RS49539B - Ekstrakt timusa, postupak za njegovo dobijanje i farmaceutski preparat koji sadrži taj ekstrakt - Google Patents

Abstract

Ekstrakt timusa, naznačen time, što predstavlja smešu peptidne i lipidne frakcije tumusa teladi, pri čemu peptidna frakcija sadrži peptide molekulske mase manje od 10 000 D u količini od 0.3% - 4%, a lipidna frakcija sadrži 66-70 tež.% neutralnih lipida, 23-28 teћ.% fosfolipida i 1-2 teћ.% glikolipida. Prijava sadrži još 2 nezavisna patentna zahteva i 4 zavisna patentna zahteva.

Description

Oblast tehnike

Pronalazak se odnosi na imunofarmakologiju. odnosno na timusni preparat i postupak za njegovo dobijanje.

Preci/nije pronalazak se odnosi na ekstrakt iz timusa. postupak za njegovo dobijanje i preparat na bazi tog ekstrakta, tako da se može svrstati u klase A61 K. 35/26. A 61 K. 37'UH. A 61 K 9.-08.

Dcfinisani problem

Tehnički problem koji se rešava ovim pronalaskom je ekstrakt iz telećeg timusa koji je nov po sastavu, postupak za njegovo dobijanje i farmaceutski preparat na bazi iimusnog ekstrakta i njegovu primena za tečenje lezija kože.

Stanje tehnike

Timus je žlezda koja igra važnu ulogu, kako u imunološkom tako i u neuro-endokrinom regulacionom sistemu organizma.

O fiziološkoj ulozi timusa najviše se saznalo u toku poslednjih tridesetak godina.

Radovi Jankovića, AVacsmana, Arnasona (1962) o ulozi timusa u procesima rane i kasne preosetljivosti, kao i radovi nekih durgih autora: Fichtelius i sar. (1961), Archer i Pierce

(1961), Miller (1961), Martiner i sar. (1962) su predstavljali ključna zapažanja koja su dovela

do enormnog i naglog razvoja saznanja o ulozi timusa u imunološkim procesima.

Od zapažanja \Varthin-a (1928) do danas, objavljenje veliki broj radova koji ukazuju dalimus utiče na funkciju drugih endokrinih žlezda, kao što i druge endokrine žlezde mogu znatno da utiču na strukturu i funkciju timusa. U zaključku poglavlja"O hormonalnim interakcijama timusa'' Comsa (1973) smatra da hormonalne interakcije mogu da objasne utieaj timusa na produkciju limfocita.

Hormoni timusa amagoniziraju konikotropni uiicaj prednjeg režnja hipofize, a mogu i da inhibiraju limfolilički efekat ACTH. Osimloga, deluju sinergistički sa somatotroptiiin hormonom koji stimulišc proliferativnu aktivnost limfoidnog tkiva, a antagotiizuje limfulitičku aktivnost glikokortikoida. i na kraju, utvrdjena je interakcija timusa .ia tireoideom. reproduktivnim endokrinim sistemom kao i sa dclovanjem insulina.

\a osnovu navedenog, jasno je zašto se prišlo značajnim medicinskim istraživanjima. pr\o u pogledu načina korišćenja timusa a. zatim, na razvoj odgovarajućih preparata na bazi timusa.

Na tržištu postoje preparati na bazi:

- celokupnog ekstrakta timusa (telećeg, goveđeg, svinjskog, humanog, fetalnog timusa ilimu>a pacuva). do prečišćenih peptidnih smesa određenog sastava, i izolovanih pojedinačnih peptida .

-limusnih ćelija i tkiva.

- sintetizovanih analoga prirodnim proizvodima, koji se primenjuju za lečenje imuno-deficijentnih bolesti, alergija, artroza, vtrusnih infekcija (uključujući i A1DS). odredjenih vrsta kaneera , u gerijatriji, za povećanje mortiliteta spermatozoida i dr.

Preparati dobijeni ekstrakcijom iz timusa. koji su prisutni na tržištu, predstavljaju pretežno proteinsko-peptidne preparate, odnosno, niskomolekulame peptidne preparate dobijene iz proteinskih frakcija timusa koji su manje ili više prečišćeni.

