RO120711B1 - Reactivi de legare a receptorului de calcitonină şi variante marcate ale acestora - Google Patents

Abstract

Invenţia se referă la reactivi de legare a receptorului de calcitonină, care pot forma complecşi cuionii metalici, inclusiv cu ionii metalelor radioactive, şi la variantele marcate ale acestor reactivi pentru utilizare în imagistica unei zone dintr-un corp de mamifer sau pentru utilizare în terapie, în special în terapia cancerului.

Description

Invenția se referă la reactivi de legare a receptorului de calcitonină, care pot forma complecși cu ionii metalici, inclusiv ionii metalelor radioactive, și la variantele marcate ale acestor reactivi, pentru utilizare în imagistica unei poziții într-un corp de mamifer sau pentru utilizare în terapie, în special pentru utilizare în terapia cancerului.

Este cunoscut faptul că în ultimii 60 de ani s-au făcut progrese mari în reducerea mortalității datorată anumitor tipuri de cancer, cum ar fi cancerul de stomac. Cu toate acestea, în aceeași perioadă, tendința mortalității datorată altor tipuri de cancer a rămas stabilă sau a crescut. De exemplu, cancerul pulmonar este cea mai frecventă formă de cancer din lume, reprezentând cauza majoră a mortalității datorată cancerului la bărbați și femei. Cancerul mamar este cancerul cel mai frecvent la femei și constituie a doua cauză a mortalității, iar rata mortalității produsă de cancerul ovarian este în creștere în anumite țări. Cancerul limfatic infantil și la adulți, cum arfi leucemiile și limfomurile ne-Hodgkin, continuă să reprezinte cauze semnificative ale mortalității datorate cancerului. Diagnoza timpurie și tratamentul eficient constituie un obiectiv pentru toate aceste tipuri de cancer.

Acum câțiva ani, s-au propus terapia și diagnoza direcționată local, pentru a permite țintirea in vivo a pozițiilor concrete ale bolii într-un corp animal. în general, terapia și diagnoza direcționată local utilizează un mijloc de țintire, cum arfi un anticorp specific pentru zona bolnavă sau pentru organismul care a cauzat boala, cuplat la un marker, în cazul unui agent de diagnosticare, sau la un agent citotoxic, în cazul unui agent terapeutic. Există un volum mare de literatură referitoare la anticorpi sau fragmente de anticorpi radiomarcați pentru scopuri imagistice de diagnostic, în mod similar, s-a propus un număr de agenți terapeutici, direcționați local, care folosesc anticorpi monoclonali și o varietate de radioizotopi, de exemplu, cum sunt cei din US 4454106,4472509,4828991,5246691,5355394 și 5641471, în EP 429624, 585986; WO 90/15625 ș.a. Asemenea agenți pe bază de anticorpi produc efecte secundare legate de răspunsurile imune la anticorpul animalului tratat, chiar dacă s-au folosit ca fragmente de țintire fragmente de anticorp sau anticorpi umanizați. Dezavantajele agenților terapeutici și de diagnostic direcționați local pe bază de anticorpi pot fi evitate când se folosesc fragmente de țintire cu greutăți moleculare mai mici, cum arfi peptidele cu specificitate la receptor sau molecule mici. Totuși, cuplarea unei peptide sau a unei molecule mici la un agent de marcare sau citotoxic, cu menținerea specificității compusului față de receptor, poate fi dificilă din punct de vedere tehnic. Metodele pentru radiomarcarea peptidelor și a altor molecule mici care păstrează capacitatea compusului de a se lega specific la un receptor, sunt prezentate în US 5225180, 5405597, 5443815, 5508020, 5552525, 5561220, 5620675, 5645815, 5654272, 5711931; 5716596; 5720934 și 5736122; în cererea de brevet US (abandonată) 07/955466 și în WO 92/13572, 93/10747, 93/17719, 93/21962, 93/23085, 93/25244,94/00489,94/07918 și 94/28942. Metodele descrise în aceste brevete și publicații sunt deosebit de potrivite pentru obținerea agenților imagistici de diagnostic direcționați local. US 5620675, 5716596; WO 94/00489, 95/03330, 95/00553, 95/31221 și 96/04308 prezintă analogi de peptidă somatostatină care pot fi folosiți pentru radioterapia localizată. WO 95/33497 prezintă analogi de somatostatină, peptide care leagă receptorul gpllb/llla și peptide care leagă leucocite, care pot fi folosiți pentru radiodiagnoza sau radioterapia localizată. WO 96/30055 prezintă peptide care leagă receptorul peptidă intestinală vasoactivă (VIP), care pot fi folosiți pentru radiodiagnoza sau radioterapia localizată. Celulele tumorale deseori exprimă sau supraexprimă un receptor particular sau un subtip de receptor, după cum este precizat de studiile de legare a receptorului. în unele tipuri de cancer, markerii celulei tumorale se pot modifica pe măsură ce boala progresează, reflectând posibil etapa bolii și în felul acesta prognoza pacientului. Tipul de receptor, pe care îl exprimă o celulă tumorală, poate

RO 120711 Β1 fi caracteristic pentru etiologia tumorii și în felul acesta constituie un marker relativ specific 1 pentru tumoră. De exemplu, s-a arătat că analogii de somatostatină radiomarcați se leagă specific la tumorile neuroendocrine, melanoame, cancer pulmonar și anumite cancere ma- 3 mare. Un astfel de analog, ¹¹¹ln-OCTREOSCAN a primit aprobare comercială pentru utilizare în imagistica tumorilor neuroendocrine. Un al doilea analog de somatostatină radiomarcat, 5 ^99mTc-Depreotide, a trecut de faza a IIl-a a încercărilor clinice pentru utilizare în imagistica cancerelor pulmonare. Peptida intestinală ¹²³l-vasoactivă țintește adenocarcinomurile 7 colonului și stomacului.

Calcitonina (CT) este o peptidă cu 32 de aminoacizi secretată de tiroidă ca răspuns 9 la nivelurile ridicate de calciu din ser. Calcitonina are o serie de efecte biologice care sunt mediate de receptorii de calcitonină prezenți pe suprafața celulelor în organul țintă. S-au 11 identificat receptori cu afinitate înaltă pentru CT în oase, rinichi, plămân și sistemul nervos central. în oase, CT inhibă resorpția osoasă de osteoclaste; în rinichi, CT mărește excreția 13 ionilor de calciu; și în sistemul nervos central, peptida induce analgezia, secreția acidului gastric și inhibă apetitul. Cantități mici de CT s-au administrat la animale și om fără efecte 15 toxice și CT de somon s-a folosit clinic pentru a trata afecțiuni osoase, cum ar fi boala lui Paget, hipercalcemia malignă și osteoporoza. Calcitonina administrată intravenos limpezește 17 rapid sângele și este eliminată în principal în urină. Pozițiile majore de localizare pentru CT administrată sunt rinichiul, ficatul și epifizele oaselor lungi. 19

Nivelurile de CT de circulație sunt considerate a fi un marker pentru anumite tipuri sau stadii de cancer, de exemplu, carcinomul tiroid medular, cancerul pulmonar al celulelor 21 mici, carcinoizi și cancerul gastrointestinal. Receptorii de CT cu afinitate înaltă s-au identificat în celule limfoide, linii de celule ale cancerului pulmonar uman, linii de celule ale cancerului 23 mamar uman și în țesut de cancer mamar primar. Findlay ș.a. (1981) Biochem. J. 196:513520 prezintă că receptorii de CT sunt supraexprimați în anumite linii de celule ale cancerului 25 mamar, pulmonar, ovarian și limfoame.

Secvențele de aminoacizi ale CT din câteva specii (uman, somon și tipar) sunt 27 prezentate mai jos: hCT CGNLSTCMLGTYTQDFNKFHTFPQTAIGVG.AP.ap.AMIDĂ (SECV. ID NR.1) 29 sCT CSNLSTCVLGKLSQELHKLQTYPRTNTGSG.TP.aD.AMIDĂ (SECV. ID NR.2) eCT CSNLSTCVLGKLSQELHKLQTYPRTDVGAGTP.ap.AMIDĂ (SECV. ID NR.3) 31 (în care prescurtările cu o singură literă pentru aminoacizi pot fi găsite în Zubay, Biochemistry, ed. a 2-a, 1988, MacMilIan Publishing: New York, p.33 și în care aminoacizii 33 subliniați dintre două resturi de cisteină în porțiunea amino terminală a peptidei reprezintă o legătură disulfidică). Dintre specii, sunt conservate nouă resturi, incluzând prolin amida cu 35 carboxil terminal și resturile de cisteină legate cu disulfură în pozițiile 1 și 7. CT de somon și tipar sunt mai puternice decât CT uman atât in vitro, cât și in vivo. 37

S-au elaborat analogi ai peptidei CT, în care disulfură labilă chimic este înlocuită cu legături carbon-carbon stabile, formate între acidul 2-aminosuberic, așa cum s-a descris în 39 US 4086221. Analogii în care porțiunea amino terminală, porțiunea de mijloc sau porțiunea terminală carboxil a moleculei este eliminată demonstrează numai o legare slabă la receptorii 41 de CT. Multe substituții de aminoacizi pot fi făcute între resturile 8 și 22 ale moleculei CT pentru a genera analogi CT activi biologic. Unii analogi CT cu numai o omologie minimă a 43 secvenței cu orice formă naturală de CT au activitate biologică similară cu cea a CT de somon. Derivații trunchiați ai peptidei CT (cum ar fi Cbz-LHKLQY-OMe) rețin activitatea 45 substanțială a receptorului.

Deoarece tumorile pot exprima sau supraexprima diferiți receptori, este necesară o 47 diversitate de agenți de radiodiagnostic și radioterapeutici, pentru o diagnosticare în condiții optime a cancerului și pentru modalitățile terapeutice ale acestuia. 49

RO 120711 Β1

Receptorii de CT de pe suprafațele celulei adenocarcinomului pulmonar și ovarian, ai cancerului mamar și limfoamelor pot fi folosiți ca markeri, pentru a localiza, identifica și trata tumorile in vivo.

Problema, pe care o rezolvă invenția, este de a realiza un reactiv de legare a receptorului de calcitonină, un agent imagistic scintigrafic, o compoziție, un agent radioterapeutic cu reactivul de legare a receptorului de calcitonină, un complex obținut pentru reacția reactivului, o trusă pentru prepararea unui preparat radiofarmaceutic și utilizarea respectivului reactiv în radiologie.

Reactivul de legare a receptorului de calcitonină, conform invenției, conține compuși cu masă moleculară mai mică de 10.000 Da și sunt legați la un chelatizator de radiometal care are o afinitate de legare a receptorului de calcitonină egală sau mai mare decât afinitatea de legare a calcitoninei native radioiodate, pentru respectivul receptor.

Agentul imagistic scintigrafic, conform invenției, cuprinde un reactiv de legare a receptorului de calcitonină definit în oricare dintre revendicările1...19 și technețiu-99m.

Compoziția conform invenției conține reactivul definit în oricare dintre revendicările 1...19 și un ion stanos.

Agentul radioterapeutic, conform invenției, conține reactivul definit în oricare dintre revendicările 1...19 și un radioizotop citotoxic.

Complexul conform invenției, obținut prin marcarea reactivului definitîn oricare dintre revendicările 1...19, cu technețiu-99m, reniu-186 sau reniu-188, în prezența unui agent de reducere.

Trusă pentru prepararea unui preparat radiofarmaceutic, conform invenției, care cuprinde o fiolă care conține o cantitate predeterminată dintr-un reactiv definit în oricare dintre revendicările 1...19 și o cantitate suficientă dintr-un agent de reducere pentru marcarea reactivului cu technețiu-99m, reniu-186 sau reniu-188.

Utilizare conform invenției, a unui reactiv definit în oricare dintre revendicările 1 ...19, pentru fabricarea unei compoziții farmaceutice pentru imagistica unei poziții dintr-un corp de mamifer, pentru tratarea unei boli caracterizate prin prezența receptorilor de calcitonină.

Autorii prezentei invenții au elaborat pentru prima dată compuși sintetici mici care includ peptide derivate de CT, care au capacitatea de legare cu afinitate mare la receptorii de CT și au farmacocinetici favorabile, permițând în felul acesta o localizare eficientă in vivo a agențilorde diagnostic și terapeutici la pozițiile tumorei. Reactivii conform invenției asigură baza procedeelor imagistice de diagnosticare rapide, ieftine și neinvazive, utile pentru detectarea tumorii, a stadiului bolii și evaluarea evoluției metastatice a tumorilor caracterizate prin exprimarea sau supraexprimarea receptorilor de CT. Reactivii conform invenției asigură baza pentru evaluarea eficacității terapeutice a altor modalități de tratament, de exemplu, prin localizarea celulelortumorale care exprimă receptorul de CT, care urmează unei intervenții chirurgicale, terapiei prin radiații sau chemoterapiei. Reactivii conform invenției pot fi folosiți și ca fragmente de țintire pentru radioterapia localizată.

Invenția oferă reactivi de legare a receptorului de CT, cuprinde compuși de legare a receptorului de CT, de preferință, peptide CT, derivați CT sau analogi CT, care sunt legați covalent la un agent de chelatizare a unui radiometal. Compușii de legare a receptorului de CT, folosiți în reactivii conform invenției, au o masă moleculară mai mică de aproximativ 10.000 Da. în unele realizări, reactivii conform invenției sunt caracterizați ca peptide, în virtutea prezenței unei legături peptidice fie în porțiunea reactivului de legare a receptorului CT, fie în virtutea prezenței unei legături peptidice în chelatorul radiometalului. Reactivii conform invenției au o afinitate de legare a receptorului de CT, care nu este de aproximativ minimum o zecime din afinitatea CT nativ radioiodat pentru respectivul receptor, comparați

RO 120711 Β1 într-o determinare standardizată, cum ar fi analizele descrise în exemplul 4 de mai jos. în 1 realizările preferate, reactivii conform invenției au o afinitate de legare a receptorului de CT egală sau mai mare decât a CT nativ sau a speciilor radioiodate ale CT nativ pentru respec- 3 tivul receptor, când s-au comparat în respectiva analiză standardizată.

Radiofarmaceuticele conform invenției pot fi folosite ca agenți de diagnostic și tera- 5 peutici locali specifici. Când sunt marcați cu technețiu-99m, iod-123 și iod-131, reactivii conform invenției pot fi folosiți ca agenți imagistici scintigrafici. Când sunt marcați cu un metal 7 magnetic, paramagnetic, supermagnetic sau superparamagnetic, reactivii conform invenției pot fi folosiți ca agenți de contrast în rezonanța magnetică. Când sunt marcați cu radionuclide 9 citotoxice, reactivii conform invenției pot fi folosiți pentru radioterapia localizată. Invenția se referă și la compoziții farmaceutice care conțin compuși radiomarcați de legare a receptorului 11 de CT, conform invenției, și un purtător acceptabil farmaceutic. Metodele de obținere a reactivilor de legare a receptorului de CT conform invenției și realizările radiomarcate fac parte 13 tot din prezenta invenție.

Invenția se referă, de asemenea, la truse pentru prepararea compușilor radiomarcați 15 de legare a receptorului de CT din reactivii conform invenției. Trusele conform invenției cuprind o fiolă etanșă care conține o cantitate predeterminată de reactiv, conform invenției, și 17 opțional, o cantitate suficientă dintr-un agent de reducere pentru radiomarcarea reactivului.

Invenția se referă la metode de utilizare, în scop de diagnosticare și terapeutic, a re- 19 activilor radiomarcați de legare a receptorului de CT, conform invenției. într-o realizare, metodele se referă la utilizarea reactivilor conform invenției, în formă marcată, pentru poziții ima- 21 gistice într-un corp de mamifer prin obținerea imaginilor in vivo. Aceste metode cuprind etapele de administrare a unei cantități eficiente pentru diagnosticare de reactivi marcați, con- 23 form invenției și detectarea marcajului localizat în corpul mamiferului.

