RO110780B1 - Biopreparat peliculogen, cu efect protector și cicatrizant și procedeu de obținere - Google Patents

Abstract

Prezenta invenție se referă la un biopreparat peliculogen, cu efect protector și cicatrizant și Ia procedeul de obținere a acestuia. Biopreparatul peliculogen este constituit din 0,8 ... 1,6 părți In greutate de solujie 0,3 ... 0,6 % de colagen, cu greutatea molecularii medie 280000 ... 350000 și puritatea de 80 ... 95 %, 0,2 ... 0,5 părți în greutate soluție 0,1 ... 0,3 % de glicozaminoglicani, cu greutatea moleculară medie 15000... 25000 și conținutînhexozamine de 20 ... 35 % și 0,002 ... 0,010 părți în greutate glicerină și este condiționat sub formă de pelicule sterile. Procedeul de obținere a preparatului peliculogen constă în aceea că 1 - 2 părți în greutate, comee bovină, se supun extracției cu 3 ... 6 părți NaOH 0,5 M timp de 20 ... 30 h, la 4°C, după care se separă, prin centrifugare și soluția obținută se amestecă cu 0,03 ... 0,1 pSxți celită și se lasă în repaus 24 h, la 4°C, se centrifughează, iar supematantul obținut se aduce lapH-ul fiziologic și se precipită cu 2 ... 3 volume etanol, ce conține acetat de sodiu 0,5 %, precipitatul obținutse usucă cu etanol absolut, rezultând glicozaminoglicani,sub formă de pulbere, în continuare, țesutul rămas după prima centrifugare este folosit pentru extracția colagenului, prin tratare cu 1 ... 3 părți acid acetic 0,5 M conținând pepsină 1 mg/ml, timp de 20 ... 28 h, la 4°C, se centrifughează, iar soluția obținută se precipită cu NaCl 0,7 M, se lasă în repaus 24 h, la rece, precipitatul astfel obținut se dizolvă în tampon fosfat salinpH=7,4 și se dializează fată de același tampon, obținându-se o soluție de colagen, cu un conjinut de substanță uscată de 0,7 ... 1,2 % care se amestecă cu soluția de glicozaminoglicani obținută mai sus și cu glicerină.

Description

Prezenta invenție se referă la un biopreparat peliculogen, cu efect protector cicatrizant, precum și la procedeul de obținere al acestuia.

Corneea constituie, alături de sclerotică, tunica rezistentă mecanic a globului ocular. Transparența corneei este dată de organizarea ultrastructurală fină și compoziția biochimică unică a componentelor sale extracelulare colagen și glicozaminoglicani. Spre deosebire de celelalte țesuturi conjunctive, în cornee cele două componente macromoleculare sunt asociate într-un mod de organizare superior: fibrilele de colagen au diametrul uniform și mic, iar glicozaminiglicanii sunt localizați specific, în spațiile dintre aceste fibrile.

Este cunoscută o compoziție pe bază de colagen pentru membrane medicinale, utilizată în oftalmologie .constituită din 100-125 părți soluție 1

- 2 % colagen cu greutate moleculară 250000 - 300000; 100 -125 părți hidrogel de alcool polivinilic 0,2 - 0,8 %, obținut din pulbere de alcool polivinilic și alcool etilic în raport în greutate de 5:1, dizolvate complet în apă și 0,2 - 0,8 părți glicerină, părțile fiind exprimate în greutate, compoziția având un pH de 6,5

- 7, precum și un procedeu de obținere a membranelor colagenice prin reticularea cu dispersii sau soluții coloidale de colagen cu concentrație 0,5-1 % și pHul 2,5 - 6,5 cu agenți tananți aleși dintre aldehida formică, aldehida glutarică sau trimetilolmelamină în concentrație de 0,001 - 0,5 % și plastifiați cu glicerină în proporție de 0,2 - 1 %, adăugarea în produsul obținut de substanțe medicamentoase în proporție de până la 4 %, în funcție de scopul terapeutic urmărit și supunerea amestecului obținut operației de uscare sub formă de peliculă, la temperatură sub 37°C.

Prezenta invenție se referă la obținerea unui biopreparat peliculogen cu efect protector și cicatrizant al țesutului cornean, prin asocierea optimă a principalelor componente extracelulare ale corneei: colagen și glicozaminoglicani.

Biopreparatul peliculogen, con2 form invenției, este constituit din 0,8 ...