Comsa je još i 973 godine, u svom radu, pregledno prikazao delovanja šesnest ekstrakata dobijenih različitim postupcima ekstrakcije timusa. Prvi opisani ekstrakt dobijen je još 1924 godine - Thurner, tako što je homogenat timusa u fiziološkom rastvoru zagrcvan do ključanja . a zatim Filtriran. Rezultat je bila smeša peptida. Poslednji opisani ekstrakt je iz 1965 - Panskv i sar.. a dobijen je ekstrakcijom timusa miševa pomoću acetona .

Goldstein A.L. i sar. (1966) su iz telećih timusa prvo izolovali jedan limfocitopoetićki faktor koji su nazvali Thymosin - frakcija 5.

Daljim radom na prečišćavanju ove frakcije utvrdjeno je da Thvmosin ne sadrži jedan peptid. već da predstavlja familiju termosiabilnih peptida molekulskih masa od 1 000-15 000 D. Iz njega su izmedju ostalih izolovani sledeći polipeptidi:

- Thvmosm a, (US 4.079.127) koji sadrži 28 amhiokiselina, sa molekulskom masom

od 3 108 D,

- Thvmosin 017 koji predstavlja kiseli polipeptid sa molekulskom masom od 2 500 I.).

- Thvmosin pV |ix p\

l ioldsiemCi11974) je iz telećih timus izolovao dva polipeptiđa koje je naz\ao riivmopoetin I11 Inmopoetin 11 ( US 4 077 949 }. Thvmopoetin 1 i II se sastoje od 49 aminokiselina čija je sekvenca utvrđena.

Prema l'S 4.377 511 J.M. Lopukhina iz 1980 godine, dobija sc preparat na bazi peptida male molekulske ma>e koji se koristi za tretman primarne i sekundarne imunodelicijencije. k>le>.n

■zu/vane malignitetom neoplazmi. psorijaze i drugih patoloških stanja. Preparat se dobija homogenizacijom sveže zamrznutog tkiva timusa u natrijum hloridu. držanjem hornugenizaui u toku 12-16 sati na temperaturi od 2-6 °C , posle čega se vrši termička denuiuracija. taloženje peptida organskim rustvaračem, rastvaranje staloženih proteina, sukcesivno isoljavajnc u tri faze sa različitim zasićenjima amonijum sulfata, pa sc peptidi ponovo rastvaraju, zatim ultrafiltriraju (granična vrednost membrane 12 000D), podvrgavaju gel hromatografiji. da bi se izdvojili peptidi od I 500 - 6 000 D, posle čega se vrši odstranjivanje soli i liofilizacija. Nedostatak navedenog postupka je što je komplikovan jer sadrži mnogo faza.

Prema DE prijavi 3.128.503 Dr Milana Pešića iz 1981 godine dobija se Sandberg-ov ekstrakt iz telećih timusa (Thymex-L) koji se priprema po sledećem postupku : timus mladih i zdravih teladi ( 1 -4 meseca) se homogenizuje sa destilovanom vodom i vrši ekstrakcija u toku 48 sati na temperaturi od 0 do +4 °C. Po završenoj ekstrakciji, odvajanje supernatanta od pulpe se vrši dekamovanjem. Supernatant se sipa u bočice i liofilizira. Jedna bočica sadili 150 mg ukupnog timusnog ekstrakta standardizovanog na sadržaj proteina od 0,6 mg/mg liofilizata .Postupak deluje jednostavno međutim proizvod karakleriše prisustvo peptida molekulskih masa koje se graniče sa proteinima .

Navedeni preparat se koristi za roumalska oboljenja: osteoporozu. cerviko-bruhijalni sindrom sa cervikalnom spondilozom, malignome i u gerijatriji.

Prema US 5.070.076 V.G. Morozova se takodje dobija preparat na bazi polipeptida malih molekulskih masa od 600 - 6 000 D. Postupak dobijanja ovog preparata obuhvata homogenizaciju timusnog tkiva, ekstrakciju rezultujućeg homogenizata 1-10% vodenim rastvorom sirćetne kiseline u prisustvu cink hlorida i taloženje proteina sa organskim rasu tracima, iz rezultujućeg supernalanla.

