KR102067477B1

KR102067477B1 - 스킬로이노사민을 포함하는 아미노사이클리톨 화합물, 이의 제조방법 및 이를 함유하는 약학 조성물

Info

Publication number: KR102067477B1
Application number: KR1020180070709A
Authority: KR
Inventors: 박제원
Original assignee: 고려대학교 산학협력단
Priority date: 2018-06-20
Filing date: 2018-06-20
Publication date: 2020-01-17
Also published as: KR20190143137A

Abstract

본 발명은 기존 아미노글리코사이드 항균제의 신장독성(nephrotoxicity)을 극복하는 한편 무의미 점 돌연변이(nonsense point mutation)에 기인한 유전질환을 치료할 수 있는 스킬로이노사민을 포함하는 아미노사이클리톨 화합물, 이의 제조방법 및 이를 함유하는 약학 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 스킬로이노사민을 포함하는 아미노사이클리톨 화합물은 신장 세포주에 대하여 상대적으로 낮은 세포 독성을 나타내며, 기존 아미노글리코사이드에 비해 향상된 무의미 통독 유도 활성을 나타내므로, 낭성 섬유증 등과 같은 무의미 점 돌연변이(nonsense point mutation)에 기인한 인간 유전질환 치료제로 유용하다.

Description

스킬로이노사민을 포함하는 아미노사이클리톨 화합물, 이의 제조방법 및 이를 함유하는 약학 조성물 {Scyllo-inosamine containing aminocyclitol compounds, method for the preparation thereof and pharmaceutical compositions comprising the same}

본 발명은 스킬로이노사민을 포함하는 아미노사이클리톨 화합물, 이의 제조방법 및 이를 함유하는 약학 조성물에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 기존 아미노글리코사이드 항균제의 신장독성(nephrotoxicity)을 극복하는 한편 무의미 점 돌연변이(nonsense point mutation)에 기인한 유전질환을 치료할 수 있는 스킬로이노사민을 포함하는 아미노사이클리톨 화합물, 이의 제조방법 및 이를 함유하는 약학 조성물에 관한 것이다.

아미노글리코사이드는 주로 세균성 감염증 처치를 위해 일반적으로 사용되는 항세균제로 광범위하게 적용이 가능한 가장 오래된 역사를 가진 항세균제이다. 2-데옥시스트렙타민(2-deoxystreptamine)을 함유하는 아미노글리코사이드 계열 항세균제로는 대표적으로 카나마이신(kanamycin), 겐타마이신(gentamicin) 및 네오마이신(neomycin) 등의 천연 항세균제와 이들 천연 항세균제에 화학적 반합성법(semi-synthetic process)을 적용한 2세대 계열인 아미카신(amikacin), 이세파마이신(isepamicin) 등이 있다. 다음으로, 스킬로이노사민(scyllo-inosamine)을 함유하는 아미노사이클리톨 계열로는 최초의 결핵제였던 스트렙토마이신(streptomycin), 포티마이신(fortimicin) 및 이스타마이신(istamycin) 등이 있다. 특히, 스킬로이노사민 포함 아미노사이클로톨 중 포티마이신과 이스타마이신은 주요 구조인 스킬로이노사민에 추가로 하나의 당이 부가된 의사이당(pseudo-disaccharide)구조로서 2-데옥시스트렙타민 함유 항세균제에 저항성을 가진 내성세균 특이적으로 활성을 유지하고 있는 것으로 알려져 있다 (Ramirez MS et al., Drug Resistance Updates 13(6):151-171, 2010).

다수의 인간 유전병의 경우 기존 아미노산 암호화 코돈이 정지 코돈들로 치환되는 무의미 돌연변이(nonsense mutation)에 의해 유전질환이 나타난다. 이러한 무의미 돌연변이에 따라 번역의 조기종결(premature termination)이 나타나고, 이에 따른 단편화된 불활성 단백질 생합성이 야기된다. 현재까지, 수백 종의 무의미 돌연변이가 알려져 있고, 그 중 낭성 섬유증(cystic fibrosis), 듀시엔형 근이영양증(duchenne muscular dystrophy, DMD), 모세혈관 확장성 운동 실조증후군(ataxia telangiectasia), 헐러 증후군(hurler syndrome), A형 혈우병(hemophilia A), B형 혈우병(hemophilia B), 및 테이-삭스 병(tay-sachs) 등의 불치 유전질환들의 원인으로 보여지고 있다 (Park, S.R., et al., Nat. Prod. Rep. 30(1):11-20, 2013; Atkinson, J et al., Nucleic Acids Res. 22(8):1327-34, 1994). 현재까지 이들 불치병에 대한 효과적인 처치법은 없는 상황이며, 최근 그 잠재적 해결책으로 유전자 치료(gene therapy)가 부각되고 있으나, 아직까지 인체 적용 및 처치 전에 풀어야 할 다수의 문제점은 남아 있는 실정이다.

한편, 아미노글리코사이드는 생체 내 라이보솜(ribosome)이 무의미 돌연변이를 통독(read-through)하도록 유도시키는 활성이 있고, 그에 따라 단편화되지 않고 완전길이(full-length)의 단백질이 만들어질 수 있다는 점 때문에, 지난 수년간 아미노글리코사이드의 유전질환에 대한 치료제로서의 잠재성이 보고된바 있다 (Burke, J.F. et al., Nucleic Acids Res. 13(17):6265-72, 1985; Kaufman, R.J. et al., J. Clin. Invest. 104(4):367-8, 1999; Kerem, E. et al., Curr . Opin . Pulm . Med. 10(6):547-52, 2004; Manuvakhova, M. et al., RNA 6(7):1044-55, 2000). 이러한 유전질환 치료 잠재성으로 인식되고 있는 대부분의 무의미 통독 유도(nonsense read-through inducer) 활성의 경우, 최근까지도 임상 사용 중인 아미노글리코사이드 상용품 만을 대상으로 연구가 이루어졌으며, 그 화합물의 구조를 변형시킴으로서 무의미 통독 활성을 최적화하려는 노력은 거의 전무하였다 (Kerem, E. et al., Curr. Opin. Pulm. Med. 10(6):547-52, 2004).

이스라엘의 테크니온 리서치 앤 디벨로퍼먼트 파운데이션(Technion Research & Development Foundation)의 바소브(Baasov) 연구팀은 의사삼당(pseudo-trisaccharide) 아미노글리코사이드를 기본 구조로 가진 다양한 신규 아미노글리코사이드 화합물을 화학적 유기합성 제조법을 통하여 합성하여, 이들 화합물의 무의미 통독 유도 활성을 확인하는 한편, 낮은 세포 독성 및 포유동물 세포에 대한 선택성이 있는 신규한 아미노글리코사이드를 발명하여 유전 질환 치료에 이용가능한 화합물로 보고하였다 (US20130237489A1). 또한, 일본의 도쿄대와 마이크로비얼 케미스티리 리서치 파운데이션(Microbial Chemistry Research Foundation)은 공동으로 카나마이신 천연 아미노글리코사이드의 반합성 제제로 개발된 아베카신(arbekacin)의 무의미 통독 유도 활성을 실험관 수준에서 확인하였다 (EP2535051A4). 이들을 제외하고는, 최근까지 보고된 유기합성이나 생합성 제조방법을 통하여 아미노글리코사이드 구조를 변형한 화합물에 대한 보고는 모두 감염질환 치료와 관련된 신규한 항세균제 및 항생제 이점만을 제시하고 있다 (US20130096078A1 및 US8383596B2).

아울러, 상술한 아미노글리코사이드의 문제점 외에도 대다수의 임상 사용 중인 상용 아미노글리코사이드는 무의미 통독 유도 활성이 있음에도 불구하고 임상 적용시 다른 문제점이 있다. 최근 미국 바이오 제약회사인 피티시 세라퓨틱스(PTC Therapeutics)는 무의미 통독 유도 활성을 가진 아미노글리코사이드의 임상 적용시 문제점을 극복할 방안으로, 다수의 화합물 라이브러리로부터 신규한 무의미 통독 유도 화합물을 스크리닝하였고, 비 아미노글리코사이드 화합물인 아탈루렌(ataluren, PTC124)을 발견하였다 (US7863456B2). 이 화합물은 아미노글리코사이드와는 구조적으로 독립적이고, 항세균 활성을 가지지 않으며, 독성이 나타나지 않았다. 미국 FDA는 PTC124를 희귀 질환인 낭성 섬유증과 듀시엔형 근이영양증에 대한 신약 후보물질로 규정하여 패스트트랙(fast-track)으로 임상 진입시켰고, 2014년 현재 임상 3상 단계에 있다 (Lane, M.A. et al., Clin. Med. 14(1):76-8, 2014).

이에, 본 발명자들은 무의미 통독 유도 활성을 지닌 동시에, 포유동물 세포에 대한 낮은 세포 독성과 항세균 활성을 최소화시킨 신규 아미노글리코사이드 화합물을 제조하고자 예의 노력한 결과, 아미노글리코사이드의 생합성과 관련 다양한 유전자 조합을 2종의 이종숙주에 도입하여 재조합 미생물 세포 공장을 통한 스킬로이노사민을 포함하는 아미노사이클리톨 화합물을 제조하고, 상기 화합물이 무의미 통독 유도 활성을 나타내는 동시에 기존 아미노글리코사이드의 임상 적용 시 문제점을 극복할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 목적은 기존 아미노글리코사이드 항균제의 신장독성(nephrotoxicity)을 극복하는 한편 무의미 점 돌연변이(nonsense point mutation)에 기인한 유전질환을 치료할 수 있는 하기 화학식 1로 표시되는 스킬로이노사민을 포함하는 아미노사이클리톨 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 제공하는데 있다:

[화학식 I]

상기 식에서, R₁은 NH₂ 또는 OH이고, R₂는 H 또는 CH₃이고, R₃은 H 또는 라이보스(ribose)이고, R₄는 H 또는 글루코스(glucose) 또는 자일로스(xylose)이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 화합물을 유효성분으로 함유하는 무의미 점 돌연변이에 기인한 유전 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물, 상기 화합물을 유효성분으로 함유하는 약학 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 무의미 점 돌연변이에 기인한 유전 질환의 예방 또는 치료방법, 상기 화합물을 무의미 점 돌연변이에 기인한 유전 질환의 예방 또는 치료에 사용하기 위한 용도 및 무의미 점 돌연변이에 기인한 유전 질환의 예방 또는 치료용 약제의 제조를 위한 상기 화합물을 유효성분으로 함유하는 약학 조성물의 용도를 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 i) fmrO _s, ino1 _s, forA , forG , forS 및 forM 유전자가 도입되어 있는 재조합 대장균 (EC1); ii) fmrO _s, ino1 _s, forA , forG , forS, forM , forD 및 forK _s 유전자가 도입되어 있는 재조합 대장균 (EC2); iii) fmrO _s, ino1_s, forA , forG , forS , forM , forD , neoL 및 neoP 유전자가 도입되어 있는 재조합 대장균 (EC3); iv) fmrO _s, ino1 _s, forA , forG , forS , forM , forD 및 kanM2 유전자가 도입되어 있는 재조합 대장균 (EC4); v) fmrO _s, ino1 _s, forA , forG , forS, forM , forD 및 GenM2 유전자가 도입되어 있는 재조합 대장균 (EC5); vi) fmrO_s, ino1 _s, forA , forG , forS , forM , forD , neoL , neoP 및 forK _s 유전자가 도입되어 있는 재조합 대장균 (EC6); vii) fmrO _s, ino1 , forA , forG , forS , forM , forD, kanM2 및 forK _s 유전자가 도입되어 있는 재조합 대장균 (EC7); 및 viii) fmrO_s, ino1 _s, forA , forG , forS , forM , forD , genM2 및 forK _s 유전자가 도입되어 있는 재조합 대장균 (EC8)으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 상기 화합물 생산능을 가지는 재조합 대장균; 및

i) forE 유전자가 결실되고, neoL 및 neoP 유전자가 도입되어 있는 재조합 마이크로모노스포라 속 미생물 (MO1); ii) forE 유전자가 결실되고, kanM2 유전자가 도입되어 있는 재조합 마이크로모노스포라 속 미생물 (MO2); 및 iii) forE 유전자가 결실되고, genM2 유전자가 도입되어 있는 재조합 마이크로모노스포라 속 미생물 (MO3)로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 상기 화합물 생산능을 가지는 재조합 마이크로모노스포라 속 미생물을 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 재조합 대장균의 세포외 추출물 및 핵산당 UDP-포도당의 효소반응을 통하여 스킬로이노사민을 포함하는 아미노사이클리톨 화합물을 생성하는 단계; 및 (b) 상기 생성된 스킬로이노사민을 포함하는 아미노사이클리톨 화합물을 회수하는 단계를 포함하는 상기 화합물의 제조방법을 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 재조합 대장균 또는 상기 재조합 마이크로모노스포라 속 미생물을 배양하여 스킬로이노사민을 포함하는 아미노사이클리톨 화합물을 생성하는 단계; 및 (b) 상기 생성된 스킬로이노사민을 포함하는 아미노사이클리톨 화합물을 회수하는 단계를 포함하는 상기 화합물의 제조방법을 제공하는데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 스킬로이노사민을 포함하는 아미노사이클리톨 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 제공한다:

[화학식 I]

본 발명은 또한, 상기 화합물을 유효성분으로 함유하는 무의미 점 돌연변이에 기인한 유전 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 화합물을 유효성분으로 함유하는 약학 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 무의미 점 돌연변이에 기인한 유전 질환의 예방 또는 치료방법을 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 화합물을 무의미 점 돌연변이에 기인한 유전 질환의 예방 또는 치료에 사용하기 위한 용도를 제공한다.

본 발명은 또한, 무의미 점 돌연변이에 기인한 유전 질환의 예방 또는 치료용 약제의 제조를 위한 상기 화합물을 유효성분으로 함유하는 약학 조성물의 용도를 제공한다.