Invenția se referă, de asemenea, la metode de ameliorare a afecțiunilor caracterizate 25 prin expresia sau supraexpresia receptorilor de CT care cuprind etapa de administrare a unei cantități eficiente terapeutic de reactivi radiomarcați de legare a receptorului de CT, conform 27 invenției, la un animal.

Alte aspecte și avantaje ale prezentei invenții sunt evidențiate de descrierea detaliată 29 și de realizările preferate, prezentate în continuare.

Invenția se referă la reactivi de legare a receptorului de CT, utili în prepararea agen- 31 ților farmaceutici de legare a receptorului de CT, pentru diagnostic și terapie. în prezenta invenție, termenul compus de legare a receptorului de CT se referă la CT care se găsește 33 în mod natural, la fragmente de CT, analogi ai CT și derivați ai CT, care se leagă specific la receptorul de CT exprimat într-o varietate de tipuri de celule recunoscute de specialiștii în 35 domeniu. Sunt incluși în această definire, și prin urmare și în prezenta invenție, compușii desemnați a mima proprietățile de legare a receptorului de CT. 37 în prezenta invenție, termenul afinitate de legare a receptorului de CT se referă la afinitatea de legare, măsurată prin orice metodă cunoscută de specialiștii în domeniu, inclu- 39 zând printre altele, acele metode care măsoară afinitatea de legare printr-o constantă de disociere, o constantă de inhibare sau o valoare IC50. 41

Termenul având o afinitate de legare a receptorului de CT de minimum o zecime din afinitatea CT radioiodat pentru respectivul receptor se referă la aceea că constanta de diso- 43 ciere (K_d) a reactivului nu este mai mică de zece ori decât (K_d) al CT radioiodat, măsurată într-o analiză a legării directe a receptorului CT sau de inhibare competitivă, sau constanta 45 de inhibare (K_f) sau IC50 a reactivului nu este mai mare de 10 ori decât cea a CT radioiodat, determinată într-o analiză de inhibare competitivă a receptorului CT. 47

RO 120711 Β1

Termenul având o afinitate de legare a receptorului de CT egală cu sau mai mare decât a CT nativ sau a speciilor radioiodate ale CT pentru respectivul receptor de CT se referă la reactivii care au o constantă de disociere (K_d) egală sau mai mare decât a CT nemarcat sau CT radioiodat, așa cum se determină dintr-o analiză a legării directe a receptorului CT sau a inhibării competitive. Ca variantă, acest termen poate fi interpretat ca cuprinzând reactivii care au o constantă de inhibare (Kj) sau IC50 egală sau mai mică decât cea a CT nativ sau CT radioiodat, măsurată într-o analiză a inhibării competitive a receptorului CT.

Reactivii conform invenției au o afinitate de legare a receptorului de CT de cel puțin zece ori mai mare decât afinitatea CT nativ radioiodat pentru respectivul receptor, comparată într-o analiză standard descrisă mai jos. în realizări preferate, reactivii conform invenției au o afinitate de legare a receptorului de CT egală cu sau mai mare cu a CT nativ sau a speciilor radioiodate ale CT nativ pentru respectivul receptor, dacă se compară în respectiva analiză standardizată.

Constantele de disociere sau constantele de inhibare a legăturii, ale produselor radiofarmaceutice, conform invenției, raportate la receptorul de CT, precum și compararea afinității sau avidității unei astfel de legăturii cu legarea însăși a CT marcat cu¹²⁵l pot fi determinate folosind metode cunoscute, cum ar fi cele prezentate în Receptors, A Quantitative Approach. A. Levitzki, The Benjamin/Cummings Publishing Company (California, 1984). O analiză standardizată de legare a receptorului de CT, cum arfi analizele prezentate în exemplul 4 de mai jos, este folosită pentru a măsura afinitatea de legare a receptorului de CT a reactivilor conform invenției.

Pe lângă compusul de legare a receptorului de CT, reactivii conform invenției cuprind un chelator de radiometal care este legat covalent la compus, într-un astfel de mod, încât specificitatea de legare a compusului pentru receptorul de CT nu este alterată substanțial. Orice chelator de radiometal poate fi legat covalent la un compus de legare a receptorului de CT, cu obținerea unui reactiv conform invenției. De exemplu, un compus de legare a receptorului de CT, de preferință o peptidă, poate fi legat covalent la un chelator cu formula:

C(pgp)^s-(aa)-C(pgp)^s în care (pgp)^s este hidrogen sau o grupare tiol de protecție și (aa) este orice a-sau β-aminoacid care nu conține o grupare tiol. într-o formă de realizare preferată, -aminoacidul este glicina.

Alt exemplu este acela în care chelatorul de radiometal folosit în reactivii conform invenției cuprinde o singură grupă care conține tiol cu formula:

A-CZ(B)-[C(R^aR^b)]n X în care A este H, HOOC, H2NOC, (peptidă)-NHOC, (peptidă)-OOC, Re°₂NCO, sau R^d; B este H, SH sau -NHR^C, -N(R^d)-(peptidă) sau R^d; Z este H sau R^d; X este SH sau -NHR^C, N(R'Mpeptidă) sau R^d; R^a, R^b, R^c și R^d sunt independent H sau alchil inferior cu catenă liniară sau ramificată sau ciclic; n este 0,1 sau 2; R^e este alchil C1-C4, un aminoacid sau o peptidă care conține 2 până la aproximativ 10 aminoacizi; și: (1) când B este -NHR^C sau -N(R^C)(peptidă), X este SH și n este 1 sau 2; (2) când X este NHR^C sau N(R^c)-(peptidă), B este SH și n este 1 sau 2; (3) când B este H sau R^d, Este HOOC, H2NOC, (peptidă)-NHOC, sau (peptidă)-OOC, X este SH și n este 0 sau 1; (4) când A este H sau R^d, atunci când B este SH, X este NHR^C sau -N(R^c)-(peptidă) și când X este SH, B este NHR^C sau -N(R^c)-(peptidă) și n este 1 sau 2: (5) când X este H sau R^d, A este HOOC, H₂NOC, (peptidă)-NHOC, sau

RO 120711 Β1 (peptidă)-OOC și B este SH; (6) când Z este metil, X este metil, A este HOOC, H₂NOC, 1 (peptidă)-NHOC, sau (peptidă)-OOC și B este SH și n este 0; și (7) când B este SH, X nu este SH și când X este SH, B nu este SH. 3

Forme de realizare preferate ale acestui chelatorde radiometal au formula chimică:

R¹-CO-(aminoacid)¹-(aminoacid)²-Z în care (aminoacid)¹ și (aminoacid)² sunt fiecare independent orice a- sau β-aminoacid primar care nu conține o grupare tiol. Z este un fragment care conține tiol, adică cisteină, homo- 9 cisteină, izocisteină, penicilamină, 2-mercaptoetilamină sau 3-mercaptopropilamină, și R¹ este alchil inferior C^C^ un aminoacid sau o peptidă care conține 2 până la 10 aminoacizi. 11 Dacă Z este cisteină, homocisteină, izocisteină sau penicilamină, gruparea carbonil a respectivului fragment este legată covalent la o grupare hidroxil, o grupare NR³R⁴în care fiecare 13 dintre R³ și R⁴ sunt independent H sau alchil inferior un aminoacid sau o peptidă care conține 2 până la 10 aminoacizi sau 15

Y-(aminoacid)²-(aminoacid)¹-NHR² 17 în care Y este un fragment care conține tiol, adică cisteină, homocisteină, izocisteină, peni- 19 cilamină, 3-mercaptoacetat sau 3-mercaptopropionat, (aminoacid)¹ și (aminoacid)² sunt fiecare independent orice a- sau β-aminoacid primar care nu conține o grupă tiol și R² este H 21 sau alchil inferior C,-C₄, un aminoacid sau o peptidă care conține 2 până la 10 aminoacizi.

Când Y este cisteină, homocisteină, izocisteină sau penicilamină, gruparea amino a respec- 23 tivului fragment este legată covalent la H, un aminoacid sau o peptidă care conține 2 până la 10 aminoacizi. 25 în realizări particulare ale acestui aspect al invenției, formula acestui chelator de radiometal este aleasă din grupul format din:27

- (aminoacid)¹-(aminoacid)²-A-CZ(BHC(R¹R²))_n-X},

- A-CZ(B)-{C(R¹R²)}_ri-X}-(aminoacid)¹-(aminoacid)²,29

- (diaminoacid primar a,ω-sau β,ω)-(3Γπίηο3^)¹-Α-ΌΖ(Β)-{'·^:(Ρ^²)}_η-Χ}, și

- A-CZ(B)-{C(R¹R²)}_ri-X}-(aminoacid)¹-(diaminoacid primar α,β-sau α,γ)31 în care (aminoacid)¹ și (aminoacid)² sunt fiecare independent orice a- sau β- aminoacid natural, modificat, substituit sau alterat, care nu conține o grupare tiol; A este H, HOOC, H₂NOC,33 (aminoacid sau peptidă)-NHOC, (aminoacid sau peptidă)-OOC sau R⁴; B este H, SH sau

NHR³, N(R³)-(aminoacid sau peptidă) sau R⁴; Z este H sau R⁴; X este SH sau NHR³; -N(R³)-35 (aminoacid sau peptidă) sau R⁴; R¹, R², R³ și R⁴ sunt independent H sau alchil inferior cu catenă liniară sau ramificată sau ciclic; n este un număr întreg, care este 0,1 sau 2; (peptidă) 37 este o peptidă cu 2 până la aproximativ 10 aminoacizi; și (1) când B este -NHR³ sau -N(R³)(aminoacid sau peptidă), X este SH și n este 1 sau 2; (2) când X este -NHR³ sau -N(R³)- 39 (aminoacid sau peptidă), B este SH și n este 1 sau 2; (3) când B este H sau R⁴, A este HOOC, H₂NOC, (aminoacid sau peptidă)-NHOC, (aminoacid sau peptidă)-OOC, X este SH41 și n este 0 sau 1; (4) când A este H sau R⁴, atunci când B este SH, X este -NHR³sau -N(R³)(aminoacid sau peptidă) și când X este SH, B este -NHR³ sau -N(R³)-(-aminoacid sau pep-43 tidă) și n este 1 sau 2; (5) când X este H sau R⁴, A este HOOC, H2NOC, (aminoacid sau peptidă)-NHOC, (aminoacid sau peptidă)-OOC și B este SH; (6) când Z este metil, X este45 metil, A este HOOC, H₂NOC, (aminoacid sau peptidă)-NHOC, (aminoacid sau peptidă)-OOC și B este SH și n este 0; și (7) când B este SH, X nu este SH și când X este SH, B nu este 47 SH. Realizări preferate, în mod special, ale acestui aspect al invenției, includ chelatori de

RO 120711 Β1 radiometal cu formula aleasă din grupul format din: -Gly-Gly-Cys-, Cys-Gly-Gly-, Gly-GlyCys-, -(e-Lys)-Gly-Cys-, (0-Om)-Gly-Cys-, -(y-Dab)-Gly-Cys-, -(P-Dap)-Lys-Cys- și -(β-Dap)Gly-Cys- (în aceste formule, se înțelege că ε-Lys reprezintă un rest de lizină în care gruparea ε-amino, și nu gruparea tipică α-amino, este legată covalent la gruparea carboxil a aminoacidului adiacent, pentru a forma o legătură peptidică; δ-Om reprezintă un rest de ornitină în care gruparea δ-amino, și nu gruparea tipică α-amino, este legată covalent la gruparea carboxil a aminoacidului adiacent, pentru a forma o legătură peptidică; γ-Dab reprezintă un rest de acid 2,4-diamino-butiric în care gruparea γ-amino este legată covalent la gruparea carboxil a aminoacidului adiacent, pentru a forma o legătură peptidică; și β-Dap reprezintă un rest de acid 1,3-diaminopropionic în care gruparea β-amino este legată covalent la gruparea carboxil a α-aminoacidului adiacent, pentru a forma o legătură peptidică).

într-o altă realizare, chelatorul de radiometal al reactivului conform invenției este un chelator bisamino-bistiol cu formula:

NH I	N-A-CO-peptide w
S-(pgp)s	S-<Pgp)‘

în care fiecare n poate fi independent n, CH₃ sau C₂H₅, fiecare (pgp)^s poate fi independent o grupare de protecție tiol sau H; m, n și p sunt independent 2 sau 3; A este alchil inferior liniar sau ciclic, arii, heterociclil, combinații sau derivați substituiți ai acestora; și X este peptidă. Ca alternativă, chelatorul bisamino bistiol, în această realizare a invenției, are formula:

NH |	N-A-CH(V)NHR'
	(CR»)P
S-(pgp)s	S-(pgp)s

în care fiecare R este independent H, CH₃ sau C₂H₅, m, n și p sunt independent 2 sau 3; A este alchil inferior liniar sau ciclic, arii, heterociclil, combinații sau derivați substituiți ai acestora; V este H sau CO-peptidă; R' este H sau peptidă; cu condiția că dacă V este H, R este peptidă și dacă R¹ este Η, V este CO-peptidă. în prezenta invenție, fragmentele de chelatizare având aceste structuri sunt desemnate ca fragmente BAT.

Ca alternativă, chelatorul de radiometal utilizat în reactivul conform invenției poate avea o formulă aleasă din grupul format din: acid dietilentriaminopentaacetic (DTPA) (HOOCCH₂)₂N(CR₂)(CR₂)N(CH₂COOH)(CR₂)(CR₂)N(CH₂COOH)în care fiecare R este independent H, alchil C, la C₄, sau arii și un R este legat covalent la un agent de legare bivalent; acid etilendiaminotetraacetic (EDTA): (HOOCCH₂)2N(CR₂)(CR₂)N(CH₂COOH);

RO 120711 Β1 în care fiecare R este independent H, alchil C, la C₄, sau arii și un R este legat 1 covalent la un agent de legare bivalent;

acid 1,4,7,10-tetraazadodecanetetraacetic: 3

în care n este un număr întreg, care este 2 sau 3, și în care fiecare R este independent H, alchil C,-C₄ sau arii și un R este legat covalent la compusul de legare a receptorului de CT și desferioxamina.

Majoritatea radiometalelor pot fi chelatizate la reactivii conform invenției care conțin chelatorii de radiometale menționați.

Reactivii conform invenției pot cuprinde, de asemenea, un chelatorde radiometal ales din grupul format din:

(ii) o grupă cu formula:

în care n, m și p sunt fiecare numere întregi, care sunt independent 0 sau 1; fiecare 43 R' este independent H, alchil inferior, hidroxialchil C₂-C₄, sau alcoxi-C₂-C₄ alchil, și fiecare R este independent H sau R în care R este alchil inferior substituit sau nesubstituit, sau fenil 45 care nu conține o grupare tiol, și un R sau R¹ este L, în care L este un fragment de legătură bivalent care leagă chelatorul de metal la fragmentul țintă și în care un R este L, NR'₂ este 47 o amină.

RO 120711 Β1 în realizări preferate, L este o grupare alchil Cf-C₅ cu catenă liniară, ramificată sau ciclică, un ester carboxilic, o carboxamidă, o sulfonamidă, un eter, un tioeter, o amină, o alchenă, o alchină, un ciclu benzenic, opțional substituit, legat 1,2-, 1,3- sau 1,4-, sau un aminoacid sau o peptldă cu 2 până la aproximativ 10 -aminoacizi, sau combinații ale acestora.

în realizări preferate, R este o grupare alchil CfCg liniară, ramificată sau ciclică; o grupare -C_qOC_r, -C_qNHC; sau -C_qSC_r, în care q și rsunt numere întregi, fiecare independent de la 1 la 5, în care suma q + rnu este mai mare de 6; (Cf-CgJ-alchil-Xîn care X este o grupă hidroxil, o amină substituită, o guanidină, o amidină, o grupă tiol substituită sau un acid carboxilic, ester, fosfat, sau o grupă sulfat; o grupă fenil sau o grupă fenil substituită cu un halogen, hidroxil, amină substituită, guanidină, amidină, tiol substituit, eter, fosfat, sau o grupă sulfat; o grupă îndoi; o grupă heterociclică Cf-Cg care conține 1 până la 3 atomi de azot, oxigen sau sulf sau combinații ale acestora.

