RO133136B1

RO133136B1 - Process for preparing a drug-release system of collagenized textile meshes type

Info

Publication number: RO133136B1
Application number: ROA201700755A
Authority: RO
Inventors: Ştefania Marin; Kaya Mădălina Georgiana Albu; Mihaela Violeta Ghica; Denisa Ioana Udeanu; Vlad Denis Constantin
Original assignee: Institutul Naţional De Cercetare-Dezvoltare Textile Şi Pielărie-Sucursala Institutul De Cercetare Pielărie-Încălţăminte
Priority date: 2017-09-27
Filing date: 2017-09-27
Publication date: 2022-12-30
Also published as: RO133136A2

Description

Invenția se referă la un procedeu de obținere a plaselor textile colagenice și impregnate cu minociclină, utilizate în chirurgia generală pentru tratamentul herniei abdominale.The invention relates to a process for obtaining collagenous textile meshes impregnated with minocycline, used in general surgery for the treatment of abdominal hernia.

Hernia este o afecțiune care apare atunci când peretele abdominal este slăbit sau perforat iar presiunea din interior împinge conținutul abdominal prin această zonă afectată. Herniile abdominale sunt foarte frecvente, în special în rândul bărbaților, iar dacă nu este tratată la timp se poate ajunge la ocluzie intestinală. Pe plan mondial, sunt realizate în fiecare an peste 20 de milioane de operații pentru repararea herniei abdominale, utilizând plase chirurgicale. Cea mai utilizată plasă este cea sintetică, realizată din polipropilenă, datorită capacității sale de a consolida zona afectată însă acest tip de plasă provoacă numeroase reacții negative din partea organismului din cauza lipsei de biocompatibilitate. Se studiază de foarte mulți ani creșterea biocompatibilității plaselor sintetice prin impregnarea acestora cu polimeri naturali ca albumina, gelatina sau colagenul. De-a lungul timpului, a fost studiată utilizarea colagenului, în special a celui de tip I - extras din piele bovină, în impregnarea plaselor textile pentru creșterea gradului de acceptare a acestora de către organism.A hernia is a condition that occurs when the abdominal wall is weakened or perforated and pressure from within pushes the abdominal contents through this affected area. Abdominal hernias are very common, especially among men, and if it is not treated in time it can lead to intestinal occlusion. Worldwide, more than 20 million operations are performed each year to repair abdominal hernias using surgical mesh. The most used mesh is the synthetic one, made of polypropylene, due to its ability to strengthen the affected area, but this type of mesh causes numerous negative reactions from the body due to the lack of biocompatibility. Increasing the biocompatibility of synthetic nets by impregnating them with natural polymers such as albumin, gelatin or collagen has been studied for many years. Over time, the use of collagen, especially type I - extracted from bovine skin, has been studied in the impregnation of textile nets to increase their acceptance by the body.

în momentul intervenției chirugicale de reparare a herniilor abdominale, pot apărea leziuni postoperatorii care trebuie tratate. Tratamentul leziunilor postoperatorii reprezintă în prezent unul dintre cele mai atractive și în continuă dezvoltare domenii de interes, cu atât mai mult cu cât sistemul prezintă cedare topică a medicamentului, oferind avantajul unei cedări medicamentoase locale și îmbunătățite către țesuturile afectate, cu menținerea unei concentrații suficiente și eficiente de medicament. în plus, se evită toxicitatea sistemică și efectele secundare asociate, crescându-se astfel complianța pacientului. îmbunătățirile administrării topice atât a analgezicelor cât și a antibioticelor s-au bazat pe utilizarea unor biopolimeri care asigură un suport adecvat de cedare a substanței active. Medicamentul trebuie să fie încorporat în anumite tipuri de structuri fizice care servesc ca rezervor de medicament sau ca suport de cedare a medicamentului. Polimerii sunt cele mai adecvate vehicule pentru sistemele topice de cedare, un interes crescut fiind acordat colagenului.at the time of surgical intervention to repair abdominal hernias, postoperative injuries may occur that need to be treated. The treatment of postoperative injuries is currently one of the most attractive and continuously developing fields of interest, especially since the system presents topical drug release, offering the advantage of a local and improved drug release to the affected tissues, while maintaining a sufficient concentration and effective medicine. in addition, systemic toxicity and associated side effects are avoided, thus increasing patient compliance. improvements in the topical administration of both analgesics and antibiotics have been based on the use of biopolymers that provide a suitable support for the release of the active substance. The drug must be incorporated into certain types of physical structures that serve as a drug reservoir or drug delivery support. Polymers are the most suitable vehicles for topical delivery systems, with increased interest being given to collagen.

