RO110262B1 - Anticorp uman, reformat si gena care il codifica - Google Patents

Anticorp uman, reformat si gena care il codifica Download PDF

Info

Publication number
RO110262B1
RO110262B1 RO92-200678A RO92200678A RO110262B1 RO 110262 B1 RO110262 B1 RO 110262B1 RO 92200678 A RO92200678 A RO 92200678A RO 110262 B1 RO110262 B1 RO 110262B1
Authority
RO
Romania
Prior art keywords
ser
tyr
agc
val
gly
Prior art date
Application number
RO92-200678A
Other languages
English (en)
Inventor
Martine Elisa Verhoeyen
Original Assignee
Unilever Nv
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from GB898926045A external-priority patent/GB8926045D0/en
Priority claimed from GB909019552A external-priority patent/GB9019552D0/en
Application filed by Unilever Nv filed Critical Unilever Nv
Publication of RO110262B1 publication Critical patent/RO110262B1/ro

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/40—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against enzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Hydrogenated Pyridines (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Nitrogen Condensed Heterocyclic Rings (AREA)
  • Luminescent Compositions (AREA)
  • Fireproofing Substances (AREA)
  • Solid-Sorbent Or Filter-Aiding Compositions (AREA)
  • Dental Preparations (AREA)
  • Paper (AREA)