Conform prezentei invenții, chelatorul de radiometal al reactivului de legare a receptorului de CT poate avea formula;

O

NH HN

NR’R²

UI în care Rf și R₂ sunt fiecare independent H, alchil inferior, hidroxialchil C₂-C₄ sau alcoxialchil C₂-C₄; R³, R⁴, R⁵ și R⁶ sunt independent H, alchil inferior substituit sau nesubstituit, sau fenil care nu conține o grupă tiol; R⁷ și R⁸ sunt fiecare independent H, alchil inferior, hidroxialchil inferior sau alcoxialchil inferior; L este o grupare de legătură bivalentă și Z este o peptidă CT.

Suplimentar, chelatorii de metal preferați, conform invenției, includ chelatori cu formula:

IV în care R¹ și R² sunt fiecare independent H, alchil inferior, hidroxialchil C2-C4 sau alcoxialchil C2-C4; R³, R⁴, R⁵ și R⁶ sunt independent H, alchil inferior substituit sau nesubstituit, sau fenil care nu conține o grupare tiol, și unul dintre R³, R⁴, R⁵ sau R⁶ este Z-LHN(CH2)_n, în care L este o grupare de legătură bivalentă, Z este un fragment de țintire; și n este un număr întreg de la 1 la 6; R⁷ și R⁸ sunt fiecare independent H, alchil inferior, hidroxialchil inferior sau alcoxialchil inferior; și X este o grupare amino, o grupare amino substituită sau -NR¹-Y, în care Y este un aminoacid, o aminoacid amidă sau o peptidă care conține de la 2 la 10 aminoacizi.

RO 120711 Β1

Chelatorii de metal mai preferați, conform invenției, includ chelatori cu formula:

în care R¹ și R² sunt fiecare independent H, alchil inferior, hidroxialchil inferior sau alchenilalchil inferior; R³ și R⁴ sunt independent H, alchil inferior substituit sau nesubstituit, sau fenil care nu conține o grupare tiol; n este un număr întreg de la 1 la 6, L este o grupare de legătură bivalentă și Z este un fragment de peptidă CT.

Fragmente de chelatizare mai preferate, suplimentare, includ chelatori cu formula:

în care L este o grupare de legătură bivalentă și Z este un fragment de peptidă CT. 25 Cele mai preferate fragmente de chelatizare, conform invenției, includ chelatori cu următoarele formule:27 (aminoacid)¹-(aminoacid)²-cisteină-, (aminoacid)¹-(aminoacid)²-izocisteină-,29 (aminoacid)¹-(aminoacid)²-homocisteină-, (aminoacid)¹-(aminoacid)²-penicilamină-,31 (aminoacid)¹-(aminoacid)²-2-mercaptoetilamină-, (aminoacid)¹-(aminoacid)²-2-mercaptopropilamină-,33 (aminoacid)¹-(aminoacid)²-2-mercapto-2-metilpropilamină-, (aminoacid)¹-(aminoacid)²-3-mercaptopropilamină-,35 în care (aminoacid) este un a- sau β-aminoacid care nu conține o grupare tiol și în care chelatorul este atașat fie la un fragment de țintire, fie la o grupare de legătură prin inter- 37 mediul unei legături covalente cu carboxilul terminal al chelatorului sau o catenă laterală de la una din grupele aminoacidului. 39

Cei mai preferați chelatori includ chelatorii cu formula de mai sus, în care (aminoacid)¹ este fie un α,ω- sau β,ω-aminoacid, în care gruparea a- sau β-amino este o amină 41 liberă și α,ω- sau β,ω-aminoacidul este legat covalent prin gruparea ω-amino.

Alți chelatori foarte preferați includ pe cei selectați din grupul format din:43

- cisteină-(aminoacid)-(a^- sau β,γ diaminoacid);

- izocisteină-(aminoacid)-(a^- sau β,γ-diaminoacid);45

- homocisteină-(aminoacid)-(a^- sau β,γ-diaminoacid);

- penicilamină-(aminoacid)-(a^- sau β,γ-diaminoacid);47

- acid 2-mercaptoacetic-(aminoacid)-(a^- sau β,γ-diaminoacid);

RO 120711 Β1

- acid 2- sau 3-mercaptopropionic -(aminoacid)-(a^- sau β,γ-diaminoacid);

- acid 2-mercapto-2-metilpropionic-(aminoacid)-(a^- sau β,γ-diaminoacid);

în care (aminoacid) este un a- sau β-aminoacid primar care nu conține o grupare tiol și în care chelatorul este atașat fie la un fragment de țintire, fie la o grupare de legătură printr-o legătură covalentă cu gruparea amino terminală a chelatorului sau cu o catenă laterală de la una din grupările aminoacidului.

Chelatori de metal preferați în mod deosebit sunt selectați din grupul format din: GlyGly-Cys-, Arg-Gly-Cys-, -(e-Lys)-Gly-Cys-, -(0-0m)-Gly-Cys-, -(γ Dab)-Gly-Cys-, -(β-Dap)Lys-Cys-. și -$-Dap)-Gly-Cys-: (în aceste formule, denumirea aminoacizilor are aceeași semnificație ca mai sus.)

Un exemplu de chelatororde radiometal cu structura III de mai sus este Gly-Gly-Cys-, în care fragmentul de chelatizare are structura:

VII.

compus de legare a receptorului de calcitonină.

Liganzi de chelatare cu structura de tip VII formează complecși oxotechnețiu cu structura:

vm.

compus de legare a receptorului de calcitonină.

Un exemplu de chelator de radiometal cu structura de tip V, așa cum s-a prezentat mai sus, este Lys-(o)-peptidă)-Gly-Cys.amidă care formează un chelator cu structura:

compus de legare a receptorului de calcitonină.

Liganzi de chelatizare cu structura de tip IX formează complecși oxotechnețiu cu structura:

RO 120711 Β1

compus de legare a receptorului de calcitonină.

Un exemplu de reactiv conform invenției, care conține un chelator de radiometal cu 9 structura II, așa cum s-a prezentat mai sus, este (grupă de țintire)-Cys-Gly-a,p-diaminopropionamidă care formează un chelator cu structura: 11

compus de legare a receptorului de calcitonină.

Agenții de radiodiagnostic cu structura de tip XI formează complecși oxotechnețiu cu structura:

compus de legare a receptorului de calcitonină.

în chelatorii de radiometal și reactivii de legare ai receptorului de CT, conform invenției, care conțin un tiol legat covalent la o grupare de protecție tiol [(pgp)s], gruparea de protecție tiol poate fi aceeași sau diferită și poate fi, dar nu se limitează la:

-CH₂-aril (arii este fenil sau fenil substituit cu alchil sau alchiloxi);

-CH-(aril)₂, (arii este fenil sau fenil substituit cu alchil sau alchiloxi);

-C-(aril)₃, (arii este fenil sau fenil substituit cu alchil sau alchiloxi); -CH₂-(4-metoxifenil);

-CH-(4-piridil)(fenil)₂;

-C(CH₃)₃;

-9-fenilfluorenil;

-CH₂NHCOR (R este alchil nesubstituit sau substituit, sau arii);

-CH₂-NHCOOR (R este alchil nesubstituit sau substituit, sau arii);

-CONHR (R este alchil nesubstituit sau substituit, sau arii);

-CH₂-S-CH₂-fenil.

RO 120711 Β1

Grupele de protecție preferate au formula -CH₂-NHCOR, în care R este un alchil inferior având între 1 și 8 atomi de carbon, fenil sau fenil-substituit cu alchil inferior, hidroxil, alcoxi inferior, carboxi sau alcoxicarbonil inferior. Cea mai preferată grupare de protecție este gruparea acetamidometil.

Când reactivul conform invenției cuprinde un compus de legare a receptorului de CT, care este o peptidă, peptida, de preferință, cuprinde secvența de aminoacizi:

CH,CO.SNLSTX- SECV. ID NR. 10 în care X este ales din grupul format dintr-un rest de cisteină, un rest de homocisteină și un rest de homohomocisteină. Ca alternativă, peptida poate cuprinde secvența de aminoacizi:

CH2CO.X¹NLSTX²~

SECV. IDNR. 11 în care X² este ales din grupul format dintr-un rest de alanină, un rest de glicină și un rest de serină; și X² este ales din grupul format dintr-un rest de cisteină, un rest de homocisteină și un rest de homohomocisteină. Astfel de peptide includ CT natural uman și analogi de peptidă CT, cum ar fi cei care sunt specificați în secvențele de aminoacizi prezentate mai jos:

CH,CQ.SNLST.Hhc.VLGKLSCELHKLQTYPRTNTGSGTP.amidă

CH₂CO.SNLST.Hcv.VLGKLSCELHKLQTYPRTNTGSGTP.amidă

CH₂CO.SNLST.Cys.VLGKLSCELHKLQTYPRTNTGSGTP.amidă (SECV.ID Nr.5), (SECV.ID Nr.6), (SECV.ID Nr.7),

Și

SNLST.Asu.VLGKLSCELHKLQTYPRTNTGSGTP.amidă (SECV.ID Nr.8).

Realizările preferate, în mod special, ale reactivilor conform invenției, includ:

CH_?CO.SNLST.Hhc.VLGKLSCfBADELHKLQTYPRTNTGSGTP.amidă (SECV.ID Nr.4),

CH₂CO.SNLST.Hhc.VLGKLSQELHKI_QTYPRTNTGSGTP(F.-K)GCamidă.

CH,CQ.SNLST.Hhc.VLGKLSC(CH-,CO.GGCK.amidă1ELHKLQTYPRTNTGSGTP.arnidă·

CHoCQ.SNLST.Hhc.VLGKLSCiCHoCO.fB-DaDlKCK.amidăjELHKLQTYPRTNTGSGTP.amidă,

CH,CO.SNLST.Hhc.VLGKLSC(CH₂CO.(£-K)GCE.amidă)ELHKLQTYPRTNTGSGTP.amidă₇

CH,CQ.SNLST.Hcv.VLGKLSC(CH₂CO.GGCK.amidă)ELHKLQTYPRTNTGSGTP.arnidă.

CH₉CQ.SNLST.Hcv,VLGKLSC(CHXQ.(B-DaD)KCK.amidă)ELHKLQTYPRTNTGSGTP.amidă,

CH-,CO.SNLST.Hcv.VLGKLSC(CH₂CQ.(£-K)GCE.amidă)ELHKLQTYPRTNTGSGTP.amidă.

CH,CO.SNLST.Cvs.VLGKLSC(CH₂CQ.GGCK.amidă)ELHKLQTYPRTNTGSGTP.amidă.

CH,CO.SNLST.Cvs.VLGKLSC(CH-,CO(3-DaD)KCK.amidă)ELHKLQTYPRTNTGSGTP. amidă,

CH₂CO.SNLST.Cvs.VLGKLSC(CH₂CO.(s-K)GCE.amidă)ELHKLQTYPRTNTGSGTP.amidă. SNLST..Asu.VLGKLSC(CH2CO.(B-DaD)KCK.amidă^AELHKLQTYPRTNTGSGTP.amidă. și ȘNLȘLAșu.VLGKLSC(CH₂CO.(p-Dap)KCK.amidă)ELHKLQTYPRTDVGAGTP.amidă.

Toți aminoacizii naturali sunt abreviați folosind abrevieri standard (care pot fi găsite în G. Zubay, Biochemistry (2d. ed.). 1988 (MacMilIen Publishing: New York, p.33). în prezenta invenție, aminoacizii naturali sunt caracterizați ca lipofili (alanina, izoleucina, leucina, metionina, fenilalanina, tirosina, prolina, triptofan și valina, precum și derivații S-alchilați ai cisteinei), hidrofili (aspargina, glutamina, treonina, serina), acizi (acid glutamic și acid aspartic), bazici (arginina, histidina și lizina). ε-Κ, δ-Orn, β-Dab și β-Dap au semnificațiile de mai sus. (BAT) reprezintă acid N⁶,N⁹-b/s(2-mercapto-2-metil-propil)-6,9-diazanonanoic; K.(BAT) și Lys. (BAT) reprezintă -aminoacidul, lizina acilată la gruparea ε-amino din catena laterală

RO 120711 Β1 a aminoacidului cu (BAT); C(BAT) și Cys(BAT) reprezintă S-(N⁶,N⁹-b/s(2-mercapto-2-metil- 1 propil)-6,9-diazanonan-1-il)cisteină; (BAM) este (N⁴,N⁴-b/s(2-mercapto-2-metilpropil)-1,4,10triazadecan; (BAT-BM)este N-(2-(N',N'-b/s(2-maleimidoetil)aminoetil}-N⁹-(t-butoxicarbonil)- 3 N⁶,N⁹-b/s(2-metil-2-trifenil-metiltiopropil)-6,9-diazanonanamida; (BAT-BS) este N {2-(N',N'b/s(2-succinimidoetil)aminoetil)-N⁶,N⁹-b/s(2-mercapto-2-metil-propil)-6,9-diazanonanamidă; 5 (BMH) este b/s-maleimidohexan; (BSH) este b/s-succinimidohexan; (BMME) este b/s-maleimidometileter; (BSEE) este b/s-succinimidoetileter; (BMEE) este b/s-maleimidoetileter; și 7 (BSME) este b/s-succinimidometileter. Așa cum se utilizează în prezenta invenție, următorii aminoacizi și analogi de aminoacid sunt reprezentați prin următoarele prescurtări: Acm este 9 grupare de protecție acetamidometil a sulfhidrilului; Pen este penicilamina; Aca este acidul 6-aminocaproic; Hly este homolizina; Ape este L-{S-3-aminopropil)-cisteina; F_D este D-fenil- 11 alanină; W_D este D-triptofan: Y_D este D-tirosina; Cpa este L-(4-clorfenil)alanina; Thp este acidul 4-amino-tetrahidrotiopiran-4-carboxilic; D-Nal este D-2-naftilalanina; Dpg este dipropil- 13 glicina; Nle este norleucina; Hcy este homo-cisteina; Hhe este homohomocisteina; Aib este acid aminoizobutiric; Nai este 2-naftilalanina; D-Nal este D-2-ηaftilalanina; Ain este acidul 2- 15 aminoindan-2-carboxilic: Achxa este4-amino-ciclohexilalanina; Amf este4-aminometil-fenilalanina; Aec este S-(2-aminoetil)cisteina; Ape este S-(3-aminopropil)cisteina; Aes este O-(2~ 17 aminoetil)serina; Aps este O-(3-aminopropil)serina; Abu este acidul 2-aminobutiric; Nva este norvalina; și Asu este acidul 2-amino suberic, în care aminoacizi cu capătul amino terminal 19 din peptidele care conțin un rest Asu sunt ciclizați printr-o legătură amido între grupa amino cu amino terminal și fragmentul de acid carboxilic din catena laterală a restului Asu. 21

Conform invenției, peptidele de legare a receptorului de CT pot cuprinde unul sau mai mulți derivați de aminoacid având un chelator de radiometal legat la o catenă laterală de 23 aminoacid. De preferință, chelatorul de radiometal esteîncorporatîn peptidă la carbonilul terminal al peptidei de legare a receptorului de CT. Mai preferat, chelatorul de radiometal este 25 încorporat în peptida sintetică de legare a receptorului de CT, la atomul de sulf din catena laterală a cisteinei corespunzător la poziția 14 din peptida nativă. Cel mai preferat, chelatorul 27 de radiometal este încorporat în catena laterală a unui aminoacid din peptida de legare a receptorului de CT având secvența 29

CH₂CO.SNLST.Hhc.VLGKLSCELHKLQTYPRTNTGSGTP.amidă (SECV ID Nr.9).