본 발명은 또한, i) fmrO _s, ino1 _s, forA , forG , forS 및 forM 유전자가 도입되어 있는 재조합 대장균 (EC1);

ii) fmrO _s, ino1 _s, forA , forG , forS , forM , forD 및 forK _s 유전자가 도입되어 있는 재조합 대장균 (EC2);

iii) fmrO _s, ino1 _s, forA , forG , forS , forM , forD , neoL 및 neoP 유전자가 도입되어 있는 재조합 대장균 (EC3);

iv) fmrO _s, ino1 _s, forA , forG , forS , forM , forD 및 kanM2 유전자가 도입되어 있는 재조합 대장균 (EC4);

v) fmrO _s, ino1 _s, forA , forG , forS , forM , forD 및 GenM2 유전자가 도입되어 있는 재조합 대장균 (EC5);

vi) fmrO _s, ino1 _s, forA , forG , forS , forM , forD , neoL , neoP 및 forK _s 유전자가 도입되어 있는 재조합 대장균 (EC6);

vii) fmrO _s, ino1 , forA , forG , forS , forM , forD , kanM2 및 forK _s 유전자가 도입되어 있는 재조합 대장균 (EC7); 및

viii) fmrO _s, ino1 _s, forA , forG , forS , forM , forD , genM2 및 forK _s 유전자가 도입되어 있는 재조합 대장균 (EC8)으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 상기 화합물 생산능을 가지는 재조합 대장균을 제공한다.

본 발명은 또한, i) forE 유전자가 결실되고, neoL 및 neoP 유전자가 도입되어 있는 재조합 마이크로모노스포라 속 미생물 (MO1);

ii) forE 유전자가 결실되고, kanM2 유전자가 도입되어 있는 재조합 마이크로모노스포라 속 미생물 (MO2); 및

iii) forE 유전자가 결실되고, genM2 유전자가 도입되어 있는 재조합 마이크로모노스포라 속 미생물 (MO3)로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 상기 화합물 생산능을 가지는 재조합 마이크로모노스포라 속 미생물을 제공한다.

본 발명은 또한, (a) fmrO _s, ino1 _s, forA , forG , forS 및 forM 유전자가 도입되어 있는 재조합 대장균 (EC1)의 세포외 추출물 및 핵산당 UDP-포도당의 효소반응을 통하여 2′-디아미노-포티마이신 FU-10 (2DFU10)을 생성하는 단계; 및

(b) 상기 생성된 2′-디아미노-포티마이신 FU-10 (2DFU10)을 회수하는 단계를 포함하는 2′-디아미노-포티마이신 FU-10 (2DFU10)의 제조방법을 제공한다.

본 발명은 또한, (a) fmrO _s, ino1 _s, forA , forG , forS , forM , forD 및 forK_s 유전자가 도입되어 있는 재조합 대장균 (EC2)의 세포외 추출물 및 핵산당 UDP-포도당의 효소반응을 통하여 2′-디아미노-6′-메틸-포티마이신 FU-10 (2D6MFU10)을 생성하는 단계; 및

(b) 상기 생성된 2′-디아미노-6′-메틸-포티마이신 FU-10 (2D6MFU10)을 회수하는 단계를 포함하는 2′-디아미노-6′-메틸-포티마이신 FU-10 (2D6MFU10)의 제조방법을 제공한다.

본 발명은 또한, (a) fmrO _s, ino1 _s, forA , forG , forS , forM , forD 및 forK_s 유전자가 도입되어 있는 재조합 대장균 (EC2)을 배양하여 6′-메틸-포티마이신 FU-10 (6MFU10)을 생성하는 단계; 및

(b) 상기 생성된 6′-메틸-포티마이신 FU-10 (6MFU10)을 회수하는 단계를 포함하는 6′-메틸-포티마이신 FU-10 (6MFU10)의 제조방법을 제공한다.

본 발명은 또한, (a) i) fmrO _s, ino1 _s, forA , forG , forS , forM , forD , neoL 및 neoP 유전자가 도입되어 있는 재조합 대장균 (EC3); 또는 ii) forE 유전자가 결실되고, neoL 및 neoP 유전자가 도입되어 있는 재조합 마이크로모노스포라 속 미생물 (MO1)을 배양하여 4,5-라이보실 (ribosyl)-포티마이신 FU-10 (RFU10)을 생성하는 단계; 및

(b) 상기 생성된 4,5-라이보실 (ribosyl)-포티마이신 FU-10 (RFU10)을 회수하는 단계를 포함하는 4,5-라이보실 (ribosyl)-포티마이신 FU-10 (RFU10)의 제조방법을 제공한다.

본 발명은 또한, (a) i) fmrO _s, ino1 _s, forA , forG , forS , forM , forD 및 kanM2 유전자가 도입되어 있는 재조합 대장균 (EC4); 또는 ii) forE 유전자가 결실되고, kanM2 유전자가 도입되어 있는 재조합 마이크로모노스포라 속 미생물 (MO2)을 배양하여 4,6-글루코실 (glucosyl)-포티마이신 FU-10 (GFU10)을 생성하는 단계; 및

(b) 상기 생성된 4,6-글루코실 (glucosyl)-포티마이신 FU-10 (GFU10)을 회수하는 단계를 포함하는 4,6-글루코실 (glucosyl)-포티마이신 FU-10 (GFU10)의 제조방법을 제공한다.

본 발명은 또한, (a) i) fmrO _s, ino1 _s, forA , forG , forS , forM , forD 및 GenM2 유전자가 도입되어 있는 재조합 대장균 (EC5); 또는 ii) forE 유전자가 결실되고, genM2 유전자가 도입되어 있는 재조합 마이크로모노스포라 속 미생물 (MO3)을 배양하여 4,6-자일로실 (xylosyl)-포티마이신 FU-10 (XFU10)을 생성하는 단계; 및

(b) 상기 생성된 4,6-자일로실 (xylosyl)-포티마이신 FU-10 (XFU10)을 회수하는 단계를 포함하는 4,6-자일로실 (xylosyl)-포티마이신 FU-10 (XFU10)의 제조방법.

본 발명은 또한, (a) fmrO _s, ino1 _s, forA , forG , forS , forM , forD , neoL , neoP 및 forK _s 유전자가 도입되어 있는 재조합 대장균 (EC6)을 배양하여 4,5-라이보실 (ribosyl)-6′-메틸-포티마이신 FU-10 (R6MFU10)을 생성하는 단계; 및

(b) 상기 생성된 4,5-라이보실 (ribosyl)-6′-메틸-포티마이신 FU-10 (R6MFU10)을 회수하는 단계를 포함하는 4,5-라이보실 (ribosyl)-6′-메틸-포티마이신 FU-10 (R6MFU10)의 제조방법을 제공한다.

본 발명은 또한, (a) fmrO _s, ino1 , forA , forG , forS , forM , forD , kanM2 및 forK _s 유전자가 도입되어 있는 재조합 대장균 (EC7)을 배양하여 4,6-글루코실 (glucosyl)-6′-메틸-포티마이신 FU-10 (G6MFU10)을 생성하는 단계; 및

(b) 상기 생성된 4,6-글루코실 (glucosyl)-6′-메틸-포티마이신 FU-10 (G6MFU10)을 회수하는 단계를 포함하는 4,6-글루코실 (glucosyl)-6′-메틸-포티마이신 FU-10 (G6MFU10)의 제조방법을 제공한다.

본 발명은 또한, (a) fmrO _s, ino1 _s, forA , forG , forS , forM , forD , genM2 및 forK _s 유전자가 도입되어 있는 재조합 대장균 (EC8)을 배양하여 4,6-자일로실 (xylosyl)-6′-메틸-포티마이신 FU-10 (X6MFU10)을 생성하는 단계; 및

(b) 상기 생성된 4,6-자일로실 (xylosyl)-6′-메틸-포티마이신 FU-10 (X6MFU10)을 회수하는 단계를 포함하는 4,6-자일로실 (xylosyl)-6′-메틸-포티마이신 FU-10 (X6MFU10)의 제조방법을 제공한다.

본 발명에 따른 스킬로이노사민을 포함하는 아미노사이클리톨 화합물은 신장 세포주에 대하여 상대적으로 낮은 세포 독성을 나타내며, 기존 아미노글리코사이드에 비해 향상된 무의미 통독 유도 활성을 나타내므로, 낭성 섬유증 등과 같은 무의미 점 돌연변이(nonsense point mutation)에 기인한 인간 유전질환 치료제로 유용하다.

도 1은 반합성법에 따라 최근 새로이 합성된 아미노글리코사이드 선도물질들의 화학적 구조이다.
도 2는 재조합 미생물의 발효를 통한 제조방법 및 재조합 미생물의 체외추출물을 활용한 효소적 제조방법으로 생합성된 스킬로이노사민을 포함하는 아미노사이클리톨 화합물들을 나타낸 도식도이다.
도 3은 스킬로이노사민을 포함하는 아미노사이클리톨 화합물의 신장 관련 세포주 대상 세포독성을 비교한 그래프이다.
도 4는 스킬로이노사민을 포함하는 아미노사이클리톨 화합물의 낭성 섬유증(cystic fibrosis) 환자 유래 일차 세포주에서 무의미 통독 유도 활성을 비교한 그래프이다.

다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.

본 발명에서는 세균성 감염의 치료 또는 예방 효과를 가지는 신규 항세균제로 뿐만 아니라, 기존 아미노글리코사이드(aminoglycoside) 항세균제의 임상 적용 시 주요 문제점인 신장독성(nephrotoxicity) 극복 및 무의미 점 돌연변이(nonsense point mutation)에 의해 필수 단백질로의 번역에 조기 종결(premature termination)이 발생하는 인간 유전질환에 대한 의약적 유용성 확장이 가능한 스킬로이노사민(scyllo-inosamine)을 포함하는 아미노사이클리톨 화합물을 제조하였다. 이들 화합물의 생합성에 관여하는 유전자들을 이종숙주(heterologous host)로서 대장균(Escherichia coli) 또는 특정 유전자를 결손화 시킨 마이크로모노스포라(Micromonospora) 속 미생물에 추가적으로 도입시킨 재조합 미생물들을 발효과정을 통해 상기 화합물을 제조하거나 또는 상기 유전자들이 단백질로 발현된 세포외 추출물(cell-free extract)을 통한 효소적 방법으로 상기 화합물을 제조하였다.

따라서, 본 발명은 일 관점에서, 하기 화학식 1로 표시되는 스킬로이노사민을 포함하는 아미노사이클리톨 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염에 관한 것이다:

[화학식 I]

상기 식에서,

R₁은 NH₂ 또는 OH이고,

R₂는 H 또는 CH₃이고,

R₃은 H 또는 라이보스(ribose)이고,

R₄는 H 또는 글루코스(glucose) 또는 자일로스(xylose)이다.

본 발명에 있어서, 상기 화학식 1로 표시되는 스킬로이노사민을 포함하는 아미노사이클리톨 화합물은

i) 2′-디아미노-포티마이신 FU-10 (2DFU10);

ii) 2′-디아미노-6′-메틸-포티마이신 FU-10 (2D6MFU10);

iii) 6′-메틸-포티마이신 FU-10 (6MFU10);

iv) 4,5-라이보실 (ribosyl)-포티마이신 FU-10 (RFU10);

v) 4,6-글루코실 (glucosyl)-포티마이신 FU-10 (GFU10);

vi) 4,6-자일로실 (xylosyl)-포티마이신 FU-10 (XFU10);

vii) 4,5-라이보실 (ribosyl)-6′-메틸-포티마이신 FU-10 (R6MFU10);

viii) 4,6-글루코실 (glucosyl)-6′-메틸-포티마이신 FU-10 (G6MFU10); 및

ix) 4,6-자일로실 (xylosyl)-6′-메틸-포티마이신 FU-10 (X6MFU10)로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 따른 화학식 1의 화합물은 약학적으로 허용 가능한 염의 형태로 사용할 수 있으며, 염으로는 약학적으로 허용 가능한 유리산(free acid)에 의해 형성된 산 부가염이 유용하다. 유리산으로는 무기산과 유기산을 사용할 수 있으며, 무기산으로는 염산, 브롬산, 황산, 인산 등을 사용할 수 있고, 유기산으로는 구연산, 아세트산, 젖산, 말레산, 푸마린산, 글루콘산, 메탄설폰산, 글리콘산, 숙신산, 타타르산, 4-톨루엔술폰산, 갈룩투론산, 엠본산, 글루탐산, 아스파르트산 등을 사용할 수 있다. 바람직하게는 황산을 사용할 수 있다.

본 발명에 따른 화학식 1의 화합물은 약학적으로 허용되는 염뿐만 아니라, 통상의 방법에 의해 제조될 수 있는 모든 염, 수화물 및 용매화물을 모두 포함한다.

본 발명에 따른 화학식 1의 화합물은 결정 형태 또는 비결정 형태로 제조될 수 있으며, 화학식 1의 화합물이 결정 형태로 제조될 경우, 임의로 수화되거나 용매화될 수 있다.

최근, 아미노글리코사이드 구조에 반합성법을 적용하여 제조된 신규 아미노글리코사이드 선도물질 3종이 차세대 항생제로 개발되고 있다 (Park, J.W. et al., Curr. Opin . Biotechnol. 48:33-41, 2017). 천연 2-데옥시스트렙타민을 포함하는 아미노글리코사이드인 시소마이신을 기본구조로 하여 1번 탄소 부착 아미노기(amino group)에 AHBA(4-amino-2-hydroxybutyrate)를 부가하는 한편 6‘번 탄소 부착 아미노기에 하이드록시에틸기(hydroxyethyl)을 추가적으로 부가한 신규 아미노글리코사이드로 플라조마이신(plazomicin)이 개발되었다 (도 1). 이 신규 아미노글리코사이드는 다양한 아미노글리코사이드 변형효소들을 가지고 있는 그람음성 내성균들에 대하여 뛰어난 항세균 활성을 보여주고 있으며, 특히 최근의 카바페넴(carbapenem) 내성 장내세균과(Enterobacteriaceae)를 포함하는 다재내성 장내세균과들을 대상으로 유일하게 항세균 활성을 유지하고 있는 아미노글리코사이드로서 2017년 현재 임상 3상 진입 중이다 (Zhanel, G.G. et al., Expert Rev. Anti. Infect. Ther. 10:459-473, 2012).

