5C), i CFTR-W1282X (SLIKA 5B i D), ostvarenih sa egzemplarnim jedinjenjima u skladu sa nekim realizacijama ovog pronalaska, sa NB124 (oznaĉen crnim krugovima), sa NB125 (oznaĉen otvorenim krugovima), sa NB127 (oznaĉen crnim trouglovima), i sa NB128 (oznaĉen otvorenim trouglovima), pomoću ranije objavljenih referentnih primera NB74 (oznaĉen praznim rombovima) i NB84 (oznaĉen crnim rombovima), i pomoću kontrolnih lekova gentamicina (oznaĉen crnim pravougaonicima) i G418 (oznaĉen praznim pravougaonicima);

SLIKE. 6A-F daju rezultate proĉitavanja testa zaustavnog kodona prikazivanjem komparativnih grafika in vitro proĉitavanja nivoa zaustavnog kodona izazvanog sa egzemplarnim jedinjenjima u skladu sa nekim realizacijama ovog pronalaska, sa NB124 (oznaĉen crnim krugovima) i sa NB125 (oznaĉen otvorenim krugovima), pomoću ranije objavljenog referentnog primera NB74 (oznaĉen praznim rombovima) i pomoću kontrolnog leka gentamicina (oznaĉen crnim pravougaonicima), u seriji konstrukta, u kontekstu besmislene mutacije, predstavljanjem raznih genetskih bolesti (u zagradi), gde su rezultati koji se odnose na Konstrukt R3X (USH1) prikazani na SLICI 6A, za R245X (USH1) na SLICI 6B, za G542X (CF) na SLICI 6C, za W1282X (CF) na SLICI 6D, za Q70X (HS) na SLICI 6E, i za R3381X (DMD) na SLICI 6F;

SLIKE. 7A-F daju rezultate proĉitavanja testa zaustavnog kodona prikazivanjem komparativnih grafika nivoa supresije zaustavnog kodona in vitro, indukovanog sa ranije objavljenim referentnim primerom NB84 (oznaĉen crnim rombovima), sa egzemplarnim jedinjenjima u skladu sa nekim realizacijama ovog pronalaska, sa NB127 (oznaĉen crnim trouglovima) i sa NB128 (oznaĉen otvorenim trouglovima), i pomoću kontrolnih lekova G418 (oznaĉen praznim pravougaonicima) i gentamicinom (oznaĉen crnim pravougaonicima), u seriji konstrukta, u kontekstu besmislene mutacije, predstavljanjem raznih genetskih bolesti (u zagradi), gde su rezultati koji se odnose na Konstrukt R3X (USH1) prikazani na SLICI 7A, na R245X (USH1) na SLICI 7B, na G542X (CF) na SLICI 7C, na W1282X (CF) na SLICI 7D, na Q70X (HS) na SLICI 7E, i na R3381X (DMD) na SLICI 7F;

SLIKE. 8A-D predstavljaju komparativne grafike rezultata ex vivo testova supresije prevremene mutacije zaustavnog kodona, obavljenih na konstruktima CFTR-G542X (SLIKA 8A i 8C) i CFTR-W1282X (SLIKA 8B i 8D), ostvarenih sa egzemplarnim jedinjenjima u skladu sa nekim realizacijama ovog pronalaska, sa NB124 (oznaĉen crnim krugovima), sa NB125 (oznaĉen otvorenim krugovima), sa NB127 (oznaĉen crnim trouglovima) i sa NB128 (oznaĉen otvorenim trouglovima), pomoću ranije objavljenih referentnih primera NB74 (oznaĉen praznim rombovima) i NB84 (oznaĉen crnim rombovima), i sa kontrolnim lekovima gentamicinom (oznaĉen crnim pravougaonicima) i sa G418 (oznaĉen praznim pravougaonicima);

SLIKE. 9A-E daju rezultate proĉitavanja testa zaustavnog kodona prikazivanjem komparativnih grafika ex vivo nivoa supresije zaustavnog kodona izazvanog sa egzemplarnim jedinjenjima u skladu sa nekim realizacijama ovog pronalaska, NB124 (oznaĉen crnim krugovima) i NB125 (oznaĉen otvorenim krugovima), pomoću ranije objavljenog referentnog primera NB74 (oznaĉen crnim rombovima), i pomoću kontrolnih lekova gentamicinom (oznaĉen crnim pravougaonicima) i sa G418 (oznaĉen praznim pravougaonicima) u seriji konstrukta, u kontekstu besmislene mutacije, predstavljanjem raznih genetskih bolesti (u zagradi), gde su rezultati koji se odnose na Konstrukt R3X (USH1) prikazani na SLICI 9A, na R245X (USH1) na SLICI 9B, na Q70X (HS) na SLICI 9C, na W1282X (CF) na SLICI 9D i na G542X (CF) na SLICI 9E;

SLIKE. 10A-E daju rezultate proĉitavanja testa zaustavnog kodona prikazivanjem komparativnih grafika ex vivo nivoa supresije zaustavnog kodona, izazvanog sa egzemplarnim jedinjenjima u skladu sa nekim realizacijama ovog pronalaska, NB127 (oznaĉen crnim pravougaonicima) i NB128 (oznaĉen otvorenim trouglovima), pomoću ranije objavljenog referentnog primera NB84 (oznaĉen crnim rombovima) i pomoću kontrolnih lekova gentamicinom (oznaĉen crnim pravougaonicima) i sa G418 (oznaĉen praznim pravougaonicima), u seriji konstrukta, u kontekstu besmislene mutacije, predstavljanjem raznih genetskih bolesti (u zagradi), gde su rezultati koji se odnose na Konstrukt R3X (USH1) prikazani na SLICI 10A, na R245X (USH1) na SLICI 10B, na Q70X (HS) na SLICI 10C, na W1282X (CF) na SLICI 10D i na G542X (CF) na SLICI 10E;

SLIKE. 11A-D predstavljaju semilogaritamske grafike in vitro inhibicije translacije za prokariote (oznaĉen crnim krugovima) i eukariote (oznaĉen otvorenim krugovima), merene za egzemplarna jedinjenja u skladu sa nekim realizacijama ovog pronalaska, NB118 (SLIKA 11A), NB119 (SLIKA 11B) NB122 (SLIKA 11C) i NB123 (SLIKA 11D);

SLIKE. 12A-D predstavljaju semilogaritamske grafike procenata ex vivo vitalnosti ćelija u zavisnosti od testiranog jedinjenja u HEK-293 (SLIKA 12A i SLIKA 12C) i u humanim fibroblastima ćelija prepucijuma penisa (HFF) (SLIKA 12B i SLIKA 12D), za gentamicin (oznaĉen praznim pravougaonicima), i za ĉetri egzemplarna jedinjenja u skladu sa nekim realizacijama ovog pronalaska; za NB118 (oznaĉen otvorenim krugovima), za NB119 (oznaĉen crnim krugovima), za NB122 (oznaĉen otvorenim trouglovima), i za NB123 (oznaĉen crnim trouglovima); i

SLIKE. 13A-B predstavljaju grafike rasipanja za identifikaciju moguće korelacije izmeĊu proĉitavanja aktivnosti i inhibicije translacije proteina in vitro u eukariotskim sistemima, iz opaţanja u seriji poznatih jedinjenja i egzemplarnih jedinjenja, u skladu sa nekim realizacijama ovog pronalaska, pri ĉemu je povećanje inhibicije sinteze proteina (niţe vrednosti IC50) povezano sa povećanjem proĉitavanja aktivnosti, dok je SLIKA 13A semilogaritamski grafik eukariotske inhibicije translacije u zavisnosti od in vitro proĉitavanja aktivnosti za koncentraciju od 1.4 µM testiranih aminoglikozida (prikazanih na X-osi), korišćenjem šest razliĉitih besmislenih mutacija (W1282X, Q70X, R3X, R245X, G542X i R3381X), a SLIKA 1B je linearni grafik istih podataka, predstavljenih na SLICI 13A.

OPIS SPECIFIĈNIH REALIZACIJA OVOG PRONALASKA

[0050] Ovaj pronalazak, u nekim njegovim realizacijama, se odnosi na jednu novu klasu aminoglikozida, a odreĊenije, ali ne i iskljuĉivo, na nove aminoglikozide sa poboljšanom efikasnošću prema tretmanu genetskih poremećaja.

[0051] Specifiĉno, ovaj pronalazak se u nekim njegovim realizacijama odnosi na jednu novu klasu jedinjenja, izvedenih iz paromomicina, koja pokazuju visoku aktivnost proĉitavanja prevremenih mutacija zaustavnog kodona, uz posedovanje niske toksiĉnosti prema ćelijama sisara. Ovaj pronalazak daje još i farmaceutsku kompoziciju koja sadrţi ova jedinjenja, i njenu upotrebu u tretiranju genetskih poremećaja, kao što je cistiĉna fibroza (CF). Ovaj pronalazak daje još i postupke za dobijanje ovih jedinjenja.

[0052] Princip i upotreba ovog pronalaska bolje će se razumeti pozivanjem na slike i prateće opise.

[0053] Pre detaljnog objašnjavanja bar jedne realizacije ovog pronalaska, podrazumeva se da se ovaj pronalazak ne ograniĉava njegovim aplikacijama, sa iznetim detaljima u opisu koji sledi, ili ilustrovanim primerima. Ovaj pronalazak je pogodan i za druge realizacije ili da se praktikuje i obavlja na razliĉite naĉine. TakoĊe se podrazumeva, da frazeologiju i terminologiju, koje su ovde korišćene u svrhu opisa, ne treba smatrati ogranĉavajućim.

[0054] Kao što je gore razmatrano, nekoliko strukturnih manipulacija na strukturi paromamina dovelo je do sintetskih aminoglikozida, za koje je pokazano da pokazuju poboljšanu aktivnost proĉitavanja prevremenih mutacija zaustavnog kodona, uz posedovanje niske toksiĉnosti u ćelijama sisara. Praćenje ovih strukturnih manipulacija dovelo je do razvoja egzemplarnih referentnih jedinjenja NB30 i NB54, kao pseudo-trisaharidnih derivata kliniĉkog aminoglikozida paromomicina. Strukturni koncept, prikazan na referentnom primeru NB30, pokazuje znaĉajno smanjenu citotoksiĉnost, u poreĊenju sa gentamicinom i paromomicinom, i unapreĊenu supresiju besmislenih mutacija gena PCDH15, zavisnu od doze, gena koji je naznaĉen, kao uzrok tipa 1 Usher-ovog sindroma (USH1), ali je njegov potencijal supresije primetno niţi u odnosu na gentamicin i paromomicin. Referentni primer NB54, koji je razvijen kao druga generacija ovog koncepta strukture, je pokazao znaĉajno smanjenu ćelijsku i akutnu toksiĉnost, a suštinski veće proĉitavanje efikasnosti, nego gentamicin i paromomicin.

[0055] Iako se još dešifruje veza izmeĊu strukture i aktivnosti ovih aminoglikozida, u nastojanju da se dalje poboljša njihov terapeutski efekat u kontekstu genetskih poremećaja, ovi pronalazaĉi su ispitivali brojne dodatne modifikacije, na razliĉitim pozicijama strukture paromamina, ii sa iznenaĊenjem su pronašli da supstituisanje vodonika na poziciji 5" boĉnog lanca na ribozaminskom prstenu (prsten III) sa metil grupom, daje aminoglikozid koji pokazuje znaĉajno smanjenu ćelijsku tokiĉnost, dok paralelno pokazuje suštinski povećano proĉitavanje aktivnosti za bolesti koje izazivaju besmislene mutacije, ĉak i u poreĊenju sa istima za gentamicin. Prema tome, ovi pronalazaĉi su identifikovali i drugu znaĉajnu poziciju u farmakoforu, koja ukazuje na kandidate za lek, sa kojima se moţe boriti protiv bolesti koje potiĉu od genetskih mutacija.

[0056] Bez oslanjanja na neku posebnu teoriju, predlaţe se da se uvoĊenjem modifikacija u ribozaminski prsten (Prsten III), ĉuvaju već dobro utvrĊeni uticaji prstenova I i II, u prethodnom konceptu struktura (videti, na primer, egzemplarna referentna jedinjenja NB30 i NB54, opisana gore), dok se uvoĊenjem novog strukturnog motiva signifikantno povećava aktivnost supresije i sniţava toksiĉnost.

[0057] Iako se ovaj pronalazak umanjuje u praksi, ovi pronalazaĉi su uspešno pripremili aminoglikozide (npr., egzemplarna referentna jedinjenja NB30, NB54 NB74 i NB84), u kojima je uvedena (S)-5"-metil grupa u boĉni lanac ribozaminskog prstena (prsten III), ĉime su generisali novu familiju aminoglikozida. Ovi pronalazaĉi su pokazali da ova nova, dizajnirana jedinjenja, pokazuju signifikantno smanjenu ćelijsku toksiĉnost, a paralelno pokazuju suštinski veću aktivnost proĉitavanja besmislenih mutacija koje izazivaju bolest, u preĊenju, na primer, sa gentamicinom. Opaţeno je takoĊe da ugraĊivanje (S)-5"-metil grupe ne utiĉe signifikantno na ćelijsku toksiĉnost, dok uveliko poboljšava aktivnost proĉitavanja zaustavnog kodona, i specifiĉnost prema eukariotskom ribozomu u dobijenim strukturama, u poreĊenju sa istima u ranije objavljenim strukturama.

[0058] Pošto ugraĊivanje metil grupe na C5"-poziciji ribozaminskog prstena generiše jedan novi stereogeni centar, ovi pronalazaĉi su dobili oba C5"-dijastereomera, definisali njihove apsolutne konfiguracije i uporedili njihova biološka svojstva.

[0059] Prema tome, otkrivena je nova farmakoforna taĉka, (S)-5"-metil grupa, kao vredan strukturni element u ribozaminskom prstenu (prsten III), koja signifikantno utiĉe na aktivnost supresije, a nema signifikantan uticaj na ćelijsku toksiĉnost. Ova nova farmakoforna taĉka je peta taĉka, koja je sada dodata na prethodne ĉetri taĉke, koje su otkrivene i opisane u, na primer, WO 2007/113841. Shema 1 predstavlja paromaminsko jezgro sa svih pet farmakofornih taĉaka, koje su do sada otkrivene, a oznaĉene su brojevima i-iv, u skladu sa redosledom njihovog otrkivanja. Specifiĉno, farmakoforna taĉka, oznaĉena kao "i", odnosi se na prisustvo hidroksilne grupe na poziciji 6’; taĉka oznaĉena sa "ii", odnosi se na prisustvo AHB grupe na poziciji N1; taĉka "iii", odnosi se na prisustvo tećeg saharidnog ostatka (prsten III), spojenog sa drugim saharidnim prstenom; "iv" predstavlja prisustvo neke modifikacije na poziciji 6’ (prikazani primer u Shemi 1 je neki niţi alkil); i farmakoforna taĉka opisana ovde, oznaĉena je sa "v", a odnosi se na prisustvo modifikacije na pozicji 5", u skladu sa ovim realizacijama (kao primer u Shemi 1, uzet je neki niţi alkil).

Shema 1

[0060] Dakle, u skladu sa jednim aspektom realizacije ovog pronalaska, daje se jedinjenje koje ima opštu Formulu I:

ili neka njegova farmaceutski prihvatljiva so,

gde su:

R1je poţeljno neki alkil, koji ima 1-4 atoma ugljenika;

R2je vodonik ili (S)-4-amino-2-hidroksibutiril (AHB);

R3je poţeljno vodonik ili neki alkil, koji ima 1-4 atoma ugljenika; a

[0061] stereo-konfiguracija svake od pozicije 6’ i pozicije 5", nezavisno, predstavlja neka R konfiguracija ili neka S konfiguracija.

[0062] Treba naglasiti da iako je pozicija prstena III na poziciji 05, na prstenu II je pokazano da ima optimalne rezultate, dok se razmatraju pozicije na prstenu III, kao što su pozicija 06 na prstenu II i pozicije 3’ i 4’ na prstenu I.

[0063] Termini "hidroksilni" ili "hidroksi", kako se ovde koriste, odnose se na -OH grupu.

[0064] Kako se ovde koristi, termin "amin" opisuje neku -NR’R" grupu, u kojoj svaki od R’ i R" nezavisno predstavlja vodonik, alkil, cikloalkil, heteroalicikliĉno, aril ili heteroaril, kako su ovi termini ovde definisani.

[0065] Kako se ovde koristi, termin "alkil" opisuje neki alifatiĉni ugljovodonik, ukljuĉujući grupe ravnog lanca i raĉvastog lanca. Ovaj alkil moţe imati 1 do 20 atoma ugljenika, ili 1-10 atoma ugljenika, a moţe biti raĉvast ili ne mora biti raĉvast. U skladu sa realizacijama ovog pronalaska, alkil predstavlja neki niţi alkil, koji ima 1-4 atoma ugljenika (naime, metil, etil, propil i butil).

[0066] Termin "cikloalkil" se odnosi na neki potpuno ugljeniĉni, monocikliĉni ili fuzionisani prsten (tj., prsteni koji dele susedni par atoma ugljenika), raĉvastu ili koja nije raĉvasta, grupu, koja sadrţi 3 ili više atoma ugljenika, pri ĉemu jedan ili više ovih prstenova nema potpuno konjugovan sistem pi-elektrona, a moţe biti još supstituisan, ili nesupstituisan. Egzemplarne cikloalkil grupe su, na primer, ciklopropil, ciklobutil, ciklopentil, cikloheksil ili ciklododecil.

[0067] Kada god se ovde navodi brojĉani opseg; npr., "1-10", tu se podrazumeva da grupa, u ovom sluĉaju alkil grupa, moţe sadrţati 1 atom ugljenika, 2 atoma ugljenika, 3 atoma ugljenika, itd., sve do zakljuĉno 10 atoma ugljenika. U nekim realizacijama, alkil je niţi alkil, koji ukljuĉuje 1-6 ili 1-4 atoma ugljenika. Alkil moţe biti supstituisan ili nesupstituisan. Kada je supstituisan, supstituent moţe da bude, na primer, neki alkil (koji formira raĉvasti alkil), neki alkenil, neki alkinil, neki cikloalkil, neki aril, neki heteroaril, neki halo, neki hidroksi, neki alkoksi i neki hidroksialkil, kao što su ovi termini definisani u nastavku. Termin "alkil", kako se ovde koristi, obuhvata takoĊe zasićene ili nezasićene ugljovodonike, pa prema tome ovaj termin obuhvata još alkenil i alkinil.

[0068] Termin "alkenil" opisuje neki nezasićeni alkil, kao što je ovde definisan, koji ima najmanje dva atoma ugljenika i najmanje jednu dvogubu vezu ugljenik-ugljenik, npr., alil, vinil, 3-butenil, 2-butenil, 2-heksenil i i-propenil. Ovaj alkenil moţe biti supstituisan ili nesupstituisan, sa jednim ili više supstituenata, kao što je gore opisano.

[0069] Termin "alkinil", kako je ovde definisan, je neki nezasićeni alkil, koji ima najmanje dva atoma ugljenika i najmanje jednu trogubu vezu ugljenik-ugljenik. Ovaj alkinil moţe biti supstituisan ili nesupstituisan, sa jednim ili više supstituenata, kao što je gore opisano.

[0070] Termin "aril" opisuje neku potpuno ugljeniĉnu monocikliĉnu grupu ili fuzionisani policikliĉni prsten (tj., prstenovi koji dele susedni par atoma atoma ugljenika), koji imau potpuno konjugovan sistem pi-elektrona. Ova aril grupa moţe biti supstituisana ili nesupstituisana sa jednim ili više supstituenata, kao što je gore opisano.

[0071] Termin "heteroaril" opisuje neku monocikliĉnu grupu ili fuzionisani prsten (tj., prstenove koji dele susedni par atoma), koja ima u jednom ili više prstenova jedan ili više atoma, kao što su, na primer, azot, kiseonik i sumpor, a pored toga, ima jedan potpuno konjugovan sistem pi-elektrona. Primeri, bez ograniĉavanja, heteroaril grupa su pirol, furan, tiofen, imidazol, oksazol, tiazol, pirazol, piridin, pirimidin, hinolin, izohinolin i purin. Heteroaril grupa moţe biti supstituisana ili nesupstituisana sa jednim ili više supstituenata, kao što je opisano gore. Reprezentativni primeri su tiadiazol, piridin, pirol, oksazol, indol, purin i sliĉno.

[0072] Termin "heteroalicikliĉan", kako se ovde koristi, opisuje neku monocikliĉnu ili fuzionisanu prstenastu grupu, koja ima u jednom ili više prstenova jedan ili više atoma kao što su azot, kiseonik i sumpor. Ovi prstenovi mogu takoĊe imati jednu ili više dvogubih veza. MeĊutim, ovi prstenovi nemaju potpuno konjugovan sistem pielektrona. Ova heteroalicikliĉna grupa moţe biti supstituisana ili nesupstituisana. Supstituisana heteroalicikliĉna grupa moţe imati jedan ilii više supstituenata, pri ĉemu svaki supstituent moţe nezavisno biti, na primer, alkil cikloalkil, alkenil, alkinil, aril, heteroaril i heteroalicikliĉna grupa. Reprezentativni primeri su morfolin, piperidin, piperazin, tetrahidrofuran, tetrahidropiran i sliĉno.

[0073] Termin "halid", kako se ovde koristi, odnosi se na anjon nekog halo atoma, tj. F-, Cl-, Br<->and I-.

[0074] Termin "halo" odnosdi se na atome F, Cl, Br i I, kao supstituente.

[0075] Termin "alkoksi" se odnosi na neki R’-O<->anjon, gde je R’ definisan gore.

[0076] Termin "hidroksialkil," kako se ovde koristi, se odnosi na neku alkil grupu, supstituisanu sa jednom hidroksi grupom, npr., hidroksimetil, p-hidroksietil i 4-hidroksipentil.

[0077] Termin "alkoksialkil," kako se ovde koristi, se odnosi na neku alkil grupu, supstituisanu sa jednom alkoksi grupom, npr., metoksimetil, 2-metoksietil, 4-etoksibutil, n-propoksietil i t-butiletil.

[0078] Ostatak (S)-4-amino-2-hidroksibutiril, ovde se takoĊe oznaĉava kao AHB. U skladu sa nekim realizacijama ovog pronalaska, allternativa ostatku AHB moţe biti αhidroksi-β-aminopropionil (AHP) ostatak. Ovi, tako-zvani boĉni lanci ili opcioni ostaci, smatra se da blokiraju pristup enzima, modifikovanih sa aminoglikozidom, do ciljanog mesta. Pored toga, AHB ili AHP sadrţe 1,3- ili 1,2-hidroksilnamin ostatak, koji se vezuje za fosfodiesteraze i za Hoogsteen-ov par baza gvanozina na A-mestu 16S rRNK. Napominje se ovde da se, u skladu sa nekim realizacijama ovog pronalaska, drugi ostaci, koji sadrţe neku kombinaciju jedne ili više karbonilnih, hidroksilnih i amino grupa, zajedno sa nekim niţim alkilom, pokazujući pri tome bilo koju stereohemiju, smatraju opcionim supstituentima, umesto AHB i/ili AHP. Na primer, 2-amino-3-hidroksibutanoil, 3-amino-2-hidroksipentanoil, 5-amino-3-hidroksiheksanoil, i sliĉno.

[0079] Ovde se podrazumeva da kad god se poziva na AHB, da su obuhvaćene ekvivalentne grupe, kao što su ovde opisane (npr., AHP).

[0080] Kako se ovde koristi, pod nazivom "ostatak" opisuje se neki deo, poţeljno glavni deo nekog hemijskog eniteta, kao što je molekul ili neka grupa, koji podleţe nekoj hemijskoj reakciji, a kovalentno je povezan sa drugim molekulskim entitetom.

[0081] U skladu sa nekim realizacijama ovog pronalaska, R1je alkil.

[0082] U skladu sa nekim realizacijama, R1je neki niţi alkil, kako je ovde definisan, ukljuĉujući, ali bez ograniĉavanja, metil, etil, propil, butil i izopropil. U skladu sa drugim realizacijama ovog pronalaska, R1je metil.

[0083] U nekim realizacijama ovog pronalaska, R1je alkil, kao što je ovde opisano, a svaki od R2i R3je vodonik. U pogledu farmakofornih taĉaka, prikazanih u Shemi 1 (vide supra), ova jedinjenja poseduju petu (v) taĉku, a ne poseduju drugu (ii) i ĉetvrtu (iv) taĉku. Ova jedinjenja pokazuju superioran farmakološki profil, u poreĊenju sa ranije poznatim jedinjenjima i lekovima, koja se uzimaju u obzir prilikom tretiranja genetskih poremećaja, naime, ova jedinjenja su manje toksiĉna, a efikasnija u proĉitavanju preuranjenih mutacija u zaustavnim kodonima, kao što je pokazano u odeljku Primeri u nastavku.

[0084] Egzemplarna aminoglikozidna jedinjenja, koja imaju vodonik u poloţajima R2i R3,

su ona koja se razlikuju jedno od drugog po stereo konfiguraciji hiralnog centra na pooziciji 5", u prstenu III.

[0085] U nekim realizacijama ovog pronalaska, R1je alkil, kao što je ovde opisano, R2je AHB, a R3je atom vodonika. U pogledu farmakofornih taĉaka, prikazanih u Shemi 1 (vide supra), za razliku od onih koji poseduju petu (v) taĉku, ova jedinjenja poseduju drugu (ii) taĉku, a ne poseduju ĉetvrtu (iv) taĉku. Ova jedinjenja pokazuju superioran farmakološki profil, u poreĊenju sa ranije poznatim jedinjenjima i lekovima, koji su razmatrani u tretmanu genetskih poremećaja, naime ova jedinjenja su manje toksiĉna, a efikasnija u proĉitavanju prevremenih mutacija zaustavnog kododna, kao što se pokazuje u odeljku Primeri, koji sledi u nastavku.

[0086] Egzemplarna aminoglikozidna jedinjenja koja imaju AHB ostatak u poloţaju R2, a vodonik u R3, su:

koja se razlikuju jedno od drugog po stereo-konfiguraciji hiralnog centra, na poziciji 5" u prstenu III.

[0087] Opciono, R1is cikloalkil, kao što je ovde opisano, R2je AHB, a R3je atom vodonika.

[0088] Opciono, R1je aril, kao što je ovde opisano, R2je AHB, a R3je atom vodonika.

[0089] U nekim realizacijama ovog pronalaska, R1je alkil, kao što je ovde opisano, R2je vodonik, a R3je alkil, kao što je ovde opisano. U pogledu farmakofornih taĉaka, prikazanih u Shemi 1 (vide supra), koje se razlikuju od pete (v) taĉke, ova jedinjenja ne poseduju drugu (ii) taĉku, a poseduju ĉetvrtu (iv) taĉku. Ova jedinjenja pokazuju superioran farmakološki profil, u poreĊenju sa ranije poznatim jedinjenjima i lekovima, koji se razmatraju za upotrebu u tretiranju genetskih poremećaja, naime ova jedinjenja au manje toksiĉna, a efikasnija u proĉitavanju preuranjenih mutacija zaustavnog kodona, kao što se pokazuje u odeljku Primeri, koji sledi u nastavku.

[0090] U bilo kojoj od goe pomenutih realizacija, gde je R3alkil, R3predstavlja neki niţi alkil, kako je ovde definisan. U skladu sa tim realizacijama, R3je metil.

[0091] Egzemplarna aminoglikozidna jedinjenja, u kojima je vodonik u poloţaju R2, a alkil u poloţaju R3, su:

koja se razlikuju jedno od drugog po stereo-konfiguraciji na hiralnom centru na poziciji 5” prstena III.

[0092] U nekim realizacijama ovog pronalaska, R2je AHB, a R3je alkil. U pogledu farmakofornih taĉaka, prikazanih u Shemi 1 (vide supra), ova jedinjenja poseduju svih pet taĉaka; Ova jedinjenja pokazuju najbolji farmakološki profil, u preĊenju sa ranije poznatim jedinjenjima i lekovima niţe citotoksiĉnosti, a veće efikasnosti proĉitavanja, kao što se pokazuje u odeljku Primeri koji sledi u nastavku.

[0093] Egzemplarna aminoglikozidna jedinjenja u kojima R2predstalja AHB, a R3 je alkil, su:

[0094] U traţenju puta za predviĊanje i kvantitativno vrednovanje kapaciteta nekog sintetskog aminoglikozida koji bi predstavljao kandidata za lek za tretiranje genetskih bolesti izazvanih preuranjenim mutacijama zaustavnog kodona (koji bi pokazivao aktivnost proĉitavanja), a istovremeno bi pokazivao nisku ili nikakvu citotoksiĉnost, naĊeno je da visoka selektivnost tog jedinjenja prema eukariotskim citoplazmiĉnim sistemima translacije (tj., eukariotskim citoplazmiĉnim ribozomima), u poreĊenju sa prokariotskim translacionim sistemima, a koji su sliĉni ili u izvesnoj meri potsećaju na mitohondrijske translacione sisteme, moţe biti upotrebljena kao neka predvidiva mera. Brojĉana vrednost, koja se jednostavno moţe upotrebiti za kvantitativno odreĊivanje ove selektivnosti je odnos IC50<Euk>/IC50<Pro>, koji dovodi u vezu inhibiciju translacije u eukariotima sa inhibicijom translacije u prokariotima (videti Tabelu 3, u nastavku). Kao što je pokazano u odeljku Primeri, u nastavku, uoĉljva selektivnost nekog datog aminoglikozidnog jedinjenja, kao što su jedinjenja u skladu sa nekim realizacijama ovog pronalaska, prema inhibiranju translacije u eukariotu, prema inhibiranju translacije u prokariotu, moţe se upotrebiti za predviĊanje njihove eikasnosti i bezbednosti kao kandidata za lek za tretiranje genetskih poremećaja povezanih sa prevremenim mutacijama zaustavnog kodona.

[0095] Ipak, odve je opaţeno da odnos IC50<Euk>/IC50<Pro>, koji predviĊa selektivnost, nije dovoljan kriterijum za izbor kandidata iz ove familije aminoglikozida; zato što se mora uzeti u obzir i mehanizam inhibicije translacije. Na primer, naĊeno je da egzemplarni referentni aminoglikozid NB33, koji je dimer matiĉnog jedinjenja paromamina, pokazuje vrednost ovog odnosa od oko 2, koja se smatra niskom, a time predvidivim kandidatom za dobro proĉitavanje leka. MeĊutim, egzemplarnno referentno jedinjenje NB33 u suštini ne pokazuje aktivnost proĉitavanja. Predpostavlja se da egzemplarno referentno jedinjenje NB33 inhibira mehanizam translacije na neki razliĉiti naĉin inhibicije, kao što je pokazano u kristalnom kompleksu izmeĊu citoplazmiĉnog A mesta RNK i egzemplarnog referentnog jedinjenja NB33 [ChemBioChem, 2007, 8(14), p.1617].

[0096] Bez vezivanja za neku posebnu teoriju, jedan mogući zakljuĉak iz gornje diskusije je da ako neki aminoglikozid, kao kandidat za lek, treba da ispoljava ţeljenu osobinu proĉitavanja prevremene mutacije zaustavnog kododna, on treba da: 1) inhibira i prokariotske i eukariotske ribozome po istom mehanizmu vezivanja na aminoacil-tRNK mesto vezivanja i stabilizuje konformaciju dekodiranja, ili inhibira proces translacije proteina interferiranjem sa autentiĉnošću procesa korigovanja; i 2) odnos IC50<Euk>/IC50<Pro>treba da favorizuje eukariote, ali takoĊe treba da bude praćen znaĉajnim smanjenjem specifiĉnosti tog jedinjenja prema prokariotskom ribozomu; drugim reĉima, sa povišenim vrednostima za IC50<Pro>. Reprezentativni primer ovog zahteva je G418; on ima odnos IC50<Euk>/IC50<Pro>koji je 225, što je znaĉajno niţe nego za gentamicin, ali je još uvek visoko toksiĉan, na šta ukazuje relativno vrlo niska vrednost IC50<Pro>.