Cel mai preferat, chelatorul de radiometal este încorporat în peptida de legare a 31 receptorului de CT la atomul de sulf din catena laterală a cisteinei la poziția 13 a peptidei din SECV ID Nr.9 (evidențiată prin bolduirea din SECV ID Nr.9). 33

Forme de realizare suplimentare a reactivilor, conform invenției, cuprind cel puțin doi compuși sintetici de legare a receptorului de CT, fiecare compus fiind legat covalent la un 35 chelator de radiometal, și un agent de legare polivalent care formează o legătură covalentă selectată din grupul constând dintr-o legătură la fiecare compus, o legătură la fiecare che- 37 lator și o legătură la un compus și la un chelator al altui compus. Se pot efectua, de asemenea, permutări suplimentare ale acestui mod de realizare, în conformitate cu invenția. Agenți 39 de legare polivalenți, adecvați pentru utilizare în această realizare a invenției, cuprind cel puțin două grupări funcționale identice, capabile de legare covalentă la analogii CT, la corn- 41 pușii de legare a receptorului de CT, la peptide CT sau la chelatori de radiometal sau grupări capabile de legare atât la un compus de legare a receptorului de CT, cât și la un chelator de 43 radiometal. Grupele funcționale preferate includ, fără a fi limitate la amine primare, amine secundare, grupări hidroxil, grupări de acid carboxilic sau grupe tiol reactive. în realizări 45 preferate, agenții de legare polivalenți cuprind b/s-succinimidilmetileter (BSME), bissuccinimidiletileter (BSEE), acid 4-(2,2-dimetilacetil)benzoic (DMBA), N-{2-(N',N-tr/s(2- 47 succinimido-etil)aminoetil}-N⁶,N⁹-b/s-(2-metil-2-mercapto-propil)-6,9-diazanonanamidă (BAT15

RO 120711 Β1

BS), tr/s (succinimidiletil)amina (TSEA), b/s-succinimido-hexan (BSH), 4-(O-CH₂CO-Gly-GlyCys.amidă)-2-metilpropiofenonă (ETAC), t/7s(acetamidoetil)amină, b/s-acetamidometil eter, b/s-acetamidoetil eter, α,ε-b/s-acetillizina, lizina și 1,8-b/s-acetamido-3,6-dioxa-octan sau derivați ai acestora.

Compușii de legare ai receptorului de CT, conform invenției, pot fi sintetizați chimic in vitro, folosind orice metodă de sinteză adecvată. De preferință, peptidele CT pot fi sintetizate, conform invenției, folosind metode de recombinare. Mai preferat, peptidele CT, derivații de peptide CT și analogii de peptide CT pot fi preparați, în mod avantajos, în conformitate cu prezenta invenție, folosind un sintetizator de peptide. Peptidele CT, conform invenției, sunt sintetizate, de preferință, prin legarea covalentă a chelatorului de radiometal la peptidă, în timpul sintezei chimice in vitro, folosind tehnici cunoscute specialiștilor în domeniu, cum arfi sinteza peptidei în fază solidă. în acest mod, chelatorul de radiometal poate fi încorporat în peptidă în mod selectiv, la orice poziție virtuală din peptidă, evitând astfel o descreștere a afinității și specificității peptidei pentru receptorul de CT.

Conform invenției, peptidele de legare a receptorului de CT se prepară având un aminoacid care conține tiol protejat, în mod tipic, un rest de cisteină încorporat în peptidă. După scindarea peptidei de rășina sintetică și ciclizarea restului amino terminal, se deprotejează gruparea tiol și se prevede cu o grupare prostetică care conține un chelator de radiometal și o grupare tiol reactivă.

După cum s-a arătat mai sus, reactivii de legare a receptorului de CT, conform invenției, sunt capabili de a fi radiomarcați pentru a obține agenți de radiodiagnostic sau radioterapeutici. O utilizareîn radiodiagnostic a reactivilor radiomarcați, conform invenției, o constituie imagistica scintigrafică, în care se poate determina localizarea și mărimea tumorilor care poartă receptori de CT. Termenul agent imagistic scintigrafic, așa cum este utilizat în prezenta invenție, reprezintă un reactiv radiomarcat capabil de a fi detectat cu mijloace de detectare a radioactivității (incluzând, dar nefiind limitate la un numărător gamma sau o sondă detectoare a scintilației). în realizări radioterapeutice, conform invenției, reactivii de legare a receptorului de CT sunt marcați cu o radionuclidă citotoxică și sunt folosiți în tratamentul bolilor sau al altor afecțiuni la animale, de preferință la om, cum ar fi bolile sau afecțiunile caracterizate prin expresia sau supraexpresia receptori lor de CT. Bolile sau afecțiunile legate de CT includ, dar nu sunt limitate la cancer mamar, cancerul ovarian, cancer pulmonar, limfoame și alte boli caracterizate prin creșterea tumorilor maligne sau benigne capabile de a lega compușii de legare ai receptorului de CT, CT sau derivații sau analogii acestora prin expresia receptorilor de CT pe suprafața celulelor care conțin astfel de tumori.

Orice radiometal poate fi complexat cu reactivi conform invenției, cu obținerea unui agent de radiodiagnostic sau radioterapeutic. De exemplu, reactivii conform invenției pot fi radiomarcați cu technețiu-99m, iod-125 sau iod-123, cu obținerea unui agent imagistic scintigrafic. Invenția se referă, de asemenea, și la reactivi de legare a receptorului de CT capabili de a forma un complex cu un atom, ion sau particulă de metal magnetic, paramagnetic, supermagnetic sau superparamagnetic. Reactivii de legare a receptorului de CT, conform invenției, pot fi, de asemenea, radiomarcați, în mod avantajos, cu un radioizotop citotoxic selectat din grupul format din scandiu-47, cupru-67, galiu-72, itriu-90, staniu-117m, iod-125, iod-131, samariu-153, gadoliniu-159, disprosiu-165, holmiu-166, iterbiu-175, lutețiu-177, reniu-186, reniu-188, astatin-211, bismut-212, și bismut-213, cu obținerea unui agent radioterapeutic.

Când reactivii conform invenției sunt utilizați pentru a forma un complex de technețiu sau reniu radioactiv, complexul de technețiu, de preferință o sare de technețiu-99m pertechnetat, sau reniu sub formă de perenat, care a reacționat cu reactivul în prezența unui

RO 120711 Β1 agent de reducere. Agenții de reducere preferați sunt ionii ditionit, stanos și feros; cel mai 1 preferat agent de reducere este clorură stanoasă. Ca alternativă, complexul poate fi format prin reacția unui reactiv conform invenției cu un complex labil preformat de technețiu sau 3 reniu și un alt compus cunoscut ca ligand de transfer. Acest procedeu este cunoscut ca procedeu de schimb al ligandului și este bine cunoscut de specialiștii în domeniu. Complexul 5 labil poate fi format folosind astfel de liganzi de transfer, cum ar fi, de exemplu, tartrat, citrat, gluconat sau manitol. Dintre sărurile pertechnetat de technețiu-99m și de reniu, utile în pre- 7 zenta invenție, sunt incluse sărurile de metal alcaline, cum ar fi sarea de sodiu sau sărurile de amoniu sau sărurile de alchil inferior amoniu. 9

Invenția se referă și la o trusă pentru prepararea reactivilor marcați cu radiometal, pentru utilizare ca produse radiofarmaceutice. Trusa conform invenției cuprinde o fiolă 11 etanșă care conține o cantitate predeterminată de reactiv de legare a receptorului de CT, și opțional, dacă radiometalulestetechnețiu-99m, reniu-186sau reniu-188, un agent de redu- 13 cere. De exemplu, o cantitate adecvată de reactiv conform invenției este introdusă într-o fiolă care conține un agent de reducere, cum ar fi clorură stanoasă, într-o cantitate suficientă 15 pentru a marca reactivul cu technețiu-99m, reniu-186 sau reniu-188. O cantitate adecvată de ligand de transfer descris (cum ar fi, de exemplu, tartrat, citrat, gluconat, glucoheptanat 17 sau manitol) poate fi, de asemenea, inclusă în trusă. Trusa mai poate conține materiale farmaceutice convenționale, cum ar fi, de exemplu, săruri acceptabile farmaceutic, pentru a 19 ajusta presiunea osmotică, tampoane, conservanți ș.a. Componentele trusei pot fi în formă lichidă, congelată sau uscată. într-o formă de realizare preferată, componentele trusei sunt 21 în formă liofilizată. Produsele radiofarmaceutice marcate cu technețiu-99m, reniu-186 și reniu-188, conform prezentei invenții, pot fi preparate prin adăugarea unei cantități adecvate 23 de technețiu-99m, reniu-186 sau reniu-188, sau complecși radionuclidici ai acestora, în fiole, și efectuarea reacției în condițiile descrise în exemplul de mai jos. 25

Trusa conform invenției poate fi realizată într-o formă adecvată pentru diagnostic imagistic sau ca agent terapeutic, folosind un radioizotop al iodului, incluzând iod-123 și iod-131, 27 și de preferință iod-123. în această realizare, trusa cuprinde o fiolă etanșă care conține o cantitate predeterminată dintr-un reactiv de legare a receptorului de CT capabil de a fi radio- 29 marcat cu un izotop al iodului. Reactivii de legare a receptorului de CT adecvați pentru utilizare în această realizare includ CT ca atare, un derivat CT, un analog CT, mimetice CT și 31 peptidomimetice CT care se leagă specific la receptorul de CT. Când reactivii de legare la receptorul de CT, peptide și peptidomimetice, sunt folosiți în această realizare, un rest de 33 tirosină din reactiv poate fi radioiodat. Un astfel de rest de tirosină se poate găsi în mod natural în peptidă sau peptidomimetice, sau restul de tirosină poate fi adăugat la o poziție din 35 peptidă sau peptidomimetic, care nu împiedică legarea reactivului la receptorii, CT. Doza, locurile și căile de administrare, formulări și radioactivitatea specifică administrată, folosind 37 trusa acestei realizări, sunt descrise pentru reactivii marcați cu technețiu și reniu, pentru utilizări scintigrafice și terapeutice. 39

Agenții imagistici, conform invenției, sunt utili pentru imagistica tumorii, în mod particular, pentru imagistica pozițiilor neoplazice primare și metastatice caracterizate prin celule 41 neoplazice care exprimă sau superexprimă receptorii de CT și, în special, celulele derivate din tumori primare și, în special, metastatice de cancer mamar, pulmonar și ovarian, care nu 43 s-au putut detecta prin metodologia convențională. Reactivii imagistici, conform invenției, pot fi folosiți și pentru vizualizarea organelor, cum arfi rinichii sau oasele pentru diagnosticarea 45 disfuncțiilor în aceste organe.

în scopul diagnosticării, se administrează, de preferință intravenos, o cantitate 47 eficientă din punct de vedere al diagnosticării de agent de diagnostic sau radiodiagnostic,

RO 120711 Β1 conform invenției. în realizări de radiodiagnosticare, localizarea radiomarcării este detectată folosind metodologii convenționale, cum ar fi scintigrafia gamma. în realizările de diagnosticare neradioactive, localizarea zonelor de acumulare a agențilorde diagnosticare marcați cu metal paramagnetic, conform invenției, este realizată folosind metodologii imagistice de rezonanță magnetică. Conform invenției, pentru imagistica scintigrafică, reactivii marcați cu technețiu-99m se administrează într-o doză injectabilă singulară. Reactivii marcați cu technețiu-99m, conform invenției, pot fi administrați intravenos în orice mediu convențional pentru injectarea intravenoasă, cum ar fi un mediu salin apos sau în mediu de plasmă sanguină. în general, doza unitară pentru administrare are o radioactivitate de aproximativ 0,01 mCi până la aproximativ 100 mCi, de preferință 1 mCi până la 20 mCi. Soluția pentru injectare la doza unitară este de la aproximativ 0,01 până la aproximativ 10 ml. După administrare intravenoasă, imaginea in vivose obține în câteva minute. Totuși, imaginea se poate obține, dacă se dorește, în câteva ore sau mai mult, după injectarea reactivului radiomarcat la un pacient. în majoritatea cazurilor, o cantitate suficientă de doză administrată se acumulează în suprafața care se dorește vizualizată în aproximativ 0,1 dintr-o oră, pentru a permite obținerea scintifotografiilor. în prezenta invenție se poate folosi orice metodă imagistică scintigrafică convențională în scopuri de diagnosticare.

în prezenta invenție, radioterapia se referă la orice efect terapeutic care variază de la calmarea durerii până la ablația tumorii, sau remisia simptomelor asociate cu cancerul care trebuie tratat. Când reactivii conform invenției sunt utilizați pentru scopuri terapeutice, ei sunt radiomarcați cu o cantitate eficientă dintr-un radioizotop citotoxic. Pentru acest scop, o cantitate de radioizotop citotoxic, de la aproximativ 10 la aproximativ 200 mCi, poate fi administrată prin orice cale clinică adecvată, de preferință, prin injectare intravenoasă.

Conform invenției, agenții de radiodiagnostic și radioterapeutici eficienți pot fi identificați după cum urmează. Reactivii conform invenției conținând compuși de legare ai receptorului de CT, incluzând fragmente CT, analogi de peptide CT și derivați CT, sunt sintetizați folosind metode conform invenției, și un chelator de radiometal este legat covalent la compus. Reactivii sunt apoi complexați cu un radiometal sau un izotop neradioactiv având caracteristici de chelatizare similare cu ale radiometalului dorit și legarea receptorului de CT este apoi evaluată în analize de legare competitivă in vitro, așa cum s-a descris folosind CT radioiodat. Ca exemplu, pentru această metodologie, se folosește ReO, pentru a evalua dacă peptidele de legare a receptorului CT pot fi utilizate ca agenți imagistici scintigrafici radiomarcați cu technețiu-99m, după cum se descrie în exemplul 4.

Metodele pentru producerea și marcarea acestor compuși sunt mai complet ilustrate în următoarele exemple, care ilustrează anumite aspecte ale invenției și rezultatele avantajoase, și sunt prezentate cu scop de ilustrare și nu de limitare.

Exemplul 1. Sinteza chelatorilor BAT.

Chelatorii BAT, în particular chelatorii BAT derivați de la S-cisteină și ε-amino lizină, sunt preparați conform metodelor prezentate în cererea de brevet US 08/414424, inclus în prezenta descriere prin referire.

Exemplul 2. Sinteza peptidei în fază solidă.

Sinteza peptidei în fază solidă (SPPS) s-a efectuat pe o scară de 0,25 mili-moli (mmol), folosind un sintetizator de peptide Applied Biosystems Model 431 și folosind protecția amino terminală 9-fluorenilmetiloxicarbonil (Fmoc), cuplare cu diciclohexilcarbodiimid/hidroxi benztriazol sau 2-(1 H-benztriazol-1 -il)-1,1,3,3-tetra-metiluroniuhexafluorfosfat/ hidroxibenz triazol (HBTU/HOBT), și folosind rășină hidroximetil henoximetil-polistiren (HMP) sau Sasrin™ sau rășină clortritil pentru acizii carboxil-terminali sau rășină amidică Rink pentru amide carboxil-terminale.

RO 120711 Β1

Când este cazul, Fmoc-Cys(BAT) și Na-Fmoc-Ne-(BAT)Lys s-au sintetizat conform 1 seriei cererilor de brevet US 08/414424, incluse în prezenta descriere prin referire.

