RO128587B1 - Mulberry tree - morus spp. vitroplantules inoculated with endomycorrhizae of the vesicular-arbuscular type intended for cultivating lead-contaminated soils and process for obtaining the same - Google Patents

Mulberry tree - morus spp. vitroplantules inoculated with endomycorrhizae of the vesicular-arbuscular type intended for cultivating lead-contaminated soils and process for obtaining the same Download PDF

Info

Publication number
RO128587B1
RO128587B1 ROA201100916A RO201100916A RO128587B1 RO 128587 B1 RO128587 B1 RO 128587B1 RO A201100916 A ROA201100916 A RO A201100916A RO 201100916 A RO201100916 A RO 201100916A RO 128587 B1 RO128587 B1 RO 128587B1
Authority
RO
Romania
Prior art keywords
mulberry
endomycorrhizae
inoculated
arbuscular
vesicular
Prior art date
Application number
ROA201100916A
Other languages
Romanian (ro)
Other versions
RO128587A2 (en
Inventor
Cristiana Diaconescu
Doina Tănase
Maria Ichim
Laura Urdeş
Georgeta Diniţă
Răzvan Popa
Adriana Vişan
Liviu-Ionel Ichim
Ramona Enache
Original Assignee
Universitatea De Ştiinţe Agronomice Şi Medicină Veterinară Din Bucureşti
Bioing S.A.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Universitatea De Ştiinţe Agronomice Şi Medicină Veterinară Din Bucureşti, Bioing S.A. filed Critical Universitatea De Ştiinţe Agronomice Şi Medicină Veterinară Din Bucureşti
Priority to ROA201100916A priority Critical patent/RO128587B1/en
Publication of RO128587A2 publication Critical patent/RO128587A2/en
Publication of RO128587B1 publication Critical patent/RO128587B1/en

Links

Landscapes

  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

The present invention relates to a seedling material consisting of mulberry vitroplantules colonized with endomycorrhizae of the vesicular-arbuscular type for at least 15% of the root biomass preserving the genetic characteristics of the parental forms while exhibiting higher bioproductive parameters and physiologic tolerance in lead-contaminated soils. The invention also relates to a process for preparing seedling material consisting in in-vitro multiplication of nodal explants resulting from stimulated sprouts of dormant shoots, using the culture medium MS, the multiplication hormones BAP and KIN, the rooting hormone IBA, after which the vitroplantules are inoculated with raw inoculum resulting from the root biomass of maize or onion plants or with commercial biofertilizers, the colonization being controlled and the colonized vitroplantules being selected from the replication field.

Description

Invenția se referă la un nou material săditor, reprezentat de vitroplantule de dudThe invention relates to a new planting material, represented by mulberry seedlings

Morus sp. inoculate cu endomicorize de tip vezicular-arbuscular, și la un procedeu de obținere a acestuia, prin metode biotehnologice, acesta urmând a fi utilizat pentru cultivare pe solurile contaminate cu plumb, și pentru practicarea sericiculturii, respectiv, pentru obținerea gogoșilor de mătase de la specia Bombyx mori L., destinate industriei textile.Morus sp. inoculated with vesicular-arbuscular endomycorrhizae, and in a process of obtaining it, by biotechnological methods, which will be used for cultivation on lead-contaminated soils, and for practicing sericulture, respectively, for obtaining silk donuts of the species Bombyx mori L., intended for the textile industry.

Plantele de dud aparținând genului Morus sunt considerate plante cu importanță economică pentru sericicultură, frunza de dud constituind unica sursă de hrană a viermilor de mătase din specia Bombyx mori. Din punct de vedere botanic, plantele de dud aparțin diferitelor specii din genul Morus, fiind plante unisexuat dioice, înmulțite pe cale vegetativă sau sexuată.Mulberry plants belonging to the genus Morus are considered plants of economic importance for sericulture, the mulberry leaf being the only source of food for silkworms of the species Bombyx mori. From a botanical point of view, mulberry plants belong to different species of the genus Morus, being unisexual dioecious plants, propagated vegetatively or sexually.

Valorificând totipotența celulelor și țesuturilor meristematice ale plantelor de dud în scopul donării in vitro, s-au obținut rezultate pozitive, menționate în lucrări internaționale și naționale.By capitalizing on the totipotency of the meristematic cells and tissues of mulberry plants for the purpose of in vitro donation, positive results were obtained, mentioned in international and national works.

Pentru îmbunătățirea parametrilor bioproductivi ai vitroplantulelorde dud, s-a luat în considerare biofertilizarea acestora cu endomicorize de tip vezicular-arbuscular, rezultatele experimentale fiind extrem de încurajatoare pentru cultura dudului în România, și permițând utilizarea pentru prima dată în țara noastră a acestui tip de material săditor.In order to improve the bioproductive parameters of mulberry vitroplants, their biofertilization with vesicular-arbuscular endomycorrhizae was considered, the experimental results being extremely encouraging for mulberry cultivation in Romania, and allowing the use of this type of planting material for the first time in our country.

Asociațiile de tip vezicular-arbuscular sunt cele mai răspândite tipuri de micorize prezente în sistemele agricole, ceea ce explică interesul crescut în manipularea lor pentru a fi încorporate în practicile de producție.Bladder-arbuscular associations are the most common types of mycorrhizae present in agricultural systems, which explains the increased interest in their handling to be incorporated into production practices.

