RO137243A2 - Microorganism şi procedeu de obţinere a unui polizaharid microbian prin sinteză biologică - Google Patents

Abstract

Invenţia se referă la un procedeu de obţinere a unui biopolimer de tip polizaharidă microbiană cu aplicabilitate în industria farmaceutică şi medicină. Procedeul, conform invenţiei, constă în: faza de preinocul prin procesul de creştere celulară a tulpinii Rhizobium radiobaster ICCF 410 pe un mediu nutritiv agarizat, faza de inocul (vegetativă) prin cultivarea tulpinii pe un mediu lichid care conţine glicerină ca sursă de carbon şi extract de porumb ca sursă de azot, faza de biosinteză pe un mediu submers conţinând glicerină, extract de porumb, acid citric şi săruri minerale, urmată de procesarea post-biosinteză, din care se izolează polizaharida purificată (rizoban), având un conţinut de 40...45% acid glucuronic, 30...35% glucoză şi ramnoză.

Description

MICROORGANISM ȘI PROCEDEU DE OBȚINERE A UNUI POLIZAHARID MICROBIAN PRIN SINTEZĂ BIOLOGICĂ

Invenția se referă la un procedeu de obținere a unui polizaharid microbian, prin fermentație, utilizând microorganismul Rhizobium radiobacter ICCF 410, izolat din natură.

în prezent, dintre polizaharidele bacteriene studiate pe larg și exploatate comercial, fee parte: celuloza bacteriană, produsă de Acetobacter xylinum, dextranul, produs de bacterii din genul Leuconostoc, levanul, produs de bacterii din genurile Bacillus, Zymomonas și Lactobacillus și xantanul, produs de bacterii din genul Xanthomonas [1],

Biosinteza de polizaharide rizobiene a fost studiată la diverse specii ale genului Rhizobium, precum Rhizobium tropici, Rhizobium leguminosarum, Rhizobium radiobacter CAS, Rhizobium sp. PRIM-18, Rhizobium sp. M2 [2], Rhizobium meliloti [3], Rhizobium mongolense [4].

Din literatura de specialitate se remarcă feptul că polizaharidele obținute cu speciile Rhizobium conțin în general, ca monozaharide principale, galactoză și glucoză [5].

S-a menționat capacitatea unor tulpini de Rhizobium radiobacter de a produce succinoglican, polizaharid compus în principal, din unități de galactoză și glucoză, unite prin legături glicozidice β-1,3, β-1,4 și β-1,6 [6], cât și glucomanan produs de Rhizobium leguminosarum, polizaharid constituit majoritar din glucoză, manoză și cantități mici de galactoză și ramnoză [7].

De asemenea, s-a remarcat obținerea de curdlan produs de Rhizobium radiobacter, cu un conținut de glucoză, galactoză și piruvat în raport de 1:1:1, în contrast cu polizaharidul curdlan produs de Rhizobium radiobacter ATCC 6466, compus doar din glucoză [8],

Tulpinile de Rhizobium metabolizează diferite surse de carbon pentru producerea de polizaharide, predominant fiind folosite glucoza și sucroza [2].

WO2019082906 (Al) prezintă o gamă largă de substanțe utilizate ca posibile surse de carbon pentru obținerea de polizaharide rizobiene, printre care maltoză, glucoză, fructoză, manitol, trehaloză, lactoză, zaharoză și amidon, alături de extract de drojdie și peptonă, ca surse de azot.

Polizaharidele rizobiene au câștigat o atenție deosebită în diferite domenii, în special, în medicină, industria fermaceutică și cosmetică datorită proprietăților importante pe care le posedă: activitate anti-tumorală, antioxidantă, antibacterienă și imunostimulatoare.

Mai mult, pot fi utilizate ca agenți de gelifiere, îngroșate și stabilizare a produselor alimentare, cât și în industria chimică datorită vâscozității lor ridicate la concentrații scăzute, compatibilității cu sărurile minerale și stabilității bune pe o gamă largă de pH, temperatură și rezistență ionică [9].

Problema tehnică pe care o rezolvă invenția constă într-un procedeu de obținere a unui polizaharid numit ihizoban, prin biosinteză, cu o tulpină nou-izolată de Rhizobium radiobacter, utilizând ca sursă de carbon glicerina, subprodus din industria biodieselului, cu un conținut nou în monomeri, constituit majoritar din acid glucuronic, glucoză și ramnoză.

