RO113307B1 - Metoda pentru determinarea unei componente supresoare a starii imune umane - Google Patents

Description

Prezenta invenție se referă la o metodă pentru determinarea unei componente supresoare a stării imune umane, care este utilizată în domeniul medicinii umane și anume la diagnosticare.

Este cunoscută,în domeniul de specialitate, substanța β-1-glicoproteina de origine placentară care este un analog de β-1-glicoproteină trofoblastică (TBG), care este utilizată ca stimulator al dezvoltării celulelor hematopoietice din sânge. Cu toate acestea, acești compuși nu au fost utilizați pentru determinarea unei componente supresoare a stării imune umane.

Este cunoscută, însă, utilizarea TBG-ului pentru diagnosticarea și prognosticarea cursului sarcinii, așa cum rezultă din literatura de specialitate. Cu toate acestea, nu se dezvăluie posibilitatea utilizării TBG-ului pentru diagnosticarea unei componente supresoare a stării imune umane.

In domeniul de specialitate, este cunoscută o metodă de determinare a componentei supresoare a stării imune umane, care cuprinde colectarea sângelui periferic, pentru obținerea unei suspensii de limfocite pure pentru cultivarea culturilor test cu un activator de suprimare, și fără un activator de suprimare, și mai departe evaluarea nivelurilor de proliferare. Concanvalina A este folosită ca drept activator al supresiei. Acest fapt face ca metoda să folosească un preparat care este greu accesibil și este costisitor.

Este cunoscută, de asemenea, o metodă pentru determinarea unei comonente supresoare a stării imune umane, care cuprinde colectarea de sânge periferic, obținând o suspensie de celule mononucleare (MNCs), după care suspensia respectivă este divizată în două porțiuni egale, cultivând MNCs-urile din cea de a doua porție cu un activator de supresie, spălarea MNCs-urilor din mediul de cultură și blocarea proliferării, adăugând MNCs-uri proaspăt izolate de la un donor normal la fiecare dintre porțiunile de MNCs menționate mai sus, stimulând cu fitohemaglutinină în porțiuni egale, pentru a obține culturile test, cultivarea acestora și apoi evaluarea proliferării respective în culturile test (așa cum rezultă din literatura de specialitate). Și în această metodă se folosește concanvalina A ca activator, deci un preparat greu accesibil și costisitor.

Metoda pentru determinarea unei componente supresoare a stării imune umane, în conformitate cu prezenta invenție, constă în aceea că folosește drept activator de supresie β-1-glicoproteina trofoblastică (TBG) într-o doză de la 3 la 120 pg/ml suspensie MNC. Suspensia MNC este produsă din celulele obținute ca rezultat al separării într-o etapă cu gradient de ficol-urotrust. Cultivarea MNC-urilor se realizează pe parcursul a 48 h. Proliferarea este blocată prin tratarea MNCs-urilor cu mitomicin C. Fiecare cultură este cultivată pe parcursul a 72 h.

Avantajul metodei, conform invenției, este acela că permite utilizarea pe scară largă, atât în scopuri științifice cât și pentru practica clinică.

De asemenea, trebuie notat că utilizarea concanvalinei A, pentru tratarea bolilor menționate mai sus, este contraindicată din cauza toxicității acesteia. Prin utilizarea de TBG 6 produs de trofoblaste) rezultă o metodă care nu prezintă toxicitate și nu provoacă reacții alergice. Acest fapt permite să se utilizeze respectivul preparat și ca medicament.

Se dă, în continuare, un exemplu de realizare a invenției.

In prima etapă, suspensia de Mnc este preparată din celule obținute ca rezultat al separării într-o etapă cu gradient de densitate ficol-urotrust 6 (metoda lui Boyum).

De la un pacient, se recoltează sânge periferic, prin venipunctură și este plasat simultan în tuburi care conțin soluție de heparină (1 ml de sânge = 20 ... 30 unități de heparină). In continuare, sângele este diluat cu soluție Hanks, în proporție de 1:2, fără Ca⁺⁺ și Mg⁺⁺ și este depusă în strat de coloană cu gradient ficol-urotrust (densitatea fiind

RO 113307 Bl de 1,078). Urmează centrifugarea care se realizează la 400 xg timp de 30 min. Dispersia de MNC, din interfază este plasată într-un tub de centrifugare, se adaugă apoi soluție HANKS fără Ca⁺⁺ și Mg⁺⁺ și se realizează trei centrifugări succesive (de câte 10 min fiecare), pentru a se spăla celulele de soluția de ficolurotrust. După a treia centrifugare, reziduul de MNC este resuspendat într-un ml de mediu 199, și apoi se numără celulele mononucleare (prin utilizarea aparatului Goryajev).

In a doua etapă, MNC-urile sunt împărțite în două părți egale, prima parte este cultivată fără activator de supresor, iar a doua parte este cultivată cu activatorul supresor, și anume β-1-glicoproteina trofoblastică (TBG), care are rol de activator.

