RO116204B1

RO116204B1 - Procedeu de obţinere a unui preparat proteolitic din culturi de aspergillus oryzae

Info

Publication number: RO116204B1
Application number: RO97-00336A
Authority: RO
Inventors: Ana Ioniţă; Ştefana Jurcoane; Silvia Horiţa; Ovidiu Popa; Ortansa Fotea; Hildegard Scurei; Liliana Dragoicea; Geta Raitaru
Original assignee: Institutul Naţional De Cercetare- Dezvoltare Chimico- Farmaceutică - Iccf
Priority date: 1997-02-20
Filing date: 1997-02-20
Publication date: 2000-11-30

Abstract

Invenţia se referă la un procedeu de obţinere a unui preparat proteolitic din culturi de Aspergillus oryzae ICCF 20/9 şi constă în aceea că, utilizând mediu de cultură ce conţine g/% (v/v) făină de soia 2,0, amidon solubil 0,5, tărâţe de grâu 0,5 şi săruri de K, Ca, Mg, în diferite proporţii, la parametri tehnologici optimi ce constau în: temperatura 30...32°C, pH iniţial al mediului = 5,5...5,8, aerare şi presiune variabilă în funcţie de fazele de creştere a microorganismului, cu agitare constantă la 220 rpm, pe parcursul bioprocesului, pentru a împiedica ruperea hifelor, se obţine la faza de prelucrare a mediului de cultură, ce include concentrarea prin ultrafiltrare a lichidului enzimatic şi precipitarea cu acetonă, un preparat proteolitic cu activitate enzimatică 400...540 UP/g, activ în domeniul de pH= 3,5....8,5 şi temperatura 35...40°C.

Description

RO 116204 B

Invenția se referă la un procedeu de obținere a unui preparat proteolitic din culturi de Aspergillus oryzae, cu aplicabilitate în industria farmaceutică, a cosmeticelor, în zootehnie etc.

în prezent sunt cunoscute și alte procedee de obținere a preparatelor proteolitice fungice, atât cu tulpini de Aspergillus oryzae, cât și cu Aspergillus sojae, Rhizopus oryzae, Mucor pusillus, Mucor miehei, Aspergillus niger etc., prin cultivarea microorganismelor în sistem continuu, în condiții chemostazate, cu sursa de carbon limitată, sau prin cultivarea lor în sistem discontinuu, în medii de cultură cu alte surse de carbon ca: fructoză, maltoză, sucroză etc. sau de azot - extract de porumb, săruri de azot etc., care induc numai sinteza unui anumit tip de proteaze.

Pentru obținerea acestor preparate, autori din Japonia, SUA, Anglia, Germania utilizează aparatură ultraspecializată și reactivi de înaltă puritate, fapt care are ca urmare prețul de cost ridicat al produsului de biosinteză.

Procedeul de obținere a unui preparat proteolitic din culturi de Aspergillus oryzae, conform invenției, constă în aceea că se realizează cultivarea submersă, în sistem discontinuu, a tulpinii Aspergillus oryzae înregistrată în Colecția de Microorganisme a I.C.C.F.-București, sub nr.20/9, în mediu de cultură ce conține gr.% (v/v) făină de doia 2,0, amidon solubil 0,5, tărâțe de grâu 0,5 și săruri de K⁺, Ca²⁺și Mg²⁺ în diferite proporții, însămânțat cu 1,0 % (v/v] suspensie de spori de Aspergillus oryzae ICCF 20/9, la parametri tehnologici: temperatură 3O...32°C, agitare constantă la 220 rpm, aer și presiune variabile pe parcursul bioprocesului, astfel încât conținutul de oxigen dizolvat în mediu să nu scadă sub 50% în perioada 48.. 66 h de la inoculare, apoi se prelucrează mediul de cultură ce include și concentrarea prin ultrafiltrare a lichidului enzimatic pe un modul cu randament în activitate proteolitică cuprins între 80,9...86,7 %, rezultând un concentrat proteolitic, din care, la faza de izolare și purificare a proteazelor prin precipitare cu acetonă în raport 1 /3 (v/v) se obține preparatul proteolitic brut, parțial purificat, de culoare alb-gri, cu activitate proteolitică 400...540 UP/g, activ în domeniul de pH 3,5...8,5 și temperatură 35. ..40°C, lipsit de toxicitate și potențial mutagenic la testele farmacologice efectuate pe șobolani Wistar.

Avantajul invenției constă în aceea că, prin cultivarea tulpinii Aspergillus oryzae ICCF 20/9 pe o formulă de mediu ce conține predominant ingrediente naturale și la parametri tehnologici optimi, fără consum mare de energie, se obține un preparat proteolitic ce conține toate cele trei fracțiuni acide, neutre și alcaline, fiind activ într-un domeniu larg de pH 3,5...8,5, lipsit de toxicitate (la testele de farmacologie] cu aplicabilitate în industria farmaceutică (la obținerea unor preparate polienzimatice cu acțiune terapeutică] a cosmeticelor, zootehnie (la alcătuirea premixurilor] etc.

