RO113867B1 - MUTANTA YARROWIA LIPOLYTICA PRODUCĂTOARE DE BIOMASĂ PROTEICĂ FURAJERĂ Șl PROCEDEU DE OBȚINERE A ACESTEIA - Google Patents
MUTANTA YARROWIA LIPOLYTICA PRODUCĂTOARE DE BIOMASĂ PROTEICĂ FURAJERĂ Șl PROCEDEU DE OBȚINERE A ACESTEIA Download PDFInfo
- Publication number
- RO113867B1 RO113867B1 RO9602072A RO9602072A RO113867B1 RO 113867 B1 RO113867 B1 RO 113867B1 RO 9602072 A RO9602072 A RO 9602072A RO 9602072 A RO9602072 A RO 9602072A RO 113867 B1 RO113867 B1 RO 113867B1
- Authority
- RO
- Romania
- Prior art keywords
- yarrowia lipolytica
- mutant
- mutants
- lipolytica
- fodder
- Prior art date
Links
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Mutanta Yarrowia lipolytica
DG, realizată pentru obținerea proteinelor din
grăsimi, la care se referă invenția de față,
este utilizată la fabricarea biomasei proteice
furajere, bogată în aminoacizi cu sulf.
Obținerea mutantei s-a realizat prin acțiunea
factorului mutagen formaldehidă asupra
tulpinii parentale Yarrowia lipolytica. Izolarea și
selecția mutantelor s-a făcut pe criterii de
auxotrofie și pe criterii de asimilație. Invenția
vizează obținerea unei mutante cu caracteristici
genetice stabile, având ca marker de
auxotrofie homoserina (horn'].
Description
Invenția de față se referă la o mutantă, Yarrowia lipolytica, producătoare de biomasă proteică furajeră și la un procedeu de obținere a acesteia.
In scopul obținerii biomasei proteice furajere, se folosește, în mod curent, substratul de borhot de melasă pe care se cultivă specii ale genului Candida, iar biomasele furajere obținute au dezavantajul că sunt sărace în aminoacizi esențiali limitativi pentru organismul animal.
In literatura de specialitate, sunt cunoscute procedee de obținere a mutantelor de drojdii, care cuprind etapele de: determinarea curbelor de creștere, a curbelor de inactivare a agentului mutagen de izolare și selecție a mutantelor (Rene Scriban și colab., Technique Documentation - Lavoisier, 1993).
Mutanta Yarrowia lipolytica DG^ conform invenției, este înregistrată în colecția ICECHIM la nr.22, este stabilă din punct de vedere genetic, este auxotrofă față de homoserină (horn) și are activitatea optimă de dezvoltare la temperatura de 34 ... 36°C pe substrat de 2% grăsimi, pH=3,8 ... 4,2, debit de aer 0,6 l/l min, durata procesului fiind 24 h și produce o biomasă cu proteină 50% s.u., metionină 0,57% s.u. acizi nucleici 6,2% s.u.
Procedeul de obținere a mutantei Yarrowia lipolytica DGV conform invenției, constă în aceea că, tulpina parentală Y. lipolytica ICECHIM 21, aflată în faza staționară de creștere, este supusă mutagenezei cu formaldehidă (FA) în doză de 60 mM, cu timp de contact de 50 min, la 31 ± 0,5°C, în condiții de aerareagitare, după care se face izolarea și selecția mutantelor prin tehnici în sine cunoscute.
Prin aplicarea invenției, se obține o biomasă proteică furajeră, cu conținut ridicat de aminoacizi esențiali limitativi, indispensabili organismului animal, utilizându-se instalațiile existente.
Se dă, în continuare, un exemplu de realizare a invenției.
Pentru pregătirea tulpinilor parentale în vederea mutagenezei, se deter2 mină curba de creștere a tulpinii parentale.
Tehnica determinării curbei de creștere a tulpinii parentale Yarrowia lipolytica, constă în prelevarea unei porțiuni din cultura “STOC” și dispersării în plăci Petri ce conțin mediul malț-agar (extract malț 12% și agar 2%). După dezvoltarea coloniilor timp de 48 h, la 34 ± 0,5°C, dintr-o colonie tipică s-a făcut o subcultură de 24 h, pe același mediu și în aceleași condiții. Cultura astfel dezvoltată a fost suspendată prin desprinderea ei de pe suprafața mediului agarizat, într-o soluție izotonică de clorură de. sodiu sterilă (9 %□),. și a fost spălată de două ori consecutiv, cu aceeași soluție. Depozitul de drojdie s-a resuspendat în soluție izotonică de clorură de sodiu, pentru a se obține o densitate de 106 celule pe ml. Această suspensie a servit drept inocul pentru un mediu lichid must de malț 12%, astfel încât să se abțină un titru inițial de 10a celule pe ml. Flacoanele cu o capacitate de 750 ml, conținând 100 ml mediu de însămânțare, au fost montate pe agitator rotativ cu 240 r.p.m. și excentricitate 5 cm, la temperatura de 34 ± 1°C, timp de 30 h.