Inocularea cu endomicorize vezicular-arbusculare constituie o metodă de cultivare cu efecte benefice în scopul reducerii aplicării de fertilizând chimici și de pesticide, ca element cheie în abordările durabile din agricultură și horticultura; se știe că micorizele sunt capabile să colonizeze diferite habitate, succesul lor ecologic reflectând un grad ridicat de diversitate a capacităților genetice și fiziologice ale fungilor endofiți. Aproape 6000 de specii de fungi dintre Zygo-, Asco- și Basidio-micete au fost identificate ca micorizale, iar odată cu dezvoltarea tehnicilor moleculare, noi specii micorizale și noi tipuri de asociații sunt descrise pe baza amprentării ADN.Inoculation with vesicular-arbuscular endomycorrhizae is a method of cultivation with beneficial effects in order to reduce the application of chemical fertilizers and pesticides, as a key element in sustainable approaches in agriculture and horticulture; it is known that mycorrhizae are able to colonize different habitats, their ecological success reflecting a high degree of diversity of genetic and physiological capabilities of endophytic fungi. Nearly 6,000 species of fungi between Zygo-, Asco- and Basidio-mycetes have been identified as mycorrhizal, and with the development of molecular techniques, new mycorrhizal species and new types of associations are described based on DNA fingerprinting.

Efectul major al simbiozelor micorizale asupra plantelor gazdă constă în creșterea aportului de elemente minerale, în special al celor care, în stare ionică, prezintă o mobilitate redusă, ori care sunt prezente în concentrații suboptimale (fosfor, amoniu, zinc, cupru, inclusiv contaminanți precum plumbul). Micorizele ajută plantele gazdă să reziste la stresul abiotic prin ameliorarea deficienței nutrienților, contribuie la creșterea toleranței la secetă, salinitate și la poluare, inclusiv cu metale grele precum plumbul.The major effect of mycorrhizal symbioses on host plants is to increase the intake of mineral elements, especially those which, in the ionic state, have reduced mobility, or which are present in suboptimal concentrations (phosphorus, ammonium, zinc, copper, including contaminants such as lead). Mycorrhizae help host plants withstand abiotic stress by ameliorating nutrient deficiencies, helping to increase tolerance to drought, salinity and pollution, including heavy metals such as lead.

Maria Ichim & colab. în “Studies on translocation ofleadcontaminanta andtheir accumulation in morus plants”, The 39th International Session of Scientific Communications of the Faculty of Animal Science, Bucharest, Nov. 2010, Scientific papers, seria D, voi. LIII - ZOOTEHNIE, pp. 67-70, se referă la un model experimental pentru obținerea unui material biologic, respectiv, răsaduri de Morus sp. necesare evaluării gradului de translocare a contaminanților de plumb, și acumularea acestora în plantele de Morus sp.Maria Ichim & colab. în “Studies on translocation ofleadcontaminanta andtheir accumulation in morus plants”, The 39th International Session of Scientific Communications of the Faculty of Animal Science, Bucharest, Nov. 2010, Scientific papers, D series, vol. LIII - ZOOTEHNIE, pp. 67-70, refers to an experimental model for obtaining a biological material, respectively, seedlings of Morus sp. necessary to evaluate the degree of translocation of lead contaminants, and their accumulation in plants of Morus sp.

EP 0911387 (A2) se referă la o ciupercă izolată și purificată, din genul Glomus, care formează o rețea arbusculară de micorize cu plante metalofite Viola calaminaria sau V. guestphalica, și la remedierea pentru agricultură a solului contaminat, folosind noua ciupercă sau sporii săi, care formează o simbioză micorizală cu o plantă metalofită.EP 0911387 (A2) relates to an isolated and purified fungus, of the genus Glomus, which forms an arbuscular network of mycorrhizae with metallophyte plants Viola calaminaria or V. guestphalica, and to the remediation of contaminated soil for agriculture, using the new fungus or its spores , which forms a mycorrhizal symbiosis with a metallophytic plant.

Problema tehnică pe care o rezolvă invenția de față constă în remedierea pe cale biologică a solurilor contaminate cu plumb, pentru reintroducerea lor în circuitul agricol.The technical problem solved by the present invention consists in the biological remediation of lead-contaminated soils, for their reintroduction into the agricultural circuit.

RO 128587 Β1RO 128587 Β1

Potențialul biosintetic al rădăcinilor de la dud este puțin studiat, fapt care evidențiază 1 importanța cercetărilor privind stabilirea de clone în condiții in vitro, și experimentarea biofertilizării cu endorize vezicular-arbusculare a vitroplantulelor și a plantulelor de dud. 3 Combinarea efectului fungilor de micorize privind ecosistemul plantă-sol la vitroplantele de dud creează premisa utilizării cu succes a acestora în fitoremediere, adică în 5 procesul de detoxifiere a mediului poluat cu ajutorul acestor plante, abordare biotehnologică de mare perspectivă. 7The biosynthetic potential of mulberry roots is little studied, which highlights the importance of research on the establishment of clones in vitro conditions, and the experimentation of biofertilization with vesicular-arbuscular endorosis of vitroplants and mulberry seedlings. 3 The combination of the effect of mycorrhizal fungi on the plant-soil ecosystem in mulberry plants creates the premise for their successful use in phytoremediation, ie in the process of detoxifying the environment polluted with these plants, a biotechnological approach of great perspective. 7

Principalul obiectiv al invenției a constat în obținerea unui nou material săditor de dud, printr-un procedeu biotehnologic, sub formă de vitroplantule de dud inoculate cu 9 endomicorize de tip vezicular arbuscular, destinate solurilor contaminate cu plumb.The main object of the invention was to obtain a new mulberry planting material, by a biotechnological process, in the form of mulberry seedlings inoculated with 9 arbuscular vesicular endomycorrhizae, intended for lead-contaminated soils.