Se prezintă, în continuare, un exemplu de realizare a invenției.

a] Cultivarea submersă în sistem discontinuu a tulpinii Aspergillus oryzae ICCF 20/9 într-un bioreactor de 150 m³, cu 70...80 m³ mediu de cultură ce conține gr% (v/v] făină de soia 2,0, amidon solubil 0,5, tărâțe de grâu 0,5 și săruri de potasi, calciu și magneziu în diverse proporții cu pH-ul inițial 5,5...5,8, se însămânțează cu o suspensie de spori de Aspergillus oryzae ICCF 20/9 în proporție de 1,0% (v/v].

Cultivarea se efectuează timp de 64...66 h la următorii parametri tehnologici: temperatura 30. ..32°C, agitare constantă (220 rpm), aerare și presiune variabile pe

Claims

RO 116204 B parcursul bioprocesului, și anume: 0,8...1,0 1/1 min., aer și presiune 1,0 atm. în perioada (0...24 h de la inoculare], crescând la 1,3...1,6 1/1 min. Aer și presiune 1,2...1,5 atm. în perioada 48...66 h de la inoculare, astfel încât conținutul de oxigen în mediu să nu scadă sub 50%. 50

b] Prelucrarea mediului de cultură

La sfârșitul bioprocesului, după 64...66 h de cultivare a producătorului, se efectuează prelucrarea mediului de cultură în următoarele faze:

bj Separarea, biomasei de Aspergillus oryzae ICCF 20/9 prin filtrare pe filtru Nutsche, cu adăugare de adjuvant de filtrare 0,1 % [Perlită] ss

- Viteza medie de filtrare 25,4 l/m^s/h, b_a) Concentrarea prin ultrafiltrare, a lichidului de cultură rezultat la faza de separare a biomasei, utilizând un modul Pellicon Standard (Millipore Corp) echipat cu o casetă de membrane polisulfonice de tip PTGC 00005 (limită de excludere NMWL10kDa], realizându-se o concentrare până la 5...10 ori a filtratului cu un randament εο în activitate proteolitică, cuprins între 80,9 și 86,7 % - rezultând concentratul lichid de proteaze.

b₃) Izolarea și purificarea proteazelor din concentratul lichid de proteaze se realizează prin precipitare cu acetonă rece (+5°C) sub agitare, pe baie de gheață în raport 1/3 (v/v), randamentul de izolare a enzimelor proteolitice variază între 83,0 65 și 86,5 %.

Precipitatul acetonic se filtrează, se usucă în exicator sub vid, obținându-se preparatul enzimatic brut, parțial purificat, sub forma unei pudre de culoare alb-gri cu activitate proteolitică cuprinsă între 400 și 540 UP/gr, activ în domeniul de pH 3,5...8,5 și temperatura 35...40°C, lipsit de toxicitate și potențial mutagenic la 70 testele de farmacologie efectuate pe șobolani Wistar.

Produsul obținut prin procedeul conform invenției permite obținerea unor preparate polienzimatice care conțin și proteaze pe lângă alte enzime extrase din tulpini de Aspergillus oryzae, utilizabile în tratamentul unor dispepsii digestive, precum și al unor necroze cutanate de origine traumatică. 75

De asemenea, preparatul proteolitic obținut conform invenției poate fi utilizat în industria produselor cosmetice (pastă de dinți, șampon), ca și în zootehnie (la alcătuirea premixurilor).

Revendicare 8 o

Procedeu de obținere a unui preparat proteolitic, din culturi de Aspergillus oryzae, caracterizat prin aceea că se realizează cultivarea submersă, în sistem discontinuu, a tulpinii Aspergillus oryzae înregistrată în Colecția de Microorganisme a I.C.C.F.-București, sub nr.20/9, în mediu de cultură ce conține gr.% (v/v] făină de 85 soia 2,0, amidon solubil 0,5, tărâțe de grâu 0,5 și săruri de K⁺, Ca^a+ și Mg²⁺ în diferite proporții, însămânțat cu 1,0 % (v/v) suspensie de spori de Aspergillus oryzae ICCF 20/9, la parametri tehnologici: temperatură 3O...32°C, agitare constantă la 220 rpm, aer și presiune variabile pe parcursul bioprocesului, astfel încât conținutul de oxigen dizolvat în mediu să nu scadă sub 50% în perioada 48...66 h de la 90 inoculare, apoi se prelucrează mediul de cultură ce include și concentrarea prin ultrafiltrare a lichidului enzimatic pe un modul cu randament în activitate proteolitică

RO 116204 B cuprins între 80,9 și 86,7 %, rezultând un concentrat proteolitic, din care, la faza de izolare și purificare a proteazelor prin precipitare cu acetonă în raport 1/3 [v/v] se 95 obține preparatul proteolitic brut, parțial purificat, de culoare alb-gri, cu activitate proteolitică 400..,540 UP/g, activ în domeniul de pH 3,5...8,5 și temperatură 35...40°C, lipsit de toxicitate și potențial mutagenic Ia testele farmacologice efectuate pe șobolani Wistar.

Președintele comisiei de examinare: chim. Hăulică Mariela

Examinator: biochim. Creții Adina

Editura < ’

Editare și tehnoredactare computerizată OS1M

Tipărit la: Oficiul de Stat pentru Invenții și Mărci