Ovaj preparat se može koristiti za uspostavljanje poremećenih procesa imunogene/e. regulaciju hemopoeze. hemokoagulaciju i za normalizaciju metabolizma ugljenih hidrata. masti i proteina.

Po svojoj jednostavnosti postupak dobijanja ovog preparata je sličan po.-tupaku dobijanja ekstrakta timusa prema ovom pronalasku, ali su postupci u suštini potpuno ra/lieili .Takođe po distribuciji molekulskih masa peptida. ovaj preparat je sličan distribuciji molekulskih masa peptidne frakcije iz našeg pronalaska .

Potop i saradniei 1966. i 1967. su radili, sa lipidnim odnosno lipoproteinskim frakcijama goveđeg timusa koji su delovali na rast kulture KB tumorskih ćelija i inhibiranje proliferacije ćelija.

Thvmosterin. izolovan iz jedne od ovih lipidnih frakcija karakterisan je kao sterolni hormon koji poseduje izražena antiproliferativna svojstva (Potop i Milcu 1973). Međutim ova tvrdnja nije dobila potvrdu u kasnijim istraživanjima ( J. Reisch i A. Fl-Sharaky 1982 ) . primenom savremenih analitičkih metoda.

Opis pronalaska

Cilj i prednost pronalaska je dobijanje novog ekstrakta iz telećeg timusa koji predstavlja smešu peptida i lipida.

Peptidi poseduju imunomodulatorska, hematološka i neuro-endokrina svojstva, a hemijska priroda lipida u preparatu (fosfolipidi) stimuliše imuni odgovor na adjuvantni način, ali bez indukovanja značajnih sporednih dejstava.

Dalje, cilj pronalaska jc novi postupak ekstrakcije timusa, kao i farmaceutski preparat na bazi ekstrakta iz timusa u obliku uljanog rastvora.. l-kstrakt telećeg timusa prema pronalasku, sadrži niskomolekularnu peptidnu frakciju i lipidnu frakciju.

Pcptidna frakcija ekstrakta sadrži peptide molekulske mase manje od 10 000 D. u količini od 0,3 % - 4 %.

Lipidna frakcija ekstrakta se sastoji od 66 - 70% neutralnih lipida, 23 - 28% fosfolipida i !-2% ghkolipida.

Postupak prema pronalasku se sastoji u tome što se samleveno tkivo timusa pomeša sa organskim rastvaračem. koji se meša sa vodom iz tkiva i gradi binarnu smešu. pri čemu odnos tkivo : rastvarač iznosi I : 3. Zatim se vrši destilacija pod vakuumom. Destilacija se prekida kada počne da destiliše čist organski rastvarač. Po završenoj destilaciii celokupna sii-jpen/ija se filtrira i pulpa se dvapula ispere sa svezom količinom organskog rasivaraea 1/llltrala ><e zatim, uparavanjem u vakumu . odstrani organski rastvarač, a zatim se nastavilaMišenie uparenog llltrala do uklanjanja rezidualne vlage i tragova organskog rasivaraea u trajanju od 4-6 časova.Vakuum destilacija i sušenje se vrše nalamperalurama koje ne prela/e 40<C>C

Osušeni proizvod sadrži maksimum 0.5% vlage i 0.3% organskog rastvaraća . a prinos je

2 - 14° o u odnosu nalimus.

Ovako dobijen gotov proizvod predstavlja ekstrakt telećeg timusa.

Kao organski rastvarač koristi sc: n-propil alkohol, alil alkohol, sec. butil alkohol, izobutil alkohol, n-butil alkohol, amil alkohol, n-heksil alkohol i cikloheksanol.

Od proizvoda dobij onog na opisani način izradjuju se farmaceutski preparati u obliku uljanih rastvora, koji se primenjuju u akutnim i hroničnim inficiranim i neinficiranim lezijama kože rezistentnim na klasičnu medikamentnu terapiju

Preparat je, na temperaturi tela. bistar, sterilan, stabilan uljani rastvor koji sadrži dodatne supstance koje se mešaju sa ekstraktom timusa i izmedju ostalog deluju emolijenmo doprinoseći bržem zarastanju rana.

