RS52018B - Postupak za utvrđivanje čistoće citoplazmatski sterilne linije kod suncokreta (helianthus annuus) - Google Patents

Abstract

Postupak za utvrđivanje čistoće citoplazmatski sterilne (CS) linije kod suncokreta pomoćuPCR reakcije (Polymerase Chain Reaction), koja za rezultat ima razlikovanje DNK fragmenata citoplazmatski sterilne od fragmenata citoplazmatski fertilne linije, vidljivo putem elektroforeze aparatom koji može da meri i dužinu i koncentraciju PCR proizvoda naznačen time da se naklijavanje semena vrši u komorama za naklijavanje pri temperaturi između 20-25°C, pri čemu se semena stave između dva vodom nakvašena filter papira i čeka 4-6 dana za pojavu kotiledona koji se koriste za izolaciju DNK, zatim se vrši izolacija DNK iz kotiledona lg biljnog tkiva gde su komponente koje sačinjavaju 20 µL PCR reakcije:2.0 µL (10 x) PCR Puffer (finalno: 1 x)1.2 µL (25mM) MgCl2 (finalno: 1.5mM)0.5 µL (10mM) dNTP (finalno: 250mM)1.0 µL (10µM) prajmeraplT139 (finalno: 0.5 µM )1.0 µL (10µM) prajmeraplT481 (finalno: 0.5 µM )0.2 µL (5U/ µL) Taq polimeraze (finalno: 1U)15ng genomske DNA;i gde je temperaturni profil korišćen za PCR amplifikaciju sa prajmerima plT139 - 5' GAA CTC AAA ACT GCA GCT ATC 3' i plT481 - 5' GTC TTA CAC TCT CTA CTC C 3' takav da se na 94°C tokom 3minuta vrši početna denaturacija a da se zatim u narednoj fazi u 10 ciklusa na 94 °C tokom 15sekundi vrši denaturacija, zatim na 58°C tokom 8sekundi se vrši hibridizacija, da bi se zatim na 72°C tokom 30sekundi vršila ekstenzija, a da se zatim u narednih 25 ciklusa ponovo vrši denaturacija - 15 sekundi na 94°C, zatim hibridizacija - 8 sekundi na 57°C, pa ekstenzija - 30 sekundi na 72°C, nakon čega se vrši finalna ekstenzija - 5minuta na 72°C.Prijava sadrži još 1 patentni zahtev.

Description

Oblast tehnike na kojusepronalazak odnosi

Pronalazak pripada oblasti biotehnologije, i to molekularne biologije, a odnosi se na ispitivanje čistoće citoplazmatske sterilne (CS) linije kod suncokreta, radi proizvodnje hibridnog semena.

Prema Međunarodnoj klasifikaciji patenata (MKP) oznaka je: A01C 1/00.

Tehnički problem

Pronalazak rešava problem dobijanja rezultata čistoće citoplazmatske sterilne linije kod suncokreta bez sađenja semena i ispitivanja cveta za potrvđivanje prisustva polena. Putem PCR reakcije (Polvmerase Chain Reaction) sintetisani fragmenti DNK (produkt PCR reakcije) omogućavaju razlikovanje sterilne i fertilne (CF) linije suncokreta, čime se višestruko smanjuje vreme i troškovi potrebni/. adobijanje rezultata čistoće.

Stanje tehnike

Sađenje semena i ispitivanje cveta za potvrđivanje prisustva polena.

Utvrđivanje fertilnosti suncokreta vrši se putem sađenja semena i ispitivanja cveta za potvrđivanje prisustva polena. Prisustvo, odn. odsustvo polena u cvetu ukazuje da se radi o fertilnoj, odn. sterilnoj liniji suncokreta, a samo je sterilna podobna za proizvodnju hibridnog semena za uzgoj suncokreta visokog prinosa. Postupak traje celu vegetacijsku sezonu, pošto se suncokret sadi na proleće. a cveta tokom leta. pa se na upotrebu semena mora čekati sledeće proleće. Radi uštede u vremenu, sađenje se obavlja u jesen u zemljama južne hemisfere, kada tamo počinje setva, pa se ispitivanje cveta može obaviti tokom zime. kada suncokret cveta u zemljama južne hemisfere, čime se ceo proces smanjuje na šest meseci.

Izlaganje suštine pronalaska

Pronalazak čine dva prajmera (kratak oligonukleotidni lanac DNK) koji se tokom PCR vezuju vodoničnim vezama za komplementarne sekvence na DNK (hibridizacija) i vrši se njihova ekstenzija.

PCR fragmenti se razlikuju kod sterilne i fertilne linije suncokreta za oko lObp (u zavisnosti od linije) što daje marker za citoplazmatsku fertilnost. Odvajanje PCR fragmenata različite dužine se vrši putem elektroforeze.

U odnosu na stanjeLehnike. ovaj pronalazak omogućava da se čistoća sterilne linije suncokreta utvrdi u laboratoriji, bez sađenja suncokreta na oglednim poljima, a rezultati se dobijaju u periodu ne dužem od deset dana.