Efectele pozitive ale colagenului asupra regenerării tisulare și interacțiunea acestuia cu celulele sunt motivele principale ale interesului deosebit de crescut pentru tratamentele locale ale țesuturilor afectate sau pentru formarea de țesut nou cum ar fi osul, pielea sau nervul. Utilizând astfel colagenul pentru impregnarea plaselor, în primul rând se îmbunătățește biocompatibilitatea, riscul respingerii de către organism scăzând, și în al doilea rând acesta reprezintă un suport propice înglobării antibioticelor sau antiinflamatoarelor. Așadar, utilizând colagenul, se pot ceda cantități adecvate de medicament, în cazul în care apar complicații postoperatorii, biocompatibilitatea plasei funcționalizate este îmbunătățită, influențând creșterea celulelor, regenerarea țesuturilor, cedarea medicamentului și o bună complianță a pacientului.The positive effects of collagen on tissue regeneration and its interaction with cells are the main reasons for the particularly increased interest in local treatments of damaged tissues or the formation of new tissue such as bone, skin or nerve. Using collagen in this way to impregnate the nets, first of all, the biocompatibility is improved, the risk of rejection by the body decreases, and secondly, it represents a suitable support for incorporating antibiotics or anti-inflammatories. So, by using collagen, adequate amounts of drug can be released, in case of postoperative complications, the biocompatibility of the functionalized mesh is improved, influencing cell growth, tissue regeneration, drug release, and good patient compliance.

Brevetul RU 2011122424 (A) descrie metoda realizării plaselor chirurgicale din mătase, evitând astfel materialele sintetice care scad biocompatibilitatea. în brevetul US 6262332 (B1) este descrisă metoda de colagenare a plaselor textile realizate din materiale sintetice, utilizând colagen non-uman pentru a mări capacitatea de dezvoltare a noului țesut. O colagenare similară este prezentată în brevetul US 2017143872 (A1), însă în cazul acesta se dorește păstrarea în totalitate a structurii plasei, astfel că sunt introduse ace în pori pentru a se evita acoperirea acestora după impregnare. Acestea sunt extrase ulterior, iar acoperirea cu colagen se face în totalitate doar pe suprafața sintetică. Cu toate acestea nu este rezolvată problema complicațiilor postoperatorii din cauza lipsei unui antibiotic introdus în structura plaselor. Alte tipuri de impregnări ale plaselor chirurgicale sintetice sunt prezentate și în brevetul US 2013110137 (A1) în cazul căruia suprafața este acoperită cu o soluție realizată din colagen pentru biocompatibilitate și cu heparină caPatent RU 2011122424 (A) describes the method of making silk surgical nets, thus avoiding synthetic materials that reduce biocompatibility. US patent 6262332 (B1) describes the method of collagenizing textile meshes made of synthetic materials, using non-human collagen to increase the capacity of new tissue development. A similar collagenization is presented in the patent US 2017143872 (A1), but in this case it is desired to completely preserve the structure of the mesh, so needles are inserted into the pores to avoid covering them after impregnation. They are extracted later, and the collagen coating is done entirely on the synthetic surface only. However, the problem of postoperative complications due to the lack of an antibiotic introduced into the mesh structure is not solved. Other types of impregnations of synthetic surgical meshes are also presented in US patent 2013110137 (A1) in which the surface is covered with a solution made of collagen for biocompatibility and with heparin as

RO 133136 Β1 anticoagulant. O plasă chirurgicală care încearcă să înlăture componenta sintetică în 1 totalitate este prezentată în brevetul EP 1389450 (A1) în care se propune realizarea unei plase în totalitate din colagen sub formă de membrană în interiorul căreia se produc 3 numeroase găuri astfel încât să preia structura unei plase sintetice, însă în acest caz intervine problema rezistenței mecanice apărute din cauza lipsei componentei sintetice. 5 Problema pe care o rezolvă invenția constă în prezentarea unui procedeu de obținere a unui sistem de eliberare a medicamentelor de tip plase textile colagenice. 7RO 133136 Β1 anticoagulant. A surgical mesh that tries to completely remove the synthetic component is presented in patent EP 1389450 (A1) in which it is proposed to make a mesh entirely of collagen in the form of a membrane inside which 3 numerous holes are produced so that it takes the structure of a synthetic nets, but in this case the problem of mechanical resistance arises due to the lack of the synthetic component. 5 The problem that the invention solves consists in the presentation of a method for obtaining a collagen textile mesh-type drug release system. 7

Procedeul de obținere a unui sistem de eliberare a medicamentelor de tip plase textile colagenice, conform invenției, înlătură dezavantajele de mai sus prin aceea că 9 colagenul fibrilar de tip I, obținut din dermă bovină sub formă de gel, cu structură de triplu helix, cu conținut de 1,1...2,3% colagen substanță uscată se amestecă cu 0,1...0,8% mino- 11 ciclină solubilizată în prealabil cu soluție de hidroxid de sodiu 1M și 0,15...0,9% glutaraldehidă și formează o compoziție de colagenare care va fi utilizată sub formă de soluție 13 0,2...0,3% în apă distilată, în care sunt imersate plasele sintetice apoi aceste plase se lasă la uscat 24 h, în continuare etapa de imersare este repetată de mai multe ori pentru a crește 15 grosimea stratului de colagen cu minociclină și în final se realizează fixarea prin imersarea plaselor în soluție de alcool etilic 10%, obținându-se plasele colagenice de culoare galbenă 17 care sunt impregnate cu minociclină.The process of obtaining a collagen textile mesh-type drug release system, according to the invention, removes the above disadvantages by the fact that type I fibrillar collagen, obtained from bovine dermis in the form of a gel, with a triple helix structure, with content of 1.1...2.3% collagen dry substance is mixed with 0.1...0.8% minocycline previously solubilized with 1M sodium hydroxide solution and 0.15...0 .9% glutaraldehyde and forms a collagenizing composition that will be used as a solution 13 0.2...0.3% in distilled water, in which the synthetic nets are immersed then these nets are left to dry for 24 h, in next, the immersion step is repeated several times to increase the thickness of the collagen layer with minocycline and finally the fixation is carried out by immersing the nets in 10% ethyl alcohol solution, obtaining yellow collagen nets 17 that are impregnated with minocycline.