Preparat se pokazao naročito efikasnim u tretmanu ulcus erurisa, deeubitusa. opekotina i povreda izazvanih vatrenim oružjem pri Čemu deluje bez sporednih neželjenih efekata. Postupak 7.a dobijanje sterilnog uljanog rastvora ekstrakta timusa izvodi se. prema pronalasku, tako što se aseptično pripremi kosolvent koji može da sadrži benzil alkohol, benzil benzoat. etil oleat. izo-propil miristat. nordihidroksi gvajaretnu kiselinu, butilhidroksi toluol i butil hidroksi anizol, u kojem se uz zagrevanje do 40°C rastvara odgovarajuća količina ekstrakta teiećeg timusa. Rastvoru se. uz mešanje na istoj temperaturi, dodaje neutralno maslinovo i'ili sezamovo ulje i dopunjava do odgovarajuće zapremine, tako da preparat može da sadrži: 1U - 30% ekstrakta timusa, 0,01 - 0,02 % butilhidroksi anizola (BHA), butilhidroksi toluola iMH'lJ.ili nordihidroksi gvajaretne kiseline, 1 - 3 % benzil alkohola, 10 - 20% % benzil hcnzoaiu ili izopropil miristata. 20 - 40 % etil oleata i 10 - 80 % neutralnog maslinovog ulja rili se/aniovog ulja .

Postupak prema pronalasku će dalje biti prikazan kroz sledeće primere. bez namere da se na njih ogianiei.

l'riiner l

Ekstrakcija i izolovanje ekstrakta telećeg timusa

2D kg zamrznutog telećeg timusa se samelje i homogenizuje sa 60 1 n-butanola. Zatim se vrši azeotiopska destilacija, pod\akuumom. na temperaturi 35"C. u toku koje se dodaje predesuli.sana količina n-butanola. Destilacija se prekida kada poene da desliliše čist organski rasi\amč. Po završenoj azeotropskoj destilaciji zapremina suspenzije u balonu je 57.3 1 a temperatura suspenzije je 26° - 27"C. Suspenzija se filtrira i dobija se talog ( pulpa ) i filtrat. Talog se ispere sa 10 I n-butanola. Filtrat sc upari na vakuum uparivaču pri temperaturi od 35°C a zatim se nastavlja sušenje na vakuum uparivaču na temperaturi od 38°C. do uklanjanja rezidualne vlage i tragova n-butanola u toku 4 časa.

Osušeni proizvod sadrži 0,25% vlage i 0.1% n-butanola. Težinski prinos eksttaktalelećeg timusa je5% u odnosu na limus.

Fmkcinisanje ekstrakta telećeg timusa

l-'rakcionisanje ekstrakta telećeg timusa je rađeno na koloni silika gela (Silicagel 60, Merck) po metodi : J. J. Johnston, H.A. Ghanbari. W.B. Wheeler, and J. R. Kirk,Journal offood science ,Vol.48, 33-35 ,1983.

Neutralni lipiđi su eluirani sa kolone silika gela pomoću hloroforma a fofolipidi sa acetonom, sa odgovarajućim istim zaprcminama. Glikolipidi su eluirani sa kolone silika gela sa metanolom u zaprem i ni koja odgovara 50 % zapremine rastvarača sa kojom su eluirani neutralni i tosfolipidi. Sadržaj izolovanih neutralnih lipida je 68%. fosfolipida 25% i glikolipidu je 1.5%.

Pepliilna frakcija

U cilju hemijske karakterizaeije peptidi su iz ekstrakta telećeg timusa izolovani primenom klasične metode po Folchu (Folch, J. i saradnici,./Biol. Chem..226,497-509, 1957). Tako su i/olo\ane nelipidne komponente u prinosu od 1.6 %. Ova frakcija je ispitivana Diuretskom metodom . HPLC metodom, infraervenom spektroskopijom i nuklearnom magnetnom rezonancijom.