MNCs-urile sunt cultivate în vase de penicilină cu dopuri de cauciuc * 14,5 la temperatura de 37°C. Mediul de cultură este PPMI-1640 ce conține 20% ser, grupa (AB)IV și 300 mg de glutamină. Fiecare vas conține 5 χ 10⁶ celule, în 2,0 ml de mediu complet. In continuare, la cultură, se adaugă TBG, în doze de 3 ... 120 ug, pentru a induce supresorul. Celulele sunt apoi cultivate timp de 48 h. In continuare, MNCs-urile sunt spălate de mediul de cutlură și proliferarea este blocată prin tratare cu mitomicin C (în cantitate de 40 /zg/ml, timp de 30 min și la temperatura de 37°C). Spălarea este realizată, de trei ori, utilizând mediu 199 ce conține 5% ser (AB)IV care este rece. Reziduul celular este resuspendat și este numărat numărul de celule care conțin nuclee și apoi determinat procentul de viabilitate a celulelor, utilizând o soluție 0,1% de tripan-blue și suspensia rezultată este diluată până la concentrația cerută. Toate operațiile sunt realizate separat pentru celulele de control și pentru celulele stimulate cu TBG, iar pentru a spăla celulele, se utilizează vase de siliciu.

In etapa următoare, limfocitele proaspăt izolate de la un donator normal (limfocite care sunt prestimulate cu fitohemaglutinină (PHA) și sunt utilizate ca celule test pentru răspuns) sunt adăugate în fiecare dintre porțiunile de control și de limfocite stimulate cu TBG 3 porțiuni egale (0,5 χ 10⁶ celule/ml: 0,5 x 10^G celule/ml) pentru a obține culturile test. In continuare, se realizează evaluarea culturilor, utilizând H³-timidină și suspensia este evaluată prin gradul de descreștere a proliferării din acestea. Indexul de supresie este determinat utilizând următoarea formulă:

IS = (1 - numărul de impulsuri/minut în cultura test cu TBG) x 100% numărul de impulsuri/minut în culturile test fără TBG

Pentru a evalua coponenta supresoare la un donator normal, s-a realizat un studiu de diagnostic în conformitate cu metode care sunt cunoscute din stadiul tehnicii, precum și un studiu de diagnostic, conform cu metoda din prezenta invenție și utilizând un grup de donatori normali (100 persoane). Pe baza rezultatelor astfel obținute, valorile normale a activității supresorilor-T sub inducția cu concanvalina A se determină ca fiind 56,8% ± 4%, pe când în conformitate cu metoda din prezenta invenție, valoarea este de 63,4% ± 4,7%.

□ descriere suplimentară a invenției este ilustrată prin testele următoare care au fost efectuate. Astfel:

A. O pacientă (femeie) în vârstă de 40 ani s-a prezentat la spital cu diagnosticul de “scleroză deseminată, formă cerevromedulară” în stare acută. S-a determinat activitatea supresorilor-T în sângele periferic sub inducerea de concanvalin A (în conformitate cu metoda care este cunoscută din literatura de specialitate) care este evaluată la 16%. In mod similar, s-a determinat activitatea supresorilor-T în sângele periferic (la aceeași pacientă) utilizând metoda în conformitate cu prezenta invenție (sub inducerea de TBG) și valoarea astfel obținută este de 19%.

B. Au fost studiați 150 pacienți care suferă descleroză deseminată și artrită reumatoidă. S-a demonstrat că activitatea supresorilor-T, determinată prin metoda în conformitate cu prezenta

RO 113307 Bl invenție, corespunde valorilor obținute prin metoda care este cunoscută.

Prin urmare, a fost confirmată eficiența mare a TBG-ului, ca mijloc pentru determinarea componentei supre- 5 soare a stării imune umane.

Claims (5)

1. Revendicări

   1. Metodă pentru determinarea io unei componente supresoare a stării imune umane, care cuprinde colectarea sângelui periferic pentru a obține o suspensie de celule mononucleare (MNCs), împărțirea respectivei suspensii în două 15 părți egale, cultivarea MNCs-urilor din prima porțiune fără un activator de supresor, spălarea MNCs-urilor din mediul de cultură, blocarea proliferării, adăugarea MNCs-urilor proaspăt izolate 20 de la un donor normal, MNCs-uri care au fost stimulate cu fitohemaglutinină, în fiecare dintre porțiunile respective de MNC în proporții egale pentru a obține culturile test, cultivarea culturilor test 25 respective, apoi evaluarea proliferării în culturile test menționate și determinarea valorii supresiei pe baza rapoartelor nivelelor de proliferare în culturile test, caracterizat prin aceea că, drept activator de supresie se utilizează β-1-glicoproteina trofoblastică (TBG], într-o doză de la 3 la 120 pg/ml suspensie MNC.
2. 2. Metodă, conform revendicării 1, caracterizată prin aceea că, suspensia de MNC este produsă din celulele obținute ca rezultat al separării într-o etapă cu gradient ficol-urotrust.
3. 3. Metodă, conform revendicării 1, caracterizată prin aceea că, cultivarea MNC-urilor se realizează pe parcursul a 48 h.
4. 4. Metodă, conform revendicării 1, caracterizată prin aceea că, proliferarea este blocată prin tratarea MNCs-urilor cu mitomicin C.
5. 5. Metodă, conform revendicării 1, caracterizată prin aceea că, fiecare cultură test este cultivată pe parcursul a 72 h.