다음으로, 결핵균(Mycobacterium tuberculosis)에 내재된 약재 방출 펌프(drug efflux pump) 내성 메커니즘을 표적화한 신규 반합성 아미노글리코사이드도 개발되었다. 기존에 스트렙타민 포함 아미노글리코사이드인 스펙티노마이신(spectonomycin)은 임균 감염(gonorrheal infection)에 대응하는 2차 치료제로 이용되어 왔으나, 낮은 항결핵균 활성은 결핵 치료제로서의 임상 이용에 한계가 있었다. 하지만, 스펙티노마이신 구조에 반합성적으로 신규 제조된 일부 스펙티나미드(spectinamide) 유도체들은 선택적인 라이보솜 저해 활성 및 눈에 띄게 향상된 항결핵균 활성을 제시하였다 (Lee, R.E. et al., Nat. Med . 20:152-158, 2014). 즉, 결핵균 내재 방출 펌프인 Rv1258C을 대상으로 인비보 및 인비트로 저해 활성을 보여줄 뿐만 아니라, 유도체들 중 스펙티나미드 1599 (도 1) 선도물질은 인비보 활성과 인비보 안정성을 도출하여 항결핵 활성 아미노글리코사이드 치료제의 개발 가능성을 보여주었다 (Viveiros, M. et al., Trends Microbiol . 22:170-171, 2014).

마지막으로, 네오마이신의 구조 유사체 중 하나인 파로모마이신(paromomycin)은 리슈마니아(Leishmania) 속 편모충의 라이보솜을 표적으로 하여, 치사 감염증 중 하나로 알려진 내장리슈만편모충증(visceral leishmaniasis)에 효과적인 것으로 알려져 왔으나 여전히 그 정확한 활성 메커니즘은 밝혀지지 않고 있었다. 하지만, 2015년 파로모마이신과 라이보솜 부착 A-부위의 결합에 대한 삼차원 구조가 보고되었고(halev, M. et al., Nucleic Acids Res. 43:8601-8613, 2015), 이를 토대로 하여 파로모마이신 반합성 유도체들의 구조에 따른 라이보솜 결합 정도 및 리슈만편모충의 성장을 비교할 수가 있었다. 결과적으로 유사삼당(pseudo-trisaccharide) 구조로서 6‘번 탄소에 메틸기(methyl)가 부가되고 5“번 탄소에 아미노기가 추가적으로 부가된 파로모마이신 유도체(도 1)가 낮은 독성뿐만 아니라 향상된 활성으로 내장리슈만편모충증 처치에 효과적임을 확인할 수 있었다.

아미노글리코사이드는 모두 원핵세포의 라이보솜에 선택적으로 작용하는 항세균제로서, 구체적으로, 16S 라이보솜 RNA의 디코딩(decoding) A-부위에 결합하여 단백질 번역을 억제하고, 번역 충실도(translational fidelity)를 방해한다 (Davis, B.D. et al., Microbiol . Rev. 51(3):341-50, 1987; Jana, S. et al., Appl . Microbiol . Biotechnol. 70(2):140-50, 2006; Fujisawa, K. et al., J. Antibiot . (Tokyo), 27(9):677-81, 1974, Magnet, S. et al., Chem . Rev. 105(2):477-98, 2005; Ogle, J.M. et al., Science 292(5518):897-902, 2001; Vicens, Q. et al., Biopolymers 70(1):42-57, 2003). 한편, 단백질 생합성의 종료는 mRNA 내 종료코돈의 존재로부터 시작되며, 방출인자 (release factor) 단백질이 이 과정에 관여하는 것으로 알려져 있다. 번역 종료의 효율은 일반적으로 매우 높으며, 종료 코돈에 대응하는 아미노산이 잘못 삽입될 가능성은 10,000의 1 정도의 낮은 빈도로 나타난다. 진핵세포 내 아미노글리코사이드에 의한 단백질 생합성 종료의 억제 활성 향상은 단백질 생합성 중 번역 충실도를 방해하는 아미노글리코사이드의 활성과 동일한 기전으로 발생하는 것으로 추정되고 있다. 즉, 아미노글리코사이드의 라이보솜 내 A 부위로의 결합은 그 결합의 구조적 변화를 유도하여, 방출인자의 삽입 대신에 mRNA-tRNA 복합체를 안정화시키는 것으로 예측되고 있다 (Howard, M.T. et al., Ann. Neurol. 48(2):164-9, 2000).

아미노글리코사이드가 포유동물 세포 내 무의미 돌연변이에 기인한 번역 조기 종결을 억제한다는 사실은 1985년 처음으로 보고되었으며, 유전 질환 치료제로의 이용 잠재성 역시 처음으로 언급된 바 있다(Atkinson, J. et al., Nucleic Acids Res. 22(8):1327-34, 1994). 처음으로 수행된 유전병은 낭성 섬유증으로, 낭성 섬유증은 CFTR(cystic fibrosis transmembrane conductance regulator, CFTR) 유전자의 점 돌연변이로부터 발생한다. 이 질환은 코카시인 인종에 가장 빈번히 발생하는 퇴행성 유전 질환으로 신생아의 2,500분의 1의 빈도로 발생하고 있다. 현재까지 CFTR 유전자 내 1000종 이상의 다양한 돌연변이가 확인되고 있다 (Kaufman, R.J. et al., J. Clin. Invest. 104(4):367-8, 1999).

아미노글리코사이드에 의한 CFTR 무의미 돌연변이 억제에 대한 첫 연구에서 겐타마이신과 그 생합성 중간체로 알려진 게네티신(geneticin 또는 G-418)이 활성을 나타내었으며, 기관지 상피 세포주를 이용한 실험에서 완전길이 기능의 CFTR이 복귀됨을 확인하였다 (Bedwell, D.M. et al., Nat. Med . 3(11):1280-4, 1997; Howard, M. et al., Nat. Med . 2(4):467-9, 1996). 인간 유래 CFTR-G542X 유전자가 이입된 CFTR (-) 유전자 이입 생쥐로부터 적출한 장 조직 내 연구를 통하여, 겐타마이신 처치 실험 동물의 경우 인간유래 CFTR이 발현됨을 확인하였다 (Du, M. et al., J. Mol . Med. 80(9):595-604, 2002). 무엇보다도, 위약과의 비교를 통한 이중 암맹 임상 시험 결과 겐타마이신은 질환자 내 무의미 돌연변이를 억제하는 것으로 나타났으며, 또한, 겐타마이신 처치를 통하여 CFTR 종료 돌연변이를 앓고 있는 19명의 환자 그룹에서 코 점막을 통한 막횡단 전도효율이 향상되는 것이 확인되었다 (Wilschanski, M. et al., N. Engl . J. Med . 349(15):1433-41, 2003). 이 밖에 6종의 유전 질환 세포주 및 실험 동물 모델이 실시되어 아미노글리코사이드의 유전 질환 치료제로서의 잠재성이 보고된 바 있다 (Barton-Davis, E.R. et al., J. Clin . Invest. 104(4):375-81, 1999; Keeling, K.M. et al., Hum. Mol . Genet. 10(3):291-9, 2001; Sangkuhl, K. et al., Hum. Mol . Genet. 13(9):893-903, 2004; Helip-Wooley, A. et al., Mol . Genet. Metab . 75(2):128-33, 2002; Grayson, C. et al., J. Med . Genet. 39(1):62-7, 2002; Xi, B. et al., J. Am. Chem . Soc. 126(18):5660-1, 2004).

하지만, 아미노글리코사이드의 유전질환 치료제로의 응용에 있어서, 주된 한계점 중 하나는 포유류 세포에 대한 높은 독성, 특히 신장 독성(nephrotoxicity) 및 내이독성(ototoxicity)이다. 이 같은 독성의 원인은 인지질(phospholipids)과의 상호작용, 포스포라이파아제(phospholipase)의 저해, 자유 라디칼류(free radicals)의 형성과 같은 여러 요인들의 복합적 원인에 기인한 것으로 추측되고 있다 (Forge, A. et al., Neurootol . 5(1):3-22, 2000; Nagai, J. et al., Drug Metab. Pharmacokinet. 19(3):159-70, 2004). 세균과 같은 원핵세포의 라이보솜에 대한 충분한 선택성에도 불구하고, 대부분의 아미노글리코사이드는 여전히 진핵세포의 라이보솜 내 A 부위에 결합한다. 포유동물 세포 내 번역 억제 효과 또한 아미노글리코사이드의 높은 독성의 주요 원인 중 하나이다. 이러한 독성과 연관된 또 다른 가능성은 미토콘드리아 내 12S rRNA A-부위와의 결합인 것으로 알려져 있다 (Vicens, Q. et al., Chembiochem 4(10):1018-23, 2003).

효과적인 무의미 통독 유도제에 요구되는 특성은 경구 투여 및 그에 따른 장내 세균에 대한 영향을 최소화하는 부분이다. 즉, 무의미 통독 유도 의약품의 항세균 활성, 특히, 장내 상재 세균총인 가스트로인테스티널 비오타(gastrointestinal biota)에 대하여 어떠한 영향을 미치는 것은 바람직하지 않다. 그런 관점에서, 상술한 아미노글리코사이드의 문제점 외에, 대다수의 임상 사용 중인 상용 아미노글리코사이드는 무의미 통독 유도 활성이 있음에도 임상 적용시 다른 문제점이 있다.

따라서, 본 발명은 다른 관점에서, 상기 화합물을 유효성분으로 함유하는 무의미 점 돌연변이에 기인한 유전 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.

본 발명에 있어서, 상기 유전 질환은 낭성 섬유증 (cystic fibrosis), 듀시엔형 근이영양증 (duchenne muscular dystrophy, DMD), 모세혈관 확장성 운동 실조증후군 (ataxia telangiectasia), 헐러 증후군 (hurler syndrome), A형 혈우병 (hemophilia A), B형 혈우병 (hemophilia B), 및 테이-삭스 병 (tay-sachs)으로 구성된 군에서 선택되는 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에서 사용되는 용어 "예방"은, 상기 화학식 1로 표시되는 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 약학적 조성물의 투여로 무의미 돌연변이에 기인한 유전 질환을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 의미한다. 또한, 본 발명에서 사용되는 용어 "치료"는, 상기 화학식 1로 표시되는 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 약학적 조성물의 투여로 무의미 돌연변이에 기인한 유전 질환의 증세가 호전되거나 완치되는 모든 행위를 의미한다.

본 발명의 화학식 1의 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염은 사람과 원숭이를 포함하는 포유동물 신장 관련 세포주에 대하여 상대적으로 낮은 세포 독성을 나타내며 (실험예 1), 상대적으로 유효한 무의미 통독 유도 활성을 나타내어 (실험예 2), 낭성 섬유증, 듀시엔형 근이영양증, 모세혈관 확장성 운동 실조증후군, 헐러 증후군, A형 혈우병, B형 혈우병, 및 테이-삭스 병 등의 무의미 돌연변이에 기인한 유전 질환의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

또한, 본 발명은 화학식 1로 표시되는 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는, 무의미 돌연변이형 낭성 섬유증 막횡단 전도 조절에 대하여 무의미 통독 유도 활성을 갖는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 표준 약학적 실시에 따라 경구 또는 비경구 투여 형태로 제형화할 수 있다. 이들 제형은 유효성분 이외에 약학적으로 허용 가능한 담체, 보조제 또는 희석액 등의 첨가물을 함유할 수 있다.

본 발명의 조성물을 의약품으로 사용하는 경우, 화학식 1로 표시되는 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 적어도 하나 이상 유효성분으로 함유하는 약학적 조성물은 임상 투여 시에 하기의 다양한 경구 또는 비경구 투여 형태로 제제화 시켜 투여될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

경구 투여용 제형으로는 예를 들면 정제, 환제, 경질 캄셀제, 연질 캅셀제, 액제, 현탁제, 유화제, 시럽제, 과립제, 엘릭시르제 등의 제형일 수 있는데, 이들 제형은 유효성분 외에 희석제(예: 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 만니톨, 솔비톨, 셀룰로즈 및/또는 글리신), 활택제(예: 실리카, 탈크, 스테아르산의 마그네슘염, 스테아르산의 칼슘염 및/또는 폴리에틸렌 글리콜)를 함유할 수 있다. 정제는 또한, 마그네슘 알루미늄 실리케이트, 전분 페이스트, 젤라틴, 메틸셀룰로즈, 나트륨 카복시메틸셀룰로즈 및/또는 폴리비닐피롤리딘과 같은 결합제를 함유할 수 있으며, 경우에 따라 전분, 한천, 알긴산 또는 그의 나트륨염과 같은 붕해제 또는 비등 혼합물 및/또는 흡수제, 착색제, 향미제, 및 감미제를 함유할 수 있다.

비경구 투여용 제형으로는 피하 주사, 정맥 주사, 근육 내 주사 또는 흉부 내 주사를 주입하는 방법에 의할 수 있다. 이때, 비경구 투여용 제형으로 제제화하기 위하여, 화학식 1로 표시되는 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 적어도 하나 이상 포함하고, 안정제 또는 완충제와 함께 물에 혼합하여 용액 또는 현탁액으로 제조하며, 이를 앰플 또는 바이알 단위 투여형으로 제조할 수 있다. 상기 조성물은 멸균되고/되거나 방부제, 안정화제, 수화제 또는 유화 촉진제, 삼투압 조절을 위한 염 및/또는 완충제 등의 보조제, 기타 치료적으로 유용한 물질을 함유할 수 있으며, 통상적인 방법인 혼합, 과립화 또는 코팅 방법에 따라 제제화할 수 있다.

또한, 본 발명의 화합물의 인체에 대한 투여량은 환자의 나이, 몸무게, 성별, 투여 형태, 건강 상태 및 질환 정도에 따라 달라질 수 있으며, 몸무게가 70 ㎏인 성인 환자를 기준으로 할 때, 일반적으로 0.001 ~ 1,000 ㎎/일이고, 바람직하게는 0.01 ~ 500 ㎎/일이며, 의사 또는 약사의 판단에 따라 일정시간 간격으로 1일 1회 내지 수회로 분할 투여할 수도 있다.

본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 화합물을 유효성분으로 함유하는 약학 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 무의미 점 돌연변이에 기인한 유전 질환의 예방 또는 치료방법에 관한 것이다.

본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 화합물을 무의미 점 돌연변이에 기인한 유전 질환의 예방 또는 치료에 사용하기 위한 용도에 관한 것이다.

본 발명은 또 다른 관점에서, 무의미 점 돌연변이에 기인한 유전 질환의 예방 또는 치료용 약제의 제조를 위한 상기 화합물을 유효성분으로 함유하는 약학 조성물의 용도에 관한 것이다.

