ES2833938T3

ES2833938T3 - Aminoglucósidos y usos de los mismos en el tratamiento de trastornos genéticos

Info

Publication number: ES2833938T3
Application number: ES17192028T
Authority: ES
Inventors: Timor Baasov; Dana Atia-Glikin; Jeyakumar Kandasamy; Valery Belakhov
Original assignee: Technion Research and Development Foundation Ltd
Current assignee: Technion Research and Development Foundation Ltd
Priority date: 2010-11-18
Filing date: 2011-11-17
Publication date: 2021-06-16
Anticipated expiration: 2031-11-17
Also published as: WO2012066546A1; US20190224226A9; US9616079B2; US20210228608A1; NO2640734T3; CA2816789A1; SI2640734T1; EP2640734A1; US20170182078A1; IL266495A; PT2640734T; HUE036248T2; IL284067B; SMT201800019T1; CA2816789C; IL284067A; US11865128B2; JP2018123135A; HK1248709A1; JP5960712B2

Abstract

Un compuesto que tiene la fórmula general I: **(Ver fórmula)** o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en la que: R1 es un alquilo que tiene de 1-4 átomos de carbono; R2 es hidrógeno o (S)-4-amino-2-hidroxibutirilo (AHB); R3 se selecciona entre el grupo que consiste en hidrógeno y un alquilo que tiene de 1-4 átomos de carbono; y una estéreo configuración de cada una de las posiciones 6' y la posición 5" es independientemente una configuración R o una configuración S, para su uso en el tratamiento de un trastorno genético en combinación con otro agente útil en el tratamiento de dicho trastorno genético.

Description

DESCRIPCIÓN

Aminoglucósidos y usos de los mismos en el tratamiento de trastornos genéticos

Campo y antecedentes de la invención

La presente invención, en algunas realizaciones de la misma, se refiere a una nueva clase de aminoglucósidos y más particularmente, pero no exclusivamente, a novedosos aminoglucósidos con efectividad mejorada hacia el tratamiento de trastornos genéticos.

Muchos trastornos genéticos humanos son el resultado de mutaciones sin sentido, en las que uno de los tres codones de parada (UAA, UAG o UGA) reemplaza un codón que codifica un aminoácido, conduciendo a la terminación prematura de la traducción y finalmente a proteínas inactivas truncadas. En la actualidad, se conocen cientos de tales mutaciones sin sentido y se demostró que varias explican ciertos casos de enfermedades fatales, incluyendo fibrosis quística (FQ), Distrofia muscular de Duchenne (DMD), ataxiatelangiectasia, Síndrome de Hurler, hemofilia A, hemofilia B, Tay-Sachs y más. Para muchas de esas enfermedades actualmente no existe un tratamiento eficaz, y aunque la terapia génica parece una posible solución potencial para los trastornos genéticos, aún quedan muchas dificultades críticas por resolver antes de que esta técnica pueda usarse en seres humanos.

Se ha demostrado que ciertos aminoglucósidos tienen valor terapéutico en el tratamiento de varias enfermedades genéticas debido a su capacidad para inducir a los ribosomas a leer las mutaciones del codón de parada, generando proteínas de longitud completa a partir de parte de las moléculas de ARNm.

Típicamente, los aminoglucósidos son antibióticos de amplio espectro muy potentes comúnmente usados para el tratamiento de infecciones potencialmente mortales. Se acepta que el mecanismo de acción de los antibióticos aminoglucósidos, tales como paromomicina, implica la interacción con el ribosoma procariótico y, más específicamente, implica la unión al sitio A decodificador del ARN ribosómico 16S, lo que da lugar a la inhibición de la traducción de proteínas y la interferencia con la fidelidad traduccional.

Varios logros en la determinación de la estructura del ribosoma bacteriano, junto con estructuras cristalinas y de RMN de modelos de oligonucleótidos de sitio A bacterianos, han proporcionado información útil para comprender el mecanismo de descodificación en células procariotas y comprender cómo los aminoglucósidos ejercen su deletérea lectura errónea del código genético. Estos y otros estudios han dado lugar a la hipótesis de que la afinidad del sitio A por un complejo de ARNm-ARNt no afín aumenta tras la unión de los aminoglucósidos, impidiendo que el ribosoma discrimine eficazmente entre complejos no afines y afines.

Se cree que el aumento de la supresión de la terminación por los aminoglucósidos en eucariotas se produce en un mecanismo similar a la actividad de los aminoglucósidos en procariotas de interferir con la fidelidad traduccional durante la síntesis de proteínas, a saber, la unión de ciertos aminoglucósidos al sitio ribosómico A probablemente induce cambios conformacionales que estabilizan complejos ARNm-ARNt casi afines, en lugar de insertar el factor de liberación. Se ha demostrado que los aminoglucósidos suprimen diversos codones de parada con eficiencias notablemente diferentes (UGA> UAG> UAA) y la eficacia de la supresión depende además de la identidad del cuarto nucleótido inmediatamente corriente abajo del codón de parada (C> U> A > gramos) así como el contexto de secuencia local alrededor del codón de terminación.

Las características deseadas de un fármaco de lectura completa eficaz serían la administración oral y poco o ningún efecto sobre las bacterias. La actividad antimicrobiana del fármaco de lectura completa no es deseable ya que cualquier uso innecesario de antibióticos, particularmente con respecto a la biota gastrointestinal (GI), debido a los efectos adversos provocados por la alteración del equilibrio de la biota GI y la aparición de resistencias. A este respecto, además de las limitaciones anteriormente mencionadas, la mayoría de los aminoglucósidos clínicos son muy selectivos contra los ribosomas bacterianos y no ejercen un efecto significativo sobre los ribosomas citoplasmáticos de las células humanas.

En un esfuerzo por eludir las limitaciones anteriormente mencionadas, la industria biofarmacéutica está buscando nuevos fármacos para supresión de mutaciones mediante el análisis de grandes bibliotecas químicas para detectar actividades de lectura sin sentido. Usando este enfoque, se ha descubierto un compuesto no aminoglucósido, ácido 3-[5-(2-fluorofenil)-1,2,4-oxadiazol-3-il]benzoico (PTC124). Los hechos de que se informa que PTC124 no tiene actividad antibacteriana y no se ha informado de toxicidad, sugieren que su mecanismo de acción sobre el ribosoma es diferente al de los aminoglucósidos.

El hecho de que los aminoglucósidos podrían suprimir mutaciones sin sentido prematuras en células de mamíferos fue demostrado por primera vez por Burke y Mogg en 1985, quienes también señalaron el potencial terapéutico de estos fármacos en el tratamiento de trastornos genéticos. La primera enfermedad genética examinada fue la fibrosis quística (FQ), el trastorno autosómico recesivo más prevalente en la población caucásica, que afecta a 1 de cada 2500 recién nacidos. La FQ está provocada por mutaciones en la proteína reguladora de la conductancia transmembrana de la fibrosis quística (CFTR, por sus siglas en inglés). En la actualidad, se identificaron más de 1.000 mutaciones diferentes que provocan FQ en el gen CFTR, y el 5-10 % de las mutaciones son codones de parada prematuros. En los judíos Ashkenazi, la mutación W1282X y otras mutaciones sin sentido representan el 64 % de todos los alelos mutantes de CFTR.

Los primeros experimentos de supresión mediada por aminoglucósidos de mutaciones de parada de CFTR demostraron que las mutaciones de parada prematuras encontradas en el gen CFTR podrían suprimirse por miembros de la familia de la gentamicina y geniticina (G-418), según lo medido por la apariencia de CFTR funcional de longitud completa en líneas de células epiteliales bronquiales.

Los experimentos de supresión de tejidos intestinales de mutantes de ratones transgénicos CFTR -/- que llevan un transgén CFTR-G542X humano mostraron que el tratamiento con gentamicina y, en menor medida, tobramicina, han dado como resultado la aparición de proteína CFTR humana en las glándulas de los ratones tratados. De forma más importante, los estudios clínicos con ensayo cruzado, doble ciego, controlado con placebo, han demostrado que la gentamicina puede suprimir las mutaciones de parada en los pacientes afectados y que el tratamiento con gentamicina mejoró la conductancia transmembrana a través de la mucosa nasal en un grupo de 19 pacientes que portaban mutaciones de parada de CFTR. Otros trastornos genéticos para los que se probó el potencial terapéutico de los aminoglucósidos en sistemas in vitro, líneas celulares cultivadas o modelos animales incluyen DMD, Síndrome de Hurler, diabetes insípida nefrogénica, cistinosis nefropática, retinitis pigmentosa y ataxia-telangiectasia.

Sin embargo, una de las principales limitaciones en el uso de aminoglucósidos como productos farmacéuticos es su alta toxicidad para los mamíferos, típicamente expresado en enfermedades renales (nefrotoxicidad) y asociadas al oído (ototoxicidad). Se supone que el origen de esta toxicidad es el resultado de una combinación de diferentes factores y mecanismos tales como interacciones con fosfolípidos, inhibición de fosfolipasas y la formación de radicales libres. Aunque se considera selectivo para los ribosomas bacterianos, la mayoría de los aminoglucósidos se unen también al sitio A eucariota pero con afinidades menores que al sitio A bacteriano. La inhibición de la traducción en células de mamíferos es también una de las posibles causas de la alta toxicidad de estos agentes. Otro factor que se suma a su citotoxicidad es su unión al ribosoma mitocondrial en el sitio A del ARNr 12S, cuya secuencia es muy cercana al sitio A bacteriano.

Se han intentado muchos estudios para comprender y ofrecer formas de aliviar la toxicidad asociada a los aminoglucósidos, incluyendo el uso de antioxidantes para reducir los niveles de radicales libres, así como el uso de poli-L-aspartato y daptomicina, para reducir la capacidad de los aminoglucósidos para interactuar con los fosfolípidos. Recientemente se ha demostrado el papel de la megalina (un receptor endocítico multiligando que es especialmente abundante en los túbulos proximales del riñón y el oído interno) en la captación de aminoglucósidos. La administración de agonistas que compiten por la unión de aminoglucósidos a megalina también dio como resultado una reducción en la absorción y toxicidad de aminoglucósidos. Además, se ha investigado la alteración del programa de administración y/o la manera en que se administran los aminoglucósidos como medio para reducir las toxicidades.

A pesar de los grandes esfuerzos para reducir la toxicidad de los aminoglucósidos, pocos resultados han madurado en prácticas y procedimientos clínicos convencionales para la administración de aminoglucósidos para suprimir mutaciones de parada, distintos de cambios en el horario de administración. Por ejemplo, el uso de dosis sub-tóxicas de gentamicina en las pruebas clínicas probablemente provocó la reducción de la eficiencia de lectura obtenida en los experimentos in vivo en comparación con los sistemas in vitro. El aminoglucósido geneticin® (sulfato G-418) mostró la mejor actividad de supresión de terminación en sistemas de traducción-transcripción in vitro, sin embargo, su uso como agente terapéutico no es posible ya que es letal incluso a concentraciones muy bajas. Por ejemplo, la DL⁵⁰de G-418 contra los fibroblastos humanos es de 0,04 mg/ml, en comparación con 2,5-5,0 mg/ml para gentamicina, neomicina y kanamicina.

La sensibilidad aumentada de los ribosomas eucariotas a algunos fármacos de aminoglucósido, tales como G-418 y gentamicina, es intrigante pero hasta la fecha no se pudo explicar racionalmente debido a la falta de datos estructurales suficientes sobre su interacción con los ribosomas eucariotas. Ya que G-418 es extremadamente tóxico incluso a concentraciones muy bajas, actualmente, la gentamicina es el único aminoglucósido probado en diversos modelos animales y ensayos clínicos. Aunque algunos estudios han demostrado que debido a su toxicidad relativamente menor en células cultivadas, la amikacina y la paromomicina pueden representar alternativas a la gentamicina para la terapia de supresión de mutaciones de parada, todavía no se han informado ensayos clínicos con estos aminoglucósidos.

Hasta la fecha, casi todos los experimentos de supresión se han realizado con aminoglucósidos clínicos disponibles en el mercado, sin embargo, solo un número limitado de aminoglucósidos, incluyendo gentamicina, amikacina y tobramicina, se encuentran en uso clínico como antibióticos para administración interna en humanos. Entre estos, la tobramicina no tiene actividad de supresión de mutaciones de parada y la gentamicina es el único aminoglucósido probado para la actividad de supresión de mutaciones de parada en modelos animales y ensayos clínicos. Recientemente, se demostró que un conjunto de derivados de neamina promueve la lectura completa de la proteína SMN en fibroblastos derivados de pacientes con atrofia muscular espinal (AME); sin embargo, estos compuestos se diseñaron originalmente como antibióticos y no se derivaron conclusiones para una mejora adicional de la actividad de lectura completa de estos derivados.

El documento WO 2007/113841, por algunos de los presentes inventores, enseña una clase de aminoglucósidos derivados de paromomicina, que fueron diseñados específicamente para exhibir una alta actividad de lectura de mutaciones de codones de parada prematuros mientras ejercen una baja citotoxicidad en células de mamíferos y una baja actividad antimicrobiana, y por lo tanto pueden usarse en el tratamiento de enfermedades genéticas. Esta clase de aminoglucósidos derivados de paromomicina se diseñó mediante la introducción de ciertas manipulaciones de un núcleo de paromamina, que dieron lugar a una mayor actividad de lectura y una reducción de la toxicidad y la actividad antimicrobiana. Las manipulaciones se realizaron en varias posiciones del núcleo de paromamina.

Una de estas manipulaciones del núcleo de paromamina que se ha descrito en el documento WO 2007/113841 es la determinación del papel beneficioso de un grupo hidroxilo en la posición 6' del núcleo de aminoglucósido (véase, por ejemplo, NB30 y NB54 a continuación).

(_Iq 6' Anillo I

HO_p Anillo I

HO '-A-O H -'V^l . Anill II

NB30 NB54

Otra manipulación del núcleo de paromamina que se ha definido y demostrado en el documento WO 2007/113841 es la introducción de uno o más restos de monosacárido o un resto de oligosacárido en la posición 3', 5 y/o 6 del núcleo de aminoglucósido. Esta manipulación se refleja como "Anillo III" en los compuestos ejemplares NB30 y NB54 mostrados anteriormente en el presente documento.

Una manipulación adicional del núcleo de paromamina que se ha definido y demostrado en el documento WO 2007/113841 es la introducción de un resto (S)-4-amino-2-hidroxibutirilo (AHB) en la posición 1 del núcleo de paromamina. Esta manipulación se refleja en un compuesto ejemplar NB54 mostrado anteriormente en el presente documento. Se ha demostrado que tal introducción de un resto AHB proporciona una actividad de lectura mejorada y una toxicidad reducida.

Una manipulación adicional del núcleo de paromamina que se ha descrito en el documento WO 2007/113841 es la sustitución de hidrógeno en la posición 6' por un alquilo tal como un sustituyente metilo. Esta manipulación se ha ejemplificado en un derivado de los compuestos NB30 y NB54, denominados NB74 y NB84 respectivamente.

Nudelman, I., y col., Bioorg Med Chem, 2010. 18(11): p. 3735-46 también se refiere a los compuestos denotados como NB74 y NB84 y describe su toxicidad celular reducida y su efectividad de lectura superior en comparación con la gentamicina.

Los antecedentes de la técnica adicionales incluyen Nudelman, I., y col., Bioorg Med Chem Lett, 2006. 16(24): p.6310 5; Hobbie, S. N., y col., Nucleic Acids Res, 2007. 35(18): p. 6086-93; Kondo, J., y col., Chembiochem, 2007. 8(14): p.

1700-9; Rebibo-Sabbah, A., y col., Hum Genet, 2007. 122(3-4): p. 373-81; Azimov, R., y col., Am J Physiol Renal Physiol, 2008. 295(3): p. F633-41; Hainrichson, M., y col., Org Biomol Chem, 2008. 6(2): p. 227-39; Hobbie, S.N., y col., Proc Natl Acad Sci U S A, 2008. 105(52): p. 20888-93; Hobbie, S.N., y col., Proc Natl Acad Sci U S A, 2008.

105(9): p. 3244-9; Nudelman, I., y col., Adv. Synth. Catal., 2008. 350: p. 1682-1688; Nudelman, I., y col., J Med Chem, 2009. 52(9): p. 2836-45; Venkataraman, N., y col., PLoS Biol, 2009. 7(4): p. e95; Brendel, C., y col., J Mol Med (Berl), 2010. 89(4): p. 389-98; Goldmann, T., y col., Invest Ophthalmol Vis Sci, 2010. 51(12): p. 6671-80; Malik, V., y col., Ther Adv Neurol Disord, 2010. 3(6): p. 379-89; Warchol, M.E., Curr Opin Otolaryngo1Head Neck Surg, 2010. 18(5): p.

454-8; López-Novoa, J.M., y col., Kidney Int, 2011,79(1): p. 33-45; Rowe, S.M., y col., J Mol Med (Berl), 2011. 89(11): p. 1149-61; y Vecsler, M., y col., PLoS One, 2011. 6(6): p. e20733.

Sumario de la invención

La presente invención se refiere a la materia objeto como se define en las reivindicaciones.

Se desvela una nueva clase de pseudo-trisacárido aminoglucósidos, que puede usarse de forma beneficiosa en el tratamiento de enfermedades genéticas, tales como fibrosis quística, en combinación con otro agente útil en el tratamiento de dicho trastorno genético, exhibiendo una alta actividad de lectura de mutaciones de codones de parada prematura mientras ejercen una baja toxicidad en células de mamíferos y una baja actividad antimicrobiana. Los aminoglucósidos desvelados actualmente se caracterizan por una estructura central basada en los Anillos I, II y III de paromomicina con la adición de un alquilo en la posición 5" del Anillo III.

Por tanto, de acuerdo con un aspecto de algunas realizaciones de la presente invención, se proporciona un compuesto que tiene la fórmula general I:

o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, para su uso en el tratamiento de un trastorno genético en combinación con otro agente útil en el tratamiento de dicho trastorno genético en el que:

R¹es un alquilo que tiene de 1-4 átomos de carbono;

R²es hidrógeno o (S)-4-amino-2-hidroxibutirilo (AHB);

R³se selecciona entre el grupo que consiste en hidrógeno y un alquilo que tiene de 1-4 átomos de carbono; y una estéreo configuración de cada una de las posiciones 61 y la posición 5" es independientemente una configuración R o una configuración S.

De acuerdo con algunas realizaciones de la invención, el alquilo es metilo.

De acuerdo con algunas realizaciones de la invención, R²y R³son cada uno hidrógeno.

De acuerdo con algunas realizaciones de la invención, R²es AHB y R³es hidrógeno.

De acuerdo con algunas realizaciones de la invención, R²es hidrógeno y R³es un alquilo que tiene de 1-4 átomos de carbono.

De acuerdo con algunas realizaciones de la invención, R²es AHB y R³es un alquilo que tiene de 1-4 átomos de carbono.

De acuerdo con algunas realizaciones de la invención, el alquilo es metilo.

De acuerdo con algunas realizaciones de la invención, los compuestos presentes en el presente documento se seleccionan entre el grupo que consiste en los compuestos NB118, NB119, NB122, NB123, NB124, NB125, NB127 y NB128.

De acuerdo con algunas realizaciones de la invención, los compuestos presentados en el presente documento se caracterizan por exhibir una relación de CI⁵⁰de inhibición de la traducción en eucariotas a CI⁵⁰de inhibición de la traducción en procariotas menor de 15. De acuerdo con algunas realizaciones de la invención, la relación es menor de 1.

De acuerdo con algunas realizaciones de la invención, los compuestos presentados en el presente documento se caracterizan por una CMI en bacterias Gramnegativas más alta que 200 pM y una CMI en bacterias Grampositivas más alta que 20 pM.

De acuerdo con otro aspecto de algunas realizaciones de la presente invención, se proporciona una composición farmacéutica que incluye uno cualquiera de los compuestos presentados en el presente documento y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

De acuerdo con algunas realizaciones de la invención, la composición farmacéutica se envasa en un material de embalaje y se identifica en forma impresa, en o sobre el material de embalaje, para su uso en el tratamiento de un trastorno genético.

De acuerdo con algunas realizaciones de la invención, los compuestos presentados en el presente documento son para su uso en el tratamiento de un trastorno genético.

De acuerdo con otro aspecto de algunas realizaciones de la presente invención, se proporciona un uso de uno cualquiera de los compuestos presentados en el presente documento en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de un trastorno genético.

De acuerdo con algunas realizaciones de la invención, el trastorno genético está asociado a una mutación de codón de parada prematura y/o un fenotipo de truncamiento de proteínas.

De acuerdo con algunas realizaciones de la invención, el trastorno genético se selecciona del grupo que consiste en fibrosis quística (FQ), Distrofia muscular de Duchenne (DMD), ataxia-telangiectasia, Síndrome de Hurler, hemofilia A, hemofilia B, Síndrome de Usher y Tay-Sachs.

De acuerdo con algunas realizaciones de la invención, el trastorno genético es la fibrosis quística.

Además, se desvela un procedimiento de preparación del compuesto presentado en el presente documento, el procedimiento se efectúa mediante:

(a) proporcionar un compuesto donante que tiene la Fórmula general II:

en la que:

R¹es un alquilo que tiene de 1-4 átomos de carbono;

R⁴es hidrógeno o un grupo protector de amino donante;

R⁵es un grupo protector de amino donante si R⁴es hidrógeno o hidrógeno si R⁴es un grupo protector de amino donante; cada uno de HPd es un grupo protector de hidroxilo donante; y

L es un grupo saliente;

(b) acoplar el compuesto donante con un compuesto aceptor que tiene la fórmula general III

en la que:

la línea discontinua indica una configuración R o una configuración S;

R³se selecciona entre el grupo que consiste en hidrógeno y un alquilo que tiene de 1-4 átomos de carbono; R⁶es un grupo protector de amino aceptor o (SJ-4-azido-2-0-acetil-1-butirilo;

HPa es un grupo protector de hidroxilo aceptor; y

APa es un grupo protector de amino aceptor; y

(c) retirar cada uno del grupo protector de amino y el grupo protector de hidroxilo, obteniendo de esa manera el compuesto.

De acuerdo con algunas realizaciones del procedimiento, el grupo saliente es tricloroacetimidato.

De acuerdo con algunas realizaciones del procedimiento, el grupo protector de hidroxilo donante es O-benzoílo y el grupo protector de amino donante es azido.

De acuerdo con algunas realizaciones del procedimiento, el grupo protector de hidroxilo aceptor es O-acetilo y el grupo protector de amino aceptor es azido.

A menos que se defina de otro modo, todos los términos técnicos y/o científicos usados en este documento tienen el mismo significado que el comúnmente entendido por un experto en la materia a la cual pertenece la invención. Aunque se pueden usar procedimientos y materiales similares o equivalentes a los descritos en el presente documento en la práctica o ensayo de realizaciones de la invención, a continuación se describen procedimientos y/o materiales ejemplares. En caso de conflicto, prevalecerá la especificación de la patente, incluidas las definiciones. Además, los materiales, procedimientos y ejemplos son solo ilustrativos y no pretenden ser necesariamente limitantes.

Breve descripción de los dibujos

Algunas realizaciones de la invención se describen en el presente documento, únicamente a modo de ejemplo, con referencia a los dibujos adjuntos. Con referencia específica ahora a los dibujos en detalle, se hace hincapié en que los detalles que se muestran son a modo de ejemplo y con fines de análisis ilustrativo de realizaciones de la invención. En este sentido, la descripción tomada con los dibujos pone de manifiesto a aquellos expertos en la materia cómo pueden ponerse en práctica las realizaciones de la invención.

En los dibujos:

Las FIGURAS 1A-C presentan una ruta sintética para la preparación de ésteres diasteroméricos C5 (R,X)-27 y (S,X)-28, en los que "a" representa DCC, 4-DMAP, CSA, Dc M, a temperatura ambiente (FIGURA 1A); Espectros de RMN 1H de (R,X)-27 y (S,X)-28, en los que las diferencias de desplazamiento químico (AS) entre protones particulares de (R,X)-27 y (S,X)-28 están resaltados (FIGURA 1B); y una asignación de configuración absoluta en el carbono 5 (denotado por X) del Compuesto 9 alcohólico principal por regla de Sector (FIGURA 1C);

Las FIGURAS 2A-F presentan los resultados del ensayo de lectura completa del codón de parada que muestra gráficos comparativos de niveles de supresión del codón de parada in vitro inducidos por el ejemplo de referencia NB30 informado anteriormente (marcado por círculos vacíos), por los compuestos ejemplares, NB118 (marcado por triángulos negros) y NB119 (marcado por triángulos vacíos) y por el fármaco de control gentamicina (marcado por rectángulos negros) en una serie de construcciones de contexto de mutación sin sentido que representan diversas enfermedades genéticas (entre paréntesis), en los que los resultados pertenecientes a la construcción R3X (USH1) se muestran en la FIGURA 2A, R245X (USH1) en la FIGURA 2B, G542X (FQ) en la FIGURA 2C, W1282X (FQ) en la FIGURA 2D, Q70X (HS) en la FIGURA 2E y R3381X (DMD) en la FIGURA 2F;

Las FIGURAS 3A-F presentan los resultados del ensayo de lectura completa del codón de parada que muestra gráficos comparativos de niveles de supresión del codón de parada in vitro inducidos por el ejemplo de referencia NB54 informado anteriormente (marcado por círculos negros), por los compuestos ejemplares, NB122 (marcado por triángulos negros) y NB123 (marcado por triángulos vacíos) y por gentamicina como un fármaco de control (marcado por rectángulos negros) en una serie de construcciones de contexto de mutación sin sentido que representan diversas enfermedades genéticas (entre paréntesis), en los que los resultados pertenecientes a la construcción R3X (USH1) se muestran en la FIGURA 3A, R245X (USH1) en la FIGURA 3B, G542X (FQ) en la FIGURA 3C, W1282X (FQ) en la FIGURA 3D, Q70X (HS) en la FIGURA 3E y R3381X (DMD) en la FIGURA 3F; Las FIGURAS 4A-D presentan la supresión ex vivo de las mutaciones sin sentido PCDH15-R3X (FIGURA 4A), PCDH15-R245X (FIGURA 4B), IDUA-Q70X (FIGURA 4C), y CFTR-W1282X (FIGURA 4D), efectuadas por el ejemplo de referencia previamente informado NB54 (marcado por círculos negros), por compuestos ejemplares, NB122 (marcado por triángulo negro) y NB123 (marcado por triángulos vacíos) y por el fármaco de control gentamicina (marcado por rectángulos negros);

Las FIGURAS 5A-D presentan gráficos comparativos de los resultados de ensayos de supresión in vitro de la mutación del codón de parada prematura del CFTR-G542X (FIGURA 5A y 5C) y CFTR-W1282X (FIGURA 5B y D) efectuada por los compuestos ejemplares, NB124 (marcado por círculos negros), NB125 (marcado por círculos vacíos), NB127 (marcado por triángulos negros) y NB128 (marcado por triángulos vacíos), por los ejemplos de referencia informados anteriormente NB74 (marcado por rombos vacíos) y NB84 (marcado por rombos negros) y por los fármacos de control gentamicina (marcado por rectángulos negros) y G418 (marcado por rectángulos vacíos);

Las FIGURAS 6A-F presentan los resultados del ensayo de lectura completa del codón de terminación mostrando gráficos comparativos de niveles de lectura del codón de parada in vitro inducidos por los compuestos ejemplares, NB124 (marcado por círculos negros) y NB125 (marcado por círculos vacíos), por el ejemplo de referencia informado anteriormente NB74 (marcado por rombos vacíos) y por el fármaco de control gentamicina (marcado por rectángulos negros), en una serie de construcciones de contexto de mutación sin sentido que representan diversas enfermedades genéticas (entre paréntesis), en los que los resultados pertenecientes a la construcción R3X (USH1) se muestran en la FIGURA 6A, R245X (USH1) en la FIGURA 6B, G542X (FQ) en la FIGURA 6C, W1282X (FQ) en la FIGURA 6D, Q70X (HS) en la FIGURA 6E y R3381X (DMD) en la FIGURA 6F;

Las FIGURAS 7A-F presentan los resultados del ensayo de lectura completa del codón de parada que muestra gráficos comparativos de niveles de supresión del codón de parada in vitro inducidos por el ejemplo de referencia NB84 informado anteriormente (marcado por rombos negros), por los compuestos ejemplares, NB127 (marcado por triángulos negros) y NB128 (marcado por triángulos vacíos) y los fármacos de control G418 (marcados por rectángulos vacíos) y gentamicina (marcado por rectángulos negros), en una serie de construcciones de contexto de mutación sin sentido que representan diversas enfermedades genéticas (entre paréntesis), en los que los resultados pertenecientes a la construcción R3X (USH1) se muestran en la FIGURA 7A, R245X (USH1) en la FIGURA 7B, G542X (CF) en la FIGURA 7C, W1282X (CF) en la FIGURA 7D, Q70X(HS) en la FIGURA 7E y R3381X (DMD) en la FIGURA 7F;

Las FIGURAS 8A-D presentan gráficos comparativos de resultados de ensayos de supresión de mutación del codón de parada prematura ex vivo realizados para las construcciones CFTR-G542X (FIGURA 8A y 8C) y CFTR- W1282X (FIGURA 8B y 8D), efectuados por los compuestos ejemplares, NB124 (marcado por círculos negros), NB125 (marcado por círculos vacíos), NB127 (marcado por triángulos negros) y NB128 (marcado por triángulos vacíos), por los ejemplos de referencia informados anteriormente NB74 (marcado por rombos vacíos) y NB84 (marcado por rombos negros) y por los fármacos de control gentamicina (marcado por rectángulos negros) y G418 (marcado por rectángulos vacíos);

Las FIGURAS 9A-E presentan los resultados del ensayo de lectura completa del codón de terminación mostrando gráficos comparativos de niveles de supresión del codón de parada in vitro inducidos por los compuestos ejemplares, NB124 (marcado por círculos negros) y NB125 (marcado por círculos vacíos), por el ejemplo de referencia informado anteriormente NB74 (marcado por rombos negros), y por los fármacos de control gentamicina (marcado por rectángulos negros) y G418 (marcado por rectángulos vacíos) en una serie de construcciones de contexto de mutación sin sentido que representan diversas enfermedades genéticas (entre paréntesis), en los que los resultados pertenecientes a la construcción R3X (USH1) se muestran en la FIGURA 9A, R245X (USH1) en la FIGURA 9B, Q70X (HS) en la FIGURA 9C, W1282X (CF) en la FIGURA 9D y G542X (CF) en la FIGURA 9E; Las FIGURAS 10A-E presentan los resultados del ensayo de lectura completa del codón de terminación mostrando gráficos comparativos de niveles de supresión del codón de parada in vitro inducidos por los compuestos ejemplares, NB127 (marcado por rectángulos negros) y NB128 (marcado por triángulos vacíos), por el ejemplo de referencia informado anteriormente NB84 (marcado por rombos vacíos) y por los fármacos de control gentamicina (marcado por rectángulos negros) y G418 (marcado por rectángulos vacíos), en una serie de construcciones de contexto de mutación sin sentido que representan diversas enfermedades genéticas (entre paréntesis), en los que los resultados pertenecientes a la construcción R3X (USH1) se muestran en la FIGURA 10A, R245X (USH1) en la FIGURA 10B, Q70X(HS) en la FIGURA 10C, W1282X(CF) en la FIGURA 10D y G542X (CF) en la FIGURA 10E; Las FIGURAS 11A-D presentan gráficas semilogarítmicas de inhibición de la traducción in vitro en sistemas procariotas (marcados con círculos negros) y eucariotas (marcados con círculos vacíos) medidos para los compuestos ejemplares, NB118 (FIGURA 11A), NB119 (FIGURA 11B) NB122 (FIGURA 11C) y NB123 (Figura 11D);

Las FIGURAS 12A-D presentan gráficas semilogarítmicas de los porcentajes de viabilidad celular ex vivo frente a la concentración del compuesto probado en células HEK-293 (FIGURA 12a y FIGURA 12C) y en fibroblastos de prepucio humano (HFF) (FIGURA 12B y FIGURA 12D), para gentamicina (marcada por rectángulos vacíos) y para los compuestos ejemplares, NB118 (marcado por círculos vacíos), NB119 (marcado por círculos negros), NB122 (marcado por triángulos vacíos), y NB123 (marcado por un triángulo negro); y

Las FIGURAS 13A-B presentan gráficos de dispersión para identificar la posible correlación entre la actividad de lectura y la inhibición de la traducción de proteínas in vitro en sistemas eucariotas como se observa para una serie de compuestos conocidos y compuestos ejemplares, en los que el aumento de la inhibición de la síntesis de proteínas (valores de CI⁵⁰menores) está asociado al aumento de la actividad de lectura, mientras que la FIGURA 13A es una gráfica semilogarítmica de inhibición eucariota de la traducción frente a la actividad de lectura in vitro a una concentración de 1,4 pM de los aminoglucósidos probados (que se muestran en el eje X) usando seis mutaciones sin sentido diferentes (W1282X, Q70X, R3X, R245X, G542X y R3381X) y la FIGURA 1B es un gráfico lineal de los mismos datos presentados en la FIG 13A.