Prin aplicarea invenției s-au obținut următoarele avantaje: 19By applying the invention, the following advantages were obtained: 19

- realizarea unui tratament cu aplicare locală pentru hernia abdominală sau infecții postoperatorii, sub forma unor sisteme de eliberare a medicamentelor, manifestate prin 21 cedarea controlată a minociclinei dintr-un film polimeric realizat dintr-un polimer natural, colagenul, adăugat pe suprafața plasei sintetice; 23- the realization of a treatment with local application for abdominal hernia or postoperative infections, in the form of drug release systems, manifested by the controlled release of minocycline from a polymer film made from a natural polymer, collagen, added to the surface of the synthetic mesh; 2. 3

- utilizarea sistemelor de cedare topică este mult mai avantajoasă comparativ cu administrarea sistemică deoarece sunt evitate limitările impuse de efectul primului pasaj 25 hepatic și eliminate riscurile și inconvenientele terapiei intravenoase;- the use of topical release systems is much more advantageous compared to systemic administration because the limitations imposed by the effect of the first hepatic passage are avoided and the risks and inconveniences of intravenous therapy are eliminated;

- plasele sintetice colagenate furnizează un mediu propice regenerării țesuturilor, sunt 27 biocompatibile, biodegradabile în timp permițând celulelor să-și sintetizeze propria matrice într-o perioadă de câteva luni, netoxice și eliberează medicamentul (minociclină) controlat. 29 - sistemul de cedare a medicamentelor sub formă de plase colagenate impregnate cu minociclină, odată introduse în organism pentru tratarea herniilor abdominale, au 31 capacitatea de a ajuta la regenerarea țesutului lezat, datorită colagenului care acoperă plasa sintetică, biocompatibilitatea fiind superioară. în același timp, în mod controlat, medicamentul 33 (antibiotic cu spectru larg - minociclină) este eliberat având rolul de a distruge microorganismele din țesuturile infectate, în timp ce colagenul, regenerează țesutul lezat. 35 în continuare se prezintă invenția în detaliu în legătură cu fig. 1...6 care reprezintă:- synthetic collagenous meshes provide an environment conducive to tissue regeneration, are 27 biocompatible, biodegradable over time allowing cells to synthesize their own matrix over a period of several months, non-toxic and release the drug (minocycline) in a controlled manner. 29 - the drug delivery system in the form of minocycline-impregnated collagen meshes, once introduced into the body to treat abdominal hernias, have the 31 ability to help regenerate damaged tissue, thanks to the collagen that covers the synthetic mesh, the biocompatibility being superior. at the same time, in a controlled manner, drug 33 (broad-spectrum antibiotic - minocycline) is released with the role of destroying the microorganisms in the infected tissues, while the collagen regenerates the damaged tissue. 35 further presents the invention in detail in connection with fig. 1...6 which represent:

- fig. 1, prezintă profilele cinetice cumulate de cedare in vitro ale minociclinei din 37 plasele colagenate, redate comparativ ca procent cumulat de medicament cedat în funcție de timp;39- fig. 1, shows the cumulative in vitro release kinetic profiles of minocycline from the 37 collagen meshes, rendered comparatively as the cumulative percentage of drug released as a function of time;39

- fig. 2, prezintă influența numărului de straturi/imersări al plasei în gelul compozit asupra procentului cumulat de minociclină cedat;41- fig. 2, shows the influence of the number of layers/immersions of the mesh in the composite gel on the cumulative percentage of minocycline yielded;41

- fig. 3, prezintă influența cantității de minociclină din gelul compozit asupra procentului de minociclină cedat;43- fig. 3, shows the influence of the amount of minocycline in the composite gel on the yielded minocycline percentage;43

- fig. 4, prezintă evoluția leziunilor superficiale la nivelul pielii în urma tratamentului cu plasa colagenată 6;45- fig. 4, shows the evolution of superficial skin lesions following collagen mesh treatment 6;45

- fig. 5, prezintă evoluția leziunilor de severitate medie induse prin arsură în urma tratamentului cu plasa colagenată 6;47- fig. 5, shows the evolution of medium-severity burn-induced injuries following collagen mesh treatment 6;47

- fig. 6, prezintă evoluția procesului de cicatrizare al leziunilor induse prin arsură la animalele de experiență în urma tratamentului cu plasa colagenată 6.49- fig. 6, shows the evolution of the healing process of burn-induced lesions in experimental animals following treatment with collagen mesh 6.49

RO 133136 Β1RO 133136 Β1

Având în vedere incidența mare a herniilor abdominale, problema tehnică pe care o rezolvă invenția constă în realizarea unui sistem de eliberare controlată a unui medicament (minociclină) dintr-un suport polimeric sub formă de plasă colagenată și reticulată astfel încât eliberarea medicamentului și degradarea filmului colagenic, să se facă în același timp, controlat, și să asigure tratamentul posibilei infecții, dar și regenerarea țesutului lezatîn urma intervenției chirurgicale.Considering the high incidence of abdominal hernias, the technical problem that the invention solves consists in creating a system for the controlled release of a drug (minocycline) from a polymeric support in the form of a collagenized and cross-linked mesh so that the release of the drug and the degradation of the collagen film , to be done at the same time, controlled, and to ensure the treatment of the possible infection, but also the regeneration of the damaged tissue following the surgical intervention.