Când este cazul, grupele 2-cloracetil, 2-bromacetil și 2-brom-3-fenilpropionil sunt in- 3 troduse fie folosind acid 2-halo corespunzător, ca ultim rest cuplat în timpul SPPS, sau prin tratarea peptidei cu aminoacid fără N-terminal, legată la rășină fie cu acid 2-halo/diizopropil- 5 carbodiimidă/N-hidroxisuccinimidă/NMP sau anhidrida acidului 2-halo/diizopropiletilamină/ NMP. 7

Când este cazul, peptidele 2-haloacilate, purificate prin HPLC, sunt ciclizate prin agitarea unei soluții 0,1...1,0 mg/ml în tampon fosfat sau bicarbonat sau hidroxid de amoniu 9 diluat (pH 8,0), opțional conținând 0,5...1,0 mM EDTAsau acetonitril sau THF, timp de 1 ...48 h, urmată, opțional, de acidulare cu acid acetic, liofilizare și purificare prin HPLC. 11

Când este cazul, peptidele care conțin tiol sunt reacționate cu fragmente de complexare technețiu-99m tiol-protejate, care conțin cloracetil, la pH 10, timp de 0,5...4 h, la tempera- 13 tura camerei, urmată de acidulare cu acid acetic și evaporarea soluției cu obținerea aductului peptid-sulfură corespunzător. Deprotejarea și purificarea sunt realizate în mod obișnuit, după 15 cum s-a descris, cu obținerea unui conjugat chelator-peptidă.

Când este cazul, aducții BSME, BSEE și BSH sunt preparați prin reacția peptidelor 17 care conțin tiol (5 la 50 mg/ml, în DMF tamponat, la pH 7, cu N-metil-morfolină sau N-etilmorfolină sau 50mM tampon fosfat de sodiu, pH 7...8, opțional conținând 0,5 mM EDTS sau 19 DMF sau THF sau acetonitril) cu 0,5 echivalenți molari de BMME (b/s-maleimidometileter), BMEE (tr/s-maleimidoetileter) sau respectiv, BMH (b/s-maleimidohexan), predizolvat în 21 acetonitril, la temperatura camerei, timp de aproximativ 1...18 h. Soluția s-a concentrat și produsul s-a purificat prin HPLC. 23

Când este cazul, aducții TSEAsunt preparați prin reacția peptidei conținând un singur tiol (la concentrații de 10 la 100 mg/ml peptidăîn DMF, tamponat la pH 7 cu N-metilmorfolină 25 sau N-etilmorfolină, sau 5 la 50 mg/ml peptidă în 50mM fosfat de sodiu, pH 7...8, opțional conținând 0,5 mM EDTA sau DMF sau THF sau acetonitril) cu 0,33 echivalenți molari de 27 TMEA (tris(2-maleimidoetil)amină) predizolvată în acetonitril sau DMF, cu sau fără 1 echivalent molar de trietanolamină, la temperatura camerei, timp de aproximativ 1...18 h. Aceste 29 amestecuri de reacție conținând aducți sunt concentrate și aducții sunt apoi purificați, folosind HPLC. 31

Când este cazul, (BAM)(N¹,N⁴-b/s(2-mercapto-2-metilpropil)-1,4,10-triazadecan)este conjugat la peptidă prin activarea inițială a carboxilatului peptidei cu un amestec de diizopro- 33 pilcarbodiimidă/N-hidroxisuccinimidă sau HBTU/HOBtîn DMF, NMP sau clorură de metilen, urmată de cuplare în prezență de diizopropiletil-amină. După cuplare, conjugatele sunt 35 deprotejate după cum s-a descris mai sus.

Când este cazul, (BAT) (acidul N⁶,N⁹-b/s(2-mercapto-2-metilpropil)-6,9-diazanona- 37 noic) este încorporat în peptidă ca derivați de aminoacid protejați, cum arfi (Na(Fmoc)Ne(NBocj-S.S'-b/sstritil-BATjlizină (preparat din Na(Fmoc)-lizină și NsțN-Bocj-S.S'-b/stritil-BAT, 39 după cum se descrie în exemplul 2 din seria de cereri de brevet US 08/044825, încorporată prin referire), sau ca (N(Fmoc)-S,S’-b/stritil-BAT)-cisteină (preparat după cum se descrie în 41 exemplul 1F din seria de cereri de brevet US 8/414424, încorporată prin referire), în timpul sintezei peptidei și apoi deperotejată după scindarea peptidei complete de rășina sintetică. 43

Când este cazul, aducții BAT-BS (/V-{2-(/V’,/V-(b/s(2-succinimidoetil)-aminoetil)}-N⁶,N⁹t>/s(2-metil-2-mercaptopropil)-6,9-diazanonanamidă) sunt preparați prin reacția peptidei con- 45 ținând tiol singular (la concentrații de 2 la 50 mg/ml peptidă în DMF tamponat la pH 7, cu Nmetilmorfolină sau N-etilmorfolină, sau în 50 mM fosfat de sodiu (pH 7...8), opțional 47 conținând 0,5mM EDTSau DMF sau THF sau acetonitril) cu 0,5 echivalenți molari de BAT19

RO 120711 Β1

BM(N-{2-(N’,N'-b/s(2-maleimidoetil)-aminoetil)}-N⁹-(t-butoxicarbonil)-N⁶,N⁹-b/s(2-metil-2-trifenilmetiltiopropil)-6,9-diaza-nonanamidă), predizolvatîn acetonitril sau THF, la temperatura camerei, timp de aproximativ 1...18 h. Soluția s-a evaporat apoi la sec și conjugatele (BATBS)-peptidă s-au deprotejat prin tratare cu 10 mL TFA și 0,2 ml trietilsilan, timp de 1 h. Soluția a fost concentrată, aducții s-au precipitat cu eter și apoi s-au purificat prin HPLC.

Când este cazul, precursorii de peptidă sunt ciclizați (între capetele amino și carboxilul terminali) prin reacția catenei laterale protejate a aminei fără N-terminal și acid fără Cterminal cu difenilfosforil azidă.

Peptidele legate la rășină SasrinT™ sunt scindate folosind o soluție de 1% TFA în diclormetan, cu obținerea peptidei protejate. Când este cazul, precursorii de peptidă protejați sunt ciclizați între grupele amino și carboxil terminale prin reacția catenei laterale protejate, a aminei fără capetele amino terminale și acid fără capătul carboxil terminal cu difenilfosforil azidă.

Produșii amidici legați de rășină HMP sau Rink sunt scindați în mod uzual și peptidă ciclizată protejată este deprotejată folosind o soluție ce cuprinde acid trifluoracetic (TFA) sau TFA și clorură de metilen, opțional conținând apă, tioanisol, etanditiol, și trietilsilan sau triizopropilsilan, în rapoarte de 100:5:5:2,5:2, timp de 0,5...3 h, la temperatura camerei. Când este cazul, produșii au fost re-S-tritilați în trifenolmetanol/TFA, și în peptidă s-au reintrodus grupe N-Boc, folosind (Boc)₂O.

Când este cazul, funcțiunile tiol, din secvența de peptidă sau peptidomimetică destinată pentru dezvoltare ulterioară cu o grupă prostetică, au fost protejate folosind un compus cum ar fi S-t-butil (cu formare de amestec de t-butil disulfuri) sau p-metoxibenzii. Grupele S-fbutil sunt îndepărtate prin tratare cu o soluție de ditiotreitol sau mercaptoetanol, în timp ce grupele p-metoxibenzil sunt îndepărtate folosind trifluorură de bor eterată, în acid trifluoracetic, în prezența unui captator de radicali liberi, cum ar fi m-cresol. Peptidele prostetice conținând fragmente de legarea radiometalului se prepară prin terminarea SPPS cu o grupare 2-halo acetil cu N-terminal. Grupările prostetice se îndepărtează din rășină și orice grupări tiol sunt protejate, de exemplu, cu o grupare tritil. Secvența haloacetilată este apoi cuplată cu peptidă care conține tiol, în aceleași condiții ca cele descrise mai sus, la prepararea tioeterilor ciclici. îndepărtarea grupelor de protecție rămase se face folosind metodele descrise la obținerea produsului final.

Peptidele brute sunt purificate prin cromatografie lichidă preparativă de presiune ridicată (HPLC), folosind o coloană Waters Delta Pak C 18 și gradient de eluție cu 0,1% acid trifluoracetic (TFA) în apă, modificat cu acetonitril. Acetonitrilul este evaporat din fracțiile eluate care sunt apoi liofilizate. Identitatea fiecărui produs este confirmată prin spectroscopie de masă cu bombardment de atomi rapizi (FABMS) sau prin spectroscopie de masă prin electrospray (ESMS).

Peptidele de legare a receptorului de CT, derivații și analogii sintetizați, precum și produșii rezultați din astfel de sinteze, identificați prin ESMS sau FABMS, sunt prezentați în tabelul 1 de mai jos.

co hRO 120711 Β1

Complex ReO

3877*

3886

NA

4078

3975

4047

NA

3962

4063

4033

NA

3947

4048

4019

NA

4057

Peptida

3679*

3687*

3373*

3873*

3777*

3849*

3360*

3762*

3862*

3835

3346*

3748*

3848*

3820

3356

3858

Peptida

I. CH,CO.SNLST.Hhc.VLGKLSC(BAWELHKLQTYPRTNTGSGTP.amidă

2.CHoCO.SNLST.Hhc.VLGKLSOELHKLQTYPRTNTGSGTP(e-K)GC.amidă

3.CHnCO.SNLST.Hhc.VLGKLSCELHKLQTYPRTNTGSGTP.amidă

cu Ό E cu oi I— 0 0 0 I— z I— OL CL > I— CI —I X. X —1 LU iu Ό E cu O 0 0 6 o CM X o o 0 —1 0 —1 > o .c X ρω —1 Z 0 o o CM X o rt·

cu Ό E cu CL 1— 0 ω 0 1z ία: CL o —1 X _l LU iu E cu O ϋ cu Q ca O 0 CM X o o ω —1 SL 0 —I > 6 .c X 1— ω —1 z 0 O o o X o iii

>cu E cu CL 1— 0 0 0 1— z ία: CL σ —1 X —1 LU iu Ό E cu LU O 0 £ A o o CM O 0 0 —1 0 —1 > o -C X 1— ω —1 z ω O o CM X o CD

7.CH,C0.SNLST.Hcv.VLGKLSCELHKLQTYPRTNTGSGTP.amidă

8.CH,CO.SNLST.Hcv.VLGKLSC(CH,CO.GGCK.amidă)ELHKLQTYPRTNTGSGTP.amidă

cu Ό E cu CL 1— 0 ω 0 i— z ιοί CL > 1— σ —1 X —1 LU^ i? Ό E cu O ”2 cu Q ca. O 0 CM X o o 0 _l 0 > o X 1— 0 —1 z ω O O o X o oi

10.CHoCO.SNLST.Hcv.VLGKLSCfCH.CO.(e-K)GCE.amidă)ELHKLQTYPRTNTGSGTP.amidă

11. CKCO.SNLST.Cvs.VLGKLSCELHKLQTYPRTNTGSGTP.amidă

cu n Έ cu CL I— 0 0 0 H Z I— OL CL > 1— σ —J X X _l LU CU Ό E cu O 0 0 O O CM T o o 0 —1 X. 0 —1 > c/i > O 1— 0 z 0 6 O o X o csi

13.CHnCO.SNLST.Cvs.VLGKLSC(CHoCO.(8-DaD)KCK.amidă)ELHKLQTYPRTNTGSGTP.amidă

14.CH2CO.SNLST.Cvs.VLGKLSC(CHnCO.(L-K)GCE.amidă)ELHKLQTYPRTNTGSGTP.amidă

15. SNLST.Asu.VLGKLSCEI.HKLQTYPRTNTGSGTP.amidă

cu TD E cu CL I— 0 0 0 I— z ιοί CL > I— σ —1 X _l w cu ’E cu iii O o. cu Q ca O O CM X o o 0 _l 0 _j > zi (Λ < 1— 0 —1 z 0 CD

* = M+ determinată prin spectrometrie de masă prin electrospray;

M+ determinată prin spectrometria de masă cu bombardment cu atomi rapizi, pentru toate celelalte peptide.

RO 120711 Β1

Exemplul 3. Metodă generală pentru radiomarcare cu technetiu-99m.

0,1 mg de peptidă preparată ca în exemplul 2 s-a dizolvat în 0,1 ml sau 0,2 ml apă sau 0,9% soluție de sare. S-a preparat gluceptat de technețiu-99m prin reconstituirea unei fiole Glucoscan (E.l. DuPont de Nemours, Inc., Wilmington, DE) cu 0,25 ml technețiu-99m pertechnetat de sodiu conținând până la 200 mCi și s-a lăsat 15 min la temperatura camerei. S-a adăugat apoi la peptidă 25 pl gluceptat de technețiu-99m și reacția s-a lăsat să se desfășoare la temperatura camerei, timp de 15 până la 60 min, sau la 100°C, timp de 10 la 30 min, și apoi filtrat printr-un filtru de 0,2 pm.

Puritatea peptidei marcate cu technețiu-99m s-a determinat prin HPLC cu fază inversă în următoarele condiții: o coloană analitică Waters Delta Pak C-I8, 5 μ, 3,9 mm x 150 mm s-a încărcat cu fiecare peptidă radiomarcată, și peptidele s-au eluat cu un debit de solvent de 1 ml/min (Delta-Pak). Eluția s-a făcut la un gradient de 20...50% Solvent B/Solvent A (Solventul A este 0,1% CF₃COOH în apă și Solventul B este 0,1% CF₃COOH în 90/10 CH₃CN/H₂O), timp de 20 min, urmat de 100% B/A, timp de 3 min.

Componentele radioactive s-au detectat folosind un detector radiometric, legat in-line, la un înregistrator de integrare. Gluceptatul de technețiu-99m și pertechnetatul de sodiu technețiu-99m eluează între 1 și 4 min în aceste condiții, în timp ce peptidă marcată cu technețiu-99m a eluat după un timp mai lung. Peptidele s-au detectat prin spectrofotometrie in-line la 220 nm.

Complecșii de reniu neradioactivi au fost preparați prin codizolvarea fiecărui reactiv peptidic, conform invenției, cu aproximativ un echivalent molar de fefra-butilamoniu oxotetrabromrenat (+5), preparat după cum se descrie în Cotton ș.a. (1966, Inorg. Chem. 5: 9-16) în dimetilformamidă sau acetonitril/apă și s-a agitat timp de 0,5...5 zile. Complecșii de reniu au fost izolați prin HPLC cu fază inversă, după cum s-a descris mai sus pentru peptidă marcată cu technețiu-99m și au fost caracterizați prin FABMS sau ESMS. Peptidele neradioactive au fost detectate ca peptide prin detecție spectrofotometrică in-line la 220 nm.

Complecșii radioactivi de reniu sunt preparați folosind de exemplu Re-186 sau Re188, pornind de la sărurile perenat corespunzătoare, folosind aceeași tehnică ca și pentru marcarea cu technețiu-99m, sau prin adăugarea unui agent de reducere la o soluție de peptidă și perenat, sau opțional folosind un agent de transfer de ligand, cum arfi citrat și incubarea reacției la o temperatură între temperatura camerei și 100°C, timp de 5 până la 60 min. Rezultatele purificării HPLC ale peptidelor, peptidelor marcate cu technețiu-99m și peptidelor complexate cu ReO sunt prezentate în tabelul 2.

r*. o

ΙΌ r*.