Materialul săditor, conform invenției, constă în vitroplantulele de dud Morus sp. 11 inoculate cu endomicorize de tip vezicular-arbuscular la un minim de 15% din biomasa radiculară, endomicorize provenite din inocul brut de biomasă radiculară de porumb Zea 13 mays sau ceapă Allium cepa, sau inocul comercial care conține linii ale fungilor Glomus mosseae, G. fasciculatum și Sclerocystis sp., și care au caracteristici genetice identice cu 15 ale formelor parentale, un conținut de proteină de 28,5% și toleranță fiziologică de 100% pe soluri contaminate cu plumb. 17The planting material, according to the invention, consists of the mulberry seedlings Morus sp. 11 inoculated with vesicular-arbuscular endomycorrhizae at a minimum of 15% of the root biomass, endomycorrhizae derived from the raw inoculum of corn root biomass Zea 13 mays or onion Allium cepa, or commercial inoculum containing lines of fungi Glomus mosseae, G. fasciculatum and Sclerocystis sp., and which have genetic characteristics identical to 15 of the parental forms, a protein content of 28.5% and a physiological tolerance of 100% on lead-contaminated soils. 17

Procedeul de obținere a vitroplantulelor, conform invenției, constă în multiplicarea in vitro a explantelor nodale rezultate din lăstarii lignifiați, stimulați ai mugurilor dorminzi, 19 utilizând mediul de cultură MS, hormonii de multiplicare BAPÎn doză de 1 mg/l și KIN în doză de 1 ...2 mg/l, hormonul de înrădăcinare IBA în doză de 1 mg/l, inocularea vitoplantulelor cu 21 inocul brut de biomasă radiculară de porumb Zea mays sau ceapă Allium cepa, în doză de 50 g/1000 g substrat, sau inocul comercial, care conține linii ale fungilor Glomus mosseae, 23 G. fasciculatum și Sclerocystis sp. în doză de 30 mg/1000 g substrat, controlul inoculării prin metoda Trypan blue și selecția vitroplantulelor inoculate prin control randomizat pe diagonala 25 câmpului de repicare la un număr minim de 10 plante/1000 vitroplantule, cât și suprainocularea repetată de cel mult 3 ori; la sfârșitul perioadei de vegetație, existența unui 27 număr de 10% de plante de dud necolonizate va fi considerată în limite normale.The process for obtaining in vitro seedlings according to the invention consists in the in vitro multiplication of nodal explants resulting from lignified, stimulated dormant shoots, 19 using MS culture medium, BAP multiplying hormones at a dose of 1 mg / l and KIN at a dose of 1 ... 2 mg / l, IBA rooting hormone at a dose of 1 mg / l, inoculation of vitoplants with 21 crude inoculum of corn root biomass Zea mays or onion Allium cepa, at a dose of 50 g / 1000 g substrate, or commercial, containing lines of the fungi Glomus mosseae, 23 G. fasciculatum and Sclerocystis sp. at a dose of 30 mg / 1000 g of substrate, control of inoculation by the Trypan blue method and selection of inoculated in vitro seedlings by random control on the diagonal of the 25 replanting field at a minimum of 10 plants / 1000 in vitro seedlings, as well as repeated over-inoculation no more than 3 times; at the end of the growing season, the existence of a number of 10% non-colonized mulberry plants will be considered within normal limits.

Invenția prezintă următoarele avantaje: 29The invention has the following advantages: 29

- noul tip de material săditor de dud prezintă o rezistență sporită la agenții patogeni specifici; 31- the new type of mulberry planting material has an increased resistance to specific pathogens; 31

- sistemul radicular al acestui material săditor permite o mobilizare și o absorbție mai bună a macro- și microelementelor din sol, inclusiv a unor metale grele imobilizate în 33 particulele de sol, realizând astfel și decontaminarea solurilor la nivele optime de conținut;- the root system of this propagating material allows a better mobilization and absorption of soil macro- and microelements, including heavy metals immobilized in 33 soil particles, thus achieving decontamination of soils at optimal levels of content;

- noul tip de material săditor de dud permite valorificarea terenurilor contaminate cu 35 metale grele (zinc, cupru, plumb) necesare agriculturii, respectiv, sericiculturii;- the new type of mulberry planting material allows the capitalization of lands contaminated with 35 heavy metals (zinc, copper, lead) necessary for agriculture, respectively, sericulture;

- cercetările recente au abordat aspecte privind înființarea unor plantații de dud cu 37 destinație sericicolă pe terenurile contaminate cu plumb, ce permit valorificarea economică a acestora prin includerea în circuitul agricol;39- recent research has addressed issues related to the establishment of mulberry plantations with 37 destinations on sericultural land on lead-contaminated land, which allow their economic recovery through inclusion in the agricultural circuit;

- cercetările efectuate de către autorii invenției au condus la obținerea unui material săditor de dud cu toleranță fiziologică totală pe solurile contaminate cu plumb.41- the research carried out by the authors of the invention has led to the production of a mulberry planting material with total physiological tolerance on soils contaminated with lead.41

Se dă, în continuare, un exemplu concret de realizare a invenției.The following is a concrete embodiment of the invention.