[0097] Prema tome, u skladu sa nekim realizacijama ovog pronalaska, jedinjenja koja se ovde daju karakteriše odnos IC50za inhibiciju translacije u eukariotima prema IC50za inhibiciju translacije u prokariotima, koji je niţi od 15, niţi od 10, niţi od 5 ili niţi od 1, ukljuĉujući bilo koju vrednost izmeĊu 15 i 1.

[0098] Kaošto se pokazujeu nastavku, kada se dobijaju i testiraju egzemplarna jedinjenja u skladu sa nekim realizacijama ovog pronalaska, opaţeno je da je povećanje inhibicije sinteze prokariotskog citoplazmiĉnog proteina takoĊe povezano a ovećanjem aktivnosti proĉitavanja. Podaci, koji su prikazani u Tabeli 3, pokazuju da sistematsko dodavanje farmakofornih taĉaka, prikazanih u Shemi 1, postepeo povećava specifiĉnost jedinjenja pema citoplazmiĉnom ribozomu i smanjuje njihovu specifiĉnost prema prokariotskom ribozomu.

[0099] Razumno je oĉekivati da aminoglikozidi, koji treba da budu selektivni prema prokariotima, pošto su se aminoglikozidi razvili prirodnom selekcijom iz roda Streptomyces, i drugih vrsta, kao što je Saccharopolyspora erythraea, da treba da budu aktivni i prema drugim prokariotima. Ipak, jedinjenja, u skladu sa nekim realizacijama ovog pronalaska, pokazuju obrnutu selektivnost prema eukariotima u odnosu na prokariotske sisteme translacije (ribozom).

[0100] Prema tome, u skladu sa nekim realizacijama ovog pronalaska, jedinjenja koja se ovde daju karakteriše odnos IC50inhibicije translacije u eukariotima prema IC50inhibicije translacije u prokariotima, koji je niţi od 15, niţi od 1.

[0101] Kao što je gore razmatrano, obećavajuće aminoglikozidno jedinjenje, u skladu sa nekim realizacijama ovog pronalaska, je ono koje nema primetnu, ili je uopšte nema, antimikrobnu aktivnost. Takva neaktivnost takoĊe je predvidiva za jedinjenja sa niskom ili nikakvom citotoksiĉnošću prema sisarima. Rezultati za egzemplarna jedinjenja, koja su dobijena i testirana na antimikrobnu aktivnost ili neaktivnost, prikazana su u Tabelama 1 i 2, u nastavku.

[0102] Prema tome, u skladu sa nekim realizacijama ovog pronalaska, jedinjenja koja se ovde daju karakteriše vrednost MIC za Gram-negativne bakterije koja je veća od 200 µM, veća od 300 µM, veća od 500 µM, veća od 700 µM, ili veća od 1000 µM, kao i vrednost MIC za Gram-pozitivne bakterije koja je veća od 20 µM, veća od 40 µM, veća od 80 µM, ili veća od 100 µM.

[0103] Ove realizacije obuhvataju još i bilo koji od enantiomera, dijastereomera, prolekova, solvata, hidrata i/ili farmaceutski prihvatljivih soli jedinjenja koja su ovde opisana.

[0104] Kako se ovde koristi, termin "enantiomer" odnosi se na neki stereoizomer nekog jedinjenja, koji se preklapa sa njegovim pandanom jedino kao što se odnose predmet i lik u ogledalu. Za enantiomere se kaţe da su "hiralni", pošto se odnose jedan prema drugom kao desna i leva ruka. Enantiomeri imaju identiĉna hemijska i fiziĉka svojstva, izuzev kada se prezentiraju u nekoj sredini koja je sama hiralna, kao što su ţivi sistemi. U kontekstu ovog pronalaska, neko jedinjenje moţe imati jedan ili više hiralnih centara, a svaki od njih poseduje R- ili S-konfiguraciju i bilo koju njihovu kombinaciju, a jedinjenja u skladu sa nekim realizacijama ovog pronalaska, mogu imati bilo koji od hiralnih centara koji pokazuju neku R- ili S-konfiguraciju.

[0105] Termin "dijastereomeri", kako se ovde koristi, odnosi se na stereoizomere koji jedan u odnosu na drugi nisu enantiomeri. Dijastereomerizam se dešava kada dva ili više stereoizomera nekog jedinjenja imaju razliĉite konfiguracije na jednom ili više, ali ne na svim ekvivalentnim (povezanim) stereocentrima, a jedan prema drugom nisu kao predmet i lik u ogledalu. Kada se dva dijastereoizomera meĊusobno razlikuju samo u jednom stereocentru, onda su oni epimeri. Svaki stereo-centar (hiralni centar) daje dve razliĉite konfiguracije, pa tako dva razliĉita stereoizomera. U ovom kontekstu sadašnjeg pronalaska, realizacije iz ovog pronalaska obuhvataju jedinjenja sa više hiralnih centara, koja se javljaju u bilo kojoj kombinaciji stereokonfiguracije, naime kao bilo koji dijastereomer.

[0106] Termin "prolek" se odnosi na neki agens, koji se konvertuje in vivo u aktivno jedinjenje (aktivni matiĉni lek). Prolekovi se tipiĉno koriste za olakšavanje ordiniranja matiĉnog leka. Oni mogu, na primer, biti biodostupni oralnim odiniranjem, a matiĉni lek to nije. Prolek moţe takoĊe imati poboljšanu rastvorljivost u farmaceutskim kompozicijama, u poreĊenju sa matiĉnim lekom. Prolekovi se obiĉno ĉesto koriste za ostvarivanje uzdrţanog oslobaĊanja aktivnog jedinjenja in vivo. Primer, ali bez ograniĉavanja, proleka bilo bi neko jedinjenje iz ovog pronalaska, koje ima jedan ili više ostataka karboksilne kiseline, koje se ordinira kao neki estar ("prolek"). Ovakav jedan prolek se hidrolizuje in vivo, dajući tako slobodno jedinjenje (matiĉni lek). Odabrani estar moţe da utiĉe i na karakteristike rastvorljivosti i na brzinu hidrolize proleka.

[0107] Termin "solvat" se odnosi na neki kompleks varijabilne stehiometrije (npr., di-, tri-, tetra-, penta-, heksa-, i tako dalje), koji formira rastvorena supstanca (jedinjenje iz ovog pronalaska) i neki rastvaraĉ, a pri tome ovaj rastvaraĉ ne interferira sa biološkom aktivnosti rastvorene supstence. Pogodni rastvaraĉi su, na primer, etanol, sirćetn kiselina i sliĉno.

[0108] Termin "hidrat" odnosi se na neki solvat, kako je definisan gore, gde je rastvaraĉ voda.

[0109] Fraza "farmaceutski prihvatljiva so" odnosi se na naelektrisanu vrstu matiĉnog jedinjenja i njen kontra jon, koja se tipiĉno koristi za modifikovanje karakteristika rastvorljivosti matiĉnog jedinjenja i/ili za smanjivanje bilo kakvog znaĉajnog iritiranja organizma sa matiĉnim jedinjenjem, ali bez poništavanja biološke akivnosti i svojstava ordiniranog jedinjenja. Primer, ali bez ograniĉavanja, neke farmaceutski prihvatljive soli bio bi neki hidroksilni anjon (O-) i neki katjon, kao što su, ali bez ograniĉavanja na iste, amonijum, natrijum, kalijum i sliĉno. Sledeći primer, bez ograniĉavanja, neke farmaceutski prihvatljive soli bio bi neki katjon amonijuma i neka njegova kisela adiciona so. Primeri kiselih adicionih solii su, ali ne i ograniĉeni njima, adiciona so hlorovodoniĉne kiseline, adiciona so sumporne kiseline (sulfatna so), adiciona so sirćetne kiseline, adiciona so askorbinske kiseline, adiciona so benzenesulfonske kiseline, adiciona so kamforsulfonske kiseline, adiciona so limunske kiseline, adiciona so maleinske kiseline, adiciona so metanesulfonske kiseline, adiciona so naftalinesulfonske kiseline, adiciona so oksalne kiseline, adiciona so fosforne kiseline, adiciona so ćilibarne kiseline, adiciona so sumporaste kiseline, adiciona so vinske kiseline i adiciona so toluenesulfonske kiseline.

[0110] U skladu sa nekim realizacijama ovog pronalaska, kisela adiciona so je sulfatna so.

[0111] Dalje, u skladu sa ovim pronalaskom, daje se postupak za dobijanje ovde opisanih jedinjenja.

[0112] Putevi sinteze, koji se ovde opisuju, odnose se na reakciju izmeĊu nekog akceptora i nekog donora, pri ĉemu, termin "akceptor" se ovde koristi da se opiše struktura skeleta, koja se izvodi iz paromamina, koja ima najmanje jednu, a poţeljno selektivno izabranu, dostupnu (nezaštićenu) hidrokislnu grupu, na pozicijama, kao što su C5, C6 i C3’, koja je reaktivna za vreme reakcije glikozilovanja, i moţe da prihvati glikozil ostatak, a termin "donor" s ove koristi da oznaĉi glikozil. U skladu sa nekim realizacijama ovog pronalaska, pozicija akceptora je pozicija C5.

[0113] Termin "glikozil", kako se ovde koristi, odnosi se na hemijsku grupu koja se dobija uklanjanjem hidroksilne grupe sa hemiacetalne funkcije nekog monosaharida, i šire, nekog niţeg oligosaharida.

[0114] Termin "monosaharid", kako se ovde koristi, a kako je dobro poznato u stanju tehnike, odnosi se na neki jednostavan oblik nekog šećera, koji se sastoji od nekog molekula saharida, koji se ne moţe dalje razloţiti hidrolizom. Najĉešći primeri monosaharida su glukoza (dekstroza), fruktoza, galaktoza i riboza. Monosaharidi se mogu klasifikovati, prema broju atoma ugljenika u ugljenom hidratu, tj., trioza, ima 3 atoma ugljenika, kao što su gliceraldehid i dihidroksiaceton; tetroza, ima 4 atoma ugljenika, kao što su eritroza, treoza i eritruloza; pentoza, ima 5 atoma ugljenika, kao što su arabinoza, liksoza, riboza, ksiloza, ribuloza i ksiluloza; heksoza, ima 6 atoma ugljenika, kao što su alloza, altroza, galaktoza, glukoza, guloza, idoza, manoza, taloza, fruktoza, psikoza, sorboza i tagatoza; heptoza, ima 7 atoma ugljenika, kao što su manoheptuloza, sedoheptuloza; oktoza, ima 8 atoma ugljenika, kao što je 2-keto-3-deoksi-mano-oktonat; nonoza, ima 9 atoma ugljenika, kao što je sialoza; i dekoza, ima 10 atoma ugljenika. Monosaharidi su graditeljski blokovi oligosaharida, kao što je saharoza (obiĉni šećer) i drugi polisaharidi (kao što su celuloza i skrob).

[0115] Termin "oligosaharid", kako se ovde koristi, odnosi se na neko jedinjenje koje je saĉinjeno od dve ili više monosaharidnih jedinica, kako su one ovde definisane. U skladu sa nekim realizacijama ovog pronalaska, oligosaharid sadţi 2-6 monosaharida. Alternativno, oligosaharid sadrţi 2-4 monosaharida, ili dodatno alternativno, oligosaharidni disaharidni ostatak, koji ima dve monosaharidne jedinice.

[0116] DonorI i akceptorI dizajnirani su tako da formiraju ţeljena jedinjenja u skladu sa nekim realizacijama ovog pronalaska. U nastavku se opisuju neke realizacije ovog aspekta pronalaska, predstavljanjem egzemplarnih postupaka za dobijanje egzemplarnih podvrsta jedinjenja koja su ovde opisana. Detaljni postupci za dobijanje egzemplarnih jedinjenja u skladu sa nekim realizacijama ovog pronalaska, dati su odeljku Primeri, koji sledi niţe.

[0117] Sintezu jedinjenja u skladu sa nekim realizacijama ovog pronalaska, obiĉno ĉini (i) dobijanje nekog akceptorskog jedinjenja pomoću selektivne zaštite jednog ili više hidroksila i amina, na odabranim pozicijama prisutnim u strukturi paromamina, ostavljajući jednu ili dve pozicije nezaštićene, pa stoga slobodne za prihvatanje nekog donorskog jedinjenja (glikozil), kako je ovde definisano; (ii) dobijanje nekog donorskog jedinjenja, selektivnom zaštitom jednog ili više hidroksila ili amina, na odabranim pozicijama glikozila, ostavljajući jednu poziciju nezaštićenu, pa stoga slobodnu za prihvatanje akceptorskog jedinjenja, kako je ovde definisan; (iii) podddvrgavanje ovog donora i ovog akceptora nekoj reakciji kuplovanja; i (iii) uklanjanje svih zaštitnih grupa, tako da se dobije ţeljeno jedinjenje.

[0118] Fraza "zaštitna grupa", kako se ovde koristi, odnosi se na neki supstituent, koji se obiĉno koristi za blokiranje ili zaštitu posmatrane funkcionalnosti, dok reaguju ostale funkcionalne grupe na tom jedinjenju. Na primer, "aminozaštitnu grupu" predstvlja neki supstituent spojen sa amino grupom, koji treba da blokira ili zaštiti funkcionalnost amino grupe u tom jedinjenju. Pogodne amino-zaštitne grupe su azid (azido), N-ftalimido, N-acetil, N-trifluoroacetil, N-t-butoksikarbonil (BOC), N-benziloksikarbonil (CBz) i N-9-fluorenilmetilenoksikarbonil (Fmoc). Sliĉno, neka "hidroksilna zaštitna grupa" se odnosi na neki supstituent hidroksilne grupe, koji blokira ili štiti hidroksilnu funkcionalnost. Pogodne zaštitne grupe su izopropiliden ketal i cikloheksanon dimetil ketal (koji formiraju 1,3-dioksan sa dve susedne hidroksilne grupe), 4-metoksi-1-metilbenzen (koji formira 1,3-dioksan sa dve susedne hidroksilne grupe), O-acetil, O-hloroacetil, O-benzoil i O-silil. Za opšti opis zaštitnih grupa i njihovu upotrebu, videti T. W. Greene, Protective Grups in Organic Synthesis, John Wiley & Sons, New York, 1991.

[0119] U skladu sa nekim realizacijama, amino-zaštitne grupe su neka azido (N3-) i/ili neka N-ftalimido grupa, a hidroksilne-zaštitne grupe su O-acetil (AcO-), O-benzoil (BzO-) i/ili O-hloroacetil. Napominje se, da se prema potrebi, "zaštitna grupa" odnosi na neki ostatak koji moţe da zaštiti jednu reaktivnu funkciju nekog jedinjenja, ili više od jedne funkcije, istovremeno, kao što je to u sluĉaju dve susedne funkcionalnosti, npr., dve hidroksilne grupe, koje se zajedno, iz jedanput, mogu zaštiti sa izopropiliden ketalom.

[0120] Dakle, daje se jedan postupak za dobijanje ovih jedinjenja, koja imaju opštu Formulu I, koji je prikazan ovde. Ovaj postupak se ostvaruje dobijanjem pogodno zaštićenog akceptorskog jedinjenja i pogodno zaštićenog donorskog jedinjenja, kuplovanja ova dva jedinjenja jednog sa drugim, i na kraju uklanjanjem svih zaštitnih grupa sa nastalog jedinjenja.

[0121] Donorsko jedinjenje je neki zaštićeni monosaharid, koji se moţe prikazati sa opštom Formulom II, koji ima odlazeću grupu na njegovoj poziciji 1", oznaĉenu sa L, i neki alkil, cikloalkil ili aril na poziciji 5", oznaĉen kao R1:

gde su:

R1je neki alkil, koji ima 1-4 atoma ugljenika;

R4je vodonik, ili neki donor amino-zaštitne grupe;

R5je neki donor amino-zaštitne grupe, ukoliko R4predstavlja vodonik, ili vodonik, ukoliko R4predstavlja neki donor amino-zaštitne grupe; i

svaki HPd je neki donor hidroksilne-zaštitne grupe.

[0122] Treba napomenuti da je apsolutna stereo-konfiguracija hiralnog centra na poziciji 5" odreĊena identitetom R4i R5, davanjem obe opcije, R- i S-konfiguracije, kao dva pojedinaĉna i razdvojiva donora (koji su dijastereomeri), ili njihove racemske smeše. Detaljan postupak za dobijanje svakog od ovih R- i S-donorskih jedinjenja, kao i metoda za utvrĊivanje njihove apsolutne stereo-konfiguracije, daje se u odeljku Primeri, u nastavku.

[0123] Kako se ovde koristi, fraza "odlazeća grupa", oznaĉava neki labilan atom, grupu ili hemijski ostatak, koji tokom hemijske reakcije lako podleţe odvajanju od organskog molekula, pri ĉemu je ovo naknadno odvajanje olakšano sa relativnom stabilnošću odlazećeg atoma, grupe ili ostatka. Tipiĉno, bilo koja grupa koja predstavlja konjugovanu bazu neke jake kiseline, moţe delovati kao odlazeća grupa. Reprezentativni primeri pogodnih odlazećih grupa, u skladu sa ovim realizacijama, su, ali bez ograniĉavanja, trihloroacetimidat, acetat, tozilat, triflat, sulfonat, azid, halid, hidroksi, tiohidroksi, alkoksi, cijanat, tiocijanat, nitro i cijano.

[0124] U skladu sa nekim realizacijama ovog pronalaska, odlazeća grupa je trihloroacetimidat, koja daje najbolje zadovoljavajuće rezultate u reakciji kuplovanja sa akceptorom, mada se mogu upotrebiti i druge odlazeće grupe.

[0125] U skladu sa nekim realizacijama ovog pronalaska, svaki od donora hidroksilnih-zaštitnih grupa je O-benzoil, a donor amino-zaštitne grupe ili za R4ili za R5je azido, mada se mogu upotrebiti i druge zaštitne grupe.

[0126] Struktura donorskog jedinjenja odreĊuje apsolutnu strukturu prstena III dobijenog jedinjenja, u skladu sa nekim realizacijama ovog pronalaska, naime stereo-konfiguraciju pozicije 5" i vrstu alkila na toj poziciji. Egzemplarna donorska jedinjenja, pogodna za dobijanje jedinjenja u skladu sa nekim realizacijama ovog pronalaska, su Jedinjenje (S)-17 i Jedinjenje (R)-18, ĉije dobijanje je ilustrovano u Shemi 2 u nastavku.

[0127] Akceptor, u skladu sa nekim realizacijama, ima opštu Formulu III:

gde su:

isprekdana linija oznaĉava R- konfiguraciju ili S-konfiguraciju;

R3se bira iz grupe koju ĉine vodonik i neki alkil, koji ima 1-4 atoma ugljenika; R6je neki akceptor amino-zaštitne grupe, ili (S)-4-azido-2-O-acetil-1-butiril (zaštićeni oblik AHB);

HPa je neki akceptor hidroksilne-zaštitne grupe; i

APa je neki akceptor amino-zaštitne grupe.

[0128] U skladu sa nekim realizacijama ovog pronalaska, akceptorska hidroksilnazaštitna grupa je O-acetil, a donorska amino-zaštitna grupa je azido, mada i druge zaštitne grupe mogu da se upotrebe.

[0129] Napominje se da se egzemplarna realizacija, koja je gore data, odnosi na zaštićenu grupu AHB, meĊutim, to ne znaĉi ograniĉenje upotrebe AHB ostatka, pošto se i drugi korisni ostaci, kao što je gore prikazani AHP, mogu upotrebiti umesto nje. U tim sluĉajevima ovaj postupak se modifikuje, upotrebom nekog akceptorskog jedinjenja, gde su reaktivne grupe u ostatku, koji se koristi umesto AHB, odgovarjuće zaštićene.

[0130] Sruktura akceptorskog jedinjenje odreĊuje apsolutnu strukturu prstena I i prstena II, u dobijenom jedinjenju, u skladu sa nekim realizacijama ovog pronalaska, naime stereo-konfiguraciju pozicije 6’ i vrstu alkila na toj poziciji, ukoliko je prisutan, i supstituent na amino grupi, na poziciji N1. Egzemplarna akceptorska jedinjenja, pogodna za dobijanje jedinjenja u skladu sa nekim realizacijama ovog pronalaska, su Jedinjenja 19, 20, 219 i 220, ĉija dobijanja su ilustrovana u Shemi 3 i u Shemi 4, u nastavku.

[0131] Pema tome, ovaj postupak se ostvaruje:

(a) dobijanjem i ţeljenog donorskog jedinjenja i ţeljenog akceptorskog jedinjenja;

(a) kuplovanjem gore pomenutog akceptorskog jedinjenja sa gore pomenutim donorskim jedinjenjem (takoĊe se naziva reakcijom glikozilacije); i

(b) naknadnim uklanjanjem svake od zaštitnih grupa, ĉime se dobija ţeljeno jedinjenje.

[0132] Na primer, egzemplarno jedinjenje NB118 se moţe dobiti deprotekcijom Jedinjenja (S)-21, koje se dobija glikolizacijom (kuplovanjem) akceptorskog Jedinjenja 19 sa donorskim Jedinjenjem (S)-17. Na taj naĉin se dobija egzemplarno jedinjenje NB119, deprotekcijom Jedinjenja (R)-22, koje je proizvod kuplovanja akceptorskog Jedinjenja 19 sa donorskim Jedinjenjem (R)-18.

[0133] Sliĉno, egzemplarno jedinjenje NB122 se dobija deprotekcijom Jedinjenja (S)-23, kao proizvod kuplovanja izmeĊu akceptorskog Jedinjenja 20 i donorskog Jedinjenja (S)-17. Sliĉno tome, egzemplarno jedinjenje NB123 se dobija 34 deprotekcijom Jedinjenja (R)-24, koje je proizvod kuplovanja akceptorskog Jedinjenja 20 sa donorskim Jedinjenjem (R)-18.

[0134] Egzemplarno jedinjenje NB124 se dobija deprotekcijom Jedinjenja (S)-221, kuplovanjem proizvoda izmeĊu akceptorskog Jedinjenja 219 i donorskog Jedinjenja (S)-17. Sliĉno se dobija egzemplarno jedinjenje NB125, deprotekcijom Jedinjenja (R)-222, koje je proizvod kuplovanja akceptorskog Jedinjenja 219 sa donorskim Jedinjenjem (R)-18.

[0135] Egzemplarno jedinjenje NB127 se dobija deprotekcijom Jedinjenja (S)-223, kuplovanjem proizvoda izmeĊu akceptorskog Jedinjenja 220 i donorskog Jedinjenja (S)-17. Sluĉno se dobija, egzemplarno jedinjenje NB128 deprotekcijom Jedinjenja (R)-224m koje je proizvod kuplovanja akceptorskog Jedinjenja 220 sa donorskim Jedinjenjen (R)-18.

[0136] Kao što je pokazano u odeljku Primeri, koji sledi, jedinjenja koja su ovde data, dizajnirana su tako da, a zaista je to i pokazano, poseduju aktivnost supresije za isprekidane mutacije, naime, sposobnost da indukuju proĉitavanje prevremene mutacije zaustavnih kodona. Ovakva aktivnost ĉini ova jedinjenja pogodnim za upotrebu kao terapeuski aktivnih agenasa u tretmanu genetskih poremećaja, za koje je karakteristiĉna isprekidana mutacija.

[0137] Prema tome, opisuje se upotreba jedinjenja, datih opštom Formulom I, u tretiranju nekog genetskog poremećaja. Ovaj tretman se ostvaruje ordiniranjem subjektu, kome je to neophodno, terapeutski efikasne koliĉine jednog ili više jedinjenja koja su ovde data, a koja imaju opštu Formulu I.

[0138] Kako se ovde koristi, termin "tretiranje" obuhvata prekid, suštinsko inhibiranje, usporavanje ili recidiv u napredovanju nekog stanja, uz suštinsko ublaţavanje kliniĉkih ili estetskih simptoma nekog stanja, ili spreĉavanja pojave tih kliniĉkih ili estetskih simptoma nekog stanja.

[0139] Kako se ovde koristi, fraza "terapeutski efikasna koliĉina" opisuje neku koliĉnu polimera koji se ordinira, a koja će u izvesnoj meri ublaţiti jedan ili više simptoma stanja koje se tretira.

[0140] Fraza "genetski poremećaj", kako se ovde koristi, odnosi se na neki hroniĉni poremećaj, koji je prouzrokovan sa jednim ili više oštećenja gena, a koji se ĉesto nasleĊuje od roditelja, i koji se moţe dogoditi neoĉekivano, kada se dva zdrava nosaĉa oštećenog recesivnog gena reprodukuju, ili kada je oštećeni gen dominantan. Genetski poremećaji se mogu dogoditi razliĉitim putevima nasleĊivanja, koji obuhvataju dominantni autozomalni put, gde je samo jedna mutirana kopija gena potrebna da se poremećaj ispolji kod naslednika, i autozomalni recesivni put, kada moraju da se mutiraju dve kopije gena, da bi se poremećaj ispoljio kod naslednika.

[0141] U skladu sa nekim realizacijama, genetski poremećaj ukljuĉuje neki gen koji ima isprekidanu mutaciju, koja dovodi do neodgovarajuće njegove translacije. Ova neodgovarajuća translacija izaziva smanjivanje ili izostanak sinteze nekog esencijalnog proteina.

[0142] Ovakvi egzemplarni genetski poremećaji su, ali ne i ograniĉeni njima, cistiĉna fibroza (CF), Duchenne-ova mišićna distrofija (DMD), ataksija-telagiektazija, Hurlerov sindrom, hemofilija A, hemofilija B, Usher-ov sindrom i Tay-Sachs.

[0143] U skladu sa tim, daje se upotreba nekog jedinjenja, koje ima opštu Formulu I, koja je data ovde, za proizvodnju nekog medikamenta za tretiranje nekog genetskog poremećaja.

[0144] U nekom od postupaka i upotreba, koji su ovde opisani, moţe se upotrebiti farmaceutska kompozicija, kao takva ili neka koja sadrţi još neki farmaceutski prihvatljiv nosaĉ.

[0145] Prema tome, u skladu sa ovim pronalaskom, daje se još i farmaceutska kompozicija, koja kao aktivni sastojak sadrţi neko od novih jedinjenja, koja su ovde opisana, i neki farmaceutski prihvatljiv nosaĉ.

[0146] Kako se ovde koristi "farmaceutska kompozicija " se odnosi na neki preparat jedinjenja koja su ovde data, sa drugim hemijskim komponentama, kao što su farmaceutski prihvatljivi i pogodni nosaĉi i ekscipijenti. Svrha neke farmaceutske kompozicije je olakšavanje ordiniranja nekog jedinjenja u neki organizam.

[0147] U nastavku, termin "farmaceutski prihvatljiv nosaĉ" će se odnositi na neki nosaĉ ili diluent, koji ne izaziva znaĉajnu iritaciju u organizmu i ne izaziva prekid biološke aktivnosti i svojstava ordiniranog jedinjenja. Primeri nosaĉa, bez ograniĉavanja, su: propilen glikol, slani rastvor, emulzije i smeše organskih rastvaraĉa sa vodom, a iso tako to mogu biti ĉvrsti (npr., sprašeni) i gasoviti nosaĉi.

[0148] Termin "ekscipijent" ovde se odnosi na neku inertnu supstancu, koja se dodaje u farmaceutsku kompoziciju da dodatno olakša ordiniranje jedinjenja. Primeri, ali bez ograniĉavanja, ekscipijenata su kalcijum-karbonat, kalcijum-fosfat, razne vrste šećera i skroba, derivati celuloze, ţelatin, biljna ulja i polietilen glikoli.

[0149] Tehnike formulisanja i ordiniranja lekova mogu se naći u "Remington’s Farmaceutsk Sciences" Mack Publishing Co., Easton, PA, poslednje izdanje.

[0150] Farmaceutska kompozicija iz ovog pronalaska se moţe proizvoditi u skladu sa postupcima koji su dobro poznati u stanju tehnike, npr., pomoću postupaka konvencionalnog mešanja, rastvaranja, granulacije, pravljenja draţeja, sprašivanja, emulgovanja, enkapsuliranja, upakivanja ili liofilizovanja.

[0151] Farmaceutska kompozicija za upotrebu u skladu sa ovim pronalaskom, moţe se formulisati na konvencionalan naĉin, korišćenjem jednog ili više farmaceutski prihvatljivih nosaĉa, koji sadrţe ekscipijente i pomoćne agense, a koji olakšavaju procesuiranje jedinjenja koja su ovde data u preparate, koji se mogu farmaceutski upotrebiti. Prava formulacija zavisi od puta izabranog za ordiniranje.

[0152] U skladu sa nekim realizacijama, ordiniranje se obavlja oralno. Za oralno ordiniranje, jedinjenja koja su ovde data, mogu se lako formulisati kombinovanjem ovih jedinjenja sa farmaceutski prihvatljivim nosaĉima, koji su dobro poznati u stanju tehnike. Ovakvi nosaĉu omogućavaju da se jedinjenja koja su ovde data formulišu kao tablete, pilule, draţeje, kapsule, teĉnosti, gelovi, sirupi, guste suspenzije, suspenzije, i sliĉno, za oralno gutanje od strane pacijenta. Farmakološki preparati za oralnu upotrebu mogu koristiti neki ĉvrst ekscipijent, opciono usitnjavanjem dobijene smeše, pa procesuiranjem u smešu granula, posle dodavanja pogodnih pomoćnih agenasa, ukoliko se to ţeli, tako da se dobiju tablete ili jezra draţeja. Pogodni ekscipijenti su naroĉito, punioci, kao što su šećeri, ukljuĉujući laktozu, saharozu, manitol ili sorbitol; preparati celuloze, kao što su, na primer, kukuruzni skrob, pšeniĉni skrob, pirinĉani skrob, krompirov skrob, ţelatin, guma tragakant, metil celuloza, hidroksipropilmetil-celuloza, natrijum karbometilceluloza; i/ili fiziološki prihvatljivi polimeri, kao što je polivinilpirolidon (PVP). Ukoliko se ţeli, mogu se dodati agensi za dezintegraciju, kao što su umreţeni polivinil pirolidon, agar, ili alginska kiselina ili neka njena so, kao što je natrijum-alginat.

[0153] Farmaceutska kompozicija, koja se moţe upotrebljavati oralno, obuhvata push-fit kapsule napravljene od ţelatina (takozvane push-fit kapsule), isto tako meke, hermetiĉne kapsule napravljene od ţelatina nekog plastifikatora, kao što su glicerin ili sorbitol. Kapsule mogu sadrţati aktivne sastojke pomešane sa puniocima, kao što je laktoza, vezivima, kao što su skrobovi, lubrikantima, kao što su talk ili magnezijum-stearat, i opciono, stabilizatori. U mekim kapsulama, jedinjenja, koja su ovde data, mogu se rastvoriti ili suspendovati u pogodnim teĉnostima, kao što su masna ulja, teĉni parafin ili teĉni polietilen glikoli. Pored toga, mogu se dodavati i stabilizatori. Sve formulacije za oralno ordiniranje treba da su u dozama koje su pogodne za odabrani put ordiniranja.

[0154] Za injekcije, jedinjenja koja su ovde data mogu se formulisati u vodenim rastvorima, poţeljno u fiziološki kompatibilnim puferima, kao što su Hank-ov rastvor, Ringer-ov rastvor, ili fiziološki slani pufer, sa ili bez organskih rastvaraĉa, kao što su propilen glikol, polietilen glikol.