σ>

RO 120711 Β1

Complex ReO	15,6	13,5	NA	CO	12,9	12,4	NA	13,5	11,8	CO	NA	V	CM CD	10,7	NA	11,4	NA
Peptidă	13,7	15,0	19,2	21,2	CM~ V	11,9	CO	12,4	11,0	12,5	10,7	9,98	8,23	86*6	12,7	10,7	13,2	11,1
Peptidă	1. CHoCO.SNLST.Hhc.VLGKLSCiBAnELHKLOTY PRTNTGSGTP.amidă	2. CHoCO.SNLST.Hhc.VLGKLSQELHKLOTYPRTNTGSGTPtL-KlGC.amidă	3. CHoCO.SNLST.Hhc.VLGKLSCELHKLQTYPRTNTGSGTP.amidă	4. CHoCO.SNLST.Hhc.VLGKLSCiCH,CO.GGCK.amidă)ELHKLQTYPRTNTGSCTP.amidA	5. CH,CO.SNLST.Hhc.VLGKLSC(CH9CO.(B-DaD)KCK.amidă)ELHKLQTYPRTNTGSGTP.amidă	6. CHnCO.SNLST.Hhc.VLGKLSCiCH9CO.(e-K)GCE.amidă)ELHKLQTYPRTNTGSGTP.amidă	7. CH,CO.SNLST.Hcv.VLGKLSCELHKLQTYPRTNTGSGTP.amidă	8. CHoCO.SNLST.Hcv.VLGKLSCiCH,CO.GGCK.amidă)ELHKLQTYPRTNTGSGTP.amidă	9. CH,CO.SNLST.Hcv.VLGKLSC(CH,CO.(B-DaD)KCK.amidă)ELHKLQTYPRTNTGSGTP.amidă	10. CH,CO.SNLST.Hcv.VLGKLSC(CH,CO.(a-K)GCE.amidă)ELHKLQTYPRTNTGSGTP.amidă	11. CHnCO.SNLST.Cvs.VLGKLSCELHKLQTYPRTNTGSGTP.amidă	>co Ό E CD CL I— o ω o Iz ιοί CL > I— O _l I _l ϋί ><D E CD O CD CD O O M I o o ω _l CD —I > > q 1— co —1 Z co O o CM I o CM	13. CHoCO.SNLST.Cvs.VLGKLSC(CH,CO.(B-DaD)KCK.amidă)ELHKLQTYPRTNTGSGTP.amidă	>co a ’S co CL 1— CD co CD 1— z 1— ct 0. £ σ —1 X. X —1 LU xcT Ό E CD LU O CD 5 1 ω o o CM I o o co —1 CD —1 > ui > q 1— ω _i z co O q X ω ττ	I5. SNLST.Asu.VLGKLSCELHKLQTYPRTNTGSGTP.amidă	>CD Ό E <0 CL I— CD co CD I— z I— oi 0. > 1— σ —1 I —1 W KD Ό E co O co □ ώ. O O CM X o o co —1 CD —1 > 5 UI < ιω _j z co cb	17. SNLST.Asu. VLGKLSCELHKLQTYPRTDVGAGTP.amidă	18. SNLST.Asu.VLGKLSC(CH2CO.(P-Dap)KCK.amidă)ELHKLQTYPRTDVGAGTP.amidă

RO 120711 Β1

Datele reprezintă timpii de retenție HPLC în minute.

Exemplul 4. Probele biologice.

A. Analize de inhibare a legării.

Reactivii peptidici, conform invenției, sau complecși ai acestora cu ReO s-au testat folosind analize in vitro care evaluează capacitatea lor de a inhiba legarea specifică a ¹²⁵I-CT la receptorul de CT, folosind membrane de creier de șobolan sau de la o linie de celule ale tumorii mamare și celulele integrale de la liniile celulare ale tumorii mamare, după cum se descrie în detaliu în continuare.

Analizele folosind fracții de membrane microzomale de creier de șobolan și celule T47D (obținute de la American Type Culture Collection, Rockville, MD, ATCC Accession No. HTB-133) au fost utilizate pentru a identifica analogii cu afinitate ridicată pentru receptorul de CT, conform metodei lui Fisherș.a. (1977, British J. Cancer 35:777-784). Pe scurt, țesutul s-a mărunțit și omogenizat. Membranele s-au spălat de câteva ori, s-au analizat pentru determinarea conținutului de proteină și s-au utilizat în analizele de legare. Proteina membranei s-a incubatcu 0,1 pCi ¹²⁵I-CT de somon (Amersham, Cleveland, OH), în prezența sau absența diferitelor concentrații de reactivi de testat. S-au testat atât reactivii necomplexați, cât și complexați cu ReO. O legare specifică de 100% a ¹²⁵I-CT la receptorul de CT s-a definit ca diferența între legarea totală ¹²⁵I-CT și legarea nespecifică a ¹²⁵I-CT măsurată în prezența unei concentrații de saturare a receptorului (1 μΜ) a excesului de CT de somon nemarcat (Sigma, St. Louis, MO). Concentrația la care reactivii testați au inhibat legarea specifică a ¹²⁵I-CT cu 50% a fost definită ca IC50.

Rezultatele legării la preparate de membrane ale receptorilor de CT pentru fiecare din reactivii testați sunt prezentate în tabelul 3. Aceste rezultate indică faptul că reactivii peptidici, conform invenției, și complecșii ReO ai acestor reactivi se leagă cu afinitate ridicată la celula tumorală care exprimă receptorul de CT și la membranele creierului.

Experimente similare s-au făcut cu reactivi peptidici suplimentari care intră în sfera prezentei invenții, folosind celule T-47D integrale și celule MCF-7 (ATCC Accession Nr. HTB22). Analizele legării celulei au fost făcute prin metoda lui Findlay ș.a. (1990, J. Endocrinol. 130: 321-326). Pe scurt, celulele au fost spălate în soluție salină și resuspendate în soluție de sare Hank. Unul până la două milioane de celule au fost incubate cu 0,1 pC de CT de somon-¹²⁵l, în absența și prezența a 1 μΜ CT de somon nemarcat, pentru a determina valoarea legării specifice de 100%. Celulele s-au incubat cu 0,1 pCi ¹²⁵I-CT, în prezența sau absența diferitelor concentrații de reactivi de testat, în formă necomplexată și/sau complexată cu ReO. Valorile IC50 au fost determinate în modul descris mai sus. Rezultate pentru fiecare dintre reactivii testați sunt prezentate în tabelul 4.

s· σ>

c*>

RO 120711 Β1 ₍C

Q >Ț Η c ai i— o

I— o

I ro P ro o. φ Q

Creier de șobolan	ilf	ND	ND	3,0	ND
O ID o	2,6	00	C\l	22
T-47D		0,41	CM	IO	22
o in O	0,53	CD		28
Structura peptidei		1 .(CtbCO.SNLST.Hhc) VLGKLSC(BAT)ELHKLQTYPRTNTGSGTP.amidă	2. (CHoCO.SNLST.HhckVLGKLSQELHKLQTYPRTNTGSGTP(e-K)GC.amidă	1. (CH,CO.SNLST.Hhc).VLGKLSCfBAT)ELHKLQTYPRTNTGSGTP.amidă(ReO)	2. ÎCH„CO.SNLSTHhc').VLGKLSQELHKLQTYPRTNTGSGTP(L-K)GC.amidă(ReO)

Deplasarea ¹²⁵I-CT din celule T-47D (celule și membrane) și MCF-7

IC50 (nM)z

C

Ό C

5,8

3,3

4,8

Ό C

n c

5,2

7D c

CD

8,0

7,0

IC50 (nM)y

pu

Ό c

0,42

0,33

0,83

0,84

0,89

o

2,9

2,6

2,7

0,55

IC50 (nM)X

CO

2,6

a c

PU

TJ c

73 C

Ό C

PU

nd

σ c

C

PU

Secvență

3. CHoCO.SNLST.Hhc.VLGKLSCELHKLQTYPRTNTGSGTP.amidă

4. CHXO.SNLST.Hhc. VLGKLSCfChbCO. GGCK.amidălELHKLQTYPRTNTGSGTP.amidă

o Φ x >ro Ό E 05 x ΙΟ U) 0 I— z H CC CL > ΙΟ —I id X —I LU i? Ό E 05 id o a 0J Q co. O O CM X o o CO —1 0 > o _c x 1—· co —1 z co O o 0 I o iri

6. CH,CO.SNLST.Hhc.VLGKLSC(CH,CO.(£-K)GCE.amidă)ELHKLQTYPRTNTGSGTP.amidăReO

o Φ CC >05 Ό E 05 CL H 0 co 0 1z 1— CC X > ΙΟ _J X _1 LU >05 E 05 O 0 0 O o CV X o o co _l 0 —1 > > o X 1—· co _l z co o o c X o co

o Φ CC >05 Ό E 05 CL h0 CO 0 H Z hCC 0. £ σ —1 id X —1 w >05 Ό E 05 O ”2 05 Q 1 CO. O O CV X o o CO _l * 0 —1 > > o X 1— co _l z co o ω o X o σ>

o Φ CC >05 a E 05 CL H 0 CO 0 1— z 1— CC X 1— O id X _l lu ir? E 05 LU O 0 2° Ά O o CM X o o co —1 id 0 > > o X F— ω —1 Z ω o o o X o 6 V

12. CHQCO.SNLST.Cvs.VLGKLSC(CHoCO.GGCK.amidă)ELHKLQTYPRTNTGSGTP.amidă-ReO

O o X >05 TJ E 05 X I— 0 CO 0 H Z I— CC x > I— σ —1 id X _l LU >05 Ό E co X. O 2 05 Q ώ. O O tM X o o co —1 id 0 —1 > ώ > 0 1—· co _J z co o o 0 X o CO

o Φ CC >03 Ό E 05 CL ίο co 0 1— z H CC CL 1— σ —1 id X LU >03 E 03 LLÎ O 0 id ά O o CM X o o ω —1 id 0 —1 > ui > O 1— co —1 Z CO o ω 0 X o

16. SNLST.Asu. VLGKLSC(CH9CO.(p-Dap)KCK.amidă)ELHKLQTYPRTNTGSGTP.amidăReO

O φ CC >05 E 05 X I— 0 < 0 > Q I— CC CL £ O —1 id X —1 lu io Ό E 05 X. O * *2 co O 1 θ o o σ> X O o co _J id 0 > 5 ω <C 1—· co —1 z co oo

CSNLSTCVLGKLSQELHKLQTYPRTNTGSGTP-NH2 (calcitonină de somon )

CO in h- σ>

RO 120711 Β1 nd = nedeterminat1 în care:

’x membrane de celule T-47D,3 y celui T-47D integrale, z celule MCF-7 integrale.5

Aceste rezultate indică că reactivii peptidici, conform invenției, și complecșii ReO ai acestor peptide au fost apți de a se lega specific la receptorii de CT pe celule integrale, și în 7 felul acesta reactivii au fost inhibitori puternici ai legării CT în două linii diferite de celule ale tumorii mamare care exprimă receptorul de CT. 9

B. Exprimarea receptorului de CT în linia de celule de cancer mamar.

Legarea ¹²⁵I-CT la celulele integrale s-a folosit pentru evaluarea densității receptorului 11 de CT în șapte linii diferite de celule de cancer mamar uman. Densitatea pozițiilor per celulă s-a determinat pentru celule MCF-7 în prezența diferitelor concentrații de CT, pentru a realiza 13 saturarea receptorilor. Datele au fost apoi liniarizate prin metoda lui Scatchard ș.a. (1949, N.Y. Acad. Sci. 51; 600-672), pentru a estima densitatea receptorului. Pe scurt, curbele de 15 saturație s-au liniarizat și s-au calculat valorile K_d (-1 /pantă), și B_max a fost egal cu intersecția axei x a curbei. Alte linii de celule (fiecare obținută de la ATCC, Rockville, MD) s-au comparat 17 cu celulele MCF-7 la o singură concentrație de ¹²⁵l-CTși s-a estimat apoi densitatea receptorului de CT. Datele sunt prezentate în tabelul 5. 19

Tabelul 5

Tabelul 5

Linia de celule	Receptori CT/Celule x 10'3
Du4475	21,5
ZR75	39,5
MDA-MB-157	51,0
MCF-7	1,000
Bt474	166
HS578T	0
T-47D	360

Aceste date arată că 86% (6 din 7) din liniile de celule de cancer mamar au fost pozi tive pentru receptorii de CT. Prin urmare, receptorul țintă pentru reactivii conform invenției 31 este prezent în majoritatea liniilor de celule de cancer mamar testate. Recent, receptorul țintă pentru reactivii conform invenției a fost găsit a fi supraexprimatîn cancerele mamare primare 33 (Gillespie, ș.a. (1997) Int. J. Cancer73,812-815). Aceste rezultate indică faptul că peptidele

CT conform invenției sunt corespunzătoare pentru prepararea reactivilor cu specificitate 35 locală pentru diagnoza și tratamentul tumorilor umane.

C. Analize in vivo. 37

Liniile de celule de cancer mamar s-au selectat pentru exprimarea receptorului și s-au ales cele mai bune linii de celule pentru implantarea de xenogrefe la șoareci cu deficiență 39 imunitară. Aceste modele de tumori s-au utilizat pentru a evalua potențialul de țintire a tumorii in vivo a peptidelor cu afinitate înaltă, identificate în analizele in vitro de mai sus. 41

Celule de cancer mamar care exprimă receptorul de CT (T47D și MCF-7) s-au implantat în șoareci cu deficiență imunitară sau în șobolani Sprague-Dawley și s-a lăsat să 43 crească tumora. Pentru testarea noilor peptide 9^9mTc-CT, șoarecii sau șobolanii purtători de tumoră s-au injectat cu aproximativ 0,025 până la aproximativ 6 mCi/10 nmoli peptidă. 45

RO 120711 Β1

Animalele s-au dislocat cervical și s-au luat imagini statice timp de 5 min, folosind un aparat de fotografiat gama. S-a determinat apoi biodistribuția peptidei 9^9mTc-CT prin numărarea 3 sângelui, tumorii, organelor țintă și a mușchiului într-un numărător gamma împreună cu părți aliquote standard din doza injectată. Timpii pentru biodistribuție au fost aleși pentru a 5 reprezenta stadiile incipient, mediu și târziu al limpezirii analogului ^99mTc-CT. Studiile de biodistribuție au indicat că rapoartele optime semnal zgomot sunt la 90 min după injectare.

Pentru a evalua potențialul imagistic al tumorii, al analogilor selectați, s-a comparat raportul radioactivității în sânge și în diferite țesuturi cu cel al tumorii. Datele de biodistribuție reprezentative după 90 min sunt prezentate în continuare în tabelul 6.

<o

RO 120711 Β1 co

Φ

Biodistribuție	PK(min)	CO. £4 τ— 4-*		20?		o>	X	CM		25,9
0 CM 4-4		1,6?			CD_	1,6		τ— CO
rinichi	(%ID/g)		45,6	co	35	CO	32,2	14,1		53	27
Ficat	(%ID/g)		3,7	5,5	4,0	5,8	2,5	2,3		2,7	tn
tract Gl	(%ID/g)		4,8	5,4	2,0	4,5	co	5,3
plămân	(ai %)	1,23 %ID/g	0,10%ID/g	0,24	053	0,56	0,10	0,20 |.	2,5 %ID/g	6,5 %ID/g	2,3 %ID/g
sânge	(%ID/g)	0,16	0,026		0,027	0,048	0,044	0,012	0,23	0,94	0,91
Tumoră	Tum:Con	2,8		o					25	2,5	2,1
Tum:Bld	2,8		3,3					9,9	4,2	co
(%ID/g)	0,42		co					2,0	3,9	ID
	Specii	_Q O o Φ 05 O CD*	șobolan	șoarece3	șobolan	șobolan	șobolan	iepure	șoarece15	X) Φ O Φ L_ Φ O	șoarece3
	Peptida	00	CO	CM		in	co	co	09	6C	(Ό

O) CM

RO 120711 Β1

Numerotarea peptidei corespunde celei din tabelele 1 la 4. tumora ^aT-47D în șoarece nud, xenogrefă de cancer mamar ^bMCF-7 în șoarece nud, °diferite preparate.

Trebuie înțeles că descrierea prezintă anumite realizări specifice, conform invenției, și toate modificările sau variantele echivalente acestora intră în scopul și sfera de protecție a invenției, după cum se prezintă în revendicările anexate.

LISTA DE SECVENȚE (1) INFORMAȚII GENERALE:

(i) SOLICITANT: Dean, Richard T.

Bush, Larry R. Pearson, Daniel A. Lister-James, John 10 (ii) TITLUL INVENȚIEI: RECEPTORI DE LEGARE A RECEPTORULUI DE CALCITONINĂ Șl VARIANTE MARCATE ALE ACESTORA (iii) NUMĂR DE SECVENȚE: 11 (iv) ADRESA PENTRU CORESPONDENȚA:

(A) DESTINATAR: Diati'de, Inc.