Au fost prelevate probe sterile din două în două ore, pentru determinarea numărului de celule prin metoda diluțiilor și numărarea cu ajutorul lamei Goreaev.
Curba de creștere a tulpinii Yarrowia lipolytica are o fază de Iag, scurtă, de aproximativ 4 h, faza exponențială se întinde de la 4 h la 20 h, iar faza staționară este, de asemenea, de aproximativ 4 h. Faza staționară, când activitatea fiziologică a celulei de drojdie o face aptă pentru modificările induse de factorul mutagen formaldehidă, a fost stabilită între orele 20 ... 24 de dezvoltare, în condițiile specifice pentru tulpina Yarrowia lipolytica.
Pentru determinarea nivelului mutației spontane, se utilizează o cultură la începutul fazei staționare de creștere, dezvoltată pe mediul de must de malț, timp de 20 h, în condiții de aerare-agitare.
Cultura dezvoltată se centrifuRO 113867 Bl ghează pentru separarea celulelor, depozitul se spală de două ori cu soluție izotonică de clorura de sodiu sterilă.
Depozitul se resuspendă în aceeași soluție, pentru a obține un număr de aproximativ 1O6 celule pe ml. Din această suspensie, se fac diluții seriate și dispersii în plăci cu mediu malț-agar, însămânțându-se câte □, 1 ml din diluțiile 1O5 și 1O®. Plăcile se mențin 48 ... 72 h, la 34 ± O,5°C.
Verificarea nivelului mutației spontane spre auxotrofie se face prin metoda replicii, a coloniilor de pe mediul complet malț-agar, pe mediul minimal agarizat.
Procentul de mutante apărute se calculează, raportând numărul de mutante auxotrofe la numărul de colonii repicate.
Verificarea a 12.000 colonii nu a evidențiat mutante spontane cu caracteristici auxotrofe. Stabilitatea genetică a tulpinii parentale Yarrowia lipolytica a permis trecerea la etape de inducere a mutantelor.
Procesul de mutageneză cu formaldehidă (FA] a tulpinii parentale cuprinde și stabilirea dozei optime de inducere a mutantelor. In acest scop, s-au folosit doze de 30 mM, 60 mM și
100 mM, timpul de contact al agentului mutagen cu microorganismul fiind de 40, 50 și 60 min. In cazul dozei de 30 mM, viabilitatea variază între 93,63 și
90,57%, scăderea viabilității fiind proporțională cu timpul de expunere.
In cazul dozei de 60 mM, viabilitatea variază între 8,18 și 2,18%. In timp ce, pentru doza de 100 mM, se ob10 ține o viabilitate cuprinsă între 0,40 și 0,01%, se stabilește doza optimă de inducere a mutantelor, care este 60 mM la timpul de contact de 50 min, conform tabelului 1.
Inducerea mutagenezei cu formaldehidă (FA) 60 mL se realizează pe o cultură în fază staționară de creștere. Astfel, cultura dezvoltată 20 h pe mediu lichid malț-extract se centrifughează în condiții aseptice, 15 min la 5.000 rot/min. După înlăturarea supernatantului și spălarea celulelor cu soluție izotonică de clorură de sodiu, depozitul se resuspendă în tampon fosfat pH=7,4 (Na2HP04 anhidru-7,0 g, KHaP04 anhidru-2,0 g, NaCI-4,0 g, MgS04.7H200,2 g, apă distilată 1.000 ml] pentru a obține, în final, o densitate de 10B celule pe ml, la care se adaugă FA, pentru a
0 ajunge la 60 mM.
