RO111333B

RO111333B - Procedeu de obținere a keratan sulfatului

Info

Publication number: RO111333B
Application number: RO9300627A
Authority: RO
Inventors: Lucia Moldovan; Anca Olguta Oancea; Iordachel Maria Caloianu; Julieta Silvia Ionescu
Original assignee: Inst De Biolog Dezvoltarii
Priority date: 1993-05-05
Filing date: 1993-05-05
Publication date: 1996-09-30

Abstract

Procedeul conform invenției constă în aceea că 500... 1500 părți cornee bovină se extrag cu 3...15 părți papaină, 0,0005 M cisteină și 0,005 M EDTA-Na2, în 1 500...4 500 părți tampon fosfat, pH=6,5 și timp de 24...48 h, se filtrează și supernatantul se tratează cu 1...2% celită, se lasă în repaus la 4°C, se centrifughează și precipitatul obținut se dizolvă în apă distilată și se cromatografiază pe Dowex 1x2 [CI'), se eluează coloana cu gradient de NaCI și fracțiunea eluată cu 3,0 M NaCI se dializează față de apă distilată, se concentrează la rece și se precipită cu 2,5...4 voi etanol, se centrifughează și precipitatul de keratan se usucă prin tratări succesive cu etanol absolut și eter etilic anhidru.

Description

Prezenta invenție se referă la un procedeu de obținere a keratan sulfatului, care este utilizat în biologie și medicină.

Keratan sulfatul face parte din 5 clasa glicozaminoglicanilor și este alcătuit din unități dizaharidice repetitive de galactoză și N-acetilglucozamină. In vivo, glicozaminoglicanii se leagă covalent, printr-o secvență glucidică terminală io specifică, de un lanț polipeptidic, formând astfel proteoglicanii.

Sunt cunoscute rolul și implicațiile protooglicanilor și glicozaminoglicanilor din structura țesuturilor conjunctive în 15 procesele de diferențiere, adeziune și migrare celulară, precum și în aspecte patologice.

De asemenea, glicozaminoglicanii și proteoglicanii extrași din țesuturi 20 cartilaginoase pot fi utilizați în asociere cu alți compuși la realizarea de biomateriale de uz medical.

Sunt cunoscute procedee de obținere a keratan sulfatului din corneea de 25 bovine, cum ar fi, de exemplu, procedeul ce constă în aceea că pulberea de cornee bovină este digerată cu 3 I acetat de sodiu 0,10 M, 0,01 M cisteină clorhidrică, 0,01 M EDTA-Na₂ 30 și 150 mg papaină, la pH 5,5. Se lasă la 65°C, timp de 50 h, cu amestecare. Se concentrează la 1,5 I și se aduce la pH 1,3 cu HCI 6 M. Se cromatografiază pe Sephade x x G-25 și fracțiunile de 35 carbazol și antron s-au concentrat și apoi s-au trecut pe Dowex 1 x 2 și s-a eluat în continuare cu gradient de NaCI.

In continuare, supernatantul s-a trecut pe coloană de Bio-Gel P - 2 și apoi tratat 40 cu acid acetic, acetat de calciu și etanol. După un repaus la 5°C, se centrifughează și precipitatul obținut se precipită cu etanol saturat cu acetat de sodiu. Keratanul obținut se spală cu eta- 45 noi și acetonă și apoi se usucă la 65°C.

Procedeul, conform invenției, constă în aceea că 500 ... 1500 părți cornee bovină se extrag cu 3 .. 15 părți papaină, 0,0005 M cisteină și 0,005 M 50 EDTA-Na₂ în 1500 ... 4.500 părți tampon fosfat pH 6,5 și timp de 24 ...

h, se filtrează și supernatantul se tratează cu 1 .. 2% celită, se lasă în repaus la 4°C, se centrifughează și precipitatul obținut se dizolvă în apă distilată și se cromatografiază pe Dowex 1x2 (CI], se eluează coloana cu gradient de NaCI și fracțiunea eluată cu 3,0 M NaCI se dializează față de apă distilată, se concentrează la rece și se precipită cu 2,5 ... 4 volume etanol, se centrifughează și precipitatul de keraton se usucă prin tratări succesive cu etanol absolut și eter etilic anhidru.

