RU2396566C1 - Способ определения блокирующего эффекта аутологичной женской сыворотки - Google Patents
Способ определения блокирующего эффекта аутологичной женской сыворотки Download PDFInfo
- Publication number
- RU2396566C1 RU2396566C1 RU2009116174/15A RU2009116174A RU2396566C1 RU 2396566 C1 RU2396566 C1 RU 2396566C1 RU 2009116174/15 A RU2009116174/15 A RU 2009116174/15A RU 2009116174 A RU2009116174 A RU 2009116174A RU 2396566 C1 RU2396566 C1 RU 2396566C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- serum
- female
- autologous
- marker
- medium
- Prior art date
Links
Images
Landscapes
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Abstract
Изобретение относится к области медицины, в частности к способам определения состояния иммунной системы, и касается способа определения блокирующего эффекта аутологичной женской сыворотки. Сущность способа заключается в том, что женские лимфоциты инкубируют в среде с добавлением фитогемагглютинина в среде с добавлением фитогемагглютинина и аутологичной женской сыворотки, в среде с добавлением фитогемагглютинина и пулированной АВ-сыворотки и в среде без добавок, с последующим добавлением меченых FITC антител к CD69. Далее оценивают флуоресценцию в каждой из проб и определяют блокирующий эффект по формуле ! ! где А1 - доля клеток, несущих маркер CD69, в культуре женских клеток, стимулированных ФГА, А2 - доля клеток, несущих маркер CD69, в культуре женских клеток, стимулированных ФГА с добавлением АВ-сыворотки, A3 - доля клеток, несущих маркер CD69, в культуре женских клеток, стимулированных ФГА с добавлением аутологичной женской сыворотки, Ак - доля клеток, неспецифически связывающих иммуноглобулины того типа, к которому принадлежат антитела к CD69. Использование способа позволяет упростить определение блокирующего эффекта аутологичной женской сыворотки. 4 ил.
Description
Изобретение относится к области медицины, в частности к способам определения состояния иммунной системы женщины, и может найти применение в диагностике патологии беременности.
Известно, что в течение беременности функциональная активность иммунной системы женщины снижена. Это отражает наличие феномена неспецифической иммуносупрессии, необходимой для успешного внутриутробного развития полуаллогенного плода.
Течение беременности во многом определяется реакцией иммунной системы матери на отцовские антигены плода. Слабую выраженность этой реакции связывают с вероятностью самопроизвольного прерывания беременности на ранних сроках. В качестве недостаточности реакции иммунной системы матери рассматривается отсутствие блокирующей способности ее сыворотки, развитие которой является необходимым атрибутом физиологической беременности.
Блокирующая способность определяется наличием так называемых блокирующих факторов - растворимых факторов женской сыворотки, включающих не только антитела к антигенам плода, появляющиеся во время беременности, но и стероидинициируемые белки беременности, гидролитические ферменты, иммунные комплексы, антиидиотипические антитела, растворимые формы рецепторов к цитокинам и другим иммунорегуляторным молекулам.
Известен способ определения блокирующих свойств женской сыворотки по ингибированию пролиферативного ответа женских лимфоцитов на стимуляцию митогенами, в частности фитогемагглютинином (ФГА), в культуре при добавлении сыворотки в среду инкубации (К.В.Шмагель, В.А.Черешнев «Иммунитет беременной женщины». - М.: Медкнига, 2003, стр.225). Оценка пролиферативной активности лимфоцитов в культуре регистрируется по синтезу ДНК с использованием радиоактивно меченого Н3-тимидина.
Недостатками способа является использование трудоемкого меченого Н3 и необходимость специального оборудования и помещения для обеспечения безопасности работающего персонала.
Задача настоящего изобретения - упрощение способа определения блокирующих свойств женской сыворотки за счет исключения трудоемких реагентов и использования специального оборудования и помещения.
Поставленная задача решается способом определения блокирующего эффекта аутологичной женской сыворотки, включающим инкубирование женских лимфоцитов в культуре с добавлением фитогемагглютинина и аутологичной женской сыворотки, и где дополнительно инкубируют лимфоциты в среде с добавлением фитогемагглютинина и в среде с добавлением фитогемагглютинина и пулированной АВ-сыворотки, по окончании инкубации к каждой из проб добавляют меченые FITC антитела к CD69, оценивают интенсивность флуоресценции каждой из проб и определяют блокирующий эффект по формуле
где A1 - доля клеток, несущих маркер CD69, в культуре женских клеток, стимулированных ФГА,
А2 - доля клеток, несущих маркер CD69, в культуре женских клеток, стимулированных ФГА с добавлением АВ-сыворотки,
А3 - доля клеток, несущих маркер CD69, в культуре женских клеток, стимулированных ФГА с добавлением аутологичной женской сыворотки,
Ак - доля клеток, неспецифически связывающих иммуноглобулины того типа, к которому принадлежат антитела к CD69.