() di\ di\\ tn/ c sadržaia peptida Bturelskum metodom

l'umoću moditikovane Diuretske metode ( N.P.Mcšov. S.F.. Severin. Pruktikum i/, hiohcmijc. Itcngrad 1485, p 102-103 ) utvrđeno je da se ekstraktu telećeg timusa nalazi U.344% peptida

Hl' U' mctudii

Aparat: Varijan Star

Kolona : Supeleo TSK. G 3000SW (60 cm x 7.8 mm )

Detekcija : UV 234 nm

Infracrvena spekrroskopija

Infracrveni spektrofotometar Perkin Elmer 1725 XL

IR- Tanak film na KBr pločicama, opseg 4000-600 cm"<1>

Peplidna frakcija izolovana iz Ekstrakta telećeg timusa je snimljena između Klir pločica . Analiza spektra je ukazala na prisustvo karakterističnih traka za peptide:

3300-2300 cm"<1>v ( OH ) + v ( NH ) + jaka široka

1600 -1560 cm'<1>v ( C=0 ), jaka traka

1410 cm'<1>v„ ( OO ), slaba traka

Suklcarnu magnaetna rezonanca

NMR Varian Gemini 200 MHz

NMR - 10 % rastvor u D20 u kiveti od 2 ml na 200 MHz

Jednodimenzionalni 'H spektar uzorka peptidne frakcije izolovane iz ekstrakta telećeg timusa snimljen je u teškoj vodi ( D2O ) i analizom spektra je dokazano prisustv o traka karakterističnih za peptide:

'\midni i aromatični 6-10 ppm

I lu 4-6 ppm

I lp". I I-/2-2 5 ppm

Metil grupe - 2 ppm

l'riincr 2

Farmaceutski preparat u obliku uljanog rastvora

1 kg ekstrakta timusa koji je dobijen prema primeru 1, mesa se i homogenizuje sa solvensom koji sadrži 0,001 kg butilhidroksi anizola, 0,2 kg benzil alkohola, 2 kg benzil benzoata i 2 kg etil oleata uz zagrcvanje, na temperaturi do 40°C. Rastvoru se dodaje neutralno maslinovo ulje do zapremine od 10,0 1. Rastvor se sterilno filtrira, puni u ampule i zatapa u aseptičnim uslovima, tako da 1 ml sadrži 100 mg ekstrakta timusa.

Primer 3

Primena farmaceutskog preparata za tečenje akutnih i kronično inficiranih i neinficirunih

lezija kože rezistentnih na klasičnu medikamentnu terapiju.

Lipidno-peptiđni ekstrakt telećeg timusa ispitivan na čoveku. pokazao je veoma dobru efikasnost kod rana koje otezano zarastaju, kao što su: ulcus cruris i decubitus. Posle lokalne upotrebe lipidno-peptidnog timusnog ekstrakta u dozi od 5 mg/kg dnevno, preparat je ispoljio imunomcdulatorno lokalno i sistemsko dejstvo. Takode je uticao na povećanje lnterleukina-1 i NO (azot monoksida). na proliferaciju iibroblasta i keratinocita. a u serumu povećao broj monociiu i ukupih limfocita. Ovakvo dejstvo je ispoljeno samo pri pri meni lipidno-peptidnog ekstrakta na oštećenu površinu kože. dok pri primeni na zdravoj, neoštećenoj koži no ispoljava nikakvo dejstvo.

Rezultati studije lokalne primene lipidno-peptidnog timusnog ekstrakta kod čoveku. ukazuju da preparat efikasno ubrzava proces zarastanja rana ( 2,8 putu brže u odnosu na placehoj i da dovodi do epitelizaeije (ironičnih uceraeija III i IV stepena koje su nastale kao poslcdicu različitih ctioloških faktora: venske staze (ulcus cruris). pritiska (decubitus). povrede vatrenim oružjem (vulnus e.\plozivum) i traume, a koje su bile rezistentne na klasičnu medikamentnu terapiju. Dužina trajanja ulceracija pre primene lipidno-peptidnog timusnog ekstrakta je prosečno iznosila 3.5 godina, dok je posle primene lipidno-peptidnog timusnog ekstrakta, tokom 30 dana. kod pacijenata sa ulcus cruris-om došlo do zarastanja ulceracija i nestanka kliničkih znakova i simptoma inflamacijc (eritema i edema) kao i do eradikaeijc uzročnika infekcije, dok je kod bolesnika sa decubitus-om došlo do zarastanja rana posle tri mesc-ca od početka primene datog ekstrakta. Kod 90 % ispitivanih pacijenata došlo je do eradikaeijc uzročnika infekcija: Staph. aurcusa, Pseudomonasa aeruginosa, Acinetobaotera, Escherichia coli. P. mirabilis. koji su identifikovani na baznom pregledu. Ovo ukazuje na antibakierijsko dejstvo lipidno-peptidnog timusnog ekstrakta, pri čemu to dejstvo nije direktno već indirektno preko povećanja broja ćelija monocitno-makrofagnog sistema kao i povećanja njihove aktivnosti.

