RO113867B1

RO113867B1 - MUTANTA YARROWIA LIPOLYTICA PRODUCĂTOARE DE BIOMASĂ PROTEICĂ FURAJERĂ Șl PROCEDEU DE OBȚINERE A ACESTEIA

Info

Publication number: RO113867B1
Application number: RO9602072A
Authority: RO
Inventors: Stela Popovici; Sever Serban; Stelian Niculescu; Eugen Marica
Original assignee: Inst Cercetari Chim
Priority date: 1996-10-30
Filing date: 1996-10-30
Publication date: 1998-11-30

Abstract

Mutanta Yarrowia lipolytica DG, realizată pentru obținerea proteinelor din grăsimi, la care se referă invenția de față, este utilizată la fabricarea biomasei proteice furajere, bogată în aminoacizi cu sulf. Obținerea mutantei s-a realizat prin acțiunea factorului mutagen formaldehidă asupra tulpinii parentale Yarrowia lipolytica. Izolarea și selecția mutantelor s-a făcut pe criterii de auxotrofie și pe criterii de asimilație. Invenția vizează obținerea unei mutante cu caracteristici genetice stabile, având ca marker de auxotrofie homoserina (horn'].

Description

Invenția de față se referă la o mutantă, Yarrowia lipolytica, producătoare de biomasă proteică furajeră și la un procedeu de obținere a acesteia.

In scopul obținerii biomasei proteice furajere, se folosește, în mod curent, substratul de borhot de melasă pe care se cultivă specii ale genului Candida, iar biomasele furajere obținute au dezavantajul că sunt sărace în aminoacizi esențiali limitativi pentru organismul animal.

In literatura de specialitate, sunt cunoscute procedee de obținere a mutantelor de drojdii, care cuprind etapele de: determinarea curbelor de creștere, a curbelor de inactivare a agentului mutagen de izolare și selecție a mutantelor (Rene Scriban și colab., Technique Documentation - Lavoisier, 1993).

Mutanta Yarrowia lipolytica DG^ conform invenției, este înregistrată în colecția ICECHIM la nr.22, este stabilă din punct de vedere genetic, este auxotrofă față de homoserină (horn) și are activitatea optimă de dezvoltare la temperatura de 34 ... 36°C pe substrat de 2% grăsimi, pH=3,8 ... 4,2, debit de aer 0,6 l/l min, durata procesului fiind 24 h și produce o biomasă cu proteină 50% s.u., metionină 0,57% s.u. acizi nucleici 6,2% s.u.

Procedeul de obținere a mutantei Yarrowia lipolytica DG_V conform invenției, constă în aceea că, tulpina parentală Y. lipolytica ICECHIM 21, aflată în faza staționară de creștere, este supusă mutagenezei cu formaldehidă (FA) în doză de 60 mM, cu timp de contact de 50 min, la 31 ± 0,5°C, în condiții de aerareagitare, după care se face izolarea și selecția mutantelor prin tehnici în sine cunoscute.

Prin aplicarea invenției, se obține o biomasă proteică furajeră, cu conținut ridicat de aminoacizi esențiali limitativi, indispensabili organismului animal, utilizându-se instalațiile existente.

Se dă, în continuare, un exemplu de realizare a invenției.

Pentru pregătirea tulpinilor parentale în vederea mutagenezei, se deter2 mină curba de creștere a tulpinii parentale.

Tehnica determinării curbei de creștere a tulpinii parentale Yarrowia lipolytica, constă în prelevarea unei porțiuni din cultura “STOC” și dispersării în plăci Petri ce conțin mediul malț-agar (extract malț 12% și agar 2%). După dezvoltarea coloniilor timp de 48 h, la 34 ± 0,5°C, dintr-o colonie tipică s-a făcut o subcultură de 24 h, pe același mediu și în aceleași condiții. Cultura astfel dezvoltată a fost suspendată prin desprinderea ei de pe suprafața mediului agarizat, într-o soluție izotonică de clorură de. sodiu sterilă (9 %□),. și a fost spălată de două ori consecutiv, cu aceeași soluție. Depozitul de drojdie s-a resuspendat în soluție izotonică de clorură de sodiu, pentru a se obține o densitate de 10⁶ celule pe ml. Această suspensie a servit drept inocul pentru un mediu lichid must de malț 12%, astfel încât să se abțină un titru inițial de 10^acelule pe ml. Flacoanele cu o capacitate de 750 ml, conținând 100 ml mediu de însămânțare, au fost montate pe agitator rotativ cu 240 r.p.m. și excentricitate 5 cm, la temperatura de 34 ± 1°C, timp de 30 h.