Plasele textile colagenate, conform invenției înlătură dezavantajele menționate prin aceea că soluția de colagenare este alcătuită din următoarele componente, exprimate în procente gravimetrice raportate la 100% colagen substanță uscată: a) un polimer natural, colagen fibrilar tip I, obținut din dermă bovină, sub formă de gel, cu structură de triplu helix, cu un conținut de 1,1 ...2,3% colagen substanță uscată, b) 0,1 ...0,8% minociclină, solubilizată în prealabil în soluție de hidroxid de sodiu 1M, se amestecă în colagenul gel, și c) 0,15...0,9% agent de reticulare, glutaraldehida care se amestecă în compoziția finală sub formă de soluție 0,2...0,3% în apă distilată.The collagenized textile nets, according to the invention, remove the disadvantages mentioned in that the collagenizing solution is made up of the following components, expressed in gravimetric percentages related to 100% collagen dry substance: a) a natural polymer, type I fibrillar collagen, obtained from bovine dermis, under gel form, with a triple helix structure, with a content of 1.1 ... 2.3% collagen dry substance, b) 0.1 ... 0.8% minocycline, previously solubilized in hydroxide solution 1M sodium, mixed into the collagen gel, and c) 0.15...0.9% cross-linking agent, glutaraldehyde which is mixed into the final composition as a 0.2...0.3% solution in distilled water .

Procedeul de obținere a plaselor colagenate impregnate cu minociclină constă în aceea că, în prealabil gelul de colagen se amestecă cu soluția de minociclină, se omogenizează, se ajustează pH-ul la 7,4 cu hidroxid de sodiu 1M și se adaugă apă distilată până ce compoziția finală conține 1,1% colagen substanță uscată și se adaugă agent de reticulare. în compoziția obținută sub formă de gel colagen-minociclină reticulat se imersează plasele sintetice apoi se lasă la uscat, 24 h, pentru formarea filmului pe suprafața acestora, realizându-se apoi imersări repetate pentru a crește grosimea stratului de colagen cu minociclină.The procedure for obtaining minocycline-impregnated collagen meshes consists in the fact that, beforehand, the collagen gel is mixed with the minocycline solution, it is homogenized, the pH is adjusted to 7.4 with 1M sodium hydroxide and distilled water is added until the final composition contains 1.1% collagen dry matter and crosslinking agent is added. synthetic nets are immersed in the composition obtained in the form of a crosslinked collagen-minocycline gel, then left to dry for 24 h, for the formation of the film on their surface, and repeated immersions are then carried out to increase the thickness of the collagen layer with minocycline.

Pentru a demonstra capacitatea de eliberare controlată a medicamentelor, cedarea minociclinei a fost simulată în soluție tampon fosfat la un pH de 7,4 și temperatura de 37°C și a fost studiată influența concentrației de medicament și a procesului de acoperire a plaselor sintetice (numărul de straturi/imersări) asupra profilelor cinetice de cedare a medicamentului.To demonstrate the ability of controlled drug release, the release of minocycline was simulated in phosphate buffer solution at a pH of 7.4 and temperature of 37°C, and the influence of drug concentration and coating process of synthetic meshes was studied (number of layers/immersions) on the drug release kinetic profiles.

Profilele cinetice cumulate de cedare in vitro ale minociclinei din plasele colagenate sunt prezentate comparativ ca procent cumulat de medicament cedat în funcție de timp în fig. 1.Cumulative in vitro release kinetic profiles of minocycline from collagen meshes are shown comparatively as cumulative percentage of drug released as a function of time in Fig. 1.

în fig. 2, este prezentată spre exemplificare influența numărului de straturi/imersări asupra procentului de minociclină cedat.in fig. 2, the influence of the number of layers/immersions on the yielded percentage of minocycline is presented as an example.

în fig. 3, este prezentată spre exemplificare influența cantității de minociclină din gelul compozit asupra procentului de minociclină cedat.in fig. 3, the influence of the amount of minocycline in the composite gel on the yielded minocycline percentage is shown as an example.