Realizarea invenției constă în parcurgerea următoarelor etape de execuție:43The realization of the invention consists in completing the following execution steps: 43

- realizarea vitroplantulelor de dud;- making mulberry seedlings;

- obținerea inoculului endomicorizal de tip vezicular-arbuscular, sub formă de inocul 45 brut, provenit din biomasa radiculară a plantelor de Zea mays sau Allium cepa, sau sub formă de inocul comercial;47- obtaining the vesicular-arbuscular endomycorrhizal inoculum, in the form of crude inoculum 45, from the root biomass of Zea mays or Allium cepa plants, or in the form of commercial inoculum;

RO 128587 Β1RO 128587 Β1

- realizarea de vitroplantule de dud inoculate cu endomicorize de tip vezicular arbuscular și repicarea acestora;- making mulberry seedlings inoculated with arbuscular vesicular endomycorrhizae and transplanting them;

- controlul colonizării prin metoda de colorare cu Trypan blue, selecția vitroplantulelor de dud inoculate cu endomicorize vezicular-arbusculare din câmpul de repicare, și suprainocularea materialului săditor de dud necolonizat.- control of colonization by the Trypan blue staining method, selection of mulberry seedlings inoculated with vesicular-arbuscular endomycorrhizae from the transplantation field, and overraining of non-colonized mulberry seedlings.

Realizarea vitroplantulelor de dud cuprinde parcurgerea unui procedeu de lucru laborios.The production of mulberry seedlings involves a laborious work process.

Biotehnologiile de multiplicare a plantelor de dud fac referire la obținerea de vitroplantule prin culturi de țesuturi, meristeme și, în ultima perioadă de timp, prin culturi de celule. Formule nutritive pentru mediile de cultură au fost standardizate, fiind stabilite pe baza unor testări privind tipul și concentrațiile diferitelor substanțe constitutive, în funcție de procesul morfogenetic ce urmează să fie indus.Biotechnologies for the multiplication of mulberry plants refer to the obtaining of vitroplants through tissue cultures, meristems and, lately, through cell cultures. Nutrient formulas for culture media have been standardized, being established on the basis of tests on the type and concentrations of different constituents, depending on the morphogenetic process to be induced.

Pentru multiplicare in vitro a plantelor de dud este utilizat mediul bazai Murashige -Skoog (1962), bogat în azot, care s-a dovedit a asigura la nivel optim elementele nutritive pentru dezvoltarea explantelor cultivate. Acest mediu bazai constituie formula nutritivă optimă pentru inițierea culturilor de meristeme și de apexuri.For in vitro multiplication of mulberry plants, the nitrogen-rich Murashige-Skoog (1962) base medium is used, which has been shown to provide optimal nutrients for the development of cultivated explants. This basic medium is the optimal nutrient formula for initiating meristem and apex cultures.

Multiplicarea in vitro a plantelor de dud se face având drept sursă de explante lăstari vegetativi obținuți din muguri dorminzi de iarnă, stimulați să intre în vegetație.The in vitro multiplication of mulberry plants is done having as a source of explants vegetative shoots obtained from dormant winter buds, stimulated to enter the vegetation.

Procedeul de lucru parcurge următoarele etape:The work process goes through the following steps:

Obținerea sursei de explante se realizează prin forțarea lăstarilor lignificați, recoltați din colecția sau plantația de dud, în perioada noiembrie-decembrie, perioadă de repaus vegetativ. Stimularea se realizează prin simularea condițiilor de dezmugurire, prin amplasarea acestor lăstari în vase cu apă de robinet și asigurarea unei temperaturi ambientale de 24.. ,25°C. După 60 de zile, din mugurii dorminzi se vor dezvolta apical lăstarii erbacei care vor constitui sursa de explante.Obtaining the source of explants is done by forcing the lignified shoots, harvested from the mulberry collection or plantation, during November-December, a period of vegetative rest. The stimulation is performed by simulating the budding conditions, by placing these shoots in vessels with tap water and ensuring an ambient temperature of 24 .., 25 ° C. After 60 days, from the dormant buds will grow apically the weed shoots that will be the source of explants.

Sterilizarea materialului vegetal constă într-o operație de spălare cu apă normală de robinet (presterilizare) a lăstarilor, necesară pentru eliminarea mecanică a unorcontaminanți. Lăstarii erbacei sunttăiați în bucăți de circa 1,5...2,0 cm, fiecare conținând un mugure axilar care va deveni un explant nodal, rezultând totodată și explante apicale. Sterilizarea efectivă se realizează cu HgCI2 în concentrație de 0,03% timp de 30 de min, explantele nodale fiind amestecate în continuu în această soluție, după care sunt spălate cu apă distilată timp de 10 min, în 3 reprize. Sterilizarea poate fi realizată și prin utilizarea unei soluții de 3...5% de hipoclorit de potasiu (produsul comercial Domestos).The sterilization of the vegetal material consists in a washing operation with normal tap water (presterilization) of the shoots, necessary for the mechanical removal of some contaminants. The shoots of the weed are cut into pieces of about 1.5 ... 2.0 cm, each containing an axillary bud that will become a nodal explant, resulting in apical explants. The effective sterilization is performed with HgCl 2 in a concentration of 0.03% for 30 minutes, the nodal explants being continuously mixed in this solution, after which they are washed with distilled water for 10 minutes, in 3 batches. Sterilization can also be performed by using a solution of 3 ... 5% potassium hypochlorite (commercial product Domestos).