Au fost prelevate probe sterile din două în două ore, pentru determinarea numărului de celule prin metoda diluțiilor și numărarea cu ajutorul lamei Goreaev.

Curba de creștere a tulpinii Yarrowia lipolytica are o fază de Iag, scurtă, de aproximativ 4 h, faza exponențială se întinde de la 4 h la 20 h, iar faza staționară este, de asemenea, de aproximativ 4 h. Faza staționară, când activitatea fiziologică a celulei de drojdie o face aptă pentru modificările induse de factorul mutagen formaldehidă, a fost stabilită între orele 20 ... 24 de dezvoltare, în condițiile specifice pentru tulpina Yarrowia lipolytica.

Pentru determinarea nivelului mutației spontane, se utilizează o cultură la începutul fazei staționare de creștere, dezvoltată pe mediul de must de malț, timp de 20 h, în condiții de aerare-agitare.

Cultura dezvoltată se centrifuRO 113867 Bl ghează pentru separarea celulelor, depozitul se spală de două ori cu soluție izotonică de clorura de sodiu sterilă.

Depozitul se resuspendă în aceeași soluție, pentru a obține un număr de aproximativ 1O⁶ celule pe ml. Din această suspensie, se fac diluții seriate și dispersii în plăci cu mediu malț-agar, însămânțându-se câte □, 1 ml din diluțiile 1O⁵ și 1O®. Plăcile se mențin 48 ... 72 h, la 34 ± O,5°C.

Verificarea nivelului mutației spontane spre auxotrofie se face prin metoda replicii, a coloniilor de pe mediul complet malț-agar, pe mediul minimal agarizat.

Procentul de mutante apărute se calculează, raportând numărul de mutante auxotrofe la numărul de colonii repicate.

Verificarea a 12.000 colonii nu a evidențiat mutante spontane cu caracteristici auxotrofe. Stabilitatea genetică a tulpinii parentale Yarrowia lipolytica a permis trecerea la etape de inducere a mutantelor.

Procesul de mutageneză cu formaldehidă (FA] a tulpinii parentale cuprinde și stabilirea dozei optime de inducere a mutantelor. In acest scop, s-au folosit doze de 30 mM, 60 mM și

100 mM, timpul de contact al agentului mutagen cu microorganismul fiind de 40, 50 și 60 min. In cazul dozei de 30 mM, viabilitatea variază între 93,63 și

90,57%, scăderea viabilității fiind proporțională cu timpul de expunere.

In cazul dozei de 60 mM, viabilitatea variază între 8,18 și 2,18%. In timp ce, pentru doza de 100 mM, se ob10 ține o viabilitate cuprinsă între 0,40 și 0,01%, se stabilește doza optimă de inducere a mutantelor, care este 60 mM la timpul de contact de 50 min, conform tabelului 1.

Inducerea mutagenezei cu formaldehidă (FA) 60 mL se realizează pe o cultură în fază staționară de creștere. Astfel, cultura dezvoltată 20 h pe mediu lichid malț-extract se centrifughează în condiții aseptice, 15 min la 5.000 rot/min. După înlăturarea supernatantului și spălarea celulelor cu soluție izotonică de clorură de sodiu, depozitul se resuspendă în tampon fosfat pH=7,4 (Na₂HP0₄ anhidru-7,0 g, KH_aP0₄ anhidru-2,0 g, NaCI-4,0 g, MgS0₄.7H₂00,2 g, apă distilată 1.000 ml] pentru a obține, în final, o densitate de 10^B celule pe ml, la care se adaugă FA, pentru a

0 ajunge la 60 mM.

Tabelul 1

Timp de expunere (min)	Număr de celule pe ml	Viabilitate (%)	Număr mutante pe nr. colonii repicate	Frecvența ’ mutației (%j
inițial	final
40 FA-30mM 50 60	7,85 . 10⁶	7,35 . 10®	93,63	0/195	0
7,85 . 10⁶	7,51 . 10®	95,66	0/245	0
7,85 .10®	7,11 . 10®	90,57	0/200	0
40 FA-60mM 50 60	5,50.10⁶	0,45 . 10®	8,18	0/150	0
5,50.10⁶	0,31 . 10®	5,63	0/200	0,50
5,50.10⁶	0,12 . 10®	2,18	1/250	0,40
40 FA-100mM 50 60	1,70 . 10®	7,9 . 10³	0,40	0/175	0
1,70.10⁶	5,35 . 10²	0,03	0/100	0
1,70.10®	2,55 . 10²	0,01	0/95	0

RO 113867 Bl

Mutageneza se realizează la 31 ± O,5°C și în condiții de aerare- agitare la baloane, pe agitator rotativ, la 240 r.p.m. și 5 cm excentricitate. După 45 min, timp de contact al celulelor cu a- 5 gentul mutagen, totul se centrifughează 15 min, la 5.000 r.p.m. iar depozitul de celule obținute se spală cu o soluție izotonică de clorură de sodiu, de două ori consecutiv. io

După întreruperea acțiunii factorului mutagen, se efectuează diluții zecimale ale probelor mutagenizate de la malț-agar repartizat în cutii Petri.