Din examinarea figurilor se poate constata faptul că cedarea antibioticului este rapidă în primele 60 min, apoi medicamentul este cedat lent și gradual, pe parcursul a încă 300 min. Astfel de profile cinetice sunt de urmărit în proiectarea unor plase încărcate cu antibiotic destinate utilizării în chirurgia generală pentru tratamentul herniei abdominale. Aceasta întrucât primele ore sunt critice în controlul invaziei și multiplicării bacteriene și în plus bacteriile prezente de la nivelul leziunii pot produce un biofilm rezistent la acțiunea agenților antimicrobieni. Cedarea rapidă a antibioticului, după contactul plasei colagenate cu fluidul biologic de la locul de aplicare, asigură o diminuare rapidă a bacteriilor. Pe de altă parte, cedarea treptată a medicamentului asigură protecție antibacteriană pe perioadă mai lungă necesară vindecării.From the examination of the figures, it can be seen that the release of the antibiotic is rapid in the first 60 min, then the drug is released slowly and gradually, during another 300 min. Such kinetic profiles are to be pursued in the design of antibiotic-loaded meshes intended for use in general surgery for the treatment of abdominal hernia. This is because the first hours are critical in controlling bacterial invasion and multiplication, and in addition the bacteria present at the level of the lesion can produce a biofilm resistant to the action of antimicrobial agents. The rapid release of the antibiotic, after the contact of the collagen mesh with the biological fluid at the application site, ensures a rapid reduction of bacteria. On the other hand, the gradual release of the drug provides antibacterial protection for the longer period necessary for healing.

Pentru determinarea mecanismului de cedare a minociclinei din suporturile de tip plase proiectate s-a utilizat modelul legii puterii (ecuația 1):The power law model (equation 1) was used to determine the release mechanism of minocycline from the designed mesh supports:

^=k-tⁿ (D^=kt ⁿ (D

RO 133136 Β1RO 133136 Β1

unde m_t este cantitatea de substanță activă cedată la momentul t, m - cantitatea totală de substanță activă din suporturile proiectate, m_t/m - fracția cedată de medicament la timpu t, k - constanta cinetică, n - exponentul de cedare. Valorile coeficientului de determinare pentru modelul legii puterii obținute la cedarea minociclinei din sistemele compozite de tip plase, parametrii cinetici specifici modelului legi puterii și procentul de medicament cedat sunt prezentate în tabelul următor:where m _t is the amount of active substance released at time t, m - the total amount of active substance from the designed supports, m _t /m - the fraction of the drug released at time t, k - the kinetic constant, n - the release exponent. The values of the coefficient of determination for the power law model obtained for the release of minocycline from the composite mesh systems, the kinetic parameters specific to the power law model and the percentage of drug released are presented in the following table: 1 3 5 7 9 1 3 5 7 9 Sisteme de tip plase de cedare a minociclinei Minocycline release mesh systems Coeficientul de determinare pentru modelul legii puterii The coefficient of determination for the power law model Exponentul de cedare The yield exponent Constanta cinetică (1/minⁿ)Kinetic constant (1/min ⁿ ) % cedat % yielded Exemplul 1 Example 1 0,9854 0.9854 0,33 0.33 0,121 0.121 80,53 80.53 11 11 Exemplul 2 Example 2 0,9889 0.9889 0,29 0.29 0,162 0.162 85,62 85.62 Exemplul 3 Example 3 0,9758 0.9758 0,19 0.19 0,327 0.327 92,52 92.52 13 13 Exemplul 4 Example 4 0,9874 0.9874 0,18 0.18 0,310 0.310 87,09 87.09 Exemplul 5 Example 5 0,9995 0.9995 0,27 0.27 0,174 0.174 84,43 84.43 15 15 Exemplul 6 Example 6 0,9907 0.9907 0,20 0.20 0,291 0.291 90,27 90.27 Exemplul 7 Example 7 0,9988 0.9988 0,21 0.21 0,264 0.264 86,32 86.32 17 17

Profilele de cedare ale minociclinei din plasele colagenate, dar și mecanismul cinetic 19 sunt influențate de numărul de straturi/imersări al plasei în gelul compozit și de concentrația de medicament. Prin modularea numărului de straturi/imersări și a concentrației de mino- 21 ciclină se poate controla cantitatea de medicament cedat, în vederea obținerii unor sisteme de cedare care să asigure o eliberare optimă a medicamentului în raport cu locul de aplicare 23 și indicația terapeutică.The release profiles of minocycline from collagen meshes but also the kinetic mechanism 19 are influenced by the number of layers/immersions of the mesh in the composite gel and the drug concentration. By modulating the number of layers/immersions and minocycline concentration, the amount of released drug can be controlled, in order to obtain release systems that ensure an optimal release of the drug in relation to the application site 23 and the therapeutic indication.

Plasa impregnată cu colagen și minociclină a fost testată în vederea stabilirii 25 toleranței cutanate și a identificării unor posibile reacții adverse locale în două modele experimentale de leziuni cutanate la animale de experiență. Pentru modelul experimental s- 27 au folosit șobolani Wistar procurați de la Biobaza Universității de Medicină și Farmacie „Carol Davila, București. Experimentul s-a desfășurat conform Directivei 2010/63/UE a Consiliului 29 European privind protecția animalelor utilizate în scopuri științifice și a Legii nr. 43, adoptată de Parlamentul României la data de 11/04/2014. Pentru studiul in vivo s-au utilizat 20 de 31 șobolani Wistar în greutate de 180 ± 10 g care au fost ținuți în condiții standard de laborator, hrăniți de două ori pe zi și au primit apă ad libitum. Animalelor li s-a îndepărtat blana de pe 33 partea dorsală iar leziunile au fost induse în urma anestezierii animalelor cu eter etilic. Animalele luate în studiu au fost împărțite în 4 loturi a câte 5 indivizi. 35The mesh impregnated with collagen and minocycline was tested to establish skin tolerance and to identify possible local adverse reactions in two experimental models of skin lesions in experimental animals. For the experimental model s-27 they used Wistar rats procured from the Biobase of the "Carol Davila" University of Medicine and Pharmacy, Bucharest. The experiment was carried out according to Directive 2010/63/EU of the European Council 29 on the protection of animals used for scientific purposes and Law no. 43, adopted by the Romanian Parliament on 04/11/2014. For the in vivo study, 20 of 31 Wistar rats weighing 180 ± 10 g were used, which were kept under standard laboratory conditions, fed twice a day and given water ad libitum. The fur on the animals' backs was removed and the lesions were induced by anesthetizing the animals with ethyl ether. The animals taken in the study were divided into 4 groups of 5 individuals. 35