[0155] Za transmukozalno ordiniranje, u formulaciji se koriste penetranti. Ti penetranti su generalno poznati u stanju tehnike.

[0156] Jezgra draţeja se obiĉno daju sa pogodnim oblogama. U tu svrhu mogu se koristiti koncentrovani rastvori šećera, koji opciono mogu da sadrţe gumiarabiku, talk, polivinilpirolidon, karbopol gel, polietilen glikol, titanijum-dioksid, rastvore laka i pogodne organske rastvaraĉe ili smeše rastvaraĉa. Boje ili pigmenti se mogu dodavati u obloge za tablete ili draţeje za identifikaciju ili za karakterizaciju razliĉitih kombinacija doza aktivnih aminogliukozidnih jedinjenja.

[0157] Za bukalno ordiniranje, kompozicije mogu bitiu obliku tableta ili pastila, formulisanih na konvencionalan naĉin.

[0158] Za ordiniranje inhalacijom, pogodno je da se jedinjenja koja su ovde data, doziraju u obliku raspršivanja nekog aerosola (koji tipiĉno sadrţi sprašene, teĉne i/ili gasovite nosaĉe) iz nekog pakovanja pod pritiskom ili iz nebulizatora, uz upotrebu nekog pogodnog propelanta, kao što su npr., dihlorodifluorometan, trihlorofluorometan, dihlorotetrafluoroetan ili ugljen-dioksid. U sluĉaju aerosola pod pritiskom, jediniĉna doza se moţe odreĊivati preko oslobaĊanja kroz ventil, koji oslobaĊa odmerenu koliĉinu. Kapsule i kartridţi od, npr., ţelatina, za upotrebu u nekom inhaleru ili insuflatoru, mogu se formulisati tako da sadrţe neku mešavinu praha jedinjenja koja su ovde data i pogodne praškaste baze, kao što su, ali bez ograniĉavanja, laktoza ili skrob.

[0159] Jedinjenja koja su ovde data mogu se formulisati za parenteralno ordiniranje, npr., bolus injekcijom ili kontinualnom infuzijom. Formulacije za injekcije mogu se davai u obliku jediniĉne doze, npr., u ampulama ili u kontejnerima sa više doza, opciono, sa dodatkom nekog prezervativa. Ove kompozicije mogu biti u obliku suspenzija, rastvora ili emulzija u ulju ili vodenom teĉnom nosaĉu, i mogu sadrţati agense za formulisanje, kao što su agensi za suspendovanje, stabilizovanje i/ili dispergovanje.

[0160] Farmaceutska kompozicija za parenteralno ordiniranje ukljuĉuje preparate vodenih rastvora ovih jedinjenja, koja su rastvorna u vodi. Pored toga, mogu se pripremati suspenzije jedinjenja, koja su ovde data, kao suspenzije i emulzije u odgovarajućem ulju (npr., voda-u-ulju, ulje-u-vodi ili emulzije voda-u-ulju u ulju). Pogodni lipofilni rastvaraĉi ili teĉni nosaĉi su masna ulja, kao što je susamovo ulje, ili sintetski estri masni kiselina, kao što je etil oleat, trigliceridi ili lipozomi. Injekcije vodenih suspenzija mogu sadrţati supstance, koje povećavaju viskoznost ove suspenzije, kao što su natrijum karboksimetil celuloza, sorbitol ili dekstran. Opciono, suspenzija moţe takoĊe da sadrţi pogodne stabilizatore ili agense koji povećavaju rastvorljivost jedinjenja koja su ovde data, da se omogući pripremanje visoko koncentrisanih rastvora.

[0161] Alternativno, jedinjenja koja su ovde data mogu biti u obliku praha, za konstituisanje pred upotrebu sa pogodnih teĉnim nosaĉem, npr., sterilnom, apirogenom vodom.

[0162] Jedinjenja koja su ovde data mogu takoĊe da se formulišu u rektalne kompozicije, kao što su supozitorije ili retencioni klistiri, korišćenjem, npr., konvencionalnih baza za supozitorije, kao što su kakao buter ili drugi gliceridi.

[0163] Ovde opisana farmaceutska kompozicija moţe takoĊe sadrţati pogodne nosaĉe ili ekscipijente u ĉvrstoj ili gel fazi. Primeri ovakvih nosaĉa ili ekscipijenata su, ali bez ograniĉavanja na iste, kalcijum-karbonat, kalcijum-fosfoat, razni šećeri, skrobovi, derivati celuloze, ţelatin i polimeri, kao što su polietilen glikoli.

[0164] Farmaceutska kompozicija, pogodna za upotrebu u kontekstu ovog pronalaska, ukljuĉuje kompozicije u kojima su aktivni sastojci sadrţani u koliĉini koja je efikasna za namenjenu svrhu. OdreĊenije, terapeutski efikasna koliĉina oznaĉava neku koliĉinu jedinjenja koja su ovde date, koja efikasno speĉava, ublaţava ili odlaţe simptome poremećaja, ili produţava preţivljavanje tretiranog subjekta.

[0165] OdreĊivanje terapeutski efikasne koliĉine je unutar struĉnosti onih koji su verzirani u stanju tehnike, posebno u pogled detaljnog uopisa koji se ovde daje.

[0166] Za bilo koje od jedinjenja, koja se daju ovde i koriste u postupcima ovih realizacija, terapeutski efikasna koliĉina ili doza, moţe se proceniti na osnovu testova aktivnosti na animalnim bićima. Na primer, neka doza se moţe formlisati na animalnim modelima, za postizanje opsega koncentracije u krvotoku, koji ukljuĉuju sadrţaje za supresiju mutacije, a su odreĊene pomoću testova aktivnosti (npr., koncentracije testiranih jedinjenja sa kojima se postiţe suštinsko proĉitavanje isprekidane mutacije). Ova informacja se moţe upotrebiti za taĉnija odreĊivanja korisnih doza za humana bića.

[0167] Toksiĉnost i therapeutska efikasnost jedinjenja koja su ovde data, mogu da se odrede pomoću standardnih farmaceutskih procedura na eksperimentalnim ţivotinjama, npr., preko odreĊivanja EC50(koncentracije jedinjenja na kojoj se opaţa 50% od maksimalnog efekta) i LD50(letalna doza, koja izaziva smrt kod 50% testiranih ţivotinja) za posmatrano jedinjenje. Podaci koji se dobiju iz ovakvih testiranja aktivnosti i ispitivanja na ţivotinjama, mogu se koristiti za formulciju opsega za doziranje humanim bićima.

[0168] Doza moţe varirati zavisno od upotrebljenog oblika za doziranje i korišćenog puta za ordiniranje. Taĉnu formulaciju, put ordiniranja i dozu moţe birati lekar, individualno za svakog pacijenta, prema njegovom stanju. (Videti npr., Fingl et al., 1975, in "The Farmakological Basis of Therapeutics", Ch.1 p.1).

[0169] Koliĉina doze i interval doziranja se mogu podešavati individualno, tako da sadrţaji jedinjenja, koja su ovde data, u plazmi, budu dovoljni za ţeljene efekte, a nazivaju se minimalna efikasna koncentracija (MEC). Vrednost MEC će varirati za svaki preparat, ali se moţe proceniti iz podataka dobijenih in vitro; npr., koncentracija ovih jedinjenja potrebna da se postigne 50-90% ekspresije celog gena koji ima isprekidanu mutaciju, tj. proĉitavanje kodona mutacije. Doze koje su neophodne za postizanje MEC će zavisiti od individualni karakteristika i puta ordiniranja. Testovi HPLC ili biotestovi se mogu koristiti za odreĊivanje koncentracije u plazmi.

[0170] Intervali doziranja takoĊe se mogu odrediti korišćenjem vrednosti MEC. Preparati treba da se ordiniraju korišćenjem nekog reţima, kojim se odrţavaju sadrţaji u plazmi iznad MEC, tokom 10-90% vremena, poţeljno izmeĊu 30-90% a najpoţeljnije od 50-90%.

[0171] Zavisno od ozbiljnosti i odgovora hroniĉnog stanja koje treba da se tretira, doziranje moţe takoĊe biti ordiniranje unutar jednog perioda, za kompozicije koje se sporo oslobaĊaju, koje su opisane gore, sa trajanjem perioda tretmana od nekoliko dana do nekoliko nedelja, ili dok se ne ostvari dovoljno poboljšanje tokom perioda tretmana, ili dok se ne postigne suštinsko smanjenje poremećaja stanja tokom perioda tretmana.

[0172] Koliĉina neke kompozicije koja treba da se ordinira, naravno da će zavisiti od subjekta koji se tretira, ozbiljnosti patnje, naĉina ordiniranja, provere lekara, itd.. Kompozicije iz ovog pronalaska mogu, ukoliko se ţeli, da se daju u obliku nekog pakovanja ili ueĊaja za doziranje, kao što je neki komplet preporuĉen od FDA (U.S. Food and Drug Administration), koji moţe da sadrţi jedan ili više oblika jediniĉne doze u kojoj je sadrţan aktivni sastojak. Ovo pakovanje moţe, na primer, da sadrţi metalnu ili plastiĉnu foliju, kao što je ali bez ograniĉavanja, blister pakovanje ili neki kontejner od pritiskom (za inhalaciju). Ovo pakovanje ili ureĊaj za doziranje moţe da prati uputstvo za ordiniranje. Ovo pakovanje, ili ureĊaj za doziranje, moţe takoĊe da prati obaveštenje povezano sa tim kontejnerom, u obliku be preporuke neke drţavne agencije, koja reguliše proizvodnju, upotrebu i prodaju farmaceutskih proizvoda, obaveštenje koje sadrţi odobrenje te agencije o obliku kompozicija za humana i veterinasrka ordiniranja. Takvo uputstvo moţe, na primer, biti nalepnica, odobrena od U.S. Food and Drug Administration za prepisivanje lekova ili umetak za odobreni porizvod. Kompozicije koje sadrţe neko jedinjenje u skladu sa ovim realizacijama, formulisane u nekom kompatiibilnom farmaceutskom nosaĉu, mogu takoĊe da se prirpeme, smeste u odgovarajući kontejner, i oznaĉe sa etiketom, za tretman nekog indikovanog stanja ili dijagnoze, kao što je detaljno diskutovano gore.

[0173] Dakle, u nekim realizacijama, farmaceutska kompozicija se pakuje u neki materijal za pakovanje i identifikuje štampanim slovima u ili na materijalu za pakovanje, za upotrebu u tretmanu nekog genetskog poremećaja, kako je ovde definisan.

[0174] U bilo kojoj od kompozicija, postupaka i upotreba, koje su ovde opisane, ova jedinjenja se mogu koristiti u kombinaciji i sa drugim agensima, koji su korisni u tretmanu ovih genetskih poremećaja.

[0175] Pošto su prvenstveno usmerena na tretiranje genetskih poremećaja, koji su po definiciji hroniĉni, jedinjenja, koja su ovde data, ili farmaceutska kompozicija koja sadrţi ista, oĉekuje se da se ordiniraju tokom ĉitavog ţivota subjekta koji se tretira. Stoga, naĉin ordiniranja farmaceutske kompozicije koja sadrţi ova jedinjenja, treba da bude takav da je lak i komforan za ordiniranje, poţeljno za samo-ordiniranje, tako da najmanje opterećuje pacijentovo blagostanje i naĉin ţivota.

[0176] Ponavljanje i periodiĉno ordiniranje jedinjenja koja su ovde data, ili farmaceutske kompozicije koja sadrţi ista, moţe se ostvariti, na primer, na dnevnoj bazi, tj. jedanput na dan, poţeljnije ordiniranje se ostvaruje na nedeljnoj bazi, tj. jedanput nedeljno, poţeljnije ordiniranje se ostvaruje na meseĉnoj bazi, tj. jedanput na mesec dana, a najpoţeljnije ordiniranje se ostvaruje jedanput na nekoliko meseci (npr., na svakih 1.5 mesec, 2 meseca, 3 meseca, 4 meseca, 5 meseci, ili ĉak 6 meseci).

[0177] Kao što je gore diskutovano, neka od ograniĉenja za upotrebu danas poznatih aminoglikozida, kao lekova za prepoznavanje isprekidane mutacije, su povezana sa ĉinjenicom da su oni prvenstveno antibakterijski (koriste se kao antibiotĉki agensi). Hroniĉna upotreba bilo kog antibakterijskog agensa veoma je nepreporuĉljiva, ĉak i ugroţavajuća, zato što menja mikrobiološku floru u intestinumu, što moţe prouzrokovati ili pogoršati druga medicinska stanja, kao što je rasplamsavanje inflamatornih bolesti utrobe, i moţe izazvati pojavu rezistentnosti prema nekim patološkim sojevima mikroorganizama.

[0178] U nekim realizacijama, jedinjenja koja se ovde daju, u suštini nemaju antibakterijsku aktivnost. Pod "nemanje antibakterijske aktivnosti" podrazumeva se da je njihova minimalna inhibicija koncentracije (MIC) za neki posmatrani soj, mnogo veća od od koncentracije jedinjenja koje se smatra antibiotikom, posmatrajući taj soj. Dalje, MIC ovih jedinjenja je primetno veća od koncentracije potrebne za pokazivanje aktivnosti za supresiju isprekidane mutacije.

[0179] Pošto su u suštini ne-bakterijska, jedinjenja, koja su ovde data, ne pokazuju gore pomenute štetne efekte, pa se stoga mogu ordinirati apsorpcionim putevima, koji mogu sadrţati benigne i/ili korisne mikroorganizme na koje ne ciljaju, pa se ĉak moţe zahtevati i njihovo oĉuvanje. Ova znaĉajna kakteristika jedinjenja koja su ovde data, preporuĉuje ova jedinjenja kao naroĉito efikasne lekove protiv hroniĉnih stanja, zato što se mogu ordinirati sa ponavljanjem i tokom ĉitavog ţivota, bez izazivanja bilo kakve štete povezane sa antibakterijskim delovanjem, akumuliranjem efekata, a pored toga, mogu se ordinirati oralno ili rektalno, tj. kroz GI trakt, što je vrlo korisna i vaţna karakteristika nekog leka koji je namenjen za tretiranje hroniĉnih poremećaja.

[0180] Kao što je gore diskutovano, u skladu sa nekim realizacijama, jedinjenja koja su ovde data su selektivna prema eukariotskom sisemu ćelijske translacij, u odnosu na isti u prokariotskim ćelijama, naime ova jedinjenja pokazuju veću aktivnost u eukariotskim ćelijama, kao što je one sisara (humanih bića), u poreĊenju sa njihovom aktivnošću u prokariotskim ćelijama, kao što su one bakterija. Bez vezivanja za neku posebnu teoriju, predpostavlja se da jedinjenja koja su ovde data, za koja je poznato da deluju preko vezivanja za A-mesto u 16S ribozomalnoj RNK, dok je taj ribozom ukljuĉen u translaciju gena, imaju veći afinitet prema eukariotskom ribozomalnom A-mestu, ili drugaĉije reĉeno, su selektivni prema eukariotskom A-mestu, u odnosu na prokariotsko ribozomalno A-mesto, kao što je mitohondrijalno ribozomalno A-mesto, koje potseća na njegov prokariotski pandan.

[0181] Kako se ovde koristi termin "oko" odnosi se na ±10 %.

[0182] Termini "sadrţi", "sadrţan", "ukljuĉen", "ukljuĉujući", "koji ima" i njihovi konjugati oznaĉavaju "ukljuĉujući, ali ne ograniĉavajući isti".

[0183] Termin "sastoji se od naĉina” oznaĉava "ukljuĉujući i ograniĉavajući".

[0184] Termin "sastoji se suštinski od" oznaĉava da posmatrana kompozicija, postupak ili struktura mogu ukljuĉivati dodatne sastojke, korake i/ili delove, ali samo ako ovi dodatni satojci, koraci i/ili delovi materijalno ne menjaju osnovne i nove karakteristike štićene kompozicije, postupka ili strukture.

[0185] Kako se ovde koristi, oblik jednine (kada se engleski oznaĉava sa "a", "an" i "the") ukljuĉuje višestruke reference, ukoliko kontekst jasno ne diktira na drugi naĉin. Na primer, termin "neko jedinjenje" ili "bar jedno jedinjenje" moţe ukljuĉivati više jedinjenja, ukljuĉujući njihove smeše. Kroz ovu prijavu, razne realizacije ovog pronalaska mogu se predstavljati u formatu nekog opsega. Podrazumeva se da je taj opis u formatu opsega samo radi pogodnosti i konciznosti, a ne treba ga tumaĉiti kao nefleksibilno ograniĉenje obima ovog pronalaska. U skladu sa tim, opis nekog opsega treba tumaĉiti tako da ima specifiĉno opisane sve moguće pod-opsege, kao i pojedinaĉne brojĉane vrednosti unutar tog opsega. Na primer, opis nekog opsega, kao što je od 1 do 6, treba posmatrati kao da ima specifiĉno opisane pod-opsege, kao što su od 1 do 3, od 1 do 4, od 1 do 5, od 2 do 4, od 2 do 6, od 3 do 6 itd., kao i pojedinaĉne brojeve unutar tog opsega, na primer, 1, 2, 3, 4, 5 i 6. Ovo vaţi nezavisno od širine opsega.

[0186] Kada god se ovde naznaĉi brojĉano opseg, to unaĉi da je unutar naznaĉenog opsega ukljuĉena bilo koja citiranu brojka (razlomak ili ceo broj). Fraze "kreće se od/ili kreće se" prva ukazuje na broj, i druga ukazuje na broj, a u "kreće se/kreće se od" prva ukazuje na broj "do", a druga ukazuje na broj, koriste se ovde naizmeniĉno, a oznaĉavju da su obuhvaćeni prvi i drugi naznaĉeni broj, kao i svi razlomljeni i celi brojevi izmeĊu njih.

[0187] Kako se ovde koristi, termin "postupak" se odnosi na naĉine, sredstva, tehnike i procedure za obavljanje datog zadatka, ukljuĉujući, ali ne ograniĉavajući se, one naĉine, sredstva, tehnike i procedure, koje su ili poznate ili jednostavno razvijene iz ponatih naĉina, sredstava, tehnika i procedura od strane onoga ko ih praktikuje u hemijskom, farmakološkom, biološkom, biohemijskom i medicinskom stanju tehnike.

[0188] Oĉekuje se da će tokom ţivota nekog patenta, koji sazreva od njegove prijave, biti pronaĊeni mnogi aminoglikozidi, koji imaju neku 5"-alkil grupu, a namera je da su u obim ovog termina a priori ukljuĉene sve takve nove tehnologije.

[0189] Ceni se da izvesne karakteristike ovog pronalaska, koje su radi jasnoće opisane u kontekstu odvojenih realizacija, mogu takoĊe da se daju u kombinaciji, u samo jednoj realizaciji. Obrnuto, razne karakteristike ovog pronalaska, koje su zbog kratkoće opisane u kontekstu jedne realizacije, mogu takoĊe da se daju odvojeno u bilo kojoj pogodnoj sub-kombinaciji, ili ako je pogodno, u bilo kojoj drugoj realizaciji ovog pronalaska. Neke karakteristike, opisane u kontekstu raznih realizacija, ne treba da se smatraju bitnim karakteristikama tih realizacija, ukoliko ta realizacija nije operativna bez tih elemenata.

[0190] Razne realizacije i aspekti ovog pronalaska, kao što je podvuĉeno gore i šiti se u patentnim zahtevima u nastavku, nalaze eksperimentalnu potvrdu u sledećim primerima.

PRIMERI

[0191] Sada se ovde poziva na primere koji slede, koji zajedno sa gornjim opisima ilustruju neke realizacije ovog pronalaska, ali na naĉin bez ograniĉavanja.

PRIMER 1

HEMIJSKA SINTEZA

Sintetske procedure:

[0192] Jedinjenja NB118, NB119, NB122, NB123, NB124, NB125, NB127 i NB128 su sintetizovana u skladu sa opštom procedurom, koja obuhvata konstrukciju prstena III, kao da pojedinaĉna jedinjenja imaju (S)-5-metil i (R)-5-metil sa već utvrĊenom stereohemijom (Jedinjenje (S)-17 i Jedinjenje (R)-18), koristeći njih kao donore u reakcijama glikozilovanja. Ovi donori su lako pristupaĉni iz poznatog tioglikozida, Jedinjenja 7, kao što je ilustrovano u Shemi 2, niţe (gde "a" predstavlja 1,1-dimetoksipropan, CSA, aceton, sobna temperatura; "b" predstavlja Dess-Martinov perjodinan (DMP), DCM, sobna temperatura; "c" predstavlja MeMgBr, THF,-30°C; "d" predstavlja TsCl, Py, 4-DMAP, sobna temperatura; "e" predstavlja NaN3, HMPA, DMF, 70°C; "f" predstavlja sirćetna kiselina/voda (8:2), refluks; "g" predstavlja BzCl, Py, 4-DMAP, sobna temperatura; "h" predstavlja NBS, aceton/voda (8:2), -30°C; i "I" predstavlja CC13CN, DBU, DCM, 0°C).

Shema 2

[0193] Selektivnu zaštitu C2- i C3-hidroksila pomoću izopropilidina (2,2-dimetoksi propan/aceton, CSA) sledi oksidacija preostalog primarnog alkohola, korišćenjem Dess-Martin-ovog perjodinana (DMP, dihlorometan), dajući aldehidno Jedinjenje 8, sa izolovanim prinosom 70%, za dva koraka. Tretman Jedinjenja 8 sa MeMgBr je dao odgovarajući sekundarni alkohol, kao smešu C5-dijastereomera (4:1 odnos), sa izolovanim prinosom od 88%. Ova smeša se razdvoji fleš hromatografijom na koloni, a glavni dijastereomer se posebno podvrgne odreĊivanju apsolutne dtereohemije na poziciji C5- (vide infra). Ovim ispitivanjem je utvrĊeno da glavni i manjinski dijastereomeri pokazuju (R)- i (S)-konfiguraciju, respektivno (Jedinjenja (R)-9 i (S)-10).

[0194] Sledeći koraci u Shemi 2 se odvojeno obavljaju na svakom dijastereomeru. Tozilovanje (TsCl, piridin, 4-DMAP) ovog sekundarnog alkohola sledi SN2 premeštanje odgovarajućih tozilata (Jedinjenja (R)-11 i (S)-12), sa NaN3(DMF, HMPA), dajući azide Jedinjenja (S)-13 i (R)-14, sa invertovanim konfiguracijama. Hidrolizu izopropiliden ketala sa sirćetnom kiselinom u vodi, sledi benzoilovanje nastalih sekundarnih alkohola, dajući benzoate Jedinjenja (S)-15 i (R)-16. Ranija ispitivanja skupa egzemplarnih referentnih pseudo-trisaharida NB30 i NB54, su pokazala da su ţeljeni C5 akceptori manje reaktivni u reakcijama glikozilovanja, a trihloroacetimidatni donori su dali zadovoljavajuće rezultate.

[0195] Opaţeno je da reakcija glikolizacije, u kojoj se kao donori koriste tioglikozidni donori, kao što su (S)-15 i (R)-16 (videti, Shemu 2, gore), moţe da se obavi u prisustvu raznih reagenasa za glikozilovanje, ukljuĉujući N-jodosukcinimid (NIS) i trifluorometan sulfonsku kiselinu (HOTf); ili NIS i srebro triflat (AgOTf).

[0196] Stoga se tioglikozidna Jedinjenja (S)-15 i (R)-16 konvertuju u odgovarajuće trihloroacetimidate, Jedinjenja (S)-17 i (R)-18, kroz dva uzastopna koraka; hidroliza sa NBS u acetonu i vodi, pa tretman nastalih hemiacetala sa CCl3CN, u prisustvu DBU. Donorska Jedinjenja (S)-17 i (R)-18 su korišćena u reakciji glikolizacije, bez daljeg preĉišćavanja.

[0197] Sinteza egzemplarnih pseudo-trisaharidnih jedinjenja, NB118, NB119, NB122 i NB123, je obavljena iz odgovarajućih selektivno zaštićenih pseudodisaharidnih akceptorskih Jedinjenja 19 i 20, kao što je ranije objavljeno (WO 2007/113841), i donorskih Jedinjenja (S)-17 i (R)-18, korišćenjem, u suštini istih hemijskih transformacija, kao što je ilustrovano u Shemi 3, niţe (gde "a" predstavlja BF3·Et2O, DCM, 4Å MS, -20 °C; "b" predstavlja MeNH2-EtOH, sobna temperatura; a "c" predstavlja PMe3, NaOH, THF, sobna temperatura).

Shema 3

[0198] Lewis-ova kiselina (BF3·Et2O/DCM) promoviše glikozilovanje, dajući zaštićena pseudo-trisaharidna Jedinjenja 21-24, u izolovanim prinosima od 79-85%, iskljuĉivo kao beta-anomere, na novo generisanoj glikozidnoj vezi. Dva uzastopna koraka deprotekcije: tretman sa metilaminom, za uklanjanje celokupne zaštite estra, i Staudinger-ova reakcija (Me3P, THF/NaOH) za konvertovanje azida u odgovarajuće amine, dalo je zatim ciljana jedinjenja NB118, NB119, NB122 i NB123, sa izolovanim prinosima od 79-82%, za dva koraka.

[0199] Strukture svih egzemplarnih jedinjenja NB118, NB119, NB122, NB123, NB124, NB125, NB127 i NB128 potvrĊene su kombinacijom raznih 1D i 2D NMR tehnika, ukljuĉujući 2D<1>H-<13>C HMQC i HMBC, 2D COSY, i 1D TOCSY selektivne eksperimente, zajedno sa analizom masenih spektara (videti ESM).

[0200] Slike 1A-C predstavljaju plan sinteze C5- dijastereomernih estara (R,X)-27 i (S,X)-28, reagense i uslove, gde "a" predstavlja DCC, 4-DMAP, CSA, DCM, na sobnoj temperaturi (Slika 1A);<1>H NMR spectri (R,X)-27 i (S,X)-28, pri ĉemu su istaknute razlike u hemijskim pomeranjima ( Δ δ) izmeĊu pojedinih protona (R,X)-27 i (S,X)-28 (Slika 1B); i utvrĊivanje apsolutne konfiguracije 5-ugljenika (oznaĉen sa X) glavnog alkoholnog Jedinjenja 9, pomoću tehnike Sector rule (Slika 1C).

[0201] Za utvrĊivanje stereohemije boĉnog lanca C5-alkohola, u Jedinjenjima 9 i 10 (videti, Shemu 2), glavni proizvod, Jedinjenj 9, se odvojeno kupluje (korišćenjem DCC, 4-DMAP, CSA) sa (R)-2-metoksi-2(1-naftil)propanoinskom kiselinom (R)-MαNP i (S)-MαNP, poznate apsolutne stereohemije, dajući odgovarajuće estre (R,X)-MαNP-27 i (S,X)-MαNP-28 (videti, Sliku 1A), u skladu sa ranije objavljenom procedurom. Apsolutna konfiguracija C5-pozicije (oznaĉene sa X), zatim je odreĊena korišćenjem<1>H NMR anizotropne metode (Slika 1B-C): razlika hemijskih pomeranja [Δδ = δ(R, X) - δ(S, X)] za H-3 (-0.15) i H-4 (-0.30) bila je negativna, dok je ista bila pozitivna za H-6 (+0.28). Raspored struktura (R,X)-MαNP-27 i (S,X)-MαNP-28, u skladu sa tehnikom Sector rule (videti, Slika 1C: OMαNP i H-5 su pozicionirani ispred i iza, respektivno, dok je pozitivni deo Δδ na desnoj strani ravni MαNP, a Δδ za negativni deo je na levoj strani), zatim je potrvĊena R konfiguracija (X=R) pozicije C5 u Jedinjenju 9.

[0202] Sledeći sliĉne sintetske procedure i sintetski princip, obavljena je sinteza pseudo-trisaharida NB124, NB125, NB127 i NB128 (videti, Shemu 4, niţe) iz odgovarajućih selektivno zaštićenih pseudo-disaharidnih akceptorskih Jedinjenja 219 i 220, kao što je ranije objavljeno (WO 2007/113841), i donorskih Jedinjenja (S)-17 i (R)-18, korišćenjem u suštini istih hemijskih transformacija, koje su ilustrovane u Shemi 3 (gde "a" predstavlja BF3·Et2O, DCM, 4Å MS, -20°C; "b" predstavlja MeNH2-EtOH, sobna temperatura; i "c" predstavlja PMe3, NaOH, THF, sobna temperatura).

Shema 4

Materijali i postupci:

[0203] Sve reakcije su obavljane u atmosferi argona i sa anhidrovanim rastvaraĉima, ukoliko nije na drugi naĉin naglašeno.

[0204] Sve hemikalije, ukoliko nije drugaĉije navedeno, su nabavljane iz komercijalnih izvora, kao što su Sigma-Aldrich, Fluka i sliĉno.

[0205] Reakcije su praćene pomoću TLC, na silikagelu 60 F254 (0.25 mm, Merck), a mrlje su vizualizovane pomoću ţutog rastvora, koji je sadrţao (NH4)Mo7O24×4H2O (120 g) i (NH4)2Ce(NO3)6(5 g), u 10 % H2SO4(800 mL).

[0206] Hromatografija na koloni je obavljana na silikagelu 60 (70-230 meš).

[0207] 1D i 2D NMR spektri, registrovani su rutinski na instrumentu Bruker Avance™ 500 spectrometer.

[0208] Maseni spektri su dobijeni i analizirani ili na instrumentu Bruker Daltonix Apex 3 mass spectrometer, sa raspršivanjem elektrona jonizacijom (ESI), ili na instrumentu TSQ-70B mass spectrometer (Finnigan Mat).

[0209] U biološkim testovima, svi testirani aminoglikozidi bili su u obliku njihovih sulfatnih soli. Navedene koncentracije se odnose na oblik slobodnog amina svakog aminoglikozida.

Dobijanje 4-metilfenil 2,3-O-1-metiletiliden-1-tio-β-D-ribopentodialdo-1,4-furanozida (Jedinjenje 8):

[0210] Smeša 4-metilfenil 1-tio-β-D-ribofuranozida (Jedinjenje 7, 25 g, 0.097 mol) i 1,1-dimetoksipropana (22.3 mL, 0.39 mol) u acetonu (500 mL) meša se na sobnoj temperaturi oko pet minuta, a zatim se dodaju katalitiĉka koliĉina CSA (1.0 g) i MgSO4(5.0 g). Napredovanje reakcije se prati pomoću TLC, koje je pokazalo završetak posle 5 h. Reakciona smeša se razblaţi sa etilacetatom i opere sa zasićenim NaHCO3i rastvorom soli. Kombinovani organski sloj se osuši iznad MgSO4, ispari i podvrgne hromatografiji na koloni (EtOAc/Heksan), dajući ţeljeni 2,3-izopropiliden derivat, sa prinosom 82% (23.5 g).

<1>H NMR (500 MHz, CDCl3): δH 3.73-3.85 (m, 2H, H-5), 4.37 (m, 1H, H-4), 4.74 (dd, 1H, J1= 2.5, J2= 6.0 Hz, H-2), 4.80 (dd, 1H, J1= 1.7, J2= 6.0 Hz, H-3), 5.52 (d, 1H, J = 2.5 Hz, H-1). Dodatni pikovi u spektru su identifikovani kao što sledi: δH 1.37 (s, 3H, izopropiliden-CH3), 1.53 (s, 3H, izopropiliden-CH3), 2.35 (s, 3H, aril-CH3), 7.16 (d, 2H, J= 8.0 Hz), 7.42 (d, 2H, J= 8.0 Hz).