Tabelul 1
Timp de expunere (min) | Număr de celule pe ml | Viabilitate (%) | Număr mutante pe nr. colonii repicate | Frecvența ’ mutației (%j | |
inițial | final | ||||
40 FA-30mM 50 60 | 7,85 . 106 | 7,35 . 10® | 93,63 | 0/195 | 0 |
7,85 . 106 | 7,51 . 10® | 95,66 | 0/245 | 0 | |
7,85 .10® | 7,11 . 10® | 90,57 | 0/200 | 0 | |
40 FA-60mM 50 60 | 5,50.106 | 0,45 . 10® | 8,18 | 0/150 | 0 |
5,50.106 | 0,31 . 10® | 5,63 | 0/200 | 0,50 | |
5,50.106 | 0,12 . 10® | 2,18 | 1/250 | 0,40 | |
40 FA-100mM 50 60 | 1,70 . 10® | 7,9 . 103 | 0,40 | 0/175 | 0 |
1,70.106 | 5,35 . 102 | 0,03 | 0/100 | 0 | |
1,70.10® | 2,55 . 102 | 0,01 | 0/95 | 0 |
RO 113867 Bl
Mutageneza se realizează la 31 ± O,5°C și în condiții de aerare- agitare la baloane, pe agitator rotativ, la 240 r.p.m. și 5 cm excentricitate. După 45 min, timp de contact al celulelor cu a- 5 gentul mutagen, totul se centrifughează 15 min, la 5.000 r.p.m. iar depozitul de celule obținute se spală cu o soluție izotonică de clorură de sodiu, de două ori consecutiv. io
După întreruperea acțiunii factorului mutagen, se efectuează diluții zecimale ale probelor mutagenizate de la malț-agar repartizat în cutii Petri.
Termostatarea se face la 37 ± □,5°C, după care se fac citirile și se calculează procentul de viabilitate, conform relației:
V % = nr.de cel,/ml probă tratată . 100 nr.de cel./ml probă netratată
Letalitatea se calculează după formula: L%= 100-V
Pentru îmbogățirea suspensiei în 20 mutante, se însămânțează 1 ml suspensie în 50 ml mediu lichid must de malț 12% și se menține 24 h la 37 ± 0,5°C, pe agitator rotativ. Din această suspensie, se face izolarea de mutante auxo- 2 5 trofe ca și în cazul mutagenezei spontane.
Tehnicile de izolare și selecție a mutantelor se referă, atât la criterii de laborator, pentru a putea marca mutan- 30 tele și a putea stabili condițiile de dezvoltare, cât și la criterii industriale, bazate pe proprietățile alcooligene, osmotolerante și termotolerante.
Determinarea necesităților nutri- 35 ționale ale mutantelor constă din însămânțare în suprafață a mediului minimal agarizat, ce conține o combinație de aminoacizi, baze purinice și pirimidinice, și vitamine, conform tabelului 2. 40
Soluțiile se combină în mod steril, în volume egale, pentru a forma amestecurile arătate în coloanele orizontale 1 ... 6 și coloanele verticale 7 ... 12.
La 100 ml mediu minimal, se adaugă 1 ml amestec. Mediul minimal agarizat (M.M.A.), este format din: soluție săruri minerale 100 ml, apă agarizată 300 ml, soluție glucoză 20% 4 ml. Soluția de săruri minerale cuprinde: NH4CI - 20 g, NH4N03 - 4 g, Na2S04 anhidru - 8 g, K2HP04 anhidru - 12 g, KH2P04 anhidru - 4 g, MgS04 . 7H20 0,4 g, apă distilată - până la 1.000 ml; se aduce la pH=7,2 cu NaOH 20%. Apa agarizată conține : agar - 20 g și apă distilată până la 1.000 ml ( se aduce pHul la 7,2). Soluția de glucoză cuprinde: glucoză - 20 g și apă - 100 ml.
Interpretarea rezultatelor se face în felul următor: mutantele crescute pe un singur mediu indică o necesitate nutrițională față de doi sau mai mulți factori de mediu, iar creșterea pe două medii indică o singură necesitate nutrițională.
Tabelul 2
Amestec | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 |
7 | adenină* | biotină++ | fenil-alaninăx | alanină* | arginină* | leuci- nă* |
RO 113867 Bl
Tabelul 2 (continuare)
8 | xantină* | acid folic(5O)++ | serinăx | cisteină* | ornitină* | glici- nă* |
9 | citozină* | pantotenat de Ca (50Γ | triptofan* | homoseri- nă* | acid aspartic* | izoleuci nă* |
10 | guanină+ | piridoxină (50)++ | tirazină* | vit.B12 (50) | pralină* | histi- dină* |
11 | timină(1) | tionină (1)++ | acid paraminobenzoic (50]** | metionină* | acid glutamic* | lizină* |
12 | uracil* | riboflavină (250)*+ | acid nicotinic (5or | colină (1000)++ | inozitol (500)** | valină |
x » Soluții de 10 mg pe 10 ml pentru forma L (sau 20 pg pe pe ml pentru forma DL]: + = Soluții de 5 mg pe ml;
= Soluții în concentrațiile indicate în paranteie (pg pe ml).