Pentru inducerea unei leziuni cutanate superficiale s-a îndepărtat chirurgical epidermul la două loturi de animale, un lot martor netratat, iar cel de al doilea lot a fost tratat 37 cu plasa colagenată 6 (exemplul 6) fixată cu plasture de mătase imediat după inducerea leziunii. 39In order to induce a superficial skin lesion, the epidermis was surgically removed from two groups of animals, an untreated control group, and the second group was treated 37 with collagen mesh 6 (example 6) fixed with a silk patch immediately after the induction of the lesion. 39

Al doilea model experimental a presupus inducerea unei leziuni de severitate medie prin arsură. Leziunile au fost realizate cu ajutorul unui dispozitiv metalic cu diametrul de 10 41 mm încălzit într-o soluție de ser fiziologic la fierbere aplicat timp de 10 s în zona dorsală epilată. Peste zona lezată a fost aplicată plasa colagenată 6 (exemplul 6) care a fost fixată 43 cu o bandă adezivă de mătase. în paralel s-a utilizat un lot martor netratat.The second experimental model involved the induction of a moderate burn injury. The lesions were made using a metal device with a diameter of 10 41 mm heated in a boiling saline solution applied for 10 s to the depilated dorsal area. Collagen mesh 6 (Example 6) was applied over the injured area and secured 43 with a silk adhesive tape. in parallel, an untreated control lot was used.

RO 133136 Β1RO 133136 Β1

Animalele au fost monitorizate și pentru identificarea posibilelor reacții adverse topice sau sistemice în urma aplicării plasei colagenate la nivelul pielii lezate în vederea utilizării ulterioare a acestor sisteme farmaceutice în scop chirurgical.The animals were also monitored to identify possible topical or systemic adverse reactions following the application of the collagen mesh to the damaged skin with a view to the subsequent use of these pharmaceutical systems for surgical purposes.

Evoluția morfologică a leziunilor a fost înregistrată cu ajutorul unui aparat de fotografiat Olympus SP-590UZ. Leziunile au fost considerate vindecate în momentul căderii crustei. în cazul leziunilor induse prin arsură diametrul rănilor a fost determinat pe o perioadă de 10 zile. Procesul de vindecare a rănilor provocate prin arsură a fost calculat cu ajutorul ecuației (2) și prezentat în fig. 6:The morphological evolution of the lesions was recorded using an Olympus SP-590UZ camera. Lesions were considered healed when the crust fell off. in the case of burn-induced lesions, the diameter of the wounds was determined over a period of 10 days. The burn wound healing process was calculated using equation (2) and shown in fig. 6:

% Pr oces de vindecare =% Healing process =

Dinitial - DtInitial - Dt

Dinitial *100 (2) unde D este diametrul leziunii, în prima zi de tratament (D inițial, t = 0) sau la momentul t (Dt) corespunzător zilelor 3, 5 sau 10 de tratament.Initial *100 (2) where D is the diameter of the lesion, on the first day of treatment (initial D, t = 0) or at time t (Dt) corresponding to days 3, 5 or 10 of treatment.

Imaginile macroscopice ale leziunilor experimentale superficiale și de severitate medie induse la șobolani sunt prezentate în fig. 4 și respectiv fig. 5.Macroscopic images of superficial and medium-severity experimental lesions induced in rats are shown in fig. 4 and respectively fig. 5.

în cazul leziunilor superficiale, tratamentul cu plasa 6 induce o cicatrizare mai rapidă a rănilor după 3 zile de la aplicarea membranei colagenate. Epiteliul este complet refăcut după 5 zile de la aplicarea tratamentului comparativ cu lotul martor la care procesul de cicatrizare este prelungit, vindecarea completă depășind 7 zile.In the case of superficial lesions, the treatment with mesh 6 induces a faster healing of the wounds after 3 days after the application of the collagenous membrane. The epithelium is completely restored after 5 days from the application of the treatment compared to the control group in which the healing process is prolonged, complete healing exceeding 7 days.