본 발명은 또 다른 관점에서, i) fmrO_s, ino1_s, forA, forG, forS 및 forM 유전자가 도입되어 있는 재조합 대장균 (EC1);

ii) fmrO_s, ino1_s, forA, forG, forS, forM, forD 및 forK_s 유전자가 도입되어 있는 재조합 대장균 (EC2);

iii) fmrO_s, ino1_s, forA, forG, forS, forM, forD, neoL 및 neoP 유전자가 도입되어 있는 재조합 대장균 (EC3);

viii) fmrO _s, ino1 _s, forA , forG , forS , forM , forD , genM2 및 forK _s 유전자가 도입되어 있는 재조합 대장균 (EC8)으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 화학식 1로 표시되는 스킬로이노사민을 포함하는 아미노사이클리톨 화합물 생산능을 가지는 재조합 대장균에 관한 것이다.

본 발명에 있어서, 상기 fmrO_s는 16s rRNA methyltransferase를 코딩하는 것으로 예측되는 유전자, ino1_s는 myo-inositol-3-phosphate synthase를 코딩하는 것으로 예측되는 유전자, forA는 myo-inositol-3-phosphate phosphatase를 코딩하는 것으로 예측되는 유전자, forG는 myo-inositol 3-dehydrogenase를 코딩하는 것으로 예측되는 유전자, forS는 ketocyclitol aminotransferase를 코딩하는 것으로 예측되는 유전자, forM은 (N-acetyl-)hexosaminyltransferase를 코딩하는 것으로 예측되는 유전자, forD는 N-acetyl-hexosaminyl deacetylase를 코딩하는 것으로 예측되는 유전자, forK_s은 fortimicin KL1 C-methyltrnasferase를 코딩하는 것으로 예측되는 유전자, neoL은 neomycin ribosyltransferase를 코딩하는 유전자, neoP는 neomycin phosphatase를 코딩하는 유전자, kanM2는 paromamine 6-glucosyltransferase를 코딩하는 유전자 및 GenM2는 gentamicin glycosyltransferase II를 코딩하는 유전자인 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 상기 16s rRNA methyltransferase는 GenBank 등록번호 BAA02451, myo-inositol-3-phosphate synthase는 GenBank 등록번호 BAC72008, myo-inositol-3-phosphate phosphatase는 GenBank 등록번호 CAF31552, myo-inositol 3-dehydrogenase는 GenBank 등록번호 CAF31550, ketocyclitol aminotransferase는 GenBank 등록번호 CAF31540 및 (N-acetyl-)hexosaminyltransferase는 GenBank 등록번호 CAF31539, N-acetyl-hexosaminyl deacetylase는 GenBank 등록번호 CAF31544, fortimicin KL1 C-methyltrnasferase는 GenBank 등록번호 CAF31547, neomycin ribosyltransferase는 GenBank 등록번호 CAF33322, neomycin phosphatase는 GenBank 등록번호 CAF33318, paromamine 6-glucosyltransferase는 GenBank 등록번호 CAF31591 및 gentamicin glycosyltransferase II는 GenBank 등록번호 CAF31433인 것이나, 이에 한정되는 것은 아니다.

또한, 상기 fmrO_s, ino1_s 및 forK_s는 대장균 코돈이용도(codon-usage)에 따라 인공 합성된 유전자인 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 fmrO_s은 서열번호 23, ino1_s는 서열번호 25 및 forK_s는 서열번호 24로 표시되는 염기서열을 가지는 것이나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명은 또 다른 관점에서, i) forE 유전자가 결실되고, neoL 및 neoP 유전자가 도입되어 있는 재조합 마이크로모노스포라 속 미생물 (MO1);

iii) forE 유전자가 결실되고, genM2 유전자가 도입되어 있는 재조합 마이크로모노스포라 속 미생물 (MO3)로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 화학식 1로 표시되는 스킬로이노사민을 포함하는 아미노사이클리톨 화합물 생산능을 가지는 재조합 마이크로모노스포라 속 미생물에 관한 것이다.

본 발명에 있어서, 상기 forE는 cyclitol 3-dehydrogenase를 코딩하는 것으로 예측되는 유전자, neoL은 neomycin ribosyltransferase를 코딩하는 유전자, neoP는 neomycin phosphatase를 코딩하는 유전자, kanM2는 paromamine 6-glucosyltransferase를 코딩하는 유전자 및 GenM2는 gentamicin glycosyltransferase II를 코딩하는 유전자인 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 cyclitol 3-dehydrogenase는 GenBank 등록번호 CAF31541, neomycin ribosyltransferase는 GenBank 등록번호 CAF33322, neomycin phosphatase는 GenBank 등록번호 CAF33318, paromamine 6-glucosyltransferase는 GenBank 등록번호 CAF31591 및 gentamicin glycosyltransferase II는 GenBank 등록번호 CAF31433인 것이나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명은 상기와 같은 아미노글리코사이드 생합성 관련 유전자 조합 바이오파트(bio-part)들을 내재하고 있는 바이오디바이스(bio-device) 및 상기 바이오디바이스로 형질전환 된 스킬로이노사민을 포함하는 아미노사이클리톨 생산 재조합 대장균 또는 마이크로모노스포라 속 미생물인 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 forA , forG , forS , forM 및 forD 유전자는 마이크로모노스포라 올리바스테로스포라(Micromonospora olivasterospora) 유전체 내 포티마신 생합성 유전자 집단에서 분리되었고, 각각 GenBank 등록번호 AJ628421 내 오픈 리딩 프레임 MolI14.23, MolI14.21, MolI14.11c, MolI14.10c, MolI14.15c 인 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 fmrO _s 및 forK _s 유전자는 마이크로모노스포라 올리바스테로스포라(Micromonospora olivasterospora) 유전체 내 포티마신 생합성 유전자 집단에서 분리된 fmrO (GenBank 등록번호 BAA02451) 및 forK (GenBank 등록번호 CAF31547) 유전자 산물을 이종숙주인 대장균 내 발현 및 유전자 조작 상 편이성을 위하여 코돈 최적화하여 합성한 인공 유전자인 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 각각 서열번호 23 및 서열번호 24인 것이나, 이에 한정되는 것은 아니다.

또한, 상기 ino1 _s 유전자는 스트렙토마이세스 아버미틸리스(Streptomyces avermitilis) 유전체 내 존재하는 myo-inositol-1-phosphate synthase를 암호화하는 ino1 유전자 산물 (GenBank 등록번호 BAC72008)의 이종숙주인 대장균 내 발현 및 유전자 조작 상 편이성을 위하여 코돈 최적화하여 합성한 인공 유전자인 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 서열번호 25인 것이나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기, 인공 합성 유전자들의 염기서열은 대장균 코돈최적화로 원래 염기서열과는 달라졌으나, 대장균 내 발현되는 단백질 아미노산 서열은 동일하다.

본 발명에 있어서, 상기 neoL 및 neoP 유전자는 스트렙토마이세스 프라디애(Streptomyces fradiae) 유전체 내 네오마이신 생합성 유전자 집단에서 분리되었고, GenBank 등록번호 AJ629247 내 오픈 리딩 프레임 SfrF04.12c와 SfrF04.8 인 것을 특징으로 할 수 있다.

상기 kanM2 유전자는 스트렙토마이세스 카나마이세티쿠스(Streptomyces kanamtceticus) 유전체 내 카나마이신 생합성 유전자 집단에서 분리되었고, GenBank 등록번호 AJ628422 내 오픈 리딩 프레임 SkaJ19.24 인 것을 특징으로 할 수 있다.

또한, 상기 genM2 유전자는 마이크로모노스포라 에키노스포라(Micromonospora echinospora) 유전체 내 겐타마이신 생합성 유전자 집단에서 분리되었고, GenBank 등록번호 AJ628149 내 포함되어 있는 당전이효소(CAF31433) 암호화 유전자인 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 각 재조합 미생물의 발효 및 세포외 추출물의 효소 반응을 통하여 생합성 되는 화합물은 아래와 같다.

EC1 균주: 아미노사이클리톨 화합물 2DFU10

EC2 균주: 아미노사이클리톨 화합물 2D6MFU10 및 6MFU10

EC3 균주: 아미노사이클리톨 화합물 RFU10

EC4 균주: 아미노사이클리톨 화합물 GFU10

EC5 균주: 아미노사이클리톨 화합물 XFU10

EC6 균주: 아미노사이클리톨 화합물 RFU10 및 R6MFU10

EC7 균주: 아미노사이클리톨 화합물 GFU10 및 G6MFU10

EC8 균주: 아미노사이클리톨 화합물 XFU10 및 X6MFU10

MO1 균주: 아미노사이클리톨 화합물 RFU10

MO2 균주: 아미노사이클리톨 화합물 GFU10

MO3 균주: 아미노사이클리톨 화합물 XFU10

본 발명은 1) 상기 재조합 대장균 또는 재조합 마이크로모노스포라 속 미생물의 발효과정을 거쳐 스킬로이노사민을 포함하는 아미노사이클리톨 화합물을 얻는 단계; 또는 2) 아미노글리코사이드 생합성 유전자 조합들을 발현한 상기 재조합 대장균으로부터 얻어지는 세포외 추출물의 단계적 효소 반응을 통하여 상기 아미노사이클리톨 화합물을 얻는 단계를 포함하는 상기 화합물의 제조방법에 관한 것이다.

따라서, 본 발명은 또 다른 관점에서, (a) fmrO _s, ino1 _s, forA , forG , forS 및 forM 유전자가 도입되어 있는 재조합 대장균 (EC1)의 세포외 추출물 및 핵산당 UDP-포도당의 효소반응을 통하여 2′-디아미노-포티마이신 FU-10 (2DFU10)을 생성하는 단계; 및

(b) 상기 생성된 2′-디아미노-포티마이신 FU-10 (2DFU10)을 회수하는 단계를 포함하는 2′-디아미노-포티마이신 FU-10 (2DFU10)의 제조방법에 관한 것이다.

본 발명에서, 상기 재조합 대장균 (EC1)는 fmrO _s, ino1 _s, forA , forG , forS의 발현에 의해 스킬로이노사민을 생성하며, forM 또한 EC1 내에서 발현되므로, EC1의 세포외 추출물에는 스킬로이노사민 및 ForM이 포함되어 있다. 따라서, 여기에 핵산당 UDP-포도당을 첨가하면, 2′-디아미노-포티마이신 FU-10 (2DFU10)의 제조가 가능하다 (도 2).

본 발명은 또 다른 관점에서, (a) fmrO _s, ino1 _s, forA , forG , forS , forM , forD 및 forK _s 유전자가 도입되어 있는 재조합 대장균 (EC2)의 세포외 추출물 및 핵산당 UDP-포도당의 효소반응을 통하여 2′-디아미노-6′-메틸-포티마이신 FU-10 (2D6MFU10)을 생성하는 단계; 및

(b) 상기 생성된 2′-디아미노-6′-메틸-포티마이신 FU-10 (2D6MFU10)을 회수하는 단계를 포함하는 2′-디아미노-6′-메틸-포티마이신 FU-10 (2D6MFU10)의 제조방법에 관한 것이다.

본 발명에서, 상기 재조합 대장균 (EC2)는 fmrO _s, ino1 _s, forA , forG , forS의 발현에 의해 스킬로이노사민을 생성하며, forM 및 forK _s 또한 EC2 내에서 발현되므로, EC2의 세포외 추출물에는 스킬로이노사민 및 ForM과 ForK가 포함되어 있다. 따라서, 여기에 핵산당 UDP-포도당을 첨가하면, 2′-디아미노-6′-메틸-포티마이신 FU-10 (2D6MFU10)의 제조가 가능하다 (도 2).

본 발명은 또 다른 관점에서, (a) fmrO _s, ino1 _s, forA , forG , forS , forM , forD 및 forK _s 유전자가 도입되어 있는 재조합 대장균 (EC2)을 배양하여 6′-메틸-포티마이신 FU-10 (6MFU10)을 생성하는 단계; 및

(b) 상기 생성된 6′-메틸-포티마이신 FU-10 (6MFU10)을 회수하는 단계를 포함하는 6′-메틸-포티마이신 FU-10 (6MFU10)의 제조방법에 관한 것이다.

본 발명에서, 상기 재조합 대장균 (EC2)는 fmrO _s, ino1 _s, forA , forG , forS의 발현에 의해 스킬로이노사민을 생성하며, forM , forK _s 및 forD 또한 EC2 내에서 발현되므로, EC2 내에는 스킬로이노사민 및 ForM, ForK, ForD가 포함되어 있다. 따라서, 재조합 대장균 EC2의 인비보 발효를 통해 6′-메틸-포티마이신 FU-10 (6MFU10)의 제조가 가능하다 (도 2).

본 발명은 또 다른 관점에서, (a) i) fmrO _s, ino1 _s, forA , forG , forS , forM, forD , neoL 및 neoP 유전자가 도입되어 있는 재조합 대장균 (EC3); 또는 ii) forE 유전자가 결실되고, neoL 및 neoP 유전자가 도입되어 있는 재조합 마이크로모노스포라 속 미생물 (MO1)을 배양하여 4,5-라이보실 (ribosyl)-포티마이신 FU-10 (RFU10)을 생성하는 단계; 및

(b) 상기 생성된 4,5-라이보실 (ribosyl)-포티마이신 FU-10 (RFU10)을 회수하는 단계를 포함하는 4,5-라이보실 (ribosyl)-포티마이신 FU-10 (RFU10)의 제조방법에 관한 것이다.

본 발명에서, 상기 재조합 대장균 (EC3)는 fmrO _s, ino1 _s, forA , forG , forS의 발현에 의해 스킬로이노사민을 생성하며, forM , forD , neoL 및 neoP 또한 EC3 내에서 발현되므로, EC3 내에는 스킬로이노사민 및 ForM, ForD, NeoL, NeoP가 포함되어 있다. 따라서, 재조합 대장균 EC3의 인비보 발효를 통해 4,5-라이보실 (ribosyl)-포티마이신 FU-10 (RFU10)의 제조가 가능하다 (도 2).

또한, 본 발명에서, 상기 재조합 마이크로모노스포라 속 미생물 (MO1)은 forE가 결실되어 포티마이신 FU-10을 생성하며, 네오마이신 생합성 과정 중 ribose의 당전이화에 관여하는 neoL과 neoP가 MO1 내에서 발현되므로, MO1 내에는 포티마이신 FU-10 및 4,5-라이보실 (ribosyl)-포티마이신 FU-10 (RFU10)의 제조가 가능하다 (도 2).