Descripción de realizaciones específicas de la invención

La presente invención, en algunas realizaciones de la misma, se refiere a una nueva clase de aminoglucósidos para su uso en el tratamiento de un trastorno genético en combinación con otro agente útil en el tratamiento de dicho trastorno genético y más particularmente, pero no exclusivamente, a novedosos aminoglucósidos con efectividad mejorada hacia el tratamiento de trastornos genéticos.

Específicamente, la presente invención, en algunas realizaciones de la misma, se refiere a una nueva clase de compuestos, derivados de paromomicina, que exhiben una alta actividad de lectura de mutaciones de codones de parada prematura mientras ejercen una baja toxicidad en células de mamíferos. Por lo tanto, la presente invención se refiere además a las composiciones farmacéuticas que contienen estos compuestos y a los usos de los mismos en el tratamiento de trastornos genéticos, tales como fibrosis quística (FQ).

Los principios y funcionamiento de la presente invención pueden entenderse mejor con referencia a las figuras y descripciones adjuntas.

Antes de explicar al menos una realización de la invención en detalle, debe entenderse que la invención no está limitada en su aplicación a los detalles expuestos en la siguiente descripción o ejemplificados por los Ejemplos. La invención es capaz de otras realizaciones o de practicarse o llevarse a cabo de diversas maneras. También, debe entenderse que la fraseología y la terminología empleada en el presente documento tiene fines descriptivos y no debe considerarse como limitante.

Como se ha analizado anteriormente, varias manipulaciones estructurales sobre la estructura de la paromamina han dado lugar a aminoglucósidos sintéticos que se ha demostrado que ejercen una actividad mejorada de lectura de mutaciones de codones de parada prematuros mientras ejercen una baja toxicidad en células de mamíferos. Seguir estas manipulaciones estructurales ha dado lugar al desarrollo de los compuestos de referencia ejemplares NB30 y NB54 como derivados de pseudo-trisacárido del aminoglucósido clínico paromomicina. El concepto estructural demostrado en el ejemplo de referencia NB30 mostró una citotoxicidad significativamente reducida en comparación con gentamicina y paromomicina y promovió la supresión dependiente de la dosis de mutaciones sin sentido del gen PCDH15, la causa subyacente del síndrome de Usher tipo 1 (USH1), pero su potencia de supresión fue notablemente menor en relación con la de la gentamicina y la paromomicina. El ejemplo de referencia NB54, que se desarrolló como la estructura conceptual de segunda generación, exhibió toxicidades celular, coclear y aguda significativamente reducidas, y tiene una eficiencia de lectura sustancialmente más alta que aquellas de gentamicina y paromomicina.

Mientras descifra aún más la relación estructura-actividad de tales aminoglucósidos, en un intento de mejorar aún más su efecto terapéutico en el contexto de trastornos genéticos, los presentes inventores han investigado numerosas modificaciones adicionales, en diferentes posiciones de la estructura de paromamina, y sorprendentemente han descubierto que al sustituir un hidrógeno en la cadena lateral de 5" en el anillo de ribosamina (anillo III) con un grupo metilo, el aminoglucósido resultante muestra una toxicidad celular significativamente reducida, mientras que en paralelo exhibe una actividad de lectura sustancialmente mayor de mutaciones sin sentido que provocan enfermedades, incluso en comparación con los de la gentamicina. Por tanto, los presentes inventores han identificado otra posición significativa en el farmacóforo que constituye candidatos a fármacos viables que pueden combatir enfermedades que se derivan de mutaciones genéticas.

Sin desear quedar ligado a teoría particular alguna, se sugiere que la introducción de una modificación en el anillo de ribosamina (Anillo III) preserva los impactos ya bien establecidos de los anillos I y II en las estructuras de conceptos anteriores (véase, por ejemplo, los compuestos de referencia ejemplares NB30 y NB54 descrito anteriormente), al tiempo que introduce un nuevo motivo estructural con una actividad de supresión significativa y una toxicidad reducida.

Al tiempo que reducen la presente invención a la práctica, los presentes inventores han preparado con éxito aminoglucósidos (por ejemplo, los compuestos de referencia ejemplares NB30, NB54 NB74 y NB84) a la que la cadena lateral (S)-5"-metilo se introdujo en un anillo de ribosamina (anillo III), y de ese modo ha generado una nueva familia de aminoglucósidos. Los presentes inventores han demostrado que estos compuestos nuevamente diseñados muestran una toxicidad celular significativamente reducida, mientras que en paralelo exhiben una actividad de lectura sustancialmente mayor de mutaciones sin sentido que provocan enfermedades, en comparación, por ejemplo, con la gentamicina. También se observó que la instalación del grupo (S)-5"-metilo no afecta significativamente a la toxicidad celular, mientras que mejora en gran medida la actividad de lectura del codón de parada y la especificidad para el ribosoma eucariota de las estructuras resultantes en comparación con las de las estructuras informadas anteriormente.

Dado que la instalación de un grupo metilo en la posición C5" del anillo de ribosamina genera un nuevo centro estereogénico, los presentes inventores han preparado ambos diastereómeros C5" con una configuración absoluta definida y han comparado sus propiedades biológicas.

Por tanto, un nuevo punto farmacóforo, el grupo (S)-5"-metilo, se ha descubierto como un valioso elemento estructural del anillo de ribosamina (anillo III) que afecta significativamente la actividad de supresión y no tiene una influencia significativa sobre la toxicidad celular.

Este nuevo punto farmacóforo es un quinto punto que ahora se suma a los cuatro puntos anteriores descubiertos y desvelados en, por ejemplo, el documento WO 2007/113841. El esquema 1 presenta el núcleo de paromamina con los cinco puntos farmacóforos descubiertos hasta ahora, numerados i-iv de acuerdo con la secuencia de su descubrimiento. Específicamente, el punto farmacóforo denominado "i" se refiere a la provisión de un grupo hidroxilo en la posición 6'; el punto denominado "ii" se refiere a la provisión de un grupo AHB en la posición N1; el punto "iii" se refiere a la provisión de un tercer resto sacárido (Anillo III) unido al segundo anillo sacárido; "iv" es la provisión de una modificación en la posición 6 '(ejemplificada en el Esquema 1 como un alquilo inferior); y el punto de farmacóforo descrito en el presente documento se denomina "v" y se refiere a la provisión de modificación en la posición 5" de acuerdo con las presentes realizaciones (ejemplificadas en el Esquema 1 como un alquilo inferior).

Esquema 1

Por tanto, de acuerdo con un aspecto de las realizaciones de la presente invención, se proporciona un compuesto que tiene la fórmula general I:

o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo,

en la que:

R¹es preferentemente un alquilo que tiene de 1-4 átomos de carbono;

R²es hidrógeno o (S)-4-amino-2-hidroxibutirilo (AHB);

R³es preferentemente hidrógeno o un alquilo que tiene de 1-4 átomos de carbono; y

una estéreo configuración de cada una de las posiciones ⁶' y la posición 5” es independientemente una configuración R o una configuración S, para su uso en el tratamiento de un trastorno genético en combinación con otro agente útil en el tratamiento de dicho trastorno genético.

Se observa en el presente documento que si bien se ha demostrado que la posición del Anillo III en la posición O5 en el Anillo II presenta resultados óptimos, se contemplan otras posiciones para el Anillo III, tales como la posición O⁶en el Anillo II y las posiciones 3' y 4' en el Anillo I.

Los términos "hidroxilo" o "hidroxi", como se usa en el presente documento, se refiere a un grupo -OH.

Como se usa en el presente documento, el término "amina" describes un grupo -NR'R" en el que cada uno de R' y R" es independientemente hidrógeno, alquilo, cicloalquilo, heteroalicíclico, arilo o heteroarilo, como estos términos se definen en el presente documento.

Como se usa en el presente documento, el término "alquilo" describe un hidrocarburo alifático que incluye grupos de cadena lineal y de cadena ramificada. El alquilo puede tener de 1 a 20 átomos de carbono, o de 1 a 10 átomos de carbono, y puede ser ramificado o sin ramificar. De acuerdo con las realizaciones de la presente invención, el alquilo es un alquilo inferior, que tiene de 1-4 átomos de carbono (es decir, metilo, etilo, propilo y butilo).

El término "cicloalquilo" se refiere a un anillo monocíclico o condensado totalmente de carbono (es decir, anillos los cuales comparten un par adyacente de átomos de carbono), grupo ramificado o sin ramificar que contiene 3 o más átomos de carbono en los que uno o más de los anillos no tiene un sistema de electrones pi completamente conjugado, y además puede estar sustituido o sin sustituir. Grupos cicloalquilo ejemplares incluyen, por ejemplo, ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo, ciclohexilo o ciclododecilo.

Siempre que sea un intervalo numérico; por ejemplo, "1-10", como se indica en el presente documento, implica que el grupo, en este caso el grupo alquilo, puede contener 1 átomo de carbono, 2 átomos de carbono, 3 átomos de carbono, etc., hasta e incluso 10 átomos de carbono. En algunas realizaciones, el alquilo es un alquilo inferior, que incluye de 1- 6 o de 1-4 átomos de carbono. Un alquilo puede estar sustituido o sin sustituir. Cuando está sustituido, el sustituyente puede ser, por ejemplo, un alquilo (que forma un alquilo ramificado), un alquenilo, un alquinilo, un cicloalquilo, un arilo, un heteroarilo, un halo, un hidroxi, un alcoxi y un hidroxialquilo como se definen estos términos a continuación. El término "alquilo", como se usa en el presente documento, también incluye hidrocarburo saturado o insaturado, por lo que este término abarca además alquenilo y alquinilo.

El término "alquenilo" describe un alquilo insaturado, como se define en el presente documento, que tiene al menos dos átomos de carbono y al menos un doble enlace carbono-carbono, por ejemplo, alilo, vinilo, 3-butenilo, 2-butenilo, 2- hexenilo e i-propenilo. El alquenilo puede estar sustituido o sin sustituir con uno o más sustituyentes, como se describió anteriormente.

El término "alquinilo", como se define en el presente documento, es un alquilo insaturado que tiene al menos dos átomos de carbono y al menos un triple enlace carbono-carbono. El alquinilo puede estar sustituido o sin sustituir con uno o más sustituyentes, como se describió anteriormente.

El término "arilo" describe grupos monocíclicos o policíclicos de anillo condensado (es decir, anillos que comparten pares adyacentes de átomos de carbono) que tienen un sistema de electrones pi completamente conjugado. El grupo arilo puede estar sustituido o sin sustituir con uno o más sustituyentes, como se describió anteriormente.

El término "heteroarilo" describe un grupo de anillo monocíclico o condensado (es decir, anillos que comparten un par de átomos adyacentes) que tiene en el anillo o anillos, uno o más átomos, tales como, por ejemplo, nitrógeno, oxígeno y azufre y, además, que tiene un sistema de electrones pi completamente conjugado. Los ejemplos, sin limitación, de grupos heteroarilo incluyen pirrol, furano, tiofeno, imidazol, oxazol, tiazol, pirazol, piridina, pirimidina, quinolina, isoquinolina y purina. El grupo heteroarilo puede estar sustituido o sin sustituir con uno o más sustituyentes, como se describió anteriormente. Los ejemplos representativos son tiadiazol, piridina, pirrol, oxazol, indol, purina y similares.

El término "heteroalicíclico", como se usa en el presente documento, describe un grupo de anillo monocíclico o condensado que tiene en el anillo o anillos, uno o más átomos, tales como nitrógeno, oxígeno y azufre. Los anillos también pueden tener uno o más dobles enlaces. Sin embargo, los anillos no tienen un sistema de electrones pi completamente conjugado. El heteroalicíclico puede estar sustituido o sin sustituir. El heteroalicíclico sustituido puede tener uno o más sustituyentes, por lo que cada grupo sustituyente puede ser independientemente, por ejemplo, alquil cicloalquilo, alquenilo, alquinilo, arilo, heteroarilo y heteroalicíclico. Los ejemplos representativos son morfolina, piperidina, piperazina, tetrahidrofurano, tetrahidropirano y similares.

El término "haluro", como se usa en el presente documento, se refiere al anión de un átomo halo, es decir F-, Cl-, Br y I-.

El término "halo" se refiere a átomos de F, Cl, Br e I como sustituyentes.

El término "alcoxi" se refiere a un anión R'-O‘, en el que R' es como se ha definido anteriormente.

El término "hidroxialquilo", como se usa en el presente documento, se refiere a un grupo alquilo sustituido con un grupo hidroxi, por ejemplo, hidroximetilo, p-phidroxietilo y 4-hidroxipentilo.

El término "alcoxialquilo", como se usa en el presente documento, se refiere a un grupo alquilo sustituido con un grupo alcoxi, por ejemplo, metoximetilo, 2-metoxietilo, 4-etoxibutilo, n-propoxietilo y t-butiletilo.

El resto (S)-4-amino-2-hidroxibutirilo, también se denomina en el presente documento como AHB. De acuerdo con algunas realizaciones de la presente invención, una alternativa al resto AHB puede ser el resto a-hidroxi-p aminopropionilo (AHP). Se cree que estas denominadas cadenas laterales o restos opcionales bloquean el acceso de enzimas modificadoras de aminoglucósidos a los sitios diana. Por otra parte, AHB o AHP contienen un resto 1,3- o 1,2-hidroxilamina que se une a los fosfodiésteres y a la cara base hoogsten de la guanosina del sitio A del rRNA 16S. Se indica en el presente documento que de acuerdo con algunas realizaciones de la presente invención, otros restos que implican una combinación de grupo(s) carbonilo(s), hidroxilo(s) y amino a lo largo de un alquilo inferior que exhibe cualquier estereoquímica, se contemplan como sustituyentes opcionales en lugar de AHB y/o AHP. Por ejemplo, 2-amino-3-hidroxibutanoílo, 3-amino-2-hidroxipentanoílo, 5-amino-3-hidroxihexanoilo y similares.

En el presente documento, debe entenderse que siempre que se hace referencia a AHB, también se incluyen grupos equivalentes como se describe en este documento (por ejemplo, AHP).

Como se usa en el presente documento, la frase "resto" describe una parte, y preferiblemente una parte principal, de una entidad química, tal como una molécula o un grupo, que ha sufrido una reacción química y ahora está unida covalentemente a otra entidad molecular.

De acuerdo con algunas realizaciones de la presente invención, R¹es alquilo.

De acuerdo con algunas realizaciones, R¹es un alquilo inferior como se define en el presente documento, incluyendo, pero no se limita a, metilo, etilo, propilo, butilo y isopropilo. De acuerdo con otras realizaciones de la presente invención, R¹es metilo.

En algunas realizaciones de la presente invención, R1 es alquilo, como se describe en el presente documento y R²y R³son cada uno hidrógeno. En términos de los puntos farmacóforos presentados en el Esquema 1 (véase anteriormente), estos compuestos poseen el punto quinto (v) y no poseen los puntos segundo (ii) y cuarto (iv). Estos compuestos exhiben un perfil farmacológico superior en comparación con los compuestos y fármacos previamente conocidos que se consideran para su uso en el tratamiento de trastornos genéticos, es decir, estos compuestos son menos tóxicos y más eficientes en la lectura completa de mutaciones prematuras de codones de parada, como se demuestra en la sección de Ejemplos que sigue a continuación.

Ejemplos de compuestos de aminoglucósidos que exhiben hidrógeno en las posiciones R²y R³incluyen:

las cuales se diferencian entre sí en la configuración estereoscópica del centro quiral en la posición 5 "del Anillo III.

En algunas realizaciones de la presente invención, R¹es alquilo, como se describe en el presente documento, R²es AHB y R³es un átomo de hidrógeno. En términos de los puntos farmacóforos presentados en el Esquema 1 (véase anteriormente), además de poseer el punto quinto (v), estos compuestos poseen el punto segundo (ii) y no poseen el punto cuarto (iv). Estos compuestos exhiben un perfil farmacológico superior en comparación con los compuestos y fármacos previamente conocidos que se consideran para su uso en el tratamiento de trastornos genéticos, es decir, estos compuestos son menos tóxicos y más eficientes en la lectura completa de mutaciones prematuras de codones de parada, como se demuestra en la sección de Ejemplos que sigue a continuación.

Los ejemplos de compuestos de aminoglucósidos que tienen un resto AHB en la posición R²e hidrógeno en R³incluyen:

las cuales se diferencian entre sí en la configuración estereoscópica del centro quiral en la posición 5 "del Anillo III. Opcionalmente, R¹es cicloalquilo, como se describe en el presente documento, R²es AHB y R³es un átomo de hidrógeno.

Opcionalmente, R¹es arilo, como se describe en el presente documento, R²es AHB y R³es un átomo de hidrógeno. En algunas realizaciones de la presente invención, R¹es alquilo, como se describe en el presente documento, R²es hidrógeno y R³es alquilo, como se describe en el presente documento. En términos de los puntos farmacóforos presentados en el Esquema 1 (véase anteriormente), además de poseer el punto quinto (v), estos compuestos no poseen el punto segundo (ii) y poseen el punto cuarto (iv). Estos compuestos exhiben un perfil farmacológico superior en comparación con los compuestos y fármacos previamente conocidos que se consideran para su uso en el tratamiento de trastornos genéticos, es decir, estos compuestos son menos tóxicos y más eficientes en la lectura completa de mutaciones prematuras de codones de parada, como se demuestra en la sección de Ejemplos que sigue a continuación.

En cualquiera de las realizaciones descritas anteriormente en la que R³es alquilo, R³es un alquilo inferior, como se define en el presente documento. De acuerdo con estas realizaciones, R³es metilo.

Los ejemplos de compuestos de aminoglucósidos que exhiben hidrógeno en la posición R²y alquilo en la posición R³incluyen:

las cuales se diferencian entre sí en la configuración estereoscópica del centro quiral en la posición 5 "del Anillo III. En algunas realizaciones de la presente invención, R²es AHB y R³es alquilo. En términos de los puntos farmacóforos presentados en el Esquema 1 (véase anteriormente), estos compuestos poseen los cinco puntos; Estos compuestos exhiben el perfil farmacológico más superior en comparación con los compuestos y fármacos previamente conocidos en términos de menor citotoxicidad y mayor eficiencia de lectura, como se demuestra en la sección de Ejemplos que sigue a continuación.

Ejemplos de compuestos de aminoglucósidos en los que R²es AHB y R³es alquilo incluyen:

Aunque se busca una manera de predecir y evaluar cuantitativamente la capacidad de un aminoglucósido sintético para constituir un fármaco candidato para el tratamiento de enfermedades genéticas provocadas por mutaciones prematuras de codones de terminación (exhiben actividad de lectura) y al mismo tiempo exhiben baja o nula citotoxicidad, se encontró que la alta selectividad del compuesto a los sistemas de traducción citoplasmáticos eucariotas (es decir, ribosomas citoplasmáticos eucariotas) en comparación con los sistemas de traducción procariotas, que son similares o se parecen en cierta medida al sistema de traducción mitocondrial, pueden usarse como medida predictiva. Un valor numérico que puede usarse fácilmente para cuantificar esta selectividad es la relación CI⁵⁰Euc/CI⁵⁰Pra que correlaciona una inhibición de la traducción en eucariotas con una inhibición de la traducción en procariotas (véase la Tabla 3 a continuación). Como se demuestra en la sección de Ejemplos a continuación, una selectividad notable de cualquier compuesto de aminoglucósido dado, tales como los compuestos de acuerdo con algunas realizaciones de la presente invención, hacia la inhibición de la traducción en eucariota sobre la inhibición de la traducción en procariota puede usarse para predecir su eficacia y seguridad como fármaco candidato para el tratamiento de trastornos genéticos asociados con mutaciones de codones de parada prematura.

No obstante, se observa en el presente documento que la relación CI⁵⁰Euc/CI⁵⁰Pra que indica selectividad, no es un criterio suficiente para seleccionar candidatos a fármacos de esta familia de aminoglucósidos; también hay que considerar el mecanismo de inhibición de la traducción. Por ejemplo, se encontró que el aminoglucósido de referencia ejemplar NB33, que es un dímero del compuesto original paromamina, exhibe un valor de relación de aproximadamente 2, que se considera bajo y, por lo tanto, predictivo para un buen candidato a fármaco de lectura completa. Sin embargo, la referencia ejemplar NB33 no presenta esencialmente actividad de lectura completa. Se supone que la referencia ejemplar NB33 inhibe el mecanismo de traducción en un modo de inhibición diferente, como se muestra en el cristal del complejo entre el ARN del sitio citoplasmático A y la referencia ejemplar NB33 [ChemBioChem, 2007, 8(14), p. 1617].

Sin desear quedar ligado a teoría particular alguna, una posible conclusión del análisis anterior es que para que un aminoglucósido muestre los rasgos deseados de un candidato a fármaco de lectura de mutación del codón de parada prematura, 1) debe inhibir tanto los ribosomas procarióticos como eucarióticos por el mismo mecanismo de unión al sitio de unión del aminoacil-ARNt y estabilizar la conformación de descodificación o inhibir el proceso de traducción de proteínas interfiriendo con la fidelidad del proceso de corrección de pruebas; y 2) la relación CI⁵⁰Euc/CI⁵⁰Pra que favorece a los eucariotas también debe ir acompañada de una disminución significativa en la especificidad del compuesto para el ribosoma procariota; en otras palabras, valores de CI⁵⁰Pra elevados. Un ejemplo representativo de este requisito es G418; su relación CI⁵⁰Euc/CI⁵⁰Pra es 225, que es significativamente más bajo que el de la gentamicina pero aún así es altamente tóxico como lo indica un valor de CI⁵⁰Pra relativamente muy bajo.

Por lo tanto, de acuerdo con algunas realizaciones de la presente invención, los compuestos presentados en el presente documento se caracterizan por una relación de CI⁵⁰de inhibición de la traducción en eucariotas a CI⁵⁰de inhibición de la traducción en procariotas menor de 15, menor que 10, menor que 5 o menor que 1, incluyendo cualquier valor intermedio entre 15 y 1.

Como se demuestra a continuación en el presente documento, mientras se preparaban y probaban compuestos ejemplares de acuerdo con algunas realizaciones de la presente invención, se ha observado que el aumento de la inhibición de la síntesis de proteínas citoplasmáticas procariotas también se asocia a un aumento de la actividad de lectura. Los datos presentados en la Tabla 3 muestran que la adición sistemática de puntos del farmacóforo presentado en el Esquema 1 aumenta gradualmente la especificidad de los compuestos hacia el ribosoma citoplasmático y disminuye su especificidad hacia el ribosoma procariótico.

Sería razonable esperar que los aminoglucósidos fueran selectivos hacia los procariotas, dado que los aminoglucósidos se han desarrollado por selección natural en el género Streptomyces y otras especies tales como especies Saccharopolyspora erythraea, para ser activos contra otros procariotas. No obstante, los compuestos de acuerdo con algunas realizaciones de la presente invención, exhiben selectividad inversa a los sistemas de traducción eucariotas frente a procariotas (ribosoma).

Por lo tanto, de acuerdo con algunas realizaciones de la presente invención, los compuestos presentados en el presente documento se caracterizan por una relación de CI⁵⁰de inhibición de la traducción en eucariotas a CI⁵⁰de inhibición de la traducción en procariotas menor de 15, menor de 1.

Como se analizó anteriormente, un compuesto de aminoglucósido prometedor, de acuerdo con algunas realizaciones de la presente invención, es aquel que no tiene una actividad notable o ninguna antimicrobiana. Dicha falta de actividad también predice la citotoxicidad baja o nula del compuesto para los mamíferos. Los resultados, que muestran que los ejemplos de compuestos que se han preparado y probado para determinar la actividad antimicrobiana o la falta de ella, se presentan en las Tablas 1 y 2 a continuación en el presente documento.

Por tanto, de acuerdo con algunas realizaciones de la presente invención, los compuestos presentados en el presente documento se caracterizan por un valor de CMI en bacterias Gramnegativas que es más alto que 200 pM, más alto que 300 pM, más alto que 500 pM, más alto que 700 pM o más alto que 1000 pM, así como un valor de CMI en bacterias Grampositivas que es más alto que 20 pM, más alto que 40 pM, más alto que 80 pM o más alto que 100 pM.

Las presentes realizaciones abarcan además cualquier enantiómero, diastereómero, profármaco, solvato, hidrato y/o sal farmacéuticamente aceptable de los compuestos descritos en el presente documento.

Como se usa en el presente documento, el término "enantiómero" se refiere a un estereoisómero de un compuesto que es superponible con respecto a su contraparte solo por una inversión/reflexión completa (imagen especular) entre sí. Se dice que los enantiómeros tienen "lateralidad", ya que se refieren entre sí como la mano derecha y la izquierda. Los enantiómeros tienen propiedades químicas y físicas idénticas, excepto cuando están presentes en un entorno que por sí mismo tiene la lateralidad, como todos los sistemas vivos. En el contexto de las presentes realizaciones, un compuesto puede exhibir uno o más centros quirales, cada uno de los cuales exhibe una configuración R o S y cualquier combinación, y compuestos de acuerdo con algunas realizaciones de la presente invención, puede tener cualquiera de sus centros quirales que presenten un configuración R o S.

El término "diastereómeros", como se usa en el presente documento, se refiere a estereoisómeros que no son enantiómeros entre sí. El diastereoisómero aparece cuando dos o más estereoisómeros de un compuesto tienen configuraciones diferentes en uno o más, pero no en todos los estereocentros equivalentes (relacionados) y no son imágenes especulares entre sí. Cuando dos diastereoisómeros difieren entre sí en un solo estereocentro, son epímeros. Cada estereocentro (centro quiral) da lugar a dos configuraciones diferentes y, por tanto, a dos estereoisómeros diferentes. En el contexto de la presente invención, las realizaciones de la presente invención abarcan compuestos con múltiples centros quirales que aparecen en cualquier combinación de estereoconfiguración, a saber, cualquier diastereoisómero.

El término "profármaco" se refiere a un agente, el cual se convierte en el compuesto activo (el fármaco precursor activo) in vivo. Los profármacos normalmente son útiles para facilitar la administración del fármaco precursor. Pueden, por ejemplo, estar biodisponibles mediante administración oral, mientras que el fármaco original no lo está. Un profármaco también puede tener una mejor solubilidad en comparación con el fármaco original en las composiciones farmacéuticas. Los profármacos también se utilizan a menudo para lograr una liberación sostenida del compuesto activo in vivo. Un ejemplo, sin limitación, de un profármaco sería un compuesto de la presente invención, que tiene uno o más restos de ácido carboxílico, el cual se administra como un éster (el "profármaco"). Tal profármaco se hidroliza in vivo, para proporcionar así el compuesto libre (el fármaco precursor). El éster seleccionado puede afectar tanto a las características de solubilidad como a la velocidad de hidrólisis del profármaco.

El término "solvato" se refiere a un complejo de estequiometría variable (por ejemplo, di-, tri-, tetra-, penta-, hexa-, etc.), que está formado por un soluto (el compuesto de la presente invención) y un disolvente, por lo que el solvente no interfiere con la actividad biológica del soluto. Disolventes adecuados incluyen, por ejemplo, etanol, ácido acético y similares.

El término "hidrato" se refiere a un solvato, como se ha definido en el presente documento anteriormente, en el que el disolvente es agua.

La frase "sal farmacéuticamente aceptable" se refiere a una especie cargada del compuesto original y su contraión, el cual se usa normalmente para modificar las características de solubilidad del compuesto original y/o para reducir cualquier irritación significativa en un organismo por el compuesto original, sin anular la actividad biológica y las propiedades del compuesto administrado. Un ejemplo, sin limitación, de una sal farmacéuticamente aceptable sería un anión hidroxilo (O-) y un catión tal como, pero no se limita a, amonio, sodio, potasio y similares. Otro ejemplo, sin limitación, de una sal farmacéuticamente aceptable sería un catión de amonio y una sal de adición de ácido del mismo. Los ejemplos de sales de adición de ácido incluyen, pero sin limitación, sal de adición de ácido clorhídrico, sal de adición de ácido sulfúrico (sal sulfato), sal de adición de ácido acético, sal de adición de ácido ascórbico, sal de adición de ácido bencenosulfónico, sal de adición de ácido alcanforsulfónico, sal de adición ácido cítrico, sal de adición de ácido maleico, sal de adición de ácido metanosulfónico, sal de adición de ácido naftalenosulfónico, sal de adición de ácido oxálico, sal de adición de ácido fosfórico, sal de adición de ácido succínico, sal de adición de ácido sulfúrico, sal de adición de ácido tartárico y sal de adición de ácido toluenosulfónico.

De acuerdo con algunas realizaciones de la presente invención, la sal de adición de ácido es sal sulfato.

Además, se proporcionan procedimientos para preparar los compuestos descritos en el presente documento.

Las rutas sintéticas descritas en el presente documento incluyen una reacción entre un aceptor y un donante, por lo que el término "aceptor" se usa en el presente documento para describir la estructura esquelética derivada de paromamina que tiene al menos un grupo hidroxilo disponible (desprotegido), preferiblemente seleccionado selectivamente, en posiciones tales como C5, C6 y C3', que es reactivo durante una reacción de glicosilación y puede aceptar un glicosilo, y el término "donante" se usa en el presente documento para describir el glicosilo. De acuerdo con algunas realizaciones del presente procedimiento, la posición en el aceptador es la posición C5.

El término "glicosilo", como se usa en el presente documento, se refiere a un grupo químico que se obtiene retirando el grupo hidroxilo de la función hemiacetal de un monosacárido y, por extensión, de un oligosacárido inferior.

El término "monosacárido", como se usa en este documento y es bien conocido en la técnica, se refiere a una forma simple de un azúcar que consiste en una única molécula de sacárido que no puede descomponerse adicionalmente por hidrólisis. Los ejemplos más comunes de monosacáridos incluyen glucosa (dextrosa), fructosa, galactosa y ribosa. Los monosacáridos se pueden clasificar de acuerdo con el número de átomos de carbono del carbohidrato, es decir, triosa, que tiene 3 átomos de carbono tales como gliceraldehído y dihidroxiacetona; tetrosa, que tiene 4 átomos de carbono, tales como eritrosa, treosa y eritrulosa; pentosa, que tiene 5 átomos de carbono, tales como arabinosa, lixosa, ribosa, xilosa, ribulosa y xilulosa; hexosa, que tiene 6 átomos de carbono, tales como alosa, altrosa, galactosa, glucosa, gulosa, idosa, manosa, talosa, fructosa, psicosa, sorbosa y tagatosa; heptosa, que tiene 7 átomos de carbono, tales como as manoheptulosa, sedoheptulosa; octosa, que tiene 8 átomos de carbono, tales como 2-ceto-3-deoxi-manooctonato; nonosa, que tiene 9 átomos de carbono, tal como sialosa; y decosa, que tiene 10 átomos de carbono. Los monosacáridos son los componentes básicos de los oligosacáridos como la sacarosa (azúcar común) y otros polisacáridos (como la celulosa y el almidón).