1,6 părți în greutate de soluție 0,3 ... 0,6 % de colagen cu greutatea moleculară medie 280000 ... 350000 și puritatea de 80 ... 95 %, 0,2 ... 0,5 părți în greutate soluție 0,1 ... 0,3 % de glicozaminoglicani cu greutatea moleculară medie 15000 ... 25000 și conținut în hexozamine de 20 ... 35 % și 0,002 ... 0,010 părți în greutate glicerină și este condiționat sub formă de pelicule sterile.

Procedeul de obținere al preparatului peliculogen constă în aceea că 1 - 2 părți în greutate cornee bovină se supun extracției cu 3 -6 părți NaOH 0,5 M, timp de 20 - 30 h la 4°C, după care se separă prin centrifugare și soluția obținută se amestecă cu 0,03 0,1 părți celită și se lasă în repaus 24 h la 4°C, se centrifughează, iar supernatantul obținut se aduce la pH-ul fiziologic și se precipită cu 2 -3 volume etanol ce conține acetat de sodiu 0,5 %, precipitatul obținut se usucă cu etanol absolut, rezultând glicozaminoglicani sub formă de pulbere, în continuare țesutul rămas după prima centrifugare este folosit pentru extracția colagenului prin tratare cu 1 - 3 părți acid acetic 0,5 M conținând pepsină 1 mg/ml, timp de 20 - 28 h la 4°C, se centrifughează, iar soluția obținută se precipită cu NaCl 0,7 M, se lasă în repaus 24 h la rece, precipitatul astfel obținut se dizolvă cu tampon fosfat salin pH 7,4 și se dializează față de același tampon, obținându-se o soluție de colagen cu un conținut de substanță uscată de 0,7 1,2 %, care se amestecă cu soluția de glicozaminoglicani obținută mai sus și cu glicerină.

Invenția prezintă următoarele avantaje:

- se obține printr-un procedeu relativ simplu, din materii prime indigene;

- este biocompatibil și bine tolerat de mucoasa globului ocular;

- asigură hidratarea uniformă a ochiului, precum și regenerarea leziunilor țesutului cornean;

- crează un cadru matriceal asemănător celui natural, având rol protec110780 tor și terapautic.

Se dau, în continuare, 2 exemple de realizare a invenției

Exemplul 1. Se ia o cantitate de

500 g cornee bovină ce &-au obținut prin disecție din ochi proveniți de la animale adulte și se curăță de țesuturile aderente. Se spală cu apă rece și se mărunțesc mecanic în bucăți de 1 - 3 mm. Țesutul mărunții se suspendă de 2 -3 ori în tampon fosfat salin pH 7,4 la temperatura de 4°C. Pentru extracția glicozaminoglicanilor corneeni se tratează țesutul cu 2000 ml soluție NaOH 0,5 M și se lasă la rece timp de 24 h. Prin centrifugare la 3000 rot/min timp de 30 min, se separă soluția care conține glicozaminoglicanii de țesut rămas, ce conține colagen. Peste soluția astfel obținută se adaugă, pentru clarificare, 15 g celită și se lasă la rece timp de 24 h. Se îndepărtează apoi impuritățile prin centrifugare la 4000 rot/min timp de 30 min, iar soluția limpede obținută se aduce la pH neutru. Purificarea glicozaminoglicanilor din această soluție se face prin adăugare de 2,5 volume alcool etilic, în care s-a dizolvat, în prealabil, 0,5 % acetat de sodiu. Uscarea precipitatului se realizează cu etanol absolut. Se obține astfel o pulbere alb-gălbuie de glicozaminoglicani solubilă în apă, având următoarele caracteristici: hexozamine 28 %, acizi uranici 11 %, hexoze neutre 10 %, azot total 3 %, sulf 2 %, greutate moleculară medie 22000. Țesutul rămas după extracția glicozaminoglicanilor este folosit pentru extracția colagenului utilizând pepsină în mediu de acid acetic. Peste acest țesut se adaugă 1500 ml acid acetic 0,5 M în care s-a dizolvat pepsină în concetrație de 1 mg/ml lăsându-se 24 h sub agitare la 4°C, urmată de centriofugare la 3000 rot/min timp de 30 min. Supematantul obținut este precipitat cu NaCl 0,7 M si se lasă în repaus peste noapte la rece pentru stabilizare. Separarea precipitatului de colagen din această soluție se realizează prin centrifugare la 4000 rot/min timp de 40 min; precipitatul obținut se dizolvă în tampon fosfat salin pH= 7,4 și se dializează, față de același solvent, până la îndepărtarea totală a clorurii de sodiu. Se obține astfel o soluție de colagen de concentrație 0,9 % substanță uscată de puritate 92 % și greutate moleculară medie 320000.