Кровь для анализа брали натощак из локтевой вены в стерильные пробирки. Лимфоциты выделяли стандартным методом центрифугирования в градиенте плотности с использованием смеси фиколлверографин плотностью 1,077. Сыворотку крови получали стандартным способом. Для проведения анализа сыворотку инактивировали нагреванием на водяной бане при 56°С в течение 30 минут.
Лимфоциты инкубировали в 96-луночных планшетах при 37°С в атмосфере с 5% CO2. Каждая лунка содержала по 0,25×106 лимфоцитов в среде RPMI-1640 с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки. В каждую лунку добавляли 50 мкл раствора ФГА с концентрацией 100 мкг/мл. Характер реакции женских лимфоцитов исследовали при добавлении 50 мкл женской сыворотки или 50 мкл пулированной АВ-сыворотки и без указанных добавок. Суммарный объем инкубационной смеси в каждой лунке составил 250 мкл.
Интенсивность пролиферации оценивали методом проточной цитофлуориметрии с использованием прямых, меченых FITC антител к CD69. Для этого после инкубации в течение 72 часов клетки снимали из лунок планшета в стандартные 1,5 мл пробирки типа Eppendorf, ресуспендировали в растворе PBS с 0,5 mM EDTA, отмывали в PBS и метили антителами к CD69 (Becton-Dickinson, США) и пропидием иодидом. Интенсивность флуоресценции оценивали на живых клетках на цитофлуориметре FACScan (Becton-Dickinson, США).
Блокирующий эффект аутологичной сыворотки рассчитывали как разницу блокирующих эффектов в средах с АВ-сывороткой и исследуемой сывороткой.
Блокирующие эффекты сывороток рассчитывали как отношение доли клеток, несущих маркер CD69, в среде без добавления сывороток, к доле клеток, несущих маркер CD69, в средах с добавлением АВ-сыворотки и аутологичной сыворотки и выражали в процентах.
Пример.
Определение блокирующего эффекта женской сыворотки проводили у практически здоровой фертильной женщины 30 лет (пациентки X), имеющей двух детей в возрасте 6 лет и 4 года. Обе беременности протекали без осложнений; искусственных, самопроизвольных абортов и неразвивающихся беременностей, а также урогенитальных инфекций в анамнезе нет.
Кровь для анализа у пациентки Х брали натощак из локтевой вены в стерильные пробирки. Лимфоциты выделяли стандартным методом центрифугирования в градиенте плотности с использованием смеси фиколлверографин плотностью 1,077. Сыворотку крови получали стандартным способом. Для проведения анализа сыворотку инактивировали нагреванием на водяной бане при 56°С в течение 30 минут.
Лимфоциты инкубировали в 96-луночных планшетах при 37°С в атмосфере с 5% СО2. Каждая лунка содержала по 0,25×106 лимфоцитов в среде RPMI-1640 с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки. В каждую лунку добавляли 50 мкл раствора ФГА с концентрацией 100 мкг/мл. Характер реакции женских лимфоцитов исследовали при добавлении 50 мкл женской сыворотки или 50 мкл пулированной АВ-сыворотки и без указанных добавок. Суммарный объем инкубационной смеси в каждой лунке составил 250 мкл.
Интенсивность пролиферации оценивали методом проточной цитофлуориметрии с использованием прямых меченых FITC антител к CD69. Для этого после инкубации в течение 72 часов клетки снимали из лунок планшета в стандартные 1,5 мл пробирки типа Eppendorf, ресуспендировали в растворе PBS с 0,5 mM EDTA, отмывали в PBS и метили антителами к CD69 (Becton-Dickinson, США) и пропидием иодидом. Интенсивность флуоресценции оценивали на живых клетках на цитофлуориметре FACScan (Becton-Dickinson, США).
Блокирующий эффект аутологичной сыворотки рассчитывали по вышеуказанной формуле.
Результаты обследования пациентки X:
A1=84,7%, А2=77,1%, А3=59,3%, Ак=3,0%; (табл.).
Блокирующий эффект = -(59,3-77,1)/(84,7-3,0)×100%=21,8%.