El término "oligosacárido" como se usa en este documento se refiere a un compuesto que comprende dos o más unidades de monosacárido, como se definen en el presente documento. Preferentemente, un oligosacárido comprende de 2-6 monosacáridos. Como alternativa, un oligosacárido comprende de 2-4 monosacáridos, o además como alternativa, un oligosacárido es un resto de disacárido que tiene dos unidades de monosacárido.

Los donantes y aceptores están diseñados para formar los compuestos deseados de acuerdo con algunas realizaciones de la presente invención. A continuación se describen algunas realizaciones de este aspecto del presente procedimiento, presentando procedimientos ejemplares de preparación de subconjuntos ejemplares de los compuestos descritos en el presente documento. Los procedimientos detallados de preparación de compuestos ejemplares de acuerdo con algunas realizaciones de la presente invención se presentan en la sección de Ejemplos que sigue a continuación.

Las síntesis de los compuestos de acuerdo con algunas realizaciones de la presente invención, generalmente incluyen (i) preparar un compuesto aceptor por protección selectiva de uno o más hidroxilos y aminas en posiciones seleccionadas presentes en el armazón de paromamina, dejando una o dos posiciones desprotegidas y por lo tanto libre de aceptar un compuesto donante (glicosilo) como se define en el presente documento; (ii) preparar un compuesto donante mediante la protección selectiva de uno o más hidroxilos y aminas en posiciones seleccionadas presentes en el glicosilo, dejando una posición desprotegida y por lo tanto libre para acoplarse con un compuesto aceptor como se define en el presente documento; (iii) someter al donante y al aceptor a una reacción de acoplamiento; y (iii) retirar todos los grupos protectores para obtener de ese modo el compuesto deseado.

La expresión "grupo protector", como se usa en el presente documento, se refiere a un sustituyente que se emplea comúnmente para bloquear o proteger una funcionalidad particular mientras reaccionan otros grupos funcionales en el compuesto. Por ejemplo, un "grupo aminoprotector" es un sustituyente unido a un grupo amino que bloquea o protege la funcionalidad amino en el compuesto. Los grupos protectores de amino adecuados incluyen azida (azido), N-ftalimido, N-acetilo, N-trifluoroacetilo, N-t-butoxicarbonilo (BOC), N-benciloxicarbonilo (CBz) y N-9-fluorenilmetilenxicarbonilo (Fmoc). De forma similar, un "grupo protector de hidroxilo" se refiere a un sustituyente de un grupo hidroxilo que bloquea o protege la funcionalidad hidroxilo. Los grupos protectores adecuados incluyen isopropiliden cetal y ciclohexanona dimetil cetal (formando un 1,3-dioxano con dos grupos hidroxilo adyacentes), 4-metoxi-1-metilbenceno (que forman un 1,3-dioxano con dos grupos hidroxilo adyacentes), O-acetilo, O-cloroacetilo, O-benzoilo y O-sililo. Para una descripción general de los grupos protectores y su uso, véase T. W. Greene, Protective Groups in Organic Synthesis, John Wiley & Sons, Nueva York, 1991.

De acuerdo con algunas realizaciones, los grupos protectores de amino incluyen un grupo azido (N³-) y/o N-ftalimido, y los grupos protectores de hidroxilo incluyen O-acetilo (AcO-), O-benzoílo (BzO-) y/u O-cloroacetilo. Se observa en el presente documento que, cuando sea aplicable, un "grupo protector" se refiere a un resto que puede proteger una función reactiva en un compuesto o más de una función al mismo tiempo, como en el caso de dos funcionalidades adyacentes, por ejemplo, dos grupos hidroxilo que pueden protegerse a la vez mediante un cetal de isopropilideno. Por tanto, se proporciona un procedimiento para preparar los compuestos que tienen la Fórmula general I como se presenta en el presente documento. El procedimiento se efectúa preparando un compuesto aceptor adecuadamente protegido y un compuesto donante adecuadamente protegido, acoplando estos dos compuestos entre sí y retirando posteriormente todos los grupos protectores del compuesto resultante.

El compuesto donante es un monosacárido protegido que puede representarse por la Fórmula general II, que tiene un grupo saliente en la posición 1" del mismo, denominado L, y un alquilo, cicloalquilo o arilo en la posición 5", denominado R¹:

en la que:

R¹es un alquilo que tiene de 1-4 átomos de carbono;

R⁴es hidrógeno o un grupo protector de amino donante;

R⁵es un grupo protector de amino donante si R⁴es hidrógeno o hidrógeno si R⁴es un grupo protector de amino donante; y cada uno de HPd es un grupo protector de hidroxilo donante.

Se observa en este documento que la estereoconfiguración absoluta del centro quiral en la posición 5" está determinada por la identidad de R⁴y R⁵, dando ambas opciones de configuración R y S como dos donantes individuales y separables (que son diastereómeros) o como una mezcla racémica de los mismos. En la sección de Ejemplos a continuación se presenta un procedimiento detallado para obtener cada uno de los compuestos donantes R y S y un procedimiento para asignar la estereoconfiguración absoluta de los mismos.

Como se usa en el presente documento, la frase "grupo saliente" describe un átomo, grupo o resto químico lábil que se desprende fácilmente de una molécula orgánica durante una reacción química, mientras que el desprendimiento es facilitado por la estabilidad relativa del átomo, grupo o resto saliente sobre el mismo. Por lo general, cualquier grupo que sea la base conjugada de un ácido fuerte puede actuar como grupo saliente. Los ejemplos representativos de grupos salientes adecuados según las presentes realizaciones incluyen, por tanto, sin limitación, tricloroacetimidato, acetato, tosilato, triflato, sulfonato, azida, haluro, hidroxi, tiohidroxi, alcoxi, cianato, tiocianato, nitro y ciano.

De acuerdo algunas realizaciones del presente procedimiento, el grupo saliente es tricloroacetimidato, que dio los resultados más satisfactorios en la reacción de acoplamiento con el aceptor, aunque se contemplan otros grupos salientes.

De acuerdo con algunas realizaciones del presente procedimiento, cada uno de los grupos protectores de hidroxilo donadores es O-benzoílo y el grupo protector de amino donador en R⁴o R⁵es azido, aunque se contemplan otros grupos protectores.

La estructura del compuesto donante establece la estructura absoluta del Anillo III en el compuesto resultante de acuerdo con algunas realizaciones de la presente invención, a saber, la estereoconfiguración de la posición 5" y el tipo de alquilo en esa posición. Los compuestos donantes ejemplares, adecuados para producir compuestos de acuerdo con algunas realizaciones de la presente invención, incluyen el Compuesto (S)-17 y el Compuesto (R)-18, la preparación de los mismos se ilustra en el Esquema 2 a continuación.

El aceptor, de acuerdo con algunas realizaciones, tiene la Fórmula general III:

en la que:

la línea discontinua indica una configuración R o una configuración S;

R³se selecciona entre el grupo que consiste en hidrógeno y un alquilo que tiene de 1-4 átomos de carbono; R⁶es un grupo protector de amino aceptor o (S)-4-azido-2-0-acetil-1-butirilo (una forma protegida de AHB); HPa es un grupo protector de hidroxilo aceptor; y

APa es un grupo protector de amino aceptor.

De acuerdo con algunas realizaciones del presente procedimiento, el grupo protector de hidroxilo aceptor es O-acetilo, y el grupo protector de amino donante es azido, aunque se contemplan otros grupos protectores.

Se indica en el presente documento que la realización ejemplar proporcionada anteriormente se refiere a un AHB protegido, sin embargo, no pretende limitar el uso del resto AHB ya que en su lugar se pueden usar otros restos útiles, tales como AHP como se presentó anteriormente. En esos casos, el procedimiento se modificará usando un compuesto aceptor en el que los grupos reactivos del resto usado en lugar de AHB están protegidos en consecuencia. La estructura del compuesto aceptor establece la estructura absoluta del Anillo I y el Anillo II en el compuesto resultante de acuerdo con algunas realizaciones de la presente invención, a saber, la estereoconfiguración de la posición ⁶' y el tipo de alquilo en esa posición cuando está presente. y el sustituyente del grupo amino en la posición N1. Los compuestos aceptores ejemplares, adecuados para producir compuestos de acuerdo con algunas realizaciones de la presente invención, incluyen los Compuestos 19, 20, 219 y 220, cuya preparación se ilustra en el Esquema 3 y el Esquema 4 a continuación en el presente documento.

Por tanto, el procedimiento se realiza mediante:

(a) proporcionar tanto el compuesto donante deseado como el compuesto aceptor deseado;

(a) acoplar el compuesto aceptor mencionado anteriormente al compuesto donante mencionado anteriormente (también denominado reacción de glicosilación); y

(b) retirar posteriormente cada uno de los grupos protectores para obtener así el compuesto deseado.

Por ejemplo, el compuesto ejemplar NB118 puede proporcionarse desprotegiendo el compuesto (S)-21, el cual se obtiene glicosilando (acoplando) el compuesto aceptor 19 con el compuesto donante (S)-17. En correspondencia, el compuesto ejemplar NB119 se obtiene desprotegiendo el compuesto (R)-22 el cual es el producto de acoplar el compuesto aceptor 19 con el compuesto donante (R)-18.

De forma similar, el compuesto ejemplar NB122 se obtiene desprotegiendo el compuesto (S)-23, el producto de acoplamiento entre el compuesto aceptor 20 y el compuesto donante (S)-17. En correspondencia, el compuesto ejemplar NB123 se obtiene desprotegiendo el compuesto (R)-24 el cual es el producto de acoplar el compuesto aceptor 20 con el compuesto donante (R)-18.

El compuesto ejemplar NB124 se obtiene desprotegiendo el compuesto (S)-221, el producto de acoplamiento entre el compuesto aceptor 219 y el compuesto donante (S)-17. En correspondencia, el compuesto ejemplar NB125 se obtiene desprotegiendo el compuesto (R)-222 el cual es el producto de acoplar el compuesto aceptor 219 con el compuesto donante (R)-18.

El compuesto ejemplar NB127 se obtiene desprotegiendo el compuesto (S)-223, el producto de acoplamiento entre el compuesto aceptor 220 y el compuesto donante (S)-17. En correspondencia, el compuesto ejemplar NB128 se obtiene desprotegiendo el compuesto (R)-224 el cual es el producto de acoplar el compuesto aceptor 220 con el compuesto donante (R)-18.

Como se demuestra en la sección de Ejemplos que sigue, los compuestos presentados en este documento se diseñaron para poseer, y de hecho se demostró que, poseen una actividad de supresión de la mutación de truncamiento, a saber, la capacidad de inducir la lectura completa de una mutación de codón de parada prematura. Tal actividad hace que estos compuestos sean adecuados para su uso como agentes terapéuticamente activos para el tratamiento de trastornos genéticos, y particularmente los trastornos que se caracterizan por una mutación de truncamiento.

Por tanto, de acuerdo con otro aspecto de la presente invención, se proporciona un uso de compuestos representados en el presente documento por la Fórmula general I en el tratamiento de un trastorno genético. El tratamiento, de acuerdo con algunas realizaciones de este aspecto de la presente invención, se efectúa administrando a un sujeto que lo necesite una cantidad terapéuticamente eficaz de uno o más de los compuestos presentados aquí que tienen una Fórmula general I.

Como se usa en el presente documento, el término "tratar" incluye anular, inhibir sustancialmente, ralentizar o revertir la progresión de una afección, mejorar sustancialmente los síntomas clínicos o estéticos de una afección o prevenir sustancialmente la aparición de síntomas clínicos o estéticos de una afección.

Como se usa en el presente documento, la frase "cantidad terapéuticamente eficaz" describe una cantidad del polímero que se administra que aliviará hasta cierto punto uno o más de los síntomas de la afección que se está tratando.

La frase "trastorno genético", como se usa en el presente documento, se refiere a un trastorno crónico causado por uno o más genes defectuosos que a menudo se heredan de los padres, y que puede ocurrir inesperadamente cuando dos portadores sanos de un gen recesivo defectuoso se reproducen o cuando el gen defectuoso es dominante. Los trastornos genéticos pueden producirse en diferentes patrones de herencia que incluyen el patrón autosómico dominante en el que solo se necesita una copia mutada del gen para que una descendencia se vea afectada, y el patrón autosómico recesivo en el que dos copias del gen deben estar mutadas para que una descendencia esté afectada.

De acuerdo con algunas realizaciones, el trastorno genético implica un gen que tiene una mutación de truncamiento que conduce a una traducción incorrecta del mismo. La traducción incorrecta provoca una reducción o abolición de la síntesis de una proteína esencial.

Los ejemplos de tales trastornos genéticos incluyen, pero no se limitan a, fibrosis quística (FQ), Distrofia muscular de Duchenne (DMD), ataxia-telangiectasia, Síndrome de Hurler, hemofilia A, hemofilia B, Síndrome de Usher y Tay-Sachs.

En consecuencia, se proporciona el uso de un compuesto que tiene la Fórmula I general como se presenta en el presente documento en la fabricación de un medicamento para tratar un trastorno genético.

En cualquiera de los procedimientos y usos descritos en el presente documento, los compuestos descritos en el presente documento pueden usarse ya sea en sí mismos o formando parte de una composición farmacéutica, que además comprende un vehículo farmacéuticamente aceptable.

Por lo tanto, de acuerdo además con la presente invención, se proporciona una composición farmacéutica que comprende, como un principio activo, cualquiera de los novedosos compuestos descritos en el presente documento y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

Como se usa en el presente documento, una "composición farmacéutica" se refiere a una preparación de los compuestos presentados en el presente documento, con otros componentes químicos tales como vehículos y excipientes farmacéuticamente aceptables y adecuados. El fin de una composición farmacéutica es facilitar la administración de un compuesto a un organismo.

En lo sucesivo en el presente documento, la frase "vehículo farmacéuticamente aceptable" se refiere a un vehículo o diluyente que no provoca irritación significativa a un organismo y no anula la actividad biológica y las propiedades del compuesto administrado. Los ejemplos, sin limitaciones, de vehículos son: propilenglicol, solución salina, emulsiones y mezclas de disolventes orgánicos con agua, así como vehículos sólidos (por ejemplo, en polvo) y gaseosos.

En el presente documento el término "excipiente" se refiere a una sustancia inerte añadida a una composición farmacéutica para facilitar adicionalmente la administración de un compuesto. Los ejemplos, sin limitación, de excipientes incluyen carbonato cálcico, fosfato cálcico, diversos azúcares y tipos de almidón, derivados de celulosa, gelatina, aceites vegetales y polietilenglicoles.

Las técnicas para la formulación y administración de fármacos se pueden encontrar en "Remington's Pharmaceutical Sciences" Mack Publishing Co., Easton, PA, última edición.

Las composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden fabricarse mediante procedimientos bien conocidos en la técnica, por ejemplo, por medio de mezcla convencional, disolución, granulación, preparación de grageas, levigación, emulsión, encapsulación, procedimientos de atrapamiento o liofilización.

Las composiciones farmacéuticas para su uso de acuerdo con la presente invención pueden formularse por lo tanto de manera convencional usando uno o más vehículos farmacéuticamente aceptables que comprenden excipientes y adyuvantes, que facilitan el procesamiento de los compuestos presentados en el presente documento en preparaciones que, pueden usarse farmacéuticamente. La formulación adecuada depende de la vía de administración elegida.

De acuerdo con algunas realizaciones, la administración se efectúa por vía oral. Para la administración oral, los compuestos presentados en el presente documento pueden formularse fácilmente combinando los compuestos con vehículos farmacéuticamente aceptables bien conocidos en la técnica. Dichos vehículos permiten que los compuestos presentados en el presente documento se formulen como comprimidos, píldoras, grageas, cápsulas, líquidos, geles, jarabes, pastas, suspensiones y similares, para ingestión oral por parte de un paciente. Las preparaciones farmacológicas para uso oral pueden realizarse usando un excipiente sólido, opcionalmente moliendo la mezcla resultante y procesando la mezcla de gránulos, después de añadir auxiliares adecuados si se desea, para obtener comprimidos o núcleos de grageas. Los excipientes adecuados son, en particular, cargas tales como azúcares, incluyendo lactosa, sacarosa, manitol o sorbitol; preparaciones de celulosa tales como, por ejemplo, almidón de maíz, almidón de trigo, almidón de arroz, almidón de patata, gelatina, goma tragacanto, metilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, carbometilcelulosa sódica; y/o polímeros fisiológicamente aceptables tales como polivinilpirrolidona (PVP). Si se desea, pueden añadirse agentes disgregantes, tales como polivinilpirrolidona reticulada, agar o ácido algínico o una sal del mismo tal como alginato sódico.

Las composiciones farmacéuticas, que pueden usarse por vía oral, incluyen cápsulas de ajuste rápido hechas de gelatina así como cápsulas blandas, selladas hechas de gelatina y un plastificante, tales como glicerol o sorbitol. Las cápsulas de ajuste rápido pueden contener los principios activos mezclados con una carga tal como lactosa, aglutinantes tales como almidones, lubricantes como talco o estearato de magnesio y, opcionalmente, estabilizantes. En las cápsulas blandas, los compuestos presentados en el presente documento pueden disolverse o suspenderse en líquidos adecuados, tales como aceites grasos, parafina líquida o polietilenglicoles líquidos. Además, pueden añadirse estabilizantes. Todas las formulaciones para administración oral deben estar en dosis adecuadas para la vía de administración elegida.

Para inyección, los compuestos presentados en el presente documento pueden formularse en soluciones acuosas, preferentemente en tampones fisiológicamente compatibles tales como solución de Hank, solución de Ringer o tampón salino fisiológico con o sin disolventes orgánicos tales como propilenglicol, polietilenglicol.

Para administración transmucosa, se usan penetrantes en la formulación. Dichos penetrantes son generalmente conocidos en la técnica.

Los núcleos de grageas se proporcionan con recubrimientos adecuados. Para ello, pueden usarse soluciones concentradas de azúcar que pueden contener opcionalmente goma arábiga, talco, polivinilpirrolidona, gel de carbopol, polietilenglicol, dióxido de titanio, soluciones de laca y disolventes orgánicos o mezclas de disolventes adecuados. Pueden añadirse colorantes o pigmentos a los comprimidos o recubrimientos de grageas para identificación o para caracterizar diferentes combinaciones de dosis de compuestos de aminoglicosidos activos.

Para administración bucal, las composiciones pueden tomar la forma de comprimidos o pastillas para chupar formuladas de manera convencional.

Para la administración por inhalación, los compuestos presentados en el presente documento se administran convenientemente en forma de una presentación en aerosol (que generalmente incluye vehículos en polvo, licuados y/o gaseosos) desde un paquete presurizado o un nebulizador, con el uso de un propulsor adecuado, por ejemplo, diclorodifluorometano, triclorofluorometano, diclorotetrafluoroetano o dióxido de carbono. En el caso de un aerosol presurizado, la unidad de dosificación puede determinarse proporcionando una válvula para administrar una cantidad medida. Las cápsulas y cartuchos de, por ejemplo, gelatina para su uso en un inhalador o insuflador pueden formularse conteniendo una mezcla en polvo de los compuestos presentados en el presente documento y una base en polvo adecuada tales como, pero no limitado a, lactosa o almidón.

Los compuestos presentados en el presente documento pueden formularse para administración parenteral, por ejemplo, mediante inyección en bolo o infusión continua. Las formulaciones para inyección pueden presentarse en forma de dosificación unitaria, por ejemplo, en ampollas o en envases multidosis con opcionalmente, un conservante añadido. Las composiciones pueden ser suspensiones, soluciones o emulsiones en vehículos oleaginosos u acuosos y pueden contener agentes de formulación tales como agentes de suspensión, estabilizantes y/o dispersantes.

Las composiciones farmacéuticas para administración parenteral incluyen soluciones acuosas de la preparación de compuestos en forma hidrosoluble. De manera adicional, las suspensiones de los compuestos presentados en el presente documento pueden prepararse como suspensiones y emulsiones oleaginosas apropiadas para inyección (por ejemplo, emulsiones de agua en aceite, de aceite en agua o de agua en aceite en aceite). Los disolventes o vehículos lipófilos adecuados incluyen aceites grasos tales como el aceite de sésamo o ésteres de ácidos grasos sintéticos tales como el oleato de etilo, triglicéridos o liposomas. Las suspensiones inyectables acuosas pueden contener sustancias, que aumentan la viscosidad de la suspensión, tales como carboximetilcelulosa sódica, sorbitol o dextrano. Opcionalmente, la suspensión también puede contener estabilizantes o agentes adecuados, que aumentan la solubilidad de los compuestos presentados en el presente documento para permitir la preparación de soluciones altamente concentradas.

Alternativamente, los compuestos presentados en el presente documento pueden estar en forma de polvo para su constitución con un vehículo adecuado, por ejemplo, agua estéril libre de pirógenos, antes de su uso.

Los compuestos presentados en el presente documento también pueden formularse en composiciones rectales tales como supositorios o enemas de retención, usando, por ejemplo, bases de supositorios convencionales tales como manteca de cacao u otros glicéridos.

Las composiciones farmacéuticas descritas en el presente documento también pueden comprender vehículos o excipientes sólidos o en fase de gel adecuados. Los ejemplos de tales vehículos o excipientes incluyen, pero no se limitan a, carbonato cálcico, fosfato cálcico, diversos azúcares, almidones, derivados de celulosa, gelatina y polímeros tales como polietilenglicoles.

Las composiciones farmacéuticas adecuadas para su uso en el contexto de la presente invención incluyen composiciones en las que los principios activos están contenidos en una cantidad eficaz para lograr el fin pretendido. Más específicamente, una cantidad terapéuticamente eficaz significa una cantidad de compuestos presentados en el presente documento eficaces para prevenir, aliviar o mejorar los síntomas del trastorno o prolongar la supervivencia del sujeto a tratar.

La determinación de una cantidad terapéuticamente eficaz está dentro de la capacidad de los expertos en la materia, especialmente a la luz de la divulgación detallada que se proporciona en el presente documento.

Para cualquier compuesto presentado en el presente documento usado en los procedimientos de las presentes realizaciones, la cantidad o dosis terapéuticamente eficaz puede estimarse inicialmente a partir de ensayos de actividad en animales. Por ejemplo, puede formularse una dosis en modelos animales para lograr un intervalo de concentración circulante que incluye los niveles de supresión de mutaciones determinados por ensayos de actividad (por ejemplo, la concentración de los compuestos de prueba que logra una lectura sustancial de la mutación de truncamiento). Esta información puede usarse para determinar con mayor precisión las dosis útiles en humanos.

La toxicidad y la efectividad terapéutica de los compuestos presentados en el presente documento pueden determinarse mediante procedimientos farmacéuticos convencionales en animales de experimentación, por ejemplo, determinando la CE⁵⁰(la concentración de un compuesto en la que se observa el 50 % de su efecto máximo) y la DL⁵⁰(dosis letal que provoca la muerte en el 50 % de los animales probados) para un compuesto objeto. Los datos obtenidos de estos ensayos de actividad y estudios en animales pueden usarse para formular un intervalo de dosis para su uso en humanos.

La dosificación puede variar dependiendo de la forma de dosificación empleada y la vía de administración utilizada. La formulación exacta, la vía de administración y la dosificación pueden elegirse por el médico individual en vista del estado del paciente. (Véase, por ejemplo, Fingl y col., 1975, en "The Pharmacological Basis of Therapeutics", Cap. 1 p.1).

La cantidad y el intervalo de dosificación pueden ajustarse individualmente para proporcionar niveles en plasma de los compuestos presentados en el presente documento que sean suficientes para mantener los efectos deseados, denominada la concentración mínima eficaz (CME). La CME variará para cada preparación, pero puede estimarse a partir de datos in vitro; por ejemplo, la concentración de los compuestos necesaria para lograr el 50-90 % de expresión de todo el gen que tiene una mutación de truncamiento, es decir, lectura completa del codón de mutación. Las dosificaciones necesarias para lograr la CME dependerán de las características individuales y la vía de administración. Pueden usarse ensayos de HPLC o bioensayos para determinar las concentraciones en plasma.

Los intervalos de dosificación también pueden determinarse usando el valor de CME. Las preparaciones deben administrarse usando un régimen, que mantiene los niveles plasmáticos por encima de la CME durante el 10-90 % del tiempo, preferentemente entre el 30-90 % y lo más preferentemente el 50-90 %.

Dependiendo de la gravedad y la capacidad de respuesta de la enfermedad crónica a tratar, la dosificación también puede ser una única administración periódica de una composición de liberación lenta descrita anteriormente en el presente documento, con un transcurso de tratamiento periódico que dura desde varios días hasta varias semanas o hasta que se efectúa una mejoría suficiente durante el tratamiento periódico o se logra una disminución sustancial del estado de trastorno para el tratamiento periódico.

La cantidad de una composición a administrar será, por supuesto, dependiente del sujeto que se esté tratando, la gravedad de la aflicción, la forma de administración, el juicio del médico que prescribe, etc. Las composiciones de la presente invención pueden, si se desea, presentarse en un envase o dispositivo dispensador, tales como un kit aprobado por la FDA (la Food and Drug Administration de EE.UU.), que puede contener una o más formas de dosificación unitarias que contienen el principio activo. El envase puede, por ejemplo, comprender una lámina de metal o plástico, tales como, pero no limitado a un envase tipo blíster o un recipiente presurizado (para inhalación). El envase o dispositivo dispensador puede ir acompañado de instrucciones de administración. El envase o dispensador también puede ir acompañado de un aviso asociado con el recipiente en una forma prescrita por una agencia gubernamental que regula la fabricación, el uso o la venta de productos farmacéuticos, cuyo aviso refleja la aprobación por parte de la agencia de la forma de las composiciones para administración humana o veterinaria. Tal aviso, por ejemplo, puede ser de un etiquetado aprobado por la Food and Drug Administration de EE.UU. para medicamentos recetados o de un prospecto de producto aprobado. Las composiciones que comprenden un compuesto de acuerdo con las presentes realizaciones, formuladas en un vehículo farmacéutico compatible, también pueden prepararse, colocarse en un recipiente apropiado y etiquetarse para el tratamiento de una afección o diagnóstico indicado, como se detalla anteriormente en el presente documento.

Por lo tanto, en algunas realizaciones, la composición farmacéutica se envasa en un material de embalaje y se identifica en forma impresa, en o sobre el material de embalaje, para su uso en el tratamiento de un trastorno genético, como se define en el presente documento.

En cualquiera de las composiciones, los procedimientos y los usos descritos en el presente documento, los compuestos se utilizan en combinación con otros agentes útiles en el tratamiento del trastorno genético.

Estando principalmente dirigidos al tratamiento de trastornos genéticos, que son crónicos por definición, se espera que los compuestos presentados en el presente documento o las composiciones farmacéuticas que los contienen se administren durante toda la vida del sujeto que se está tratando. Por lo tanto, el modo de administración de las composiciones farmacéuticas que contienen los compuestos debe ser tal que sea fácil y cómodo para la administración, preferentemente por autoadministración, y de tal manera que tenga el menor coste posible en el bienestar y el transcurso de la vida del paciente.

Puede efectuarse la administración repetitiva y periódica de los compuestos presentados en el presente documento o de las composiciones farmacéuticas que los contienen, por ejemplo, en una base diaria, es decir, una vez al día, más preferentemente la administración se efectúa en una base semanal, es decir, una vez a la semana, más preferentemente la administración se efectúa en una base mensual, es decir, una vez al mes, y lo más preferentemente la administración se efectúa una vez cada varios meses (por ejemplo, cada 1,5 meses, 2 meses, 3 meses, 4 meses, 5 meses, o incluso 6 meses).

Como se analizó anteriormente, algunas de las limitaciones para usar aminoglucósidos actualmente conocidos como fármacos de lectura de mutación de truncamiento están asociadas al hecho de que son principalmente antibacterianos (usados como agentes antibióticos). El uso crónico de cualquier agente antibacteriano es muy injustificado e incluso potencialmente mortal, ya que altera la flora microbiana intestinal que puede causar o empeorar otras afecciones médicas como el agravamiento de la enfermedad inflamatoria intestinal y puede provocar la aparición de resistencia en algunas cepas patológicas de microorganismos.

En algunas realizaciones, los compuestos presentados en el presente documento no tienen sustancialmente actividad antibacteriana. Por "sin actividad antibacteriana" se entiende que la concentración mínima de inhibición (CMI) de la misma para una cepa particular es mucho mayor que la concentración de un compuesto que se considera un antibiótico con respecto a esta cepa. Además, la CMI de estos compuestos es notablemente más alta que la concentración requerida para ejercer la actividad de supresión de mutaciones por truncamiento.

Siendo sustancialmente no bactericida, los compuestos presentados en el presente documento no ejercen los efectos adversos mencionados anteriormente y, por lo tanto, pueden administrarse mediante vías de absorción que pueden contener microorganismos benignos y/o beneficiosos que no están dirigidos y, por lo tanto, su conservación puede incluso ser necesaria. Esta importante característica de los compuestos presentados en el presente documento hace que estos compuestos sean fármacos particularmente eficaces contra enfermedades crónicas, ya que pueden administrarse repetidamente y durante el tiempo de vida, sin provocar ningún adverso relacionado con los efectos adversos acumulables antibacterianos y además puede administrarse por vía oral o rectal, es decir, a través del tracto GI, que es una característica muy útil e importante para un medicamento dirigido al tratamiento de trastornos crónicos.

Como se analizó anteriormente, de acuerdo con algunas realizaciones, los compuestos presentados en el presente documento son selectivos hacia el sistema de traducción celular eucariota frente al de las células procariotas, a saber, los compuestos exhiben una mayor actividad en las células eucariotas, tales como aquellas de mamíferos (humanos) en comparación con su actividad en células procariotas, tales como aquellas de las bacterias. Sin desear quedar ligado a teoría particular alguna, se supone que los compuestos presentados en el presente documento, que se sabe que actúan uniéndose al sitio A del ARN ribosómico 16s mientras que el ribosoma está implicado en la traducción de un gen, tienen una afinidad más alta por el sitio A del ribosoma eucariota, o son selectivos hacia el sitio A eucariota, frente al sitio A ribosómico procariota, así como el sitio A del ribosoma mitocondrial que se asemeja a su contraparte procariota.

Como se usa en el presente documento, el término "aproximadamente" se refiere a ± 10 %.

Las expresiones "comprende", "que comprende", "incluye", "que incluye", "que tiene" y sus conjugados significan "que incluye pero no se limita a".

La expresión "que consiste en" significa "que incluye y se limita a".

La expresión "que consiste esencialmente en" significa que la composición, el procedimiento o la estructura pueden incluir ingredientes, etapas y/o partes adicionales, pero solo si los ingredientes, etapas y/o partes adicionales no alteran materialmente las características básicas y novedosas de la composición, el procedimiento o la estructura reivindicados.

Como se usa en el presente documento, la forma singular "un", "uno" y "el/la" incluyen referentes plurales salvo que el contexto dicte claramente lo contrario. Por ejemplo, la expresión "un compuesto" o "al menos un compuesto" puede incluir una pluralidad de compuestos, incluyendo mezclas de los mismos. A lo largo de la presente solicitud, pueden presentarse diversas realizaciones de la presente invención en un formato de intervalo. Debe entenderse que la descripción en formato de intervalo es meramente por conveniencia y brevedad y no debe interpretarse como una limitación inflexible del ámbito de la invención. En consecuencia, debe considerarse que la descripción de un intervalo tiene específicamente desvelados todos los subintervalos posibles, así como los valores numéricos individuales dentro de ese intervalo. Por ejemplo, debe considerarse que la descripción de un intervalo como de 1 a 6 tiene subintervalos específicamente desvelados tales como de 1 a 3, de 1 a 4, de 1 a 5, de 2 a 4, de 2 a 6, de 3 a 6 etc., así como números individuales dentro de ese intervalo, por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5 y 6. Esto se aplica independientemente de la amplitud del intervalo.