Termostatarea se face la 37 ± □,5°C, după care se fac citirile și se calculează procentul de viabilitate, conform relației:

V % = nr.de cel,/ml probă tratată . 100 nr.de cel./ml probă netratată

Letalitatea se calculează după formula: L%= 100-V

Pentru îmbogățirea suspensiei în 20 mutante, se însămânțează 1 ml suspensie în 50 ml mediu lichid must de malț 12% și se menține 24 h la 37 ± 0,5°C, pe agitator rotativ. Din această suspensie, se face izolarea de mutante auxo- 2 5 trofe ca și în cazul mutagenezei spontane.

Tehnicile de izolare și selecție a mutantelor se referă, atât la criterii de laborator, pentru a putea marca mutan- 30 tele și a putea stabili condițiile de dezvoltare, cât și la criterii industriale, bazate pe proprietățile alcooligene, osmotolerante și termotolerante.

Determinarea necesităților nutri- 35 ționale ale mutantelor constă din însămânțare în suprafață a mediului minimal agarizat, ce conține o combinație de aminoacizi, baze purinice și pirimidinice, și vitamine, conform tabelului 2. 40

Soluțiile se combină în mod steril, în volume egale, pentru a forma amestecurile arătate în coloanele orizontale 1 ... 6 și coloanele verticale 7 ... 12.

La 100 ml mediu minimal, se adaugă 1 ml amestec. Mediul minimal agarizat (M.M.A.), este format din: soluție săruri minerale 100 ml, apă agarizată 300 ml, soluție glucoză 20% 4 ml. Soluția de săruri minerale cuprinde: NH₄CI - 20 g, NH₄N0₃ - 4 g, Na₂S0₄anhidru - 8 g, K₂HP0₄ anhidru - 12 g, KH₂P0₄ anhidru - 4 g, MgS0₄ . 7H₂0 0,4 g, apă distilată - până la 1.000 ml; se aduce la pH=7,2 cu NaOH 20%. Apa agarizată conține : agar - 20 g și apă distilată până la 1.000 ml ( se aduce pHul la 7,2). Soluția de glucoză cuprinde: glucoză - 20 g și apă - 100 ml.

Interpretarea rezultatelor se face în felul următor: mutantele crescute pe un singur mediu indică o necesitate nutrițională față de doi sau mai mulți factori de mediu, iar creșterea pe două medii indică o singură necesitate nutrițională.

Tabelul 2

Amestec	1	2	3	4	5	6
7	adenină*	biotină⁺⁺	fenil-alanină^x	alanină*	arginină*	leuci- nă*

RO 113867 Bl

Tabelul 2 (continuare)

8	xantină*	acid folic(5O)⁺⁺	serină^x	cisteină*	ornitină*	glici- nă*
9	citozină*	pantotenat de Ca (50Γ	triptofan*	homoseri- nă*	acid aspartic*	izoleuci nă*
10	guanină⁺	piridoxină (50)⁺⁺	tirazină*	vit.B₁₂ (50)	pralină*	histi- dină*
11	timină(1)	tionină (1)⁺⁺	acid paraminobenzoic (50]**	metionină*	acid glutamic*	lizină*
12	uracil*	riboflavină (250)*⁺	acid nicotinic (5or	colină (1000)⁺⁺	inozitol (500)**	valină

^x » Soluții de 10 mg pe 10 ml pentru forma L (sau 20 pg pe pe ml pentru forma DL]: ⁺ = Soluții de 5 mg pe ml;

= Soluții în concentrațiile indicate în paranteie (pg pe ml).

Mutantele auxotrofe se studiază io din punct de vedere al capacității lor de a produce o proteină cu conținut ridicat de aminoacizi cu sulf prin însămânțarea lor pe un mediu complet ce conține 12% must de malt, la temperatura de 34 ... 15 36 ± 0,5°C.'

A fost selecționată mutanta Yarrowia lipolytica DG,, care este auxotrofă pentru homoserină (horn) 1 mg/ml, înalt producătoare de proteină (50% 20 s.u.), cu conținut ridicat de metionină, 0,5% s.u.

