PL180473B1 - Sposób oznaczania skladnika supresorowego w ukladzie odpornosciowym czlowieka PL PL PL PL PL PL PL PL PL - Google Patents

Abstract

1. Sposób oznaczania skladnika supresorowego w ukladzie odpornosciowym czlowie- ka znamienny tym, ze obejmuje zbieranie krwi obwodowej, wytwarzanie zawiesiny komó- rek jednojadrowych (MNC), podzielenie tej zawiesiny na dwie równe czesci, hodowanie MNC z pierwszej czesci bez aktywatora supresji oraz hodowanie MNC z drugiej czesci z akty- watorem supresji, odmywanie MNC od osrodka hodowli, blokowanie proliferacji, dodawanie swiezo wydzielonych MNC od zwyklego dawcy, stymulowanych fitohemaglutynina, do kaz- dej ze wspomnianych czesci MNC w równych proporcjach w celu uzyskania hodowli testo- wych, prowadzenie hodowli testowych, dokonywanie oceny proliferacji w hodowlach testowych oraz okreslanie stopnia supresji na podstawie stosunków poziomów proliferacji w hodowlach testowych, przy czym jako aktywator supresji stosuje sie tromboblastyczna ß- 1- glikoproteine. PL PL PL PL PL PL PL PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku dotyczącego spraw medycznych jest sposób diagnostycznej oceny aktywności supresorów T, a w szczególności sposób oznaczania składnika supresorowego w układzie odpornościowym człowieka.

Znana jest β-I-glikoproteina pochodząca z łożyska, będąca analogiem trofoblastycznej glikoproteiny β-I (TBG) wykorzystywanej jako stymulator wzrostu i proliferacji hematopoetycznych komórek krwi (opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 5269835, klasa A61K 35/50, 1989).

Jednakże znany związek nie został zastosowany do oznaczania składnika supresorowego w układzie odpornościowym człowieka.

Znane jest zastosowanie TBG do diagnozowania i prognozowania przebiegu ciąży (patrz L.G. Sotnikova i inni, The Role of β-I-glykoprotein Trophoblast in Diagnosing and Prognosticating Pregnancy, Metodicheskije Recomendatsii, Moska 1984). Jednakże w pracy tej nie ujawniono możliwości zastosowania TBG do diagnozowania składnika supresorowego w układzie odpornościowym człowieka.

Znany jest sposób oznaczania składnika supresorowego w układzie odpornościowym człowieka, obejmujący zbieranie krwi obwodowej, wytwarzanie zawiesiny czystych limfocytów do prowadzenia testowych hodowli z aktywatorem supresji i bez tego aktywatora, oraz ocenę poziomów proliferacji (patrz Dutton R.W., Inhibitory and Stimulatory Effects of Concanavalin A on the Response ofMouse Spleen Cells Suspensions to Antigen. J. Exp. Med., 138,1496-1505,1973).

Jednakże znany sposób wymaga stosowania trudno dostępnego i drogiego preparatu z importu, czyli konkanawaliny A jako aktywatora supresji.

Znany jest sposób oznaczania składnika supresorowego w układzie odpornościowym człowieka, obejmujący zbieranie krwi obwodowej, wytwarzanie zawiesiny komórek jednojądrowych

180 473 (MNC), podzielenie tej zawiesiny na dwie równe części, hodowanie MNC z pierwszej części bez aktywatora supresji oraz hodowanie MNC z drugiej części z aktywatorem supresji, odmywanie MNC od ośrodka hodowli i blokowanie proliferacji, dodawanie świeżo wydzielonych MNC od zwykłego dawcy do każdej ze wspomnianych części MNC, stymulowanie fitohemaglutyniną w równych proporcjach w celu uzyskania hodowli testowych, prowadzenie hodowli i dokonywanie oceny proliferacji w hodowlach testowych oraz określanie stopnia supresji na podstawie stosunków poziomów proliferacji w hodowlach testowych )patrz By Lien Shov, Stanley A. Schwarts i Robert A. Good, Supressor Cell Activity after Concanavalin A treatment of Lymphocytes from Normal Donors, J, Exp. Med. 1976, 143, nr 5, 1100-1110).

Jednakże taki znany sposób również wymaga stosowania trudno dostępnego i drogiego preparatu czyli konkanawaliny A.

Głównym celem wynalazku jest dostarczenie tańszego sposobu oznaczania aktywności supresora w układzie odpornościowym człowieka poprzez zastosowanie dostępnego preparatu wykazującego zdolność korygowania odporności i nie powodującego reakcji uczuleniowych.