Siempre que se indique un intervalo numérico en el presente documento, se pretende que incluya cualquier número citado (fraccionario o entero) dentro del intervalo indicado. Las frases "que varía/varía entre" un primer número de indicación y un segundo número de indicación y "que varía/varía entre" un primer número de indicación "a" un segundo número de indicación se usan en el presente documento indistintamente y pretenden incluir el primer y segundo números indicados y todos los numerales fraccionarios y enteros entre ellos.

Como se usa en el presente documento, el término "procedimiento" se refiere a maneras, medios, técnicas y procedimientos para realizar una tarea determinada incluyendo, pero no limitado a, esas maneras, medios, técnicas y procedimientos conocidos o desarrollados fácilmente a partir de maneras, medios, técnicas y procedimientos conocidos por los practicantes de las técnicas químicas, farmacológicas, biológicas, bioquímicas y médicas.

Se espera que durante la vida de una patente que madura a partir de esta solicitud, se desarrollarán muchos aminoglucósidos relevantes que tienen un grupo alquilo de 5" y el ámbito de este término pretende incluir todas estas nuevas tecnologías a priori.

Se aprecia que determinadas características de la invención, que, por claridad, se han descrito en el contexto de realizaciones separadas, también pueden proporcionarse en combinación en una única realización. A la inversa, diversas características de la invención, que, por brevedad, se han descrito en el contexto de una única realización, también puede proporcionarse por separado o en cualquier subcombinación adecuada o según sea adecuado en cualquier otra realización descrita de la invención. Ciertas características descritas en el contexto de diversas realizaciones no deben considerarse características esenciales de esas realizaciones, a menos que la realización no funcione sin esos elementos.

Diversas realizaciones y aspectos de la presente invención como se delinean anteriormente en el presente documento y como se reivindica en la sección de reivindicaciones a continuación encuentran apoyo experimental en los siguientes ejemplos.

Ejemplos

Ahora se hace referencia a los siguientes ejemplos, los cuales junto con las descripciones anteriores ilustran algunas realizaciones de la invención de forma no limitativa.

EJEMPLO 1

SÍNTESIS QUÍMICA

Procedimientos sintéticos:

Los compuestos NB118, NB119, NB122, NB123, NB124, NB125, NB127 y NB128 se sintetizaron de acuerdo con un procedimiento general que implica la construcción del Anillo III como dos compuestos individuales que poseen (S)-5-metilo y (R)-5-metilo con estereoquímica ya establecida (compuesto (S)-17 y compuesto (R)-18) y usándolos como donantes para las reacciones de glicosilación. Estos donantes eran fácilmente accesibles a partir del compuesto tioglucósido 7 conocido como se ilustra en el Esquema 2 a continuación (en el que "a" representa 1,1-dimetoxipropano, CSA, acetona, temperatura ambiente; "b" representa peryodinano de Dess-Martin (DMP), DCM, temperatura ambiente; "c" representa MeMgBr, THF, -30 °C; "d" representa TsCl, Py, 4-DMAP, temperatura ambiente; "e" representa NaN3, HMPA, DMF, 70 °C; "f" representa ácido acético/agua (8:2), reflujo; "g" representa BzCl, Py, 4-d Ma P, temperatura ambiente; "h" representa NBS, acetona/agua (8:2), -30 °C; e "I" representa CCl3CN, DBU, DCM, 0 °C).

Esquema 2

La protección selectiva de hidroxilos C2 y C3 por isopropilidina (2,2-dimetoxipropano/acetona, CSA) fue seguida por la oxidación del alcohol primario restante usando peryodinano de Dess-Martin (DMP, diclorometano) para producir el compuesto aldehído 8 con un rendimiento del 70 % aislado durante dos etapas. El tratamiento del compuesto 8 con MeMgBr dio el correspondiente alcohol secundario como una mezcla de diasterómeros C5 (proporción 4:1) con un rendimiento aislado del 88 %. Esta mezcla se separó mediante cromatografía en columna ultrarrápida y el diastereoisómero principal se sometió por separado para la asignación de estereoquímica absoluta en la posición C5 (véase posteriormente). Este estudio estableció que los diastereómeros mayor y menor exhiben configuración (R) y (S), respectivamente (compuestos (R)-9 y (S)-10).

Las siguientes etapas del Esquema 2 se realizaron por separado en cada diastereoisómero. La tosilación (TsCl, piridina, 4-DMAP) del alcohol secundario fue seguida por el desplazamiento Sn2 de los tosilatos correspondientes (compuestos (R)-11 y (S)-12) con NaN3 (DMF, HMPA) para proporcionar los compuestos azidas (S)-13 y (R)-14 con configuraciones invertidas. La hidrólisis del isopropiliden cetal con ácido acético acuoso, seguida de benzoilación de los alcoholes secundarios resultantes, proporcionó los compuestos benzoatos (S)-15 y (R)-16. Estudios anteriores sobre el ensamblaje de los pseudotrisacáridos de referencia ejemplares NB30 y NB54 han demostrado que los aceptores de C5 deseados son menos reactivos en las reacciones de glicosilación, y los donantes de tricloroacetimidato dieron resultados satisfactorios.

Se observa que la reacción de glicosilación usando donantes de tioglucósidos, tales como (S)-15 y (R)-16 (véase el Esquema 2 anterior) como donantes, puede proporcionarse en presencia de varios reactivos de glicosilación, incluida la N-yodosucinimida (NIS) y ácido triflorometanosulfónico (HOTf); o NIS y triflato de plata (AgOTf).

Por lo tanto, los compuestos tioglucósidos (S)-15 y (R)-16 se convirtieron en los correspondientes compuestos tricloroacetimidatos (S)-17 y (R)-18 en dos etapas sucesivas; hidrólisis con NBS en acetona acuosa y tratamiento de los hemiacetales resultantes con CChCN en presencia de DBU. Los compuestos donantes (S)-17 y (R)-18 se usaron en reacciones de glicosilación sin purificación adicional.

La síntesis de los ejemplos de compuestos pseudotrisacáridos, NB118, NB119, NB122 y NB123, se logró a partir de los correspondientes aceptores de pseudodisacáridos protegidos selectivamente compuestos 19 y 20, como se informó anteriormente (documento WO 2007/113841) y los compuestos donantes (S)-17 y (R)-18, usando esencialmente las mismas transformaciones químicas, como se ilustra en el Esquema 3 a continuación (en el que "a" representa BF³-Et²O, DCM, 4Á EM, -20 °C; "b" representa MeNH²-EtOH, temperatura ambiente; y "c" representa PMe³, NaOH, THF, temperatura ambiente).

Esquema 3

El ácido de Lewis (BF³-Et²O/DCM) promovió la glicosilación proporcionando los compuestos pseudotrisacáridos protegidos 21-24 con rendimientos aislados del 79-85 %, exclusivamente como beta-anómeros en el enlace glicosídico recién generado. Dos etapas secuenciales de desprotección: tratamiento con metilamina para retirar toda la protección del éster, y la reacción de Staudinger (Me³P, THF/NaOH) para convertir azidas en aminas correspondientes, después proporcionó los compuestos diana NB118, NB119, NB122 y NB123 con rendimientos aislados del 79-82 % durante dos etapas.

Las estructuras de todos los compuestos ejemplares NB118, NB119, NB122, NB123, NB124, NB125, NB127 y NB128 se confirmaron mediante una combinación de varias técnicas de RMN 1D y 2D, incluidos los experimentos 2D 1H-13C HMQC y HMBC, 2D COSY y TOCSY selectivo 1D, junto con análisis espectral de masas (véase ESM).

La Figura 1A-C presenta el plan de síntesis de los ésteres diastereoméricos C5 (R,X)-27 y (S,X)-28, reactivos y condiciones, en la que "a" representa DCC, 4-DMAP, CSA, DCM, a temperatura ambiente (Figura 1A); espectros de RMN 1H de (R,X)-27 y (S,X)-28, en los que se destacan ñas diferencias de desplazamiento químico (□ □ ) entre protones particulares de (R,X)-27 y (S,X)-28 (Figura 1B); y asignación de configuración absoluta en el carbono 5 (indicado por X) del compuesto 9 de alcohol principal por regla de sector (Figura 1C).

Para la asignación de la estereoquímica en los alcoholes C5 de la cadena lateral en los compuestos 9 y 10 (véase Esquema 2), el producto principal compuesto 9 se acopló por separado (usando DCC, 4-DMAP, CSA) con ácido (R)-2-metoxi-2(1-naftil)propanoico (R)-MaNP y (S)-MaNP de estereoquímica absoluta conocida, para producir los correspondientes ésteres (R,X)-MaNP-27 y (s,X)-MaNP-28 (véase Figura 1A), de acuerdo con el procedimiento informado anteriormente. La configuración absoluta en la posición C5 (indicada por X) se determinó después mediante el procedimiento de anisotropía de RMN 1H (Figura 1B-C): la diferencia de desplazamiento químico [Aó = 5(R, X) - 6(S, X)] para H-3 (-0,15) y H-4 (-0,30) fue negativo mientras que para H-6 (+0.28) fue positivo. Una disposición de las estructuras (R,X)-MaNP-27 y (S,X)-MaNP-28 de acuerdo con la regla del Sector (véase Figura 1C: OMaNP y H-5 se colocan en la parte delantera y trasera, respectivamente, mientras que la parte positiva Aó está en el lado derecho del plano MaNP y la parte negativa Aó está en el lado izquierdo) después se confirmó la configuración R (X=R) del C5 en el compuesto 9.

Siguiendo procedimientos sintéticos similares y sintéticos racionales, se logró la síntesis de los pseudotrisacáridos NB124, NB125, NB127 y NB128 (véase Esquema 4 a continuación) a partir de los correspondientes aceptores de pseudodisacáridos protegidos selectivamente Compuestos 219 y 220, como se informó anteriormente (documento WO 2007/113841) y los compuestos donantes (S)-17 y (R)-18, usando esencialmente las mismas transformaciones químicas como se ilustran en el Esquema 3 (en el que "a" representa BF³Et²O, DCM, 4Á EM, -20 °C; "b" representa MeNH²-EtOH, temperatura ambiente; y "c" representa PMe³, NaOH, THF, temperatura ambiente).

Esquema 4

Materiales y procedimientos:

Todas las reacciones se llevaron a cabo en atmósfera de argón con disolventes anhidros, a menos que se indique otra cosa.

Todos los productos químicos, a menos que se indique lo contrario, se obtuvieron de fuentes comerciales como Sigma-Aldrich, Fluka y similares.

Las reacciones se controlaron mediante TLC sobre gel de sílice 60 F²⁵⁴(0,25 mm, Merck), y las manchas se visualizaron carbonizando con una solución de color amarillo que contenía (NH4)Mo7O24-4H2O (120 gramos) y (NH⁴)²Ce(NO³)⁶(5 gramos) en H²SO⁴al 10 % (800 ml).

La cromatografía en columna se realizó en un gel de sílice 60 (malla 70-230).

Los espectros de RMN 1D y 2D se registraron de forma rutinaria en un espectrómetro Bruker Avance™ 500.

El análisis de espectros de masas se obtuvo en un espectrómetro de masas Bruker Daltonix Apex 3 en ionización por pulverización de electrones (IEN), o mediante un espectrómetro de masas TSQ-70B (Finnigan Mat).

En todas las pruebas biológicas, todos los aminoglucósidos probados estaban en sus formas de sal sulfato. Las concentraciones informadas se refieren a las de la forma de amina libre de cada aminoglucósido.

Preparación de 2,3-O-1-metiletiliden-1-tio-P-D-ribopentodialdo-1,4-furanósido de 4-metilfenilo (compuesto 8):

Una mezcla de 1-tio-^-D-ribofuranósido de 4-metilfenilo (compuesto 7, 25 gramos, 0,097 mol) y 1,1-dimetoxipropano (22,3 ml, 0,39 mol) en acetona (500 ml) se agitó a temperatura ambiente durante aproximadamente cinco minutos y después, se añadió una cantidad catalítica de CSA (1,0 gramos) y MgSO⁴(5,0 gramos). El progreso de la reacción se controló por TLC, la cual indicó la finalización después de 5 horas. La mezcla de reacción se diluyó con acetato de etilo y se lavó con NaHCO³saturado y salmuera. La capa orgánica combinada se secó sobre MgSO⁴, se evaporó y se sometió a cromatografía en columna (EtOAc/Hexano) para proporcionar el derivado de 2,3-isopropilideno deseado con un rendimiento del 82 % (23,5 gramos).

RMN 1H (500 MHz, CDCb): 5h 3,73-3,85 (m, 2H, H-5), 4,37 (m, 1H, H-4), 4,74 (dd, 1H, Ji = 2,5, J ² = 6,0 Hz, H-2), 4,80 (dd, 1H, J¹= 1,7, J²= 6,0 Hz, H-3), 5,52 (d, 1H, J = 2,5 Hz, H-1). Se identificaron picos adicionales en el espectro de la siguiente manera: 5h 1,37 (s, 3H, isopropiliden-CH³), 1,53 (s, 3H, isopropiliden-CH³), 2,35 (s, 3H, aril-CH³), 7,16 (d, 2H, J = 8,0 Hz), 7,42 (d, 2H, J = 8,0 Hz).

RMN 13C (125 MHz, CDCI³): 5c 21,0 (CH³), 25,2 (CH³), 26,8 (CH³), 63,2 (C-5), 81,8 (C-3), 85,7 (C-2), 87,7 (C-4), 93,0 (C-1), 113,3 (cuaternario-C), 129,2 (Ar), 129,9 (Ar), 132,3 (Ar), 138,0 (Ar).

MALDI TOFMS calculado para C-i⁵H²⁰O⁴SNa ([M+Na]+) m/e 319,1; medido m/e 319,09.

El producto de la etapa anterior (22 gramos, 0,074 mol) se agitó en diclorometano (500 ml) a temperatura ambiente al cual se le añadieron peryodinano de Dess-Martin (DMP, 34,6 gramos, 0,082 mol) y MgSO⁴(5,0 gramos). El progreso de la reacción se controló por TLC, la cual indicó la finalización después de 8 horas. La mezcla de reacción se diluyó con éter y se lavó con NaHCO³saturado, Na²S²O³y salmuera. La capa orgánica combinada se secó sobre MgSO⁴, se evaporó y se sometió a cromatografía en columna (EtOAc/Hexano) para producir el compuesto 8 (18,0 gramos, rendimiento del 85 %).

RMN 1H (500 MHz, CDCh): 5h 4,49 (s, 1H, H-4), 4,69 (d, 1H, J = 6,5 Hz, H-2), 5,21 (d, 1H, J = 6,0 Hz, H-3), 5,86 (s, 1H, H-1), 9,80 (s, 1H, H-5, CHO). Se identificaron picos adicionales en el espectro de la siguiente manera: 5h 1,37 (s, 3H, isopropiliden-CH³), 1,52 (s, 3H, isopropiliden-CH³), 2,36 (s, 3H, Ar-CH³), 7,19 (d, 2H, J= 8,0 Hz, Ar), 7,41 (d, 2H, J= 8,0 Hz, Ar).

RMN 13C (125 MHz, CDCh): 5c 21,0 (CH³), 25,1 (CH³), 26,2 (CH³), 87,1 (C-3), 84,5 (C-2), 89,9 (C-4), 92,6 (C-1), 113,3 (cuaternario-C), 128,9 (Ar), 130,0 (Ar), 131,0 (Ar), 137,8 (Ar), 200,3 (CHO).

MALDI TOFMS calculado para C¹⁵H¹⁹O⁴S ([M+H]+) m/e 295,1; medido m/e 295,1.

Preparación de 6-deoxi-2,3-O-1-metiletiliden-1-tio-p-D-alofuranósido de 4-metilfenilo (compuesto (R)-9) y 6-deoxi-2,3-O-1-metiletiliden-1-tio-a-L-talofuranósido de 4-metilfenilo (compuesto (S)-10):

El compuesto de aldehido 8 (17 gramos, 0,057 mol) se agitó en THF (200 ml) a -30 °C durante 30 minutos, al cual se le añadió gota a gota con una jeringa una solución de MeMgBr (1,4 M en THF/Tolueno, 235 ml, 0,171 mol). La mezcla de reacción se agitó durante 2 horas a la misma temperatura y el progreso se controló por TLC. Después de completarse, la mezcla de reacción se inactivó con NH⁴Cl saturado y se extrajo con acetato de etilo. La capa orgánica combinada se secó sobre MgSO⁴y se evaporó. El producto en bruto se purificó por cromatografía en columna (EtOAc/Hexano) para proporcionar una relación de 4:1 de dos diastereómeros C5 con un rendimiento del 88%: el compuesto del producto principal (5R)-9 (13 gramos, Rf = 0,38 en EtOAc/Hexano 1:4) y el compuesto del producto secundario (5S)-10 (3 gramos, Rf = 0,48 en EtOAc/Hexano 1:4). La configuración absoluta en la posición C5 se determinó usando el procedimiento de anisotropía de RMN 1H como se describe a continuación.

Datos para el compuesto (5R)-9:

[a]D20 = -191,4 (c = 1,02, CHCh). RMN 1H (500 MHz, CDCh): 5h 1,25 (d, 3H, J = 6,3 Hz, CH³), 4,06 (m, 2H, H-4 y H-5), 4,68 (dd, 1H, J¹= 2,8, J²= 6,3 Hz, H-2), 4,87 (t, 1H, J = 5,0 Hz, H-3), 5,46 (d, 1H, J = 2,8 Hz, H-1). Se identificaron picos adicionales en el espectro de la siguiente manera: 5h 1,37 (s, 3H, isopropiliden-CH³), 1,53 (s, 3H, isopropiliden-CH³), 2,34 (s, 3H, Ar-CH³), 7,15 (d, 2H, J = 8,0 Hz, Ar), 7,42 (d, 2H, J= 8,0 Hz, Ar).

RMN 13C (125 MHz, CDCh): 5c 18,5 (C-6), 21,0 (CH³), 25,2 (CH³), 26,9 (CH³), 67,3 (C-5), 80,2 (C-3), 85,4 (C-2), 91,4 (C-4), 92,5 (C-1), 113,4 (cuaternario-C), 129,2 (Ar), 129,8 (Ar), 132,3 (Ar), 137,9 (Ar).

MALDI TOFMS calculado para C-i⁶H²²O⁴SNa ([M+Na]+) m/e 333,1; medido m/e 333,1.

Datos para el compuesto (5S)-10:

[a]D20 = -199,7 (c = 1,04, CHCh). RMN 1H (500 MHz, CDCh): 5h 1,27 (d, 3H, J = 6,3 Hz, CH³), 3,90 (m, 1H, H-5), 4,08 (dd, 1H, J¹= 1,3, J²= 5,6 Hz, H-4), 4,71 (dd, 1H, J¹= 1,3, J²= 6,0 Hz, H-3), 4,76 (dd, 1H, J¹= 2,1, J²= 6,0 Hz, H-2), 5,57 (d, 1H, J = 2,0 Hz, H-1). Se identificaron picos adicionales en el espectro de la siguiente manera: 5h 1,36 (s, 3H, isopropiliden-CH³), 1,54 (s, 3H, isopropiliden-CH³), 2,35 (s, 3H, Ar-CH³), 7,17 (d, 2H, J = 8,0 Hz, Ar), 7,43 (d, 2H, J = 8,0 Hz, Ar).

RMN 13C (125 MHz, CDCh): 5c 19,2 (C-6), 21,0 (CH³), 25,2 (CH³), 26,8 (CH³), 67,9 (C-5), 82,4 (C-3), 85,7 (C-2), 91,6 (C-4), 93,0 (C-1), 113,3 (cuaternario-C), 129,4 (Ar), 129,9 (Ar), 131,9 (Ar), 137,9 (Ar).

Preparación de ésteres compuesto (R,X)-27 y compuestos (S,X)-28 para la asignación de configuración absoluta en C5:

Una mezcla de ácido (R)-2-metoxi-2(1-naftil)propanoico [(R)-MaNP] o (S)-MaNP (0,07 gramos, 0,0003 mol), 4-dimetilaminopiridina (d Ma P, 0,05 gramos, 0,0004 mol), ácido 10-alcanforsulfónico (CSA, 0,025 gramos) y 1,3-diciclohexilcarbodiimida (DCC, 0,240 gramos, 0,0016 mol) se agitó en CH²Ch (30 ml) a 0 °C. El alcohol principal 9 de lo anterior (0,1 gramos, 0,0003 mol), se disolvió en CH²Ch (5 ml), se añadió lentamente a la mezcla de agitación anterior y la reacción se dejó a temperatura ambiente durante una noche. La mezcla se diluyó con EtOAc y se lavó con una solución de HCl al 1 %, NaHCO³saturado y salmuera. La capa orgánica combinada se secó sobre MgSO⁴, se evaporó y se sometió a una cromatografía en columna (EtOAc/Hexano) para producir los deseados ésteres compuesto (R,X)-27 (0,135 gramos, 80 %) o compuesto (S,X)-28 (0,138 gramos, 80 %).

Datos para el compuesto (R,X)-27:

RMN 1H (500 MHz, CDCI³): 5h 1,23 (d, 3H, J = 6,3 Hz, CH³), 3,54 (d, 1H, J = 6,1 Hz, H-3), 3,72 (d, 1H, J = 9,0 Hz, H-4), 4,18 (dd, 1H, J¹= 2,3, J²= 6,1 Hz, H-2), 5,08 (m, 1H, H-5), 5,32 (d, 1H, J = 2,4 Hz, H-1). Se identificaron picos adicionales en el espectro de la siguiente manera: 5h 1,00 (s, 3H, isopropiliden-CH³), 1,32 (s, 3H, isopropiliden-CH³), 2.04 (s, 3H, CH³), 2,32 (s, 3H, Ar-CH³), 3,14 (s, 3H, OCH³), 7,11 (d, 2H, J = 8,0 Hz, Ar), 7,28-7,31 (m, 2H, Ar), 7,48 7,56 (m, 3H, Ar), 7,65 (d, 1H, J = 8,0 Hz, Ar), 7,85 (dd, 2H, J¹= 4,7, J²= 8,0 Hz, Ar), 8,47 (d, 1H, J = 8,0 Hz, Ar).

RMN 13C (125 MHz, CDCh): 5o 17,1 (C-6), 21,0 (CH³), 21,5 (CH³), 24,8 (CH³), 26,6 (CH³), 50,9 (OCH³), 70,5 (C-5), 81.2 (C-3), 81,3 (cuaternario-C), 84,8 (C-2), 88,0 (C-4), 92,5 (C-1), 112,9 (cuaternario-C), 124,7 (Ar), 125,0 (Ar), 125,7 (Ar), 125,8 (Ar), 126,6 (Ar), 128,8 (Ar), 129,5 (Ar), 129,7 (Ar), 130,3 (Ar), 131,2 (Ar), 131,3 (Ar), 134,0 (Ar), 134,6 (Ar), 137.2 (Ar), 173,1 (C=O).

MALDI TOFMS calculado para C³⁰H³⁴O⁶SNa ([M+Na]+) m/e 545,2; medido m/e 545,2.

Datos para el compuesto (S,X)-28:

RMN 1H (500 MHz, CDCh): 5o 0,95 (d, 3H, J= 6,3 Hz, OH³), 3,84 (dd, 1H, J¹= 1,5, J²= 6,2 Hz, H-3), 3,87 (dd, 1H, J¹= 1,5 y J²= 6,2 Hz, H-4), 4,08 (dd, 1H, J¹= 3,4, J²= 6,1 Hz, H-2), 5,06 (m, 1H, H-5), 5,27 (d, 1H, J = 3,4 Hz, H-1). Se identificaron picos adicionales en el espectro de la siguiente manera: 5h 1,14 (s, 3H, isopropiliden-CH³), 1,41 (s, 3H, isopropiliden-CH³), 2,09 (s, 3H, OH³), 2,33 (s, 3H, Ar-CH³), 3,14 (s, 3H, OCH³), 7,12 (d, 2H, J = 8,0 Hz, Ar), 7,35 (d, 2H, J = 8,0 Hz, Ar), 7,49-7,67 (m, 3H, Ar), 7,69 (d, 1H, J = 8,0 Hz, Ar), 7,88 (d, 2H, J = 8,0 Hz, Ar), 8,41 (d, 1H, J = 8.0 Hz, Ar).

RMN 13C (125 MHz, CDCh): 5o 16,0 (C-6), 21,0 (OH³), 21,5 (OH³), 24,9 (OH³), 26,8 (OH³), 50,8 (OCH³), 71,4 (C-5), 81.0 (C-3), 81,5 (cuaternario-C), 84,7 (C-2), 87,5 (C-4), 92,6 (C-1), 113,3 (cuaternario-C), 124,7 (Ar), 125,2 (Ar), 125,7 (Ar), 126,0 (Ar), 126,4 (Ar), 128,6 (Ar), 129,4 (Ar), 129,7 (Ar), 130,3 (Ar), 131,3 (Ar), 131,5 (Ar), 133,8 (Ar), 134,8 (Ar), 137.4 (Ar), 173,4 (C=O).

Preparación de 6-deoxi-5-O-tosil 2,3-O-1-metiletiliden-1-tio-p-D-alofuranósido de 4-metilfenilo (compuesto (R)-11):

A una solución en agitación del compuesto (R)-9 (13 gramos, 0,041 mol) en piridina (200 ml) a 0 °C, se le añadieron cloruro de tosilo (15,6 gramos, 0,082 mol) y 4-DMAP (1 gramo). La temperatura de reacción se elevó a temperatura ambiente y el progreso se controló mediante TLC. Después de la finalización (36 horas), la mezcla de reacción se diluyó con acetato de etilo y se lavó secuencialmente con una solución acuosa al 1 % de HCl, NaHCO³saturado y salmuera. La capa orgánica combinada se secó sobre MgSO⁴, se evaporó y se sometió a cromatografía en columna (EtOAc/Hexano) para obtener el compuesto (R )- 11 (16,0 gramos) con un rendimiento del 82 %.

RMN 1H (500 MHz, CDCh): 5h 1,28 (d, 3H, J = 6,2 Hz, CH³), 3,99 (d, 1H, J = 8,6 Hz, H-4), 4,60 (dd, 1H, J¹= 2,0, J²= 6.2 Hz, H-2), 4,67 (d, 1H, J = 6,2 Hz, H-3), 4,92 (m, 1H, H-5), 5,48 (d, 1H, J = 1,8 Hz, H-1). Se identificaron picos adicionales en el espectro de la siguiente manera: 5h 1,30 (s, 3H, isopropiliden-CH³), 1,48 (s, 3H, isopropiliden-CH³), 2,34 (s, 3H, Ar-CH³), 2,45 (s, 3H, Ar-CH³) 7,13 (d, 2H, J = 8,0 Hz, Ar), 7,30-7,38 (m, 4H, Ar), 7,87 (d, 2H, J= 8,0 Hz, Ar).

RMN 13C (125 MHz, CDCh): 5c 18,0 (C-6), 21,0 (CH³), 21,6 (CH³), 25,0 (CH³), 26,6 (CH³), 77,1 (C-5), 81,2 (C-3), 85,0 (C-2), 87,9 (C-4), 92,3 (C-1), 113,6 (cuaternario-C), 127,9 (Ar), 129,8 (2C, Ar), 129,9 (Ar), 131,0 (Ar), 133,8 (Ar), 137,4 (Ar), 144,8 (Ar).

MALDI TOFMS calculado para C²³H²⁹O⁶S²([M+H]+) m/e 465,1; medido m/e 465,1.

Preparación de 6-deoxi-5-O-tosil-2,3-O-1-metiletiliden-1-tio-a-L-alofuranósido de 4-metilfenilo (compuesto (S)-12):

A una solución en agitación del compuesto (S)-10 (10 gramos, 0,032 mol) en piridina (200 ml) a 0 °C, se le añadieron cloruro de tosilo (15,6 gramos, 0,082 mol) y 4-DMAP (1 gramo). La temperatura de reacción se elevó a temperatura ambiente y el progreso se controló mediante TLC. Después de la finalización (36 horas), la mezcla de reacción se diluyó con acetato de etilo y se lavó secuencialmente con una solución acuosa al 1 % de HCl, NaHCO³saturado y salmuera. La capa orgánica combinada se secó sobre MgSO⁴, se evaporó y se sometió a cromatografía en columna (EtOAc/Hexano) para obtener el compuesto (S)-12 (14,0 gramos) con un rendimiento del 88 %.

RMN 1H (500 MHz, CDCh): 5h 1,37 (d, 3H, J= 6,4 Hz, CH³), 4,09 (dd, 1H, Ji = 2,8, J ² = 4,3 Hz, H-4), 4,48 (dd, 1H, J¹= 2,8, J²= 6,2 Hz, H-3), 4,55 (dd, 1H, J¹= 4,0, J²= 6,2 Hz, H-2), 4,82 (m, 1H, H-5), 5,25 (d, 1H, J = 4,0 Hz, H-1). Se identificaron picos adicionales en el espectro de la siguiente manera: 5h 1,30 (s, 3H, isopropiliden-CH³), 1,50 (s, 3H, isopropiliden-CH³), 2,35 (s, 3H, Ar-CH³), 2,43 (s, 3H, Ar-CH³) 7,12 (d, 2H, J = 8,0 Hz, Ar), 7,32 (d, 2H, J = 8,0 Hz, Ar), 7,38 (d, 2H, J = 8,0 Hz, Ar), 7,87 (d, 2H, J= 8,0 Hz, Ar).

RMN 13C (125 MHz, CDCh): 5o 17,0 (C-6), 21,0 (Ar-CH³), 21,6 (Ar-CH³), 25,3 (isopropiliden-CH³), 27,2 (isopropiliden CH³), 78,3 (C-5), 81,2 (C-3), 84,6 (C-2), 86,7 (C-4), 92,2 (C-1), 114,1 (cuaternario-C), 127,7 (Ar), 129,6 (Ar), 129,7 (Ar), 129,8 (Ar), 132,3 (Ar), 134,1 (Ar), 137,6 (Ar), 144,7 (Ar).

MALDI TOFMS calculado para C²³H²sO⁶S²Na ([M+Na]+) m/e: 487,1; medido m/e: 487,1

Preparación de 5-azido-5,6-dideoxi-2,3-O-1-metiletiliden-1-tio-a-L-talofuranósido de 4-metilfenilo (compuesto (S)-13):

A una solución en agitación del compuesto (R)-11 (15 gramos, 0,032 mol) en DMF (250 ml) se le añadieron NaN³(10 gramos, 0,15 mol) y HMPA (15 ml) a temperatura ambiente. La temperatura de reacción se elevó a 70 °C y el progreso se controló mediante TLC. Después de la finalización (10 horas), la mezcla de reacción se diluyó con acetato de etilo y se lavó secuencialmente con una solución acuosa al 1 % de HCl, NaHCO³saturado y salmuera. La capa orgánica combinada se secó sobre MgSO⁴, se evaporó y se sometió a cromatografía en columna (EtOAc/Hexano) para obtener el compuesto (S)-13 (6 gramos) con un rendimiento del 55 %.

RMN 1H (500 MHz, CDCh): Sh 1,35 (d, 3H, J = 6,2 Hz, CH³), 3,73 (m, 1H, H-5), 3,99 (dd, 1H, J¹= 3,0, J²= 6,7 Hz, H-4) , 4,56 (dd, 1H, J¹= 3,0, J²= 6,5 Hz, H-3), 4,70 (dd, 1H, J¹= 2,0, J²= 6,2 Hz, H-2), 5,39 (d, 1H, J = 3,2 Hz, H-1). Se identificaron picos adicionales en el espectro de la siguiente manera: Sh 1,36 (s, 3H, isopropiliden-CH³), 1,53 (s, 3H, isopropiliden-CH³), 2,36 (s, 3H, Ar-CH³), 7,15 (d, 2H, J = 8,0 Hz, Ar), 7,46 (d, 2H, J = 8,0 Hz, Ar).