본 발명은 또 다른 관점에서, (a) i) fmrO _s, ino1 _s, forA , forG , forS , forM, forD 및 kanM2 유전자가 도입되어 있는 재조합 대장균 (EC4); 또는 ii) forE 유전자가 결실되고, kanM2 유전자가 도입되어 있는 재조합 마이크로모노스포라 속 미생물 (MO2)을 배양하여 4,6-글루코실 (glucosyl)-포티마이신 FU-10 (GFU10)을 생성하는 단계; 및

(b) 상기 생성된 4,6-글루코실 (glucosyl)-포티마이신 FU-10 (GFU10)을 회수하는 단계를 포함하는 4,6-글루코실 (glucosyl)-포티마이신 FU-10 (GFU10)의 제조방법에 관한 것이다.

본 발명에서, 상기 재조합 대장균 (EC4)는 fmrO _s, ino1 _s, forA , forG , forS의 발현에 의해 스킬로이노사민을 생성하며, forM , forD 및 kanM2 또한 EC4 내에서 발현되므로, EC4 내에는 스킬로이노사민 및 ForM, ForD, KanM2가 포함되어 있다. 따라서, 재조합 대장균 EC4의 인비보 발효를 통해 4,6-글루코실 (glucosyl)-포티마이신 FU-10 (GFU10)의 제조가 가능하다 (도 2).

또한, 본 발명에서, 상기 재조합 마이크로모노스포라 속 미생물 (MO2)은 forE가 결실되어 포티마이신 FU-10을 생성하며, kanM2가 MO2 내에서 발현되므로, MO2 내에는 포티마이신 FU-10 및 KanM2가 포함되어 있다. 따라서, 재조합 마이크로모노스포라 속 미생물 MO2의 인비보 발효를 통해 4,6-글루코실 (glucosyl)-포티마이신 FU-10 (GFU10)의 제조가 가능하다 (도 2).

본 발명은 또 다른 관점에서, (a) i) fmrO _s, ino1 _s, forA , forG , forS , forM, forD 및 GenM2 유전자가 도입되어 있는 재조합 대장균 (EC5); 또는 ii) forE 유전자가 결실되고, genM2 유전자가 도입되어 있는 재조합 마이크로모노스포라 속 미생물 (MO3)을 배양하여 4,6-자일로실 (xylosyl)-포티마이신 FU-10 (XFU10)을 생성하는 단계; 및

(b) 상기 생성된 4,6-자일로실 (xylosyl)-포티마이신 FU-10 (XFU10)을 회수하는 단계를 포함하는 4,6-자일로실 (xylosyl)-포티마이신 FU-10 (XFU10)의 제조방법에 관한 것이다.

본 발명에서, 상기 재조합 대장균 (EC5)는 fmrO _s, ino1 _s, forA , forG , forS의 발현에 의해 스킬로이노사민을 생성하며, forM , forD 및 genM2 또한 EC5 내에서 발현되므로, EC5 내에는 스킬로이노사민 및 ForM, ForD, GenM2가 포함되어 있다. 따라서, 재조합 대장균 EC5의 인비보 발효를 통해 4,6-자일로실 (xylosyl)-포티마이신 FU-10 (XFU10)의 제조가 가능하다 (도 2).

또한, 본 발명에서, 상기 재조합 마이크로모노스포라 속 미생물 (MO3)은 forE가 결실되어 포티마이신 FU-10을 생성하며, genM2가 MO3 내에서 발현되므로, MO3 내에는 포티마이신 FU-10 및 GenM2가 포함되어 있다. 따라서, 재조합 마이크로모노스포라 속 미생물 MO3의 인비보 발효를 통해 4,6-자일로실 (xylosyl)-포티마이신 FU-10 (XFU10)의 제조가 가능하다 (도 2).

본 발명은 또 다른 관점에서, (a) fmrO _s, ino1 _s, forA , forG , forS , forM , forD, neoL , neoP 및 forK _s 유전자가 도입되어 있는 재조합 대장균 (EC6)을 배양하여 4,5-라이보실 (ribosyl)-6′-메틸-포티마이신 FU-10 (R6MFU10)을 생성하는 단계; 및

(b) 상기 생성된 4,5-라이보실 (ribosyl)-6′-메틸-포티마이신 FU-10 (R6MFU10)을 회수하는 단계를 포함하는 4,5-라이보실 (ribosyl)-6′-메틸-포티마이신 FU-10 (R6MFU10)의 제조방법에 관한 것이다.

본 발명에서, 상기 재조합 대장균 (EC6)는 fmrO _s, ino1 _s, forA , forG , forS의 발현에 의해 스킬로이노사민을 생성하며, forM , forD , neoL , neoP 및 forK_s 또한 EC6 내에서 발현되므로, EC6 내에는 스킬로이노사민 및 ForM, ForD, NeoL, NeoP 및 ForK가 포함되어 있다. 따라서, 재조합 대장균 EC6의 인비보 발효를 통해 4,5-라이보실 (ribosyl)-6′-메틸-포티마이신 FU-10 (R6MFU10)의 제조가 가능하다 (도 2).

본 발명은 또 다른 관점에서, (a) fmrO _s, ino1 , forA , forG , forS , forM , forD, kanM2 및 forK _s 유전자가 도입되어 있는 재조합 대장균 (EC7)을 배양하여 4,6-글루코실 (glucosyl)-6′-메틸-포티마이신 FU-10 (G6MFU10)을 생성하는 단계; 및

(b) 상기 생성된 4,6-글루코실 (glucosyl)-6′-메틸-포티마이신 FU-10 (G6MFU10)을 회수하는 단계를 포함하는 4,6-글루코실 (glucosyl)-6′-메틸-포티마이신 FU-10 (G6MFU10)의 제조방법에 관한 것이다.

본 발명에서, 상기 재조합 대장균 (EC7)는 fmrO _s, ino1 _s, forA , forG , forS의 발현에 의해 스킬로이노사민을 생성하며, forM , forD , kanM2 및 forK _s 또한 EC7 내에서 발현되므로, EC7 내에는 스킬로이노사민 및 ForM, ForD, KanM2 및 ForK가 포함되어 있다. 따라서, 재조합 대장균 EC7의 인비보 발효를 통해 4,6-글루코실 (glucosyl)-6′-메틸-포티마이신 FU-10 (G6MFU10)의 제조가 가능하다 (도 2).

본 발명은 또 다른 관점에서, (a) fmrO _s, ino1 _s, forA , forG , forS , forM , forD, genM2 및 forK _s 유전자가 도입되어 있는 재조합 대장균 (EC8)을 배양하여 4,6-자일로실 (xylosyl)-6′-메틸-포티마이신 FU-10 (X6MFU10)을 생성하는 단계; 및

(b) 상기 생성된 4,6-자일로실 (xylosyl)-6′-메틸-포티마이신 FU-10 (X6MFU10)을 회수하는 단계를 포함하는 4,6-자일로실 (xylosyl)-6′-메틸-포티마이신 FU-10 (X6MFU10)의 제조방법에 관한 것이다.

본 발명에서, 상기 재조합 대장균 (EC8)는 fmrO _s, ino1 _s, forA , forG , forS의 발현에 의해 스킬로이노사민을 생성하며, forM , forD , genM2 및 forK _s 또한 EC8 내에서 발현되므로, EC8 내에는 스킬로이노사민 및 ForM, ForD, GenM2 및 ForK가 포함되어 있다. 따라서, 재조합 대장균 EC8의 인비보 발효를 통해 4,6-자일로실 (xylosyl)-6′-메틸-포티마이신 FU-10 (X6MFU10)의 제조가 가능하다 (도 2).

본 발명의 일 태양에서, 상기 제조 방법은 아미노사이클리톨 산물을 중압 액체 크로마토그래피(Medium Pressure Liquid Chromatography, MPLC) 방법으로 분리, 정제, 또는 분리 및 정제하는 단계를 추가적으로 포함할 수 있다.

본 발명의 일 태양에서, 상기 제조 아미노사이클리톨 화합물은 중압 액체 크로마토그래피 방법으로 분리, 정제, 또는 분리 및 정제될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 일 태양에서, 바람직하게는, 상기 재조합 미생물은 대장균 또는 마이크로모노스포라 속 미생물이고, 더욱 바람직하게는, 대장균 및 마이크로모노스포라 올리바스테로스포라이다.

본 발명의 일 태양에서, 상기 MPLC 방법에 사용되는 고정상은 실리카일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 일 태양에서, 상기 MPLC 방법에 사용되는 이동상은 클로로포름:메탄올:수산화암모늄 1:1:1(v/v/v) 혼합액일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 일 태양에서, 상기 MPLC 유지 시간(Retention time)은 5 ~ 12 분일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

[실시예]

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

유전자 제조용 프라이머

재조합 미생물 제조에 사용하기 위해 PCR를 이용하여 표 1의 유전자를 증폭하였다. PCR에 사용한 유전자 선택적인 프라이머(primer) 쌍은 각 유전자 단편의 서브클로닝을 용이하게 하기 위하여 양쪽 말단에 XbaI와 HindIII 제한 부위를 포함시켜 제작하였다. 삽입 위치는 표1의 서열에서 밑줄로 표시하였다.

서열번호	유전자/프라이머	서열 (5'-> 3')	제한효소	삽입위치
1	forA -F	GCTCTAGAATGACCACCGAGCAGATCCTGCC	XbaI	5’
2	forA -R	ATAAGCTTTCAGGGGCGCCGGAGCACCGG	HindIII	3’
3	forG -F	GCCTCTAGAATGCGGGTCGGTCTGATTGGTGC	XbaI	5’
4	forG -R	TATAAGCTTTCACGCGGCCGCCGTCCCCAC	HindIII	3’
5	forS -F	ACATCTAGAATGAGCGCACTCGCTCTCGCC	XbaI	5’
6	forS -R	AGTAAGCTTTCAGAGCTCGGCATGGTGCGC	HindIII	3’
7	forM -F	GGCTCTAGAATGCACGTGCTACGGCTGACGCC	XbaI	5’
8	forM -R	TATAAGCTTTCAGCCGGCGCGCACCCCGGC	HindIII	3’
9	forD -F	CAGTCTAGAATGAGCACAGCCCAATCCCTC	XbaI	5’
10	forD -R	CCGAAGCTTTCACCATGGTTGGGACTCCATTC	HindIII	3’
11	neoL -F	TGATCTAGATGAAGCGGAAGTGGTACGTC	XbaI	5’
12	neoL -R	TCCAAGCTTTCCGAGATCGAGGCCCTG	HindIII	3’
13	neoP -F	CGTTCTAGACGTCCTCTTCGAGCTGCTG	XbaI	5’
14	neoP -R	ACCAAGCTTACCGGTGTTGCTGATCTTGA	HindIII	3’
15	PE1	CTAAGCTTGCATGCCGCCGATCGGCTCGTACTGC	HindIII	5’
16	PE2	CGGGATCCCCGCTTCGAGCCCAGCACGGTCATG	BamHI	3’
17	PE3	CGGGATCCCGGGTGAAGCCCAGCTCGTCGCAG	BamHI	5’
18	PE4	CGAATTCGACGTCGATCCTGCCCTCTACGACTCCG	EcoRI	3’
19	kanM2 -F	GGTCTAGAACCGAGCCTGCCAAGGGTG	XbaI	5’
20	kanM2 -R	GGAAGCTTCGAGGAGGACCCTCACAGCCCG	HindIII	3’
21	genM2 -F	CCGTCTAGACCGATCGTGTCGCACATCTA	XbaI	5’
22	genM2 -R	AAGAAGCTTAAGTTGTCGGTGACCAGGTG	HindIII	3’

실시예 1: 2 ′- 디아미노 - 포티마이신 FU-10 ( 2DFU10 )의 제조

1-1: 재조합 대장균 EC1 제작

마이크로모노스포라 올리바스테로스포라 유전체를 템플리트 (template)로 하여 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)을 통하여 증폭된 유전자 4종 forA , forG , forS , forM와 대장균 코돈 최적화로 합성한 인공 유전자 2종 fmrO _s (서열번호 23)와 ino1 _s (서열번호 25)을 포함하는 총 6종의 외래 유전자 바이오파트 조합을 대장균 발현용 바이오디바이스인 플라스미드 pNB181(pET22B(+) 기반 플라스미드; Amp^R 선택 마커; T7 프로모터/lac 오퍼레이터/라이보솜 결합부위(RBS)/T7 전사 종결자(transcription terminator))에 순차적으로 바이오브릭스(BioBricks) 조립법을 활용하여 조립하였다. 특히, PCR에 사용되는 각 유전자 선택적인 프라이머(primer) 쌍은 각 유전자 단편의 서브클로닝을 용이하게 하기 위하여 양쪽 말단에 XbaI와 HindIII 제한 부위를 포함시켰다 (표 1). 보편적으로 사용된 모든 제한 효소는 Takara(Kyoto, 일본)에서 구입하였으며, 인공 유전자의 합성 및 서열 분석 등의 서비스는 모두 코스모젠텍(서울, 대한민국)에 의뢰하였다. 증폭된 PCR 산물들은 pGEM-T easy 벡터(Promega, Madison, WI, 미국)를 통하여 대장균 XL1 블루(XL1 blue, Stratagene)에 서브클로닝 후 그 서열을 확인하였다. 증폭 유전자 단편을 XbaI와 HindIII로 절단하고, 미리 SpeI과 HindIII 로 절단한 상기 pNB181 바이오디바이스에 연결하였다. 조립된 후, 추가적으로 상이한 유전자 바이오파트를 연결하기 위하여, 다시 BglII와 XhoI으로 절단된 바이오디바이스에 BamHI과 XhoI으로 절단된 바이오파트 유전자 단편을 연결하였다. 이 경우, XbaI과 SpeI, 그리고 BglII와 BamHI은 각각 바이오브릭스 자국(scar)으로 그 제한 부위가 사라지게 된다. 상기 총 6종의 유전자를 포함하는 바이오디바이스를 발현용 이종숙주인 대장균 BL21(DE3)(Stratagene, La Jolla, CA, 미국)에 이염화칼슘(CaCl₂)를 이용한 열 펄스 형질전환법(heat pulse transformation)으로 도입시켰고, 형질전환체의 선발을 위하여 암피실린 항생제 100 ppm을 사용하여 최종적으로 재조합 EC1 균주를 제작하였다.