în cazul leziunilor de severitate medie induse prin arsură, se observă la momentul inițial apariția unei escare de culoare albă cu afectarea atât a epidermului cât și a dermului. Zona lezată devine hiperemică după câteva ore datorită extravazării eritrocitare, treptat leziunea se acoperă cu o crustă, iar procesul de vindecare este considerat complet în momentul desprinderii acesteia de pe leziune. în cazul aplicării plasei colagenate 6 direct pe leziune, diametrul rănii scade cu 20% după primele 3 zile, iar procesul de vindecare este de 50% după 5 zile de tratament. Crusta formată în acest caz este mai puțin vizibilă comparativ cu lotul martor în primele 7 zile, procesul de vindecare este complet după 10 zile de la inducerea leziunii. în cazul lotului martor diametrul leziunii scade cu 10% în primele 3 zile, un proces inflamator local se instituie treptat încetinind procesul de vindecare. Crusta formată este vizibilă, mai groasă decât în cazul lotului tratat, iar procesul de vindecare completă depășește 10 zile.in the case of medium-severity burn-induced lesions, the appearance of a white eschar with damage to both the epidermis and the dermis is observed initially. The injured area becomes hyperemic after a few hours due to erythrocyte extravasation, gradually the lesion is covered with a crust, and the healing process is considered complete at the moment of its detachment from the lesion. in the case of applying collagen mesh 6 directly on the lesion, the diameter of the wound decreases by 20% after the first 3 days, and the healing process is 50% after 5 days of treatment. The crust formed in this case is less visible compared to the control group in the first 7 days, the healing process is complete after 10 days from the induction of the lesion. in the case of the control group, the diameter of the lesion decreases by 10% in the first 3 days, a local inflammatory process is gradually established, slowing down the healing process. The crust formed is visible, thicker than in the case of the treated lot, and the complete healing process exceeds 10 days.

în concluzie, aplicarea plasei colagenate 6 a avut efect benefic în evoluția și vindecarea a două modele de leziuni superficiale și de severitate medie induse experimental la șobolanii Wistar. La animalele de experiență luate în studiu nu s-au observat reacții adverse locale sau sistemice în urma aplicării tratamentului topic, plasele fiind ușor tolerate și cu efecte benefice în procesul de vindecare a acestor tipuri de leziuni.In conclusion, the application of collagen mesh 6 had a beneficial effect on the evolution and healing of two models of superficial and medium-severity lesions experimentally induced in Wistar rats. In the experimental animals taken in the study, no local or systemic adverse reactions were observed following the application of the topical treatment, the nets being easily tolerated and with beneficial effects in the healing process of these types of injuries.

Colagenul are rolul de a regenera țesuturile, iar minociclina este un antibiotic cu spectru larg de acțiune și este recomandat în tratamentul infecțiilor postoperatorii.Collagen has the role of regenerating tissues, and minocycline is a broad-spectrum antibiotic and is recommended in the treatment of postoperative infections.

Gelul de colagen fibrilar tip I obținut din piele bovină, cu pH acid, 2...3,5, având o concentrație de colagen de 1,1...2,3% (g/g) este utilizat în această invenție. în analiza calitativă și cantitativă, cenușa și grăsimea trebuie să fie nedetectabile. Minociclina utilizată în această invenție este un medicament comercial ce trebuie să aibă o puritate de peste 97%. Agentul de reticulare este aldehida glutarică care trebuie să fie 0,15...0,9% raportat la conținutul de colagen.Type I fibrillar collagen gel obtained from bovine skin, with acidic pH, 2...3.5, having a collagen concentration of 1.1...2.3% (w/w) is used in this invention. in qualitative and quantitative analysis, ash and fat must be undetectable. The minocycline used in this invention is a commercial drug that must have a purity of more than 97%. The crosslinking agent is glutaric aldehyde which must be 0.15...0.9% relative to the collagen content.

în continuare se prezintă 7 exemple de realizare a invenției:7 examples of the invention are presented below:

Exemplul 1 în această invenție a fost utilizat un gel de colagen fibrilar tip I cu o concentrație gravimetrică de 2,37%, 97,5% apă și pH-ul de aproximativ 2...3. O soluție de minociclină a fost preparată anterior prin amestecarea a 0,2% minociclină (raportat la gelul de colagen)Example 1 In this invention, a type I fibrillar collagen gel with a gravimetric concentration of 2.37%, 97.5% water and a pH of about 2...3 was used. A minocycline solution was previously prepared by mixing 0.2% minocycline (relative to the collagen gel)

RO 133136 Β1 cu soluție de hidroxid de sodiu 1M. Soluția de minociclină obținută a fost încorporată în gel, 1 iar pH-ul a fost ajustat la 7,4 cu 1M hidroxid de sodiu și a fost adăugată apă distilată până când compoziția finală a avut 1,1% colagen, apoi a fost reticulată cu 0,5% glutaraldehidă. 3 Plasele sintetice au fost tăiate cu dimensiunea de 3 x 3 cm, și introduse în gelul de colagen cu minociclină după care au fost puse la uscat timp de 24 h. Etapa finală a fost de fixare, 5 timp de 3 min prin imersarea plaselor în soluție de alcool etilic 10%.RO 133136 Β1 with 1M sodium hydroxide solution. The resulting minocycline solution was incorporated into the gel, 1 and the pH was adjusted to 7.4 with 1M sodium hydroxide and distilled water was added until the final composition had 1.1% collagen, then cross-linked with 0.5% glutaraldehyde. 3 The synthetic meshes were cut to the size of 3 x 3 cm, and inserted into the collagen gel with minocycline after which they were left to dry for 24 h. The final step was fixation, 5 for 3 min by immersing the meshes in 10% ethyl alcohol solution.