RMN 13C (125 MHz, CDCh): Sc 15,5 (C-6), 21,1 (Ar-CH³), 25,4 (isopropiliden-CH³), 27,1 (isopropiliden-CH³), 58,2 (C-5) , 81,9 (C-3), 85,1 (C-2), 88,9 (C-4), 91,9 (C-1), 114,2 (cuaternario-C), 129,5 (Ar), 129,7 (Ar), 132,4 (Ar), 138,8 (Ar).

MALDI TOFMS calculado para C¹⁶H²⁰N³O³S ([M-H]-) m/e: 334,1; medido m/e: 334,1.

Preparación de 5-azido-5,6-dideoxi-2,3-O-1-metiletiliden-1-tio-p-D-alofuranósido de 4-metilfenilo (compuesto (R)-14)

A una solución en agitación del compuesto (S)-12 (13 gramos, 0,028 mol) en DMF (250 ml) se le añadieron NaN³(10 gramos, 0,15 mol) y HMPA (13 ml) a temperatura ambiente. La temperatura de reacción se elevó a 70 °C y el progreso se controló mediante TLC. Después de la finalización (10 horas), la mezcla de reacción se diluyó con acetato de etilo y se lavó secuencialmente con una solución acuosa al 1 % de HCl, NaHCO³saturado y salmuera. La capa orgánica combinada se secó sobre MgSO⁴, se evaporó y se sometió a cromatografía en columna (EtOAc/Hexano) para obtener el compuesto (R)-14 (9 gramos) con un rendimiento del 97 %.

RMN 1H (500 MHz, CDCh): Sh 1,32 (d, 3H, J = 6,2 Hz, CH³), 3,81 (m, 1H, H-5), 3,89 (dd, 1H, J¹= 2,1, J²= 8,3 Hz, H-4) , 4,72 (dd, 1H, J¹= 2,5, J²= 6,3 Hz, H-2), 4,77 (dd, 1H, J¹= 2,1, J²= 6,3 Hz, H-3), 5,49 (d, 1H, J = 2,5 Hz, H-1). Se identificaron picos adicionales en el espectro de la siguiente manera: Sh 1,37 (s, 3H, isopropiliden-CH³), 1,53 (s, 3H, isopropiliden-CH³), 2,35 (s, 3H, Ar-CH³), 7,15 (d, 2H, J = 8,0 Hz, Ar), 7,74 (d, 2H, J = 8,0 Hz, Ar).

RMN 13C (125 MHz, CDCh): Sc 16,2 (C-6), 21,0 (Ar-CH³), 25,2 (isopropiliden-CH³), 26,1 (isopropiliden-CH³), 58,1 (C-5) , 81,9 (C-3), 85,1 (C-2), 89,1 (C-4), 92,2 (C-1), 113,8 (cuaternario-C), 129,7 (Ar), 129,8 (Ar), 131,6 (Ar), 137,6 (Ar).

Preparación de 5-azido-5,6-dideoxi-2,3-O-dibenzoil-1-tio-a-L-talofuranósido de 4-metilfenilo (compuesto (S)-15):

Se agitó el compuesto (S)-13 (6 gramos, 0,018 mol) en una mezcla de ácido acético-agua (100 ml, 8:2) a 70 °C durante una noche. El progreso de la reacción se controló por TLC, después de la finalización, la mezcla de reacción se diluyó con acetato de etilo y se lavó con una NaHCO³saturado y salmuera. La capa orgánica combinada se secó sobre MgSO⁴, se evaporó y se sometió a cromatografía en columna (EtOAc/Hexano) para obtener el producto desprotegido de isopropilideno deseado (5 gramos) con un rendimiento del 96 %.

RMN 1H (500 MHz, CDCla): Sh 1,36 (d, 3H, J = 6,2 Hz, CH³), 3,61 (m, 1H, H-5), 3,82 (t, 1H, J = 4,8 Hz, H-4), 4,13 (m, 2H, H-3 y H-2), 5,18 (d, 1H, J = 3,7 Hz, H-1). Se identificaron picos adicionales en el espectro de la siguiente manera: Sh 2,35 (s, 3H, ArCH³), 7,15 (d, 2H, J= 8,0 Hz, Ar), 7,45 (d, 2H, J= 8,0 Hz, Ar).

RMN 13C (125 MHz, CDCh): Sc 15,2 (C-6), 21,0 (Ar-CH³), 58,2 (C-5), 72,0 (C-3), 74,9 (C-2), 86,5 (C-4), 90,5 (C-1), 128,8 (Ar), 129,7 (Ar), 133,0 (Ar), 138,1 (Ar).

MALDI TOFMS calculado para C¹³H¹⁶N³O³S ([M-H]-) m/e: 294,1; medido m/e: 294,08.

El producto de la anterior etapa se agitó en piridina (200 ml) a 0 °C al cual se añadieron lentamente BzCl (7,14 gramos, 0,051) y 4-DMAP (1 gramo). La temperatura de reacción se elevó a temperatura ambiente y se agitó durante una noche. El progreso de la reacción se controló por TLC, después de la finalización, la mezcla de reacción se diluyó con acetato de etilo y se lavó con una solución de HCl al 1 %, NaHCO³saturado y salmuera. La capa orgánica combinada se secó sobre MgSO⁴, se evaporó y se sometió a cromatografía en columna (EtOAc/Hexano) para obtener el compuesto (S)-15 (8,0 gramos) con un rendimiento del 94 %.

RMN 1H (500 MHz, CDCI³): Sh 1,38 (d, 3H, J = 6,2 Hz, CH³), 3,81 (m, 1H, H-5), 4,22 (m, 1H, H-4), 5,55 (m, 1H, H-1), 5,56-5,58 (m, 2H, H-2 y H-3). Se identificaron picos adicionales en el espectro de la siguiente manera: Sh 2,37 (s, 3H, Ar-CH³), 7,21 (d, 2H, J = 8,0 Hz, Ar), 7,34-7,42 (m, 4H, Ar), 7,53-7,59 (m, 4H, Ar), 7,90 (dd, 2H, J¹= 1,2, J²= 8,0 Hz, Ar), 7,99 (dd, 2H, J¹= 1,2, J²= 8,0 Hz, Ar).

RMN 13C (125 MHz, CDCI³): Sc 15,2 (C-6), 21,1 (Ar-CH³), 57,9 (C-5), 72,6 (C-3), 74,4 (C-2), 85,1 (C-4), 88,4 (C-1), 127.8 (Ar), 128,3 (2C, Ar), 128,9 (Ar), 129,0 (Ar), 129,6 (Ar), 129,7 (Ar), 129,8 (Ar), 133,4 (2C, Ar), 133,9 (Ar), 138,6 (Ar), 164,9 (C=O), 165,2 (C=O).

MALDI TOFMS calculado para C²⁷H²⁵N³O⁵SNa ([M+Na]+) m/e: 526,2; medido m/e: 526,1.

Preparación de 5-azido-5,6-dideoxi-2,3-O-dibenzoil-1-tio-p-D-alofuranósido de 4-metilfenilo (compuesto (R)-16):

Se agitó el compuesto (R)-14 (8 gramos, 0,023 mol) en una mezcla de ácido acético-agua (100 ml, 8:2) a 70 °C durante una noche. El progreso de la reacción se controló por TLC, después de la finalización, la mezcla de reacción se diluyó con acetato de etilo y se lavó con una NaHCO³saturado y salmuera. La capa orgánica combinada se secó sobre MgSO⁴, se evaporó y se sometió a cromatografía en columna (EtOAc/Hexano) para obtener el producto desprotegido de isopropilideno deseado (6,5 gramos) con un rendimiento del 92 %.

RMN 1H (500 MHz, CDCh): Sh 1,36 (d, 3H, J = 6,2 Hz, CH³), 3,65 (m, 1H, H-5), 3,78 (dd, 1H, J¹= 2,5, J²= 7,5 Hz, H-4), 4,09 (t, 1H, J = 5,0 Hz, H-2), 4,15 (t, 1H, J= 4,5 Hz, H-3), 5,18 (d, 1H, J= 5,0 Hz, H-1). Se identificaron picos adicionales en el espectro de la siguiente manera: Sh 2,36 (s, 3h , Ar-CH³), 7,15 (d, 2H, J= 8,0 Hz, Ar), 7,44 (d, 2H, J= 8,0 Hz, Ar).

RMN 13C (125 MHz, CDCh): Sc 16,0 (C-6), 21,0 (Ar-CH³), 59,0 (C-5), 71,9 (C-3), 74,9 (C-2), 86,4 (C-4), 90,3 (C-1), 128.9 (Ar), 129,7 (Ar), 132,8 (Ar), 138,1 (Ar).

El producto de la anterior etapa se agitó en piridina (200 ml) a 0 °C al cual se añadieron lentamente BzCl (7,14 gramos, 0,051) y 4-DMAP (1 gramo). La temperatura de reacción se elevó a temperatura ambiente y se agitó durante una noche. El progreso de la reacción se controló por TLC, después de la finalización, la mezcla de reacción se diluyó con acetato de etilo y se lavó con una solución de HCl al 1 %, NaHCO³saturado y salmuera. La capa orgánica combinada se secó sobre MgSO⁴, se evaporó y se sometió a cromatografía en columna (EtOAc/Hexano) para obtener el compuesto (R)-16 (9,5 gramos) con un rendimiento del 93 %.

RMN 1H (500 MHz, CDCh): Sh 1,42 (d, 3H, J = 6,7 Hz, CH³), 3,74 (m, 1H, H-5), 4,24 (t, 1H, J = 4,7 Hz, H-4), 5,53 (d, 1H, J = 5,6 Hz, H-1), 5,50 (t, 1H, J = 5,5 Hz, H-2), 5,65 (t, 1H, J = 5,5 Hz, H-3). Se identificaron picos adicionales en el espectro de la siguiente manera: Sh 2,38 (s, 3H, Ar-CH³), 7,20 (d, 2H, J = 8,0 Hz, Ar), 7,38 (t, 4H, J = 7,6 Hz, Ar), 7,51 (d, 2H, J = 8,0 Hz, Ar), 7,55 (t, 2H, J = 8,0 Hz, Ar), 7,93-7,96 (m, 4H, Ar).

RMN 13C (125 MHz, CDCh): Sc 15,5 (C-6), 21,1 (Ar-CH³), 58,5 (C-5), 71,8 (C-3), 74,2 (C-2), 84,9 (C-4), 88,2 (C-1), 127.8 (Ar), 128,3 (2C, Ar), 128,9 (2C, Ar), 129,6 (Ar), 129,7 (Ar), 129,8 (Ar), 133,3 (2C, Ar), 133,8 (Ar), 138,6 (Ar), 164.9 (C=O), 165,0 (C=O).

MALDI TOFMS calculado para C²⁷H²⁵N³O⁵SNa ([M+Na]+) m/e: 526,2; medido m/e: 526,2

Preparación de L-Talofuranosa, 5-azido-5,6-dideoxi-2,3-dibenzoato 1-(2,2,2-tricloroetanimidato) (compuesto (S)-17):

Se agitó el compuesto (S)-15 (8 gramos, 0,016 mol) en una mezcla de acetona-agua (100 ml, 9:1), mezcla a -30 °C durante 10 minutos a la cual se añadió lentamente W-bromosuccinimida (9,16 gramos, 0,051 mol). La mezcla de reacción se agitó a la misma temperatura y el progreso se controló por TLC. Después de la finalización 3 horas), la mezcla de reacción se diluyó con acetato de etilo y se lavó con NaHCO³saturado, Na²S²O³saturado y salmuera. La capa orgánica combinada se secó sobre MgSO⁴, se evaporó para obtener 6,3 gramos del hemiacetal correspondiente. El hemiacetal se agitó en una mezcla de diclorometano (40 ml) y tricloroacetonitrilo (5 ml) a 0 °C durante 10 minutos, a la cual se le añadió una cantidad catalítica de DBU (0,3 ml). La mezcla de reacción se agitó a la misma temperatura y el progreso se controló por TLC. Después de la finalización (3 horas), la mezcla de reacción se diluyó con DCM y se lavó con NH⁴Cl saturado. La capa orgánica combinada se secó sobre MgSO⁴y se concentró para obtener el compuesto (S)-17 (9 gramos). El producto en bruto se usó directamente para la reacción de glicosilación sin purificación.

Preparación de D-Alofuranosa, 5-azido-5,6-dideoxi-2,3-dibenzoato 1-(2,2,2-tricloroetanimidato) (compuesto (R)-18):

Se agitó el compuesto (R)-16 (9 gramos, 0,018 mol) en una mezcla de acetona-agua (100 ml, 9:1), mezcla a -30 °C durante 10 minutos a la cual se añadió lentamente W-bromosuccinimida (9,0 gramos, 0,050 mol). La mezcla de reacción se agitó a la misma temperatura y el progreso se controló por TLC. Después de la finalización 3 horas), la mezcla de reacción se diluyó con acetato de etilo y se lavó con NaHCO³saturado, Na²S²O³saturado y salmuera. La capa orgánica combinada se secó sobre MgSO⁴, se evaporó para obtener 6,5 gramos del hemiacetal correspondiente. El hemiacetal se agitó en una mezcla de diclorometano (50 ml) y tricloroacetonitrilo (6 ml) a 0 °C durante 10 minutos, a la cual se le añadió una cantidad catalítica de DBU (0,3 ml). La mezcla de reacción se agitó a la misma temperatura y el progreso se controló por TLC. Después de la finalización (3 horas), la mezcla de reacción se diluyó con DCM y se lavó con NH⁴Cl saturado. La capa orgánica combinada se secó sobre MgSO⁴y se concentró para obtener el compuesto (R)-18 (9 gramos). El producto en bruto se usó directamente para la reacción de glicosilación sin purificación.

Preparación de 5-O-(5-Azido-5,6-dideoxi-2,3-O-dibenzoil-a-L-talofuranosil)-3’,4 ’,6 ’,6-tetra-O-acetil-2’,1,3-triazido paromamina (compuesto (S)-21):

Se añadió CH²Ch anhidro (15 ml) a tamices moleculares de 4Á en polvo, secados a fuego (2,0 gramos), seguido del compuesto aceptor de adición 19 (0,75 gramos, 0,0013 mol) y el compuesto donante (S)-17 (2,1 gramos, 0,0039 mol). La mezcla de reacción se agitó durante 10 min a temperatura ambiente y después se enfrió a -20 °C. Se añadió una cantidad catalítica de BF³-Et²O (0,1 ml) y la mezcla se agitó a -15 °C y el progreso de la reacción se controló por TLC, la cual indicó la finalización después de 60 minutos. La mezcla de reacción se diluyó con acetato de etilo y se lavó con NaHCO³saturado y salmuera. La capa orgánica combinada se secó sobre MgSO⁴, se evaporó y se sometió a cromatografía en columna (EtOAc/Hexano) para obtener el compuesto (S)-21 (1,0 gramos) con un rendimiento del 80 %.

RMN 1H (500 MHz, CDCh): "Anillo I" ¿h 3,65 (dd, 1H, J¹= 4,2, J²= 9,7 Hz, H-2'), 4,20 (d, 1H, J = 11,1 Hz, H-6'), 4,26 (dd, 1H, J¹= 3,1, J²= 12,6 Hz, H-6'), 4,54 (m, 1H, H-5'), 5,08 (dd, 1H, J¹= 9,3, J²= 10,7 Hz, H-4'), 5,41 (t, 1H, J = 9,9 Hz, H-3'), 5,85 (d, 1H, J= 3,7 Hz, H-1'); "Anillo II" ¿h 1,64 (ddd, 1H, Ji=J2=J3= 12,5 Hz, H-2ax), 2,42 (td, 1H, J¹= 4,5, J²= 12,5 Hz, H-2eq), 3,49-3,56 (m, 2H, H-1 y H-3), 3,74 (t, 1H, J = 9,5 Hz, H-4), 3,87 (t, 1H, J = 8,7 Hz, H-5), 5,02 (d, 1H, J = 10,1 Hz, H-6); "Anillo III" ¿h 1,27 (d, 3H, J = 6,9 Hz, CH³), 3,72 (m, 1H, H-5"), 4,35 (t, 1H, J = 6,6 Hz, H-4"), 5,43 (dd, 1H, J¹= 5,1, J²= 7,4 Hz, H-3"), 5,62 (d, 1H, J = 3,8 Hz, H-2"), 5,66 (s, 1H, H-1"). Se identificaron picos adicionales en el espectro de la siguiente manera: ¿h 2,04 (s, 3H, OAc), 2,10 (s, 3H, OAc), 2,11 (s, 3H, OAc), 2,23 (s, 3H, OAc), 7,35-7,43 (m, 4H, Ar), 7,53-7,60 (m, 2H, Ar), 7,89-7,95 (m, 4H, Ar).

RMN 13C (125 MHz, CDCh): ¿c 15,3 (C-6"), 20,5 (OAc), 20,6 (2C, OAc), 20,9 (OAc), 31,6 (C-1), 58,3, 58,5, 59,3, 61,7, 61,8, 68,0, 68,2, 70,9, 71,8, 73,6, 74,6, 78,1, 79,5, 84,4, 96,6 (C-1'), 107,6 (C-1"), 128,4 (Ar), 128,5 (2C, Ar), 128,7 (Ar), 129,6 (2C, Ar), 133,5 (Ar), 133,6 (Ar), 164,8 (C=O), 165,3 (C=O), 169,7 (C=O), 169,9 (C=O), 170,1 (C=O), 170,6 (C=O).

MALDI TOFMS calculado para C⁴⁰H⁴³N¹²O¹⁶([M-H]-) m/e: 947,3; medido m/e: 947,28.

Preparación de 5-O-(5-Azido-5,6-dideoxi-2,3-O-dibenzoil-@-D-alofuranosil)-3’,4 ’,6 ’,6-tetra-O-acetil-2’,1,3-triazido paromamina (compuesto (R)-22):

Se añadió CH²Ch anhidro (15 ml) a tamices moleculares de 4 Á en polvo, secados a fuego (2,0 gramos), seguido del compuesto aceptor de adición 19 (0,75 gramos, 0,0013 mol) y el compuesto donante (R)-18 (2,1 gramos, 0,0039 mol). La mezcla de reacción se agitó durante 10 minutos a temperatura ambiente y después se enfrió a -20 °C. Se añadió una cantidad catalítica de BF³-Et²O (0,1 ml) y la mezcla se agitó a -15 °C y el progreso de la reacción se controló por TLC, la cual indicó la finalización después de 60 minutos. La mezcla de reacción se diluyó con acetato de etilo y se lavó con NaHCO³saturado y salmuera. La capa orgánica combinada se secó sobre MgSO⁴, se evaporó y se sometió a cromatografía en columna (EtOAc/Hexano) para obtener el compuesto (R)-22 (1,02 gramos) con un rendimiento del 82 %.

RMN 1H (500 MHz, CDCh): "Anillo I" ¿h 3,55 (dd, 1H, J¹= 4,5 y J²= 10,7 Hz, H-2'), 4,17 (d, 1H, J = 13,1 Hz, H-6'), 4,30 (dd, 1H, J¹= 4,2 y J²= 12,4 Hz, H-6'), 4,56 (m, 1H, H-5'), 5,08 (t, 1H, J = 9,7 Hz, H-4'), 5,43 (t, 1H, J = 9,9 Hz, H-3'), 5,83 (d, 1H, J = 3,9 Hz, H-1'); "Anillo II" ¿h 1,64 (ddd, 1H, J i=J2=J3=12,5 Hz, H-2ax), 2,42 (td, 1H, J-,=4,5 y J²= 12,5 Hz, H-2eq), 3,49-3,56 (m, 2H, H-1 y H-3), 3,74 (t, 1H, J= 10,0 Hz, H-4), 3,92 (t, 1H, J = 9,1 Hz, H-5), 5,03 (d, 1H, J = 9,9 Hz, H-6); "Anillo III" ¿h 1,41 (d, 3H, J= 6,9 Hz, CH³), 3,76 (m, 1H, H-5"), 4,39 (t, 1H, J= 4,9 Hz, H-4"), 5,50 (dd, 1H, J¹= 5,1 y J²= 7,0 Hz, H-3"), 5,60 (d, 1H, J = 4,9 Hz, H-2"), 5,68 (s, 1H, H-1"). Se identificaron picos adicionales en el espectro de la siguiente manera: ¿h 2,06 (s, 3H, OAc), 2,09 (s, 3H, OAc), 2,11 (s, 3H, OAc), 2,34 (s, 3H, OAc), 7,37 ^{7 ,41}(m, 4H, Ar), 7,57 (m, 2H, Ar), 7,92 (d, 4H, J= 8,0 Hz Ar).

RMN 13C (125 MHz, CDCh): ¿h 15,1 (C-6"), 20,5 (OAc), 20,6 (OAc), 20,7 (OAc), 20,8 (OAc), 31,7 (C-1), 58,2 (2C), 58,6, 61,7 (2C), 68,0, 68,1, 70,7, 71,4, 73,7, 74,6, 77,8, 79,2, 83,9, 96,6 (C-1'), 107,1 (C-1"), 128,4 (2C, Ar), 128,7 (Ar), 128,8 (Ar), 129,6 (2C, Ar), 133,4 (Ar), 133,5 (Ar), 164,9 (C=O), 165,4 (C=O), 169,7 (2C, C=O), 169,9 (C=O), 170,6 (C=O).

MALDI TOFMS calculado para C⁴⁰H⁴⁴N-i²O-i⁶Na ([M+Na]+) m/e: 971,3; medido m/e: 971,4.

Preparación de 5-O-(5-Azido-5,6-dideoxi-2,3-O-dibenzoil-a-L-talofuranosil)-3’,4 ’,6 ’,6-tetra-O-acetil-2’,3-diazido-1-N-[(S)-4-azido-2-O-acetil-butanoil]paromamina (compuesto (S)-23):

Se añadió CH²CI²anhidro (15 ml) a tamices moleculares de 4 A en polvo, secados a fuego (2,0 gramos), seguido del compuesto aceptor de adición 20 (1,0 gramos, 0,0014 mol) y el compuesto donante (S)-17 (2,2 gramos, 0,0042 mol). La mezcla de reacción se agitó durante 10 minutos a temperatura ambiente y después se enfrió a -20 °C. Se añadió una cantidad catalítica de BF³-Et²O (0,1 ml) y la mezcla se agitó a -15 °C y el progreso de la reacción se controló por TLC, la cual indicó la finalización después de 60 minutos. La mezcla de reacción se diluyó con acetato de etilo y se lavó con NaHCO³saturado y salmuera. La capa orgánica combinada se secó sobre MgSO⁴, se evaporó y se sometió a cromatografía en columna (EtOAc/Hexano) para obtener el compuesto (S)-23 (1,19 gramos) con un rendimiento del 79 %.

RMN 1H (500 MHz, CDCh): "Anillo I" Sh 3,63 (dd, 1H, J¹= 4,2, J2 = 10,4 Hz, H-2'), 4,18 (d, 1H, J= 10,8 Hz, H-⁶'), 4,29 (dd, 1H, J¹= 2,9, J²= 12,4 Hz, H-⁶'), 4,54 (m, 1H, H-5'), 5,09 (t, 1H, J = 10,2 Hz, H-4'), 5,42 (t, 1H, J = 10,2 Hz, H-3'), 5,84 (d, 1H, J = 3,9 Hz, H-1'); "Anillo II" Sh 1,50 (ddd, 1H, Ji=J2=J3= 12,5 Hz, H-2ax), 2,53 (td, 1H, J¹= 4,5, J²= 12,5 Hz, H-2eq), 3,60 (m, 1H, H-3), 3,74 (t, 1H, J = 9,5 Hz, H-4), 3,96 (t, 1H, J = 10,0 Hz, H-5), 4,06 (m, 1H, H-1), 4,93 (d, 1H, J = 9,9 Hz, H-⁶); "Anillo III" Sh 1,33 (d, 3H, J = 6,9 Hz, CH³), 3,70 (m, 1H, H-5"), 4,33 (t, 1H, J = 6,0 Hz, H-4"), 5,55 (dd, 1H, J¹= 4,9, J²= 7,7 Hz, H-3"), 5,57 (m, 2H, H-2" y H-1"). Se identificaron picos adicionales en el espectro de la siguiente manera: Sh 2,04-2,10 (m, 2H, H^{- 8}y H-⁸), 2,06 (s, 3H, OAc), 2,09 (s, ⁶H, OAc), 2,26 (s, 3H, OAc), 2,35 (s, 3H, OAc), 3,37 (dd, 2H, J¹= 6,0, J²= 7,5 Hz, H-9 y H-9), 5,20 (dd, 1H, J¹= 1,5, J²= 8,5 Hz, H-7), 6,69 (d, 1H, J = 7.5 Hz, NH), 7,35 (t, 2H, J = 8,0 Hz, Ar), 7,43 (t, 2H, J = 8,0 Hz, Ar), 7,53 (t, 1H, J= 8,0 Hz, Ar), 7,55 (t, 1H, J= 8,0 Hz, Ar), 7,87 (dd, 2H, J¹= 1,1, J²= 8,2 Hz, Ar), 7,95 (dd, 2H, J¹= 1,2, J²= 8,2 Hz, Ar).

RMN 13C (125 MHz, CDCh): So 15,4 (C-⁶"), 20,6 (4C, OAc), 20,9 (OAc), 31,9 (C-1), 47,0, 48,5, 58,4, 58,7, 61,7, 61,8, 68.0, 68,2, 70,8, 70,9, 71,4, 73,1, 74,7, 78,3, 79,7, 83,7, 96,7 (C-1'), 107,5 (C-1"), 128,4 (Ar), 128,5 (2C, Ar), 128,7 (Ar), 129,6 (Ar), 129,7 (Ar), 133,5 (Ar), 133,6 (Ar), 165,0 (C=O), 165,2 (C=O), 168,8 (C=O), 169,7 (2C, C=O), 169,8 (C=O), 170,6 (C=O), 172,5 (C=O).

MALDI TOFMS calculado para O⁴⁶H⁵⁴N¹³O¹⁹([M+H]+) m/e: 1092,3; medido m/e: 1092,3.

Preparación de 5-O-(5-Azido-5,6-dideoxi-2,3-O-dibenzoil-@-D-alofuranosil)-3’,4 ’,6 ’,6-tetra-O-acetil-2’,3-diazido-1-N-[(S)-4-azido-2-O-acetil-butanoil]paromamina (compuesto (R)-24):

Se añadió CH²Ch anhidro (15 ml) a tamices moleculares de 4 A en polvo, secados a fuego (^{2 , 0}gramos), seguido del compuesto aceptor de adición 20 (1,0 gramos, 0,0014 mol) y el compuesto donante (R)-18 (2,2 gramos, 0,0042 mol). La mezcla de reacción se agitó durante 10 minutos a temperatura ambiente y después se enfrió a -20 °C. Se añadió una cantidad catalítica de BF³-Et²O (0,1 ml) y la mezcla se agitó a -15 °C y el progreso de la reacción se controló por TLC, la cual indicó la finalización después de 60 minutos. La mezcla de reacción se diluyó con acetato de etilo y se lavó con NaHCO³saturado y salmuera. La capa orgánica combinada se secó sobre MgSO⁴, se evaporó y se sometió a cromatografía en columna (EtOAc/Hexano) para obtener el compuesto (R)-24 (1,27 gramos) con un rendimiento del 89 %.

RMN 1H (500 MHz, CDCh): "Anillo I" Sh 3,53 (dd, 1H, J¹= 4,7, J2 = 10,7 Hz, H-2'), 4,18 (d, 1H, J = 10,1 Hz, H-⁶'), 4,30 (dd, 1H, J¹= 3,9, J²= 12,3 Hz, H-⁶'), 4,56 (m, 1H, H-5'), 5,09 (t, 1H, J = 10,2 Hz, H-4'), 5,44 (t, 1H, J = 9,7 Hz, H-3'), 5,84 (d, 1H, J = 3,9 Hz, H-1'); "Anillo II" Sh 1,48 (ddd, 1H, Ji=J2=J3= 12,5 Hz, H-2ax), 2,52 (td, 1H, J¹= 4,5, J²= 12.5 Hz, H-2eq), 3,60 (m, 1H, H-3), 3,74 (t, 1H, J = 9,5 Hz, H-4), 4,00-4,08 (m, 2H, H-5 y H-1), 4,93 (t, 1H, J= 9,9 Hz, H-⁶); "Anillo III" Sh 1,41 (d, 3H, J = 6,9 Hz, CH³), 3,83 (m, 1H, H-5"), 4,37 (dd, 1H, J¹= 4,1, J²= 5,7 Hz, H-4"), 5,60 (t, 1H, J = 6,5 Hz, H-3"), 5,64 (d, 1H, J = 6,5 Hz, H-2"), 5,70 (s, 1H, H-1"). Se identificaron picos adicionales en el espectro de la siguiente manera: Sh 2,04-2,10 (m, 2H, H-8 y H-8), 2,06 (s, 3H, OAc), 2,10 (s, 3H, OAc), 2,11 (s, 3H, OAc), 2,22 (s, 3H, OAc), 2,27 (s, 3H, OAc), 3,37 (dd, 2H, J¹= 6,0, J²= 7,5 Hz, H-9 y H-9), 5,19 (dd, 1H, J¹= 1,5, J²= 8,5 Hz, H-7), 6,69 (d, 1H, J= 7,5 Hz, NH), 7,35-7,43 (m, 4H, Ar), 7,53-7,59 (m, 2H, Ar), 7,87-7,92 (m, 4H, Ar).

RMN 13C (125 MHz, CDCh): Sc 15,3 (C-6"), 20,5 (OAc), 20,5 (OAc), 20,6 (OAc), 20,7 (OAc), 20,8 (OAc), 30,4, 32,1, 47.0, 48,4, 58,2, 58,5, 61,6, 61,7, 68,0, 68,1, 70,7, 70,8, 70,9, 73,4, 74,7, 78,0, 79,5, 83,3, 96,8 (C-1'), 106,9 (C-1"), 128,4 (2C, Ar), 128,7 (2C, Ar), 129,5 (Ar), 129,6 (Ar), 133,5 (2C, Ar), 164,9 (C=O), 165,2 (C=O), 168,9 (C=O), 169,6 (C=O), 169,7 (C=O), 169,8 (C=O), 170,6 (C=O), 172,3 (C=O).

MALDI TOFMS calculado para ([M+H]+) m/e: 1092,3; medido m/e: 1092,3.

Preparación de 5-O-(5-Amino-5,6-dideoxi-a-L-talofuranosil)-paromamina (NB118):

El producto de glicosilación compuesto (S)-21 (1,0 gramos, 0,001 mol) se trató con una solución de MeNH²(solución al 33 % en EtOH, 50 ml y el progreso de la reacción se controló por TLC (EtOAc/MeOH 85:15), la cual indicó la finalización después de 8 horas. La mezcla de reacción se evaporó a sequedad y el residuo se disolvió en una mezcla de THF (5 ml) y NaOH acuoso (1 mM, 5,0 ml). La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 10 minutos, después de los cuales se añadió PMe³(solución 1 M en THF, 5,0 ml, 5,0 mmol). El progreso de la reacción se controló por TLC [CH²Ch/Me-OH/H²O/MeNH²(solución al 33 % en EtOH) 10:15:6:15], la cual indicó la finalización después de 1 hora. El producto se purificó por cromatografía en columna en una columna corta de gel de sílice. La columna se lavó con los siguientes disolventes: THF (800 ml), CH²Ch (800 ml), EtOH (200 ml) y MeOH (400 ml). Después, el producto eluyó con una mezcla de MeNH²al 20 % (solución al 33 % en EtOH) en MeOH al 80 %. Las fracciones que contenían el producto se combinaron y se evaporaron a sequedad. El residuo se volvió a disolver en un pequeño volumen de agua y se evaporó de nuevo (2-3 repeticiones) para proporcionar la amina libre de NB118.