Mutantele auxotrofe se studiază io din punct de vedere al capacității lor de a produce o proteină cu conținut ridicat de aminoacizi cu sulf prin însămânțarea lor pe un mediu complet ce conține 12% must de malt, la temperatura de 34 ... 15 36 ± 0,5°C.'
A fost selecționată mutanta Yarrowia lipolytica DG,, care este auxotrofă pentru homoserină (horn) 1 mg/ml, înalt producătoare de proteină (50% 20 s.u.), cu conținut ridicat de metionină, 0,5% s.u.
Se dă, mai departe, descrierea mutantei Yarrowia lipolytica DG,, comparativ cu tulpina parentală. 25
Fermentarea și asimilarea compușilor cu carbon și azot se face după metoda Lodder, pe mediu Lodder.
Pentru obținerea mutantei Y.l.
DG, 1, conform invenției, s-a plecat de la Yarrowia lipolytica (Y.l.) Depusă la colecția ICECHIM - Secția Biotehnologie, la nr. 21, de la data de 30 ianuarie 1996 și ale cărei caracteristici taxonomice, morfologice și biochimice sunt prezentate în tabelul 3. In același tabel, este descrisă și mutanta Y.l. - DG, obținută, fiind precizate, în paralel cu tulpina parentală, caracteristicile sale morfologice, taxonomice și biochimice. Mutanta Y.l. - DG., a fost depusă în Colecția ICECHIM, la nr. 22, la data de 2 septembrie 1996.
Tabelul 3
Nr. crt. | Caracteristici | ||
0 | 1 | 2 | 3 |
I. Caractere morfologice | |||
1 | Dimensiuni | 3-5 x 5 - 11 - peste 20μ | Idem 2 |
2 | Formă | ovale sau alungite, formează pseudomiceliu | Idem 2 |
3 | Sporulare | rar, uneori pe medii de sporulare | Idem 2 |
RO 113867 Bl
Tabelul 3 (continuare)
10
II. Caractere culturale: | |||
1 | Aspect pe medii lichide | cultivate pe mediu de must de malț și pe mediu de grăsimi cu adaos de săruri minerale, formează pseudomiceliu cu pseudohife | Idem 2 |
2 | Aspectul coloniilor | pe mediul malț-agar formează colonii rotunde, alungite, de culoare crem-gri | Idem 2 |
3 | Dezvoltare pe malț-agar | după o lună la t° camerei, culoarea este bej-gălbui, încrețită și suprafața untoasă | Idem 2 |
III. Caractere fiziologice | |||
1 | Aerob, facultativ anaerob | + | + |
2 | pH optim pentru biosinteză | 3,8 ... 4,2 | Idem 2 |
pH optim pentru multiplicare | 4,5 | Idem 2 | |
pH limită | 2 ... 7 | Idem 2 | |
T° optimă | 30 ... 32°C | Idem 2 | |
3 | T° inhibiție multiplicare | 45°C | Idem 2 |
IV. Caractere biochimice: | |||
- fermentația compușilor carbonului - asimilația compușilor carbonului: | Absentă glucoză + | Idem 2 + | |
galactoză | - | - | |
L - sorboză | + | + (slab) | |
D - riboză | - | - | |
L-ramnoză | - | - | |
etanol | + | + | |
zaharoză | + | + | |
maltoză | + | + |
RO 113867 Bl
12
Tabelul 3 (continuare]
celobioză | - | - | |
trehaloză | - | - | |
lactoză | - | - | |
melibioză | - | - | |
rafinoză | - | - | |
inulină | - | - | |
amidon solubil | - | ||
D - xiloză | - | - | |
L - arabinoză | - | - | |
- glicerol | + | + | |
eritrol | + | + | |
ribitol | - | - | |
galactitol | - | - | |
D-manitol | + | + | |
salicin | - | + | |
acid lactic | + | + | |
acid succinic | + (slab] | + | |
acid citric | + | + | |
inozitol | - | - | |
- asimilarea compușilor azotului : azotat de potasiu | |||
nitrat de potasiu | - | - | |
histidină | - | - | |
sulfat de amoniu | + | + | |
asparagină | + | + | |
glicocol | + | + | |
triptofan | + | + | |
uree | + | + |
V. Necesități nutriționale - hom
Claims (2)
1. Mutantă Yarrowia lipolytica, producătoare de biomasă proteică furajeră, din grăsimi, caracterizată prin 5 aceea că este înregistrată în colecția ICECHIM la nr. 22 sub denumirea Y. lipolytica DG 1, este stabilă din punct de vedere genetic, este auxotrofă față de homoserină, are activitate optimă de io dezvoltare la temperatura de 34 ... 36°C pe substrat de 2% grăsimi, pH=3,8 ... 4,2, debit de aer 0,6 l/l/min, durata procesului fiind de 24 h și produce o biomasă cu proteină 50% s.u., metionină 0,57% s.u., acizi nucleici 6,2% s.u.