1-2: 재조합 대장균 EC1 세포외 추출물을 통한 효소반응

상기 재조합 EC1 미생물을 LB 배지(Luria Bertani)에 1% 부피비로 접종한 후, 37℃에서 배양하고, 광학농도 0.6 ~ 0.8 사이로 성장이 확인될 때, 단백질 발현을 유도시키고자 최종농도 0.3 mM의 이소프로필-D-티오갈락토피라노시드(isopropyl-D-thiogalactopyranoside, IPTG, Sigma-Aldrich)를 첨가하였다. 이후, 20℃에서 20시간 추가 배양하였다. 배양 후 50 mM 인산나트륨 용균(lysis) 완충용액(300 nM NaCl, 10 mM imidazole, 10% glycerol, 1% Triton X-100)에 균체를 용해시키고, 초음파 분해(sonication)를 실시하였다. 이후, 12000 rpm에서 30분간 냉장 원심 분리하고, 상등액을 모아 세포외 추출물로 이용하였다.

효소 반응을 위하여 냉장 보관 중인 상기 세포외 추출물에 핵산당 UDP-포도당(UDP-glucose, 제노텍, 대전, 대한민국) 5 mM을 첨가하여 37℃에서 3시간 동안 발현 단백질들의 효소 반응을 실시하였다. 반응 후, 동량의 클로로포름을 첨가하여 반응을 정지시킨 후, 상층액의 pH를 염산 용액을 이용하여 2.5까지 낮추고, 상온의 실험실 진탕기에서 한 시간 동안 진탕하였다. 냉장 조건으로 약 20000 rpm에서 10분간 원심 분리하여 균체를 제거한 후, 상등액을 미리 메탄올 3 ml와 10 mM 염산 용액(pH 2.5) 3 ml로 전 처리한 OASIS MCX 고체상 추출 카트리지(Waters, Milford, MA, 미국)에 주입하였다. 그 다음, 카트리지를 10 mM 염산 용액 3 ml로 세척하고 약 30초간 대기압을 낮추어서 완전히 건조시켰다. 카트리지 충전재에 흡착된 아미노사이클리톨 화합물들은 5% 메탄올성 수산화암모늄(NH₄OH) 용액(암노니아수/메탄올 = 95:5, v/v) 0.5 ml로 2번에 걸쳐 용출하였고, 용출액은 상온에서 스피드백(SpeedVac, EYELA, Tokyo, 일본)으로 감압 건조하였다.

1- 3: 2 ′- 디아미노 - 포티마이신 FU-10 ( 2DFU10 )의 분리, 정제 및 구조 확인

상기 고체상 추출법으로 용출된 아미노사이클리톨 화합물의 분리 및 정제에는 콤비플래시 Rf MPLC 시스템(CombiFlash Rf MPLC Cystem, Teledyne ISCO, Lincoln, NE, 미국)을 사용하였다. 즉, 정상(normal-phase) 실리카 카트리지에 클로로포름:메탄올:수산화암모늄 1:1:1(v/v/v) 혼합액을 이동상으로 분당 8 ml의 속도로 흘러가는 MPLC 시스템에, 동일한 이동상 4 ml에 재용해시킨 실시예 1-2의 감압 건조 시료를 주입하고, 크로마토그램 상 검출된 피크를 자동 분취하였다. 개별 분획을 다시 감압하여 농축한 후, 이온트랩 질량 분석기(LCQ ion-trap mass spectrometer, ThermoFinnigan, San Jose, CA, 미국)로 질량 스펙트럼을 분석함으로써 목적하는 2‘-디아미노-포티마이신 FU-10(2DFU10) 화합물의 분획을 정제하였다. 도 2에 2DFU10으로 나타나 있으며, 최종 6.6 mg으로 확보되었다.

NMR 시료들은 200 ㎕의 D₂O에 화합물 2DFU10을 용해시킨 후, 5 ml 시게미 어드밴스드 NMR 마이크로튜브(Shigemi advanced NMR microtube, Sigma-Aldrich)에 상기 용매를 방치시킴으로써 제조하였다. ¹³C NMR 스펙트럼은 배리언(Varian) INOVA 500 분광광도계를 이용하여 298 K에서 획득하였고, 화학적 이동은 내부 준거로서 TMS를 이용하여 ppm으로 기록되었다. 모든 NMR 데이타 산출은 Mnova Suite 5.3.2 소프트웨어를 이용하여 수행하였고, 하기 표 2에 생합성된 2‘-디아미노-포티마이신 FU-10 화합물의 ¹³C-NMR 스펙트럼을 정리하여 기재하였다.

위치	2′- 디아미노 - 포티마이신 FU-10 (2DFU10)	2′- 디아미노 -6′- 메틸 - 포티마이신 FU-10 (2D6MFU10)	6′- 메틸 - 포티마이신 FU-10 (6MFU10)
위치	δ _C	δ _C	δ _C
1	73.9	73.9	73.9
2	72.0	72.0	72.1
3	57.9	57.9	57.9
4	84.0	84.1	84.0
5	72.3	72.3	72.3
6	72.9	73.0	73.0
1’	110.3	110.3	108.2
2’	74.1	74.1	55.6
3’	76.9	71.8	74.5
4’	71.6	69.1	70.2
5’	81.7	91.3	90.9
6’	62.3	66.7	66.7
6’메틸	-	19.6	19.5

실시예 2: 2 ′- 디아미노 -6′- 메틸 - 포티마이신 FU-10 ( 2D6MFU10 )의 제조

2-1: 재조합 대장균 EC2 제작

마이크로모노스포라 올리바스테로스포라 유전체를 템플리트로 하여 PCR을 통하여 증폭된 유전자 5종 forA , forG , forS , forM, forD와 대장균 코돈 최적화로 합성한 인공 유전자 3종 fmrO _s (서열번호 23), ino1_s (서열번호 25) 및 forK _s (서열번호 24)를 실시예 1-1에 기재된 것과 동일하게 바이오브릭스(BioBricks) 조립법을 활용하여 조립하였다 (표 1). 상기 총 8종의 유전자를 포함하는 바이오디바이스를 발현용 이종숙주인 대장균 BL21(DE3)(Stratagene)에 도입시켜서, 최종적으로 재조합 EC2 균주를 제작하였다.

2-2: 재조합 대장균 EC2 세포외 추출물을 통한 효소반응

상기 재조합 EC2 미생물을 대상으로 실시예 1-2와 동일하게 실험하였다.

2- 3: 2 ′- 디아미노 -6′- 메틸 - 포티마이신 FU-10 ( 2D6MFU10 )의 분리, 정제 및 구조 확인

실시예 1-3에 기재된 것과 동일하게 실험하여 목적하는 2‘-디아미노-6’-메틸-포티마이신 FU-10(2D6MFU10) 화합물의 분획을 정제하였다. 도 2에 2D6MFU10으로 나타나 있으며, 최종 5.8 mg으로 최종 확보되었다.

상기 표 2에 생합성된 2‘-디아미노-6’-메틸-포티마이신 FU-10 화합물의 ¹³C-NMR 스펙트럼을 정리하여 기재하였다.

실시예 3: 6 ′- 메틸 - 포티마이신 FU-10 ( 6MFU10 )의 제조

3-1: 재조합 대장균 EC2 제작

실시예 2-1에 기재된 것과 동일하게 실험하여 재조합 EC2 균주를 제작하였다.

3-2: 재조합 대장균 EC2 인비보 발효를 통한 아미노사이클리톨 생합성

상기 재조합 EC2 미생물을 LB 배지에 1% 부피비로 접종한 후, 37℃에서 배양하였고, 광학농도 0.6 ~ 0.8 사이로 성장이 확인될 때, 단백질 발현을 유도시키고자 최종농도 0.3 mM의 IPTG를 첨가하였다. 이후, 20℃에서 30시간 추가 배양하였다. 배양액의 pH를 염산 용액을 이용하여 2.5까지 낮추고, 상온의 실험실 진탕기에서 한 시간 동안 진탕하였다. 냉장 조건으로 약 20000 rpm에서 10분간 원심 분리하여 균체를 제거한 후, 상등액을 미리 메탄올 3 ml와 10 mM 염산 용액(pH 2.5) 3 ml로 전 처리한 OASIS MCX 고체상추출 카트리지(Waters)에 주입하였다. 이후, 카트리지를 10 mM 염산 용액 3 ml로 세척하고 약 30초간 대기압을 낮추어서 완전히 건조시켰다. 카트리지 충전재에 흡착된 아미노사이클리톨 화합물들은 5% 메탄올성 수산화암모늄(NH₄OH) 용액 0.5 ml로 2번에 걸쳐 용출하였고, 용출액은 상온에서 스피드백(EYELA)으로 감압 건조하였다.

3- 3: 6 ′- 메틸 - 포티마이신 FU-10 ( 6MFU10 )의 분리, 정제 및 구조 확인

실시예 1-3에 기재된 것과 동일하게 실험하여 목적하는 6’-메틸-포티마이신 FU-10(6MFU10) 화합물의 분획을 정제하였다. 도 2에 6MFU10으로 나타나 있으며, 최종 6.1 mg으로 최종 확보되었다.

상기 표 2에 생합성된 6’-메틸-포티마이신 FU-10 화합물의 ¹³C-NMR 스펙트럼을 정리하여 기재하였다.

실시예 4: 4 ,5- 라이보실 ( ribosyl )- 포티마이신 FU-10 ( RFU10 )의 제조

4-1: 재조합 대장균 EC3 제작

마이크로모노스포라 올리바스테로스포라 유전체를 템플리트로 하여 PCR을 통하여 증폭된 유전자 5종 forA , forG , forS , forM, forD와 4,5계열 아미노글리코사이드인 네오마신 생산 야생균주인 스트렙토마이세스 프라디애 유전체에서 PCR로 증폭시킨 당전이 관련 효소들 암호화 2종 유전자들 neoL 및 neoP, 그리고 대장균 코돈을 기반으로 최적화하여 합성한 인공 유전자 2종 fmrO _s 및 ino1 _s를 실시예 1-1에 기재된 것과 동일하게 바이오브릭스(BioBricks) 조립법을 활용하여 조립하였다 (표 1). 상기 총 9종의 유전자를 포함하는 바이오디바이스를 발현용 이종숙주인 대장균 BL21(DE3)(Stratagene)에 도입시켜서, 최종적으로 재조합 EC3 균주를 제작하였다.

4-2: 재조합 대장균 EC3 인비보 발효를 통한 아미노사이클리톨 생합성

실시예 3-2에 기재된 것과 동일하게 실험하여 재조합 EC3 균주의 인비보 발효를 통하여 생합성된 아미노사이클리톨을 추출하였다.

4-3: 재조합 마이크로모노스포라 올리바스테로스포라 MO1 제작

포타마이신 생산 야생 균주인 마이크로모노스포라 올리바스테로스포라 유전체 내 포티마이신 생합성 관련 유전자 중 하나인 forE를 pKC1139(Stratagene, 스트렙토마이세스-대장균 이중기능 벡터)를 통한 증식성 플라시미드 매개 상동 재조합 기술(replicative plasmid-mediated homologous recombination)로 결손화 시켰다. 프라이머로는 PE1와 PE2 (표 1)를 그리고 마이크로모노스포라 올리바스테로스포라에서 분리한 유전체를 템프레이트로 하여, 포티마신 생합성 집단 내 forE 오픈 리딩 프레임(open reading frame) 개시코돈으로부터 347 bp를 포함하는 업스트림(upstream) 서열 1148 bp를 우선 PCR로 증폭시켰다 (표 1). 서열 확인 후, EcoRI과 BamHI으로 절단한 PCR 절편을 동일 제한효소로 절단한 pKC1139 벡터에 결합시켰다. 다음으로, forE 오픈 리딩 프레임 종결코돈 포함 238 bp까지를 포함하는 다운스트림(downstream) 서열 238 bp 역시 PE3와 PE4를 이용하여 PCR로 증폭하였으며 (표 1), 서열 확인 후 BamHI과 HindIII로 절단한 PCR 절편을 동일 제한효소로 절단한 상기 벡터에 결합시킴으로서, 결손용 벡터인 pDforE를 제작하였다.

상기 벡터 pDforE의 대장균 ET12567 내 형질전환은 이염화칼슘을 이용한 열 펄스 형질전환법을 사용하였다. 이후, 유전자 forE 결손화용 벡터 pDforE를 포함하고 있는 형질전환 대장균 ET12567과 야생 균주 마이크로모노스포라 올리바스테로스포라의 속간 접합(intergeneric conjugation)을 통하여 forE 결손형 마이크로모노스포라 올라바스테로스포라 재조합 균주(MOΔforE)를 제작하였다. 형질전환 균주의 선발을 위하여 nalidixic acid, 아프라마이신(apramycin) 및 티오스트렙톤(thiostrepton) 항생제들이 사용되었으며, pKC1139 벡터의 열 민감성을 활용하여 최종적으로 이중 크로스오버(double cross-over) MOΔforE 재조합 균주를 선발하였다.

한편, 외래 유전자의 마이크로모노스포라 올리바스테로스포라 내 추가 도입을 위한 바이오디바이스로 pNBA1890 (pSET152 유사체; thio ^R ; PermE* 프로모터)를 이용하였다. 서열번호 11 내지 14의 프라이머 (표 1)에 네오마이신 생산 야생 균주인 스트렙토마이세스 프라디에 분리 유전체를 템플레이트로 하여 PCR 증폭을 하였으며, 기존 neoL과 neoP (GenBank 등록번호 AJ629247) 서열과의 비교 확인하였다. 이후, 그 증폭된 절편을 미리 BamHI과 XbaI로 절단한 pNBA1890과 결합시켰으며, 아프라마이신 민감성과 티오스트렙톤 내성 선발을 통해 최종 마이크로모노스포라 올리바스테로스포라 재조합 MO1 균주 제작을 완성하였다.