El producto analíticamente puro se obtuvo pasando el producto anterior a través de una columna corta de Amberlite CG50 (forma NH⁴+). La columna se lavó primero con una mezcla de MeOH/H²O (3:2), después el producto se eluyó con una mezcla de MeOH/H²O/NH⁴OH (80:10:10) para proporcionar NB118 (0,405 gramos, rendimiento del 82 %). Para el almacenamiento y las pruebas biológicas, el compuesto se convirtió a su forma de sal sulfato: la base libre se disolvió en agua, el pH se ajustó alrededor de 7,0 con H²SO⁴(0,1 N) y se liofilizó. [a]ü20 = 38,4 (c = 0,2, MeOH). RMN 1H (500 MHz, CD³OD): "Anillo I" 5h 2,64 (dd, 1H, Ji = 3,7, J ² = 10,4 Hz, H-2'), 3,27 (t, 1H, J = 9,7 Hz, H-4') 3,52 (t, 1H, J = 10,8 Hz, H-3'), 3,67 (dd, 1H, J¹= 6,0, J²= 11,8 Hz, H-6'), 3,79 (m, 1H, H-5'), 3,87 (dd, 1H, J¹= 2,0, J²= 11,9 Hz, H-6') 5,20 (d, 1H, J = 3,4 Hz, H-1'); "Anillo II" 5h 1,20 (ddd, 1H, Ji=J2=J ³ = 12,5 Hz, H-2ax), 1,97 (td, 1H, J = 4,5, J²= 12,5 Hz, H-2eq), 2,64 (m, 1H, H-1), 2,78 (m, 1H, H-3), 3,21 (t, 1H, J = 9,3 Hz, H-6), 3,38 (t, 1H, J = 9,5 Hz, H-4), 3,50 (t, 1H, J = 9,2, H-5); "Anillo III" 5h 1,18 (d, 3H, J = 6,2 Hz, CH³), 2,96 (m, 1H, H-5"), 3,57 (t, 1H, J = 6,9 Hz, H-4"), 4,02 (t, 1H, J= 5,5 Hz, H-3"), 4,06 (dd, 1H, J¹= 2,9, J²= 5,4 Hz, H-2"), 5,25 (d, 1H, J = 2,7 Hz, H-1").

RMN 13C (125 MHz, CD³OD): 5c 19,3 (C-6"), 37,5 (C-1), 50,6, 52,3, 52,6, 57,8, 62,7 (C-6'), 72,1,72,2, 75,3, 75,4, 76,2, 78,6, 84,6, 87,4, 88,6, 102,0 (C-1'), 109,5 (C-1").

MALDI TOFMS calculado para C¹⁸H³⁷N⁴O¹⁰([M+H]+) m/e: 469,2; medido m/e: 469,2.

Preparación de 5-O-(5-Amino-5,6-dideoxi-fí-D-alofuranosil)-paromamina (NB119):

El producto de glicosilación compuesto (R)-22 (1,0 gramos, 0,001 mol) se trató con una solución de MeNH²(solución al 33 % en EtOH, 50 ml) y el progreso de la reacción se controló por TLC (EtOAc/MeOH 85:15), la cual indicó la finalización después de 8 horas. La mezcla de reacción se evaporó a sequedad y el residuo se disolvió en una mezcla de THF (5 ml) y NaOH acuoso (1 mM, 5,0 ml). La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 10 minutos, después de los cuales se añadió PMe³(solución 1 M en THF, 5,0 ml, 5,0 mmol). El progreso de la reacción se controló por TLC [CH²Ch/Me-OH/H²O/MeNH²(solución al 33 % en EtOH) 10:15:6:15], la cual indicó la finalización después de 1 hora. El producto se purificó por cromatografía en columna en una columna corta de gel de sílice. La columna se lavó con los siguientes disolventes: THF (800 ml), CH²Ch (800 ml), EtOH (200 ml) y MeOH (400 ml). Después, el producto eluyó con una mezcla de MeNH²al 20 % (solución al 33 % en EtOH) en MeOH al 80 %. Las fracciones que contenían el producto se combinaron y se evaporaron a sequedad. El residuo se volvió a disolver en un pequeño volumen de agua y se evaporó de nuevo (2-3 repeticiones) para proporcionar la amina libre de NB119, también denominado como NB119.

El producto analíticamente puro se obtuvo pasando el producto anterior a través de una columna corta de Amberlite CG50 (forma NH⁴+). La columna se lavó primero con una mezcla de MeOH/H²O (3:2), después el producto se eluyó con una mezcla de MeOH/H²O/NH⁴OH (80:10:10) para proporcionar NB119 (0,398 gramos, rendimiento del 80 %). Para el almacenamiento y las pruebas biológicas, el compuesto se convirtió a su forma de sal sulfato: la base libre se disolvió en agua, el pH se ajustó alrededor de 7,0 con H²SO⁴(0,1 N) y se liofilizó. [a]ü20 = 37,0 (c = 0,2, MeOH). RMN 1H (500 MHz, CD³OD): "Anillo I" 5h 2,64 (dd, 1H, Ji = 3,4, J ² = 10,2 Hz, H-2'), 3,27 (t, 1H, J = 9,1 Hz, H-4'), 3,52 (t, 1H, J = 8,9 Hz, H-3'), 3,68 (t, 1H, J = 6,1 Hz, H-6'), 3,79 (m, 1H, H-5'), 3,87 (dd, 1H, J = 2,5, J²= 12,2 Hz, H-6'), 5,20 (d, 1H, J = 3,6 Hz, H-1'); "Anillo II" 5h 1,21 (ddd, 1H, Ji=J ² =J ³ = 12,5 Hz, H-2ax), 1,97 (td, 1H, J¹= 4,5, J²= 12,5 Hz, H-2eq), 2,64 (m, 1H, H-1), 2,78 (m, 1H, H-3), 3,18 (t, 1H, J = 9,1 Hz, H-6), 3,37 (t, 1H, J= 9,5 Hz, H-4), 3,46 (t, 1H, J= 9,2 Hz, H-5); "Anillo III" óh 1,16 (d, 3H, J = 6,2 Hz, CH³), 3,09 (m, 1H, H-5"), 3,70 (t, 1H, J =5,3 Hz, H-4"), 4,04 (dd, 1H, J¹= 3,3, J²= 5,3 Hz, H-2"), 4,15 (t, 1H, J = 5,5 Hz, H-3"), 5,21 (d, 1H, J = 2,7 Hz, H-1").

RMN 13C (125 MHz, CD³OD): 5c 18,8 (C-6"), 37,6 (C-1), 49,4, 52,1, 52,6, 57,8, 62,8 (C-6'), 70,8, 72,1, 75,2, 75,4, 76,1,78,4, 84,7, 87,8, 88,2, 102,0 (C-1'), 109,5 (C-1").

MALDI TOFMS calculado para C¹⁸H³⁷N⁴O¹⁰([M+H]+) m/e: 469,2; medido m/e: 469,2

Preparación de 5-O-(5-Amino-5,6-dideoxi-a-L-talofuranosil)-1-N-[(S)-4-amino-2-hidroxi-butanoil]paromamina (NB122):

El producto de glicosilación compuesto (S)-23 (1,1 gramos, 0,001 mol) se trató con una solución de MeNH²(solución al 33 % en EtOH, 50 ml y el progreso de la reacción se controló por TLC (EtOAc/MeOH 85:15), la cual indicó la finalización después de 8 horas. La mezcla de reacción se evaporó a sequedad y el residuo se disolvió en una mezcla de THF (5 ml) y NaOH acuoso (1 mM, 5,0 ml). La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 10 minutos, después de los cuales se añadió PMe³(solución 1 M en THF, 5,0 ml, 5,0 mmol). El progreso de la reacción se controló por TLC [CH²Ch/Me-OH/H²O/MeNH²(solución al 33 % en EtOH) 10:15:6:15], la cual indicó la finalización después de 1 hora. El producto se purificó por cromatografía en columna en una columna corta de gel de sílice. La columna se lavó con los siguientes disolventes: THF (800 ml), CH²Ch (800 ml), EtOH (200 ml) y MeOH (400 ml). Después, el producto eluyó con una mezcla de MeNH²al 20 % (solución al 33 % en EtOH) en MeOH al 80 %. Las fracciones que contenían el producto se combinaron y se evaporaron a sequedad. El residuo se volvió a disolver en un pequeño volumen de agua y se evaporó de nuevo (2-3 repeticiones) para proporcionar la amina libre de NB122.

El producto analíticamente puro se obtuvo pasando el producto anterior a través de una columna corta de Amberlite CG50 (forma NH⁴+). La columna se lavó primero con una mezcla de MeOH/H²O (3:2), después el producto se eluyó con una mezcla de MeOH/H²O/NH⁴OH (80:10:10) para proporcionar NB122 (0,450 gramos, rendimiento del 79 %). Para el almacenamiento y las pruebas biológicas, el compuesto se convirtió a su forma de sal sulfato: la base libre se disolvió en agua, el pH se ajustó alrededor de 7,0 con H²SO⁴(0,1 N) y se liofilizó. [q]d20 = 35,4 (c = 0,2, H²O).

RMN 1H (500 MHz, CD³OD) "Anillo I" Óh 2,65 (dd, 1H, Ji = 3,7 y J ² = 10,3 Hz, H-2’), 3,26 (t, 1H, J = 8,9 Hz, H-4’), 3,54 (t, 1H, J = 9,2 Hz, H-3’), 3,68 (dd, 1H, J¹= 5,9 y J²= 11,8 Hz, H-6’), 3,80 (m, 1H, H-5’), 3,87 (dd, 1H, J¹= 1,7 y J²= 11,7 Hz, H-6’), 5,21 (d, 1H, J= 3,3 Hz, H-1’); MAniMo II" óh 1,34 (ddd, 1H, Ji=J2=J3= 12,5 Hz, H-2ax), 1,99 (td, 1H, J¹= 4,5 y J²= 12,5 Hz, H-2eq), 2,84 (m, 1H, H-3), 3,40 (t, 1H, J = 9,0 Hz, H-4), 3,50-3,59 (m, 2H, H-5 y H-6), 3,81 (m, 1H, H-1); "Anillo III" óh 1,17 (d, 3H, J= 6,7 Hz, CH³), 2,95 (m, 1H, H-5”), 3,57 (t, 1H, J= 6,5 Hz, H-4”), 4,01 (t, 1H, J = 5,7 Hz, H-3"), 4,08 (dd, 1H, J¹= 2,7 y J²= 5,4 Hz, H-2"), 5,26 (d, 1H, J = 2,5 Hz, H-1"). Se identificaron picos adicionales en el espectro de la siguiente manera: óh 1,82 (m, 1H, H-8), 1,94 (m, 1H, H-8), 2,83 (t, 2H, J = 6,4 Hz, H-9 y H-9), 4,14 (dd, 1H, J¹= 4,1 y J²= 7,6 Hz, H-7).

RMN 13C (125 MHz, CD³OD): óc 19,2 (C-6"), 35,9, 37,8, 38,9, 50,8, 50,9, 52,4, 57,8, 62,8, 71,7, 72,1, 72,3, 75,3, 75,4, 75,6, 76,3, 84,7, 86,9, 88,6, 101,9 (C-1’), 109,9 (C-1"), 177,1 (C=O).

MALDI TOFMS calculado para C²²H⁴⁴N⁵O¹²([M+H]+) m/e\ 570,3; medido m/e: 570,27.

Preparación de 5-O-(5-Amino-5,6-dideoxi-P-D-alofuranosil)-1-N-[(S)-4-amino-2-hidroxi-butanoil]paromamina (NB123):

El producto de glicosilación compuesto (R)-24 (1,2 gramos, 0,0011 mol) se trató con una solución de MeNH²(solución al 33 % en EtOH, 50 ml y el progreso de la reacción se controló por TLC (EtOAc/MeOH 85:15), la cual indicó la finalización después de 8 horas. La mezcla de reacción se evaporó a sequedad y el residuo se disolvió en una mezcla de THF (5 ml) y NaOH acuoso (1 mM, 5,0 ml). La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 10 minutos, después de los cuales se añadió PMe³(solución 1 M en THF, 5,0 ml, 5,0 mmol). El progreso de la reacción se controló por TLC [CH²Cl²/Me-OH/H²O/MeNH²(solución al 33 % en EtOH) 10:15:6:15], la cual indicó la finalización después de 1 hora. El producto se purificó por cromatografía en columna en una columna corta de gel de sílice. La columna se lavó con los siguientes disolventes: THF (800 ml), CH²Ch (800 ml), EtOH (200 ml) y MeOH (400 ml). Después, el producto eluyó con una mezcla de MeNH²al 20 % (solución al 33 % en EtOH) en MeOH al 80 %. Las fracciones que contenían el producto se combinaron y se evaporaron a sequedad. El residuo se volvió a disolver en un pequeño volumen de agua y se evaporó de nuevo (2-3 repeticiones) para proporcionar la amina libre de NB123.

El producto analíticamente puro se obtuvo pasando el producto anterior a través de una columna corta de Amberlite CG50 (forma NH⁴+). La columna se lavó primero con una mezcla de MeOH/H²O (3:2), después el producto se eluyó con una mezcla de MeOH/H²O/NH⁴OH (80:10:10) para proporcionar NB123 (0,510 gramos, rendimiento del 82 %).

Para el almacenamiento y las pruebas biológicas, el compuesto se convirtió a su forma de sal sulfato: la base libre se disolvió en agua, el pH se ajustó alrededor de 7,0 con H²SO⁴(0,1 N) y se liofilizó. [a]D20 = 32,2 (c = 0,2, H²O).

RMN 1H (500 MHz, CD³OD) "Anillo I" óh 2,65 (dd, 1H, J = 3,4, J²= 10,0 Hz, H-2’), 3,27 (t, 1H, J = 9,0 Hz, H-4’), 3,54 (t, 1H, J = 9,1 Hz, H-3’), 3,66 (dd, 1H, J¹= 6,0, J²= 12,0 Hz, H-6’), 3,81 (m, 1H, H-5’), 3,88 (dd, 1H, Ji = 2,0, J²= 12,0 Hz, H-6’), 5,21 (d, 1H, J= 3,5 Hz, H-1’); "Anillo II" óh 1,33 (ddd, 1H, Ji=J ² =J ³ = 12,5 Hz, H-2ax), 1,99 (td, 1H, J1=4,5, J²= 12,5 Hz, H-2eq), 2,85 (m, 1H, H-3), 3,39 (t, 1H, J = 9,0 Hz, H-4), 3,49-3,57 (m, 2H, H-5 y H-6), 3,82 (m, 1H, H-1); "Anillo III" óh 1,16 (d, 3H, J = 6,7 Hz, CH³), 3,09 (m, 1H, H-5"), 3,70 (t, 1H, J = 5,4 Hz, H-4"), 4,08 (dd, 1H, J = 2,6, J²= 5,1 Hz, H-2"), 4,14 (t, 1H, J = 5,7 Hz, H-3"), 5,22 (d, 1H, J = 2,7 Hz, H-1"). Se identificaron picos adicionales en el espectro de la siguiente manera: óh 1,82 (m, 1H, H-8), 1,94 (m, 1H, H-8), 2,84 (t, 2H, J = 7,2 Hz, H-9 y H-9), 4,15 (dd, 1H, J¹= 4,0, J²= 7,5 Hz, H-7).

RMN 13C (125 MHz, CD³OD): óh 18,8 (C-6"), 35,9, 37,6, 38,9, 49,6, 40,8, 52,3, 57,8, 62,8, 71,0, 71,6, 72,1, 75,2, 75,3, 75,4, 76,2, 85,0, 87,1, 87,9, 101,9 (C-1’), 110,0 (C-1"), 177,0 (C=O).

MALDI TOFMS calculado para C²²H⁴⁴N⁵O¹²([M+H]+) m/e: 570,3; medido m/e: 570,27.

Preparación de 6’-(R)-Metil-5-O-(5-azido-5,6-dideoxi-2,3-O-dibenzoil-a-L-talofuranosil)-3’,4 ’,6 ’,6-tetra-O-acetil-2',1,3-triazido paromamina (compuesto (S)-221):

Se añadió CH²CI²anhidro (15 ml) a tamices moleculares de 4 A en polvo, secados a fuego (2,0 gramos), seguido del compuesto aceptor de adición 219 (0,9 gramos, 0,0015 mol) y el compuesto donante (S)-17 (2,0 gramos, 0,0037 mol). La mezcla de reacción se agitó durante 10 minutos a temperatura ambiente y después se enfrió a -20 °C. Se añadió una cantidad catalítica de BF³-Et²O (0,1 ml) y la mezcla se agitó a -15 °C y el progreso de la reacción se controló por TLC, la cual indicó la finalización después de 120 minutos. La mezcla de reacción se diluyó con acetato de etilo y se lavó con NaHCO³saturado y salmuera. La capa orgánica combinada se secó sobre MgSO⁴, se evaporó y se sometió a cromatografía en columna (EtOAc/Hexano) para obtener el compuesto (S)-221 (1,1 gramos) con un rendimiento del 75 %.

RMN 1H (500 MHz, CDCh): "Anillo I" Sh 1,27 (d, 3H, J = 6,0 Hz, CH³), 3,58 (dd, 1H, J = 5,5, J²= 10,5 Hz, H-2'), 4,45 (d, 1H, J = 10,7 Hz, H-5'), 4,96-5,02 (m, 2H, H-4' y H-6'), 5,42 (t, 1H, J = 9,6 Hz, H-3'), 5,95 (d, 1H, J = 3,7 Hz, H-1');

"Anillo II" Sh 1,51 (ddd, 1H, Ji=J2=J3= 12,5 Hz, H-2ax), 2,41 (td, 1H, J¹= 4,5, J²= 12,5 Hz, H-2eq), 3,55 (m, 2H, H-1 y H-3), 3,76 (t, 1H, J = 9,4 Hz, H-4), 3,88 (t, 1H, J = 9,0 Hz, H-5), 5,03 (t, 1H, J = 9,1 Hz, H-6); "Anillo III" Sh 1,27 (d, 3H, J = 5,6 Hz, CH³), 3,76 (m, 1H, H-5"), 4,35 (dd, 1H, J¹= 6,9, J²= 10,9 Hz, H-4"), 5,45 (t, 1H, J = 5,5 Hz, H-3"), 5,62 (m, 2H, H-2" y H-1"). Se identificaron picos adicionales en el espectro de la siguiente manera: Sh 2,08 (s, 3H, OAc), 2,09 (s, 6H, OAc), 2,38 (s, 3H, OAc), 7,37 (t, 2H, J = 7,8 Hz, Ar), 7,41 (t, 2H, J = 7,8 Hz, Ar), 7,53-7,60 (m, 2H, Ar), 7,89 (d, 2H, J = 8,0 Hz, Ar), 7,93 (d, 2H, J = 8,2 Hz, Ar).

RMN 13C (125 MHz, CDCh): Sc 13,3 (C-7'), 15,4 (C-6"), 20,6 (2C, OAc), 20,9 (OAc), 21,1 (OAc), 32,1 (C-2), 58,4, 58,8, 59,5, 61,7, 68,5, 69,0, 70,1, 70,8. 71,8, 73,6, 74,6, 77,3, 79,6, 84,4, 96,0 (C-1'), 107,6 (C-1"), 128,4 (Ar), 128,5 (Ar), 128,6 (Ar), 128,7 (Ar), 129,6 (Ar), 129,7 (Ar), 133,5 (Ar), 133,6 (Ar), 164,9 (C=O), 165,3 (C=O), 169,7 (C=O), 169,9 (C=O), 170,1 (C=O), 170,2 (C=O).

MALDI TOFMS calculado para C⁴¹H⁴⁶N¹²O¹⁶Na ([M+Na]+) m/e: 985,3; medido m/e: 985,4.

Preparación de 6’-(R)-Metil-5-O-(5-azido-5,6-dideoxi-2,3-O-dibenzoil-p-D-alofuranosil)-3’,4 ’,6 ’,6-tetra-O-acetil-2',1,3-triazido paromamina (compuesto (R)-222)

Se añadió CH²Ch anhidro (15 ml) a tamices moleculares de 4 A en polvo, secados a fuego (2,0 gramos), seguido del compuesto aceptor de adición 219 (1,0 gramos, 0,0017 mol) y el compuesto donante (R)-18 (2,2 gramos, 0,004 mol). La mezcla de reacción se agitó durante 10 minutos a temperatura ambiente y después se enfrió a -20 °C. Se añadió una cantidad catalítica de BF³-Et²O (0,1 ml) y la mezcla se agitó a -15 °C y el progreso de la reacción se controló por TLC, la cual indicó la finalización después de 120 minutos. La mezcla de reacción se diluyó con acetato de etilo y se lavó con NaHCO³saturado y salmuera. La capa orgánica combinada se secó sobre MgSO⁴, se evaporó y se sometió a cromatografía en columna (EtOAc/Hexano) para obtener el compuesto (R)-222 (1,2 gramos) con un rendimiento del 75 %.

RMN 1H (500 MHz, CDCh): "Anillo I" Sh 1,28 (d, 3H, J = 6,7 Hz, CH³), 3,46 (dd, 1H, J¹= 4,5, J²= 10,4 Hz, H-2'), 4,47 (d, 1H, J = 10,7 Hz, H-5'), 4,96-5,02 (m, 2H, H-4' y H-6'), 5,44 (t, 1H, J = 9,6 Hz, H-3'), 5,93 (d, 1H, J = 3,3 Hz, H-1');

"Anillo II" Sh 1,50 (ddd, 1H, J i=J2=J3=12,5 Hz, H-2ax), 2,41 (td, 1H, A=4,5 y J²= 12,5 Hz, H-2eq), 3,56 (m, 2H, H-1 y H-3), 3,76 (t, 1H, J = 10,0 Hz, H-4), 3,92 (t, 1H, J = 9,5 Hz, H-5), 5,04 (t, 1H, J = 9,6 Hz, H-6); "Anillo III" Sh 1,42 (d, 3H, J = 6,9 Hz, CH³), 3,78 (m, 1H, H-5"), 4,40 (t, 1H, J = 4,6 Hz, H-4"), 5,50 (t, 1H, J = 5,0 Hz, H-3"), 5,59 (t, 1H, J = 3,7 Hz, H-2"), 5,64 (s, 1H, H-1"). Se identificaron picos adicionales en el espectro de la siguiente manera: Sh 2,09 (s, 9H, OAc), 2,33 (s, 3H, OAc), 7,37-7,41 (m, 4H, Ar), 7,56 (m, 2H, Ar), 7,92 (d, 4H, J= 8,0 Hz Ar).

RMN 13C (125 MHz, CDCh): Sh 13,3 (C-7'), 15,0 (C-6"), 20,6 (OAc), 20,7 (OAc), 20,8 (OAc), 21,2 (OAc), 32,1 (C-2), 58,1, 58,2, 58,8, 61,5, 68,9, 70,2, 70,6, 71,4, 73,8, 74,6, 77,0, 77,1, 79,4, 83,9, 96,1 (C-1'), 107,0 (C-1"), 128,4 (2C, Ar), 128,7 (2C, Ar), 129,6 (2C, Ar), 133,5 (Ar), 133,6 (Ar), 164,9 (C=O), 165,4 (C=O), 169,8 (C=O), 169,9 (2C, C=O), 170,1 (C=O).

MALDI TOFMS calculado para C⁴-iH⁴⁶N¹²O-i⁶Na ([M+Na]+) m/e: 985,3; medido m/e: 985,4.

Preparación de 6’-(R)-Metil-5-O-(5-azido-5,6-dideoxi-2,3-O-dibenzoil-a-L-talofuranosil)-3’,4 ’,6 ’,6-tetra-O-acetil-2',3-diazido-1-N-[(S)-4-azido-2-O-acetil-butanoil]paromamina (compuesto (S)-223):

Se añadió CH²Ch anhidro (15 ml) a tamices moleculares de 4 A en polvo, secados a fuego (2,0 gramos), seguido del compuesto aceptor de adición 220 (1,0 gramos, 0,0014 mol) y el compuesto donante (S)-17 (2,5 gramos, 0,0046 mol). La mezcla de reacción se agitó durante 10 minutos a temperatura ambiente y después se enfrió a -20 °C. Se añadió una cantidad catalítica de BF³-Et²O (0,1 ml) y la mezcla se agitó a -15 °C y el progreso de la reacción se controló por TLC, la cual indicó la finalización después de 60 minutos. La mezcla de reacción se diluyó con acetato de etilo y se lavó con NaHCO³saturado y salmuera. La capa orgánica combinada se secó sobre MgSO⁴, se evaporó y se sometió a cromatografía en columna (EtOAc/Hexano) para obtener el compuesto (S)-223 (1,1 gramos) con un rendimiento del 73 %.

RMN 1H (500 MHz, CDCh): RMN 1H (500 MHz, CDCh): "Anillo I" Sh 1,27 (d, 3H, J = 5,2 Hz, CH³), 3,54 (dd, 1H, J¹= 4,3, J ² = 10,5 Hz, H-2'), 4,45 (dd, 1H, Ji = 1,8, J ² = 10,6 Hz, H-5'), 4,96-5,02 (m, 2H, H-4' y H-6'), 5,43 (t, 1H, J = 9,4 Hz,

H-3'), 5,94 (d, 1H, J= 3,7 Hz, H-1'); "Anillo II" Sh 1,44 (ddd, 1H, Ji=J2=J3= 12,5 Hz, H-2ax), 2,52 (td, 1H, J¹= 4,5, J²=

12,5 Hz, H-2eq), 3,60 (m, 1H, H-3), 3,66 (t, 1H, J = 4,5 Hz, H-4), 3,99 (t, 1H, J = 6,4 Hz, H-5), 4,05 (m, 1H, H-1), 4,94

(t, 1H, J = 9,2 Hz, H-6); "Anillo III" Sh 1,32 (d, 3H, J = 6,9 Hz, CH³), 3,72 (m, 1H, H-5"), 4,32 (dd, 1H, J¹= 5,85, J²=

8,0 Hz, H-4"), 5,55 (dd, 1H, J¹= 4,7, J²= 7,4 Hz, H-3"), 5,65 (m, 2H, H-2" y H-1"). Se identificaron picos adicionales en el espectro de la siguiente manera: Sh 2,04-2,10 (m, 2H, H-8 y H-8), 2,11 (m, 9H, OAc), 2,22 (s, ³H, OAc), 2,30 (s, 3H, OAc), 3,37 (t, 2H, J = 6,8 Hz, H-9 y H-9), 5,20 (t, 1H, J = 4,85 Hz, H-7), 6,70 (d, 1H, J = 7,5 Hz, NH), 7,35 (t, 2H, J =

7,6 Hz, Ar), 7,43 (t, 2H, J = 7,8 Hz, Ar), 7,53-7,61 (m, 2H, Ar), 7,86 (dd, 2H, J¹= 1,1, J²= 8,2 Hz, Ar), 7,95 (dd, 2H, J¹

= 1,2, J²= 8,2 Hz, Ar).

RMN 13C (125 MHz, CDCI³): Sc 13,5 (C-7'), 15,5 (C-6"), 20,6 (3C, OAc), 20,9 (OAc), 21,1 (OAc), 30,4, 32,2 (C-1), 47,0,

48.4, 58,6, 58,7, 61,6, 68,6, 69,0, 70,3, 70,8 (2C), 71,4, 73,1, 74,7, 77,5, 79,8, 83,6, 96,3 (C-1'), 107,4 (C-1"), 128,4

(Ar), 128,5 (Ar), 128,7 (2C, Ar), 129,6 (Ar), 129,7 (Ar), 133,5 (Ar), 133,6 (Ar), 165,0 (C=O), 165,2 (C=O), 168,8 (C=O),

169,7 (2C, C=O), 169,9 (C=O), 170,0 (C=O), 172,4 (C=O).

MALDI TOFMS calculado para C⁴⁷H⁵⁵N¹³O¹⁹Na ([M+Na]+) m/e: 1128,4; medido m/e: 1128,2.

Preparación de 6’-(R)-Metil-5-O-(5-azido-5,6-dideoxi-2,3-O-dibenzoil-p-D-alofuranosil)-3’,4 ’,6 ’,6-tetra-O-acetil-2',3-diazido-1-N-[(S)-4-azido-2-O-acetil-butanoil]pammamina (compuesto (R)-224):

Se añadió CH²Ch anhidro (15 ml) a tamices moleculares de 4 A en polvo, secados a fuego (2,0 gramos), seguido del compuesto aceptor de adición 220 (1,0 gramos, 0,0014 mol) y el compuesto donante (R)-18 (2,5 gramos, 0,0046 mol).

La mezcla de reacción se agitó durante 10 minutos a temperatura ambiente y después se enfrió a -20 °C. Se añadió una cantidad catalítica de BF³-Et²O (0,1 ml) y la mezcla se agitó a -15 °C y el progreso de la reacción se controló por

TLC, la cual indicó la finalización después de 90 minutos. La mezcla de reacción se diluyó con acetato de etilo y se lavó con NaHCO³saturado y salmuera. La capa orgánica combinada se secó sobre MgSO⁴, se evaporó y se sometió a cromatografía en columna (EtOAc/Hexano) para obtener el compuesto (R)- 224 (1,15 gramos) con un rendimiento del 76 %.

RMN 1H (500 MHz, CDCh): RMN 1H (500 MHz, CDCh): RMN 1H (500 MHz, CDCh): "Anillo I" Sh 1,28 (d, 3H, J =

6,6 Hz, CH³), 3,43 (dd, 1H, J¹= 4,3, J²= 10,6 Hz, H-2'), 4,49 (dd, 1H, J¹= 2,2, J²= 10,7 H-4' y H-6'), 5,45 (t, 1H, J = 10,6 Hz, H-3'), 5,92 (d, 1H, J = 3,7 Hz, H-1'); "Anillo II" Sh 1,42 (ddd, 1H, Ji=J2=J3= 12,5 Hz,

H-2ax), 2,52 (td, 1H, J¹= 4,5, J²= 12,5 Hz, H-2eq), 3,64 (m, 1H, H-3), 3,76 (t, 1H, J = 4,5 Hz, H-4), 4,05 (m, 2H, H-1 y

H-5), 4,93 (t, 1H, J = 10,0 Hz, H-6); "Anillo III" Sh 1,39 (d, 3H, J = 6,4 Hz, CH³), 3,85 (m, 1H, H-5"), 4,36 (dd, 1H, J¹=

4,3, J²= 6,3 Hz, H-4"), 5,63 (m, ²H, H-2" y H-3"), 5,67 (s, 1H, H-1"). Se identificaron picos adicionales en el espectro de la siguiente manera: Sh 2,04-2,10 (m, 2H, H-8 y H-8), 2,08 (s, 3H, OAc), 2,09 (s, 3H, OAc), 2,10 (s, 3H, OAc), 2,21

(s, 3H, OAc), 2,25 (s, 3H, OAc), 3,37 (t, 2H, J = 6,7 Hz, H-9 y H-9), 5,18 (t, 1H, J = 5,0 Hz, H-7), 6,66 (d, 1H, J = 7,5 Hz,

NH), 7,38-7,42 (m, 4H, Ar), 7,53-7,59 (m, 2H, Ar), 7,89-7,92 (m, 4H, Ar).

RMN 13C (125 MHz, CDCh): Sc 13,5 (C-7'), 15,2 (C-6"), 20,6 (3C, OAc), 20,8 (OAc), 21,1 (OAc), 30,4, 32,4 (C-1), 47,0,

48.4, 58,1, 58,7, 61,4, 68,6, 69,0, 70,3, 70,5, 70,8, 70,9, 73,4, 74,8, 77,2, 79,6, 83,3, 96,3 (C-1'), 106,9 (C-1"), 128,4

(2C, Ar), 128,7 (2C, Ar), 129,5 (Ar), 129,6 (Ar), 133,5 (2C, Ar), 164,9 (C=O), 165,2 (C=O), 168,8 (C=O), 169,7 (2C, C=O), 169,9 (C=O), 170,0 (C=O), 172,3 (C=O).