(B) STRADA: 9 Delta Drive (C) ORAȘUL: Londonderry (D) STATUL: NH (E) ȚARA: USA (F) COD: 03053 (v) FORMA DE CITIRE PE COMPUTER:

(A) TIPUL DE SUPORT: dischetă (B) COMPUTER: IBM PC compatibil (C) SISTEMUL DE OPERARE: PC-DOS/MS-DOS (D) SOFTWARE: Patentln Release#1,0, Versiune #1,30 (vi) DATE CURENTE REFERITOARE LA CERERE:

(A) NUMĂRUL CERERII:

(B) DATA DE ÎNREGISTRARE:

(C) CLASIFICARE (vii) DATA DE PRIORITATE A CERERII:

(A) NUMĂRUL CERERII: US 08/847,007 (B) DATA DE ÎNREGISTRARE: 01-MAI-1997 (viii) INFORMAȚII DESPRE CONSILIER/AGENT:

(A) NUME: McDaniels. Patricia A.

(B) NUMĂR DE ÎNREGISTRARE: 33.194 (C) REFERINȚĂ/ NUMĂR: DITI 125.1 PCT (ix) INFORMAȚII REFERITOARE LA TELECOMMUNICAȚIE:

(A) TELEFON: (603) 437-8970 (B) TELEFAX: (603) 437-8977

RO 120711 Β1 (2) INFORMAȚII PENTRU SECV. ID Nr:1:1 (i) CARACTERISTICILE SECVENȚEI:3 (A) LUNGIME: 32 aminoacizi (B) TIP: aminoacid5 (C) CATENARE:

(D) TOPOLOGIE: ambele7 (ii) TIP DE MOLECULA: peptidă9 (vi) SURSA ORIGINALĂ:11 (A) ORGANISM: CALCITONINĂ-UMANĂ (ix) CARACTERISTICI:

(A) NUME/CHEIE: legătura disulfură15 (B) LOCALIZARE: 1...7 (ix) CARACTERISTICI:

(A) NUME/CHEI: poziție modificată19 (B) LOCALIZARE: 32 (D) ALTE INFORMAȚII: /produs= PROLINA 32 /marcaj = amida21 (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SECV. ID Nr.1:23

Cys Gly Asn Leu Ser Thr Cys Met Leu Gly Thr Tyr Thr Gin Asp Phe

10 1525

Asn Lys Phe His Thr Phe Pro Gin Thr Ala lle Gly Val Gly Ala Pro

25 3027 (2) INFORMAȚII PENTRU SECV. ID Nr:2:29 (i) CARACTERISTICILE SECVENȚEI:31 (A) LUNGIME: 32 aminoacizi (B) TIP: aminoacid33 (C) CATENARE:

(D) TOPOLOGIE: ambele35 (ii) TIP DE MOLECULA: peptidă37 (vi) SURSA ORIGINALĂ:39 (A) ORGANISM: CALCITONINĂ-SOMON (ix) CARACTERISTICI:

(A) NUME/CHEIE: legătura disulfură43 (B) LOCALIZARE: 1...7 (ix) CARACTERISTICI:

(A) NUME/CHEI: poziție modificată47 (B) LOCALIZARE: 32 (D) ALTE INFORMAȚII: /produs= PROLINA 32” /marcaj = amida49

RO 120711 Β1 (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SECV. ID Nr.:2:

Cys Ser Asn Leu Ser Thr Cys Val Leu Gly Lys Leu Ser Gin Glu Leu 15 10 15

His Lys Leu Gin Thr Tyr Pro Arg Thr Asn Thr Gly Ser Gly Thr Pro

25 30 (2) INFORMAȚIE PENTRU SECV. ID Nr.:3:

(1) CARACTERISTICILE SECVENȚEI:

(A) LUNGIME: 32 aminoacizi (B) TIP: aminoacid (C) CATENARE:

(D) TOPOLOGIE: ambele (ii) TIP DE MOLECULA: peptidă (vi) SURSA ORIGINALĂ:

(A) ORGANISM: CALCITONINĂ-EEL (ix) CARACTERISTICI:

(A) NUME/CHEIE: legătura disulfură (B) LOCALIZARE: 1...7 (ix) CARACTERISTICI:

(A) NUME/CHEI: poziție modificată (B) LOCALIZARE: 32 (D) ALTE INFORMAȚII: /produs= PROLINA 32 /marcaj = amida (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SECV. ID Nr.:3

Cys Ser Asn Leu Ser Thr Cys Val Leu Gly Lys Leu Ser Gin Glu Leu

5 10 15

His Lys Leu Gin Thr Tyr Pro Arg Thr Asp Val Gly Ala Gly Thr Pro

25 30 (2) INFORMAȚII PENTRU SECV. ID Nr.:4:

(i) CARACTERISTICILE SECVENȚEI:

(A) LUNGIME: 31 aminoacizi (B) TIP: aminoacid (C) CATENARĂ:

(D) TOPOLOGIE: ambele (ii) TIP DE MOLECULĂ: peptidă (ix) CARACTERISTICI:

(A) NUME/CHEIE: Region (B) LOCALIZARE: 1...6

RO 120711 Β1 (D) ALTE INFORMAȚII: /produs= S1 este acetilată și X 6 este Hhc 1 /marcaj= ciclizată /notă= Peptidă este ciclizată printr-o legătură tioeter între grupa acetil cu 3 N-terminal a serinei 1 și tiolul din homohomocisteina 6 (ix) CARACTERISTICI:

(A) NUME/CHEIE: poziție modificată7 (B) LOCALIZARE: 13 (D) ALTE INFORMAȚII: /produs= C 13 /marcaj- BAT9 /nota= Grupa tiol din cisteină 13 este atașată la un chelator bisamino b/s-tiol (ix) CARACTERISTICI:

(A) NUME/CHEIE: poziție modificată13 (B) LOCALIZARE: 31 (D) ALTE INFORMAȚII: /produs= Pralină 31 /marcaj= amidă15 (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SECV. ID Nr.:4:17

Ser Asn Leu Ser Thr Xaa Val Leu Gly Lys Leu Ser Cys Glu Leu His

10 1519

Lys Leu Gin Thr Tyr Pro Arg Thr Asn Thr Gly Ser Gly Thr Pro

25 3021 (2) INFORMAȚII PENTRU SECV. ID Nr.:5:23 (i) CARACTERISTICILE SECVENȚEI:

(A) LUNGIME: 31 aminoacizi25 (B) TIP: aminoacid (C) CATENARĂ:27 (D) TOPOLOGIE: ambele (ii) TIP DE MOLECULĂ: peptidă (ix) CARACTERISTICI:

(A) NUME/CHEIE: Region 33 (B) LOCALIZARE: 1...6 (D) ALTE INFORMAȚII: /produs= S1 este acetilat și X6 este 35 Hhc/marcaj=ciclizat /notă= Peptidă este ciclizată printr-o legătură tioeter între grupa acetil cu 37 N-20 terminal a serinei 1 și tiolul homohomocisteinei 6 (ix) CARACTERISTICI:

(A) NUME/CHEIE: poziție modificată41 (B) LOCALIZARE: 31 (D) ALTE INFORMAȚII: /produs= PROLINA 31 /marcaj- amidă43 (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SECV. ID Nr.:5:45

Ser Asn Leu Ser Thr Xaa Val Leu Gly Lys Leu Ser Cys Glu Leu His

10 1547

Lys Leu Gin Thr Tyr Pro Arg Thr Asn Thr Gly Ser Gly Thr Pro

RO 120711 Β1 (2) INFORMAȚII PENTRU SECV. ID Nr.:6:

(i) CARACTERISTICILE SECVENȚEI:

(A) LUNGIME: 31 aminoacizi (B) TIP: aminoacid (D) CATENARĂ: TOPOLOGIE: ambele (ii) TIP DE MOLECULĂ: peptidă, (ix) CARACTERISTICI:

(A) NUME/CHEIE: Region (B) LOCALIZARE: 1...6 (D) ALTE INFORMAȚII: /produs= S1 este acetilatși X6este Hcy/marcaj= ciclizat /notă= Peptidă este ciclizată printr-o legătură tioeter între grupa acetil cu N-terminal a serinei 1 și tiolul homocisteinei 6.

(ix) CARACTERISTICI:

(A) NUME/CHEIE: poziție modificată (B) LOCALIZARE: 31 (D) ALTE INFORMAȚII: /produs= Pralina 31 /marcaj= amidă 55 (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SECV. ID Nr.:6:

Ser Asn Leu Ser Thr Xaa Val Leu Gly Lys Leu Ser Cys Glu Leu His 15 10 15

Lys Leu Gin Thr Tyr Pro Arg Thr Asn Thr Gly Ser Gly Thr Pro

25 30

2) INFORMAȚII PENTRU SECV. ID Nr.:7:

(i) CARACTERISTICILE SECVENȚEI:

(A) LUNGIME: 31 aminoacizi (B) TIP: aminoacid (C) CATENARĂ:

(D) TOPOLOGIE: ambele (ii) TIP DE MOLECULĂ: peptidă (ix) CARACTERISTICI:

(A) NUME/CHEIE: Region (B) LOCALIZARE: 1...6 (D) ALTE INFORMAȚII: /produs= S1 este acetilat /marcaj= ciclizat/notă= Peptidă este ciclizată printr-o legătură tioeter între grupa acetil cu N-terminal a serinei 1 și tiolul cisteinei 6.

(ix) CARACTERISTICI:

(A) NUME/CHEIE: poziție modificată (B) LOCALIZARE: 31 (D) ALTE INFORMAȚII: /produs= Pralina 31 /marcaj= amidă

RO 120711 Β1 (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SECV. ID Nr.:7:

Ser Asn Leu Ser Thr Cys Val Leu Gly Lys Leu Ser Cys Glu Leu His3

5 1015

Lys Leu Gin Thr Tyr Pro Arg Thr Asn Thr Gly Ser Gly Thr Pro5

2530 (2) INFORMAȚII PENTRU SECV. ID Nr.:8:

(1) CARACTERISTICILE SECVENȚEI:9 (A) LUNGIME: 31 aminoacizi (B) TIP: aminoacid11 (C) CATENARĂ:

(D) TOPOLOGIE: ambele13 (ii) TIP DE MOLECULĂ: peptidă15 (ix) CARACTERISTICI:17 (A) NUME/CHEIE: Region (B) LOCALIZARE: 1...619 (D) ALTE INFORMAȚII: /produs= X6 este Asu /marcaj= ciclizat/notă=

Peptida este ciclizată printr-o legătură între serina 1 și acidul 2-amino suberic 6.21 (ix) CARACTERISTICI:23 (A) NUME/CHEIE: poziție modificată (B) LOCALIZARE: 3125 (D) ALTE INFORMAȚII: /produs= Pralina 31/marcaj= amida (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SECV. ID Nr.:8:

Ser Asn Leu Ser Thr Xaa Val Leu Gly Lys Leu Ser Cys Glu Leu His29

1015

Lys Leu Gin Thr Tyr Pro Arg Thr Asn Thr Gly Ser Gly Thr Pro31

2530 (2) INFORMAȚII PENTRU SECV. ID Nr.:9:

(i) CARACTERISTICILE SECVENȚEI:35 (A) LUNGIME: 31 aminoacizi (B) TIP: aminoacid37 (C) CATENARĂ:

(D) TOPOLOGIE: ambele39 (ii) TIP DE MOLECULĂ: peptidă41 (ix) CARACTERISTICI:

(A) NUME/CHEIE: Region43 (B) LOCALIZARE: 1...6 (D) ALTE INFORMAȚIl:/produs= S1 este acetilat și X6 este Hhc45 /marcaj=ciclizat /notă=Peptida este ciclizată printr-o legătură tioeter între grupa acetil cu N-terminal 47 a serinei 1 și tiolul homohomocisteinei 6.

RO 120711 Β1 (ix) CARACTERISTICI:

(A) NUME/CHEIE: poziție modificată (B) LOCUL: 31 (D) ALTE INFORMAȚII: /produs= Pralina 31 /marcaj= amidă (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SECV. ID Nr.:9:

Ser Asn Leu Ser Thr Xaa Val Leu Gly Lys Leu Ser Cys Glu Leu His

10 15

Lys Leu Gin Thr Tyr Pro Arg Thr Asn Thr Gly Ser Gly Thr Pro

25 30 (2) INFORMAȚII PENTRU SECV. ID Nr.:10:

(1) CARACTERISTICILE SECVENȚEI:

(A) LUNGIME: 6 aminoacizi (B) TIP: aminoacid (C) CATENARĂ:

(D) TOPOLOGIE: circulară (ii) TIP DE MOLECULĂ: peptidă (ix) CARACTERISTICI:

(A) NUME/CHEIE: Region (B) LOCALIZARE: 1...6 (D) ALTE INFORMAȚII: /produs= S1 este acetilat și X6 este C, Hcy sau Hhc /marcaj= ciclizat /notă= Peptida este ciclizată printr-o legătură tioeter între grupa acetil N-terminală a serinei 1 și tiolul din X6 (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SECV. ID Nr.:10:

Ser Asn Leu Ser Thr Xaa

5 (2) INFORMAȚII PENTRU SECV. ID Nr.:11:

(i) CARACTERISTICILE SECVENȚEI:

(A) LUNGIME: 6 aminoacizi (B) TIP: aminoacid (C) CATENARĂ:

(D) TOPOLOGIE: circulară (ii) TIP DE MOLECULĂ: peptidă (ix) CARACTERISTICI:

(A) NUME/CHEIE: Region (B) LOCALIZARE: 1...6 (D) ALTE INFORMAȚII: /produs= X1 este A, G, sau S; X6 este C, Hcy, sau Hhc /marcaj= ciclizat /notă= Peptida este ciclizată printr-o legătură tioeter între metilenul cu N-terminal și tiolul din X6.

RO 120711 Β1 (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SECV. ID Nr.:11:1

Xaa Asn Leu Ser Thr Xaa

Claims (31)

1. Revendicări5

   1. Reactiv de legare a receptorului de calcitonină, care conține un compus sintetic cu 7 masă moleculară mai mică de circa 10.000 Da, legat covalent la un chelator de radiometal care are o afinitate de legare a receptorului de calcitonină egală sau mai mare decât 9 afinitatea de legare a calcitoninei native radioiodate, pentru respectivul receptor.
2. 2. Reactiv conform revendicării 1, care are o afinitate de legare a receptorului de cal- 11 citonină de nu mai puțin de circa o zecime din afinitatea de legare a calcitoninei native radioiodate, pentru respectivul receptor.13
3. 3. Reactiv conform revendicării 1 sau 2, în care chelatorul este ales din grupul format din:15

   a) C(pgp)^s-(aa)-C(pgp)^s în care (pgp)^s este H sau o grupare de protecție pentru tiol și (aa) este orice a- sau β-aminoacid primar;19

   b) un chelator care cuprinde un singur fragment care conține tiol cu formula:

   21 A-CZ(B)-ÎC(R¹R²)}_nX în care23

   A este H, HOOC, H₂NOC, (aminoacid sau peptidă)-NHOC, (aminoacid sau peptidă)-OOC sau R⁴;25

   B este H, SH sau -NHR³, N(R³)-(aminoacid sau peptidă) sau R⁴;

   X este H, SH sau -NHR³, N(R³)-(aminoacid sau peptidă) sau R⁴;27

   Z este H sau R⁴;

   R¹, R², R³ și R⁴ sunt independent H sau alchil inferior cu catenă liniară sau 29 ramificată sau ciclic;

   n este 0,1 sau 2;31 (aminoacid) este orice a-sau β-aminoacid primar care nu conține o grupare tiol;33 (peptidă) este o peptidă cu 2 până la circa 10 aminoacizi; și când B este -NHR³ sau -N(R³)-(aminoacid sau peptidă), X este SH și n este 1 sau 2;35 când X este -NHR³ sau -N(R³)-(aminoacid sau peptidă), B este SH și n este 1 sau 2;

   când B este H sau R⁴, A este HOOC, H₂NOC, (aminoacid sau peptidă)-NHOC, sau37 (aminoacid sau peptidă)-OOC, X este SH și n este 0 sau 1;

   când A este H sau R⁴, atunci când B este SH, X este NHR³ sau -N(R³)-(aminoacid sau 39 peptidă) și când X este SH, B este -NHR³ sau -N(R³)- (aminoacid sau peptidă) și n este 1 sau 2;41 când X este H sau R⁴, A este HOOC, H₂NOC, (aminoacid sau peptidă)-NHOC, sau (aminoacid sau peptidă)-OOC și B este SH;43 când Z este metil, X este metil, A este HOOC, H₂NOC, (aminoacid sau peptidă)NHOC, sau (aminoacid sau peptidă)-OOC și B este SH și n este 0;45 când B este SH, X nu este SH și când X este SH, B nu este SH.