Pentru obținerea amestecului celor două componente extrase și purificate ca mai sus, se prepară o soluție de colagen 0,6 % și alta de glicozaminoglicani de concentrație 0,2 %. Peste 400 g soluție de colagen 0,6 % se adaugă, sub agitare, 300 g soluție de glicozaminoglicani 0,2 % și 1,5 g glicerină. Amestecul obținut se toarnă în tăvițe de sticlă pe care s-au fixat folii de polietilenă și se usucă sub formă de pelicule la temperatura de 3O’C, folosind un uscător prevăzut cu ventilație. Pelicula obținută se ambalează în folii de plastic, se închide etanș și se sterilizează cu radiații gamma.

Exemplul 2. Soluția de colagen și cea de glicozaminoglicani se prepară ca cea din exemplul 1. Se iau 300 ml soluție de colagen 0,9 %, se diluează la 600 ml cu tampon fosfat salin pH 7,4. Peste această soluție se adaugă, sub agitare continuă, 100 ml soluție glicozaminoglicani 0,2 % și 1,2 g glicerină. Amestecul obținut se condiționează sub formă de pelicule ca în exemplul 1.

Peliculele obținute, conform exemplelor de mai sus, au fost testate, din punct de vedere al biocompatibilității, pe culturi de fibroblaste de găină în mediu Eagle și ser fetal bovin. La examinarea microscopică s-a observat că fibriblastele cultivate pe aceste pelicule au penetrat în substrat și au proliferat, ceea ce demonstrează că pelicula favorizează creșterea celulară.

Pelicula se prezintă sub formă de folie transparentă, flexibilă, cu o grosime uniformă cuprinsă între 0,1 -și 0,5 mm. Se aplică pe rănile oculare, asigurând refacerea țesutului lezat prin resorbția ei parțială sau totală. Substanțele încorporate - colagen și glicozaminoglicani, sunt cedate țesutului lezat în mod lent și în cantitate eficientă. De asemenea, ele asigură o bună permeabilitate a oxigenului și permit creșterea difuziei acestuia în caz de necesitate, precum și o hidratare uniformă a țesutului cornean.

Biopreparatul peliculogen, conform invenției, se utilizează ca pansament oftalmic prin aplicare pe 5 mucoasa globului ocular. Are rol protector și de lubrefiant al ochiului și de cicatrizare și regenerare a leziunilor corneene. Aceste efecte sunt rezultatul asocierii proprietăților de cicatrizare și 10 regenerare a colagenului cu cele antioxidante și osmotice ale glicozaminoglicanilor.

Claims (2)

1. Biopreparat peliculogen, cu efect protector și cicatrizant pe bază de colagen și glicerină, cerecterizet prin aceee că, este constituit din O.B - 1,6 20 părți în greutate de soluție 0,3 - 0,6 % de colagen cu greutatea moleculară medie 280000 - 350000 și puritatea de 80 - 95 %, 0,2 - 0,5 părți în greutate soluție 0,1 - 0,3 % de glicozaminoglicani 25 cu greutatea moleculară medie 15000 25000 șî conținut în hexozamine de 20 35 % și 0,002 - 0,010 părți în greutate glicerină, condiționat sub formă de pelicule sterile. 30

Președintele comisiei de examinare: Examinator: farm. Anghel Doina

2. Procedeu de obținere al preparatului peliculogen, caracterizat prin aceea că, 1-2 părți în greutate cornee bovină se supun extracției cu 3 -6 părți NaOH 0,5 M timp de 20 - 30 h la 4°C, după care se separă prin centrifugare și soluția obținută se amestecă cu 0,03 - 0,1 părți celită și se lasă în repaus 24 h la 4°C, se centrifughează »iar supernatantul se aduce la pH-ul fiziologic și se precipită cu 2 -3 volume etanol ce conține acetat de sodiu 0,5 %, precipitatul obținut se usucă cu etanol absolut . rezultând glicozaminoglicani sub formă de pulbere, în continuare țesutul rămas după prima centrifugare este folosit pentru extracția colagenului prin tratare cu 1 - 3 părți acid acetic 0,5 M conținând pepsină 1 mg/ml, timp de 20 - 28 h la 4°C, se centrifughează ,iar soluția obținută se precipită cu NaCl 0,7 M, se lasă în repaus 24 h la rece, precipitatul astfel obținut se dizolvă cu tampon fosfat salin pH= 7,4 și se dializează față de același tampon, obținându-se o soluție de colagen cu un conținut de substanță uscată de 0,7 - 1,2 %, care se amestecă cu soluția de glicozaminoglicani obținută mai sus și cu glicerină.