<13>C NMR (125 MHz, CDCl3): δC 21.0 (CH3), 25.2 (CH3), 26.8 (CH3), 63.2 (C-5), 81.8 (C-3), 85.7 (C-2), 87.7 (C-4), 93.0 (C-1), 113.3 (kvaternerni-C), 129.2 (Ar), 129.9 (Ar), 132.3 (Ar), 138.0 (Ar).

[0211] MALDI TOFMS, izraĉunato za C15H20O4SNa ([M+Na]<+>) m/e 319.1; izmeren m/e 319.09.

[0212] Proizvod iz gornjeg koraka (22 g, 0.074 mol) se meša u dihlorometanu (500 mL), na sobnoj temperaturi, pa mu se dodaju Dess-Martin-ov perjodinan (DMP, 34.6 g, 0.082 mol) i MgSO4(5.0 g). Napredovanje reakcije se prati pomoću TLC, koje je pokazalo završetak posle 8 h. Reakciona smeša se razblaţi sa etrom i opere sa zasićenim NaHCO3, Na2S2O3i rastvorom soli. Kombinovani organski sloj se osuši iznad MgSO4, ispari i podvrgne hromatografiji na koloni (EtOAc/Heksan), dajući Jedinjenje 8 (18.0 g, 85 % prinos).

<1>H NMR (500 MHz, CDCl3): δH 4.49 (s, 1H, H-4), 4.69 (d, 1H, J = 6.5 Hz, H-2), 5.21 (d, 1H, J = 6.0 Hz, H-3), 5.86 (s, 1H, H-1), 9.80 (s, 1H, H-5, CHO). Dodatni pikovi u spektru su identifikovani kao što sledi: δH 1.37 (s, 3H, izopropiliden-CH3), 1.52 (s, 3H, izopropiliden-CH3), 2.36 (s, 3H, Ar-CH3), 7.19 (d, 2H, J= 8.0 Hz, Ar), 7.41 (d, 2H, J= 8.0 Hz, Ar).

<13>C NMR (125 MHz, CDCl3): δC 21.0 (CH3), 25.1 (CH3), 26.2 (CH3), 87.1 (C-3), 84.5 (C-2), 89.9 (C-4), 92.6 (C-1), 113.3 (kvaternerni-C), 128.9 (Ar), 130.0 (Ar), 131.0 (Ar), 137.8 (Ar), 200.3 (CHO).

[0213] MALDI TOFMS, izraĉunato za C15H19O4S ([M+H]<+>) m/e 295.1; izmeren m/e 295.1.

Dobijanje 4-metilfenil 6-deoksi-2,3-O-1-metiletiliden-1-tio-β-D-alofuranozida (Jedinjenje (R)-9) i 4-metilfenil 6-deoksi-2,3-O-1-metiletiliden-1-tio-α-L-talofuranozida (Jedinjenje (S)-10):

[0214] Aldehidno Jedinjenje 8 (17 g, 0.057 mol) se meša 30 min u THF (200 mL), na -30°C, kome se, ukapavanjem kroz špric, dodaje rastvor MeMgBr (1.4 M u THF/toluenu, 235 mL, 0.171 mol). Ova reakciona smeša se meša 2 h na istoj temperaturi, a napredovanje se prati pomoću TLC. Po završetku, ova reakciona smeša se tretira sa zasićenim NH4Cl i ekstrahuje sa etilacetatom. Kombinovani organski sloj se osuši iznad MgSO4i ispari. Ovaj sirovi proizvod se preĉisti sa hromatografijom na koloni (EtOAc/Heksan), dajući 4:1 odnos dva C5-dijastereomera, sa 88% prinosom: glavni proizvod, Jedinjenje (5R)-9 (13 g, Rƒ = 0.38 u EtOAc/Heksan 1:4) i manjinski proizvod, Jedinjenje (5S)-10 (3 g, Rƒ = 0.48 u EtOAc/Heksan 1:4). Apsolutna konfiguracija na C5-poziciji odreĊena je korišćenjem anizotropne metode<1>H NMR, kao što je opisano niţe.

Podaci za Jedinjenje (5R)-9:

[0215]

[α]D<20>= -191.4 (c = 1.02, CHCl3).<1>H NMR (500 MHz, CDCl3): δH 1.25 (d, 3H, J = 6.3 Hz, CH3), 4.06 (m, 2H, H-4 i H-5), 4.68 (dd, 1H, J1= 2.8, J2= 6.3 Hz, H-2), 4.87 (t, 1H, J = 5.0 Hz, H-3), 5.46 (d, 1H, J= 2.8 Hz, H-1). Dodatni pikovi u spektru su identifikovani kao što sledi: δH 1.37 (s, 3H, izopropiliden-CH3), 1.53 (s, 3H, izopropiliden-CH3), 2.34 (s, 3H, Ar-CH3), 7.15 (d, 2H, J= 8.0 Hz, Ar), 7.42 (d, 2H, J = 8.0 Hz, Ar).

<13>CNMR (125 MHz, CDCl3): δC 18.5 (C-6), 21.0 (CH3), 25.2 (CH3), 26.9 (CH3), 67.3 (C-5), 80.2 (C-3), 85.4 (C-2), 91.4 (C-4), 92.5 (C-1), 113.4 (kvaternerni-C), 129.2 (Ar), 129.8 (Ar), 132.3 (Ar), 137.9 (Ar).

[0216] MALDI TOFMS, izraĉunato za C16H22O4SNa ([M+Na]<+>) m/e 333.1; izmeren m/e 333.1.

Podaci za Jedinjenje (5S)-10:

[0217]

[α]D<20>= -199.7 (c = 1.04, CHCl3).<1>H NMR (500 MHz, CDCl3): δH 1.27 (d, 3H, J= 6.3 Hz, CH3), 3.90 (m, 1H, H-5), 4.08 (dd, 1H, J1= 1.3, J2= 5.6 Hz, H-4), 4.71 (dd, 1H, J1= 1.3, J2= 6.0 Hz, H-3), 4.76 (dd, 1H, J1= 2.1, J2= 6.0 Hz, H-2), 5.57 (d, 1H, J = 2.0 Hz, H-1). Dodatni pikovi u spektru su identifikovani kao što sledi: δH 1.36 (s, 3H, izopropiliden-CH3), 1.54 (s, 3H, izopropiliden-CH3), 2.35 (s, 3H, Ar-CH3), 7.17 (d, 2H, J = 8.0 Hz, Ar), 7.43 (d, 2H, J= 8.0 Hz, Ar).

<13>C NMR (125 MHz, CDCl3): δC 19.2 (C-6), 21.0 (CH3), 25.2 (CH3), 26.8 (CH3), 67.9 (C-5), 82.4 (C-3), 85.7 (C-2), 91.6 (C-4), 93.0 (C-1), 113.3 (kvaternerni-C), 129.4 (Ar), 129.9 (Ar), 131.9 (Ar), 137.9 (Ar).

[0218] MALDI TOFMS, izraĉunato za C16H22O4SNa ([M+Na]<+>) m/e 333.1; izmeren m/e 333.1.

Dobijanje estara Jedinjenja (R,X)-27 i Jedinjenja (S,X)-28, za utvrĎivanje apsolutne konfiguracije na C5:

[0219] Smeša (R)-2-metoksi-2(1-naftil)propanoinske kiseline [(R)-MαNP] ili (S)-MαNP (0.07 g, 0.0003 mol), 4-dimetilaminopiridina (DMAP, 0.05 g, 0.0004 mol), 10-kamforsulfonske kiseline (CSA, 0.025 g), i 1,3-dicikloheksilkarbodiimida (DCC, 0.240 g, 0.0016 mol) se meša u CH2Cl2(30 mL), na 0°C. Glavni alkohol 9, iz gornje reakcije (0.1 g, 0.0003 mol), se rastvori u CH2Cl2(5 mL), polako dodaje u gornju mešanu smešu, pa se reakcija preko noći ostavi na sobnoj temperaturi. Ova smeša se razblaţi sa EtOAc i opere sa 1% HCl rastvorom, zasićenim NaHCO3i rastvorom soli. Kombinovani organski sloj se osuši iznad MgSO4, ispari i podvrgne hromatografiji na koloni (EtOAc/Heksan), dajući ţeljene estre Jedinjenje (R,X)-27 (0.135 g, 80 %) ili Jedinjenje (S,X)-28 (0.138 g, 80 %).

Podaci za Jedinjenj (R,X)-27:

[0220]

<1>H NMR (500 MHz, CDCl3): δH 1.23 (d, 3H, J = 6.3 Hz, CH3), 3.54 (d, 1H, J = 6.1 Hz, H-3), 3.72 (d, 1H, J= 9.0 Hz, H-4), 4.18 (dd, 1H, J1= 2.3, J2= 6.1 Hz, H-2), 5.08 (m, 1H, H-5), 5.32 (d, 1H, J = 2.4 Hz, H-1). Dodatni pikovi u spektru su identifikovani kao što sledi: δH 1.00 (s, 3H, izopropiliden-CH3), 1.32 (s, 3H, izopropiliden-CH3), 2.04 (s, 3H, CH3), 2.32 (s, 3H, Ar-CH3), 3.14 (s, 3H, OCH3), 7.11 (d, 2H, J = 8.0 Hz, Ar), 7.28-7.31 (m, 2H, Ar), 7.48-7.56 (m, 3H, Ar), 7.65 (d, 1H, J = 8.0 Hz, Ar), 7.85 (dd, 2H, J1= 4.7, J2= 8.0 Hz, Ar), 8.47 (d, 1H, J = 8.0 Hz, Ar).

<13>C NMR (125 MHz, CDCl3): δC 17.1 (C-6), 21.0 (CH3), 21.5 (CH3), 24.8 (CH3), 26.6 (CH3), 50.9 (OCH3), 70.5 (C-5), 81.2 (C-3), 81.3 (kvaternerni-C), 84.8 (C-2), 88.0 (C-4), 92.5 (C-1), 112.9 (kvaternerni-C), 124.7 (Ar), 125.0 (Ar), 125.7 (Ar), 125.8 (Ar), 126.6 (Ar), 128.8 (Ar), 129.5 (Ar), 129.7 (Ar), 130.3 (Ar), 131.2 (Ar), 131.3 (Ar), 134.0 (Ar), 134.6 (Ar), 137.2 (Ar), 173.1 (C=O).

[0221] MALDI TOFMS, izraĉunato za C30H34O6SNa ([M+Na]<+>) m/e 545.2; izmeren m/e 545.2.

Podaci za Jedinjenje (S,X)-28:

[0222]

<1>H NMR (500 MHz, CDCl3): δC 0.95 (d, 3H, J= 6.3 Hz, CH3), 3.84 (dd, 1H, J1= 1.5, J2= 6.2 Hz, H-3), 3.87 (dd, 1H, J1= 1.5 i J2= 6.2 Hz, H-4), 4.08 (dd, 1H, J1= 3.4, J2= 6.1 Hz, H-2), 5.06 (m, 1H, H-5), 5.27 (d, 1H, J = 3.4 Hz, H-1). Dodatni pikovi u spektru su identifikovani kao što sledi: δH 1.14 (s, 3H, izopropiliden-CH3), 1.41 (s, 3H, izopropiliden-CH3), 2.09 (s, 3H, CH3), 2.33 (s, 3H, Ar-CH3), 3.14 (s, 3H, OCH3), 7.12 (d, 2H, J= 8.0 Hz, Ar), 7.35 (d, 2H, J= 8.0 Hz, Ar), 7.49-7.67 (m, 3H, Ar), 7.69 (d, 1H, J= 8.0 Hz, Ar), 7.88 (d, 2H, J= 8.0 Hz, Ar), 8.41 (d, 1H, J = 8.0 Hz, Ar).

<13>C NMR (125 MHz, CDCl3): δC 16.0 (C-6), 21.0 (CH3), 21.5 (CH3), 24.9 (CH3), 26.8 (CH3), 50.8 (OCH3), 71.4 (C-5), 81.0 (C-3), 81.5 (kvaternerni-C), 84.7 (C-2), 87.5 (C-4), 92.6 (C-1), 113.3 (kvaternerni-C), 124.7 (Ar), 125.2 (Ar), 125.7 (Ar), 126.0 (Ar), 126.4 (Ar), 128.6 (Ar), 129.4 (Ar), 129.7 (Ar), 130.3 (Ar), 131.3 (Ar), 131.5 (Ar), 133.8 (Ar), 134.8 (Ar), 137.4 (Ar), 173.4 (C=O).

[0223] MALDI TOFMS, izraĉunato za C30H34O6SNa ([M+Na]<+>) m/e 545.2; izmeren m/e 545.2.

Dobijanje 4-metilfenil 6-deoksi-5-O-tozil-2,3-O-1-metiletiliden-1-tio-β-D-alofuranozida (Jedinjenje (R)-11):

[0224] U mešani rastvor Jedinjenja (R)-9 (13 g, 0.041 mol) u piridinu (200 mL), na 0°C, dodaju se tozil hlorid (15.6 g, 0.082 mol) i 4-DMAP (1 g). Temperatura reakcije se povisi na sobnu temperaturu, a napredovanje se prati pomoću TLC. Po završetku (36 h), reakciona smeša se razblaţi sa etilacetatom i redom opere sa 1% rastvorom HCl u vodi, zasićenim NaHCO3i rastvorom soli. Kombinovani organski sloj se osuši iznad MgSO4, ispari i podvrgne hromatografiji na koloni (EtOAc/Heksan) dajući Jedinjenje (R)-11 (16.0 g), sa 82% prinosom.

<1>H NMR (500 MHz, CDCl3): δH 1.28 (d, 3H, J= 6.2 Hz, CH3), 3.99 (d, 1H, J = 8.6 Hz, H-4), 4.60 (dd, 1H, J1= 2.0, J2= 6.2 Hz, H-2), 4.67 (d, 1H, J = 6.2 Hz, H-3), 4.92 (m, 1H, H-5), 5.48 (d, 1H, J = 1.8 Hz, H-1). Dodatni pikovi u spektru su identifikovani kao što sledi: δH 1.30 (s, 3H, izopropiliden-CH3), 1.48 (s, 3H, izopropiliden-CH3), 2.34 (s, 3H, Ar-CH3), 2.45 (s, 3H, Ar-CH3) 7.13 (d, 2H, J= 8.0 Hz, Ar), 7.30-7.38 (m, 4H, Ar), 7.87 (d, 2H, J= 8.0 Hz, Ar).

<13>C NMR (125 MHz, CDCl3): δC 18.0 (C-6), 21.0 (CH3), 21.6 (CH3), 25.0 (CH3), 26.6 (CH3), 77.1 (C-5), 81.2 (C-3), 85.0 (C-2), 87.9 (C-4), 92.3 (C-1), 113.6 (kvaternerni-C), 127.9 (Ar), 129.8 (2C, Ar), 129.9 (Ar), 131.0 (Ar), 133.8 (Ar), 137.4 (Ar), 144.8 (Ar).

[0225] MALDI TOFMS, izraĉunato za C23H29O6S2([M+H]<+>) m/e 465.1; izmeren m/e 465.1.

Dobijanje 4-metilfenil 6-deoksi-5-O-tozil-2,3-O-1-metiletiliden-1-tio-α-L-alofuranozida (Jedinjenje (S)-12):

[0226] U mešani rastvor Jedinjenja (S)-10 (10 g, 0.032 mol) u piridinu (200 mL), na 0°C, dodaju se tozil hlorid (15.6 g, 0.082 mol) i 4-DMAP (1 g). Temperatura reakcije se povisi na sobnu temperaturu, a napredovanje se prati pomoću TLC. Po završetku (36 h), reakciona smeša se razblaţi sa etilacetatom i redom opere sa 1% rastvorom HCl u vodi, zasićenim NaHCO3i rastvorom soli. Kombinovani organski sloj se osuši iznad MgSO4, ispari i podvrgne hromatografiji na koloni (EtOAc/Heksan), dajući Jedinjenje (S)-12 (14.0 g), sa 88% prinosom.

<1>HNMR (500 MHz, CDCl3): δH 1.37 (d, 3H, J= 6.4 Hz, CH3), 4.09 (dd, 1H, J1= 2.8, J2= 4.3 Hz, H-4), 4.48 (dd, 1H, J1= 2.8, J2= 6.2 Hz, H-3), 4.55 (dd, 1H, J1= 4.0, J2= 6.2 Hz, H-2), 4.82 (m, 1H, H-5), 5.25 (d, 1H, J= 4.0 Hz, H-1). Dodatni pikovi u spektru su identifikovani kao što sledi: δH 1.30 (s, 3H, izopropiliden-CH3), 1.50 (s, 3H, izopropiliden-CH3), 2.35 (s, 3H, Ar-CH3), 2.43 (s, 3H, Ar-CH3) 7.12 (d, 2H, J = 8.0 Hz, Ar), 7.32 (d, 2H, J = 8.0 Hz, Ar), 7.38 (d, 2H, J = 8.0 Hz, Ar), 7.87 (d, 2H, J= 8.0 Hz, Ar).

<13>CNMR (125 MHz, CDCl3): δC 17.0 (C-6), 21.0 (Ar-CH3), 21.6 (Ar-CH3), 25.3 (izopropiliden -CH3), 27.2 (izopropiliden -CH3), 78.3 (C-5), 81.2 (C-3), 84.6 (C-2), 86.7 (C-4), 92.2 (C-1), 114.1 (kvaternerni-C), 127.7 (Ar), 129.6 (Ar), 129.7 (Ar), 129.8 (Ar), 132.3 (Ar), 134.1 (Ar), 137.6 (Ar), 144.7 (Ar).

[0227] MALDI TOFMS, izraĉunato za C23H28O6S2Na ([M+Na]<+>) m/e: 487.1; izmeren m/e: 487.1

Dobijanje 4-metilfenil 5-azido-5,6-dideoksi-2,3-O-1-metiletiliden-1-tio-α-L-talofuranozida (Jedinjenje (S)-13):

[0228] U mešani rastvor Jedinjenja (R)-11 (15 g, 0.032 mol) u DMF (250 mL) dodaju se NaN3(10 g, 0.15 mol) i HMPA (15 mL), na sobnoj temperaturi. Temperatura reakcije se povisi na 70°C, a napredovanje se prati pomoću TLC. Po završetku (10 h), reakciona smeša se razblaţi sa etilacetatom i redom opere sa 1% rastvorom HCl u vodi, zasićenim NaHCO3i rastvorom soli. Kombinovani organski sloj se osuši iznad MgSO4, ispari i podvrgne hromatografiji na koloni (EtOAc/Heksan), dajući Jedinjenje (S)-13 (6 g) sa 55 % prinosom.

<1>HNMR (500 MHz, CDCl3): δH 1.35 (d, 3H, J= 6.2 Hz, CH3), 3.73 (m, 1H, H-5), 3.99 (dd, 1H, J1= 3.0, J2= 6.7 Hz, H-4), 4.56 (dd, 1H, J1= 3.0, J2= 6.5 Hz, H-3), 4.70 (dd, 1H, J1= 2.0, J2= 6.2 Hz, H-2), 5.39 (d, 1H, J= 3.2 Hz, H-1). Dodatni pikovi u spektru su identifikovani kao što sledi: δH 1.36 (s, 3H, izopropiliden-CH3), 1.53 (s, 3H, izopropiliden-CH3), 2.36 (s, 3H, Ar-CH3), 7.15 (d, 2H, J= 8.0 Hz, Ar), 7.46 (d, 2H, J= 8.0 Hz, Ar).

<13>CNMR (125 MHz, CDCl3): δC 15.5 (C-6), 21.1 (Ar-CH3), 25.4 (izopropiliden-CH3), 27.1 (izopropiliden-CH3), 58.2 (C-5), 81.9 (C-3), 85.1 (C-2), 88.9 (C-4), 91.9 (C-1), 114.2 (kvaternerni-C), 129.5 (Ar), 129.7 (Ar), 132.4 (Ar), 138.8 (Ar).

[0229] MALDI TOFMS, izraĉunato za C16H20N3O3S ([M-H]-) m/e: 334.1; izmeren m/e: 334.1.

Dobijanje 4-metilfenil 5-azido-5,6-dideoksi-2,3-O-1-metiletiliden-1-tio-β-D-alofuranozida (Jedinjenje (R)-14)

[0230] U mešani rastvor Jedinjenja (S)-12 (13 g, 0.028 mol) u DMF (250 mL) dodaju se NaN3(10 g, 0.15 mol) i HMPA (13 mL), na sobnoj temperaturi. Temperatura reakcije se povisi na 70°C, a napredovanje se prati pomoću TLC. Po završetku (10 h), reakciona smeša se razblaţi sa etilacetatom i redom opere sa 1 % rastvorom HCl u vodi, zasićenim NaHCO3i rastvorom soli. Kombinovani organski sloj se osuši iznad MgSO4, ispari i podvrgne hromatografiji na koloni (EtOAc/Heksan), dajući Jedinjenje (R)-14 (9 g), sa 97 % prinosom.

<1>HNMR (500 MHz, CDCl3): δH 1.32 (d, 3H, J= 6.2 Hz, CH3), 3.81 (m, 1H, H-5), 3.89 (dd, 1H, J1= 2.1, J2= 8.3 Hz, H-4), 4.72 (dd, 1H, J1= 2.5, J2= 6.3 Hz, H-2), 4.77 (dd, 1H, J1= 2.1, J2= 6.3 Hz, H-3), 5.49 (d, 1H, J= 2.5 Hz, H-1). Dodatni pikovi u spektru su identifikovani kao što sledi: δH 1.37 (s, 3H, izopropiliden-CH3), 1.53 (s, 3H, izopropiliden-CH3), 2.35 (s, 3H, Ar-CH3), 7.15 (d, 2H, J= 8.0 Hz, Ar), 7.74 (d, 2H, J= 8.0 Hz, Ar).

<13>CNMR (125 MHz, CDCl3): δC 16.2 (C-6), 21.0 (Ar-CH3), 25.2 (izopropiliden-CH3), 26.1 (izopropiliden-CH3), 58.1 (C-5), 81.9 (C-3), 85.1 (C-2), 89.1 (C-4), 92.2 (C-1), 113.8 (kvaternerni-C), 129.7 (Ar), 129.8 (Ar), 131.6 (Ar), 137.6 (Ar).

MALDI TOFMS, izraĉunato za C16H20N3O3S ([M-H]-) m/e: 334.1; izmeren m/e: 334.1.

Dobijanje 4-metilfenil 5-azido-5,6-dideoksi-2,3-O-dibenzoil-1-tio-α-L-talofuranozida (Jedinjenje (S)-15):

[0231] Jedinjenje (S)-13 (6 g, 0.018 mol) se preko noći meša u smeši sirćetna kiselina-voda (100 mL, 8:2), na 70°C. Napredovanje reakcije se prati pomoću TLC. Po završetku, reakciona smeša se razblaţi sa etilacetatom i opere sa zasićenim NaHCO3i rastvorom soli. Kombinovani organski sloj se osuši iznad MgSO4, ispari i podvrgne hromatografiji na koloni (EtOAc/Heksan), dajući ţeljeni deprotektovani proizvod izopropilidena (5 g), sa 96 % prinosom.

<1>HNMR (500 MHz, CDCl3): δH 1.36 (d, 3H, J= 6.2 Hz, CH3), 3.61 (m, 1H, H-5), 3.82 (t, 1H, J = 4.8 Hz, H-4), 4.13 (m, 2H, H-3 i H-2), 5.18 (d, 1H, J = 3.7 Hz, H-1). Dodatni pikovi u spektru su identifikovani kao što sledi: δH 2.35 (s, 3H, ArCH3), 7.15 (d, 2H, J= 8.0 Hz, Ar), 7.45 (d, 2H, J= 8.0 Hz, Ar).

<13>CNMR (125 MHz, CDCl3): δC 15.2 (C-6), 21.0 (Ar-CH3), 58.2 (C-5), 72.0 (C-3), 74.9 (C-2), 86.5 (C-4), 90.5 (C-1), 128.8 (Ar), 129.7 (Ar), 133.0 (Ar), 138.1 (Ar).

[0232] MALDI TOFMS, izraĉunato za C13H16N3O3S ([M-H]-) m/e: 294.1; izmeren m/e: 294.08.

[0233] Proizvod iz gornjeg koraka se meša u piridinu (200 mL), na 0°C, kome se polako dodaju BzCl (7.14 g, 0.051) i 4-DMAP (1 g). Temperatura reakcije se povisi na sobnu temperaturu, pa se meša preko noći. Napredovanje reakcije se prati pomoću TLC. Po završetku, reakciona smeša se razblaţi sa etilacetatom i opere sa 1% rastvorom HCl, zasićenim NaHCO3i rastvorom soli. Kombinovani organski sloj se osuši iznad MgSO4, ispari i podvrgne hromatografiji na koloni (EtOAc/Heksan), dajući Jedinjenje (S)-15 (8.0 g), sa 94 % prinosom.

<1>HNMR (500 MHz, CDCl3): δH 1.38 (d, 3H, J= 6.2 Hz, CH3), 3.81 (m, 1H, H-5), 4.22 (m, 1H, H-4), 5.55 (m, 1H, H-1), 5.56-5.58 (m, 2H, H-2 i H-3). Dodatni pikovi u spektru su identifikovani kao što sledi: δH 2.37 (s, 3H, Ar-CH3), 7.21 (d, 2H, J= 8.0 Hz, Ar), 7.34-7.42 (m, 4H, Ar), 7.53-7.59 (m, 4H, Ar), 7.90 (dd, 2H, J1= 1.2, J2= 8.0 Hz, Ar), 7.99 (dd, 2H, J1= 1.2, J2= 8.0 Hz, Ar).

<13>CNMR (125 MHz, CDCl3): δC 15.2 (C-6), 21.1 (Ar-CH3), 57.9 (C-5), 72.6 (C-3), 74.4 (C-2), 85.1 (C-4), 88.4 (C-1), 127.8 (Ar), 128.3 (2C, Ar), 128.9 (Ar), 129.0 (Ar), 129.6 (Ar), 129.7 (Ar), 129.8 (Ar), 133.4 (2C, Ar), 133.9 (Ar), 138.6 (Ar), 164.9 (C=O), 165.2 (C=O).

[0234] MALDI TOFMS, izraĉunato za C27H25N3O5SNa ([M+Na]<+>) m/e: 526.2; izmeren m/e: 526.1.

Dobijanje 4-metilfenil 5-azido-5,6-dideoksi-2,3-O-dibenzoil-1-tio-β-D-alofuranozida (Jedinjenje (R)-16):

[0235] Jedinjenje (R)-14 (8 g, 0.023 mol) se preko noći meša u smeši sirćetna kiselina-voda (100 mL, 8:2), na 70°C. Napredovanje reakcije se prati pomoću TLC. Po završetku, reakciona smeša se razblaţi sa etilacetatom i opere sa zasićenim NaHCO3i rastvorom soli. Kombinovani organski sloj se osuši iznad MgSO4, ispari i podvrgne hromatografiji na koloni (EtOAc/Heksan), dajući kao proizvod ţeljeni deprotektovani izopropiliden (6.5 g), sa 92 % prinosom.

<1>HNMR (500 MHz, CDCl3): δH 1.36 (d, 3H, J= 6.2 Hz, CH3), 3.65 (m, 1H, H-5), 3.78 (dd, 1H, J1= 2.5, J2= 7.5 Hz, H-4), 4.09 (t, 1H, J= 5.0 Hz, H-2), 4.15 (t, 1H, J= 4.5 Hz, H-3), 5.18 (d, 1H, J= 5.0 Hz, H-1). Dodatni pikovi u spektru su identifikovani kao što sledi: δH 2.36 (s, 3H, Ar-CH3), 7.15 (d, 2H, J= 8.0 Hz, Ar), 7.44 (d, 2H, J= 8.0 Hz, Ar).

<13>CNMR (125 MHz, CDCl3): δC 16.0 (C-6), 21.0 (Ar-CH3), 59.0 (C-5), 71.9 (C-3), 74.9 (C-2), 86.4 (C-4), 90.3 (C-1), 128.9 (Ar), 129.7 (Ar), 132.8 (Ar), 138.1 (Ar).

[0236] MALDI TOFMS, izraĉunato za C13H16N3O3S ([M-H]-) m/e: 294.1; izmeren m/e: 294.08.

[0237] Proizvod iz gornjeg koraka se meša u piridinu (200 mL), na 0°C, pa mu se polako dodaju BzCl (7.14 g, 0.051) i 4-DMAP (1 g). Temperatura reakcije se povisi na sobnu temperaturu, pa meša preko noći. Napredovanje reakcije se prati pomoću TLC. Po završetku, reakciona smeša se razblaţi sa etilacetatom i opere sa 1% rastvorom HCl, zasićenim NaHCO3i rastvorom soli. Kombinovani organski sloj se osuši iznad MgSO4, ispari i podvrgne hromatografiji na koloni (EtOAc/Heksan), dajući Jedinjenje (R)-16 (9.5 g), sa 93 % prinosom.

<1>HNMR (500 MHz, CDCl3): δH 1.42 (d, 3H, J= 6.7 Hz, CH3), 3.74 (m, 1H, H-5), 4.24 (t, 1H, J = 4.7 Hz, H-4), 5.53 (d, 1H, J = 5.6 Hz, H-1), 5.50 (t, 1H, J = 5.5 Hz, H-2), 5.65 (t, 1H, J = 5.5 Hz, H-3). Dodatni pikovi u spektru su identifikovani kao što sledi: δH 2.38 (s, 3H, Ar-CH3), 7.20 (d, 2H, J= 8.0 Hz, Ar), 7.38 (t, 4H, J = 7.6 Hz, Ar), 7.51 (d, 2H, J = 8.0 Hz, Ar), 7.55 (t, 2H, J = 8.0 Hz, Ar), 7.93-7.96 (m, 4H, Ar).

<13>CNMR (125 MHz, CDCl3): δC 15.5 (C-6), 21.1 (Ar-CH3), 58.5 (C-5), 71.8 (C-3), 74.2 (C-2), 84.9 (C-4), 88.2 (C-1), 127.8 (Ar), 128.3 (2C, Ar), 128.9 (2C, Ar), 129.6 (Ar), 129.7 (Ar), 129.8 (Ar), 133.3 (2C, Ar), 133.8 (Ar), 138.6 (Ar), 164.9 (C=O), 165.0 (C=O).

[0238] MALDI TOFMS, izraĉunato za C27H25N3O5SNa ([M+Na]<+>) m/e: 526.2; izmeren m/e: 526.2

Dobijanje L-talofuranoza, 5-azido-5,6-dideoksi- 2,3-dibenzoat 1-(2,2,2-trihloroetanimidata) (Jedinjenje (S)-17):

[0239] Jedinjenje (S)-15 (8 g, 0.016 mol) se 10 min meša u smeši aceton-voda (100 mL, 9:1), na -30°C, pa se polako dodaje N-bromosukcinimid (9.16 g, 0.051 mol). Ova reakciona smeša se meša na istoj temperaturi, a napredovanje se prati pomoću TLC. Po završetku (3 h), reakciona smeša se razblaţi sa etilacetatom i opere sa zasićenim NaHCO3, zasićenim Na2S2O3i rastvorom soli. Kombinovani organski sloj se osuši iznad MgSO4, pa ispari dajući 6.3 g odgovarajućeg hemiacetala. Ovaj hemiacetal se meša 10 min u smeši dihlorometana (40 mL) i trihloroacetonitrila (5 mL), na 0°C, u koju se doda katalitiĉka koliĉina DBU (0.3 mL). Ova reakciona smeša se meša na istoj temperaturi, a napredovanje se prati pomoću TLC. Po završetku (3 h), reakciona smeša se razblaţi sa DCM i opere sa zasićenim NH4Cl. Kombinovani organski sloj se osuši iznad MgSO4i koncenriše, dajući Jedinjenje (S)-17 (9 g). Ovaj sirovi proizvod se direktno koristi u reakciji glikolizacije, bez preĉišćavanja.