Inițierea culturii primare (inocularea) are locîn condiții aseptice la hota de flux laminat. Mediul de cultură utilizat este de tip Murashige-Skoog cu 0,8% agar, distribuitîn vase de cultură tip baby food, mediul de cultură fiind suplimentat cu hormoni de multiplicare (benzinaminopurina BAP și kinetina KIN) în următoarea combinație de dozaj:The initiation of the primary culture (inoculation) takes place under aseptic conditions at the laminated flow hood. The culture medium used is Murashige-Skoog type with 0.8% agar, distributed in baby food type culture vessels, the culture medium being supplemented with multiplication hormones (benzinaminopurine BAP and kinetin KIN) in the following dosage combination:

-1 mg/l BAP + 1 mg/l KIN, pentru soiurile de dud ce emit ușor rădăcini adventive;-1 mg / l BAP + 1 mg / l KIN, for mulberry varieties that easily emit adventitious roots;

-1 mg/l BAP + 2 mg/l KIN, pentru soiurile de dud reticente.-1 mg / l BAP + 2 mg / l KIN, for reluctant mulberry varieties.

Vasele de cultură, precum și mediul de cultură sunt sterilizate prin autoclavare realizată la 121°C și la o presiune de 1,1...1,2 atm.The culture vessels as well as the culture medium are sterilized by autoclaving performed at 121 ° C and at a pressure of 1.1 ... 1.2 atm.

înainte de autoclavare, mediului bazai trebuie să i se corecteze pH-ul la valori dePrior to autoclaving, the pH of the base medium should be adjusted to pH values

5,6...5,8.5.6 ... 5.8.

După inoculare (așezarea explantelor nodale în vasele de cultură sterilizate pe mediul de cultură se face cu respectarea polarității normale), vasele de cultură sunt sterilizate prin flacără și obturate cu rola parafilm, fiind trecute în camera de creștere.After inoculation (placing the nodal explants in the sterilized culture vessels on the culture medium is done respecting the normal polarity), the culture vessels are sterilized by flame and sealed with the parafilm roller, being passed into the growth chamber.

Incubația culturii inițiale și multiplicarea constau în transferarea în camera de incubare (de creștere) a vaselor de cultură pentru o perioadă de 15 zile, la o temperatură deThe incubation of the initial culture and the multiplication consist in the transfer to the incubation (growth) chamber of the culture vessels for a period of 15 days, at a temperature of

RO 128587 Β1RO 128587 Β1

25...28°C, iluminată artificial, cu o fotoperioadă de 16:8, la o intensitate de 3000 lux, utilizând 1 un temporizator. Incubația culturii durează 15...21 zile.25 ... 28 ° C, artificially lit, with a photoperiod of 16: 8, at an intensity of 3000 lux, using 1 a timer. The incubation of the culture lasts 15 ... 21 days.

Subcultivarea este necesară pentru obținerea clonelor de la același apex, în condițiile 3 utilizării apexurilor caulinare, și constă în transferarea de la cultura inițială a unor explante în vase de cultură cu mediu proaspăt. 5 înrădăcinarea și regenerarea plantelor autonome se realizează atunci când lăstarii dezvoltați în vasele de cultură ating lungimea de 2,5...3,0 cm, și are drept scop obținerea 7 radicelelor prin schimbarea mediului de cultură la care formula rămâne neschimbată (cu excepția agarului care nu se mai adaugă), mediul de cultură fiind lichid. Menținerea 9 vitroplantulelor în mediul de cultură lichid se realizează prin utilizarea unor punți mici de hârtie de filtru, înrădăcinarea fiind asigurată prin suplimentarea mediului de cultură cu 11 hormonul IBA (acidul indolilbutiric) în concentrație de 1 mg/l. Condițiile de mediu, de temperatură și lumină se păstrează la aceiași parametri. Primele proimordii radiculare apar 13 la un interval de 10...15 zile de la trecerea pe mediul de cultură lichid.Subcultivation is necessary to obtain clones from the same apex, under conditions 3 of the use of cauline apexes, and consists in the transfer from the initial culture of some explants into culture vessels with fresh medium. 5 rooting and regeneration of autonomous plants is achieved when the shoots developed in the culture vessels reach a length of 2.5 ... 3.0 cm, and aims to obtain 7 roots by changing the culture medium in which the formula remains unchanged (except agar that is no longer added), the culture medium being liquid. The maintenance of 9 in vitro seedlings in the liquid culture medium is achieved by using small bridges of filter paper, the rooting being ensured by supplementing the culture medium with 11 IBA hormone (indolylbutyric acid) in a concentration of 1 mg / l. The environmental, temperature and light conditions are kept at the same parameters. The first root proimordia appear 13 at an interval of 10 ... 15 days after the transition to the liquid culture medium.