MALDI TOFMS calculado para C⁴⁷H⁵⁵N¹³O¹⁹Na ([M+Na]+) m/e: 1128,4; medido m/e: 1128,4.

Preparación de 6’-(R)-Metil-5-O-(5-amino-5,6-dideoxi-a-L-talofuranosil)-paromamina (NB124):

El producto de glicosilación compuesto (S)-221 (1,0 gramos, 0,001 mol) se trató con una solución de MeNH²(solución al 33 % en EtOH, 50 ml y el progreso de la reacción se controló por TLC (EtOAc/MeOH 85:15), la cual indicó la finalización después de 8 horas. La mezcla de reacción se evaporó a sequedad y el residuo se disolvió en una mezcla de THF (5 ml) y NaOH acuoso (1 mM, 5,0 ml). La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 10 minutos, después de los cuales se añadió PMe³(solución 1 M en THF, 5,0 ml, 5,0 mmol). El progreso de la reacción se controló por TLC [CH²Cl²/Me-OH/H²O/MeNH²(solución al 33 % en EtOH) 10:15:6:15], la cual indicó la finalización después de 1 hora. El producto se purificó por cromatografía en columna en una columna corta de gel de sílice. La columna se lavó con los siguientes disolventes: THF (800 ml), C ^ C h (800 ml), EtOH (200 ml) y MeOH (400 ml). Después, el producto eluyó con una mezcla de MeNH²al 20 % (solución al 33 % en EtOH) en MeOH al 80 %. Las fracciones que contenían el producto se combinaron y se evaporaron a sequedad. El residuo se volvió a disolver en un pequeño volumen de agua y se evaporó de nuevo (2-3 repeticiones) para proporcionar la amina libre de NB124.

El producto analíticamente puro se obtuvo pasando el producto anterior a través de una columna corta de Amberlite CG50 (forma NH⁴+). La columna se lavó primero con una mezcla de MeOH/H²O (3:2), después el producto se eluyó con una mezcla de MeOH/H²O/NH⁴OH (80:10:10) para proporcionar NB124 (0,400 gramos, rendimiento del 79 %).

Para el almacenamiento y las pruebas biológicas, el compuesto se convirtió a su forma de sal sulfato: la base libre se disolvió en agua, el pH se ajustó alrededor de 7,0 con H²SO⁴(0,1 N) y se liofilizó.

RMN 1H (500 MHz, CD³OD): RMN 1H (500 MHz, CD³OD): "Anillo I" 8h 1,21 (d, 3H, J = 5,8 Hz, CH³), 2,61 (dd, 1H, J¹= 3,5, J²= 10,0 Hz, H-2'), 3,22 (t, 1H, J = 10,0 Hz, H-4'), 3,51 (t, 1H, J = 8,9 Hz, H-3'), 3,81 (dd, 1H, J¹= 3,0, J²= 10,0 Hz, H-5'), 4,12 (m, 1H, H-6'), 5,20 (d, 1H, J = 3,3 Hz, H-1'); "Anillo II" 8h 1,18 (ddd, 1H, Ji=J2=J3= 12,5 Hz, H-2ax), 1,98 (td, 1H, J¹= 4,5, J²= 12,5 Hz, H-2eq), 2,63 (m, 1H, H-1), 2,79 (m, 1H, H-3), 3,19 (t, 1H, J = 9,7 Hz, H-6), 3,38 (t, 1H, J = 9,3 Hz, H-4), 3,48 (t, 1H, J = 9,2 Hz, H-5); "Anillo MI" 8h 1,18 (d, 3H, J = 6,3 Hz, CH³), 2,95 (m, 1H, H-5"), 3,57 (t, 1H, J =6,4 Hz, H-4"), 4,03 (t, 1H, J = 5,6 Hz, H-3"), 4,07 (m, 1H, H-2"), 5,25 (d, 1H, J = 2,5 Hz, H-1").

RMN 13C (125 MHz, CD³OD): 8c 16,9 (C-7'), 19,3 (C-6"), 37,5 (C-1), 50,6, 52,3, 52,6, 57,8, 67,8, 72,2, 73,6, 75,5, 76,2, 76,7, 78,6, 84,6, 87,3, 88,6, 101,9 (C-1'), 109,6 (C-1").

MALDI TOFMS calculado para O¹⁹H³⁹N⁴O¹⁰([M+H]+) m/e: 483,3; medido m/e: 483,2.

Preparación de 6’-(R)-Metil-5-O-(5-amino-5,6-dideoxi-p-D-alofuranosil)-paromamina (NB125):

El producto de glicosilación compuesto (R)-222 (1,0 gramos, 0,001 mol) se trató con una solución de MeNH²(solución al 33 % en EtOH, 50 ml y el progreso de la reacción se controló por TLC (EtOAc/MeOH 85:15), la cual indicó la finalización después de 8 horas. La mezcla de reacción se evaporó a sequedad y el residuo se disolvió en una mezcla de THF (5 ml) y NaOH acuoso (1 mM, 5,0 ml). La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 10 minutos, después de los cuales se añadió PMe³(solución 1 M en THF, 5,0 ml, 5,0 mmol). El progreso de la reacción se controló por TLC [CH²Cl²/Me-OH/H²O/MeNH²(solución al 33 % en EtOH) 10:15:6:15], la cual indicó la finalización después de 1 hora. El producto se purificó por cromatografía en columna en una columna corta de gel de sílice. La columna se lavó con los siguientes disolventes: THF (800 ml), C ^ C h (800 ml), EtOH (200 ml) y MeOH (400 ml). Después, el producto eluyó con una mezcla de MeNH²al 20 % (solución al 33 % en EtOH) en MeOH al 80 %. Las fracciones que contenían el producto se combinaron y se evaporaron a sequedad. El residuo se volvió a disolver en un pequeño volumen de agua y se evaporó de nuevo (2-3 repeticiones) para proporcionar la amina libre de NB125.

El producto analíticamente puro se obtuvo pasando el producto anterior a través de una columna corta de Amberlite c G50 (forma NH⁴+). La columna se lavó primero con una mezcla de MeOH/H²O (3:2), después el producto se eluyó con una mezcla de MeOH/H²O/NH⁴OH (80:10:10) para proporcionar NB125 (0,398 gramos, rendimiento del 79 %).

RMN 1H (500 MHz, CD³OD): "Anillo I" 8h 1,22 (d, 3H, J = 5,8 Hz, CH³), 2,61 (dd, 1H, J¹= 2,5, J²= 9,6 Hz, H-2'), 3,22 (t, 1H, J = 9,8 Hz, H-4'), 3,50 (t, 1H, J = 9,9 Hz, H-3'), 3,83 (dd, 1H, J¹= 3,0, J²= 10,1 Hz, H-5'), 4,12 (m, 1H, H-6'), 5,20 (d, 1H, J = 3,3 Hz, H-1'); "Anillo II" 8h 1,21 (ddd, 1H, Ji=J2=J3= 12,5 Hz, H-2ax), 1,98 (td, 1H, J¹= 4,5, J²= 12,5 Hz, H-2eq), 2,65 (m, 1H, H-1), 2,78 (m, 1H, H-3), 3,18 (t, 1H, J = 9,3 Hz, H-6), 3,38 (t, 1H, J = 9,1 Hz, H-4), 3,46 (t, 1H, J = 9,2 Hz, H-5); "Anillo III" 8h 1,17 (d, 3H, J = 6,4 Hz, CH³), 3,10 (m, 1H, H-5"), 3,71 (t, 1H, J =5,0 Hz, H-4"), 4,06 (t, 1H, J = 5,6 Hz, H-2"), 4,16 (t, 1H, J = 3,0 Hz, H-3"), 5,20 (d, 1H, J = 3,0 Hz, H-1").

RMN 13C (125 MHz, CD³OD): 8o 16,6 (C-7'), 18,7 (C-6"), 37,6 (C-1), 49,5, 52,2, 52,5, 57,8, 67,8, 70,8, 73,6, 75,4, 76,1,76,7, 78,4, 84,7, 87,5, 88,0, 101,9 (C-1'), 109,6 (C-1").

MALDI TOFMS calculado para O¹⁹H³⁹N⁴O¹⁰([M+H]+) m/e: 483,3; medido m/e: 483,2.

Preparación de 6’-(R)-Metil-5-O-(5-amino-5,6-dideoxi-a-L-talofuranosil)-1-N-[(S)-4-amino-2-hidroxibutanoil]paromamina (NB127):

El producto de glicosilación compuesto (S)-223 (1,05 gramos, 0,001 mol) se trató con una solución de MeNH²(solución al 33 % en EtOH, 50 ml y el progreso de la reacción se controló por TLC (EtOAc/MeOH 85:15), la cual indicó la finalización después de 8 horas. La mezcla de reacción se evaporó a sequedad y el residuo se disolvió en una mezcla de THF (5 ml) y NaOH acuoso (1 mM, 5,0 ml). La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 10 minutos, después de los cuales se añadió PMe³(solución 1 M en THF, 5,0 ml, 5,0 mmol). El progreso de la reacción se controló por TLC [CH²Ch/Me-OH/H²O/MeNH²(solución al 33 % en EtOH) 10:15:6:15], la cual indicó la finalización después de 1 hora. El producto se purificó por cromatografía en columna en una columna corta de gel de sílice. La columna se lavó con los siguientes disolventes: THF (800 ml), OH20h (800 ml), EtOH (200 ml) y MeOH (400 ml). Después, el producto eluyó con una mezcla de MeNH²al 20 % (solución al 33 % en EtOH) en MeOH al 80 %. Las fracciones que contenían el producto se combinaron y se evaporaron a sequedad. El residuo se volvió a disolver en un pequeño volumen de agua y se evaporó de nuevo (2-3 repeticiones) para proporcionar la amina libre de NB127.

El producto analíticamente puro se obtuvo pasando el producto anterior a través de una columna corta de Amberlite CG50 (forma NH⁴+). La columna se lavó primero con una mezcla de MeOH/H²O (3:2), después el producto se eluyó con una mezcla de MeOH/H²O/NH⁴OH (80:10:10) para proporcionar NB127 (0,480 gramos, rendimiento del 86 %).

RMN 1H (500 MHz, CD³OD) "Anillo I" 8h 1,21 (d, 3H, J = 6,0 Hz, CH³), 2,63 (dd, 1H, J = 3,5, J ² = 10,0 Hz, H-2'), 3,23 (t, 1H, J = 8,9 Hz, H-4'), 3,52 (t, 1H, J = 9,9 Hz, H-3'), 3,82 (dd, 1H, J¹= 3,0, J²= 10,0 Hz, H-5'), 4,13 (m, 1H, H-6'), 5,22 (d, 1H, J = 3,3 Hz, H-1'); "Anillo II" 8h 1,34 (ddd, 1H, Ji=J2=J3= 12,5 Hz, H-2ax), 1,99 (td, 1H, J¹= 4,5 y J²= 12,5 Hz, H-2eq), 2,85 (m, 1H, H-3), 3,40 (t, 1H, J = 8,8 Hz, H-4), 3,50-3,59 (m, 2H, H-5 y H-6), 3,83 (m, 1H, H-1); "Anillo MI" 8h 1,17 (d, 3H, J = 6,6 Hz, CH³), 2,94 (m, 1H, H-5"), 3,56 (t, 1H, J = 7,1 Hz, H-4"), 4,01 (t, 1H, J = 5,7 Hz, H-3"), 4,09 (dd, 1H, J-F 2,7 y J²= 5,4 Hz, H-2"), 5,26 (d, 1H, J = 2,5 Hz, H-1"). Se identificaron picos adicionales en el espectro de la siguiente manera: 8h 1,82 (m, 1H, H-8), 1,95 (m, 1H, H-8), 2,83 (t, 2H, J = 5,7 Hz, H-9 y H-9), 4,13 (dd, 1H, J = 4,2 y J²= 7,6 Hz, H-7).

RMN 13C (125 MHz, CD³OD): 8c 16,6 (C-7'), 19,2 (C-6"), 35,9, 37,8, 39,0, 50,8, 50,9, 52,3, 57,8, 67,8, 71,7, 72,4, 73,6, 75,5, 75,6, 76,3, 76,8, 84,8, 86,7, 88,6, 101,9 (C-1'), 110,0 (C-1"), 177,1 (C=O).

MALDI TOFMS calculado para C²³H⁴⁵N⁵O¹²Na ([M+Na]+) m/e: 606,3; medido m/e: 606,6.

Preparación de 6’-(R)-Metil-5-O-(5-ammo-5,6-dideoxi-p-D-alofuranosil)-1-N-[(S)-4-ammo-2-hidmxibutanoil]paromamina (NB128):

El producto de glicosilación compuesto (R)-224 (1,12 gramos, 0,001 mol) se trató con una solución de MeNH²(solución al 33 % en EtOH, 50 ml y el progreso de la reacción se controló por TLC (EtOAc/MeOH 85:15), la cual indicó la finalización después de 8 horas. La mezcla de reacción se evaporó a sequedad y el residuo se disolvió en una mezcla de THF (5 ml) y NaOH acuoso (1 mM, 5,0 ml). La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 10 minutos, después de los cuales se añadió PMe³(solución 1 M en THF, 5,0 ml, 5,0 mmol). El progreso de la reacción se controló por TLC [CH²Ch/Me-OH/H²O/MeNH²(solución al 33 % en EtOH) 10:15:6:15], la cual indicó la finalización después de 1 hora. El producto se purificó por cromatografía en columna en una columna corta de gel de sílice. La columna se lavó con los siguientes disolventes: THF (800 ml), CH²Ch (800 ml), EtOH (200 ml) y MeOH (400 ml). Después, el producto eluyó con una mezcla de MeNH²al 20 % (solución al 33 % en EtOH) en MeOH al 80 %. Las fracciones que contenían el producto se combinaron y se evaporaron a sequedad. El residuo se volvió a disolver en un pequeño volumen de agua y se evaporó de nuevo (2-3 repeticiones) para proporcionar la amina libre de NB128.

El producto analíticamente puro se obtuvo pasando el producto anterior a través de una columna corta de Amberlite CG50 (forma NH⁴+). La columna se lavó primero con una mezcla de MeOH/H²O (3:2), después el producto se eluyó con una mezcla de MeOH/H²O/NH⁴OH (80:10:10) para proporcionar NB128 (0,500 gramos, rendimiento del 84 %).

RMN 1H (500 MHz, CD³OD) "Anillo I" 6h 1,22 (d, 3H, J = 6,3 Hz, CH³), 2,63 (dd, 1H, J¹= 3,8, J²= 10,0 Hz, H-2'), 3,22 (t, 1H, J = 9,8 Hz, H-4'), 3,52 (dd, 1H, J¹= 8,6, J2=10,3 Hz, H-3'), 3,83 (dd, 1H, J¹= 3,1, J²= 10,2 Hz, H-5'), 4,13 (m, 1H, H-6'), 5,23 (d, 1H, J = 3,7 Hz, H-1'); "A n illo II" 6h 1,34 (ddd, 1H, Ji=J2=J3= 12,5 Hz, H-2ax), 1,99 (td, 1H, J¹= 4,5 y J²= 12,5 Hz, H-2eq), 2,85 (m, 1H, H-3), 3,39 (t, 1H, J = 8,8 Hz, H-4), 3,49-3,56 (m, 2H, H-5 y H-6), 3,82 (m, 1H, H-1); "A n illo MI" 5h 1,16 (d, 3H, J = 6,7 Hz, CH³), 3,08 (m, 1H, H-5"), 3,69 (t, 1H, J = 5,5 Hz, H-4"), 4,07 (dd, 1H, J¹= 2,1, J²= 5,2 Hz, H-2"), 4,14 (t, 1H, J = 5,7 Hz, H-3"), 5,21 (d, 1H, J = 3,7 Hz, H-1"). Se identificaron picos adicionales en el espectro de la siguiente manera: 5h 1,82 (m, 1H, H-8), 1,95 (m, 1H, H-8), 2,84 (t, 2H, J = 7,2 Hz, H-9 y H-9), 4,13 (dd, 1H, J¹= 3,9, J²= 7,5 Hz, H-7).

RMN 13C (125 MHz, CD³OD): 5h 16,6 (C-7'), 18,8 (C-6"), 36,0, 37,7, 38,9, 49,6, 50,8, 52,3, 57,8, 67,8, 71,0, 71,7, 73,6, 75,5 (2C), 76,2, 76,7, 85,0, 86,9, 87,9, 101,9 (C-1'), 110,0 (C-1"), 177,1 (C=O).

MALDI TOFMS calculado para C²³H⁴⁵N⁵O-i²Na ([M+Na]+) m/e: 606,3; medido m/e: 606,6.

EJEMPLO 2

LECTURA COMPLETA DEL CODÓN DE PARADA

Como se presentó anteriormente en el presente documento, la eficiencia de la lectura completa inducida por aminoglucósidos es altamente dependiente de: (i) la identidad del codón de parada (UGA> UAG> UAA), (ii) la identidad del primer nucleótido inmediatamente corriente abajo del codón de parada(C> U> A > G) y (iii) el contexto de secuencia local alrededor del codón de parada. Por lo tanto, en un intento de proporcionar una comprensión amplia de la relación estructura-actividad de las estructuras diseñadas, se usó una diversidad de construcciones que contienen diferentes contextos de secuencia alrededor de codones de parada prematura. Estas secuencias ejemplares derivaron de los genes PCDH15, CFTR, IDUA y Distrofina que subyacen a USH1, FQ, HS y DMD, respectivamente. Las mutaciones sin sentido prevalentes de estas enfermedades que se eligieron fueron: R3X y R245X para USH1, G542X y W1282X para FQ, Q70X para HS y R3381X para DMD, como se presentan a continuación en el presente documento.

Ensayos de lectura completa:

Se crearon fragmentos de ADN derivados de ADNc de PCDH15, CFTR, distrofina e IDUA, incluyendo la mutación sin sentido probada o el codón de tipo silvestre (ts) correspondiente y de cuatro a seis codones flanqueantes corriente arriba y corriente abajo mediante hibridación de los siguientes pares de oligonucleótidos complementarios:

Síndrome de Usher:

p.R3Xmut/wt

5'-GATCCCAGAAGATGTTTCGACAGTTTTATCTCTGGACAGAGCT-3' y 5'-CTGTCAGAGATAAAACTGTCGAAACATCTTCTG-3' (secuencia de tipo silvestre SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2); GATCCCAGAAGATGTTTTGACAGTTTTATCTCTGGACAGAGCT y 5'-CTGTCAGAGATAAAACTGTCAAAACATCTTCTG-3' (secuencia mutante SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 4) p.R245Xmut/wt

5'-GATCCAAAATCTGAATGAGAGGCGAACCACCACCACCACCCTCGAGCT-3' y 5'-CGAGGGTGGTGGTGGTTGTTCGCCTCTCATTCAGATTTTG-3' (secuencia TS SEQ ID NO: 5 y 6); 5'-GATCCAAAATCTGAATGAGAGGTGAACCACCACCACCACCCTCGAGCT y 5'-CGAGGGTGGTGGTGGTTGTTCACCTCTCATTCAGATTTTG-3' (secuencia mutante SEQ ID NO: 7 y SEQ ID NO: 8)

Fibrosis quística:

p.G542Xmut/wt

5'-TCGACCAATATAGTTCTTGGAGAAGGTGGAATCGAGCT-3' y 5'-CGATTCCACCTTCTCGAAGAACTATATTGG-3' (secuencia de tipo silvestre SEQ ID NO: 9 y SEQ ID NO: 10);

5'-TCGACCAATATAGTTCTTTGAGAAGGTGGAATCGAGCT-3' 5'-CGATTCCACCTTCTCAAAGAACTATATTGG-3' (secuencia mutante SEQ ID NO: 11 y SEQ ID NO: 12). p. W1282Xmut/wt

5'-TCGACAACTTTGCAACAGTGGAGGAAAGCCTTTGAGCT-3' y 5-CAAAGGCTTTCCTCCACTGTTGCAAAGTTG-3' (secuencia TS SEQ ID NO: 13 y 14);

5'-TCGACAACTTTGCAACAGTGAAGGAAAGCCTTTGAGCT-3' y 5-CAAAGGCTTTCCTTCACTGTTGCAAAGTTG-3' (secuencia mutante SEQ ID NO: 15 y SEQ ID NO: 16).

Distrofia muscular de Duchene (DMD):

p.R3381Xmut/wt

5'-TCGACAAAAAACAAATTTTGCACCAAAAGGTATGAGCT-3' y 5'-CATACCTTTTGGTGCAAAATTTGTTTTTTG-3' (secuencia de tipo silvestre SEQ ID NO: 17 y SEQ ID NO: 18); 5'-TCGACAAAAAACAAATTTTGAACCAAAAGGTATGAGCT-3' y 5'-CATACCTTTTGGTTCAAAATTTGTTTTTTG-3' (secuencia mutante SEQ ID NO: 19 y SEQ ID NO: 20).

Síndrome de Hurler:

p.Q70Xmut/wt

5'-TCGACCCTCAGCTGGGACCAGCAGCTCAACCTCGAGCT-3' y 5'-CGAGGTTGAGCTGCTGGTCCCAGCTGAGG-3' (secuencia de tipo silvestre SEQ ID NO: 21 y SEQ ID NO: 22);

5'-TCGACCCTCAGCTGGGACTAGCAGCTCAACCTCGAGCT-3' y 5'-CGAGGTTGAGCTGCTAGTCCCAGCTGAGG-3' (secuencia mutante SEQ ID NO: 23 y SEQ ID NO: 24). Los fragmentos se insertaron en marco en el polienlazador del plásmido p2Luc entre los sitios de restricción BamHI y SacI (p.R3X y p.R245X), o SalI y SacI (todos los demás).

Para los ensayos de lectura completa in vitro, los plásmidos obtenidos, con la adición de los aminoglucósidos probados se transcribieron y tradujeron usando el sistema de traducción/transcripción de acoplamiento rápido lisado de reticulocitos TNT. La actividad luciferasa se determinó después de 90 minutos de incubación a 30 °C, usando el sistema de ensayo indicador de luciferasa dual (Promega™).

Para los ensayos de lectura completa ex vivo, las construcciones que albergan las mutaciones R3X, R245X, Q70X y W1282X se transfectaron a células HEK-293 con Lipofectamine 2000 (Invitrogen) y la adición de los compuestos probados se realizó 6 horas después de la transfección. Las células se recolectaron después de 16 horas de incubación con los aminoglucósidos probados. La lectura completa del codón de parada se calculó como se describió anteriormente (véase, Grentzmann, G. y col., RNA, 1998, 4, p. 479.)

Resultados de lectura completa:

Inicialmente, se evaluó la influencia del grupo quiral C5"-metilo en el potencial de lectura completa en los pseudotrisacáridos NB118 y NB119 usando un sistema de ensayo de indicador de luciferasa dual como se describe anteriormente. En resumen, los fragmentos de ADN se clonaron entre los sitios de restricción BamHI y SacI del vector p2luc y las construcciones obtenidas se transcribieron y tradujeron utilizando el sistema de transcripción/traducción de acoplamiento rápido TNT. La cantidad de los productos traducidos se evaluó usando el sistema de ensayo indicador de luciferasa dual y se usó para calcular el nivel de supresión. Los resultados, que representan promedios de al menos tres experimentos independientes, se resumen en las Figuras 2A-F.

Las Figuras 2A-F presentan los resultados del ensayo de lectura completa del codón de terminación mostrando gráficos comparativos de niveles in vitro de supresión del codón de parada inducidos por NB30 (marcado por círculos vacíos), NB118 (marcado por triángulos negros), NB119 (marcado por triángulos vacíos) y el fármaco de control gentamicina (marcado por rectángulos negros) en una serie de construcciones de contexto de mutación sin sentido que representan diversas enfermedades genéticas (entre paréntesis), en los que los resultados pertenecientes a la construcción R3X (USH1) se muestran en la Figura 2a , R245X (USh 1) en la Figura 2B, G542X (CF) en la Figura 2C, W1282X (CF) en la Figura 2D, Q70X (HS) en la Figura 2E y en los que los resultados pertenecientes a la construcción R3381X (DMD) se muestran en la Figura 2F.

Como puede verse en las Figuras A-F 2, en todas las mutaciones probadas, la instalación del grupo (S)-5"-metilo, como en NB118), en NB30 aumenta drásticamente su actividad de lectura completa in vitro, mientras que el del grupo (R)-5"-metilo, como en NB119), es comparativamente pequeño. Además, en todas las mutaciones probadas (excepto G542X, véase la Figura 2C), la actividad de lectura de NB118 fue significativamente mejor que la del fármaco clínico gentamicina.

La misma mejora de potencia, atribuida a la adición del grupo (S)-5"-metilo, se exploró en el caso del ejemplo de referencia n B54. Para evaluar el impacto de la estereoquímica en la posición C5", se sintetizaron ambos diastereómeros C5", a saber NB122 y NB123. Las pruebas de supresión in vitro comparativas de los pseudo trisacáridos NB54, NB122, NB123, y el fármaco de control gentamicina se realizaron en las mismas condiciones experimentales descritas anteriormente para los ejemplos de referencia de compuestos NB30, NB54 y NB118 y los datos observados (promedios de al menos tres experimentos independientes) se presentan en las Figuras 3A-F.

Las Figuras 3A-F presentan los resultados del ensayo de lectura completa del codón de terminación mostrando gráficos comparativos de niveles in vitro de supresión del codón de parada inducidos por NB54 (marcado por círculos negros), NB122 (marcado por triángulos negros), NB123 (marcado por triángulos vacíos) y gentamicina (marcado por rectángulos negros) en una serie de construcciones de contexto de mutación sin sentido que representan diversas enfermedades genéticas (entre paréntesis), en los que los resultados pertenecientes a la construcción R3X (USH1) se muestran en la Figura 3a , R245X (USh 1) en la Figura 3B, G542X (CF) en la Figura 3C, W1282X (CF) en la Figura 3D, Q70X (HS) en la Figura 3E y en los que los resultados pertenecientes a la construcción R3381X (DMD) se muestran en la Figura 3F.

Como puede verse en las Figuras 3A-F, la efectividad de la lectura completa es sustancialmente diferente entre diferentes construcciones y compuestos probados, sin una dependencia obvia de la eficacia de la lectura completa del tipo de modificación introducida en el aminoglucósido. Sin embargo, en todas las mutaciones probadas (excepto R3X y Q70X, Figura 3A y Figura 3E), NB122 indujo el nivel más alto de lectura completa, seguido de NB123, NB54, y gentamicina. La secuencia de tetracodón UGA C (R3X) mostró la mejor lectura traduccional que UGA A y UGA G, siendo el tetracodón UAG C menos eficiente, de acuerdo con observaciones anteriores.

Para evaluar adicionalmente el potencial de lectura de NB122 y NB123, su actividad se ensayó en células de mamífero cultivadas usando cuatro plásmidos indicadores de luciferasa duales diferentes que albergan la mutación sin sentido PCDH15-R3X y PCDH15-R245X de USH1, la mutación sin sentido IDUA-Q70X de HS y la mutación sin sentido CFTR-W1282X de f Q. Estas construcciones indicadoras eran las mismas que se presentaron anteriormente en el presente documento para el estudio in vitro y tienen una clara ventaja para controlar las diferencias en los niveles de ARNm entre las secuencias normales y que contienen sin sentido sobre las de un solo indicador o análisis de proteínas directo.

Las construcciones se transfectaron en una línea celular de riñón embrionario humano (HEK-293) y se incubaron con concentraciones variables de NB122, NB123, NB54 y el fármaco de control gentamicina, y los resultados se presentan en las Figuras 4A-D.

Las Figuras 4A-D presentan supresión ex vivo de las mutaciones sin sentido PCDH15-R3X (Figura 4A), PCDH15-R245X (Figura 4B), IDUA-Q70X (Figura 4C) y CFTR-W1282X (Figura 4D), efectuado por ejemplo de referencia NB54 (marcado por círculos negros), NB122 (marcado por triángulo negros), NB123 (marcado por triángulos vacíos) y el fármaco de control gentamicina (marcado por rectángulos negros).

Como se describe anteriormente en el presente documento, las construcciones de plásmido p2luc que alberga las mutaciones R3X, R245X, Q70X y W1282X se transfectaron a células HEK-293 usando lipofectamine2000 y los compuestos probados se añadieron 6 horas después de la transfección. Las células se recolectaron después de 16 horas de incubación y se determinó la actividad luciferasa usando el sistema de ensayo indicador de luciferasa dual (Promega™). La lectura completa del codón de parada se calculó como se describió anteriormente y los resultados son promedios de al menos tres experimentos independientes.

Como puede verse en las Figuras 4A-D, en todas las mutaciones probadas, la efectividad observada de la lectura directa inducida por aminoglucósidos fue en el orden NB122 > NB123> NB54 > gentamicina. Esta tendencia para NB122 y NB123 fue similar a la observada para la supresión de las mismas mutaciones de parada in vitro (véanse las Figuras 3A-F), a pesar de que la brecha de diferencia de potencia entre NB122 y NB123 fue menor que la observada para la supresión de las mismas mutaciones en extractos libres de células.

Las potencias de lectura significativamente más altas observadas para ambos NB122 y NB123, sobre el del ejemplo de referencia NB54 en R3X y Q70X (véanse la Figura 4A y la Figura 4C), fue considerablemente diferente a los de las mismas mutaciones in vitro (Figura 3A y Figura 3E). Estos datos pueden apuntar a una mejor permeabilidad celular de ambos NB122 y NB123 sobre el del ejemplo de referencia NB54, debido a la presencia del grupo 5"-metilo.

Varias combinaciones de los puntos farmacóforos anteriormente mencionados en una molécula incluyendo N1-AHB con grupo (R) -6'-metilo dio el compuesto conocido NB84 (ejemplo de referencia) y N1-AHB con grupos (S)- y (R)-5"-metilo dieron los compuestos ejemplares de acuerdo con algunas realizaciones de la presente invención, NB122 y NB123. Se ha demostrado que todos estos compuestos ejemplares exhiben una actividad de lectura completa significativamente mejorada que las estructuras originales, mientras que la citotoxicidad de las novedosas estructuras resultantes no cambió significativamente. Uno de los objetos del presente estudio fue probar combinaciones adicionales de los elementos anteriores. Como tal, la combinación de grupo (R)-6'-metilo con grupo (S)-5"-metilo o grupo (R)-5"-metilo en una molécula. Para ese fin se han preparado y probado los compuestos ejemplares NB124 y NB125. La combinación de los dos últimos grupos metilo quirales con el grupo N1-AHB dio dos compuestos ejemplares NB127 y NB128.

Como en la serie anterior, se evaluó la influencia de dos grupos metilo quirales en el potencial de lectura in vitro sobre los pseudo-trisacáridos NB124 [(R)-6', (S)-5"] y NB125 [(R)-6', (R)-5"] usando un sistema de ensayo indicador de luciferasa dual como se describe anteriormente en el presente documento y los resultados se presentan en las Figuras 5A-B y las Figuras 6A-F.

Las Figuras 5A-D presentan gráficos comparativos de resultados de ensayos de supresión de la mutación del codón de parada prematuro in vitro del CFTR-G542X (Figura 5A y Figura 5C), CFTR-W1282X (Figura 5B y Figura 5D) efectuada por compuestos ejemplares de acuerdo con algunas realizaciones de la presente invención NB124 (marcado por círculos negros), NB125 (marcado por círculos vacíos), NB127 (marcado por triángulos negros), NB128 (marcado por triángulos vacíos), ejemplo de referencia NB74 (marcado por rombos vacíos) ejemplo de referencia NB84 (marcado con rombos negros) y los fármacos de control gentamicina (marcado por rectángulos negros) y G418 (marcado por rectángulos vacíos).