Проведение измерений блокирующей способности женской сыворотки у женщин вне беременности, беременных на разных сроках гестации с использованием предлагаемого способа, показали результаты, согласующиеся с литературными данными (фиг.1-4). Самая низкая блокирующая активность - сыворотки фертильных женщин (имеющих в анамнезе двое нормальных физиологических родов) вне беременности (фиг.1). По мере увеличения срока гестации увеличиваются и блокирующие свойства сыворотки, достигая максимальных значений перед родами (фиг.2-4). При этом с увеличением срока гестации наблюдается снижение экспрессии CD69 на стимулированных ФГА лимфоцитах и без добавления в культуральную среду женской сыворотки (фиг.4). Оба эти факта отражают наличие феномена неспецифической иммуносупрессии, сопровождающей развитие нормальной беременности.
Поэтому способ оценки функционального состояния иммунной системы женщины, связанный с определением блокирующих свойств аутологичной женской сыворотки по характеру экспрессии маркера ранней пролиферации CD69 в стимулированных митогенами культурах женских лимфоцитов, может быть использован в клинико-лабораторной диагностике патологии беременности.
Результаты клинических исследований блокирующих свойств сыворотки женщин вне и в ходе беременности с использованием описанного способа представлены в таблице. Согласно полученным данным наблюдаемое увеличение блокирующего эффекта сыворотки в ходе беременности во втором и третьем триместрах носит статистически достоверный характер.
Полученный результат отражает наличие феномена неспецифической иммуносупрессии, сопровождающей развитие нормальной беременности. Поэтому способ оценки функционального состояния иммунной системы женщины, связанный с определением блокирующих свойств аутологичной женской сыворотки по характеру экспрессии маркера ранней пролиферации CD69 в стимулированных митогенами культурах женских лимфоцитов, может быть использован в клинико-лабораторной диагностике патологии беременности.
Фиг.1
Гистограммы распределения интенсивности флуоресценции лимфоцитов женщины вне беременности, меченных ФИТЦ-антителами к антигену ранней пролиферации CD69. А - контроль. Б - в отсутствие сыворотки. В - эффект АВ-сыворотки. Г - эффект аутологичной сыворотки. Пунктиром указано положение маркера.
Фиг.2
Гистограммы распределения интенсивности флуоресценции лимфоцитов женщины в состоянии беременности 1-го триместра, меченных ФИТЦ-антителами к антигену ранней пролиферации CD69. А - контроль. Б - в отсутствие сыворотки. В - эффект АВ-сыворотки. Г - эффект аутологичной сыворотки. Пунктиром указано положение маркера.
Фиг.3
Гистограммы распределения интенсивности флуоресценции лимфоцитов женщины в состоянии беременности 2-го триместра, меченных ФИТЦ-антителами к антигену ранней пролиферации CD69. А - контроль. Б - в отсутствие сыворотки. В - эффект АВ-сыворотки. Г - эффект аутологичной сыворотки. Пунктиром указано положение маркера.
Фиг.4
Гистограммы распределения интенсивности флуоресценции лимфоцитов женщины в состоянии беременности 3-го триместра, меченных ФИТЦ-антителами к антигену ранней пролиферации CD69. А - контроль. Б - в отсутствие сыворотки. В - эффект АВ-сыворотки. Г - эффект аутологичной сыворотки. Пунктиром указано положение маркера.