Aclimatizarea este stadiul în care plantele sunt transferate în vase de cultură cu apă 15 de robinet, după ce în prealabil au fost bine spălate de resturile mediului de cultură. Acest stadiu ex situ este necesar pentru fortificarea sistemului radicular și adaptarea sistemului 17 foliar al plantulelor la un conținut de umiditate scăzut al mediului ambiant, pentru depășirea așa-numitului șoc de aclimatizare. După o perioadă de 15 zile, plantulele sunt transferate 19 în ghivece care conțin un substrat de cultură solid, format din pământ de țelină, mraniță și nisip în proporție de 1:1:1, cu un pH de 5,8. Substratul solid folosit pentru transferul vitro- 21 plantulelor trebuie autoclavat (tratament profilactic). în condiții de microclimat optim, vitroplantulele de dud se vor lignifica, în vederea repicării, după o perioadă minimă de 90 de zile. 23 Obținerea inoculilor endomicorizali de tip vezicular-arbuscular se realizează procedând astfel, pentru obținerea inoculului brut: 25Acclimatization is the stage in which the plants are transferred to culture vessels with tap water, after having been thoroughly washed by the remains of the culture medium. This ex situ stage is necessary for the strengthening of the root system and the adaptation of the foliar system 17 of the seedlings to a low humidity content of the environment, in order to overcome the so-called acclimatization shock. After a period of 15 days, the seedlings are transferred 19 into pots containing a solid culture substrate, consisting of celery, manure and sand in a ratio of 1: 1: 1, with a pH of 5.8. The solid substrate used for vitro-21 seedling transfer must be autoclaved (prophylactic treatment). under optimal microclimate conditions, mulberry seedlings will lignify for transplanting after a minimum period of 90 days. 23 Obtaining endomycorrhizal inocula of vesicular-arbuscular type is performed by proceeding as follows, to obtain the raw inoculum: 25

Din parcelele cultivate cu porumb sau ceapă, se recoltează biomasa radiculară a plantelor, de la o adâncime a solului de 20...30 cm, urmând a fi condiționată prin mărunțirea 27 materialului vegetal, cu ajutorul unei mori cu ciocănele, inclusiv a particulelor de sol aderente, urmată de omogenizarea cu ajutorul unui melc transportor. Perioada optimă pentru 29 recoltarea biomasei radiculare este în fenofaza de postrecoltare a producției principale. Inoculul brut astfel obținut se păstrează în condiții de depozitare cu umiditate relativă a 31 aerului de maximum 60%, fără pericol de mucegai sau de rozătoare. Forma de prezentare poate fi vrac sau în saci de 50 kg. 33From the plots cultivated with corn or onions, the root biomass of the plants is harvested, from a soil depth of 20 ... 30 cm, and will be conditioned by crushing 27 the vegetal material, with the help of a hammer mill, including the particles of adherent soil, followed by homogenization using a conveyor screw. The optimal period for 29 root biomass harvesting is in the post-harvest phenophase of the main production. The crude inoculum thus obtained shall be stored under conditions of storage with a relative humidity of 31 air of not more than 60%, without danger of mold or rodents. The presentation can be in bulk or in 50 kg bags. 33

Utilizarea biomasei radiculare de porumb sau ceapă asigură un inocul brut de endomicorize de tip vezicular-arbuscular sigur, dar, pentru siguranță, înainte de utilizare, se 35 procedează la controlul acestuia, prin metoda de colorare Trypan blue.The use of corn or onion root biomass ensures a safe inoculation of safe vesicular-arbuscular endomycorrhizae, but, for safety, before use, it is controlled by the Trypan blue staining method.

Biofertilizarea vitroplantulelor de dud cu endomicorize se poate realiza și prin 37 folosirea unor biofertilizanți comerciali, specializați pentru tipul vezicular-arbuscular.The biofertilization of mulberry seedlings with endomycorrhizae can also be achieved by using commercial biofertilizers, specialized for the vesicular-arbuscular type.

Realizarea vitroplantulelor de dud inoculate cu endomicorize de tip vezicular- 39 arbuscular, și repicarea acestora cuprind lucrările de obținere a substratului de repicare format din pământ de țelină, mraniță și nisip, în proporții egale, ce se sterilizează prin 41 autoclavare la temperatura de 110°C, timp de 60 min. După răcire, substratul de repicare este amestecat cu inoculul brut în doză de 50 g/1000 g amestec de substrat, sau în doză de 43 30 mg inocul comercial/1000 g de substrat. Biofertilizanții comerciali conțin flora activă și linii selectate ale fungilor de Glomus mosseae, G. fasciculatum și Sclerocystis sp. 45The production of mulberry seedlings inoculated with vesicular-39 arbuscular endomycorrhizae, and their transplantation include the works of obtaining the transplanting substrate consisting of celery, manure and sand, in equal proportions, which is sterilized by 41 autoclaving at a temperature of 110 ° C, for 60 min. After cooling, the filler substrate is mixed with the crude inoculum at a dose of 50 g / 1000 g of substrate mixture, or at a dose of 43 30 mg commercial inoculum / 1000 g of substrate. Commercial biofertilizers contain the active flora and selected lines of the fungi of Glomus mosseae, G. fasciculatum and Sclerocystis sp. 45

Substratul de repicare inoculat se pune în cutii de repicare sau se modelează în brazde de repicare, cu oînălțime minimă de 40 cm. Plantulele de dud se repicăîn substratul biofertilizat, 47 asigurând o densitate de 100 plantule/m2, perioada de inoculare fiind de 45.. .50 zile. LucrărileThe inoculated transplant substrate is placed in transplant boxes or modeled in transplant furrows, with a minimum height of 40 cm. Mulberry seedlings are transplanted into the biofertilized substrate, 47 ensuring a density of 100 seedlings / m 2 , the inoculation period being 45 .. .50 days. The works

RO 128587 Β1 de îngrijire executate în această perioadă sunt plivitul, respectiv, prășitul și udarea sau irigarea. Perioada de repicare poate fi prelungită pentru întreaga perioadă de vegetație, dacă se utilizează inoculul comercial.RO 128587 Β1 care carried out during this period are weeding, hoeing and watering or irrigation, respectively. The transplanting period can be extended for the entire vegetation period, if the commercial inoculum is used.