Procedeul de biosinteză a ihizobanului, conform invenției, înlătură dezavantajul unei surse de carbon zaharidice, mai scumpă decât glicerina, utilizând un microorganism nou-izolat din natură și obținerea unui polizaharid nou, ce prezintă o compoziție originală, constituită din acid glucuronic 4045%, glucoză 30-35% și ramnoză.

Prin aplicarea invenției, se obțin următoarele avantaje:

- izolarea din natură a unui nou microorganism producător de polizaharid, identificat prin secvențierea genei ARNr 16S ca fiind specia bacteriană Rhizobium radiobacter, inclus în Colecția de Microorganisme de Importanță Industrială CM1I-ICCF-WFCC 232, cu numărul de identificare ICCF 410, cât și în cadrul Autorității de Depozit Internaționale NCAIM din Budapesta, Ungaria (National Collection of Agricultural and Industrial Microorganisms, Institute of Food Science and Technology), cu numărul de înregistrare NCAIM P (B) 001493.

- obținerea prin biosinteză, cu microorganismul Rhizobium radiobacter ICCF 410, a unui polizaharid original, cu structură diferită de a altor polizaharide microbiene cunoscute, conținând acid glucuronic (40-45%), glucoză (30-35%) și ramnoză.

- valorificarea glicerinei rezultată din industria biodieselului.

Prezenta invenție descrie obținerea polizaharidului numit ihizoban, prin valorificarea glicerinei rezultată din fabricația biodieselului. Microorganismul utilizat în acest procedeu este Rhizobium radiobacter ICCF 410.

Rhizobium radiobacter este o tulpină bacteriană ce prezintă un metabolism de tip aerob. Cultura are un aspect de tip “smooth”, coloniile sunt sferice, convexe, de culoare alb-gălbui, iar celulele se prezintă sub formă de baciii, gram-negativi.

Caracteristicile biochimice sunt următoarele:

- sinteza de catalază +;

- sinteza de oxidază +;

- hidrolizează esculina;

- temperatura optimă de cultivare: 25-30°C;

- pH-ul optim de creștere: 6-7;

Procedeul conform invenției constă în aceea că tulpina Rhizobium radiobacter ICCF 410 se supune unui proces de creștere celulară și producere de polizaharid, constând în: faza de preinocul pe un mediu nutritiv agarizat, faza de inocul pe un mediu lichid ce conține glicerină ca sursă de carbon și extract de porumb ca sursă de azot, și faza de biosinteză a rhizobanului pe un mediu submers, ce are o compoziție similară cu cea a inoculului, însă în proporții diferite.

După biosinteză, prelucrarea mediului de fermentație a constat în separarea biomasei prin filtrare, concentrarea sub vid a filtratului, precipitarea cu etanol, separarea și uscarea produsului brut 0a vid, 85°C), până la greutate constantă, urmată de redizolvare, purificarea și concentrarea soluției obținute prin filtrare, purificare prin ultrafiltrare - diafiltrare și izolarea polizaharidului purificat.

Prin cromatografie de lichide de înaltă performanță (HPLC) s-a evidențiat faptul că polizaharidul purificat prezintă o compoziție diferită, spre deosebire de cea a altor polizaharide, fiind compusă din monomeri de acid glucuronic, glucoză și ramnoză.

De asemenea, în urma studiilor realizate în vederea evaluării potențialului citotoxic al polizaharidului numit thizoban asupra liniei de fibroblaste umane (ATCC- PCS-201-012) nu s-au observat efecte citotoxice, ci din contră, o ușoară creștere a viabilității celulare.

Biopolimerul obținut prezintă aplicații potențiale în industria farmaceutică și medicină, ca “sistem inteligent de administrare a medicamentelor” în terapia cancerului și ca matrice pentru ingineria tisulară, în industria cosmetică pentru dezvoltarea formulărilor cosmetice cu potențial de hidratare ridicat, cât și în industria alimentară, ca agent de gelifiere, îngroșare și stabilizare în timpul prelucrării produselor alimentare [2].