Procedeul enzimatic de obținere a keratan sulfatului din comei bovine, conform invenției, prezintă următoarele avantaje:

- conduce la digestia integrală a țesutului, permițând obținerea unei cantități mari de keratan sulfat;

- nu necesită instalații costisitoare (aparate, utilaje];

- permite obținerea unei keratan sulfat de puritate ridicată, care poate fi utilizat la realizarea de biomateriale pentru medicină.

Se dă în continuare un exemplu de realizare a invenției.

O cantitate de 1000 g cornei bovine, curățate de țesuturile aderente, se spală cu apă și se mărunțesc mecanic. Peste țesutul mărunții se adaugă 3000 ml tampon fosfat pH 6,5, care conține 4 g papaină și inhibitori proteazici: 0.0005M cisteină și 0,05 M EDTA-Na₂. Amestecul se incubează timp de 24 h la temperatura de 65°C. Se separă apoi, prin filtrare, soluția obținută de resturile de țesut nedigerat. La soluția filtrată se adaugă 2% celită și se lasă în repaus 24 ... 48 oh la 4°C. Amestecul se centrifughează, iar soluția obținut se concentrează la rece și apoi se precipită cu 4 volume de etanol, lăsându-se timp de 24 ore la 4°C. Precipitatul obținut se separă prin centrifugare și apoi se dizolvă în apă distilată. Soluția obținută se aplică pe o coloană de schimbători de ioni de tip Dowex 1x2 (CI], activată în prealabil. Coloana se eluează cu câte 500 ... 1000 ml soluție NaCI de următoarele concentrații: 0,5 M, 1,0 M, 2,0 M si 3,0 M.

Fracțiunea eluată cu 3,0 M NaCI conține keratan sulfat și este dializată față de apă distilată la 4°C, până la 5 îndepărtarea totală a NaCI. Soluția se concentrează la rece și apoi se precipită cu 4 volume de etanol. Precipitatul se separă prin centrifugare și se usucă prin tratări repetate cu alcool etilic absolut și io eter etilic anhidru. Se obține keratan sulfat sub formă de pulbere albă, solubil în apă, cu următoarele caracteristici : hexozamine 25%, acizi uronici 1,5%, azot total 2,1%, sulf 2,8% greutate 15 moleculară 15.000 D.

Claims

Revendicare

Procedeu de obținere a keratan sulfatului prin tratarea corneei bovine cu papaină, cisteină și EDTA-Na₂ într-un tampon de extracție, la temperatura de

65°C, separarea fracțiunilor glicozaminoglicani prin trecerea pe coloană cromatografică Dowex 1x2, eluarea cu gradient de NaCI și precipitarea fracțiunii de keratan cu etanol, caracterizat prin aceea că 500 ... 1500 părți cornee bovină se extrag cu 3 .. 15 părți papaină, 0,0005 M cisteină și 0,005 M EDTA-Na₂ în 1500 ... 4.500 părți tampon fosfat pH 6,5 și timp de 24 ... 48 h, se filtrează și supematantul se tratează cu 1 .. 2% celită, se lasă în repaus la 4°C, se centrifughează și precipitatul obținut se dizolvă în apă distilată și se cromatografiază pe Dowex 1x2 (CI], se eluează coloana cu gradient de NaCI și fracțiunea eluată cu 3,0 M NaCI se dializează față de apă distilată, se concentrează la rece și se precipită cu 2,5 ... 4 volume etanol, se centrifughează și precipitatul de keratan se usucă prin tratări succesive cu etanol absolut și eter etilic anhidru.