2. Procedeu de obținere a mutantei Y. Lipolytica DG 1, caracterizat prin aceea că, tulpina parentală Y. lipolytica ICECHIM 21, aflată în faza staționară de creștere, este supusă mutagenezei cu formaldehidă, în doză de 60 mM. cu timp de contact de 50 min, la 31 ± 0,5°C, în condiții de aerare - agitare, după care se face izolarea și selecția mutantelor prin tehnici în sine cunoscute.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RO9602072A RO113867B1 (ro) | 1996-10-30 | 1996-10-30 | MUTANTA YARROWIA LIPOLYTICA PRODUCĂTOARE DE BIOMASĂ PROTEICĂ FURAJERĂ Șl PROCEDEU DE OBȚINERE A ACESTEIA |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RO9602072A RO113867B1 (ro) | 1996-10-30 | 1996-10-30 | MUTANTA YARROWIA LIPOLYTICA PRODUCĂTOARE DE BIOMASĂ PROTEICĂ FURAJERĂ Șl PROCEDEU DE OBȚINERE A ACESTEIA |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RO113867B1 true RO113867B1 (ro) | 1998-11-30 |
Family
ID=20104116
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RO9602072A RO113867B1 (ro) | 1996-10-30 | 1996-10-30 | MUTANTA YARROWIA LIPOLYTICA PRODUCĂTOARE DE BIOMASĂ PROTEICĂ FURAJERĂ Șl PROCEDEU DE OBȚINERE A ACESTEIA |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
RO (1) | RO113867B1 (ro) |
-
1996
- 1996-10-30 RO RO9602072A patent/RO113867B1/ro unknown
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Burton et al. | Novel mutation causing derepression of several enzymes of sulfur metabolism in Neurospora crassa | |
Currier et al. | Isolation and preliminary characterization of auxotrophs of a filamentous cyanobacterium | |
CZ280901B6 (cs) | Způsob kultivace bakterií | |
Gold et al. | Conditions for fruit body formation in the white rot basidiomycete Phanerochaete chrysosporium | |
Snell | Use of microorganisms for assay of vitamins | |
Leaver et al. | Nutritional studies on Piricularia oryzae | |
Tsuboi et al. | Effect of cyclic AMP, theophylline and caffeine on the glucose repression of sporulation in Saccharomyces cerevisiae | |
Thomulka et al. | Inorganic nitrogen assimilation in yeasts: alteration in enzyme activities associated with changes in cultural conditions and growth phase | |
CA1278541C (en) | Method for production of cytidine and/or deoxycytidine | |
EP0174155A2 (en) | Cell growth promoting agent and process for promoting cell growth | |
CA1316857C (en) | Riboflavin producing strains of microorganisms, method for selecting, and method for fermentation | |
Kusakabe et al. | Extracellular production of L-lysine α-oxidase in wheat bran culture of a strain of Trichoderma viride | |
MISAWA et al. | Production of Nucleic Acid-Related Substances by Fermentative Processes Part XXII. Fermentative, Production of 5'-Xanthylic Acid by a Guanine Auxotroph of Brevibacterium ammoniagenes | |
Fawole et al. | Observations on the regulation of glutamate dehydrogenase activity in Coprinus lagopus | |
RO113867B1 (ro) | MUTANTA YARROWIA LIPOLYTICA PRODUCĂTOARE DE BIOMASĂ PROTEICĂ FURAJERĂ Șl PROCEDEU DE OBȚINERE A ACESTEIA | |
KR930006994B1 (ko) | 우리딘의 제조방법 | |
Chang et al. | Factors affecting the biotin content of yeasts | |
Macris et al. | Continuous fermentation to produce fungal protein. Effect of growth rate on the biomass yield and chemical composition of Fusarium moniliforme | |
Tremaine et al. | Effect of six vitamins on ascospore formation by an isolate of bakers' yeast | |
JPH022349A (ja) | ピリミジンアナログ耐性化遺伝子dnaおよびその用途 | |
JPH0636734B2 (ja) | 新規凝集性アルコ−ル発酵酵母 | |
Nishio et al. | Utilization of hydrocarbons by microorganisms: part III. Effects of organic nutrients, mineral salts and other factors on the accumulation of vitamin B2 | |
KR880002417B1 (ko) | 구아노신의 제조법 | |
Jensen et al. | Production of lysine-rich yeast | |
Tendler | Studies on thermophilic actinomycetes |