Cel ten osiąga się stosując trofoblastyczną β-I-glikoprotęinę (TBG) jako środek do oznaczania składnika supresorowego w układzie odpornościowym człowieka oraz wykorzystując sposób według wynalazku oznaczania składnika supresorowego w układzie odpornościowym człowieka, charakteryzujący się, tym że obejmuje zbieranie próbki krwi obwodowej, wytwarzanie zawiesiny komórek jednojądrowych (MNC), podzielenie tej zawiesiny na dwie części, hodowanie pierwszej części bez aktywatora supresji oraz hodowanie drugiej części z aktywatorem supresji, odmywanie MNC od ośrodka hodowli, blokowanie proliferacji, dodawanie do każdej ze wspomnianych części MNC świeżo wydzielonych MNC od zwykłego dawcy, stymulowanie fitohemaglutyniną w równych proporcjach w celu uzyskania hodowli testowych, prowadzenie hodowli i dokonywanie oceny proliferacji w hodowlach testowych oraz określanie stopnia supresji na podstawie stosunków poziomów proliferacji w hodowlach testowych, przy czym stosuje się trofoblastyczną β-I-glikoproteinę (TBG) w dawkach od 3 do 120 pg/ml zawiesiny MNC.

Zawiesinę MNC uzyskać można z komórek otrzymywanych w wyniku rozdzielania z jednostopniowym gradientem fikolurotrust, a hodowlę MNC prowadzi się przez 48 godzin. Proliferację można blokować zadając MNC mitomycyną C, a każdą z hodowli testowych można prowadzić przez 72 godziny.

Doświadczenia i testy kliniczne wykazały nowe właściwości TBG jako aktywatora supresji przydatnego w oznaczaniu składnika supresorowego w układzie odpornościowym człowieka.

W pierwszym etapie wytwarza się zawiesinę MNC z komórek otrzymanych w wyniku rozdzielania z jednostopniowym gradientem gęstości fikol-urotrust (metoda Boyum'a).

Krew obwodową pobiera się od pacjenta przez nakłucie żyły i umieszcza się równocześnie w probówkach zawierających roztwór heparyny (1 ml krwi = 20-30 jednostek heparyny). Następnie krew rozcieńcza się roztworem Hanksa w proporcji 1:2, bez Ca⁺⁺ i Mg⁺⁺, po czym wprowadza się na gradient fikol-urotrust (gęstość 1,078 g/ml).

Następnie przeprowadza się wirowanie przy 400 x g przez 30 minut. Zawiesinę MNC z granicy faz umieszcza się w probówce wirówki, dodaje się roztwór Hanksa bez Ca++ i Mg++ i przeprowadza się 3 kolejne wirowania (po 10 minut) w celu odmycia od komórek roztworu fikol-urotrust. Po trzecim wirowaniu pozostałość MNC zawiesza się w 1 ml ośrodka 199 i liczbę komórek jednojądrowych zlicza się z wykorzystaniem kamery Goryajeva.

W drugim etapie MNC dzieli się na dwie równe części, po czym pierwszą część hoduje się bez aktywatora supresji, a drugą hoduje się aktywatorem supresji, stosując trofoblastyczną β-Ιglikoproteinę jako aktywator.

MNC hoduje się w pojemnikach na penicylinę z korkami gumowymi nr 14,5 w37°C. Ośrodek hodowli stanowi PPMI-1640 z 20% surowicy grupy (AB) i 300 mg glutaminy.

Każdy pojemnik zawiera 5 x 10⁵ komórek w 2,0 ml pełnego ośrodka.

TBG w dawkach 3-120 pg dodaje się do hodowli w celu zainicjowania supresji.

Komórki hoduje się przez 48 godzin. Następnie MNC odmywa się od ośrodka hodowli i proliferację blokuje się dodając mitomycynę C (40 pg/ml, 30 minut w 37°C). Z kolei przeprowa4

180 473 dza się trzykrotne przemywanie stosując ośrodek 199 z 5% surowicy IV (AB) (schłodzonej). Pozostałość komórkową zawiesza się, zlicza się liczbę komórek zawierających jądra określa się procent żywotności komórek stosując 0,1% roztwór błękitu trypanowego i uzyskaną zawiesinę rozcieńcza się do wymaganego stężenia. Wszystkie czynności wykonuje się odrębnie dla komórek kontrolnych i dla komórek stymulowanych TBG, stosując do przemywania komórek tacki silikonowe.