Dobijanje D-allofuranoza, 5-azido-5,6-dideoksi- 2,3-dibenzoat 1-(2,2,2-trihloroetanimidata) (Jedinjenje (R)-18):

[0240] Jedinjenje (R)-16 (9 g, 0.018 mol) se meša 10 min u smeši aceton-voda (100 mL, 9:1), na -30°C, u koju se polako dodaje N-bromosukcinimid (9.0 g, 0.050 mol). Ova reakciona smeša se meša na istoj temperature, a napredovanje se prati pomoću TLC. Po završetku (3 h), reakciona smeša se razblaţi sa etilacetatom i opere sa zasićenim NaHCO3, zasićenim Na2S2O3i rastvorom soli. Kombinovani organski sloj se osuši iznad MgSO4i ispari, dajući 6.5 g odgovarajućeg hemiacetala. Ovaj hemiacetal se meša 10 min u smeši dihlorometana (50 mL) i trihloroacetonitrila (6 mL), na 0°C, pa se doda katalitiĉka koliĉina DBU (0.3 mL). Ova reakciona smeša se meša na istoj temperaturi, a napredovanje se prati pomoću TLC. Po završetku (3 h), reakciona smeša se razblaţi sa DCM i opere sa zasićenim NH4Cl. Kombinovani organski sloj se osuši iznad MgSO4i koncentriše, dajući Jedinjenje (R)-18 (9 g). Ovaj sirovi proizvod se direktno koristi u reakciji glikolizacije, bez peĉišćavanja.

Dobijanje 5-O-(5-azido-5,6-dideoksi-2,3-O-dibenzoil-α-L-talofuranozil)-3’,4’,6’,6-tetra-O-acetil-2’,1,3-triazido paromamina (Jedinjenje (S)-21):

[0241] Anhidrovani CH2Cl2(15 mL) se doda spašenim, na plamenu osušenim molekulskim sitima 4 Å (2.0 g), a zatim se dodaju akceptorsko Jedinjenje 19 (0.75 g, 0.0013 mol) i donorsko Jedinjenje (S)-17 (2.1 g, 0.0039 mol). Ova reakciona smeša se meša 10 min na sobnoj temperaturi, pa se zatim ohladi na -20 °C. Doda se katalitiĉka koliĉina BF3-Et2O (0.1 mL), pa se dobijena smeša meša na -15°C. Napredovanje reakcije se prati pomoću TLC, koje je pokazalo završetak reakcije posle 60 min. Reakciona smeša se razblaţi sa etilacetatom i opere sa zasićenim NaHCO3i rastvorom soli. Kombinovani organski sloj se osuši iznad MgSO4, ispari i podvrgne hromatografiji na koloni (EtOAc/Heksan), dajući Jedinjenje (S)-21 (1.0 g), sa 80 % prinosom.

<1>HNMR (500 MHz, CDCl3): "Prsten I" δH 3.65 (dd, 1H, J1= 4.2, J2= 9.7 Hz, H-2’), 4.20 (d, 1H, J = 11.1 Hz, H-6’), 4.26 (dd, 1H, J1= 3.1, J2= 12.6 Hz, H-6’), 4.54 (m, 1H, H-5’), 5.08 (dd, 1H, J1= 9.3, J2= 10.7 Hz, H-4’), 5.41 (t, 1H, J = 9.9 Hz, H-3’), 5.85 (d, 1H, J= 3.7 Hz, H-1’); "Prsten II" δH 1.64 (ddd, 1H, J1=J2=J3= 12.5 Hz, H-2ax), 2.42 (td, 1H, J1= 4.5, J2= 12.5 Hz, H-2eq), 3.49-3.56 (m, 2H, H-1 i H-3), 3.74 (t, 1H, J = 9.5 Hz, H-4), 3.87 (t, 1H, J = 8.7 Hz, H-5), 5.02 (d, 1H, J = 10.1 Hz, H-6); "Prsten III" δH 1.27 (d, 3H, J= 6.9 Hz, CH3), 3.72 (m, 1H, H-5"), 4.35 (t, 1H, J= 6.6 Hz, H-4"), 5.43 (dd, 1H, J1= 5.1, J2= 7.4 Hz, H-3"), 5.62 (d, 1H, J = 3.8 Hz, H-2"), 5.66 (s, 1H, H-1"). Dodatni pikovi u spektru su identifikovani kao što sledi: δH 2.04 (s, 3H, OAc), 2.10 (s, 3H, OAc), 2.11 (s, 3H, OAc), 2.23 (s, 3H, OAc), 7.35-7.43 (m, 4H, Ar), 7.53-7.60 (m, 2H, Ar), 7.89-7.95 (m, 4H, Ar).

<13>CNMR (125 MHz, CDCl3): δC 15.3 (C-6"), 20.5 (OAc), 20.6 (2C, OAc), 20.9 (OAc), 31.6 (C-1), 58.3, 58.5, 59.3, 61.7, 61.8, 68.0, 68.2, 70.9, 71.8, 73.6, 74.6, 78.1, 79.5, 84.4, 96.6 (C-1’), 107.6 (C-1"), 128.4 (Ar), 128.5 (2C, Ar), 128.7 (Ar), 129.6 (2C, Ar), 133.5 (Ar), 133.6 (Ar), 164.8 (C=O), 165.3 (C=O), 169.7 (C=O), 169.9 (C=O), 170.1 (C=O), 170.6 (C=O).

[0242] MALDI TOFMS, izraĉunato za C40H43N12O16([M-H]-) m/e: 947.3; izmeren m/e: 947.28.

Dobijanje 5-O-(5-azido-5,6-dideoksi-2,3-O-dibenzoil-β-D-alofuranozil)-3’,4’,6’,6-tetra-O-acetil-2’,1,3-triazido paromamina (Jedinjenje (R)-22):

[0243] Anhidrovani CH2Cl2(15 mL) se doda sprašenim, u plamenu osušenim molekulskim sitima 4 Å (2.0 g), a zatim se dodaju akceptorsko Jedinjenje 19 (0.75 g, 0.0013 mol) i donorsko Jedinjenje (R)-18 (2.1 g, 0.0039 mol). Ova reakciona smeša se meša 10 min na sobnoj temperaturi, a zatim se ohladi na -20 °C. Doda se katalitiĉka koliĉina BF3-Et2O (0.1 mL), a ova smeša se meša na -15°C. Napredovanje reakcije se prati pomoću TLC, koje je pokazalo da je reakcija završena posle 60 min. Reakciona smeša se razblaţi sa etilacetatom i opere sa zasićenim NaHCO3i rastvorom soli. Kombinovani organski sloj se osuši iznad MgSO4, ispari i podvrgne hromatografiji na koloni (EtOAc/Heksan), dajući Jedinjenje (R)-22 (1.02 g), sa 82 % prinosom.

<1>HNMR (500 MHz, CDCl3): "Prsten I" δH 3.55 (dd, 1H, J1= 4.5 i J2= 10.7 Hz, H-2’), 4.17 (d, 1H, J = 13.1 Hz, H-6’), 4.30 (dd, 1H, J1= 4.2 i J2= 12.4 Hz, H-6’), 4.56 (m, 1H, H-5’), 5.08 (t, 1H, J = 9.7 Hz, H-4’), 5.43 (t, 1H, J = 9.9 Hz, H-3’), 5.83 (d, 1H, J= 3.9 Hz, H-1’); "Prsten II" δH 1.64 (ddd, 1H, J1=J2=J3=12.5 Hz, H-2ax), 2.42 (td, 1H, J1=4.5 i J2= 12.5 Hz, H-2eq), 3.49-3.56 (m, 2H, H-1 i H-3), 3.74 (t, 1H, J= 10.0 Hz, H-4), 3.92 (t, 1H, J = 9.1 Hz, H-5), 5.03 (d, 1H, J = 9.9 Hz, H-6); "Prsten III" δH 1.41 (d, 3H, J= 6.9 Hz, CH3), 3.76 (m, 1H, H-5"), 4.39 (t, 1H, J= 4.9 Hz, H-4"), 5.50 (dd, 1H, J1= 5.1 i J2= 7.0 Hz, H-3"), 5.60 (d, 1H, J= 4.9 Hz, H-2"), 5.68 (s, 1H, H-1"). Dodatni pikovi u spektru su identifikovani kao što sledi: δH 2.06 (s, 3H, OAc), 2.09 (s, 3H, OAc), 2.11 (s, 3H, OAc), 2.34 (s, 3H, OAc), 7.37-7.41 (m, 4H, Ar), 7.57 (m, 2H, Ar), 7.92 (d, 4H, J= 8.0 Hz Ar).

<13>CNMR (125 MHz, CDCl3): δH 15.1 (C-6"), 20.5 (OAc), 20.6 (OAc), 20.7 (OAc), 20.8 (OAc), 31.7 (C-1), 58.2 (2C), 58.6, 61.7 (2C), 68.0, 68.1, 70.7, 71.4, 73.7, 74.6, 77.8, 79.2, 83.9, 96.6 (C-1’), 107.1 (C-1"), 128.4 (2C, Ar), 128.7 (Ar), 128.8 (Ar), 129.6 (2C, Ar), 133.4 (Ar), 133.5 (Ar), 164.9 (C=O), 165.4 (C=O), 169.7 (2C, C=O), 169.9 (C=O), 170.6 (C=O).

[0244] MALDI TOFMS, izraĉunato za C40H44N12O16Na ([M+Na]<+>) m/e: 971.3; izmeren m/e: 971.4.

Dobijanje 5-O-(5-azido-5,6-dideoksi-2,3-O-dibenzoil-α-L-talofuranozil)-3’,4’,6’,6-tetra-O-acetil-2’,3-diazido-1-N-[(S)-4-azido-2-O-acetilbutanoil]paromamina (Jedinjenje (S)-23):

[0245] Ahidrovani CH2Cl2(15 mL) se doda sprašenim, na plamenu osušenim molekulskim sitima 4 Å (2.0 g), a zatim sledi dodavanje akceptorskog Jedinjenja 20 (1.0 g, 0.0014 mol) i donorskog Jedinjenja (S)-17 (2.2 g, 0.0042 mol). Ova reakciona smeša se meša 10 min na sobnoj temperaturi, a zatim ohladi na -20°C. Doda se katalitiĉka koliĉina BF3-Et2O (0.1 mL), pa se ova smeša meša na -15°C. Napredovanje reakcije se prati pomoću TLC, koje pokazuje da je reakcija završena posle 60 min. Reakciona smeša se razblaţi sa etilacetatom i opere sa zasićenim NaHCO3i rastvorom soli. Kombinovani organski sloj se osuši iznad MgSO4, ispari i podvrgne hromatografiji na koloni (EtOAc/Heksan), dajući Jedinjenje (S)-23 (1.19 g), sa 79 % prinosom.

<1>HNMR (500 MHz, CDCl3): "Prsten I" δH 3.63 (dd, 1H, J1= 4.2, J2= 10.4 Hz, H-2’), 4.18 (d, 1H, J= 10.8 Hz, H-6’), 4.29 (dd, 1H, J1= 2.9, J2= 12.4 Hz, H-6’), 4.54 (m, 1H, H-5’), 5.09 (t, 1H, J = 10.2 Hz, H-4’), 5.42 (t, 1H, J = 10.2 Hz, H-3’), 5.84 (d, 1H, J= 3.9 Hz, H-1’); "Prsten II" δH 1.50 (ddd, 1H, J1=J2=J3= 12.5 Hz, H-2ax), 2.53 (td, 1H, J1= 4.5, J2= 12.5 Hz, H-2eq), 3.60 (m, 1H, H-3), 3.74 (t, 1H, J = 9.5 Hz, H-4), 3.96 (t, 1H, J = 10.0 Hz, H-5), 4.06 (m, 1H, H-1), 4.93 (d, 1H, J = 9.9 Hz, H-6); "Prsten III" δH 1.33 (d, 3H, J= 6.9 Hz, CH3), 3.70 (m, 1H, H-5"), 4.33 (t, 1H, J= 6.0 Hz, H-4"), 5.55 (dd, 1H, J1= 4.9, J2= 7.7 Hz, H-3"), 5.57 (m, 2H, H-2" i H-1"). Dodatni pikovi u spektru su identifikovani kao što sledi: δh 2.04-2.10 (m, 2H, H-8 i H8), 2.06 (s, 3H, OAc), 2.09 (s, 6H, OAc), 2.26 (s, 3H, OAc), 2.35 (s, 3H, OAc), 3.37 (dd, 2H, J1= 6.0, J2 = 7.5 Hz, H-9 i H-9), 5.20 (dd, 1H, J1 = 1.5, J2 = 8.5 Hz, H-7), 6.69 (d, 1H, J = 7.5 Hz, NH), 7.35 (t, 2H, J= 8.0 Hz, Ar), 7.43 (t, 2H, J = 8.0 Hz, Ar), 7.53 (t, 1H, J = 8.0 Hz, Ar), 7.55 (t, 1H, J = 8.0 Hz, Ar), 7.87 (dd, 2H, J1= 1.1, J2= 8.2 Hz, Ar), 7.95 (dd, 2H, J1= 1.2, J2= 8.2 Hz, Ar).

<13>CNMR (125 MHz, CDCl3): δC 15.4 (C-6"), 20.6 (4C, OAc), 20.9 (OAc), 31.9 (C-1), 47.0, 48.5, 58.4, 58.7, 61.7, 61.8, 68.0, 68.2, 70.8, 70.9, 71.4, 73.1, 74.7, 78.3, 79.7, 83.7, 96.7 (C-1’), 107.5 (C-1"), 128.4 (Ar), 128.5 (2C, Ar), 128.7 (Ar), 129.6 (Ar), 129.7 (Ar), 133.5 (Ar), 133.6 (Ar), 165.0 (C=O), 165.2 (C=O), 168.8 (C=O), 169.7 (2C, C=O), 169.8 (C=O), 170.6 (C=O), 172.5 (C=O).

[0246] MALDI TOFMS, izraĉunato za C46H54N13O19([M+H]<+>) m/e: 1092.3; izmeren m/e: 1092.3.

Dobijanje 5-O-(5-azido-5,6-dideoksi-2,3-O-dibenzoil-β-D-alofuranozil)-3’,4’,6’,6-tetra-O-acetil-2’,3-diazido-1-N-[(S)-4-azido-2-O-acetil-butanoil]paromamina (Jedinjenje (R)-24):

[0247] Anhidrovani CH2Cl2(15 mL) se doda sprašenim, na plamenu osušenim molekulskim sitima 4 Å (2.0 g), a zaim sledi dodavanje akceptorskog Jedinjenja 20 (1.0 g, 0.0014 mol) i donorskog Jedinjenja (R)-18 (2.2 g, 0.0042 mol). Ova reakciona smeša se meša 10 min na sobnoj temperaturi, a zatim se ohladi na -20°C. Doda se katalitiĉka koliĉina BF3-Et2O (0.1 mL), pa se ova smeša meša na -15°C. Napredovanje reakcije se prati pomoću TLC, koja je pokazala da je reakcija završena posle 60 min. Reakciona smeša se razblaţi sa etilacetatom i opere sa zasićenim NaHCO3i rastvorom soli. Kombinovani organski sloj se osuši iznad MgSO4, ispari i podvrgne hromatografiji na koloni (EtOAc/Heksan), dajući Jedinjenje (R)-24 (1.27 g), sa 89 % prinosom.

<1>HNMR (500 MHz, CDCl3): "Prsten I" δH 3.53 (dd, 1H, J1= 4.7, J2= 10.7 Hz, H-2’), 4.18 (d, 1H, J= 10.1 Hz, H-6’), 4.30 (dd, 1H, J1= 3.9, J2= 12.3 Hz, H-6’), 4.56 (m, 1H, H-5’), 5.09 (t, 1H, J = 10.2 Hz, H-4’), 5.44 (t, 1H, J = 9.7 Hz, H-3’), 5.84 (d, 1H, J= 3.9 Hz, H-1’); "Prsten II" δH 1.48 (ddd, 1H, J1=J2=J3= 12.5 Hz, H-2ax), 2.52 (td, 1H, J1= 4.5, J2= 12.5 Hz, H-2eq), 3.60 (m, 1H, H-3), 3.74 (t, 1H, J= 9.5 Hz, H-4), 4.00-4.08 (m, 2H, H-5 i H-1), 4.93 (t, 1H, J= 9.9 Hz, H-6); "Prsten III" δH 1.41 (d, 3H, J= 6.9 Hz, CH3), 3.83 (m, 1H, H-5"), 4.37 (dd, 1H, J1= 4.1, J2= 5.7 Hz, H-4"), 5.60 (t, 1H, J = 6.5 Hz, H-3"), 5.64 (d, 1H, J= 6.5 Hz, H-2"), 5.70 (s, 1H, H-1"). Dodatni pikovi u spektru su identifikovani kao što sledi: δH 2.04-2.10 (m, 2H, H-8 i H-8), 2.06 (s, 3H, OAc), 2.10 (s, 3H, OAc), 2.11 (s, 3H, OAc), 2.22 (s, 3H, OAc), 2.27 (s, 3H, OAc), 3.37 (dd, 2H, J1= 6.0, J2= 7.5 Hz, H-9 i H-9), 5.19 (dd, 1H, J1= 1.5, J2= 8.5 Hz, H-7), 6.69 (d, 1H, J= 7.5 Hz, NH), 7.35-7.43 (m, 4H, Ar), 7.53-7.59 (m, 2H, Ar), 7.87-7.92 (m, 4H, Ar).

<13>CNMR (125 MHz, CDCl3): δC 15.3 (C-6"), 20.5 (OAc), 20.5 (OAc), 20.6 (OAc), 20.7 (OAc), 20.8 (OAc), 30.4, 32.1, 47.0, 48.4, 58.2, 58.5, 61.6, 61.7, 68.0, 68.1, 70.7, 70.8, 70.9, 73.4, 74.7, 78.0, 79.5, 83.3, 96.8 (C-1’), 106.9 (C-1"), 128.4 (2C, Ar), 128.7 (2C, Ar), 129.5 (Ar), 129.6 (Ar), 133.5 (2C, Ar), 164.9 (C=O), 165.2 (C=O), 168.9 (C=O), 169.6 (C=O), 169.7 (C=O), 169.8 (C=O), 170.6 (C=O), 172.3 (C=O).

[0248] MALDI TOFMS, izraĉunato za C46H54N13O19([M+H]<+>) m/e: 1092.3; izmeren m/e: 1092.3.

Dobijanje 5-O-(5-amino-5,6-dideoksi-α-L-talofuranozil)-paromamina (NB118):

[0249]

[0250] Proizvod glikozilovanja Jedinjenja (S)-21 (1.0 g, 0.001 mol) se tretira sa rastvorom MeNH2(33% rastvor u EtOH, 50 mL), a napredovanje reakcije se prati pomoću TLC (EtOAc/MeOH 85:15), koje je pokazalo završetak posle 8 h. Ova reakciona smeša se ispari do suva, a ostatak se rastvori u smeši THF (5 mL) i NaOH u vodi (1 mM, 5.0 mL). Ova smeša se meša na sobnoj temperaturi 10 min, a posle toga se doda PMe3(1M rastvor u THF, 5.0 mL, 5.0 mmol). Napredovanje reakcije se prati pomoću TLC [CH2Cl2/Me-OH/H2O/MeNH2(33% rastvor u EtOH) 10:15:6:15], koje je pokazalo završetak posle 1 h. Ovaj proizvod se preĉisti hromatografijom na koloni, na kratkoj kolooni sa silikagelom. Ova kolona se opere sa sledećim rastvaraĉima: THF (800 mL), CH2Cl2(800 mL), EtOH (200 mL), i MeOH (400 mL). Ovaj proizvod se zatim eluira sa smešom 20% MeNH2(33% rastvor u EtOH) u 80% MeOH. Kombinuju se frakcije koje sadrţe proizvod i ispare do suva. Ovaj ostatak se ponovo rastvori u maloj zapremini vode i ponovo ispari (2-3 ponavljanja), dajući oblik slobodnog amina NB118.

[0251] Analitiĉki ĉisto jedinjenje se dobija propuštanjem gornjeg proizvoda kroz kratku kolonu od Amberlita CG50 (NH4<+>oblik). Ova kolona se prvo opere sa smešom MeOH/H2O (3:2), a zatim se proizvod eluira sa smešom MeOH/H2O/NH4OH (80:10:10), dajući NB118 (0.405 g, 82% prinos).

[0252] Za skladištenje i biološke testove, jedinjenje se konvertuje u oblik njegove sulfatne soli: slobodna baza se rastvori u vodi, pH podesi na oko 7,0 sa H2SO4(0.1 M) i liofilizuje. [α]D<20>= 38.4 (c = 0.2, MeOH).

<1>HNMR (500 MHz, CD3OD): "Prsten I" δH 2.64 (dd, 1H, J1= 3.7, J2= 10.4 Hz, H-2’), 3.27 (t, 1H, J = 9.7 Hz, H-4’) 3.52 (t, 1H, J = 10.8 Hz, H-3’), 3.67 (dd, 1H, J1= 6.0, J2= 11.8 Hz, H-6’), 3.79 (m, 1H, H-5’), 3.87 (dd, 1H, J1 = 2.0, J2 = 11.9 Hz, H-6’) 5.20 (d, 1H, J= 3.4 Hz, H-1’); "Prsten II" δH 1.20 (ddd, 1H, J1=J2=J3= 12.5 Hz, H-2ax), 1.97 (td, 1H, J1= 4.5, J2= 12.5 Hz, H-2eq), 2.64 (m, 1H, H-1), 2.78 (m, 1H, H-3), 3.21 (t, 1H, J = 9.3 Hz, H-6), 3.38 (t, 1H, J = 9.5 Hz, H-4), 3.50 (t, 1H, J = 9.2, H-5); "Prsten III" δH 1.18 (d, 3H, J= 6.2 Hz, CH3), 2.96 (m, 1H, H-5"), 3.57 (t, 1H, J= 6.9 Hz, H-4"), 4.02 (t, 1H, J= 5.5 Hz, H-3"), 4.06 (dd, 1H, J1= 2.9, J2 = 5.4 Hz, H-2"), 5.25 (d, 1H, J= 2.7 Hz, H-1").

<13>CNMR (125 MHz, CD3OD): δC 19.3 (C-6"), 37.5 (C-1), 50.6, 52.3, 52.6, 57.8, 62.7 (C-6’), 72.1, 72.2, 75.3, 75.4, 76.2, 78.6, 84.6, 87.4, 88.6, 102.0 (C-1’), 109.5 (C-1").

[0253] MALDI TOFMS, izraĉunato za C18H37N4O10([M+H]<+>) m/e: 469.2; izmeren m/e: 469.2.

Dobijanje 5-O-(5-amino-5,6-dideoksi-β-D-alofuranozil)-paromamina (NB119):

[0254]

[0255] Proizvod glikozilovanja, Jedinjenje (R)-22 (1.0 g, 0.001 mol) se tretira sa rastvorom MeNH2(33% rastvor u EtOH, 50 mL), a napredovanje reakcije se prati pomoću TLC (EtOAc/MeOH 85:15), koje je pokazalo završetak posle 8 h. Ova reakciona smeša se ispari do suva, a ostatak se rastvori u smeši THF (5 mL) i NaOH u vodi (1 mM, 5.0 mL). Ova smeša se meša na sobnoj temperaturi 10 min, a zatim se doda PMe3(1M rastvor u THF, 5.0 mL, 5.0 mmol). Napredovanje reakcije se prati pomoću TLC [CH2Cl2/MeOH/H2O/MeNH2(33% rastvor u EtOH) 10:15:6:15], koje je pokazalo završetak posle 1 h. Ovaj proizvod se preĉisti hromatografijom na koloni, na kratkoj koloni sa silikagelom. Ova kolona se opere sa sledećim rastvaraĉima: THF (800 mL), CH2Cl2(800 mL), EtOH (200 mL), i MeOH (400 mL). Ovaj proizvod se zatim eluira sa smešom 20 % MeNH2(33% rastvor u EtOH) u 80% MeOH. Kombinuju se frakcije koje sadrţe proizvod i ispare do suva. Ovaj ostatak se ponovo rastvori u maloj zapremini vode i ponovo ispari (2-3 ponavljanja), dajući oblik slobodnog amina NB119, koji se takoĊe navodi kao NB119.

[0256] Analitiĉki ĉisto jedinjenje se dobija propuštanjem gornjeg proizvoda kroz kratku kolonu od Amberlita CG50 (oblik NH4<+>). Ova kolona se prvo opere sa smešom MeOH/H2O (3:2), a zatim se proizvod eluira sa smešom MeOH/H2O/NH4OH (80:10:10), dajući NB119 (0.398 g, 80 % prinos).

[0257] Za skladištenje i biološke testove, jedinjenje se konvertuje u oblik njegove sulfatne soli: slobodna baza se rastvori u vodi, pH podesi na oko 7,0 sa H2SO4(0.1 M) i liofilizuje. [α]D<20>= 37.0 (c = 0.2, MeOH).

[0258]<1>HNMR (500 MHz, CD3OD): "Prsten I" δH 2.64 (dd, 1H, J1= 3.4, J2= 10.2 Hz, H-2’), 3.27 (t, 1H, J= 9.1 Hz, H-4’), 3.52 (t, 1H, J= 8.9 Hz, H-3’), 3.68 (t, 1H, J= 6.1 Hz, H-6’), 3.79 (m, 1H, H-5’), 3.87 (dd, 1H, J1= 2.5, J2= 12.2 Hz, H-6’), 5.20 (d, 1H, J= 3.6 Hz, H-1’); "Prsten II" δH 1.21 (ddd, 1H, J1=J2=J3= 12.5 Hz, H-2ax), 1.97 (td, 1H, J1= 4.5, J2= 12.5 Hz, H-2eq), 2.64 (m, 1H, H-1), 2.78 (m, 1H, H-3), 3.18 (t, 1H, J = 9.1 Hz, H-6), 3.37 (t, 1H, J= 9.5 Hz, H-4), 3.46 (t, 1H, J= 9.2 Hz, H-5); "Prsten III" δH 1.16 (d, 3H, J = 6.2 Hz, CH3), 3.09 (m, 1H, H-5"), 3.70 (t, 1H, J =5.3 Hz, H-4"), 4.04 (dd, 1H, J1= 3.3, J2= 5.3 Hz, H-2"), 4.15 (t, 1H, J= 5.5 Hz, H-3"), 5.21 (d, 1H, J= 2.7 Hz, H-1").

[0259]<13>CNMR (125 MHz, CD3OD): δC 18.8 (C-6"), 37.6 (C-1), 49.4, 52.1, 52.6, 57.8, 62.8 (C-6’), 70.8, 72.1, 75.2, 75.4, 76.1, 78.4, 84.7, 87.8, 88.2, 102.0 (C-1’), 109.5 (C-1").

[0260] MALDI TOFMS, izraĉunato za C18H37N4O10([M+H]<+>) m/e: 469.2; izmeren m/e: 469.2

Dobijanje 5-O-(5-amino-5,6-dideoksi-α-L-talofuranozil)-1-N-[(S)-4-amino-2-hidroksi-butanoil] paromamina (NB122):

[0261]

[0262] Proizvod glikozilovanja, Jedinjenje (S)-23, (1.1 g, 0.001 mol) se tretira sa rastvorom MeNH2(33% rastvor u EtOH, 50 mL), a napredovanje reakcije se prati pomoću TLC (EtOAc/MeOH 85:15), koje je pokazalo završetak posle 8 h. Ova reakciona smeša se ispari do suva, a ostatak se rastvori u smeši THF (5 mL) i NaOH u vodi (1 mM, 5.0 mL). Ova smeša se meša na sobnoj temperaturi 10 min, a posle toga se doda PMe3(1M rastvor u THF, 5.0 mL, 5.0 mmol). Napredovanje reakcije se prati pomoću TLC [CH2Cl2/MeOH/H2O/MeNH2(33 % rastvor u EtOH) 10:15:6:15], koje je pokazalo završetak posle 1 h. Ovaj proizvod se preĉisti hromatografijom na koloni, na kratkoj kolooni sa silikagelom. Ova kolona se opere sa sledećim rastvaraĉima: THF (800 mL), CH2Cl2(800 mL), EtOH (200 mL) i MeOH (400 mL). Ovaj proizvod se zatim eluira sa smešom 20 % MeNH2(33 % rastvor u EtOH) u 80 % MeOH. Kombinuju se frakcije koje sadrţe proizvod i ispare do suva. Ovaj ostatak se ponovo rastvori u maloj zapremini vode i ponovo ispari (2-3 ponavljanja), dajući oblik slobodnog amina NB122.

[0263] Analitiĉki ĉisto jedinjenje se dobija propuštanjem gornjeg proizvoda kroz kratku kolonu od Amberlita CG50 (NH4<+>oblik). Ova kolona se prvo opere sa smešom MeOH/H2O (3:2), a zatim se proizvod eluira sa smešom MeOH/H2O/NH4OH (80:10:10), dajući NB122 (0.450 g, 79 % prinos).

[0264] Za skladištenje i biološke testove, jedinjenje se konvertuje u oblik njegove sulfatne soli: slobodna baza se rastvori u vodi, pH podesi na oko 7,0 sa H2SO4(0.1 M) i liofilizuje. [α]D<20>= 35.4 (c = 0.2, H2O).

<1>HNMR (500 MHz, CD3OD) "Prsten I" δH 2.65 (dd, 1H, J1= 3.7 i J2= 10.3 Hz, H-2’), 3.26 (t, 1H, J = 8.9 Hz, H-4’), 3.54 (t, 1H, J = 9.2 Hz, H-3’), 3.68 (dd, 1H, J1= 5.9 i J2= 11.8 Hz, H-6’), 3.80 (m, 1H, H-5’), 3.87 (dd, 1H, J1= 1.7 i J2= 11.7 Hz, H-6’), 5.21 (d, 1H, J= 3.3 Hz, H-1’); "Prsten II" δH 1.34 (ddd, 1H, J1=J2=J3= 12.5 Hz, H-2ax), 1.99 (td, 1H, J1= 4.5 i J2= 12.5 Hz, H-2eq), 2.84 (m, 1H, H-3), 3.40 (t, 1H, J = 9.0 Hz, H-4), 3.50-3.59 (m, 2H, H-5 i H-6), 3.81 (m, 1H, H-1); "Prsten III" δH 1.17 (d, 3H, J= 6.7 Hz, CH3), 2.95 (m, 1H, H-5"), 3.57 (t, 1H, J= 6.5 Hz, H-4"), 4.01 (t, 1H, J = 5.7 Hz, H-3"), 4.08 (dd, 1H, J1= 2.7 i J2= 5.4 Hz, H-2"), 5.26 (d, 1H, J = 2.5 Hz, H-1"). Dodatni pikovi u spektru su identifikovani kao što sledi: δH 1.82 (m, 1H, H-8), 1.94 (m, 1H, H-8), 2.83 (t, 2H, J= 6.4 Hz, H-9 i H-9), 4.14 (dd, 1H, J1= 4.1 i J2 = 7.6 Hz, H-7).

<13>CNMR (125 MHz, CD3OD): δC 19.2 (C-6"), 35.9, 37.8, 38.9, 50.8, 50.9, 52.4, 57.8, 62.8, 71.7, 72.1, 72.3, 75.3, 75.4, 75.6, 76.3, 84.7, 86.9, 88.6, 101.9 (C-1’), 109.9 (C-1"), 177.1 (C=O).