Controlul colonizării și selecția vitroplantulelor de dud inoculate se realizează prin aplicarea metodei de colorare cu Trypan blue.The control of the colonization and the selection of the inoculated mulberry vitroplants is performed by applying the staining method with Trypan blue.

Controlul și selecția vitroplantulelor de dud inoculate prin această metodă se face prin control randomizat pe diagonala câmpului de repicare la un număr minim de 10 plante/1000 vitroplantule.The control and selection of mulberry seedlings inoculated by this method is done by randomized control on the diagonal of the transplanting field at a minimum number of 10 plants / 1000 seedlings.

Vitroplantulele de dud necolonizate se vor suprainocula prin administrarea inoculului brut sau comercial în dozele menționate, în zona radiculară a fiecărei plantule, toate plantele urmând a fi udate zilnic, timp de 7 zile, apoi udările următoare devenind săptămânale. Suprainocularea se poate repeta de cel mult 3 ori; la sfârșitul perioadei de vegetație, existența unui număr de 10% de plante de dud necolonizate este considerată în limite normale.Uncolonized mulberry seedlings will be superoculated by administering the raw or commercial inoculum in the mentioned doses, in the root zone of each seedling, all plants will be watered daily for 7 days, then the next waterings becoming weekly. Superoculation can be repeated no more than 3 times; at the end of the growing season, the existence of 10% of uncolonized mulberry plants is considered to be within normal limits.

Caracteristicile genetice ale plantulelor de dud colonizate sunt identice cu formele parentale, iar conținutul de proteină a crescut, fiind de peste 28,5%, comparativ cu o medie de 26,5% la vitroplantulele fără endomicorize. Vitroplantulele de dud colonizate cu endomicorize au prezentat o rată de supraviețuire de 100% pe substrat contaminat cu plumb, manifestând o toleranță fiziologică totală.The genetic characteristics of colonized mulberry seedlings are identical to the parental forms, and the protein content increased, being over 28.5%, compared to an average of 26.5% in vitroplants without endomycorrhizae. Mulberry seedlings colonized with endomycorrhizae showed a survival rate of 100% on lead-contaminated substrate, showing a total physiological tolerance.

Biotehnologiile utilizate pot fi aplicate în toate laboratoarele și centrele de biotehnologii, la scară industrială. Rezultatele cercetărilor care au permis obținerea noului tip de material săditorde dud s-au testat în condiții de producție industrială, obținându-se un număr de peste 10000 vitroplantule de dud inoculate cu endomicorize de tip vezicular-arbuscular, pe durata unei luni normale de lucru. Toate terenurile contaminate cu plumb pot fi cultivate cu noul tip de material săditor de dud, pentru practicarea sericiculturii, activitate agricolă nealimentară.The biotechnologies used can be applied in all laboratories and biotechnology centers, on an industrial scale. The research results that allowed the obtaining of the new type of mulberry planting material were tested in industrial production conditions, obtaining a number of over 10,000 mulberry seedlings inoculated with vesicular-arbuscular endomycorrhizae, during a normal working month. All land contaminated with lead can be cultivated with the new type of mulberry planting material, for the practice of sericulture, non-food agricultural activity.

Claims (2)

Revendicări 1Claims 1 1. Vitroplantule de dud Morus sp. inoculate cu endomicorize de tip vezicular- 3 arbuscular la un minim de 15% din biomasa radiculară, endomicorize provenite din inocul brut de biomasă radiculară de porumb Zea mays sau ceapă Allium cepa, sau inocul 5 comercial care conține linii ale fungilor Glomus mosseae, G. fasciculatum și Sclerocystis sp., și care au caracteristici genetice identice cu ale formelor parentale, un conținut de proteină 7 de 28,5% și toleranță fiziologică de 100% pe soluri contaminate cu plumb.1. Vitamin plant of mulberry Morus sp. inoculated with vesicular-3 arbuscular endomycorrhizae at a minimum of 15% of root biomass, endomycorrhizae derived from raw inoculum of maize root biomass Zea mays or onion Allium cepa, or commercial inoculum 5 containing lines of fungi Glomus mosseae, G. fasciculatum and Sclerocystis sp., and which have genetic characteristics identical to those of the parental forms, a protein content of 28.5% and a physiological tolerance of 100% on lead-contaminated soils. 2. Procedeu de obținere a vitroplantulelor de dud Morus sp. definite la 9 revendicarea 1, care constă în multiplicarea in vitro a explantelor nodale rezultate din lăstarii lignifiați, stimulați ai mugurilor dorminzi, utilizând mediul de cultură MS, hormonii de 11 multiplicare BAP în doză de 1 mg/l și KIN în doză de 1...2 mg/l, hormonul de înrădăcinare2. Process for obtaining mulberry seedlings Morus sp. defined in claim 1, which consists in the in vitro multiplication of nodal explants resulting from lignified shoots, stimulated by dormant buds, using MS culture medium, BAP multiplication hormones at a dose of 1 mg / l and KIN at a dose of 1. ..2 mg / l, rooting hormone IBA în doză de 1 mg/l, inocularea vitoplantulelor cu inocul brut de biomasă radiculară de 13 porumb Zea mays sau ceapă Allium cepa, în doză de 50 g/1000 g substrat, sau inocul comercial, care conține linii ale fungilor Glomus mosseae, G. fasciculatum și Sclerocystis sp. 15 în doză de 30 mg/1000 g substrat, controlul inoculării prin metoda Trypan blue și selecția vitroplantulelor inoculate prin control randomizat pe diagonala câmpului de repicare, la un 17 număr minim de 10 plante/1000 vitroplantule, cât și suprainocularea repetată de cel mult 3 ori; la sfârșitul perioadei de vegetație, existența unui număr de 10% plante de dud necolo- 19 nizate este considerată în limite normale.IBA at a dose of 1 mg / l, inoculation of vitoplants with the raw root biomass inoculum of 13 maize Zea mays or onion Allium cepa, at a dose of 50 g / 1000 g substrate, or commercial inoculum, containing lines of fungi Glomus mosseae, G fasciculatum and Sclerocystis sp. 15 at a dose of 30 mg / 1000 g substrate, control of inoculation by the Trypan blue method and selection of inoculated in vitro seedlings by random control on the diagonal of the transplant field, at a minimum of 10 plants / 1000 in vitro seedlings, as well as repeated superinoculation of no more than 3 times; at the end of the growing season, the existence of 10% non-colonized mulberry plants is considered to be within normal limits.
ROA201100916A 2011-09-19 2011-09-19 Mulberry tree - morus spp. vitroplantules inoculated with endomycorrhizae of the vesicular-arbuscular type intended for cultivating lead-contaminated soils and process for obtaining the same RO128587B1 (en)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
ROA201100916A RO128587B1 (en) 2011-09-19 2011-09-19 Mulberry tree - morus spp. vitroplantules inoculated with endomycorrhizae of the vesicular-arbuscular type intended for cultivating lead-contaminated soils and process for obtaining the same