4-4: 재조합 마이크로모노스포라 올리바스테로스포라 MO1 미생물 인비보 발효를 통한 아미노사이클리톨 생합성

상기 재조합 MO1 미생물을 만니톨소야(Mannitol-Soya, MS medium) 고체 배지에 접종하여 그 포자를 미리 준비하였다. 이후, 포자를 NZ-Amine 배지(1% 포도당, 2% 가용성 전분, 0.5% 효소 추출물, 0.5% NZ-Amine[Sigma-Aldrich] 및 0.2% 탄산칼슘, pH 7.0)에 접종한 후, 28℃에서 10일간 배양하였다. 배양액의 pH를 염산 용액을 이용하여 2.5까지 낮추고, 상온의 실험실 진탕기에서 한시간 동안 진탕하였다. 냉장 조건으로 약 20000 rpm에서 10분간 원심 분리하여 균체를 제거한 후, 상등액을 미리 메탄올 3 ml와 10 mM 염산 용액(pH 2.5) 3 ml로 전 처리한 OASIS MCX 고체상추출 카트리지(Waters)에 주입하였다. 이후, 카트리지를 10 mM 염산 용액 3 ml터로 세척하고 약 30초간 대기압을 낮추어서 완전히 건조시켰다. 카트리지 충전재에 흡착된 아미노사이클리톨 화합물들은 5% 메탄올성 수산화암모늄(NH₄OH) 용액 0.5 ml로 2번에 걸쳐 용출하였고, 용출액은 상온에서 스피드백(EYELA)으로 감압 건조하였다.

4- 5: 4 ,5- 라이보실 ( ribosyl )- 포티마이신 FU-10 ( RFU10 )의 분리, 정제 및 구조 확인

실시예 3-3에 기재된 것과 동일하게 실험하여 목적하는 의사삼당(pseudotrisaccharide)인 4,5-라이보실-포티마이신 FU-10(RFU10) 화합물의 분획을 정제하였다. 도 2에 RFU10으로 나타나 있으며, 최종 3.1 mg으로 최종 확보되었다.

하기 표 3에 생합성된 4,5-라이보실-포티마이신 FU-10 화합물의 ¹³C-NMR 스펙트럼을 정리하여 기재하였다.

위치	4,5- 라이보실 ( ribosyl )- 포티마이신 FU-10 ( RFU10 )	4,6- 글루코실 ( glucosyl )- 포 티마이신 FU-10 (GFU10)	4,6- 자일로실 ( xylosyl )- 포티마이신 FU-10 ( XFU10 )
위치	δ _C	δ _C	δ _C
1	74.4	65.1	33.8
2	72.1	72.4	57.9
3	58.1	57.9	64.0
4	81.8	84.1	83.4
5	75.6	70.2	78.3
6	72.4	86.2	65.3
1’	108.0	108.1	107.8
2’	55.7	55.6	55.6
3’	74.1	74.0	73.8
4’	70.7	70.7	72.6
5’	78.7	78.6	74.1
6’	62.4	62.4	17.2
1“	113.3	110.1	23.7
2“	80.1	74.2	71.1
3“	76.8	76.8	41.9
4“	85.0	71.4	70.5
5“	61.8	81.3	66.6
6“	-	62.1	-

실시예 5: 4 ,6- 글루코실 ( glucosyl )- 포티마이신 FU-10 ( GFU10 )의 제조

5-1: 재조합 대장균 EC4 제작

마이크로모노스포라 올리바스테로스포라 유전체를 템플리트로 하여 PCR을 통하여 증폭된 유전자 5종 forA , forG , forS , forM, forD와 4,6계열 아미노글리코사이드인 카나마이신 생산 야생균주인 스트렙토마이세스 카나마이세티쿠스 유전체에서 PCR로 증폭시킨 당전이 관련 효소 암호화 유전자 kanM2, 그리고 대장균 코돈을 기반으로 최적화하여 합성한 인공 유전자 2종 fmrO _s 및 ino1 _s를 실시예 1-1에 기재된 것과 동일하게 바이오브릭스(BioBricks) 조립법을 활용하여 조립하였다(표 1). 상기 총 8종의 유전자를 포함하는 바이오디바이스를 발현용 이종숙주인 대장균 BL21(DE3)(Stratagene)에 도입시켜서, 최종적으로 재조합 EC4 균주를 제작하였다.

5-2: 재조합 대장균 EC4 인비보 발효를 통한 아미노사이클리톨 생합성

실시예 3-2에 기재된 것과 동일하게 실험하여 재조합 EC4 균주의 인비보 발효를 통하여 생합성된 아미노사이클리톨을 추출하였다.

5-3: 재조합 마이크로모노스포라 올리바스테로스포라 MO2 제작

실시예 4-3에 기재된 것과 동일하게 실험하여 재조합 마이크로모노스포라 올리바스테로스포라 MO2 균주를 제작하였다. 다만, 서열번호 19 및 20의 프라이머 (표 1 )와 카나마이신 생산 야생 균주인 스트렙토마이세스 카나마이세티쿠스 분리 유전체를 템플레이트를 활용하여 PCR 증폭을 하였으며, 외래 도입된 유전자가 kanM2 임이 다른 점이다.

5-4: 재조합 마이크로모노스포라 올리바스테로스포라 MO2 미생물 인비보 발효를 통한 아미노사이클리톨 생합성

실시예 4-4에 기재된 것과 동일하게 실험하여 재조합 마이크로모노스포라 올리바스테로스포라 MO2 균주의 인비보 발효를 통한 아미노사이클리톨을 생합성하였다.

5- 5: 4 ,6- 글루코실 ( glucosyl )- 포티마이신 FU-10 ( GFU10 )의 분리, 정제 및 구조 확인

실시예 3-3에 기재된 것과 동일하게 실험하여 목적하는 의사삼당인 4,6-글루코실-포티마이신 FU-10(GFU10) 화합물의 분획을 정제하였다. 도 2에 GFU10으로 나타나 있으며, 최종 4.2 mg으로 최종 확보되었다.

상기 표 3에 생합성된 4,6-글루코실-포티마이신 FU-10 화합물의 ¹³C-NMR 스펙트럼을 정리하여 기재하였다.

실시예 6: 4 ,6- 자일로실 ( xylosyl )- 포티마이신 FU-10 ( XFU10 )의 제조

6-1: 재조합 대장균 EC5 제작

마이크로모노스포라 올리바스테로스포라 유전체를 템플리트로 하여 PCR을 통하여 증폭된 유전자 5종 forA , forG , forS , forM, forD와 4,6계열 아미노글리코사이드인 겐타마이신 생산 야생균주인 마이크로모노스포라 에키노스포라 유전체에서 PCR로 증폭시킨 당전이 관련 효소 암호화 유전자 genM2, 그리고 대장균 코돈을 기반으로 최적화하여 합성한 인공 유전자 2종 fmrO _s 및 ino1 _s를 실시예 1-1에 기재된 것과 동일하게 바이오브릭스(BioBricks) 조립법을 활용하여 조립하였다(표 1). 상기 총 8종의 유전자를 포함하는 바이오디바이스를 발현용 이종숙주인 대장균 BL21(DE3)(Stratagene)에 도입시켜서, 최종적으로 재조합 EC5 균주를 제작하였다.

6-2: 재조합 대장균 EC5 인비보 발효를 통한 아미노사이클리톨 생합성

실시예 3-2에 기재된 것과 동일하게 실험하여 재조합 EC5 균주의 인비보 발효를 통하여 생합성된 아미노사이클리톨을 추출하였다.

6-3: 재조합 마이크로모노스포라 올리바스테로스포라 MO3 제작

실시예 4-3에 기재된 것과 동일하게 실험하여 재조합 마이크로모노스포라 올리바스테로스포라 MO3 균주를 제작하였다. 다만, 서열번호 21 및 22의 프라이머(표 1)와 겐타마이신 생산 야생 균주인 마이크로모노스포라 에키노스포라 분리 유전체를 템플레이트를 활용하여 PCR 증폭을 하였으며, 외래 도입된 유전자가 genM2 임이 다른 점이다.

6-4: 재조합 마이크로모노스포라 올리바스테로스포라 MO3 미생물 인비보 발효를 통한 아미노사이클리톨 생합성

실시예 4-4에 기재된 것과 동일하게 실험하여 재조합 마이크로모노스포라 올리바스테로스포라 MO3 균주의 인비보 발효를 통한 아미노사이클리톨을 생합성하였다.

6- 5: 4 ,6- 자일로실 ( xylosyl )- 포티마이신 FU-10 ( XFU10 )의 분리, 정제 및 구조 확인

실시예 3-3에 기재된 것과 동일하게 실험하여 목적하는 의사삼당인 4,6-자일로실-포티마이신 FU-10(XFU10) 화합물의 분획을 정제하였다. 도 2에 XFU10으로 나타나 있으며, 최종 3.7 mg으로 최종 확보되었다.

상기 표 3에 생합성된 4,6-자일로실-포티마이신 FU-10 화합물의 ¹³C-NMR 스펙트럼을 정리하여 기재하였다.

실시예 7: 4 ,5- 라이보실 ( ribosyl )-6′- 메틸 - 포티마이신 FU-10 ( R6MFU10 )의 제조

7-1: 재조합 대장균 EC6 제작

마이크로모노스포라 올리바스테로스포라 유전체를 템플리트로 하여 PCR을 통하여 증폭된 유전자 5종 forA , forG , forS , forM, forD와 4,5계열 아미노글리코사이드인 네오마신 생산 야생균주인 스트렙토마이세스 프라디애 유전체에서 PCR로 증폭시킨 당전이 관련 효소들 암호화 2종 유전자들 neoL 및 neoP, 그리고 대장균 코돈을 기반으로 최적화하여 합성한 인공 유전자 3종 fmrO _s, ino1 _s 및 forK _s를 실시예 1-1에 기재된 것과 동일하게 바이오브릭스(BioBricks) 조립법을 활용하여 조립하였다(표 1). 상기 총 10종의 유전자를 포함하는 바이오디바이스를 발현용 이종숙주인 대장균 BL21(DE3)(Stratagene)에 도입시켜서, 최종적으로 재조합 EC6 균주를 제작하였다.

7-2: 재조합 대장균 EC6 인비보 발효를 통한 아미노사이클리톨 생합성

실시예 3-2에 기재된 것과 동일하게 실험하여 재조합 EC6 균주의 인비보 발효를 통하여 생합성된 아미노사이클리톨을 추출하였다.

7- 3: 4 ,5- 라이보실 ( ribosyl )-6′- 메틸 - 포티마이신 FU-10 ( R6MFU10 )의 분리, 정제 및 구조 확인

실시예 3-3에 기재된 것과 동일하게 실험하여 목적하는 의사삼당인 4,5-라이보실-6‘-메틸-포티마이신 FU-10(R6MFU10) 화합물의 분획을 정제하였다. 도 2에 R6MFU10으로 나타나 있으며, 최종 2.4 mg으로 최종 확보되었다.

하기 표 4에 생합성된 4,5-라이보실-6‘-메틸-포티마이신 FU-10 화합물의 ¹³C-NMR 스펙트럼을 정리하여 기재하였다.

위치	4,5- 라이보실 ( ribosyl )-6′-메틸-포티마이신 FU-10 (R6MFU10)	4,6- 글루코실 ( glucosyl )-6′-메틸-포티마이신 FU-10 (G6MFU10)	4,6- 자일로실 ( xylosyl )-6′-메틸-포티마이신 FU-10 (X6MFU10)
	δ _C	δ _C	δ _C
1	74.4	65.1	65.1
2	72.2	72.5	72.3
3	58.1	57.9	57.8
4	81.8	84.0	83.9
5	75.5	70.3	70.3
6	72.4	86.2	86.2
1’	108.0	108.1	108.0
2’	55.7	55.5	55.5
3’	74.1	74.0	74.3
4’	70.3	70.1	70.0
5’	90.9	90.8	90.8
6’	66.6	66.5	66.6
6‘ 메틸	19.6	19.6	19.6
1“	113.4	110.2	112.5
2“	80.2	74.2	73.9
3“	76.8	76.8	77.1
4“	85.0	71.5	70.7
5“	61.9	81.4	66.4
6“	-	62.2	-

실시예 8: 4 ,6- 글루코실 ( glucosyl )-6′- 메틸 - 포티마이신 FU-10 ( G6MFU10 )의 제조

8-1: 재조합 대장균 EC7 제작

마이크로모노스포라 올리바스테로스포라 유전체를 템플리트로 하여 PCR을 통하여 증폭된 유전자 5종 forA , forG , forS , forM, forD와 4,6계열 아미노글리코사이드인 카나마이신 생산 야생균주인 스트렙토마이세스 카나마이세티쿠스 유전체에서 PCR로 증폭시킨 당전이 관련 효소 암호화 유전자 kanM2, 그리고 대장균 코돈을 기반으로 최적화하여 합성한 인공 유전자 3종 fmrO _s, ino1 _s 및 forK _s를 실시예 1-1에 기재된 것과 동일하게 바이오브릭스(BioBricks) 조립법을 활용하여 조립하였다(표 1). 상기 총 9종의 유전자를 포함하는 바이오디바이스를 발현용 이종숙주인 대장균 BL21(DE3)(Stratagene)에 도입시켜서, 최종적으로 재조합 EC7 균주를 제작하였다.

8-2: 재조합 대장균 EC7 인비보 발효를 통한 아미노사이클리톨 생합성

실시예 3-2에 기재된 것과 동일하게 실험하여 재조합 EC7 균주의 인비보 발효를 통하여 생합성된 아미노사이클리톨을 추출하였다.

8- 3: 4 ,6- 글루코실 ( glucosyl )-6′- 메틸 - 포티마이신 FU-10 ( G6MFU10 )의 분리, 정제 및 구조 확인

실시예 3-3에 기재된 것과 동일하게 실험하여 목적하는 의사삼당인 4,6-글루코실-6‘-메틸-포티마이신 FU-10(G6MFU10) 화합물의 분획을 정제하였다. 도 2에 G6MFU10으로 나타나 있으며, 최종 2.2 mg으로 최종 확보되었다.

상기 표 4에 생합성된 4,6-글루코실-6‘-메틸-포티마이신 FU-10 화합물의 ¹³C-NMR 스펙트럼을 정리하여 기재하였다.

실시예 9: 4 ,6- 자일로실 ( xylosyl )-6′- 메틸 - 포티마이신 FU-10 ( X6MFU10 )의 제조

9-1: 재조합 대장균 EC8 제작

마이크로모노스포라 올리바스테로스포라 유전체를 템플리트로 하여 PCR을 통하여 증폭된 유전자 5종 forA , forG , forS , forM, forD와 4,6계열 아미노글리코사이드인 겐타마이신 생산 야생균주인 마이크로모노스포라 에키노스포라 유전체에서 PCR로 증폭시킨 당전이 관련 효소 암호화 유전자 genM2, 그리고 대장균 코돈을 기반으로 최적화하여 합성한 인공 유전자 3종 fmrO _s, ino1 _s 및 forK _s를 실시예 1-1에 기재된 것과 동일하게 바이오브릭스(BioBricks) 조립법을 활용하여 조립하였다(표 1). 상기 총 9종의 유전자를 포함하는 바이오디바이스를 발현용 이종숙주인 대장균 BL21(DE3)(Stratagene)에 도입시켜서, 최종적으로 재조합 EC8 균주를 제작하였다.