[0265] MALDI TOFMS, izraĉunato za C22H44N5O12([M+H]<+>) m/e: 570.3; izmeren m/e: 570.27.

Dobijanje 5-O-(5-amino-5,6-dideoksi-β-D-alofuranozil)-1-N-[(S)-4-amino-2-hidroksi-butanoil] paromamina (NB123):

[0266]

[0267] Proizvod glikozilovanja, Jedinjenje (R)-24, (1.2 g, 0.0011 mol) se tretira sa rastvorom MeNH2(33 % rastvor u EtOH, 50 mL), a napredovanje reakcije se prati pomoću TLC (EtOAc/MeOH 85:15), koje je pokazalo završetak posle 8 h. Ova reakciona smeša se ispari do suva, a ostatak se rastvori u smeši THF (5 mL) i NaOH u vodi (1 mM, 5.0 mL). Ova smeša se meša na sobnoj temperaturi 10 min, a zatim se doda PMe3(1M rastvor u THF, 5.0 mL, 5.0 mmol). Napredovanje reakcije se prati pomoću TLC [CH2Cl2/MeOH/H2O/MeNH2(33 % rastvor u EtOH) 10:15:6:15], koje je pokazalo završetak posle 1 h. Ovaj proizvod se preĉisti hromatografijom na koloni, na kratkoj kolooni sa silikagelom. Ova kolona se opere sa sledećim rastvaraĉima: THF (800 mL), CH2Cl2(800 mL), EtOH (200 mL), i MeOH (400 mL). Ovaj proizvod se zatim eluira sa smešom 20 % MeNH2(33 % rastvor u EtOH) u 80 % MeOH. Kombinuju se frakcije koje sadrţe proizvod i ispare do suva. Ovaj ostatak se ponovo rastvori u maloj zapremini vode i ponovo ispari (2-3 ponavljanja), dajući oblik slobodnog amina NB123.

[0268] Analitiĉki ĉisto jedinjenje se dobija propuštanjem gornjeg proizvoda kroz kratku kolonu od Amberlita CG50 (Oblik NH4<+>). Ova kolona se prvo opere sa smešom MeOH/H2O (3:2), a zatim se proizvod eluira sa smešom MeOH/H2O/NH4OH (80:10:10), dajući NB123 (0.510 g, 82 % prinos).

[0269] Za skladištenje i biološke testove, jedinjenje se konvertuje u oblik njegove sulfatne soli: slobodna baza se rastvori u vodi, pH podesi na oko 7,0 sa H2SO4(0.1 M) i liofilizuje. [α]D<20>= 32.2 (c = 0.2, H2O).

<1>HNMR (500 MHz, CD3OD) "Prsten I" δH 2.65 (dd, 1H, J1= 3.4, J2= 10.0 Hz, H-2’), 3.27 (t, 1H, J = 9.0 Hz, H-4’), 3.54 (t, 1H, J= 9.1 Hz, H-3’), 3.66 (dd, 1H, J1 = 6.0, J2 = 12.0 Hz, H-6’), 3.81 (m, 1H, H-5’), 3.88 (dd, 1H, J1 = 2.0, J2 = 12.0 Hz, H-6’), 5.21 (d, 1H, J= 3.5 Hz, H-1’); "Prsten II" δH 1.33 (ddd, 1H, J1=J2=J3= 12.5 Hz, H-2ax), 1.99 (td, 1H, J1=4.5, J2= 12.5 Hz, H-2eq), 2.85 (m, 1H, H-3), 3.39 (t, 1H, J= 9.0 Hz, H-4), 3.49-3.57 (m, 2H, H-5 i H-6), 3.82 (m, 1H, H-1); "Prsten III" δH 1.16 (d, 3H, J= 6.7 Hz, CH3), 3.09 (m, 1H, H-5"), 3.70 (t, 1H, J= 5.4 Hz, H-4"), 4.08 (dd, 1H, J1=2.6, J2=5.1 Hz, H-2"), 4.14 (t, 1H, J = 5.7 Hz, H-3 "), 5.22 (d, 1H, J = 2.7 Hz, H-1"). Dodatni pikovi u spektru su identifikovani kao što sledi: δH 1.82 (m, 1H, H-8), 1.94 (m, 1H, H-8), 2.84 (t, 2H, J = 7.2 Hz, H-9 i H-9), 4.15 (dd, 1H, J1= 4.0, J2= 7.5 Hz, H-7).

<13>CNMR (125 MHz, CD3OD): δH 18.8 (C-6"), 35.9, 37.6, 38.9, 49.6, 40.8, 52.3, 57.8, 62.8, 71.0, 71.6, 72.1, 75.2, 75.3, 75.4, 76.2, 85.0, 87.1, 87.9, 101.9 (C-1’), 110.0 (C-1"), 177.0 (C=O).

[0270] MALDI TOFMS, izraĉunato za C22H44N5O12([M+H]<+>) m/e: 570.3; izmeren m/e: 570.27.

Dobijanje 6’-(R)-metil 5-O-(5-azido-5,6-dideoksi-2,3-O-dibenzoil-α-L-talofuranozil)-3’,4’,6’,6-tetra-O-acetil-2’,1,3-triazido paromamina

(Jedinjenje (S)-221):

[0271] Anhidrovani CH2Cl2(15 mL) se doda sprašenim, na plamenu osušenim molekulskim sitima 4 Å (2.0 g), a zaim sledi dodavanje akceptorskog Jedinjenja 219 (0.9 g, 0.0015 mol) i donorskog Jedinjenja (S)-17 (2.0 g, 0.0037 mol). Ova reakciona smeša se meša 10 min na sobnoj temperaturi, a zatim se ohladi na -20°C. Doda se katalitiĉka koliĉina of BF3-Et2O (0.1 mL), pa se ova smeša meša na -15 °C, a napredovanje reakcije se prati pomoću TLC, koja je pokazala da je reakcija završena posle 120 min. Reakciona smeša se razblaţi sa etilacetatom i opere sa zasićenim NaHCO3i rastvorom soli. Kombinovani organski sloj se osuši iznad MgSO4, ispari i podvrgne hromatografiji na koloni (EtOAc/Heksan), dajući Jedinjenje (S)-221 (1.1 g), sa 75 % prinosom.

<1>HNMR (500 MHz, CDCl3): "Prsten I" δH 1.27 (d, 3H, J= 6.0 Hz, CH3), 3.58 (dd, 1H, J1= 5.5, J2= 10.5 Hz, H-2’), 4.45 (d, 1H, J = 10.7 Hz, H-5’), 4.96-5.02 (m, 2H, H-4’ i H-6’), 5.42 (t, 1H, J = 9.6 Hz, H-3’), 5.95 (d, 1H, J = 3.7 Hz, H-1’); "Prsten II" δH 1.51 (ddd, 1H, J1=J2=J3= 12.5 Hz, H-2ax), 2.41 (td, 1H, J1= 4.5, J2= 12.5 Hz, H-2eq), 3.55 (m, 2H, H-1 i H-3), 3.76 (t, 1H, J= 9.4 Hz, H-4), 3.88 (t, 1H, J= 9.0 Hz, H-5), 5.03 (t, 1H, J= 9.1 Hz, H-6); "Prsten III" δH 1.27 (d, 3H, J= 5.6 Hz, CH3), 3.76 (m, 1H, H-5"), 4.35 (dd, 1H, J1 = 6.9, J2 = 10.9 Hz, H-4"), 5.45 (t, 1H, J = 5.5 Hz, H-3"), 5.62 (m, 2H, H-2" i H-1"). Dodatni pikovi u spektru su identifikovani kao što sledi: δH 2.08 (s, 3H, OAc), 2.09 (s, 6H, OAc), 2.38 (s, 3H, OAc), 7.37 (t, 2H, J= 7.8 Hz, Ar), 7.41 (t, 2H, J= 7.8 Hz, Ar), 7.53-7.60 (m, 2H, Ar), 7.89 (d, 2H, J= 8.0 Hz, Ar), 7.93 (d, 2H, J= 8.2 Hz, Ar).

<13>CNMR (125 MHz, CDCl3): δC 13.3 (C-7’), 15.4 (C-6"), 20.6 (2C, OAc), 20.9 (OAc), 21.1 (OAc), 32.1 (C-2), 58.4, 58.8, 59.5, 61.7, 68.5, 69.0, 70.1, 70.8. 71.8, 73.6, 74.6, 77.3, 79.6, 84.4, 96.0 (C-1’), 107.6 (C-1"), 128.4 (Ar), 128.5 (Ar), 128.6 (Ar), 128.7 (Ar), 129.6 (Ar), 129.7 (Ar), 133.5 (Ar), 133.6 (Ar), 164.9 (C=O), 165.3 (C=O), 169.7 (C=O), 169.9 (C=O), 170.1 (C=O), 170.2 (C=O).

[0272] MALDI TOFMS, izraĉunato za C41H46N12O16Na ([M+Na]<+>) m/e: 985.3; izmeren m/e: 985.4.

Dobijanje 6’-(R)-metil-5-O-(5-azido-5,6-dideoksi-2,3-O-dibenzoil-β-D-alofuranozil)-3’,4’,6’,6-tetra-O-acetil-2’,1,3-triazido paromamina

(Jedinjenje (R)-222)

[0273] Anhidrovani CH2Cl2(15 mL) se doda sprašenim, na plamenu osušenim molekulskim sitima 4 Å (2.0 g), a zaim sledi dodavanje akceptorskog Jedinjenja 219 (1.0 g, 0.0017 mol) i donorskog Jedinjenja (R)-18 (2.2 g, 0.004 mol). Ova reakciona smeša se meša 10 min na sobnoj temperaturi, a zatim se ohladi na -20°C. Doda se katalitiĉka koliĉina of BF3-Et2O (0.1 mL), pa se ova smeša meša at -15 °C. Napredovanje reakcije se prati pomoću TLC, koja je pokazala da je reakcija završena posle 120 min. Reakciona smeša se razblaţi sa etilacetatom i opere sa zasićenim NaHCO3i rastvorom soli. Kombinovani organski sloj se osuši iznad MgSO4, ispari i podvrgne hromatografiji na koloni (EtOAc/Heksan), dajući Jedinjenje (R)-222 (1.2 g), sa 75 % prinosom.

<1>HNMR (500 MHz, CDCl3): "Prsten I" δH 1.28 (d, 3H, J= 6.7 Hz, CH3), 3.46 (dd, 1H, J1= 4.5, J2= 10.4 Hz, H-2’), 4.47 (d, 1H, J = 10.7 Hz, H-5’), 4.96-5.02 (m, 2H, H-4’ i H-6’), 5.44 (t, 1H, J = 9.6 Hz, H-3’), 5.93 (d, 1H, J = 3.3 Hz, H-1’); "Prsten II" δH 1.50 (ddd, 1H, J1=J2=J3= 12.5 Hz, H-2ax), 2.41 (td, 1H, J1=4.5 i J2= 12.5 Hz, H-2eq), 3.56 (m, 2H, H-1 i H-3), 3.76 (t, 1H, J= 10.0 Hz, H-4), 3.92 (t, 1H, J= 9.5 Hz, H-5), 5.04 (t, 1H, J= 9.6 Hz, H-6); "Prsten III" δH 1.42 (d, 3H, J= 6.9 Hz, CH3), 3.78 (m, 1H, H-5"), 4.40 (t, 1H, J = 4.6 Hz, H-4"), 5.50 (t, 1H, J = 5.0 Hz, H-3"), 5.59 (t, 1H, J = 3.7 Hz, H-2"), 5.64 (s, 1H, H-1"). Dodatni pikovi u spektru su identifikovani kao što sledi: δH 2.09 (s, 9H, OAc), 2.33 (s, 3H, OAc), 7.37-7.41 (m, 4H, Ar), 7.56 (m, 2H, Ar), 7.92 (d, 4H, J= 8.0 Hz Ar).

<13>CNMR (125 MHz, CDCl3): δH 13.3 (C-7’), 15.0 (C-6"), 20.6 (OAc), 20.7 (OAc), 20.8 (OAc), 21.2 (OAc), 32.1 (C-2), 58.1, 58.2, 58.8, 61.5, 68.9, 70.2, 70.6, 71.4, 73.8, 74.6, 77.0, 77.1, 79.4, 83.9, 96.1 (C-1’), 107.0 (C-1"), 128.4 (2C, Ar), 128.7 (2C, Ar), 129.6 (2C, Ar), 133.5 (Ar), 133.6 (Ar), 164.9 (C=O), 165.4 (C=O), 169.8 (C=O), 169.9 (2C, C=O), 170.1 (C=O).

[0274] MALDI TOFMS, izraĉunato za C41H46N12O16Na ([M+Na]<+>) m/e: 985.3; izmeren m/e: 985.4.

Dobijanje 6’-(R)-metil-5-O-(5-azido-5,6-dideoksi-2,3-O-dibenzoil-α-L-talofuranozil)-3’,4’,6’,6-tetra-O-acetil-2’,3-diazido-1-N-[(S)-4-azido-2-O-acetilbutanoil]paromamina (Jedinjenje (S)-223):

[0275] Anhidrovani CH2Cl2(15 mL) se doda sprašenim, na plamenu osušenim molekulskim sitima 4 Å (2.0 g), a zaim sledi dodavanje akceptorskog Jedinjenja 220 (1.0 g, 0.0014 mol) i donorskog Jedinjenja (S)-17 (2.5 g, 0.0046 mol). Ova reakciona smeša se meša 10 min na sobnoj temperaturi, a zatim se ohladi na -20°C. Doda se katalitiĉka koliĉina BF3-Et2O (0.1 mL), pa se ova smeša meša na -15 °C. Napredovanje reakcije se prati pomoću TLC, koje je pokazalo da je reakcija završena posle 60 min. Reakciona smeša se razblaţi sa etilacetatom i opere sa zasićenim NaHCO3i rastvorom soli. Kombinovani organski sloj se osuši iznad MgSO4, ispari i podvrgne hromatografiji na koloni (EtOAc/Heksan), dajući Jedinjenje (S)-223 (1.1 g), sa 73 % prinosom.

<1>HNMR (500 MHz, CDCl3):<1>HNMR (500 MHz, CDCl3): "Prsten I" δH 1.27 (d, 3H, J= 5.2 Hz, CH3), 3.54 (dd, 1H, J1= 4.3, J2= 10.5 Hz, H-2’), 4.45 (dd, 1H, J1= 1.8, J2= 10.6 Hz, H-5’), 4.96-5.02 (m, 2H, H-4’ i H-6’), 5.43 (t, 1H, J= 9.4 Hz, H-3’), 5.94 (d, 1H, J= 3.7 Hz, H-1’); "Prsten II" δH 1.44 (ddd, 1H, J1=J2=J3= 12.5 Hz, H-2ax), 2.52 (td, 1H, J1= 4.5, J2= 12.5 Hz, H-2eq), 3.60 (m, 1H, H-3), 3.66 (t, 1H, J= 4.5 Hz, H-4), 3.99 (t, 1H, J = 6.4 Hz, H-5), 4.05 (m, 1H, H-1), 4.94 (t, 1H, J = 9.2 Hz, H-6); "Prsten III" δH 1.32 (d, 3H, J= 6.9 Hz, CH3), 3.72 (m, 1H, H-5"), 4.32 (dd, 1H, J1= 5.85, J2= 8.0 Hz, H-4"), 5.55 (dd, 1H, J1= 4.7, J2= 7.4 Hz, H-3"), 5.65 (m, 2H, H-2" i H-1"). Dodatni pikovi u spektru su identifikovani kao što sledi: δH 2.04-2.10 (m, 2H, H-8 i H-8), 2.11 (m, 9H, OAc), 2.22 (s, 3H, OAc), 2.30 (s, 3H, OAc), 3.37 (t, 2H, J= 6.8 Hz, H-9 i H-9), 5.20 (t, 1H, J= 4.85 Hz, H-7), 6.70 (d, 1H, J= 7.5 Hz, NH), 7.35 (t, 2H, J= 7.6 Hz, Ar), 7.43 (t, 2H, J= 7.8 Hz, Ar), 7.53-7.61 (m, 2H, Ar), 7.86 (dd, 2H, J1= 1.1, J2= 8.2 Hz, Ar), 7.95 (dd, 2H, J1= 1.2, J2= 8.2 Hz, Ar).

<13>CNMR (125 MHz, CDCl3): δC 13.5 (C-7’), 15.5 (C-6"), 20.6 (3C, OAc), 20.9 (OAc), 21.1 (OAc), 30.4, 32.2 (C-1), 47.0, 48.4, 58.6, 58.7, 61.6, 68.6, 69.0, 70.3, 70.8 (2C), 71.4, 73.1, 74.7, 77.5, 79.8, 83.6, 96.3 (C-1’), 107.4 (C-1"), 128.4 (Ar), 128.5 (Ar), 128.7 (2C, Ar), 129.6 (Ar), 129.7 (Ar), 133.5 (Ar), 133.6 (Ar), 165.0 (C=O), 165.2 (C=O), 168.8 (C=O), 169.7 (2C, C=O), 169.9 (C=O), 170.0 (C=O), 172.4 (C=O).

[0276] MALDI TOFMS, izraĉunato za C47H55N13O<19>Na ([M+Na]<+>) m/e: 1128.4; izmeren m/e: 1128.2.

Dobijanje 6’-(R)-metil-5-O-(5-azido-5,6-dideoksi-2,3-O-dibenzoil-β-D-alofuranozil)-3’,4’,6’,6-tetra-O-acetil-2’,3-diazido-1-N-[(S)-4-azido-2-O-acetilbutanoil]paromamina (Jedinjenje (R)-224):

[0277] Anhidrovani CH2Cl2(15 mL) se doda sprašenim, na plamenu osušenim molekulskim sitima 4 Å (2.0 g), a zatim sledi dodavanje akceptorskog Jedinjenja 220 (1.0 g, 0.0014 mol) i donorskog Jedinjenja (R)-18 (2.5 g, 0.0046 mol). Ova reakciona smeša se meša 10 min na sobnoj temperaturi, a zatim se ohladi na -20°C. Doda se katalitiĉka koliĉina BF3-Et2O (0.1 mL), pa se ova smeša meša na -15°C, a napredovanje reakcije se prati pomoću TLC, koja je pokazala da je reakcija završena posle 90 min. Reakciona smeša se razblaţi sa etilacetatom i opere sa zasićenim NaHCO3i rastvorom soli. Kombinovani organski sloj se osuši iznad MgSO4, ispari i podvrgne hromatografiji na koloni (EtOAc/Heksan), dajući Jedinjenje (R)-224 (1.15 g), sa 76 % prinosom.

<1>HNMR (500 MHz, CDCl3):<1>HNMR (500 MHz, CDCl3):<1>HNMR (500 MHz, CDCl3): "Prsten I" δH 1.28 (d, 3H, J= 6.6 Hz, CH3), 3.43 (dd, 1H, J1= 4.3, J2= 10.6 Hz, H-2’), 4.49 (dd, 1H, J1= 2.2, J2= 10.7 Hz, H-5’), 4.96-5.02 (m, 2H, H-4’ i H-6’), 5.45 (t, 1H, J = 10.6 Hz, H-3’), 5.92 (d, 1H, J = 3.7 Hz, H-1’); "Prsten II" δH 1.42 (ddd, 1H, J1=J2=J3= 12.5 Hz, H-2ax), 2.52 (td, 1H, J1= 4.5, J2= 12.5 Hz, H-2eq), 3.64 (m, 1H, H-3), 3.76 (t, 1H, J= 4.5 Hz, H-4), 4.05 (m, 2H, H-1 i H-5), 4.93 (t, 1H, J = 10.0 Hz, H-6); "Prsten III" δH 1.39 (d, 3H, J= 6.4 Hz, CH3), 3.85 (m, 1H, H-5"), 4.36 (dd, 1H, J1= 4.3, J2= 6.3 Hz, H-4"), 5.63 (m, 2H, H-2" i H-3"), 5.67 (s, 1H, H-1"). Dodatni pikovi u spektru su identifikovani kao što sledi: δH 2.04-2.10 (m, 2H, H-8 i H-8), 2.08 (s, 3H, OAc), 2.09 (s, 3H, OAc), 2.10 (s, 3H, OAc), 2.21 (s, 3H, OAc), 2.25 (s, 3H, OAc), 3.37 (t, 2H, J= 6.7 Hz, H-9 i H-9), 5.18 (t, 1H, J= 5.0 Hz, H-7), 6.66 (d, 1H, J= 7.5 Hz, NH), 7.38-7.42 (m, 4H, Ar), 7.53-7.59 (m, 2H, Ar), 7.89-7.92 (m, 4H, Ar).

<13>CNMR (125 MHz, CDCl3): δC 13.5 (C-7’), 15.2 (C-6"), 20.6 (3C, OAc), 20.8 (OAc), 21.1 (OAc), 30.4, 32.4 (C-1), 47.0, 48.4, 58.1, 58.7, 61.4, 68.6, 69.0, 70.3, 70.5, 70.8, 70.9, 73.4, 74.8, 77.2, 79.6, 83.3, 96.3 (C-1’), 106.9 (C-1"), 128.4 (2C, Ar), 128.7 (2C, Ar), 129.5 (Ar), 129.6 (Ar), 133.5 (2C, Ar), 164.9 (C=O), 165.2 (C=O), 168.8 (C=O), 169.7 (2C, C=O), 169.9 (C=O), 170.0 (C=O), 172.3 (C=O).

[0278] MALDI TOFMS, izraĉunato za C47H55N13O19Na ([M+Na]<+>) m/e: 1128.4; izmeren m/e: 1128.4.

Dobijanje 6’-(R)-metil-5-O-(5-amino-5,6-dideoksi-α-L-talofuranozil)-paromamina (NB124):

[0279]

[0280] Proizvod glikozilovanja, Jedinjenje (S)-221 (1.0 g, 0.001 mol) se tretira sa rastvorom MeNH2(33 % rastvor u EtOH, 50 mL), a napredovanje reakcije se prati pomoću TLC (EtOAc/MeOH 85:15), koje je pokazalo završetak posle 8 h. Ova reakciona smeša se ispari do suva, a ostatak se rastvori u smeši THF (5 mL) i NaOH u vodi (1 mM, 5.0 mL). Ova smeša se meša na sobnoj temperaturi 10 min, a posle toga se doda PMe3(1 M rastvor u THF, 5.0 mL, 5.0 mmol). Napredovanje reakcije se prati pomoću TLC [CH2Cl2/MeOH/H2O/MeNH2(33 % rastvor u EtOH) 10:15:6:15], koje je pokazalo završetak reakcije posle 1 h. Ovaj proizvod se preĉisti hromatografijom na koloni, na kratkoj koloni sa silikagelom. Ova kolona se opere sa sledećim rastvaraĉima: THF (800 mL), CH2Cl2(800 mL), EtOH (200 mL), i MeOH (400 mL). Ovaj proizvod se zatim eluira sa smešom 20 % MeNH2(33 % rastvor u EtOH) u 80 % MeOH. Kombinuju se frakcije koje sadrţe proizvod i ispare do suva. Ovaj ostatak se ponovo rastvori u maloj zapremini vode i ponovo ispari (2-3 ponavljanja), dajući oblik slobodnog amina NB124.

[0281] Analitiĉki ĉist proizvod se dobija propuštanjem gornjeg proizvoda kroz kratku kolonu od Amberlita CG50 (oblik NH4<+>). Ova kolona se prvo opere sa smešom MeOH/H2O (3:2), a zatim se proizvod eluira sa smešom MeOH/H2O/NH4OH (80:10:10), dajući NB124 (0.400 g, 79 % prinos).

[0282] Za skladištenje i biološke testove, jedinjenje se konvertuje u oblik njegove sulfatne soli: slobodna baza se rastvori u vodi, pH podesi na oko 7,0 sa H2SO4(0.1 M) i liofilizuje.

<1>HNMR (500 MHz, CD3OD):<1>HNMR (500 MHz, CD3OD): "Prsten I" δH 1.21 (d, 3H, J = 5.8 Hz, CH3), 2.61 (dd, 1H, J1= 3.5, J2= 10.0 Hz, H-2’), 3.22 (t, 1H, J = 10.0 Hz, H-4’), 3.51 (t, 1H, J = 8.9 Hz, H-3’), 3.81 (dd, 1H, J1= 3.0, J2= 10.0 Hz, H-5’), 4.12 (m, 1H, H-6’), 5.20 (d, 1H, J = 3.3 Hz, H-1’); "Prsten II" δH 1.18 (ddd, 1H, J1=J2=J3= 12.5 Hz, H-2ax), 1.98 (td, 1H, J1= 4.5, J2= 12.5 Hz, H-2eq), 2.63 (m, 1H, H-1), 2.79 (m, 1H, H-3), 3.19 (t, 1H, J = 9.7 Hz, H-6), 3.38 (t, 1H, J = 9.3 Hz, H-4), 3.48 (t, 1H, J = 9.2 Hz, H-5); "Prsten III" δH 1.18 (d, 3H, J = 6.3 Hz, CH3), 2.95 (m, 1H, H-5"), 3.57 (t, 1H, J =6.4 Hz, H-4"), 4.03 (t, 1H, J = 5.6 Hz, H-3"), 4.07 (m, 1H, H-2"), 5.25 (d, 1H, J = 2.5 Hz, H-1").

<13>CNMR (125 MHz, CD3OD): δc 16.9 (C-7’), 19.3 (C-6"), 37.5 (C-1), 50.6, 52.3, 52.6, 57.8, 67.8, 72.2, 73.6, 75.5, 76.2, 76.7, 78.6, 84.6, 87.3, 88.6, 101.9 (C-1’), 109.6 (C-1").

[0283] MALDI TOFMS, izraĉunato za C19H39N4O10([M+H]<+>) m/e: 483.3; izmeren m/e: 483.2.

Dobijanje 6’-(R)-metil-5-O-(5-amino-5,6-dideoksi-β-D-alofuranozil)-paromamina (NB125):

[0284]

[0285] Proizvod glikozilovanja, Jedinjenje (R)-222 (1.0 g, 0.001 mol) se tretira sa rastvorom MeNH2(33 % rastvor u EtOH, 50 mL), a napredovanje reakcije se prati pomoću TLC (EtOAc/MeOH 85:15), koje je pokazalo završetak posle 8 h. Ova reakciona smeša se ispari do suva, a ostatak se rastvori u Smeši THF (5 mL) i NaOH u vodi (1 mM, 5.0 mL). Ova smeša se meša na sobnoj temperaturi 10 min, a zatim se doda PMe3(1M rastvor u THF, 5.0 mL, 5.0 mmol). Napredovanje reakcije se prati pomoću TLC [CH2Cl2/Me-OH/H2O/MeNH2(33 % rastvor u EtOH) 10:15:6:15], koje je pokazalo završetak reakcije posle 1 h. Ovaj proizvod se preĉisti hromatografijom na koloni, na kratkoj kolooni sa silikagelom. Ova kolona se opere sa sledećim rastvaraĉima: THF (800 mL), CH2Cl2(800 mL), EtOH (200 mL), i MeOH (400 mL). Ovaj proizvod se zatim eluira sa smešom 20 % MeNH2(33 % rastvor u EtOH) u 80 % MeOH. Kombinuju se frakcije koje sadrţe proizvod i ispare do suva. Ovaj ostatak se ponovo rastvori u maloj zapremini vode i ponovo ispari (2-3 ponavljanja), dajući oblik slobodnog amina NB125.

[0286] Analitiĉki ĉist proizvod se dobija propuštanjem gornjeg proizvoda kroz kratku kolonu od Amberlita CG50 (oblik NH4<+>). Ova kolona se prvo opere sa smešom MeOH/H2O (3:2), a zatim se proizvod eluira sa smešom MeOH/H2O/NH4OH (80:10:10), dajući NB125 (0.398 g, 79 % prinos).

[0287] Za skladištenje i biološke testove, jedinjenje se konvertuje u oblik njegove sulfatne soli: slobodna baza se rastvori u vodi, pH podesi na oko 7,0 sa H2SO4(0.1 M) i liofilizuje.

<1>HNMR (500 MHz, CD3OD): "Prsten I" δH 1.22 (d, 3H, J = 5.8 Hz, CH3), 2.61 (dd, 1H, J1= 2.5, J2= 9.6 Hz, H-2’), 3.22 (t, 1H, J = 9.8 Hz, H-4’), 3.50 (t, 1H, J = 9.9 Hz, H-3’), 3.83 (dd, 1H, J1= 3.0, J2= 10.1 Hz, H-5’), 4.12 (m, 1H, H-6’), 5.20 (d, 1H, J = 3.3 Hz, H-1’); "Prsten II" δH 1.21 (ddd, 1H, J1=J2=J3= 12.5 Hz, H-2ax), 1.98 (td, 1H, J1= 4.5, J2= 12.5 Hz, H-2eq), 2.65 (m, 1H, H-1), 2.78 (m, 1H, H-3), 3.18 (t, 1H, J = 9.3 Hz, H-6), 3.38 (t, 1H, J = 9.1 Hz, H-4), 3.46 (t, 1H, J = 9.2 Hz, H-5); "Prsten III" δH 1.17 (d, 3H, J = 6.4 Hz, CH3), 3.10 (m, 1H, H-5"), 3.71 (t, 1H, J =5.0 Hz, H-4"), 4.06 (t, 1H, J = 5.6 Hz, H-2"), 4.16 (t, 1H, J = 3.0 Hz, H-3"), 5.20 (d, 1H, J = 3.0 Hz, H-1").

<13>CNMR (125 MHz, CD3OD): δC 16.6 (C-7’), 18.7 (C-6"), 37.6 (C-1), 49.5, 52.2, 52.5, 57.8, 67.8, 70.8, 73.6, 75.4, 76.1, 76.7, 78.4, 84.7, 87.5, 88.0, 101.9 (C-1’), 109.6 (C-1").

[0288] MALDI TOFMS, izraĉunato za C19H39N4O<10>([M+H]<+>) m/e: 483.3; izmeren m/e: 483.2.

Dobijanje 6’-(R)-metil-5-O-(5-amino-5,6-dideoksi-α-L-talofuranozil)-1-N-[(S)-4-amino-2-hidroksi-butanoil]paromamina (NB127):

[0289]

[0290] Proizvod glikozilovanja, Jedinjenje (S)-223 (1.05 g, 0.001 mol) se tretira sa rastvorom MeNH2(33 % rastvor u EtOH, 50 mL), a napredovanje reakcije se prati pomoću TLC (EtOAc/MeOH 85:15), koje je pokazalo završetak posle 8 h. Ova reakciona smeša se ispari do suva, a ostatak se rastvori u Smeši THF (5 mL) i NaOH u vodi (1 mM, 5.0 mL). Ova smeša se meša na sobnoj temperaturi 10 min, a zatim joj se doda PMe3(1M rastvor u THF, 5.0 mL, 5.0 mmol). Napredovanje reakcije se prati pomoću TLC [CH2Cl2/MeOH/H2O/MeNH2(33% rastvor u EtOH) 10:15:6:15], koje je pokazalo završetak posle 1 h. Ovaj proizvod se preĉisti hromatografijom na koloni, na kratkoj kolooni sa silikagelom. Ova kolona se opere sa sledećim rastvaraĉima: THF (800 mL), CH2Cl2(800 mL), EtOH (200 mL), i MeOH (400 mL). Ovaj proizvod se zatim eluira sa smešom 20% MeNH2(33% rastvor u EtOH) u 80% MeOH. Kombinuju se frakcije koje sadrţe proizvod i ispare do suva. Ovaj ostatak se ponovo rastvori u maloj zapremini vode i ponovo ispari (2-3 ponavljanja), dajući oblik slobodnog amina NB127.