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
ROA201100916A RO128587B1 (en) 2011-09-19 2011-09-19 Mulberry tree - morus spp. vitroplantules inoculated with endomycorrhizae of the vesicular-arbuscular type intended for cultivating lead-contaminated soils and process for obtaining the same

Publications (2)

Publication Number Publication Date
RO128587A2 RO128587A2 (en) 2013-07-30
RO128587B1 true RO128587B1 (en) 2016-02-26

Family

ID=48868826

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ROA201100916A RO128587B1 (en) 2011-09-19 2011-09-19 Mulberry tree - morus spp. vitroplantules inoculated with endomycorrhizae of the vesicular-arbuscular type intended for cultivating lead-contaminated soils and process for obtaining the same

Country Status (1)

Country Link
RO (1) RO128587B1 (en)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104255249B (en) * 2014-09-17 2016-08-31 甘肃乐涫有机生态农业科技有限公司 A kind of implantation methods of albumen mulberry

Also Published As

Publication number Publication date
RO128587A2 (en) 2013-07-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN107711290B (en) Culture medium for mycorrhizal edible fungus symbiotic seedling and synchronous culture method thereof
CN104041412B (en) The quick breeding method for tissue culture of a kind of Guizhou half capsule lettuce tongue
CN102640671A (en) Method for identifying Alternaria altemata (Fr.) Keissler resistance of pear germplasm
CN104542281B (en) Mediterranean Jia Opulus tissue culture propagation method
Wen et al. Efficient protocols for the micropropagation of tree peony (Paeonia suffruticosa ‘Jin Pao Hong’, P. suffruticosa ‘Wu Long Peng Sheng’, and P.× lemoinei ‘High Noon’) and application of arbuscular mycorrhizal fungi to improve plantlet establishment
CN106475408A (en) A kind of cloud and mist sedge and the method for ciliate desert-grass composite heavy metal pollution soil restoration
CN103858771A (en) Maize transgenic tissue culture seedling transplanting method
Yadav et al. A reliable protocol for micropropagation of Gloriosa superba L.(Colchicaceae)
CN109566417B (en) Tissue culture method of cordyceps sinensis ginseng
CN104823734B (en) A kind of method for alleviating cucumber Low Light Density Stress
CN102771350B (en) Method for cultivating mycorrhizal seedlings
Pradhan et al. Micropropagation of Cymbidium aloifolium (L.) Sw., a medicinal orchid by artificial seeds technology
CN104982212A (en) Seedling raising method improving HeiQi #1 medlar seedling field planting survival rate
RO128587B1 (en) Mulberry tree - morus spp. vitroplantules inoculated with endomycorrhizae of the vesicular-arbuscular type intended for cultivating lead-contaminated soils and process for obtaining the same
CN106069780B (en) A technique for tissue culture breeding is carried out using bletilla stem tuber
CN105039173B (en) Raw mortierella sp and its application in a kind of serrate clubmoss herb
CN102613075A (en) Method for breeding floating ferns of endangered ferns
ES2706099B2 (en) New strain of Trichoderma aggressivum fsp europaeum, compositions and applications thereof
Ridgway et al. Optimising the medium for producing arbuscular mycorrhizal spores and the effect of inoculation on grapevine growth
CN105638479A (en) Method for rapidly propagating large cherries
RU2206976C2 (en) Method for multiplying of normalized potato plants
CN108464207A (en) A kind of cultural method improving rice tissue-cultured seedling transplanting survival rate
Parya Effect of integrated plant nutrient system for gerbera flower production under protected cultivation
CN105454043B (en) The tissue culture detoxicating quick-breeding method of ring tree
Manuel et al. Preliminary evaluation of the potential of macromycetes as mediators in bio-hardening of orchid plantlets