9-2: 재조합 대장균 EC8 인비보 발효를 통한 아미노사이클리톨 생합성

실시예 3-2에 기재된 것과 동일하게 실험하여 재조합 EC8 균주의 인비보 발효를 통하여 생합성된 아미노사이클리톨을 추출하였다.

9- 3: 4 ,6- 자일로실 ( xylosyl )-6′- 메틸 - 포티마이신 FU-10 ( X6MFU10 )의 분리, 정제 및 구조 확인

실시예 3-3에 기재된 것과 동일하게 실험하여 목적하는 의사삼당인 4,6-자일로실-6‘-메틸-포티마이신 FU-10(X6MFU10) 화합물의 분획을 정제하였다. 도 2에 X6MFU10으로 나타나 있으며, 최종 2.5 mg으로 최종 확보되었다.

상기 표 4에 생합성된 4,6-자일로실-6‘-메틸-포티마이신 FU-10 화합물의 ¹³C-NMR 스펙트럼을 정리하여 기재하였다.

[ 실험예 ]

실험예 1: 9종의 스킬로이노사민을 포함하는 아미노사이클리톨 화합물의 신장 세포주에 대한 세포 독성

상기 제조한 실시예 화합물 9종을 유전질환 치료제로서 임상 적용시 문제점 중 하나일 수 있는 신장 세포에 대한 독성 문제를 검정하기 위하여, 정상 인간 신장세포주인 HEK293 및 원숭이 유래 신장 상피세포주 COS-7을 대상으로 하여 MTT 방법으로 그 세포 독성을 확인하였다.

대조군으로는 기존의 아미노글리코사이드 항생제인 겐타마이신(Sigma-Aldrich), 게네티신(혹은 G418, Sigma-Aldrich) 및 겐타마이신 B1(혹은 GB1, MicroCombiChem, Wiesbaden, 독일)을 동일 농도로 사용하여 비교하였다. 우선, 검정용 3종의 신장세포주를 활성화시켰고, 각각의 세포주를 수정된 DE 배지(DE medium)에 전 배양시킨 후, 원심 분리하고 T-플라스크에 분주하고 본 배양을 5일간 수행하였다. 배양 3일째에 실시예 화합물 9종 각각을 최종 20 ~ 400 μM 수준이 되도록 처리한 후, 2일간 추가 배양을 실시하였다. 각 실험군과 대조군 모두, 최종 MTT로 정색 반응을 실시하여 각 세포주에 대한 개별 반수 치사 농도인 LD₅₀ (μM)을 측정하였으며 적어도 2번 이상의 독립적 실험을 실시하였다. 통계적 처리를 위하여 씨그마플롯 소프트웨어 패키지 10.0.1(Systat Software Inc., San Jose, CA, 미국)가 사용되었다. 각 실험군과 대조군들 간 유의적 차이는 P<0.01로 표현하였다.

그 결과, 도 3에 나타난 바와 같이, 인간 신장세포주인 HEK293을 대상으로 스킬로이노사민을 포함하는 아미노사이클리톨 화합물 9종은 모두 겐타마이신(평균 LD₅₀=26.9 μM), G418(평균 LD₅₀=59.7 μM) 및 GB1(평균 LD₅₀=63.3 μM)의 경우보다, 높은 LD₅₀ 수치를 보여주었다. 특히, 2’-디아미노-6‘-메틸-포티마이신 FU-10 (2D6MFU10) 및 2’-디아미노-포티마이신 FU-10 (2DFU10) 의사이당은 각각 130.2와 105 μM의 확연히 차이 나는 높은 LD₅₀ 수치를 보여주었다.

또한, 원숭이 유래 신장 상피세포주 COS-7를 대상으로 한 세포 독성 실험 결과에서는, 대조군으로 겐타마이신(평균 LD₅₀=52.3 μM), G418(평균 LD₅₀=102.6 μM) 및 GB1(평균 LD₅₀=108.8 μM)의 경우에 비하여, 2’-디아미노-포티마이신 FU-10 (2DFU10), 2’-디아미노-6‘-메틸-포티마이신 FU-10 (2D6MFU10) 및 6’-메틸-포티마이신 FU-10 (6MFU10) 의사이당은 각각 207.3, 199.4 및 195.4 μM의 확연히 높은 LD₅₀ 수치를 보여주었다.

상기 2종의 포유동물 세포주를 이용한 신장 세포독성 검정 결과, 기존 임상 적용 아미노글리코사이드 항생제들보다 그 독성이 확연히 감소되어 스킬로이노사민을 포함하는 아미노사이클리톨 화합물들의 임상 적용 가능성을 보여줄 수 있었다. 특히 의사이당 아미노사이클리톨인 2DFU10과 2D6MFU10은 다른 화합물들과 달리 2‘위치에 아미노(amino)기가 아닌 하이드록시(hydroxy) 기능기를 가진 스킬로이노사민을 포함하는 아미노사이클리톨들로서 2종의 신장 세포주 모두에서 가장 낮은 세포 독성을 제시하였다. 이는 아미노사이클리톨 구조 내 2’위치에 하이드록시기의 존재는 신장 세포 독성을 완화할 수 있는 주요 결정인자로 예상된다.

실험예 2: 9종의 스킬로이노사민을 포함하는 아미노사이클리톨 화합물의 무의미 통독 유도 활성

상기 제조한 실시예 화합물 9종에 대하여 낭성 섬유증 환자 유래 기관지 상피 일차 세포주(Asterand Bioscience, Detroit, MI, 미국; p.ΔF508/W1282X)를 활용하여 생체 외(ex vivo) 무의미 통독 유도(nonsense readthrough inducer) 활성 검정방법을 실시하였다. 즉, 퇴행성 유전 질환자인 낭성 섬유증 유전 질환자로부터 적출한 세포주를 대상으로 하여 전 임상 초기 단계라 할 수 있는 생체 외 무의미 통독 활성 검정을 실시하였다.

우선, 낭포성 섬유증 유전 질환자에서 적출한 세포주를 10% FBS와 1% 페니실린/스트렙토마이신이 부가된 RPMI-1640 배지(Invitrogen)에 활성화시켰다. 즉 전 배양시킨 후, 원심 분리하여 T-플라스크에서 본 배양을 5일간 수행하였다. 배양 3일째에 실시예 화합물 9종 각각을 최종 25 μM 수준이 되도록 처리한 후, 2일간 추가 배양하였다. 각 실험군와 함께 대조군으로서 그 활성이 보고된 바 있는 상기 겐타마이신, G418 및 GB1을 동일하게 처리하여 비교하였다.

실험군 및 대조군 시료들을 원심 분리한 후 CelLytic NuCLEAR extraction kit(Sigma-Aldrich)를 이용하여 핵내 단백질 분획을 준비하였다. 각 시료들의 농도를 일정하게 보정한 후, 10 ㎕의 시료들을 고속액체크로마토그래피-전자스프레이이온화-질량분석기로 분석하였다. 컬럼으로는 MAbPac SEC-1 컬럼(Thermo Fisher Scientific, Sunnyvale, CA, 미국; 4x 300 ml, 5 ㎛)이, 이동상으로는 0.05% TFA와 0.1% 개미산이 첨가된 20% 아세토니트릴을 분당 200 ㎛로 30분간 흘렸다. 크로마토그램 상에 나타난 피크를 ReSpect 알고리듬을 장착한 Thermo Scientific protein deconvolution 2.0 소프트웨어로 디콘볼루션시켜 그 단백질 크기를 확인하였으며, 절단된 단백질과 완전길이 단백질의 피크 강도를 계측하여 각 화합물들의 무의미 통독 유도 활성을 검정하였다. 각 실험군과 대조군들 간 유의적 차이는 P<0.01로 표현하였다.

그 결과, 도 4에 나타난 바와 같이, 동일한 농도(25 μM) 수준으로 처리하여 대조군으로서 겐타마이신(평균 0.38), G418(평균 0.55) 및 GB1(평균 0.63)와 비교하여 일부 스킬로이노사민을 포함하는 아미노사이클리톨 화합물에서 향상된 무의미 통독 유도 활성을 확인할 수 있었다. 즉, 2’-디아미노-포티마이신 FU-10 (2DFU10), 2’-디아미노-6‘-메틸-포티마이신 FU-10 (2D6MFU10) 및 6’-메틸-포티마이신 FU-10 (6MFU10) 의사이당들은 각각 0.63, 0.71 및 0.65의 활성으로 대조군 중 가장 높은 무의미 통독 유도 활성을 제시한 GB1 대비 그 이상의 무의미 통독 유도 활성을 제시하였다.

이러한 결과에 의해, 실시예 화합물 중 일부는 유전 질환 치료제로의 임상 적용 잠재성을 확인할 수 있었다. 특히, 현존 가장 높은 무의미 통독 유도 활성이 보고된 바 있는 GB1과 비교하여, 스킬로이노사민을 포함하는 화합물 중 일부에서 상대적으로 향상된 생체 외 CFTR 무의미 통독 활성은 의미 있는 결과이다 (aradaran-Heravi, A. et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA. 114(13):3479-3484, 2017). 나아가, 의사이당 화합물 3종의 구조와 무의미 통독 유도 활성 간의 연관성을 조사한 결과, 6‘위치의 메틸 기능기 존재 여부는 생체 외 CFTR 무의미 통독 유도 활성에 주요한 결정인자로 예측된다.

[ 제제예 ]

실시예 화합물 9종에 대하여 하기와 같이 제제화 하였다.

제제예 1: 정제(직접 가압)

화합물 5.0 ㎎을 체로 친 후, 락토스 14.1 ㎎, 크로스포비돈(USNF) 0.8 ㎎ 및 마그네슘 스테아레이트 0.1 ㎎을 혼합하고 가압하여 정제로 제조하였다.

제제예 2: 정제(습식 조립)

화합물 5.0 ㎎을 체로 친 후, 락토스 16.0 ㎎과 녹말 4.0 ㎎을 섞었다. 폴리솔베이트 800.3 ㎎을 순수한 물에 녹인 후, 이 용액의 적당량을 첨가하여 미립화하였다. 건조 후에 미립을 체질한 후, 콜로이달 실리콘 디옥사이드 2.7 ㎎ 및 마그네슘 스테아레이트 2.0 ㎎과 섞었다. 미립을 가압하여 정제로 제조하였다.

제제예 3: 분말과 캡슐제

화합물 5.0 ㎎을 체로 친 후에, 락토스 14.8 ㎎, 폴리비닐 피롤리돈 10.0 ㎎ 및 마그네슘 스테아레이트 0.2 ㎎과 함께 혼합하였다. 상기 혼합물을 캡슐제조기를 사용하여 단단한 No. 5 젤라틴 캡슐에 채웠다.

제제예 4: 주사제

활성 성분 100 mg에 만니톨 180 mg, Na₂HPO₄12H₂O 26 mg 및 증류수를 함유시켜 주사제를 제조하였다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

<110> Korea University Research and Business Foundation <120> Scyllo-inosamine containing aminocyclitol compounds, method for the preparation thereof and pharmaceutical compositions comprising the same <130> P18-B087 <160> 25 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forA-F <400> 1 gctctagaat gaccaccgag cagatcctgc c 31 <210> 2 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forA-R <400> 2 ataagctttc aggggcgccg gagcaccgg 29 <210> 3 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forG-F <400> 3 gcctctagaa tgcgggtcgg tctgattggt gc 32 <210> 4 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forG-R <400> 4 tataagcttt cacgcggccg ccgtccccac 30 <210> 5 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forS-F <400> 5 acatctagaa tgagcgcact cgctctcgcc 30 <210> 6 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forS-R <400> 6 agtaagcttt cagagctcgg catggtgcgc 30 <210> 7 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence 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Claims

i) 2′-디아미노-포티마이신 FU-10 (2DFU10); 및
ii) 2′-디아미노-6′-메틸-포티마이신 FU-10 (2D6MFU10)으로 구성된 군에서 선택되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염.
삭제
제1항의 화합물을 유효성분으로 함유하는 무의미 점 돌연변이에 기인한 유전 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물로서, 상기 유전 질환은 낭성 섬유증 (cystic fibrosis), 듀시엔형 근이영양증 (duchenne muscular dystrophy, DM D), 모세혈관 확장성 운동 실조증후군 (ataxia telangiectasia), 헐러 증후군 (hurler syndrome), A형 혈우병 (hemophilia A), B형 혈우병 (hemophilia B), 및 테이-삭스병 (tay-sachs)으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
삭제
i) fmrO_s, ino1_s, forA, forG, forS 및 forM 유전자가 도입되어 있는 재조합 대장균 (EC1); 및
ii) fmrO_s, ino1_s, forA, forG, forS, forM, forD 및 forK_s 유전자가 도입되어 있는 재조합 대장균 (EC2)으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 제1항의 화합물 생산능을 가지는 재조합 대장균.
삭제
(a) fmrO _s, ino1 _s, forA , forG , forS 및 forM 유전자가 도입되어 있는 재조합 대장균 (EC1)의 세포외 추출물 및 핵산당 UDP-포도당의 효소반응을 통하여 스킬로이노사민을 포함하는 2′-디아미노-포티마이신 FU-10 (2DFU10)을 생성하는 단계; 및
(b) 상기 생성된 2′-디아미노-포티마이신 FU-10 (2DFU10)을 회수하는 단계를 포함하는 2′-디아미노-포티마이신 FU-10 (2DFU10)의 제조방법.
(a) fmrO _s, ino1 _s, forA , forG , forS , forM , forD 및 forK _s 유전자가 도입되어 있는 재조합 대장균 (EC2)의 세포외 추출물 및 핵산당 UDP-포도당의 효소반응을 통하여 2′-디아미노-6′-메틸-포티마이신 FU-10 (2D6MFU10)을 생성하는 단계; 및
(b) 상기 생성된 2′-디아미노-6′-메틸-포티마이신 FU-10 (2D6MFU10)을 회수하는 단계를 포함하는 2′-디아미노-6′-메틸-포티마이신 FU-10 (2D6MFU10)의 제조방법.
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