Stvoreni ožiljak je čvrst, bez znakova hiperplazije i maligne alteracije, kao i bez pojave keloida.

Pri primeni kod jedne pacijentkinje kod koje su keloidi nastali posle alotransplantacije usled opekotine nastale dejstvom električne struje, lokalna primena lipidno-peptidnog timusnog ekstrakta putem jonoforeze dovela je do nestanka keloida i uspostavljanja potpune funkcije desne ruke.

Opservacija ožiljka dve godine po isteku primene lipidno-peptidnog timusnog ekstrakta na

mestu ranijih ulceracija, ukazuje da nije doSlo do pojave recidiva iako je većina ispitivanih

bolesnika bila nepokretna usled svoje osnovne bolesti (paraplegio inferior).

Zaključak studije

Možemo istaći da lipidno-peptidni ekstrakt, pri lokalnoj primeni na koži. svojim imunomodulatomim dejstvom dovodi do :

1. ubrzanja procesa zarastanja rana

2. potpune epitelizaeije i uspostavljanja normalne arhitekture kože

3. eradikacije uzročnih infekcija

4. stvaranja čvrstog ožiljka

5. ne dovodi do stvaranja keloida. kao ni do pojave hiperplazije kože

6. ne dovodo do maligne alteracije.

Claims (7)

1. Ekstrakt timusa, naznačen time, što predstavlja smcšu peptidne i lipidne frakcije timusa teladi, pri čemu peptidna frakcija sadrži. peptide molekulske mase manje od 10 000 D u količini od 0.3% - 4%. a lipidna frakcija sadiži 66-70 tež.% neutralnih lipida. 23- 28 tež.% fosfolipida i 1-2lež.% glikolipida.

2. Postupak za dobijanje ekstrakta timusa. naznačen time, što se samlevenom tkivu timusa dodaje organski rastvarač, koji se meša sa vodom iz tkiva gradeći binarnu smesti, pri čemu odnos tkivo : rastvarač iznosi 1 : 3. posle čega sc vrši destilacija, a zatim se dobijena suspenzija filtrira, organski rastvarač odstranjuje uparavanjein u vakunui i upareni filtrat suši u vakuumu u toku 4-6 časova pri čemu temperature destilacije i sušenja ne prelaze 40°C . .!.

Postupak prema zahtevu 2. naznačen time. što se kao organski rnstvaraći koiiste n-propil alkohol, alil alkohol, sec. btitil alkohol, izo-bulil alkohol, n-bulil alkohol, amil alkohol, n-heksil alkohol i/ili eikloheksanol .

4. Farmaceutski preparat, naznačen time. Sto predstavlja sterilan uljani rastvor koji kao aktivnu komponentu sadrži 10-30%w/v ekstrakta timusa prema zahtevu 1.

5. Farmaceutski preparat prema zahtevu 4, naznačen time, što je ekstrat timusa rastvoren u benzil alkoholu, benzil benzoatu, etil oleatu. izo-propil miristatu. norhidroksi gvajarentnoj kiselini, maslinovom i sezamovom ulju.

6. Farmaceutski preparat prema zahtevima 4 i 5, naznačen time. Što je ekstrakt timusa stabilizovan sa butilhidroksi anizolom i butilhidroksi toluolom. I

7. Farmaceutski preparat prema zahtevima 4-6. za lečenje akutnih i hronično inficiranih i neinficiranih lezija kože. Izdaje i štampa: Zavod za intelektualnu svojinu, Beograd, Kneginje Ljubice 5