[0291] Analitiĉki ĉist proizvod se dobija propuštanjem gornjeg proizvoda kroz kratku kolonu od Amberlita CG50 (oblik NH4<+>). Ova kolona se prvo opere sa smešom MeOH/H2O (3:2), a zatim se proizvod eluira sa smešom MeOH/H2O/NH4OH (80:10:10), dajući NB127 (0.480 g, 86 % prinos).

[0292] Za skladištenje i biološke testove, jedinjenje se konvertuje u oblik njegove sulfatne soli: slobodna baza se rastvori u vodi, pH podesi na oko 7,0 sa H2SO4(0.1 M) i liofilizuje.

<1>HNMR (500 MHz, CD3OD) "Prsten I" δH 1.21 (d, 3H, J = 6.0 Hz, CH3), 2.63 (dd, 1H, J1= 3.5, J2= 10.0 Hz, H-2’), 3.23 (t, 1H, J = 8.9 Hz, H-4’), 3.52 (t, 1H, J = 9.9 Hz, H-3’), 3.82 (dd, 1H, J1= 3.0, J2= 10.0 Hz, H-5’), 4.13 (m, 1H, H-6’), 5.22 (d, 1H, J = 3.3 Hz, H-1’); "Prsten II" δH 1.34 (ddd, 1H, J1=J2=J3= 12.5 Hz, H-2ax), 1.99 (td, 1H, J1= 4.5 i J2= 12.5 Hz, H-2eq), 2.85 (m, 1H, H-3), 3.40 (t, 1H, J = 8.8 Hz, H-4), 3.50-3.59 (m, 2H, H-5 i H-6), 3.83 (m, 1H, H-1); "Prsten III" δH 1.17 (d, 3H, J = 6.6 Hz, CH3), 2.94 (m, 1H, H-5"), 3.56 (t, 1H, J = 7.1 Hz, H-4"), 4.01 (t, 1H, J = 5.7 Hz, H-3"), 4.09 (dd, 1H, J1= 2.7 i J2= 5.4 Hz, H-2"), 5.26 (d, 1H, J = 2.5 Hz, H-1"). Dodatni pikovi u spektru su identifikovani kao što sledi: δH 1.82 (m, 1H, H-8), 1.95 (m, 1H, H-8), 2.83 (t, 2H, J = 5.7 Hz, H-9 i H-9), 4.13 (dd, 1H, J1= 4.2 i J2 = 7.6 Hz, H-7).

<13>CNMR (125 MHz, CD3OD): δC 16.6 (C-7’), 19.2 (C-6"), 35.9, 37.8, 39.0, 50.8, 50.9, 52.3, 57.8, 67.8, 71.7, 72.4, 73.6, 75.5, 75.6, 76.3, 76.8, 84.8, 86.7, 88.6, 101.9 (C-1’), 110.0 (C-1"), 177.1 (C=O).

[0293] MALDI TOFMS, izraĉunato za C23H45N5O12Na ([M+Na]<+>) m/e: 606.3; izmeren m/e: 606.6.

Dobijanje 6’-(R)-metil-5-O-(5-amino-5,6-dideoksi-β-D-alofuranozil)-1-N-[(S)-4-amino-2-hidroksi-butanoil]paromamina (NB128):

[0294]

[0295] Proizvod glikozilovanja, Jedinjenje (R)-224, (1.12 g, 0.001 mol) se tretira sa rastvorom MeNH2(33 % rastvor u EtOH, 50 mL), a napredovanje reakcije se prati pomoću TLC (EtOAc/MeOH 85:15), koje je pokazalo završetak posle 8 h. Ova reakciona smeša se ispari do suva, a ostatak se rastvori u smeši THF (5 mL) i NaOH u vodi (1 mM, 5.0 mL). Ova smeša se meša na sobnoj temperaturi 10 min, a zatim se doda PMe3(1M rastvor u THF, 5.0 mL, 5.0 mmol). Napredovanje reakcije se prati pomoću TLC [CH2Cl2/MeOH/H2O/MeNH2(33 % rastvor u EtOH) 10:15:6:15], koje je pokazalo završetak posle 1 h. Ovaj proizvod se preĉisti hromatografijom na koloni, na kratkoj kolooni sa silikagelom. Ova kolona se opere sa sledećim rastvaraĉima: THF (800 mL), CH2Cl2(800 mL), EtOH (200 mL), i MeOH (400 mL). Ovaj proizvod se zatim eluira sa smešom 20 % MeNH2(33 % rastvor u EtOH) u 80 % MeOH. Kombinuju se frakcije koje sadrţe proizvod i ispare do suva. Ovaj ostatak se ponovo rastvori u maloj zapremini vode i ponovo ispari (2-3 ponavljanja), dajući oblik slobodnog amina NB128.

[0296] Analitiĉki ĉist proizvod se dobija propuštanjem gornjeg proizvoda kroz kratku kolonu od Amberlita CG50 (oblik NH4<+>). Ova kolona se prvo opere sa smešom MeOH/H2O (3:2), a zatim se proizvod eluira sa smešom MeOH/H2O/NH4OH (80:10:10), dajući NB128 (0.500 g, 84 % prinos).

[0297] Za skladištenje i biološke testove, jedinjenje se konvertuje u oblik njegove sulfatne soli: slobodna baza se rastvori u vodi, pH podesi na oko 7,0 sa H2SO4(0.1 M) i liofilizuje.

<1>HNMR (500 MHz, CD3OD) "Prsten I" δH 1.22 (d, 3H, J = 6.3 Hz, CH3), 2.63 (dd, 1H, J1= 3.8, J2= 10.0 Hz, H-2’), 3.22 (t, 1H, J = 9.8 Hz, H-4’), 3.52 (dd, 1H, J1= 8.6, J2=10.3 Hz, H-3’), 3.83 (dd, 1H, J1 = 3.1, J2 = 10.2 Hz, H-5’), 4.13 (m, 1H, H-6’), 5.23 (d, 1H, J = 3.7 Hz, H-1’); "Prsten II" δH 1.34 (ddd, 1H, J1=J2=J3= 12.5 Hz, H-2ax), 1.99 (td, 1H, J1= 4.5 i J2= 12.5 Hz, H-2eq), 2.85 (m, 1H, H-3), 3.39 (t, 1H, J = 8.8 Hz, H-4), 3.49-3.56 (m, 2H, H-5 i H-6), 3.82 (m, 1H, H-1); "Prsten III" δH 1.16 (d, 3H, J = 6.7 Hz, CH3), 3.08 (m, 1H, H-5"), 3.69 (t, 1H, J = 5.5 Hz, H-4"), 4.07 (dd, 1H, J1= 2.1, J2= 5.2 Hz, H-2"), 4.14 (t, 1H, J = 5.7 Hz, H-3"), 5.21 (d, 1H, J = 3.7 Hz, H-1"). Dodatni pikovi u spektru su identifikovani kao što sledi: δH 1.82 (m, 1H, H-8), 1.95 (m, 1H, H-8), 2.84 (t, 2H, J = 7.2 Hz, H-9 i H-9), 4.13 (dd, 1H, J1 = 3.9, J2 = 7.5 Hz, H-7).

<13>CNMR (125 MHz, CD3OD): δH 16.6 (C-7’), 18.8 (C-6"), 36.0, 37.7, 38.9, 49.6, 50.8, 52.3, 57.8, 67.8, 71.0, 71.7, 73.6, 75.5 (2C), 76.2, 76.7, 85.0, 86.9, 87.9, 101.9 (C-1’), 110.0 (C-1"), 177.1 (C=O).

[0298] MALDI TOFMS, izraĉunato za C23H45N5O12Na ([M+Na]<+>) m/e: 606.3; izmeren m/e: 606.6.

PRIMER 2

PROČITAVANJE ZAUSTAVNOG KODONA

[0299] Kao što je gore prikazano, efikasnost proĉitavanja indkovana sa aminoglikozidima veoma je zavisna od: (i) identiteta zaustavnog kodona (UGA > UAG > UAA), (ii) identiteta prvog nukleotida, u silaznom smeru neposredno od zaustavnog kodona (C > U > A ≥ G), i (iii) od konteksta lokalne sekvence u okolini zaustavnog kodona. Prema tome, u pokušajima da se pruţi šire razumevanje strukturne aktivnosti u dizajniranim strukturama, upotrebljeni su brojni konstrukti, koji sadrţe razliĉite sekvence oko konteksta prevremenog zaustavljanja kodona. Ove egzemplarne sekvence su izvedene iz gena PCDH15, CFTR, IDUA i Dystrophin, u ĉijoj osnovi su USH1, CF, HS i DMD, respektivno. PreovlaĊujuće besmislene mutacije ovih bolesti su odabrane kao što sledi: R3X i R245X za USH1, G542X i W1282X za CF, Q70X za HS i R3381X za DMD, kao što će se pokazati u nastavku.

Ispitivanja pročitavanja:

[0300] Fragmenti DNK, uzeti iz PCDH15, CFTR, Dystrophin i IDUA cDNAs, ukljuĉujući testiranu besmislenu mutaciju ili odgovarajuću divlju vrstu kodona (wt, od englski wild type), i ĉetiri do šest uzlaznih i silaznih boĉnih kodona, stvoreni su otpuštanjem sledećih parova komplementarnih oligonukleotida:

Usher-ov sindrom:

p.R3Xmut/wt

[0301] 5’-GATCCCAGAAGATGTTTCGACAGTTTTATCTCTGGACAGAGCT-3’, i 5’-CTGTCAGAGATAAAACTGTCGAAACATCTTCTG-3’

(sekvenca divljeg tipa, SEQ ID NO: 1 i SEQ ID NO: 2);

[0302] GATCCCAGAAGATGTTTTGACAGTTTTATCTCTGGACAGAGCT i

5’-CTGTCAGAGATAAAACTGTCAAAACATCTTCTG-3’

(sekvenca mutanta, SEQ ID NO: 3 i SEQ ID NO: 4)

p.R245Xmutlwt

[0303]

5’-GATCCAAAATCTGAATGAGAGGCGAACCACCACCACCACCCTCGAGCT-3’ i 5’-CGAGGGTGGTGGTGGTTGTTCGCCTCTCATTCAGATTTTG-3’

(sekvenca WT SEQ ID NO: 5 i 6);

[0304]

5’-GATCCAAAATCTGAATGAGAGGTGAACCACCACCACCACCCTCGAGCT i 5’-CGAGGGTGGTGGTGGTTGTTCACCTCTCATTCAGATTTTG-3’ (sekvenca mutanta SEQ ID NO: 7 i SEQ ID NO: 8)

Cistična fibroza:

p. G542Xmutlwt

[0305] 5’-TCGACCAATATAGTTCTTGGAGAAGGTGGAATCGAGCT-3’ i

5’-CGATTCCACCTTCTCGAAGAACTATATTGG-3’

(sekvenca divljeg tipa SEQ ID NO: 9 i SEQ ID NO: 10);

[0306] 5’-TCGACCAATATAGTTCTTTGAGAAGGTGGAATCGAGCT-3’ i

5’-CGATTCCACCTTCTCAAAGAACTATATTGG-3’

(sekvenca mutanta SEQ ID NO: 11 i SEQ ID NO: 12).

p.W1282Xmut/wt

[0307] 5’-TCGACAACTTTGCAACAGTGGAGGAAAGCCTTTGAGCT-3’ i

5-CAAAGGCTTTCCTCCACTGTTGCAAAGTTG-3’

(sekvenca WT SEQ ID NOs: 13 i 14);

[0308] 5’-TCGACAACTTTGCAACAGTGAAGGAAAGCCTTTGAGCT-3’ i

5-CAAAGGCTTTCCTTCACTGTTGCAAAGTTG-3’

(sekvenca mutanta SEQ ID NO: 15 i SEQ ID NO: 16).

Duchen-ova mišićna distrofija DMD:

p.R3381Xmut/wt

[0309] 5’-TCGACAAAAAACAAATTTTGCACCAAAAGGTATGAGCT-3’ i

5’-CATACCTTTTGGTGCAAAATTTGTTTTTTG-3’

(sekvenca divljeg tipa SEQ ID NO: 17 i SEQ ID NO: 18);

[0310] 5’-TCGACAAAAAACAAATTTTGAACCAAAAGGTATGAGCT-3’ i

5’-CATACCTTTTGGTTCAAAATTTGTTTTTTG-3’

(sekvenca mutanta SEQ ID NO: 19 i SEQ ID NO: 20).

Hurler-ov sindrom:

p.Q70Xmut/wt

[0311] 5’-TCGACCCTCAGCTGGGACCAGCAGCTCAACCTCGAGCT-3’ i

5’-CGAGGTTGAGCTGCTGGTCCCAGCTGAGG-3’

(sekvenca divljeg tipa SEQ ID NO: 21 i SEQ ID NO: 22);

[0312] 5’-TCGACCCTCAGCTGGGACTAGCAGCTCAACCTCGAGCT-3’ i

5’-CGAGGTTGAGCTGCTAGTCCCAGCTGAGG-3’

(sekvenca mutanta SEQ ID NO: 23 i SEQ ID NO: 24).

[0313] Ovi fragmenti su bili insertovani u frejm, u polilinker plazmida p2Luc, izmeĊu restrikcionih mesta ili BamHI i SacI (p.R3X i p.R245X), ili SalI i SacI (svi su ostatak).

[0314] Za ispitivanja proĉitavanja in vitro, dobijeni plazmidi, sa dodatkom testiranih aminoglikozida, bili su transkribovani i translirani korišćenjem TNT Retikulocitnog Lizata Brzo Kuplovanog Transkripcionog/Translacionog Sistema. Aktivnost Luciferaze je odreĊivana posle 90 min inkubacije na 30 °C, koristeći sistem Dual Luciferase Reporter Assay System (Promega™).

[0315] Za ispitivanja proĉitavanja ex vivo, transficirani su konstrukti zaštićeni mutacijama R3X, R245X, Q70X i W1282X, u ćelije HEK-293 sa Lipofectaminom 2000 (Invitrogen), a dodavanje testiranih jedinjenja, je obavljeno 6 h posle transficiranja. Ćelije su sakupljane nakon 16 h inkubacije sa testiranim aminoglikozidima. Proĉitavanje zaustavnih kodona je izraĉunavano ko što je ranije opisano (videti, Grentzmann, G. et al., RNA, 1998, 4, p.479.)

Rezultati pročitavanja:

[0316] Na poĉetku, uticaj hiralne C5"-metil grupe na potencijal proĉitavanja je vrednovan na pseudo-trisaharidima NB118 i NB119, korišćenjem sistema za testiranje dualnog reportera luciferaze, kao što je opisano gore. Ukratko, fragmenti DNK su klonirani izmeĊu restrikcionih mesta BamHI i SacI vektora p2luc, a dobijeni konstrukti su transkribovani i translirani korišćenjem TNT sistema brzog kuplovanja transkripcije/translacije. Koliĉina transliranih proizvoda je vrednovana korišćenjem test sistema dualnog reportera luciferaze za izraĉunavanje nivoa supresije. Rezultati, koji predstavljaju proseĉne vrednosti iz tri nezavisna eksperimenta, sabrani su na Slikama 2A-F.

[0317] Slike 2A-F pedstavljaju rezultate proĉitavanja testa zaustavnog kodona prikazivanjem komparativnih grafika nivoa supresije zaustavnog kodona in vitro, indukovanog sa NB30 (oznaĉen otvorenim krugovima), sa NB118 (oznaĉen crnim trouglovima), sa NB119 (oznaĉen otvorenim trouglovima) i sa kontrolnim lekom gentamicinom (oznaĉen crnim pravougaonicima), za seriju konstrukta, u kontekstu besmislene mutacije, predstavljanjem raznih genetskih bolesti (u zagradi), gde su rezultati, koji se odnose na Konstrukt R3X (USH1) prikazani na Slici 2A, za R245X (USH1) na Slici 2B, za G542X (CF) na Slici 2C, za W1282X (CF) na Slici 2D, za Q70X (HS) na Slici 2E, i gde su rezultati koji se odnose na konstrukt R3381X (DMD) prikazani na Slici 2F.

[0318] Kao što se moţe videti na Slikama 2 A-F, u svim testiranim mutacijama, instaliranje (S)-5"-metil grupe, kao kod NB118), na NB30, dramatiĉno povećava njegovu aktivnost proĉitavanja in vitro, dok je ista za (R)-5"-metil grupu, kao kod NB119), srazmerno mala. Pored toga, u svim testiranim mutacijama (izuzimajući G542X, videti Sliku 2C), aktivnost proĉitavanja NB118 je bila signifikantno bolja, nego kod kliniĉkog leka gentamicina.

[0319] Isto poboljšanje potentnosti, koje je pripisano dodavanju (S)-5"-metil grupe, ispitano je i u sluĉaju referentnog Primera NB54. Da bi se vrednovalo delovanje stereohemije na C5"-poziciji, sintetizovana su oba C5"-dijastereomera, naime NB122 i NB123. Komparativni testovi supresije in vitro pseudo-trisaharida NB54, NB122, NB123, i kontrolnog leka gentamicina, su obavljeni pod uistim eksperimentalnim uslovima, kao što je opisano gore za jedinjenja referentnih primera NB30, NB54 i NB118, a opaţeni podaci (proseci iz najmanje tri nezavisna eksperimenta) prikazani su na Slikama 3A-F.

[0320] Slike 3A-F predstavljaju rezultate proĉitavanja testa zaustavnog kodona prikazivanjem komparativnih grafika nivoa supresije zaustavnog kodona in vitro indukovanog sa NB54 (oznaĉen crnim krugovima), sa NB122 (oznaĉen crnim trouglovima), sa NB123 (oznaĉen otvorenim trouglovima) i sa gentamicinom (oznaĉen crnim pravougaonicima), za seriju konstrukta, u kontekstu besmislene mutacije, predstavljanjem raznih genetskih bolesti (u zagradi), gde su rezultati koji se odnose na konstrukt R3X (USH1) prikazani na Slici 3A, na R245X (USH1) na Slici 3B, na G542X (CF) na Slici 3C, na W1282X (CF) na Slici 3D, na Q70X (HS) na Slici 3E, i gde su rezultati koji se odnose na konstrukt R3381X (DMD) prikazani na Slici 3F.

[0321] Kao što se moţe videti, na Slikama 3A-F, efikasnost proĉitavanja je suštinski razliĉita za razliĉite testirane konstrukte i jedinjenja, bez oĉigledne zavisnosti efikasnosti proĉitavanja na uvedenim tipovima modifikacija na aminoglikozidu. Ipak, u svim testiranim mutacijama (izuzimajući R3X i Q70X, Slika 3A i Slika 3E), NB122 je indukovao najveći nivo proĉitavanja, a slede ga NB123, NB54 i gentamicin. Sekvenca UGA C tetrakodona (R3X) pokazala je najbolje proĉitavanje translacije u poreĊenju sa UGA A i UGA G, stim da je tetrakodon UAG C najmanje efikasan, saglasno sa ranijim opaţanjima.

[0322] Da bi se dalje vrednovao potencijal proĉitavanja NB122 i NB123, njihova aktivnost je testirana na kultivisanim ćelijama sisara, korišćenjem ĉetiri razliĉita plazmida dvojnog reportera luciferaze, koji se odnose na PCDH15-R3X i PCDH15-R245X i besmislenu mutaciju u USH1, na IDUA-Q70X i besmislenu mutaciju u HS, i na CFTR-W1282X i besmislenu mutaciju u CF. Ovi konstrukti reportera su isti oni koji su predstavlejni gore u ispitivanjima in vitro, i imaju jasnu prednost u kontroli razlika u nivoima mRNK, izmeĊu normalne i sekvence koja sadrţi besmislicu, u odnosu na one za pojedinaĉnog reportera ili na direktnu analizu prtoeina.

[0323] Ovi konstrukti se transficiraju u soj ćelija bubrega humanog embriona (HEK-293), pa se inkubiraju sa razliĉitim koncentracijama NB122, NB123, NB54 i kontrolnog leka gentamicina, a rezultati su prkazani na Slikama 4A-D.

[0324] Slike 4A-D prikazuju ex vivo supresiju PCDH15-R3X (Slika 4A), PCDH15-R245X (Slika 4B), IDUA-Q70X (Slika 4C) i CFTR-W1282X (Slika 4D) besmislenih mutacija, pod uticajem referentnog primera NB54 (oznaĉen crnim krugovima), NB122 (oznaĉen crnim trouglovima), NB123 (oznaĉen otvorenim trouglovima) i kontrolnog leka gentamicina (oznaĉen crnim pravougaonicima).

[0325] Kao što je gore opisano, konstrukti plazmida p2luc, koji se odnose na mutacije R3X, R245X, Q70X i W1282X, transficirani su u ćelije HEK-293, korišćenjem lipofektamina 2000, a testirana jedinjenja se dodaju 6 h posle transfiiiciranja. Ćelije se sakupe posle 16 h inkubiranja, a aktivnost luciferaze se odreĊuje korišćenjem sistema testiranja dualnog reportera luciferaze (Promega™). Proĉitavanje zaustavnog kodona se izraĉunava kao što je već opisano, a rezultati predstavljaju proseĉne vrednosti iz najmanje tri nezavisna eksperimenta.

[0326] Kao što se moţe videti na Slikama 4A-D, u svim testiranim mutacijama, opaţena je efikasnost proĉitavanja, indukovana sa aminoglikozidom, sa sledećim redosledom NB122 ≥ NB123 > NB54 > gentamicin. Ovaj trend za NB122 i NB123 je sliĉan onom koji je opaţen za supresiju istih zaustavnih mutacija in vitro (videti, Slike 3A-F), iako je razmak u razlici potencijala izmeĊu NB122 i NB123 manji, od opaţenog za supresiju istih mutacija u ekstraktima bez ćelija.

[0327] Signifikantno veći potencijali proĉitavanja su opaţeni za oba NB122 i NB123, u poreĊenju sa referentnim primerom NB54, za R3X i Q70X (videti, Sliku 4A i Sliku 4C), a znatno su se razlikovali u odnosu na iste mutacije in vitro (Slika 3A i Slika 3E). Ovi podaci mogu ukazivati na bolju permeabilnost ćelija za oba NB122 i NB123, u odnosu na referentni primer NB54, zahvaljujući prisustvu 5"-metil grupe.

[0328] Nekoliko kombinacija gore pomenutih farmakofornih taĉaka u jednom molekulu, ukljuĉujući N1-AHB sa (R)-6’-metil grupom, dalo je poznato jedinjenje NB84 (referentni primer), a N1-AHB, sa (S)- i (R)-5"-metil grupama, je dalo egzemplarna jedinjenja NB122 i NB123, u skladu sa nekim realizacijama ovog pronalaska. Pokazano je da sva ova egzemplarna jedinjenja pokazuju signifikantno poboljšanu aktivnost proĉitavanja u odnosu na matiĉne strukture, a da se citotoksiĉnost nastalih novih struktura nije signifikantno promenila. Jedan od predmeta ovog ispitivanja bilo je testiranje dodatnih kombinacija gornjih elemenata. Takva kombinacija je (R)-6’-metil grupa sa bilo kojom od (S)-5"-metil grupe ili (R)-5"-metil grupe, u jednom molekulu. Zato su dobijena i testirana egzemplarna jedinjenja NB124 i NB125. Ova kombinacija poslednje hiralne metil grupe sa N1-AHB grupom, dala je dva egzemplarna jedinjenja NB127 i NB128.

[0329] Kao i u prethodnom sluĉaju, uticaj ove dve hiralne metil grupe na potencijal proĉitavanja ocenjivan je in vitro, na pseudo-trisaharidima NB124 [(R)-6’, (S)-5"] i NB125 [(R)-6’, (R)-5"], korišćenjem sistema testa dualnog reportera luciferaze, kao što je gore opisano, a rezultati su prikazani na Slikama 5A-B i Slikama 6A-F.

[0330] Slike 5A-D predstavljaju komparativne grafike rezultata in vitro testova supresije prevremene mutacije zaustavnog kodona za CFTR-G542X (Slika 5A i Slika 5C), i za CFTR-W1282X (Slika 5B i Slika 5D), ostvarenih sa egzemplarnim jedinjenjima, u skladu sa nekim realizacijama ovog pronalaska, sa NB124 (oznaĉen crnim krugovima), sa NB125 (oznaĉen otvorenim krugovima), sa NB127 (oznaĉen crnim trouglovima), sa NB128 (oznaĉen otvorenim trouglovima), sa referentnim primerom NB74 (oznaĉen praznim rombovima), sa referentnin primerom NB84 (oznaĉen crnim rombovima), i sa konntrolnim lekovima gentamicinom (oznaĉen crnim pravougaonicima) i G418 (oznaĉen praznim pravougaonicima).

[0331] Slike 6A-F daju rezultate proĉitavanja testa zaustavnog kodona prikazivanjem komparativnih grafika in vitro proĉitavanja nivoa zaustavnog kodona, izazvanog sa NB124 (oznaĉen crnim krugovima), sa NB125 (oznaĉen otvorenim krugovima), referentnim primerom sa NB74 (oznaĉen praznim rombovima) i sa kontrolnim lekom gentamicinom (oznaĉen crnim pravougaonicima), u seriji konstrukta, u kontekstu besmislene mutacije, predstavljanjem raznih genetskih bolesti (u zagradi), gde su rezultati koji se odnose na konstrukt R3X (USH1) prikazani na Slici 6A, na R245X (USH1) na Slici 6B, na G542X (CF) na Slici 6C, na W1282X (CF) na Slici 6D, na Q70X (HS) na Slici 6E, i gde su rezultati koji se odnose na R3381X (DMD) konstrukt prikazani na Slici 6F.

[0332] Kao što se moţe videti sa Slika 5A-B i Slika 6A-F, dodavanje (S)-5"-metil grupe u strukturu poznatog jedinjenja NB74 (referentni primer), dajući NB124, signifikantno povećava aktivnost proĉitavanja in vitro, dok je za (R)-5"-metil grupu (u jedinjenju NB125) to isto manje. Pored toga, u svim testiranim mutacijama aktivnost proĉitavanja NB124 je signifikantno poboljšana, u poreĊenju sa istom za kliniĉki lek gentamicin. Prema tome, dve metil grupe (R)-6’-metil i (S)-5"-metil u jedinjenju NB124 deluju aditivno ili sinergistiĉki na poboljšanje aktivnosti proĉitavanja, u poreĊenju sa NB30 (referentni primer), sa NB74 (referentni primer) i sa NB118.

Konverzije bilo koga od NB30 do NB74 do NB124 (zapravo adicija prve (R)-6’-metil grupe na NB30, dajući NB74, a zatim još i adicija (S)-5"-metil na NB74, dajući NB124), ili NB30 na NB118 na NB124 (zapravo adicija prve (S)-5"-metil grupe na NB30, dajući NB118, a zatim još i adicija (R)-6’-metil grupe na NB118, dajući NB124), utiĉu aditivno na postepeno povećavanje opaţene aktivnosti nastalih struktura.

[0333] Interesantno, sliĉan aditivni efekat je opaţen takoĊe kada su gornje dve metil grupe kombinovane u NB124 i NB125, sa N1-AHB grupom, dajući jedinjenja NB127 i NB128, respektivno, što je prikazano na Slikama 5C-D i i Slikama 7A-F.

[0334] Slike 7A-F daju rezultate proĉitavanja testa zaustavnog kodona prikazivanjem komparativnih grafika nivoa supresije zaustavnog kodona in vitro, indukovane sa NB84 (referentni primer; oznaĉen crnim rombovima), sa NB127 (oznaĉen crnim trouglovima), sa NB128 (oznaĉen otvorenim trouglovima), sa G418 (oznaĉen praznim pravougaonicima) i sa gentamicinom (oznaĉen crnim pravougaonicima) u seriji konstrukta, u kontekstu besmislene mutacije, predstavljanjem raznih genetskih bolesti (u zagradi), gde su rezultati koji se odnose na konstrukt R3X (USH1) prikazani na Slici 7A, na R245X (USH1) na Slici 7B, na G542X (CF) na Slici 7C, na W1282X (CF) na Slici 7D, na Q70X (HS na Slici 7E i gde su rezultati koji se odnose na R3381X (DMD) konstrukt prikazani na Slici 7F.

[0335] Kao što se moţe videti na Slikama 5C-D i Slikama 7A-F, NB127, koji sadrţi (S)-5"-metil grupu, je signifikantno potentniji nego NB128, koji sadrţi (R)-5"-metil grupu. Pored toga, oba NB127 i NB128, su signifikantno jaĉi izazivaĉi proĉitavanja, mego odgovarajući pandani, koji ne poseduju AHB ostatak na poziciji N1 (naime NB124 i NB125) i jedinjenje NB84, koje sadrţi samo (R)-6’-metil i N1-AHB.

[0336] Primećeno je ovde, da u nekoliko konteksta mutacija, kao što su G542X, W1282X i Q70X, NB127 pokazuje sliĉnu ili veću aktivnost nego G418, i još, da se u svim do danas obavljenim testovima in vitro, G418 smatra najjaĉim izazivaĉem proĉitavanja. Opaţanje da NB127 moţe da prevaziĊe aktivnost G416, a pri tome pokazuje niţu toksiĉnost nego G418 (videti Tabelu 2), pokazuje benefite prikazanih jedinjenja u skladu sa nekim realizacijama ovog pronalaska.

[0337] Podatke o opaţenoj aktivnosti in vitro, podrţavaju i komparativni testovi ex vivo, prikazani na Slikama 8-10.

[0338] Slike 8A-D predstavljaju komparativne grafike rezultata ex vivo testova supresije prevremene mutacije zaustavnog kodona, obavljene na konstruktu CFTR-G542X (Slika 8A i 8C), na CFTR-W1282X (Slika 8B i 8D) izvedene na NB124 (oznaĉen crnim krugovima), na NB125 (oznaĉen otvorenim krugovima), na NB127 (oznaĉen crnim trouglovima), na NB128 (oznaĉen otvorenim trouglovima), na NB74 (referentni primer; oznaĉen praznim rombovima), na NB84 (referentni primer; oznaĉen crnim rombovima) i na kontrolnim lekovima gentamicinu (oznaĉen crnim pravougaonicima) i G418 (oznaĉen praznim pravougaonicima).

[0339] Slike 9A-E daju rezultate proĉitavanja testa zaustavnog kodona prikazivanjem komparativnih grafika ex vivo nivoa supresije zaustavnog kodona, izazvanih sa NB124 (oznaĉen crnim krugovima), sa NB125 (oznaĉen otvorenim krugovima), sa NB74 (referentni primer; oznaĉen crnim rombovima) i sa kontrolnim lekovima gentamicinom (oznaĉen crnim pravougaonicima) i G418 (oznaĉen praznim pravougaonicima), na seriji konstrukta, u kontekstu besmislene mutacije, predstavljanjem raznih genetskih bolesti (u zagradi), gde su rezultati koji se odnose na konstrukt R3X (USH1) prikazani na Slici 9A, na R245X (USH1) na Slici 9B, na Q70X (HS) na Slici 9C, na W1282X (CF) na Slici 9D i na G542X (CF) na Slici 9E.

[0340] Slike 10A-E daju rezultate proĉitavanja testa zaustavnog kodona prikazivanjem komparativnih grafika ex vivo nivoa supresije zaustavnog kodona, izazvanih sa NB127 (oznaĉen crnim pravougaonicima), sa NB128 (oznaĉen otvorenim trouglovima), sa NB84 (referentni primer; oznaĉen crnim rombovima) i sa kontrolnim lekovima gentamicinom (oznaĉen crnim pravougaonicima) i G418 (oznaĉen praznim pravougaonicima), na seriji konstrukta, u kontekstu besmislene mutacije, predstavljanjem raznih genetskih bolesti (u zagradi), gde su rezultati koji se odnose na konstrukt R3X (USH1) prikazani na Slici 10A, na R245X (USH1 na Slici 10B, na Q70X (HS) na Slici 10C, na W1282X (CF) na Slici 10D i na G542X (CF) na Slici 10E.