Claims (1)
- Способ определения блокирующего эффекта аутологичной женской сыворотки, включающий инкубирование женских лимфоцитов в среде с добавлением фитогемагглютинина и аутологичной женской сыворотки, в среде с добавлением фитогемагглютинина и пулированной АВ-сыворотки, в среде с добавлением фитогемагглютинина и в среде без добавок, далее по окончании инкубации к каждой из проб добавляют меченые FITC антитела к CD69, оценивают интенсивность флуоресценции каждой из проб и определяют блокирующий эффект по формуле:
где А1 - доля клеток, несущих маркер CD69, в культуре женских клеток, стимулированных ФГА;
А2 - доля клеток, несущих маркер CD69, в культуре женских клеток, стимулированных ФГА с добавлением АВ-сыворотки;
А3 - доля клеток, несущих маркер CD69, в культуре женских клеток, стимулированных ФГА с добавлением аутологичной женской сыворотки;
АК - доля клеток, неспецифически связывающих иммуноглобулины того типа, к которому принадлежат антитела к CD69.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2009116174/15A RU2396566C1 (ru) | 2009-04-29 | 2009-04-29 | Способ определения блокирующего эффекта аутологичной женской сыворотки |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2009116174/15A RU2396566C1 (ru) | 2009-04-29 | 2009-04-29 | Способ определения блокирующего эффекта аутологичной женской сыворотки |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2396566C1 true RU2396566C1 (ru) | 2010-08-10 |
Family
ID=42699148
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2009116174/15A RU2396566C1 (ru) | 2009-04-29 | 2009-04-29 | Способ определения блокирующего эффекта аутологичной женской сыворотки |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2396566C1 (ru) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2558054C1 (ru) * | 2014-06-04 | 2015-07-27 | Вячеслав Михайлович Червинец | Способ определения цитотоксичности сыворотки женщины к мужским моноклеарным клеткам |
| RU2585091C1 (ru) * | 2015-01-19 | 2016-05-27 | государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Кемеровская государственная медицинская академия" Министерства здравоохранения Российской Федерации | Способ определения антител к аллогенным hla-g |
-
2009
- 2009-04-29 RU RU2009116174/15A patent/RU2396566C1/ru not_active IP Right Cessation
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| ШМАГЕЛЬ К.В. и др. Иммунитет беременной женщины. - М.: Мед. книга, 2003, с.33-49. * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2558054C1 (ru) * | 2014-06-04 | 2015-07-27 | Вячеслав Михайлович Червинец | Способ определения цитотоксичности сыворотки женщины к мужским моноклеарным клеткам |
| RU2585091C1 (ru) * | 2015-01-19 | 2016-05-27 | государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Кемеровская государственная медицинская академия" Министерства здравоохранения Российской Федерации | Способ определения антител к аллогенным hla-g |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Ariga et al. | Kinetics of fetal cellular and cell‐free DNA in the maternal circulation during and after pregnancy: implications for noninvasive prenatal diagnosis | |
| Chitty et al. | Diagnostic accuracy of routine antenatal determination of fetal RHD status across gestation: population based cohort study | |
| Almgren et al. | Cesarean delivery and hematopoietic stem cell epigenetics in the newborn infant: implications for future health? | |
| Hussen et al. | Recent advances in camel immunology | |
| Keller et al. | Recurrent miscarriages and the association with regulatory T cells; A systematic review | |
| Inada et al. | Characterization of regulatory T cells in decidua of miscarriage cases with abnormal or normal fetal chromosomal content | |
| Harris et al. | Comparison of amniotic-fluid and maternal serum alpha-fetoprotein levels in the early antenatal diagnosis of spina bifida and anencephaly | |
| CN102792164A (zh) | 预测早产风险的方法 | |
| EA020412B1 (ru) | Иммунологический мониторинг на основе ip-10 | |
| Christiansen et al. | Association between HLA-DR1 and-DR3 antigens and unexplained repeated miscarriage | |
| WO2018156448A1 (en) | Prediction and treatment of immunotherapeutic toxicity | |
| Yuan et al. | Combination of CD4+ CD25+ CD127-regulatory T cells with MLC-BE and BE-Ab2: an efficient evaluation of the therapy of paternal lymphocyte induced immunization in unexplained recurrent spontaneous abortion patients | |
| RU2396566C1 (ru) | Способ определения блокирующего эффекта аутологичной женской сыворотки | |
| Sun et al. | Study on the relationship between CXCR3 and its ligands and tubal tuberculosis | |
| Pessanha et al. | Diagnostic and therapeutic management of toxoplasmosis in pregnancy and the effect in the newborn | |
| Zhong et al. | Th1 or Th2 cytokines are correlated with Tregs and T cell subsets and pregnancy outcomes in patients with autoimmune thyroid disease during early, middle, late pregnancy, and postpartum period | |
| CN110456057A (zh) | 检测免疫功能指标的试剂的应用与复发性流产检测试剂盒和方法 | |
| Hou et al. | The predictive value of NKG2C+ NK cells and LILRB1+ NK cells in recurrent spontaneous abortion | |
| Bressler et al. | Maternal antibody reactivity to lymphocytes of offspring with autism | |
| Van der Stroom et al. | Ovarian reserve and anti-Mullerian hormone (AMH) in mothers of dizygotic twins | |
| Keski-Nisula et al. | Maternal and neonatal IL-4 and IFN-gamma production at delivery and 3 months after birth | |
| Kehler et al. | Possible role of granulysin in pathogenesis of osteoarthritis | |
| Han et al. | Selection of early pregnancy specific proteins and development a rapid immunochromatographic test strip in cows | |
| Liu et al. | Circulating follicular T helper cells and humoral reactivity in rheumatic heart disease | |
| Merz et al. | Fetomaternal hemorrhage in the second trimester |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20140430 |