   și în care fragmentul tiol este sub formă redusă:47

   RO 120711 Β1

   C)

   NH I N-A-CO-peptide (CR,). w, s-(pgp)^s s-(pgp)^!

   în care fiecare R este independent H, CH₃ sau C₂H_S;

   fiecare (pgp)^s este, în mod independent, o grupare de protecție pentru tiol sau H;

   m, n și p sunt, în mod independent, 2 sau 3;

   A este alchil inferior liniar sau ciclic, arii, heterociclil, o combinație a acestora sau un derivat substituit al acestora.

   d)

   NH N-A-CH(V)NHR' (□u S-(pgp)⁵ S’(pgp)^s

   în care fiecare R este, în mod independent, H, CH₃ sau C₂H₅;

   m, n și p sunt, în mod independent, 2 sau 3;

   A este alchil inferior liniar sau ciclic, arii, heterociclil, o combinație a acestora sau un derivat substituit al acestora;

   V este H sau -CO-peptidă; R' este H sau peptidă;

   și în care dacă V este H, R' este peptidă și dacă R' este Η, V este -CO-peptidă;

   e) în care n, m și p sunt fiecare independent 0 sau 1;

   fiecare R' este, în mod independent, H, alchil inferior, (C₂-C₄)hidroxialchil sau (C₂CJalcoxialchil;

   RO 120711 Β1 fiecare R este, în mod independent, H sau R, în care R este alchil inferior substituit 1 sau nesubstituit sau fenil, care nu conține o grupare tiol, un R sau R' este L, în care atunci când R' este L, -NR'₂ este o amină și L este o 3 grupare bivalentă de legare a chelatorului de compus;

   f) 5 în care n, m și p sunt fiecare, în mod independent, 0 sau 1;

   fiecare R' este, în mod independent, H, alchil inferior, C₂-C₄ hidroxialchil sau C₂-C₄ alcoxialchil;

   fiecare R este, în mod independent, H sau R, în care R este alchil inferior substituit sau nesubstituit, sau fenil care nu conține o grupare tiol, un R sau R' este L, în care atunci când R' este L, -NR'₂ este o amină și

   L este o grupare bivalentă care leagă chelatorul de compus;

   g) (HOOCCH₂)₂N(CR₂)(CR₂)N(CH₂COOH)(CR₂)(CR₂)N(CH₂COOH), în care fiecare R este, în mod independent, H, alchil C_rC₄ sau arii și un R este legat covalent la un agent de legătură bivalent;

   h) (HOOCCH₂)₂N(CR₂)(CR₂)N(CH₂COOH), în care fiecare R este, în mod independent, H, alchil C,-C₄ sau arii și un R este legat covalent la un agent de legătură bivalent;

   i) acid 1,4,7,10-tetraazadodecantetraacetic;

   j) în care n este un număr întreg, care este 2 sau 3, și în care fiecare R este, în mod indepen-41 dent, H, alchil sau arii și un R este legat covalent la compusul de legare a receptorului de calcitonină; și43

   k) desferioxamină.
4. 4. Reactiv conform revendicării 1 sau 2, în care chelatorul este ales din grupul format 45 din:

   -(aminoacid)¹-(aminoacid)²-A-CZ(B)-{C(R¹R²)}_n-X};47

   -{A-CZ(B)-{C(R¹R²)}_n-X}-(aminoacid)¹-(aminoacid)²;

   RO 120711 Β1

   -(diaminoacid primar α,β-sau β,γ)-^ίηο3^)¹-{Α-ΟΖ(Β)-{Ο(Κ¹Η²)}η-Χ}; și -{A-CZ(B)-{C(R¹R²)}n-X}-(aminoacid)¹-(diaminoacid primar α,β- sau α,γ);

   în care (aminoacid)¹ și (aminoacid)² sunt fiecare, în mod independent, orice a- sau β- aminoacid natural, modificat, substituit sau alterat care nu conține o grupare tiol.
5. 5. Reactiv conform revendicării 1 sau 2, în care chelatorul este ales din grupul format din:

   (aminoacid)¹ -(aminoacid)²-cisteină-;

   (aminoacid)¹-(aminoacid)²-izocisteină-;

   (aminoacid)¹ -(aminoacid)²-homocisteină-;

   (aminoacid)¹ -(aminoacid)²-penicilamină-;

   (aminoacid)¹ -(aminoacid)²-2-mercaptoetilamină-;

   (aminoacid)¹-(aminoacid)²-2-mercaptopropilamină-;

   (aminoacid)¹ -(aminoacid)²-2-mercapto-2-metilpropilamină-; și (aminoacid)¹ -(aminoacid)²-3-mercaptopropilamină-;

   în care o grupare carboxil terminală sau o catenă laterală a respectivului chelatoreste legată covalent la compus.
6. 6. Reactiv conform revendicării 5, în care (aminoacid)¹ este ales din grupul format dintr-un α,β-diaminoacid având o α-amină liberă și un β,γ-diaminoacid care are o β-amină liberă.
7. 7. Reactiv conform revendicării 1 sau 2, în care chelatorul este ales din grupul format din:

   -cisteină-(aminoacid)-(a^- sau β,γ-diaminoacid);

   -izocisteină-(aminoacid)-(a^- sau β,γ-diaminoacid); -homocisteină-(aminoacid)-(a^- sau β,γ-diaminoacid); -penicilamină-(aminoacid)-(a^- sau β,γ-diaminoacid);

   acid 2-mercaptoacetic-(aminoacid)-(a^- sau β,γ-diaminoacid);

   acid 2- sau 3-mercaptopropionic-(aminoacid)-(a^- sau β,γ-diaminoacid); și acid 2-mercapto-2-metilpropionic-(aminoacid)-(a^- sau β,γ-diaminoacid);

   în care o grupare amino terminală sau o catenă laterală a respectivului chelator este legată covalent la compus.
8. 8. Reactiv conform revendicării 1 sau 2, în care chelatorul este ales din grupul format din:

   -Gly-Gly-Cys-;

   -Ala-Gly-Cys-;

   -(s-Lys)-Gly-Cys-;

   -(d-Orn)-Gly-Cys-;

   -(Y-Dab)-Gly-Cys-;

   -^-Dap)-Lys-Cys-;

   -$-Dap)-Gly-Cys-; și

   -Cys(BAT).
9. 9. Reactiv conform revendicării 3, în care chelatorul are formula:

   RO 120711 Β1 în care R¹ și R² sunt fiecare independent H, alchil inferior, hidroxialchil C₂-C₄ sau alcoxialchil C₂-C₄;

   R³, R⁴, R⁵ și R⁶ sunt fiecare independent H sau alchil inferior substituit sau nesubstituit, sau fenil care nu conține o grupare tiol;

   R⁷ și R⁸ sunt fiecare independent H, alchil inferior, hidroxialchil inferior sau alcoxialchil inferior;

   L este un fragment de legătură bivalent; și

   Z este o peptidă.
10. 10. Reactiv conform revendicării 3, în care chelatorul are formula:

    în care R¹ și R² sunt fiecare independent H, alchil inferior, hidroxialchil C₂-C₄ sau alcoxialchil C₂-C₄;

    R³, R⁴, R⁵ și R⁶ sunt independent H, alchil inferior substituit sau nesubstituit, sau fenil care nu conține o grupare tiol și unul dintre R³, R⁴, R⁵ și R⁶ este Z-L-HN(CR₂)_n;

    R⁷ și R⁸ sunt fiecare independent H, alchil inferior, hidroxialchil inferior sau alcoxialchil inferior;

    L este un fragment de legătură bivalent; și

    Z este o peptidă și

    X este NH₂, -NR¹R² sau -NR¹-Y, în care Y este un aminoacid, o aminoacid amidă sau o peptidă care conține de la 2 la circa 20 aminoacizi.
11. 11. Reactiv conform revendicării 3, în care chelatorul are formula:

    în care R¹ și R² sunt fiecare independent H, alchil inferior, hidroxialchil C₂-C₄, sau alcoxialchil C₂-C₄;

    R³, R⁴ sunt independent H, alchil inferior substituit sau nesubstituit, sau fenil care nu conține o grupare tiol;

    n este un număr întreg de la 1 la 6;

    L este un fragment de legătură bivalent; și

    Z este o peptidă și
12. 12. Reactiv conform revendicării 3, în care chelatorul are formula:

    RO 120711 Β1 în care L este un fragment de legătură bivalent; și

    Z este o peptidă.
13. 13. Reactiv conform revendicării 1 sau 2, în care compusul este o peptidă.
14. 14. Reactiv conform revendicării 13, în care peptidă are o secvență de aminoacizi CH,CO.SNLST.Hhc.VLGKLSCELHKLQTYPRTNTGSGTP.amidă (SECV. ID. NR.9) și chelatorul este încorporat în peptidă la o catenă latarală a unui aminoacid al respectivei secvențe.
15. 15. Reactiv conform revendicării 13, în care peptidă cuprinde un domeniu de legare a receptorului de calcitonină care este ciclizat cu un tioeter.
16. 16. Reactiv conform revendicării 13, în care peptidă cuprinde o secvență de aminoacizi:

    CH_?CQ.SNLSTX.- (SECV. ID. NR.10) în care X este ales din grupul format dintr-un rest de cisteină, un rest homocisteină și un rest de homohomocisteină.
17. 17. Reactiv conform revendicării 13, în care peptidă cuprinde o secvență de aminoacizi:

    CH_?CO.X¹NLSTX².- (SECV. ID. NR. 11) în care X¹ este ales din grupul format dintr-un rest de alanină, un rest de glicină și un rest de serină; și

    X² este ales din grupul format dintr-un rest de cisteină, un rest de homocisteină și un rest de homohomocisteină.
18. 18. Reactiv conform revendicărilor 13 și 14, având formula aleasă din grupul format din:

    CH₂CQ.SNLST.Hhc.VLGKLSCÎBAT)ELHKLQTYPRTNTGSGTP.amidă (SECV. ID. NR.4) CH,CQ.SNLST.Hhc.VLGKLSQELHKLQTYPRTNTGSGTP(e-K1GC.amidă

    CH,CQ.SNLST.Hhc.VLGKLSC(CH.CQ.GGCK.amidă)ELHKLQTYPRTNTGSGTP.amidă

    CH₂CQ.SNLST.Hhc.VLGKLSC(CHnCO.(B-DaDÎKCK.amidă)ELHKLQTYPRTNTGSGTP.amidă

    CH,CQ.SNLST.Hhc.VLGKLSC(CHoCQ.Î8-K1GCE.amidă1ELHKLQTYPRTNTGSGTP.amidă

    CH₂CO.SNLST.Hcv.VLGKLSC(CH₂CO.GGCK.amidă)ELHKLQTYPRTNTGSGTP.amidă

    CH,CQ.SNLST.Hcv.VLGKLSC(CH,CO.(8-DaDÎKCK.amidă1ELHKLQTYPRTNTGSGTP.amidă

    CH,CO.SNLST.Hcv.VLGKLSCÎCH₂CQ.(e-K1GCE.amidă)ELHKLQTYPRTNTGSGTP.amidă

    CH,CQ.SNLST.Cvs.VLGKLSC(CH-,CO.GGCK.amidă1ELHKLQTYPRTNTGSGTP.amidă

    CH₂CQ.SNLST.Cvs.VLGKLSC(CHXO.(8-DaDÎKCK.amidăîELHKLQTYPRTNTGSGTP.amidă

    CH₂CQ.SNLST.Cvs.VLGKLSC(CH₂CQ.Îe-K1GCE.amidă1ELHKLQTYPRTNTGSGTP.amidă

    SNLST.Asu.VLGKLSCiCHnCO.ÎB-DaDlKCK.amidălELHKQTYPRTNTGSGTP.amidă: și

    SNLST.Asu.VLGKLSC(CH₂CO.(B-DaDÎKCK.amidă)ELHKQTYPRTDVNTGAGTP.amidă

    CH,CO.SNLST.Hhc.VLGKLSCELHKLQTYPRTNTGSGTP.amidă (SECV. ID. NR.5)

    RO 120711 Β1

    CH₂CO.SNLST.Hcv.VLGKLSCELHKLQTYPRTNTGSGTP.amidă (SECV. ID. NR.6)1

    CH_;CO.SNLST.Cvs.VLGKLSCELHKLQTYPRTNTGSGTP.amidă (SECV. ID. NR.7) și

    SNLST.Asu.VLGKLSCELHKLQTYPRTNTGSGTP.amidă (SECV. ID. NR.8)3
19. 19. Reactiv conform revendicării 18, care are formula:

    CH_;COSNLST.Hhc.VLGKLSC(CKCO.fe-K)GCE.amidă1ELHKLQTYPRTNTGSGTP.amidă5
20. 20. Agent imagistic scintigrafic care cuprinde reactivul definit în oricare dintre revendicările 1 ...19 și technețiu-99m.7
21. 21. Compoziție care conține reactivul definit în oricare dintre revendicările 1 ...19 și un ion stanos.9
22. 22. Agent radioterapeutic care conține reactivul definit în oricare dintre revendicările

    1.. .19 și un radioizotop citotoxic.11
23. 23. Agent conform revendicării 22, în care radioizotopul este ales din grupul format din scandiu-47, cupru-67, galiu-72, itriu-90, staniu-117m, iod-125, iod-131, samariu-153, 13 gadoliniu-159, disprosiu-165, holmiu-166, iterbiu-175, lutețiu-177, reniu-186, reniu-188, astatin-211, bismut-212 și bismut-213. 15
24. 24. Complex obținut prin reacția reactivului definit în oricare dintre revendicările 1...19, cu technețiu-99m, reniu-186 sau reniu-188, în prezența unui agent de reducere.17
25. 25. Complex conform revendicării 24, în care agentul de reducere este un ion stanos.
26. 26. Complex conform revendicării 24, obținut prin marcarea reactivului definit în 19 oricare dintre revendicările 1... 19, cu technețiu-99m, prin schimbare de ligand a unui complex de tehnețiu-99m preredus.21
27. 27. Complex obținut prin marcarea reactivului definit în oricare dintre revendicările

    1.. .19, cu reniu-186 sau reniu-188, prin schimbarea ligandului unui complex de reniu 23 preredus.
28. 28. Trusă pentru prepararea unui preparat radiofarmaceutic, care cuprinde o fiolă care25 conține o cantitate predeterminată dintr-un reactiv definit în oricare dintre revendicările 1 ...19 și o cantitate suficientă dintr-un agent de reducere pentru marcarea reactivului cu technețiu- 27 99m, reniu-186 sau reniu-188.
29. 29. Trusă pentru prepararea unui preparat radiofarmaceutic, care cuprinde o fiolă care 29 conține o cantitate predeterminată dintr-un reactiv definit în oricare dintre revendicările 1 ...19.
30. 30. Utilizare a unui reactiv definit în oricare dintre revendicările 1 ...19, pentru fabrica- 31 rea unei compoziții farmaceutice pentru imagistica unei poziții dintr-un corp de mamifer.
31. 31. Utilizare a unui reactiv definit în oricare dintre revendicările 1...19, pentru 33 fabricarea unei compoziții farmaceutice pentru tratarea unei boli caracterizate prin exprimarea sau exprimarea peste normal a receptorilor de calcitonină. 35