[0341] Kao što se moţe videti na Slikama 8-10, u svim testiranim mutacijama, opaţena je efikasnost proĉitavanja, indukovana sa aminoglikozidom, sa sledećim redosledom: NB124 > NB125 > NB74 > gentamicin i NB127 ≥ NB128 > NB84 > gentamicin. Ovi trendovi su sliĉni onima koji su opaţeni za supresiju istih zaustavnih mutacija in vitro (videti, Slike 5-7), iako je razmak u razlici potencije izmeĊu NB127 i NB128 manji, nego za opaţenu supresiju istih mutacija in vitro u ekstraktima bez ćelija.

PRIMER 3

ĆELIJSKA TOKSIČNOST U ODNOSU NA PROČITAVANJE

[0342] Da bi se osigurala pogodna vitalnost ćelija za svako od testiranih jedinjenja pri testiranim koncentracijama, ćelijska toksiĉnost je odreĊivana za svako jedinjenje, preko odreĊivanja vrednosti polovine maksimalne letalne koncentracije (LC50), na ćelijama HEK-293 i HFF (fibroblasti humanog prepucijuma).

[0343] Procenti vitalnosti ćelija su izraĉunavani kao odnos izmeĊu broja ţivih ćelija u gajenim kulturama, u prisustvu testiranih jedinjenja, u odnosu na kulture koje su gajene po identiĉnom protokolu, ali bez testiranih jedinjenja. Ovi rezultati predstavljaju proseĉne vrednosti iz najmanje tri nezavisna eksperimenta.

[0344] Slike 11A-D predstavljaju semilogaritamske grafike in vitro inhibicije translacije za prokariote (oznaĉen crnim krugovima) i eukariote (oznaĉen otvorenim krugovima), sistema merenih za NB118 (Slika 11A), za NB119 (Slika 11B) za NB122 (Slika 11C) i za NB123 (Slika 11D).

[0345] Slike 12A-D predstavljaju semilogaritamske grafike procenata ex vivo ćelijske vitalnosti, u zavisnosti od testiranog jedinjenja, na sojevima ćelija HEK-293 (Slika 12A i Slika 12C) i humanih fibroblasta prepucijuma (HFF) (Slika 12B i Slika 12D), za gentamicin (oznaĉen praznim pravougaonicima), za NB118 (oznaĉen otvorenim krugovima), za NB119 (oznaĉen crnim krugovima), za NB122 (oznaĉen otvorenim trouglovima), i za NB123 (oznaĉen crnim trouglovima).

[0346] Vrednosti polovine maksimalne letalne koncentracije (LC50) dobijene su fitovanjem krivih koncentracija-odgovor, za podatke iz najmanje tri nezavisna eksperimenta, korišćenjem softvera GraFit 5.

[0347] Prokariotska i eukariotska inhibicija translacije kvantitativno je odreĊivana testovima kuplovane transkripcije/translacije, korišćenjem detekcije aktivne luciferaze, koji su obavljeni kao što je opisano gore. Vrednosti MIC su odreĊivane korišćenjem metode dvostrukog mikrorazblaţivanja, sa dve razliĉite polazne koncentracije, za svako testirano jedinjenje (384 µg/mL i 6,144 µg/mL). Svi eksperimenti su obavljani u duplikatu, a anlogni rezultati su dobijeni iz tri razliĉita ekspeimenta. U svim biološkim testovima, svi testirani aminoglikozidi su bili u oblicima njihove sulfatne soli. Prikazane koncentracije se odnose na oblik slobodnog amina svakog aminoglikozida.

[0348] Tabela 1 prikazuje komparativne ćelijske toksiĉnosti, eukariotske i prokariotske inhibicije translacije, i testove antibakterijske aktivnosti, dobijene za gentamicin, paromomicin, ranije objavljene referentne primere NB30 i NB54, i za egzemplarna jedinjenja NB118, NB119, NB122 i NB123.

Tabela 1

[0349] PoreĊenje opaţenih podataka o ćelijskoj toksiĉnosti u Tabeli 1, sa podacima o aktivnostiu proĉitavanja na Slikama 2-4, pokazuje da ugradnja (S)-5"-metil grupe u NB30, koja daje NB118, ili u NB54, koja daje NB122, ne utiĉe signifikantno na citotoksiĉnost (vrednosti LC5021.4 i 23.5 mM, za NB30 i NB118, respektivno, i 6.1 i 10.1 mM za NB54 i NB122, respektivno, za ćelije HEK-293), a znatno povećava aktivnost za opaţenu supresiju zaustavnog kodona (NB30 < NB118 i NB54 < NB122). Sliĉna ćelijska toksiĉnost je opaţena u sluĉaju NB122 i NB54, u ćelijama HEK-293 i HFF (videti, Tabelu 1), zajedno sa suštinski povišenom aktivnošću supresije NB122, u odnosu na NB54, i u in vitro i ex vivo kultivisanim ćelijama, što ukazuje da NB122 moţe predstavljati bolji izbor od NB54 u terapiji supresije.

[0350] Komparativni podaci ex-vivo supresije na Slici 4 pokazuju samo malu prednost NB122 u odnosu na NB123, dok podaci o ćelijskoj toksiĉnosti u Tabeli 1 ukazuju na mali (ćelije HEK-293) do signifikantno bolji (ćelije HFF) profil ćelijske toksiĉnosti NB123, u odnosu na NB122. Stoga, moţe se sporiti oko toga da li in vivo performanse dijastereomera NB123 mogu biti bolje nego NB122. Pored toga, nedavno ispitivanje gentamicina je pokazalo da inverzija apsolutne konfiguracije na jednom atomu ugljenika, iz (S)-6’-gentamicina C2 u (R)-6’-gentamicin C2, signifikantno smanjuje ćelijsku toksiĉnost i oĉiglednu nefrotoksiĉnost (R)-dijastereomera, u poreĊenju sa (S)-dijastereomerom, kao što je odreĊeno u ćelijskoj kulturi i ispitivanjma na ţivotinjama, a pri tome bez uticaja na bakterijsku efikasnost.

[0351] Na osnovu ovakvih opaţanja je jasno da dodatni testovi toksiĉnosti, ukljuĉujući nefrotoksiĉnost i ototoksiĉnost, mogu da na zadovoljavajući naĉin reše glavne nedostatke poznatih aminoglikozida, i opravdaju opaţenu korist bilo kog od NB122 ili NB123, u odnosu na NB54 i na gentamicin.

[0352] Snaţni uticaj (S)-5"-metil grupe na povećanje aktivnosti proĉitavanja NB118 i NB122, potvrĊuju i opaţeni podaci za eukariotsku inhibiciju translacije (videti, Tabelu 1). Efikasnost sa kojom NB122 (vrednost polovine maksimalne inhibitorske koncentracije IC50= 5.2 µM) inhibira eukariosku translaciju, je veća nego za NB118 (IC50= 16.0 µM) i za NB54 (IC50= 24.0 µM), sliĉno opaţenom trendu za aktivnost proĉitavanja, naime NB122 > NB118 > NB54 (videti, Slike 2-4). Pored toga, poreĊenje vrednosti IC50za NB118 i NB122, sa istima za njihove matiĉne strukture NB30 i NB54 (vrednosti IC5031 i 24 µM, respektivno), otkriva da su NB118 i NB122 1.9-puta i 4.6-puta specifiĉniji prema eukariotskom ribozomu, nego njihovi matiĉni NB30 i NB54, što ukazuje da je opaţeni uticaj (S)-5"-metil grupe na povećanje aktivnosti proĉitavanja u NB118 i NB122 povezan sa njihovom povećanom specifiĉnosti prema eukariotskom ribozomu. Tabela 2 prikazuje komparativne rezultate za ćelijsku toksiĉnost, eukariotsku i prokariotsku inhibiciju translacije i antibakterijsku aktivnost, u testovima dobijenim za gentamicin, G418, ranije objavljene NB74 i NB84 i egzemplarna jedinjenja NB124, NB125, NB127 i NB128.

Tabela 2

[0353] Kao što se moţe videti u Tabeli 2, poreĊenje podataka opaţene ćelijske toksiĉnosti u Tabeli 2, sa podacima o aktivnosti proĉitavanja, prikazanim na Slikama 8-10, pokazuje da jedinjenja u skladu sa nekim realizacijama ovog pronalaska, kao što su NB124, NB125, NB127 i NB128, pokazju pribliţno isti nivo ćelijske toksiĉnosti kada se isti poredi sa ranije opisanim jedinjenjima, sa izuzetkom NB128, na primeru citotoksiĉnosti u humanim fibroblastima prepucijuma (HFF).

[0354] Pored toga, sliĉno ranije opisanim jedinjenjima, nova jedinjenja NB124, NB125, NB127 i NB128 ne pokazuju signifikantnu antibakterijsku aktivnost ni prema E. coli, ni prema B. subtilis (videti, Tabelu 2, gore). Ove podatke dalje potvrĊuje njihova drastiĉno smanjena inhibicija sinteze prokariotskog proteina (Tabela 2), u poreĊenju sa standardnim aminoglikozidnim antibioticima, a to je u skladu sa opštim trendom da su aminoglikozidi sa smanjenom inhibicijom prokariotske translacije takoĊe manje citotoksiĉni, verovatno zbog umanjene inhibicije sinteze mitohondrijalnog proteina.

PRIMER 4

ANTIBAKTERIJSKA AKTIVNOST

[0355] Rezultati testova antimikobne aktivnosti za egzemplarna jedinjenja, u skladu sa realizacijama ovog pronalaska, prikazani su u Tabelama 1 i 2.

[0356] Ranije je pokazano da su jedinjenja, kao što su NB30, NB54, NB74 i NB84 (referentni primeri), oko 10-struko slabiji inhibitori prokariotskih translacija, nego gentamicin i paromomicin, a pored toga, skoro da ne pokazuju baktericidnu aktivnost protiv i G-negativnioh i G-pozitivnih bakterija. Ovi eksperimenti treba da odrede da li jedinjenja u skladu sa nekim realizacijama ovog pronalaska, kao što su NB118, NB119, NB122, NB123, NB124, NB125, NB127 i NB128, zadrţavaju sliĉna svojstva.

[0357] Prema tome, egzemplarna jedinjenja NB118, NB119, NB122, NB123, NB124, NB125, NB127 i NB128 su ispitana kao antibakterijski agensi protiv G-negativnih (Escherichia coli) i protiv G-pozitivnih (Bacillus subtilis) bakterija, zajedno sa njihovim aktivnostima prokariotske anti-translacije (videti, Tabela 1 i Tabela 2).

[0358] Kao što se moţe videti u Tabeli 1 i Tabeli 2, izmerene vrednosti IC50pokazuju da je efikasnost, sa kojom egzemplarna jedinjenja u skladu sa nekim realizacijama ovog pronalaska inhibiraju prokariotski ribozom, signifikantno niţa od iste za paromomicin i gentamicin, saglasno sa opaţenim antibakterijskim podacima za ovaj skup jedinjenja; dok gentamicin i paromomicin pokazuju signifikantne antibakterijske aktivnosti prema sojevima, E. coli i B. subtilis, egzemplarna jedinjenja, u skladu sa nekim realizacijama ovog pronalaska, nemaju znaĉajnu antibakterijsku aktivnost.

[0359] Opaţeni podaci za NB118, NB119, NB122, NB123, NB124, NB125, NB127 i NB128, su sliĉni onima koji su opaţeni za referentne primere NB30, NB54, NB74 i NB84, potvrĊujući dalje kod aminoglikozida objavljenu korelaciju izmeĊu prokariotske anti-translacione aktivnosti i vrednosti MIC, naime, da je smanjenje inhiibicije prokariotske translacije povezano sa smanjenjem antibakterijske aktivnosti.

[0360] Pored toga, opaţena kontinualna nesposobnost referentnih primera NB30, NB54, NB74 i NB84, kao i NB118, NB119, NB122, NB123, NB124, NB125, NB127 i NB128, da pokaţu signifikantnu antibakterijsku aktivnost, povezanu sa njihovom smanjenom specifiĉnosti prema prokariotskom ribozomu, sugeriše da smanjenjem specifiĉnosti prema prokariotskom ribozomu, a time gubljenjem njihove antibakterijske aktivnosti, moţe da se smanji delovanje na mašineriju sinteze eukariotskog mitohondrijskog proteina, i time signifikantno smanje njihovi toksiĉni efekti na humana bića. Ovakvo gledište potvrĊuje ĉinjenica da je mašinerija sinteze mitohondrijskog proteina sisara vrlo sliĉna prokariotskoj mašineriji, i da toksiĉnost, indukovana aminoglikozidom, moţe bar delimiĉno, biti povezana sa disfunkcijom mitohondrijalnog ribozoma, koja je posredovana lekom.

[0361] Opaţena signifikantno povećana eukaritoska anti-translaciona aktivnost (koja stvarno meri samo inhibiciju sinteze ciitoplazmiĉnog proteina, a ne i sintezu mitohondrijalnog proteina), zajedno sa signifikantno smanjenom citotoksiĉnošću jedinjenja NB118, NB119, NB122, NB123, NB124, NB125, NB127 i NB128 (u poreĊenju sa gentamicinom i paromomicinom), dodatno potvrĊuje ovakvo mišljenje.

PRIMER 5

EUKARIOTSKA - PROKARIOTSKA SELEKTIVNOST

[0362] Kao što je diskutovano gore, da bi postao vredan kandidat za lek, koji bi mogao da se koristi za tretiranje genetskih bolesti izazvanih prevremenim mutacijama zaustavnog kodona, neki aminoglikozid treba da bude ne-toksiĉan i da stupa u inteakciju sa eukariotskim citoplazmiĉnim ribozomima. Osobina netoksiĉnosti se moţe proveriti peko gubitka antimikrobne aktivnosti, što znaĉi da taj lek treba da u manjoj meri inhibira prokariotsku translaciju, a stoga je najverovatnije da neće inhibirati mitohondrijalnu translaciju. Prisustvo ovako benefitne kombinacije ţeljenih kvaliteta u nekom aminoglikozidu, kao što su jedinjenja koja su ovde data, moţe se pokazati preko odnosa selektivne aktivnosti eukariotske u odnosu na prokariotsku.

[0363] Moţe se takoĊe reći da primetna selektivnost nekog aminoglikozidnog jedinjenja prema inhibiranju translacije u eukariotu, prema inhibiciji translacije u prokariotu, moţe da se upotrebi za predviĊanje njegove efikasnosti i bezbednosti kao kandidata za lek za tretiranje genetskiih poremećaja, povezanih sa prevremenim mutacijama zaustavnog kodona.

[0364] Tabela 3 utvrĊuje i poredi rezultate dobijene za niz egzemplarnih poznatih aminoglikozida i ovde opisanih egzemplarnih aminoglikozida, u testovima inhibicije translacije, koji su obavljeni u eukariotskim i prokariotskim ribozomalnim sistemima. Za svako jedinjenje takoĊe je naglašen tip taĉke farmakofora, koji se pokazuje u tom jedinjenju (koji je prikazan u Shemi 1, gore). U Tabeli 3, farmakoforne taĉke su oznaĉene sa: "i" za hidroksilnu grupu na poziciji 6’; sa "ii" za AHB grupu na poziciji N1; sa "iii" za treći saharidni ostatak, ili "Prsten III"; sa "iv" za metil na poziciji 6’; i sa "v" za metil na poziciji 5“.

Tabela 3

[0365] U obavljenim biološkim eksperimentima svi testirani aminoglikozidi su bili u obliku njihove sulfatne soli. Koncentracije, navedene u Tabeli 3, odnose se na oblik slobodnog amina, za svaki aminoglikozid. Prokariotska i eukariotska inhibicija translacije kvantitativno je odreĊena u testovima kuplovane transkripcije/translacije, kao što je ranije opisano. Vrednosti polovine maksimalne koncentracije (IC50) dobijene su fitovanjem krivih koncentracija-odgovor za podatke iz najmanje tri nezavisna eksperimenta, korišćenjem softvera GraFit 5. Svi eksperimenti su obavljeni u duplikatu, a analogni rezultati su dobijeni iz tri nezavisna razliĉita eksperimenta.

[0366] Kao što se moţe videti iz Tabele 3, opaţeno je primetno smanjenje odnosa IC50<Euk>/ IC50<Pro>(inhibicija translacije u eukariotu prema inhibiciji translacije u prokariotu), koji opada od proseĉne vrednosti od oko 115 (prosek za odnos referentnih primera NB30, NB54, NB74 i NB84), do proseĉne vrednosti od oko 7 (proseĉan odnos za NB118, NB119, NB122 i NB123) zbog dodavanja ovde opisane farmakoforne taĉke "v", pa do proseĉne vrednosti od oko 1.6 (proseĉan odnos za NB124, NB125, NB127 i NB128) zbog dodavanja ovde opisane farmakoforne taĉke "v" i ranije opisane farmakoforne taĉke "iv".

[0367] Jasno se vidi iz Tabele 3, da egzemplarna aminoglikozidna jedinjenja, u skladu sa nekim realizacijama ovog pronalaska, koja pokazuju svih pet farmakofornih taĉaka, bez obzira na stereo-konfiguraciju na poziociji 5", takoĊe pokazuju najvišu selektivnost eukariota prema prokariotu, naime ova jedinjenja se nalaze visoko na listi mogućih kandidata leka za tretiranje genetskiih poremećaja u humanim bićima.

[0368] Zaista, dok su dobijana i testirana egzemplarna jedinjenja NB124, NB125, NB127 i NB128, naĊeno je da je povećanje inhibicije sinteze prokariotiskog citoplazmiĉkog proteina povezano sa povećanom aktivnošću proĉitavanja. Podaci u Tabeli 3 pokazuju da sistematski, široki razvoj nekog farmakofora moţe postepeno da poveća specifiĉnost novih, dizajniranih jedinjenja prema citoplazmiĉkom ribozomu, a smanji njihovu specifiĉnost prema prokariotskom ribozomu, dok NB127 i NB128, u koje je ubaĉeno svih pet farmakofornih taĉaka, pokazuju obrnutu selektivnost za odnos eukariotskog prema prokariotskom sistemu translacije (ribozom).

[0369] Ovde su registrovna dva opaţanja:

1) dok su standardni aminoglikozidni antibiotici, kao što su gentamicin i paromomicin, 2,214-puta i 1,118-puta selektivniji prema prokariotskom u odnosu na eukariotski ribozom, ova selektivnost kod G418 pada na samo 225-puta, naroĉito zbog njegove komparativno povećane inhibicije eukariotske translacije. Ova jaka inhibicija eukariotske translacije (IC50<Euk>=2 mM) smatra se glavnim uzrokom drastiĉno visoke citotoksiĉnosti G418, a isto tako glavnim uzrokom njegove aktivnosti snaţnog proĉitavanja. Rezultati prikazani u Tabeli 3 pokazuju, da iako povećana inhibicija eukariotske translacije zaista potvrĊuje njegovu snaţnu aktivnost proĉitavanja, da inhibicija eukariotske translacije nije jedino toksiĉno dogaĊanje u G418, već su sa njegovom toksiĉnošću povezani ostalih jedan ili više efekata G418 na eukariotske ćelije. U skladu sa podacima datim u Tabeli 3, nekoliko jedinjenja u skladu sa nekim realizacijama ovog pronalaska, pokazuje sliĉan ili veći potencijal za inhibiciju eukariotske translacije, ukljuĉujući NB124, NB127 i NB128, a ipak su signifikantno manje citotoksiĉni nego G418.

2) opaţena zavisnost vrednosti IC50<Euk>od in vitro aktivnosti proĉitavanja, kod svih testiranih standardnih i sintetskih aminoglikozida, ukazuje na blisku povezanost izmeĊu ova dva parametra, naime, povećanja inhibicije sa povećanom aktivnosti proĉitavanja, kao što ilustruje Slika 13A-B).

[0370] Slike 13A-B prikazuju grafike rasipanja za identifikaciju moguće korelacije izmeĊu aktivnosti proĉitavanja i inhibicije translacije proteina in vitro, u eukariotskim sistemima, opaţenu na skupu poznatih jedinjenja i egzemplarnih jedinjenja, u skladu sa nekim realizacijama ovog pronalaska, pri ĉemu je povećanje inhibicije sinteze proteina (niţe vrednosti IC50) povezano sa povećanjem aktivnosti proĉitavanja, dok Slika 13A predstavlja semilogaritamski grafik eukariotske inhibicije translacije od zavisnosti in vitro aktivnosti proĉitavanja, za 1.4 µM koncentraciju testiranih aminoglikozida (prikazano na X-osi), koristeći šest razliĉitih besmislenih mutacija (W1282X, Q70X, R3X, R245X, G542X i R3381X), a Slika 1B je linearni grafik istih podataka prikazanih na Slici 13A.

[0371] Treba napomenuti da pošto aktivnost proĉitavanja zavisi od doze, a takoĊe je pod uticajem razliĉitih faktora, ukljuĉujući identitet zaustavnog kodona, ĉetvrte baze u silaznom smeru od mesta zaustavljanja, i konteksta sekvence oko zaustavnog kodona, podaci, koji su prikazani na Slici 13, sakupljeni su upotrebljavajući samo jednu koncentraciju (1.4 µM), u kojoj su testirana sva jedinjenja, i serija razliĉitih konstrukta, koju predstavljaju 6 razliĉitih konstrukta za 4 razliĉita modela bolesti. Prema tome, povećanje specifiĉnosti i selektivnosti prema prokariotskom ribozomu vodi ka povećanju ţeljene biološke aktivnosti ovih jedinjenja, sa umanjenom toksiĉnošću.

[0372] Sledeće zapaţanje ovih pronalazaĉa obuhvata ranije objavljeno jedinjenje, referentni primer NB33, koje je u suštini dimer paromamina, u kome su dva ostatka paromamina povezana metilenskim mostom preko 3’-kiseonika. Ovaj NB33 je veoma specifiĉan prema eukariotskom ribozomu i inhibira sintezu proteina sa vrednošću IC50<Euk>od 1.1 mM, prema skoro dvostrukom za G418 (IC50<Euk>2.0 mM). MeĊutim, NB33 skoro da nema aktivnost proĉitavanja, što ukazuje da je njegov mehanizam inhibicije razliĉit u odnosu na poznati za aminoglikozide i jedinjenja u skladu sa nekim realizacijama ovog pronalaska, koja pokazuju aktivnost proĉitavanja. Stoga je zakljuĉeno da samo povećavanje potencijala inhibicije aminoglikozida nije neophodno praćeno sa povećanjem aktivnosti proĉitavanja. Ova korelacija treba da sa razmatra za ona aminoglikozidna jedinjenja koja inhibiraju proces translacije po istom mehanizmu, naime za proces autentiĉnog proĉitavanja. Zaista, nedavno ispitivanje interakcije NB33 sa humanim A-mestom na modelu rRNK oligonukleotida, pokazalo je da se NB33 vezuje i da stabilizuje A-mesto u nekoj nekodiranoj konformaciji, pa kao takav blokira korak transformacije ribozoma.

[0373] Iako je ovaj pronalazak opisan u vezi sa njegovim specifiĉnim realizacijama, oĉigledno je da postoje mnoge altenative, modifikacije i varijacije, koje su oĉigledne onima koji su verzirani u stanju tehnike. Prema tome, namera je da sve altenative, modifikacije i varijacije budu obuhvaćene unutar obima i šireg obima prikljuĉenih patentnih zahteva.

LISTA SEKVENCI

[0374]

<110> Technion Research & Development Foundation Ltd.

Baasov, Timor

Atia-Glikin, Dana

Kandasamy, Jeyakumar

Belakhov, Valery

<120> AMINOGLYKOSIDES AND USES THEREOF IN TREATING GENETIC DISORDERS

<130> 51817

<150> US 61/414,956

<151> 2010-11-18

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 43

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Single strand DNA oligonucleotide <400> 1

gatcccagaa gatgtttcga cagttttatc tctggacaga gct 43

<210> 2

<211> 33

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Single strand DNA oligonucleotide

<400> 2

ctgtcagaga taaaactgtc gaaacatctt ctg 33

<210> 3

<211> 43

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Single strand DNA oligonucleotide

<400> 3

gatcccagaa gatgttttga cagttttatc tctggacaga gct 43 <211> 33

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Single strand DNA oligonucleotide

<400> 4

ctgtcagaga taaaactgtc aaaacatctt ctg 33

<210> 5

<211> 48

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Single strand DNA oligonucleotide

<400> 5

gatccaaaat ctgaatgaga ggcgaaccac caccaccacc ctcgagct 48

<210> 6

<211> 40

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Single strand DNA oligonucleotide

<400> 6

cgagggtggt ggtggttgtt cgcctctcat tcagattttg 40

<210> 7

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Single strand DNA oligonucleotide

<400> 7

gatccaaaat ctgaatgaga ggtgaaccac caccaccacc ctcgagct 48

<210> 8

<211> 40

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Single strand DNA oligonucleotide

<400> 8

cgagggtggt ggtggttgtt cacctctcat tcagattttg 40

<210> 9

<211> 38

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Single strand DNA oligonucleotide

<400> 9

tcgaccaata tagttcttgg agaaggtgga atcgagct 38

<210> 10

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Single strand DNA oligonucleotide

<400> 10

cgattccacc ttctcgaaga actatattgg 30

<210> 11

<211> 38

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Single strand DNA oligonucleotide

<400> 11

tcgaccaata tagttctttg agaaggtgga atcgagct 38

<210> 12

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Single strand DNA oligonucleotide

<400> 12

cgattccacc ttctcaaaga actatattgg 30

<210> 13

<211> 38

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<223> Single strand DNA oligonucleotide

<400> 13

tcgacaactt tgcaacagtg gaggaaagcc tttgagct 38

<210> 14

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Single strand DNA oligonucleotide

<400> 14

caaaggcttt cctccactgt tgcaaagttg 30

<210> 15

<211> 38

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Single strand DNA oligonucleotide

<400> 15

tcgacaactt tgcaacagtg aaggaaagcc tttgagct 38

<210> 16

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<223> Single strand DNA oligonukleotid

<400> 16

caaaggcttt ccttcactgt tgcaaagttg 30

<210> 17

<211> 38

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Single strand DNA oligonucleotide

<400> 17

tcgacaaaaa acaaattttg caccaaaagg tatgagct 38

<210> 18

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Single strand DNA oligonucleotide

<400> 18

catacctttt ggtgcaaaat ttgttttttg 30

<210> 19

<211> 38

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Single strand DNA oligonucleotide

<400> 19

tcgacaaaaa acaaattttg aaccaaaagg tatgagct 38 <210> 20

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Single strand DNA oligonucleotide

<400> 20

catacctttt ggttcaaaat ttgttttttg 30

<210> 21

<211> 38

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Single strand DNA oligonucleotide

<400> 21

tcgaccctca gctgggacca gcagctcaac ctcgagct 38

<210> 22

<211> 29

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Single strand DNA oligonucleotide cgaggttgag ctgctggtcc cagctgagg 29

<210> 23

<211> 38

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Single strand DNA oligonucleotide

<400> 23

tcgaccctca gctgggacta gcagctcaac ctcgagct 38

<210> 24

<211> 29

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Single strand DNA oligonucleotide

<400> 24

cgaggttgag ctgctagtcc cagctgagg 29

Claims

PATENTNI ZAHTEVI 1. Jedinjenje koje ima opštu formulu I:

ili neka njegova farmaceutski prihvatljiva so, što: R1predstavlja neki alkil, koji ima 1-4 atoma ugljenika; R2predstavlja vodonik ili (S)-4-amino-2-hidroksibutiril (AHB); R3se bira iz grupe koju ĉine vodonik i neki alkil, koji ima 1-4 atoma ugljenika; a stereo-konfiguracija svake pozicije 6’ i pozicije 5", nezavisno predstavlja neka R konfiguracija ili neka S konfiguracija.
2. Jedinjenje prema Zahtevu 1, što R1predstavlja pomenuti alkil.
3. Jedinjenje prema bilo kom od Zahteva 1 i 2, što svaki od R2i R3predstavlja vodonik.
4. Jedinjenje prema bilo kom od Zahteva 1 i 2, što R2predstavlja AHB, a R3je vodonik.
5. Jedinjenje prema bilo kom od Zahteva 1 i 2, što R2predstavlja vodonik, a R3je pomenuti alkil.
6. Jedinjenje prema bilo kom od Zahteva 1 i 2, što R2predstavlja AHB, a R3je pomenuti alkil.
7. Jedinjenje prema Zahtevu 1, što se bira iz grupe koju ĉine:
8. Jedinjenje prema bilo kom od Zahteva 1 – 7, naznaĉeno time, što je odnos vrednosti IC50za inhibiciju translacije u eukariotima, prema vrednosti IC50za inhibiciju translacije u prokariotima niţi od 15.
9. Jedinjenje prema bilo kom od Zahteva 1 – 7, naznaĉeno time, što je vrednost MIC u G-negativnim bakterijama veća od 200 µM, a vrednost MIC u G-pozitivnim bakterijama veća od 20 µM.
10. Farmaceutska kompozicija, što sadrţi jedinjenje prema bilo kom od Zahteva 1-9, i neki farmaceutski prihvatljiv nosaĉ.
11. Farmaceutska kompozicija prema Zahtevu 10, upakovana u neki materijal za pakovanje i identifikovane štampanim slovima na ili u pomenutom materijalu za pakovanje, za upotrebu u tretmanu nekog genetskog poremećaja.
12. Jedinjenje prema bilo kom od Zahteva 1 - 9, za upotrebu u tretmanu nekog genetskog poremećaja.
13. Kompozicija ili jedinjenje za upotrebu, prema Zahtevima 11 ili 12, gde je pomenuti genetski poremećaj povezan sa nekom prevremenom mutacijom zaustavnog kodona i/ili nekim fenotipom skraćivanja proteina.
14. Kompozicija ili jedinjenje za upotrebu, prema bilo kom od Zahteva 11 - 13, pri ĉemu se pomenuti genetski poremećaj bira iz grupe koju ĉine cistiĉna fibroza (CF), Duchenne-ova mišićna distrofija (DMD), ataksija-telagiektazija, Hurler-ov sindrom, hemofilija A, hemofilija B, Usher-ov sindrom i Tay-Sachs.
15. Postupak za dobijanje jedinjenja prema Zahtevu 1, što ga ĉini: (a) dobijanje donorskog jedinjenja, koje ima opštu Formulu II:

gde su: R1je neki alkil, koji ima 1-4 atoma ugljenika; R4je vodonik ili neki donor amino-zaštitne grupe; R5je neki donor amino-zaštitne grupe, ako R4predstavlja vodonik, ili vodonik, ako je R4neki donor amino-zaštitne grupe; svaki od HPd predstavlja neki donor hidroksilne zaštitne grupe; a L je neka odlazeća grupa; (b) kuplovanje pomenutog donorskog jedinjenja sa nekim akceptorskim jedinjenjem, koje ima opštu formulu III

gde: isprekidana linija oznaĉava neku R konfiguraciju ili neku S konfiguraciju; R3se bira iz grupe koju ĉine vodonik i neki alkil, koji ima 1-4 atoma ugljenika; R6neki akceptor amino-zaštitne grupe ili (S)-4-azido-2-O-acetil-1-butiril; HPa je neki akceptor hidroksilne-zaštitne grupe; a APa je neki akceptor amino-zaštitne grupe; i (c) uklanjanja svake od pomenutih amino-zaštitnih grupa i pomenutih hidroksilnih-zaštitnih grupa, dobijajući tako ovo jedinjenje.