Detaljan opis pronalaska

• Naklijavanje semena se vrši u komorama za naklijavanje pri temperaturi između 20-25°C. Semena se stave između dva vodom nakvašena filter papira. Treba 4-6 dana za pojavu kotiledona koji se koriste za izolaciju DNK. • Izolacija DNK iz kotiledona je korišćenjem metode kompanije QUAGENZaIg biljnog tkiva (DNeasv Plant Maxi Kit)

• Komponente koje sačinjavaju 20|iL PCR reakcije:

2.0uL (10x)PCRPuffer (finalno: 1 x)

1.2 uX (25mM) MgCb (finalno: 1.5mM )

0.5 uL (lOmM) dNTP (finalno: 250mM )

l.OuL (lOuM) primera plTl39 (finalno: 0.5 uM )

1.0 uL (lOuM) prajmera plT481 (finalno: 0.5 uM )

0.2 uX (5U/ \ iL)Taqpolimeraze {finalno: 1U )

15ng genomske DNA

• Temperaturni profil korišćen za PCR amplifikaciju sa prajmerima plTl 39 i plT481 u aparatu GeneAmp PCR system 2400. Perkin Elmer Corp. • Elektroforeza se vrši u aparatu koji može da meri i dužinu i koncentraciju PCR proizvoda, korišćenjem DNA 500 l.abChip Kits.

Način primenc pronalaska u proizvodnji hibridnog semena suncokreta

Kod proizvodnje hibridnog semena suncokreta, koriste se velike količine muško sterilnog semena (citoplazmatska sterilnost) čija čistoća treba da bude do 100%. Sađenjem ovog hibridnog semena uzgaja se suncokret visokog prinosa. Pronalazak bi omogućio da se na brz način utvrdi čiosloća citoplazmatski sterilnog semena suncokreta, koji se koristi za proizvodnju hibridnog semena. PCR reakcija je pokazala da se u smesi od 25 semena (1 fertilno + 24 sterilna) dobija PCR fragment fertilnog semena čime se potvrđuje da je osetljivost reakcije 1 u 25 što smanjuje broj PCR reakcija koje su potrebne da bi se ispitalo citoplazmatski sterilno seme.

Claims (2)

1. Postupak za utvrđivanje čistoće citoplazmatski sterilne (CS) linije kod suncokreta pomoću PCR reakcije (Polvmerase Chain Reaction), koja za rezultat ima razlikovanje DNK fragmenata citoplazmatski sterilne od fragmenata citoplazmatski fertilne linije, vidljivo putem elektroforeze aparatom koji može da meri i dužinu i koncentraciju PCR proizvodanaznačen timeda se naklijavanje semena vrši u komorama za naklijavanje pri temperaturi između 20-25°C, pri čemu se semena stave između dva vodom nakvašena filter papira i čeka 4-6 dana za pojavu kotiledona koji se koriste za izolaciju DNK, zatim se vrši izolacija DNK iz kotiledona lg biljnog tkiva gde su komponente koje sačinjavaju 20uL PCR reakcije: 2.0uL (10x)PCRPuffer (finalno: 1 x) 1.2 uL (25mM) MgCl2(finalno: 1.5mM) 0.5 uL (lOmM) dNTP (finalno: 250mM) 1.0 uL (lOuM) prajmera plT 139 (finalno: 0.5 uM ) 1.0 uL (lOuM) prajmeraplT481 (finalno: 0.5 uM ) 0.2 ul. (51J/ uL)Taqpolimeraze (finalno: 1U ) 15ng genomske DNA; i gde je temperaturni profil korišćen za PCR amplifikaciju sa prajmerima plT139 - 5' GAA CTC AAA ACT GCA GCT ATC 3' i plT481 - 5' GTC TTA CAC TCT CTA CTC C 3' takav da se na 94°C tokom 3minuta vrši početna denaturacija a da se zatim u narednoj fazi u 10 ciklusa na 94 °C tokom 15sekundi vrši denaturacija, zatim na 58 °C tokom 8sekundi se vrši hibridizacija, da bi se zatim na 72 °C tokom 30sekundi vršila ekstenzija, a da sc zatim u narednih 25 ciklusa ponovo vrši denaturacija - 15 sekundi na 94 °C, zatim hibridizacija - 8 sekundi na 57°C, pa ekstenzija - 30sekundi na 72 °C, nakon čega se vrši finalna ekstenzija - 5minuta na 72 °C.

2. Postupak za utvrđivanje čistoće citoplazmatski sterilne (CS) linije kod suncokreta pomoću PCR reakcije, prema patentnom zahtevu 1,naznačen time,što se nakon hlađenja u aparatu do 4 °C PCR čuva u frižideru do analize, kada se odvajanje PCR fragmenata različite dužine vrši putem elektroforeze, pri čemu se elektroforeza vrši u aparatu, gde fragmenti sterilne linije suncokreta sadrže 344bp i fragmenti fertilne linije suncokreta sadrže 331bp.