Se prezintă în continuare un exemplu de realizare a invenției:

Biosinteză cuprinde cele trei faze caracteristice unui proces microbian, și anume: preinocul, faza de inocul (faza vegetativă) și faza de bioproces, în care are loc biosinteză propriu-zisă.

Faza de preinocul se obține prin creșterea microorganismului pe un mediu nutritiv agarizat ce conține (%, g/v): extract de drojdie 1; peptonă 1; glicerol 5; agar 2. Se corectează pH-ul la valoarea inițială de 6,5-7, sterilizare la temperatura de 115°C, timp de 30 minute. Incubarea are loc la temperatura de 30°C, timp de 48-72 h.

Cultura de Rhizobium radiobacter se preia ușor în apă distilată sterilă.

Faza de inocul se realizează în flacoane Erienmeyer de 500 mL cu 100 mL mediu, compoziția acestuia fiind următoarea (%, g/v): glicerină 1; extract de porumb 1,5; KH2PO4 0,2; NaCl 0,2; MgS04-7H20 0,05. Se corectează pH-ul la valoarea inițială de 6,5-6,7, sterilizare la temperatura de 115°C, timp de 30 minute. Cultivarea durează 24 de ore, prin incubare la 30°C, cu agitare rotativă (200-220 rot./minut).

Mediul de bioproces prezintă următoarea compoziție (%, g/v): glicerină 3,5; extract de porumb 1; KH2PO4 0,07; K2HPO4 0,4; acid citric 0,1; MgS04’7H20 0,05; MnSO4 0,03. Se corectează pH-ul la valoarea inițială de 6,5-6,7, sterilizare la temperatura de 115°C, timp de 30 minute. Incubarea ia zei de bioproces se realizează cu 10% din suspensia microbi ană de inocul. Fermentația se realizează în flacoane Erienmeyer de 500 mL cu 100 mL mediu, la o temperatură de 30°C, timp de 72 h, cu un regim de agitare variabilă de 200-220 rot./minut.

Procesarea post-biosinteză

Mediul de fermentație (1,3 L) rezultat în urma procesului de biosinteză, se diluează cu apă distilată în raport de 1:1 (v/v) și se filtrează, sub vid, pe strat adjuvant de celită. După filtrare, filtratul liber de celule se concentrează la rotaevaporator, sub vid, la maximum 60°C, până la 1/2 din volum, după care se adaugă clorură de potasiu 5%o.

Izolarea produsului brut se realizează prin precipitare cu alcool etilic, în raport de 1:3, urmată de uscarea acestuia într-o etuvă sub vid, în trepte de temperatură, la maximum 85°C.

Polizaharidul brut obținut (7,4 g) se supune apoi procesului de purificare. Acesta se dizolvă în 1,5 L apă distilată, după care se filtrează de impuritățile insolubile pe strat adjuvant de celită.

Filtratul obținut este supus ultrafiltrării-diafiltrării prin membrane polisulfonice cu limita de excludere de 1 OKDa, obținându-se 1,3 L retentat.

Acesta se concentreaz ă la rotaevaporator, de unde se obțin 0,9 L concentrat. Din concentrat, se izolează polizaharidul purificat prin precipitare cu etanol în raport de 1:3, după adăugarea de clorură de potasiu 5%o.

Produsul precipitat se filtrează pe hârtie de filtru și se usucă într-o etuvă sub vid, în trepte de temperatură, la maximum 85°C.

Se obțin 4,1 g produs purificat, conținând ca monomeri acid glucuronic 43,2%, glucoză 32,1% și ramnoză 1,5%.

Claims (2)

1. REVENDICĂRI

   1. Procedeu de biosinteză a rfiizobanului caracterizat prin aceea că o tulpină de Rhizobium radiobacter ICCF 410, nou-izolată din natură, se supune unei fermentații submerse, pe un mediu de cultură ce utilizează ca sursă de carbon glicerina, subprodus al industriei biodieselului, extract de pommb, sămri minerale și acid citric, urmată de separarea și purificarea polizaharidului obținut.
2. 2. Procedeu conform revendicării 1, caracterizat prin aceea că se obține un polizaharid original, numit rhizoban, ce prezintă o compoziție diferită de cea a altor polizaharide microbiene cunoscute, constituită din monomeri de acid glucuronic 40-45%, glucoză 30-35% șiramnoză.