W następnym etapie świeżo wydzielone limfocyty od zwykłego dawcy (wstępnie stymulowane fitohemaglutyniną(PHA), stosowane jako reagujące komórki testowe) dodaje się do każdej z części, limfocytów kontrolnych i stymulowanych TBG, w równych proporcjach (0,5 x 10⁶ : 0,5 x 10⁶ komórek/ml) w celu uzyskania hodowli testowych. Hodowle prowadzi się przez 72 godziny. Następnie ocenia się proliferację hodowli testowych stosując N³-tymidynę, a supresję ocenia się na podstawie spadku proliferacji. Wskaźnik supresji wylicza się z następującego wzoru:

liczba pulsów / minutę w testowej hodowli z TBG

SI = (1 ---------- ) x 100% liczba pulsów / minutę w testowej hodowli be z TBG

Aby ocenić składnik supresorowy u zwykłego dawcy przeprowadzono badania diagnostyczne z wykorzystaniem znanego sposobu (patrz By Lien Shov, Stanley A. Schwarts I Robert A. Good, Supressor Cell Activity After Concanavalin A treatment of Lymphocytes from Normal Donors, J, Exp. Med. 1976, 143, nr 5, 1100-1110), a także badania diagnostyczne sposobem według wynalazku dla grupy zwykłych dawców (100 osób). Na podstawie uzyskanych wyników ustalono, że normalna wielkość aktywności supresorów T przy indukcji konkawaliną A wynosi 56,8 ± 4%, a przy wykorzystaniu sposobu według wynalazku wielkość ta wynosi 63,4 ± 4,7%.

Poniższe przykłady dokładniej wyjaśniają wynalazek.

Prxykład I. Pacjent V, 30 lat, przybył do szpitala z diagnozą „stwardnienia rozsianego, postać mózgowo-rdzeniowa” w ostrym stadium. Aktywność supresorów T w krwi obwodowej przy indukowaniu konkanawaliną A wynosiła 15%, przy czym wielkość tą wyznaczono znanym sposobem oceny składnika supresorowego w układzie odpornościowym człowieka. Równocześnie aktywność supresorów T w krwi obwodowej tego samego pacjenta oznaczono wykorzystując sposób według wynalazku (przy indukowaniu TBG). Uzyskano wielkość 17%.

Przykład II. Pacjent S (kobieta), 40 lat, przybyła do szpitala z diagnozą „stwardnienia rozsianego, postać mózgowo-rdzeniowa”w ostrym stadium. Aktywność supresorów T w krwi obwodowej przy indukowaniu konkanawaliną A (oznaczona znanym sposobem) wynosiła 16%. Równocześnie aktywność supresorów T w krwi obwodowej tego samego pacjenta oznaczono wykorzystując sposób według wynalazku (przy indukowaniu TBG). Uzyskano wielkość 19%.

Przebadano 150 pacjentów ze stwardnieniem rozsianym i reumatoidalnym zapaleniem stawów. Stwierdzono, że aktywność supresorów T oznaczona sposobem według wynalazku odpowiada wielkości oznaczonej znanym sposobem.

Potwierdzono w ten sposób wysoką skuteczność TBGjako środka do oznaczenia składnika superesorowego w układzie odpornościowym człowieka.

Przydatność przemysłowa

Wyżej wspomniane zalety sposobu oznaczania składnika supresorowego w układzie odpornościowym człowieka według wynalazku, a także zastosowanego środka, umożliwiają szerokie zastosowanie tego sposobu zarówno w celach naukowych jak i w praktyce klinicznej.

Należy również zaznaczyć, że występująprzezciwwskania w zastosowaniu konkanawaliny A w leczeniu wspomnianych chorób, z uwagi na jej toksyczność; natomiast TBG (otrzymany z ludzkiego trofoblastu) nie jest toksyczny i nie powoduje reakcji uczuleniowych. Fakt ten umożliwia zastosowanie tego preparatu jako lek.

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 60 egz.

Cena 2,00 zł.

Claims (6)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Sposób oznaczania składnika .supresorowego w układzie odpornościowym człowieka znamienny tym, że obejmuje zbieranie krwi obwodowej, wytwarzanie zawiesiny komórek jednojądrowych (MNC), podzielenie tej zawiesiny na dwie równe części, hodowanie MNC z pierwszej części bez aktywatora supresji oraz hodowanie MNC z drugiej części z aktywatorem supresji, odmywanie MNC od ośrodka hodowli, blokowanie proliferacji, dodawanie świeżo wydzielonych MNC od zwykłego dawcy, stymulowanych fitohemaglutyniną, do każdej ze wspomnianych części MNC w równych proporcjach w celu uzyskania hodowli testowych, prowadzenie hodowli testowych, dokonywanie oceny proliferacji w hodowlach testowych oraz określanie stopnia supresji na podstawie stosunków poziomów proliferacji w hodowlach testowych, przy czym jako aktywator supresji stosuje się tromboblastyczną β-I-glikoproteinę.
2. 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że TBG stosuje się w dawce od'3 do 120 pg/ml zawiesiny MNC.
3. 3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że zawiesinę MNC uzyskuje się z komórek otrzymanych w wyniku rozdzielania z jednostopniowym gradientem fikol-urotrust.
4. 4. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że hodowlę MNC prowadzi się przez 48 godzin.
5. 5. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że proliferację blokuje się zadając MNC mitomycyną C.
6. 6. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że każdąhodowlę testową prowadzi się przez 72 godziny.