Las Figuras 6A-F presentan los resultados del ensayo de lectura completa del codón de terminación mostrando gráficos comparativos de niveles de lectura completa in vitro del codón de parada inducidos por NB124 (marcado por círculos negros), NB125 (marcado por círculos vacíos), ejemplo de referencia NB74 (marcado por rombos vacíos) y el fármaco de control gentamicina (marcado por rectángulos negros) en una serie de construcciones de contexto de mutación sin sentido que representan diversas enfermedades genéticas (entre paréntesis), en los que los resultados pertenecientes a la construcción R3X (USH1) se muestran en la Figura 6a , R245X (USH1) en la Figura 6B, G542X (CF) en la Figura 6C, W1282X (CF) en la Figura 6D, Q70X (HS) en la Figura 6e y en los que los resultados pertenecientes a la construcción R3381X (DMD) se muestran en la Figura 6F.

Como puede verse en las Figuras 5A-B y las Figuras 6A-F, la adición del grupo (S)-5"-metilo en la estructura del compuesto conocido NB74 (ejemplo de referencia) para producir NB124 aumenta su actividad de lectura in vitro de forma significativa, mientras que la del grupo (R)-5"-metilo (en el compuesto NB125) es más pequeña comparativamente. Además, en todas las mutaciones probadas la actividad de lectura de NB124 se mejoró significativamente en comparación con la del fármaco clínico gentamicina. Por lo tanto, los dos grupos metilo (R)-6'-metilo y (S)-5"-metilo en el compuesto NB124 están funcionando aditiva o sinérgicamente para mejorar la actividad de lectura en comparación con NB30 (ejemplo de referencia), NB74 (ejemplo de referencia) y NB118. Las conversiones de cualquiera de NB30 a NB74 a NB124 (a saber, la adición del primer grupo (R)-6'-metilo en NB30 para producir NB74 y que la adición adicional de (S)-5"-metilo en NB74 para producir NB124), o Nb 30 a NB118 a NB124 (a saber, la adición del primer grupo (S)-5"-metilo en NB30 para producir NB118 y que la adición adicional del grupo (R)-6'-metilo en NB118 para producir NB124), están afectando aditivamente para aumentar la actividad observada de las estructuras resultantes de manera paso a paso.

De forma interesante, también se observó un efecto aditivo similar cuando los dos grupos metilo anteriores en NB124 y NB125 se combinaron con el grupo N1-AHB para producir los compuestos NB127 y NB128, respectivamente, como se presenta en las Figuras 5C-D y las Figuras 7A-F.

Las Figuras 7A-F presentan los resultados del ensayo de lectura completa del codón de terminación mostrando gráficos comparativos de niveles in vitro de supresión del codón de parada inducidos por NB84 (ejemplo de referencia; marcado por rombos negros), NB127 (marcado por triángulos negros), NB128 (marcado por triángulos vacíos), G418 (marcado por rectángulos vacíos) y gentamicina (marcado por rectángulos negros) en una serie de construcciones de contexto de mutación sin sentido que representan diversas enfermedades genéticas (entre paréntesis), en los que los resultados pertenecientes a la construcción R3X (USH1) se muestran en la Figura 7A, R245X (USH1) en la Figura 7B, G542X (FQ) en la Figura 7C, W1282X (FQ) en la Figura 7D, Q70X (HS) en la Figura 7E y en los que los resultados pertenecientes a la construcción R3381X (DMD) se muestran en la Figura 7F.

Como puede verse en las Figuras 5C-D y las Figuras 7A-F, NB127 que contiene el grupo (S)-5"-metilo es significativamente más potente que el NB128 que contiene grupo (R)-5"-metilo. Además, ambos NB127 y NB128 son inductores de lectura significativamente más fuertes que las contrapartes correspondientes que no poseen un resto AHB en la posición N1 (a saber NB124 y NB125) y el compuesto n B84 que contiene solo (R)-6'-metilo y N1-AHB

Se observa en el presente documento que en diversos concursos de mutaciones probados, tales como G542X, W1282X y Q70X, NB127 exhibieron una actividad similar o mayor que la de G418, y además que en todas las pruebas in vitro realizadas hasta la fecha, G418 se considera el inductor de lectura más potente. La observación de que NB127 puede supera la actividad G416, aunque exhibe una toxicidad celular mucho menor que la de G418 (véase la Tabla 2) demuestra los beneficios conferidos por los compuestos de acuerdo con algunas realizaciones de la presente invención.

Los datos observados de actividad in vitro están respaldados por pruebas de actividad comparativa ex vivo que se muestran en las Figuras 8-10.

Las Figuras 8A-D presentan gráficos comparativos de resultados de ensayos ex vivo de supresión de la mutación del codón de parada prematura realizados para la construcción CFTR-G542X (Figura 8A y 8C), CFTR-W1282X (Figura 8B y 8D) efectuada por NB124 (marcado por círculos negros), NB125 (marcado por círculos vacíos), NB127 (marcado por triángulos negros), NB128 (marcado por triángulos vacíos), NB74 (ejemplo de referencia; marcado por rombos vacíos) NB84 (ejemplo de referencia; marcados por rombos negros) y los fármacos de control gentamicina (marcado por rectángulos negros) y G418 (marcado por rectángulos vacíos).

Las Figuras 9A-E presentan los resultados del ensayo de lectura completa del codón de terminación mostrando gráficos comparativos de niveles ex vivo de supresión del codón de parada inducidos por NB124 (marcado por círculos negros), NB125 (marcado por círculos vacíos), NB74 (ejemplo de referencia; marcado por rombos negros) y los fármacos de control gentamicina (marcado por rectángulos negros) y G418 (marcado por rectángulos vacíos) en una serie de construcciones de contexto de mutación sin sentido que representan diversas enfermedades genéticas (entre paréntesis), en los que los resultados pertenecientes a la construcción R3X (USH1) se muestran en la Figura 9A, R245X (USH1) en la Figura 9B, Q70X (HS) en la Figura 9C, W1282X (FQ) en la Figura 9D y G542X (FQ) en la Figura 9E.

Las Figuras 10A-E presentan los resultados del ensayo de lectura completa del codón de terminación mostrando gráficos comparativos de niveles ex vivo de supresión del codón de parada inducidos por NB127 (marcado por rectángulos negros), NB128 (marcado por triángulos vacíos), NB84 (ejemplo de referencia; marcado por rombos negros) y los fármacos de control gentamicina (marcado por rectángulos negros) y G418 (marcado por rectángulos vacíos) en una serie de construcciones de contexto de mutación sin sentido que representan diversas enfermedades genéticas (entre paréntesis), en los que los resultados pertenecientes a la construcción R3X (USH1) se muestran en la Figura 10A, R245X (USH1) en la Figura 10B, Q70X (HS) en la Figura 10C, W1282X (FQ) en la Figura 10D y G542X (FQ) en la Figura 10E.

Como puede verse en las Figuras 8-10, en todas las mutaciones probadas, la efectividad observada de la lectura completa inducida por aminoglucósidos fue del orden de NB124 > NB125 > NB74 > gentamicina y NB127 > NB128 > NB84 > gentamicina. Estas tendencias son similares a las observadas para la supresión de las mismas mutaciones de parada in vitro (véanse las Figuras 5-7), aunque la brecha de diferencia de potencia entre NB127 y NB128 era más pequeña que la observada para la supresión de las mismas mutaciones in vitro en extractos libres de células.

EJEMPLO 3

TOXICIDAD CELULAR frente a LECTURA COMPLETA

Con el fin de garantizar una viabilidad celular adecuada para cada uno de los compuestos probados a las concentraciones probadas, La toxicidad celular se evaluó para cada compuesto midiendo el valor de concentración semimáxima letal (valores de CL⁵⁰) en células HEK-293 y HFF (fibroblastos de prepucio humano).

Los porcentajes de viabilidad celular se calcularon como la relación entre el número de células vivas en cultivos desarrollados en presencia de los compuestos probados, frente a cultivos desarrollados con el mismo protocolo pero sin el compuesto probado. Los resultados representan promedios de al menos tres experimentos independientes.

Las Figuras 11A-D presentan gráficas semilogarítmicas de inhibición de la traducción in vitro en sistemas procariotas (marcados con círculos negros) y eucariotas (marcados con círculos vacíos) medidos para NB118 (Figura llA ) , NB119 (Figura 11B) NB122 (Figura 11C) y NB123 (Figura 11D).

Las Figuras 12A-D presentan gráficas semilogarítmicas de los porcentajes de viabilidad celular ex vivo frente a la concentración del compuesto probado en células HEK-293 (Figura 12A y Figura 12C) y en fibroblastos de prepucio humano (HFF) (Figura 12B y Figura 12D), para gentamicina (marcado por rectángulos vacíos), NB118 (marcado por círculos vacíos), NB119 (marcado por círculos negros), NB122 (marcado por triángulos vacíos), y NB123 (marcado por un triángulo negro).

Los valores de concentración letal semimáxima (CL⁵⁰) se obtuvieron ajustando las curvas de concentración-respuesta a los datos de al menos tres experimentos independientes, utilizando el software GraFit 5.

La inhibición de la traducción procariota y eucariota se cuantificó en ensayos de transcripción/traducción acoplados mediante el uso de detección activa de luciferasa, realizado como se describe anteriormente en el presente documento. Los valores de CMI se determinaron mediante el procedimiento de doble microdilución, con dos concentraciones iniciales diferentes de cada compuesto ensayado (384 pg/ml y 6.144 pg/ml). Todos los experimentos se realizaron por duplicado y se obtuvieron resultados análogos en tres experimentos diferentes. En todas las pruebas biológicas, todos los aminoglucósidos probados estaban en sus formas de sal de sulfato. Las concentraciones informadas se refieren a las de la forma de amina libre de cada aminoglucósido.

La Tabla 1 presenta la toxicidad celular comparativa, la inhibición de la traducción eucariota y procariota y los ensayos de actividad antibacteriana obtenidos para gentamicina, paromomicina, los ejemplos de referencia informados anteriormente NB30 y NB54 y los compuestos ejemplares NB118, NB119, NB122 y Nb 123.

Tabla 1

Actividad CMI Inhibición de la traducción Toxicidad celular CL⁵⁰ _{antibacteriana (pM)}(mM)

B.

subtilis E. coli Aminoglucósido CI⁵⁰del sistema CI⁵⁰del sistema

ATCC66 R477/100 procariota (nM) eucariota (pM) ^{HFF HEK-293}

33

<0,75 6 28±4 62±9 3,2±0,3 2,5±0,3 Gentamicina 1,2 22 51±5 57±4 3,1 ±0,4 4,1±0,5 Paromomicina

100 790 460±50 31 ±4 21,8±0,9 21,4±3,9 NB30

70 588 160±20 24± 1 7,8±0,4 6,1±0,6 NB54

83 2659 1960±206 16±1,3 21,8±0,5 23,5±0,6 NB118

78 4989 2132±478 28±1,1 20,1 ±0,6 19,8±0,4 NB119

33 1067 2266± 196 5,2±0,7 8,1±1,4 10,1±0,8 NB122

33 1057 811 ±59 4,6±0,6 19,3±1,5 13,9±1,3 NB123

La comparación de los datos de toxicidad celular observados en la Tabla 1 con los datos de actividad de lectura en las Figuras 2-4, demuestra que la instalación del grupo (S)-5"-metilo ya sea en NB30 para dar NB118, o en NB54 para dar NB122, no afecta significativamente la citotoxicidad (valores CL⁵⁰de 21,4 y 23,5 mM para NB30 y NBl18 respectivamente, y 6,1 y 10,1 mM para NB54 y NB122 respectivamente, respectivamente en h EK-293), mientras que aumenta en gran medida la actividad de supresión del codón de parada observada (NB30 <NB118 y NB54 <NB122).

La toxicidad celular similar observada en el caso de NB122 y NB54 en células HEK-293 y HFF (véase la Tabla 1), junto con una actividad de supresión sustancialmente elevada de NB122 sobre el de NB54 tanto in vitro como ex vivo en células cultivadas, indican que NB122 puede representar una opción más superior que NB54 en terapia de supresión.

Que los datos de supresión ex vivo comparativos en la Figura 4 muestren solo una pequeña preferencia de NB122 sobre el de NB123, mientras que los datos de toxicidad celular en la Tabla 1 indican un perfil de toxicidad celular pequeño (células HEK-293) a significativamente mejor (células HFF) de NB123 sobre el de NB122. Por lo tanto, uno puede argumentar que el rendimiento in vivo de diastereómero NB123 podría ser incluso mejor que el de NB122.

Además, un estudio muy reciente sobre gentamicina demostró que la inversión de una configuración absoluta en un solo átomo de carbono, de (S)-6'-gentamicina C²a (R)-6'-gentamicina C², reduce significativamente la toxicidad celular y la nefrotoxicidad aparente del diaestereómero (R) en comparación con el del diaestereómero (S), según lo determinado en cultivos celulares y estudios en animales, mientras que la efectividad bactericida no se ve afectada.

Basándose en estas observaciones, está claro que las pruebas de toxicidad adicionales, incluyendo nefrotoxicidad y ototoxicidad, los principales inconvenientes de los aminoglucósidos conocidos, puede resolver este problema de manera satisfactoria y validar el beneficio observado de cualquiera NB122 o NB123, sobre el de NB54 y sobre el de la gentamicina.

El impacto del grupo (S)-5"-metilo en las elevadas actividades de lectura de NB118 y NB122 está respaldado además por los datos de inhibición de la traducción eucariota observados (véase, Tabla 1). La efectividad con la que NB122 (valor de concentración inhibitoria semimáxima CI⁵⁰= 5,2 pM) inhibe la traducción eucariota es mayor que la de NB118 (CI⁵⁰= 16,0 pM) y NB54 (CI⁵⁰= 24,0 pM), una tendencia similar a la observada para la actividad de lectura completa, a saber NB122> NB118> NB54 (véanse las Figuras 2-4). Además, la comparación de los valores CI⁵⁰de NB118 y NB122 a los de sus estructuras parentales NB30 y NB54 (valores de CI⁵⁰de 31 y 24 j M, respectivamente), revela que NB118 y NB122 son 1,9 y 4,6 veces más específicos por el ribosoma eucariota que sus parentales NB30 y NB54, indicando que el impacto observado del grupo (S)-5"-metilo en las elevadas actividades de lectura de NB118 y NB122 está asociado a su mayor especificidad por el ribosoma eucariota.

La Tabla 2 presenta resultados comparativos de toxicidad celular, la inhibición de la traducción eucariota y procariota y los ensayos de actividad antibacteriana obtenidos para gentamicina, G418, los informados anteriormente NB74 y NB84 y los compuestos ejemplares NB124, NB125, Nb 127 y NB128.

Tabla 2

Actividad CMI Inhibición de la traducción Toxicidad celular CL⁵⁰

antibacteriana (j M) (mM)

B. subtilis Aminoglucósido ATCC66 E. coli CI⁵⁰del sistema CI⁵⁰del sistema HFF HEK-293

33 R477/100 procariota (j M) eucariota (j M)

<0,75 6 0,028±0,004 62± 9 3,21±0,31 2,65±0,54 Gentamicina

<1,25 9 0,009±0,002 2±0,3 1,59±0,14 1,31±0,06 G418

42 680 1,130±0,1 20 17±0,6 21,34±1,72 22,17±1,06 NB74

70 556 0,980±0,070 2,8±0,3 16,33±0,47 5,77±0,68 NB84

96 768 1,102±0,1 85 1,49±0,08 4,75±0,33 5,40±0,45 NB124

96 1536 1,862±0,1 73 7,96±0,27 7,59±0,18 16,54±3,10 NB125

192 384 1,753±0,274 0,73±0,07 6,48±0,26 5,09±0,27 NB127

96 384 1,752±0,1 45 0,89±0,07 2,78±0,11 5,35±0,31 NB128

Como puede verse en la tabla 2, la comparación de los datos de toxicidad celular observados en la Tabla 2 con los datos de actividad de lectura presentados en las Figuras 8-10, demuestra que los compuestos de acuerdo con algunas realizaciones de la presente invención, tales como NB124, NB125, NB127 y NB128 exhiben aproximadamente el mismo nivel de toxicidad celular en comparación con los compuestos desvelados anteriormente, con la excepción de citotoxicidad de NB128 en fibroblasto de prepucio humano (HFF).

Además, similar a los compuestos anteriormente desvelados, los compuestos novedosos NB124, NB125, NB127 y NB128 no exhiben actividad antibacteriana significativa tanto en E. coli como B. subtilis (véase, Tabla 2 anteriormente). Estos datos están respaldados por su inhibición drásticamente reducida de la síntesis de proteínas procariotas (Tabla 2) en comparación con los antibióticos aminoglucósidos convencionales y, por lo tanto, están de acuerdo con una tendencia general de que los aminoglucósidos con inhibición reducida de la traducción procariota también son menos citotóxicos, probablemente debido a una inhibición reducida de la síntesis de proteínas mitocondriales.

EJEMPLO 4

ACTIVIDAD ANTIBACTERIANA

Los resultados de los ensayos de actividad antimicrobiana obtenidos para algunos compuestos ejemplares de acuerdo con las realizaciones de la presente invención se presentan en las Tablas 1 y 2 anteriormente en el presente documento.

Se ha demostrado anteriormente que compuestos tales como NB30, NB54, NB74 y NB84 (ejemplos de referencia) son inhibidores de la traducción procariota aproximadamente 10 veces más débiles que la gentamicina y la paromomicina, y además no muestran casi ninguna actividad bactericida contra bacterias Gramnegativas y Grampositivas. Los presentes experimentos determinan si los compuestos de acuerdo con algunas realizaciones de la presente invención, tales como NB118, NB119, NB122, NB123, NB124, NB125, NB127 y NB128, conservan propiedades similares.

Por tanto, los compuestos ejemplares NB118, NB119, NB122, NB123, NB124, NB125, NB127 y NB128 fueron investigados como agentes antibacterianos frente a bacterias Gramnegativas (Escherichia coli) y Grampositivas (Bacillus subtilis), junto con sus actividades procariotas anti-traduccionales (véase la Tabla 1 y Tabla 2).

Como puede verse en las Tablas 1 y 2, los valores CI⁵⁰medidos muestran que la eficacia con la que los compuestos ejemplares de acuerdo con algunas realizaciones de la presente invención, inhiben el ribosoma procariota es significativamente menor que el de paromomicina y gentamicina, de acuerdo con los datos antibacterianos observados de este conjunto de compuestos; mientras que la gentamicina y la paromomicina exhiben importantes actividades antibacterianas contra ambos E. coli y B. subtilis, Los compuestos ejemplares de acuerdo con algunas realizaciones de la presente invención carecen de una actividad antibacteriana considerable.

Los datos observados con NB118, NB119, NB122, NB123, NB124, NB125, NB127 y NB128 son similares a aquellos observados para los ejemplos de referencia NB30, NB54, NB74 y NB84 y respaldan aún más la correlación informada anteriormente en los aminoglucósidos entre la actividad anti-traduccional procariota y los valores de CMI, concretamente, la disminución de la inhibición de la traducción procariota se asocia con la disminución de la actividad antibacteriana.

Adicionalmente, la continua incapacidad observada de los ejemplos de referencia NB30, NB54, NB74 y NB84, así como de NB118, NB119, NB122, NB123, NB124, NB125, NB127 y NB128, de mostrar una actividad antibacteriana significativa junto con su disminución de la especificidad del ribosoma procariota, sugiere que al reducir la especificidad del ribosoma procariota y, por lo tanto, eliminar su actividad antibacteriana, su acción sobre la maquinaria de síntesis de proteínas mitocondriales eucariotas puede reducirse y, por lo tanto, reducir significativamente sus efectos tóxicos en los seres humanos. Este punto de vista está respaldado por el hecho de que la maquinaria de síntesis de proteínas mitocondriales de los mamíferos es muy similar a la maquinaria procariota y que la toxicidad inducida por los aminoglucósidos puede, al menos en parte, estar conectada a una disfunción del ribosoma mitocondrial mediada por fármacos.

La actividad anti-traduccional eucariota observada significativamente aumentada (que en realidad mide solo la inhibición de la síntesis de proteínas citoplasmáticas y no la síntesis de proteínas mitocondriales) junto con la citotoxicidad significativamente reducida de los compuestos NB118, NB119, Nb 122, NB123, NB124, NB125, NB127 y NB128 (en comparación con los de gentamicina y paromomicina) apoyan aún más esta opinión.

EJEMPLO 5

SELECTIVIDAD EUCARIOTA frente a PROCARIOTA

Como se analizó anteriormente, para constituir un candidato a fármaco digno que pueda usarse para tratar enfermedades genéticas provocadas por mutaciones de codones de parada prematura, un aminoglucósido no debe ser tóxico e interactuar con los ribosomas citoplasmáticos eucariotas. La virtud de la no toxicidad puede verificarse por la falta de actividad antimicrobiana, lo que significa que el fármaco inhibirá la traducción procariota en menor grado y, por lo tanto, lo más probable es que no inhiba la traducción mitocondrial. La presencia de esta combinación beneficiosa de cualidades deseadas en un aminoglucósido como los compuestos presentados en el presente documento puede demostrarse mediante una actividad selectiva eucariota frente a procariota.

También puede decirse que una notable selectividad de un compuesto de aminoglucósido hacia la inhibición de la traducción en eucariotas sobre la inhibición de la traducción en procariotas puede usarse para predecir su efectividad y seguridad como fármaco candidato para el tratamiento de trastornos genéticos asociados a mutaciones de codones de parada prematura.

La Tabla 3 consolida y compara los resultados obtenidos para una serie de aminoglucósidos conocidos ejemplares y aminoglucósidos ejemplares desvelados actualmente en ensayos de inhibición de la traducción realizados con sistemas ribosómicos eucariotas y procariotas. Cada compuesto también se indica por el tipo de punto de farmacóforos que presenta el compuesto de los cinco puntos de farmacóforos presentados en el Esquema 1 anteriormente en el presente documento. En la Tabla 3, los puntos de farmacóforo se indican con "i" para el grupo hidroxilo en la posición 6'; "ii" para el grupo AHB en la posición N1; "iii" para el tercer resto de sacárido "Anillo III"; "iv" para un metilo en la posición 6'; y "v" para el metilo en la posición 5".

Tabla 3

Puntos de farmacóforo Inhibición de la traducción Selectividad procariota frente a _{Aminoglucósido}eucariota

i iii iv v CI50Euc(uM) CI50Pro (uM) CI50Euc/CI50Pro

X X entamicina 62±9 0,028±0,004 2.214

X X romomicina 57±4 0,051 ±0,005 1.118

X X X G418 2,0±0,3 0,009±0,002 225

X X NB30 31±4 0,46±0,05 68

X NB54 24± 1 0,16±0,02 151

X X X NB74 17±0,6 1,130±0,120 15

X X X NB84 2,8±0,3 0,980±0,070 2,9

X X NB118 15,5±1,3 1,960±0,206 7,9

X X NB119 28±1,1 2,132±0,478 13

X NB122 5,2±0,7 2,266±0,196 2,3

X NB123 4,6±0,6 0,811 ±0,059 5,7

X X X NB124 1,49±0,08 1,102±0,185 1,3

X X X NB125 7,96±0,27 1,862±0,173 4,3

X X X NB127 0,73±0,07 1,753±0,274 0,4

X

X X

NB128 0,89±0,07 1,752±0,145 0,5

En todos los experimentos biológicos realizados, todos los aminoglucósidos probados estaban en sus formas de sal de sulfato. Las concentraciones informadas en la Tabla 3 se refieren a las de la forma de amina libre de cada aminoglucósido. La inhibición de la traducción procariota y eucariota se cuantificó en ensayos acoplados de transcripción/traducción como se describió anteriormente. Los valores de concentración semimáxima (CI⁵⁰) se obtuvieron ajustando las curvas de concentración respuesta a los datos de al menos tres experimentos independientes, utilizando el software GraFit 5. Todos los experimentos se realizaron por duplicado y se obtuvieron resultados análogos en tres experimentos diferentes.

Como puede verse en la tabla 3, se observa una disminución notable en la relación Cl⁵⁰Euc/Cl⁵⁰Pro (inhibición de la traducción en eucariotas a inhibición de la traducción en procariotas), bajando desde un valor promedio de aproximadamente 115 (promedio de la proporción de ejemplos de referencia NB30, NB54, NB74 y NB84), a un valor promedio de aproximadamente 7 (promedio de la relación de NB118, NB119, NB122 y NB123) para añadir el punto "v" del farmacóforo actualmente desvelado, a un valor promedio de aproximadamente 1,6 (promedio de la relación de NB124, NB125, NB127 y NB128) para añadir el punto "v" del farmacóforo actualmente desvelado y el punto "iv" del farmacóforo descrito desvelado.

Puede verse claramente en la Tabla 3, que los compuestos de aminoglucósidos ejemplares, de acuerdo con algunas realizaciones de la presente invención, que exhiben los cinco puntos farmacóforos, independientemente de la estereoconfiguración en la posición de 5", también exhiben la mayor selectividad eucariota frente a procariota, concretamente, estos compuestos ocupan un lugar destacado en la lista de posibles fármacos candidatos para el tratamiento de trastornos genéticos en humanos.

De hecho, mientras se preparaban y probaban los compuestos ejemplares NB124, NB125, NB127 y NB128, se ha descubierto que el aumento de la inhibición de la síntesis de proteínas citoplasmáticas procariotas se asocia a un aumento de la actividad de lectura. Los datos de la Tabla 3 muestran que el desarrollo sistemático de un farmacóforo completo podría aumentar gradualmente la especificidad de los compuestos recientemente desarrollados para el ribosoma citoplasmático y disminuir su especificidad para el ribosoma procariota, hasta NB127 y NB128 en los que se implementan los cinco puntos farmacóforos, exhiben selectividad inversa a los sistemas de traducción eucariotas frente a procariotas (ribosoma).

En el presente documento se señalan dos observaciones:

1) mientras que los antibióticos aminoglucósidos convencionales como la gentamicina y la paromomicina son 2214 veces y 1118 veces más selectivos para los ribosomas procariotas que eucariotas, esta selectividad en G418 cae a solo 225 veces, especialmente debido a su inhibición comparativamente aumentada de la traducción eucariota. Esta fuerte inhibición (Cl⁵⁰Euc= 2 j M) de traducción eucariota se consideró como la razón principal de la citotoxicidad drásticamente alta de G418, así como la razón principal de su muy fuerte actividad de lectura. Los resultados presentados en la Tabla 3 sugieren que si bien la elevada inhibición de la traducción eucariota es de hecho un apoyo a su fuerte actividad de lectura, la inhibición de la traducción eucariota no es el único evento tóxico de G418, sino que los otros efectos de G418 sobre las células eucariotas están correlacionados con su toxicidad. De acuerdo con los datos presentados en la Tabla 3, varios compuestos de acuerdo con algunas realizaciones de la presente invención, exhiben una potencia de inhibición similar o mayor de la traducción eucariota, incluyendo NB124, NB127 y NB128, mientras que es significativamente menos citotóxico que G418.

2) representando los valores de Cl⁵⁰Euc frente a la actividad de lectura completa in vitro de todos los aminoglucósidos convencionales y sintéticos probados, se ha observado una estrecha correlación entre estos dos parámetros, concretamente, una mayor inhibición se asocia a una mayor actividad de lectura, como se ilustra en la Figura 13A-B).

Las Figuras 13A-B presentan gráficos de dispersión para identificar la posible correlación entre la actividad de lectura y la inhibición de la traducción de proteínas in vitro en sistemas eucariotas como se observa para una serie de compuestos conocidos y compuestos ejemplares de acuerdo con algunas realizaciones de la presente invención, en los que el aumento de la inhibición de la síntesis de proteínas (valores de CI⁵⁰menores) está asociado al aumento de la actividad de lectura, mientras que la Figura 13A es una gráfica semilogarítmica de inhibición eucariota de la traducción frente a la actividad de lectura in vitro a una concentración de 1,4 j M de los aminoglucósidos probados (que se muestran en el eje X) usando seis mutaciones sin sentido diferentes (W1282X, Q70X, R3X, R245X, G542X y R3381X) y la Figura 1B es un gráfico lineal de los mismos datos presentados en la FIG 13A.

Se observa que, dado que la actividad de lectura completa depende de la dosis y también se ve afectada por varios factores, incluyendo la identidad del codón de parada, la cuarta base en la secuencia corriente abajo desde la parada y la secuencia de competencia alrededor del codón de parada, los datos presentados en la Figura 13 se recopilaron utilizando una concentración (1,4 j M) en la que se probaron todos los compuestos y una serie de construcciones diferentes que representan 6 construcciones diferentes de 4 modelos de enfermedades diferentes. Por lo tanto, el aumento de la especificidad y selectividad por el ribosoma procariota conduce a un aumento posterior de la actividad biológica deseada del compuesto y con una toxicidad reducida.

Otra observación realizada por los presentes inventores implica un compuesto previamente informado, el ejemplo de referencia NB33, que es esencialmente un dímero de paromamina en el que dos restos de paromamina están conectados en oxígenos 3' mediante un puente de metileno. NB33 es altamente específico para el ribosoma eucariota e inhibe la síntesis de proteínas por un valor de Cl⁵⁰Euc de 1,1 mM, casi el doble que G418 (Cl⁵⁰Euc de 2,0 mM). Sin embargo, NB33 casi no tiene actividad de lectura completa, indicando que su mecanismo de inhibición es diferente al de los aminoglucósidos conocidos y los compuestos de acuerdo con algunas realizaciones de la presente invención,

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un compuesto que tiene la fórmula general I:

o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo,

en la que:

R¹es un alquilo que tiene de 1-4 átomos de carbono;

R²es hidrógeno o (S)-4-amino-2-hidroxibutirilo (AHB);

R³se selecciona entre el grupo que consiste en hidrógeno y un alquilo que tiene de 1-4 átomos de carbono; y una estéreo configuración de cada una de las posiciones ⁶' y la posición 5" es independientemente una configuración R o una configuración S,

para su uso en el tratamiento de un trastorno genético en combinación con otro agente útil en el tratamiento de dicho trastorno genético.

2. El compuesto para su uso de la reivindicación 1, en el que R¹es dicho alquilo.

3. El compuesto para uso de la reivindicación 1 o 2, en el que R²y R³son cada uno hidrógeno.

4. El compuesto para uso de la reivindicación 1 o 2, en el que R²es AHB y R³es hidrógeno.

5. El compuesto para uso de la reivindicación 1 o 2, en el que R²es hidrógeno y R³es dicho alquilo.

⁶. El compuesto para uso de la reivindicación 1 o 2, en el que R²es AHB y R³es dicho alquilo.

7. El compuesto para su uso de la reivindicación 1, seleccionándose del el grupo que consiste en:

8. El compuesto para su uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, caracterizado por una relación de CI⁵⁰de inhibición de la traducción en eucariotas a CI⁵⁰de inhibición de la traducción en procariotas menor de 15.

9. El compuesto para su uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, caracterizado por una CMI en bacterias Gramnegativas más alta que 200 pM y una CMI en bacterias Grampositivas más alta que 20 pM.

10. Una composición farmacéutica que comprende el compuesto para su uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1-9 y un vehículo farmacéuticamente aceptable, comprendiendo la composición además dicho otro agente útil en el tratamiento de dicho trastorno genético.

11. El compuesto para su uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1-9 o la composición de la reivindicación 10, en el que dicho trastorno genético está asociado a una mutación de codón de parada prematura y/o un fenotipo de truncamiento de proteínas.

12. El compuesto para su uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1-9 y 11 o la composición de la reivindicación 10 u 11, en el que dicho trastorno genético se selecciona del grupo que consiste en fibrosis quística (FQ), Distrofia muscular de Duchenne (DMD), ataxiatelangiectasia, Síndrome de Hurler, hemofilia A, hemofilia B, Síndrome de Usher y Tay-Sachs.