Se dă, mai departe, descrierea mutantei Yarrowia lipolytica DG,, comparativ cu tulpina parentală. 25

Fermentarea și asimilarea compușilor cu carbon și azot se face după metoda Lodder, pe mediu Lodder.

Pentru obținerea mutantei Y.l.

DG, 1, conform invenției, s-a plecat de la Yarrowia lipolytica (Y.l.) Depusă la colecția ICECHIM - Secția Biotehnologie, la nr. 21, de la data de 30 ianuarie 1996 și ale cărei caracteristici taxonomice, morfologice și biochimice sunt prezentate în tabelul 3. In același tabel, este descrisă și mutanta Y.l. - DG, obținută, fiind precizate, în paralel cu tulpina parentală, caracteristicile sale morfologice, taxonomice și biochimice. Mutanta Y.l. - DG., a fost depusă în Colecția ICECHIM, la nr. 22, la data de 2 septembrie 1996.

Tabelul 3

Nr. crt.	Caracteristici
0	1	2	3
I. Caractere morfologice
1	Dimensiuni	3-5 x 5 - 11 - peste 20μ	Idem 2
2	Formă	ovale sau alungite, formează pseudomiceliu	Idem 2
3	Sporulare	rar, uneori pe medii de sporulare	Idem 2

RO 113867 Bl

Tabelul 3 (continuare)

10

II. Caractere culturale:
1	Aspect pe medii lichide	cultivate pe mediu de must de malț și pe mediu de grăsimi cu adaos de săruri minerale, formează pseudomiceliu cu pseudohife	Idem 2
2	Aspectul coloniilor	pe mediul malț-agar formează colonii rotunde, alungite, de culoare crem-gri	Idem 2
3	Dezvoltare pe malț-agar	după o lună la t° camerei, culoarea este bej-gălbui, încrețită și suprafața untoasă	Idem 2
III. Caractere fiziologice
1	Aerob, facultativ anaerob	+	+
2	pH optim pentru biosinteză	3,8 ... 4,2	Idem 2
	pH optim pentru multiplicare	4,5	Idem 2
	pH limită	2 ... 7	Idem 2
	T° optimă	30 ... 32°C	Idem 2
3	T° inhibiție multiplicare	45°C	Idem 2
IV. Caractere biochimice:
	- fermentația compușilor carbonului - asimilația compușilor carbonului:	Absentă glucoză +	Idem 2 +
	galactoză	-	-
	L - sorboză	+	+ (slab)
	D - riboză	-	-
	L-ramnoză	-	-
	etanol	+	+
	zaharoză	+	+
	maltoză	+	+

RO 113867 Bl

12

Tabelul 3 (continuare]

celobioză	-	-
trehaloză	-	-
lactoză	-	-
melibioză	-	-
rafinoză	-	-
inulină	-	-
amidon solubil	-
D - xiloză	-	-
L - arabinoză	-	-
- glicerol	+	+
eritrol	+	+
ribitol	-	-
galactitol	-	-
D-manitol	+	+
salicin	-	+
acid lactic	+	+
acid succinic	+ (slab]	+
acid citric	+	+
inozitol	-	-
- asimilarea compușilor azotului : azotat de potasiu
nitrat de potasiu	-	-
histidină	-	-
sulfat de amoniu	+	+
asparagină	+	+
glicocol	+	+
triptofan	+	+
uree	+	+

V. Necesități nutriționale - hom

Claims

1. Mutantă Yarrowia lipolytica, producătoare de biomasă proteică furajeră, din grăsimi, caracterizată prin 5 aceea că este înregistrată în colecția ICECHIM la nr. 22 sub denumirea Y. lipolytica DG 1, este stabilă din punct de vedere genetic, este auxotrofă față de homoserină, are activitate optimă de io dezvoltare la temperatura de 34 ... 36°C pe substrat de 2% grăsimi, pH=3,8 ... 4,2, debit de aer 0,6 l/l/min, durata procesului fiind de 24 h și produce o biomasă cu proteină 50% s.u., metionină 0,57% s.u., acizi nucleici 6,2% s.u.

2. Procedeu de obținere a mutantei Y. Lipolytica DG 1, caracterizat prin aceea că, tulpina parentală Y. lipolytica ICECHIM 21, aflată în faza staționară de creștere, este supusă mutagenezei cu formaldehidă, în doză de 60 mM. cu timp de contact de 50 min, la 31 ± 0,5°C, în condiții de aerare - agitare, după care se face izolarea și selecția mutantelor prin tehnici în sine cunoscute.