Exemplul 2 7Example 2 7

Gelul compozit pe bază de colagen și minociclină a fost obținut prin procesul descris în exemplul 1 exceptând numărul de imersări ale plaselor în gelul obținut. în acest proces 9 plasele au fost imersate de 3 ori la intervale de 24 h obținându-se astfel un strat triplu comparativ cu plasele obținute în exemplul 1. Etapa finală de fixare s-a realizat conform 11 exemplului 1.The composite gel based on collagen and minocycline was obtained by the process described in example 1 except for the number of immersions of the nets in the obtained gel. in this process 9 the nets were immersed 3 times at 24 h intervals thus obtaining a triple layer compared to the nets obtained in example 1. The final fixing stage was carried out according to 11 example 1.

Exemplul 3 13Example 3 13

Gelul compozit pe bază de colagen și minociclină a fost obținut prin procesul descris în exemplul 1 exceptând procentul de minociclină utilizat, care a fost 0,6% (raportat la 15 colagen substanță uscată). Procesul de acoperire a plaselor sintetice a fost similar cu cel descris în exemplul 1. Etapa finală de fixare s-a realizat conform exemplului 1. 17The composite gel based on collagen and minocycline was obtained by the process described in example 1 except for the percentage of minocycline used, which was 0.6% (based on collagen dry matter). The process of covering the synthetic nets was similar to that described in example 1. The final fixing step was carried out according to example 1. 17

Exemplul 4Example 4

Gelul compozit pe bază de colagen și minociclină a fost obținut prin procesul descris 19 în exemplul 3. Procesul de acoperire a plaselor sintetice a fost similar cu cel descris în exemplul 2. Etapa finală de fixare s-a realizat conform exemplului 1. 21The composite gel based on collagen and minocycline was obtained by the process described 19 in example 3. The process of covering the synthetic meshes was similar to that described in example 2. The final fixation step was carried out according to example 1. 21

Exemplul 5Example 5

Gelul compozit pe bază de colagen și minociclină a fost obținut prin procesul descris 23 în exemplul 1 exceptând procentul de minociclină utilizat, care a fost 0,4% (raportat la colagen substanță uscată). Procesul de acoperire a plaselor sintetice a fost similar cu cel 25 descris în exemplul 4. Etapa finală de fixare s-a realizat conform exemplului 1.The collagen and minocycline composite gel was obtained by the process described in Example 1 except for the percentage of minocycline used, which was 0.4% (based on collagen dry matter). The process of covering the synthetic nets was similar to that described in example 4. The final fixing step was carried out according to example 1.

Exemplul 6 27Example 6 27

Gelul compozit pe bază de colagen și minociclină a fost obținut prin procesul descris în exemplul 4. Procesul de acoperire a plaselor sintetice a fost similar cu cel descris în 29 exemplul 5 exceptând numărul de imersări realizate, în acest caz plasa sintetică imersânduse în gelul de colagen cu minociclină de două ori. Etapa finală de fixare s-a realizat conform 31 exemplului 1.The composite gel based on collagen and minocycline was obtained by the process described in example 4. The process of coating the synthetic meshes was similar to that described in example 5 except for the number of immersions performed, in this case the synthetic mesh was immersed in the collagen gel with minocycline twice. The final fixation step was carried out according to example 1.

Exemplul 7 33Example 7 33

Gelul compozit pe bază de colagen și minociclină a fost obținut prin procesul descris în exemplul 5. Procesul de acoperire a plaselor sintetice a fost similar cu cel descris în 35 exemplul 6. Etapa finală de fixare s-a realizat conform exemplului 1.The composite gel based on collagen and minocycline was obtained by the process described in example 5. The process of covering the synthetic meshes was similar to that described in example 6. The final fixation step was carried out according to example 1.

Plasa sintetică colagenată și impregnată cu minociclină obținută în această invenție 37 este un sistem de eliberare controlată a unui medicament (minociclină) dintr-un film polimeric natural (colagenul) reticulat astfel încât eliberarea medicamentului și degradarea filmului, să 39 se facă în același timp, controlat, și să asigure pe de-o parte tratamentul infecției și pe de altă parte regenerarea țesutului lezat în cazul intervenției chirurgicale. 41The collagenized and minocycline-impregnated synthetic mesh obtained in this invention 37 is a system for the controlled release of a drug (minocycline) from a cross-linked natural polymer film (collagen) so that drug release and degradation of the film occur at the same time, controlled, and to ensure on the one hand the treatment of the infection and on the other hand the regeneration of the damaged tissue in case of surgical intervention. 41

Claims

1 Claim

3 Process for obtaining a collagen textile mesh-type drug release system, characterized in that the type I fibrillar collagen, obtained from bovine dermis 5 in the form of a gel, with a triple helix structure, with a content of 1.1 ...2.3% collagen dry substance is mixed with 0.1...0.8% minocycline previously solubilized with hydroxide solution

7 of 1M sodium and 0.15...0.9% glutaraldehyde and form a collagenizing composition to be used as a 0.2...0.3% solution in distilled water, in which the meshes are immersed

9 synthetic then these nets are left to dry for 24 h, then the immersion step is repeated several times to increase the thickness of the collagen layer with minocycline and finally 11 the fixation is carried out by immersing the nets in 10% ethyl alcohol solution, obtaining - yellow collagen meshes that are impregnated with minocycline.