Description

Prezenta invenție se referă la un anticorp uman reformat și gena care îl codifică.
Mai concret, invenția se referă la producerea unor astfel de anticorpi prin inginerie genetică.
Moleculele naturale de anticorpi constau din două polipeptide identice cu catenă mare și două polipeptide identice cu catenă ușoară, care sunt legate covalent prin legături de disulfură. în fig. 13 din desenele ce însoțesc descrierea, se reprezintă sub formă de diagramă structura tipică a unui anticorp din clasa IgG. Fiecare dintre catene este pliată în câteva domenii distincte. Domeniile N-terminale ale tuturor catenelor au secvența variabilă și de aceea se numesc regiunile variabile (regiunile V). Regiunile V ale unei catene mari (grele) (VH) și ale unei catene ușoare (VL) se asociază pentru a forma locul de legare a antigenului. Modulul format prin combinarea domeniilor VH și VL este notat cu Pv (fragment variabil) al anticorpului. Capetele Cterminale ale catenelor grea și ușoară sunt mai conservate din punct de vedere al secvențelor și chiar catenele sunt mai conservate ca secvențe și de aceea sunt denumite regiuni constante. Regiunile constante din catena grea sunt compuse din câteva domenii, de exemplu, catena grea (lanțul lung) a izotipului gama (IgG) constă din trei domenii (CHj, CH2, CH3) și o regiune de conectare care leagă domeniile CHj și CH2. Conectările celor două catene grele se leagă între ele covalent prin punți de disulfură. Catenele ușoare au un domeniu constant care se plasează lângă domeniul CHp Regiunile constante ale moleculei de anticoip sunt implicate în funcțiile eficiente, cum este liza și purificarea complementului prin citotoxicitatea celulei dependente de anticorp (ADCC). Prin digerarea clasică a unui anticorp cu papain-protează se obțin trei fragmente. Un fragment conține domeniile CH2 și CH3 și pentru că, cristalizează ușor, a fost denumit fragmentul Fc. Celelalte două fragmente au fost denumite fragmentele Fab (cu legare de antigen). Ele sunt identice și conțin întreaga catenă ușoară combinată cu VH și domeniul CHP Când se utilizează pepsină, scindarea proteolitică are loc astfel, încât cele două fragmente Fab rămân legate printr-o conexiune și formează fragmentul (Fab)2. Fiecare dintre domenii este reprezentat de un exon separat la nivelul genetic.
Regiunile variabile, însele, conțin fiecare 3 grupe de reziduri foarte variabile întrun cadru de secvențe mai conservate. Aceste regiuni, foarte variabile interacționează cu antigenul și se numesc regiuni care determină complementaritate (CDR). Secvențele mai conservate sunt denumite regiunile cadru (FR) (vezi Kabat și alții (1987). Studiile cu raze X ale anticorpilor au arătat că regiunile CDR formează bucle care ies dincolo de capătul moleculei, în timp ce fragmentele FR asigură cadrul structural de foaie beta.
Așa numiții anticorpi umani reformați sau alterați indică imunoglobuline care au regiunile esențiale constante și cadru uman, dar în care regiunile care determină complementaritatea (CDRs) corespund cu cele găsite într-o imunoglobulină neumană și de asemenea, cu fragmentele de anticoipi corespunzătoare reformate.
Principiile generale, prin care acești anticorpi sau aceste fragmente umane reformate se pot produce sunt bine cunoscute, putându-se face referință la Jones și alții (1986), Biechmann și alții (1988), Verhoeyen și alții (1988) și EP-A-239400 (Winter).
Invenția de față se referă la un anticorp uman, reformat sau sintetic sau fragment de anticorp uman reformat sau sintetic, care are specificitate pentru fosfataza alcalină placentară umană (PLAP), care este conferită de prezența:
- a) a cel puțin unei regiuni variabile cu catenă grea, cuprinzând următoarea CDR:
CDR1: Ser Tyr Gly Val Ser
CDR2: Val Ile Trp Glu Asp Gly Ser Thr Asn Tyr His Ser Ala Leu Ile Ser
CDR3: Pro His Tyr Gly Ser Ser Tyr Val Gly Ala Met Glu Tyr și
- b) a cel puțin unei regiuni variabile cu catenă ușoară, cuprinzând următoarea CDR:
CDR1: Arg Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Tyr Val Ala
CDR2: Asn Ala Lys Ser Leu Ala Glu
CDR3: Gin His His Tyr Val Ser Pro Trp Thr
Gena care codifică anticorpul respectiv, include una sau mai multe secvențe de nucleotide dintre următoarele:
I) AGT TAT GGT GTA AGC
II) GTA ATA TGG GAA GAC GGG AGC ACA AAT TAT CAT TCA GCT CTC ATA TCC
III) CCC CAC TAC GGT AGC AGC TAC GTG GGG GCT ATG GAA TAC
IV) CGA GCA AGT GAA AAT ATT TAC AGT TAT GTA GCA
V) AAT GCA AAA TCC TTA GCA GAC
VI) CAA CAT CAT TAT GTT AGT CCG TGG ACG codificând a) cel puțin una din secvențele de aminoacizi:
Ser Tyr Gly Val Ser
Val Ile Trp Glu Asp Gly Ser Thr Asn Tyr His Ser Ala Leu Ile Ser
Pro His Tyr Gly Ser Ser Tyr Val Gly Ala Met Glu Tyr
Arg Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Tyr Val Ala
Asn Ala Lys Ser Leu Ala Glu
Gin His His Tyr Val Ser Pro Trp Thr >Și
b) un cadru de proteină care permite secvenței ue aminoacizi codificate când este exprimată să funcționeze ca un CDR având specificitate pentru fosfataza alcalină placentară umană.
Anticorpii umani reformați și fragmentele reformate, sunt deosebit de folositoare în diagnosticarea in vivo și în tratamentul indispozițiilor umane, pentru că proteinele esențiale umane este mai puțin probabil să producă reacții adverse nedorite când sunt administrate la un pacient uman și specificitatea dorită conferită de CDR-uri poate fi mărită într-un animal gazdă, cum ar fi un șoarece, de la care se pot obține anticoipii cu specificitatea selectată mai ușor. Genele din regiunea variabilă pot fi donate din anticorpul neuman și CDR-urile grefate într-o regiune cadru umană variabilă, prin tehnicile de inginerie genetică, pentru a se obține anticorpul sau fragmentul uman reformat. Pentru a realiza acest lucru dorit, este necesar să se identifice și să se secventezc cel puțin CDR-urile din anticorpul neuman ales și de preferință, întreaga secvență a regiunii variabile neumane, pentru a permite identificarea interacțiunilor potențial importante ale cadrului CDR.
Astfel de anticorpi refonnați pot fi utilizați pentru diagnosticarea și tratamentul in vivo al cancerelor umane, de exemplu, cancerele ovariene și seminomul, și este de așteptat ca ele să reducă cel puțin problema unui răspuns imun al pacientului, care se întâlnește adeseori la administrarea de anticoip neuman. Hale și alții (1988) an arătat un avantaj asemănător dat de anticorpul
CAMPATH-1 reformat.
- fig. 1, arată secvența cADN care codifică pentru o regiune variabilă cu catenă grea de murină ce are specificitate anti-PLAP. Sunt indicate cele 3 CDR-uri clasice împreună cu o secvență de aminoacizi care se potrivește cu codul cADN;
- fig. 2, arată secvența cADN care codifică pentru regiunea variabilă de murină cu catenă scurtă, având specificitate anti-PLAP;
- fig. 3a și 3b împreună, arată o cale prin care se poate prepara un vector de expresie care codifică o catenă grea umană formată, ce încorporează CDR-urile din fig. 1;
- figurile 4a și 4b împreună, arată o cale similară de transformare pentru a obține un vector de expresie ce codifică o catenă scurtă umană reformată, care încorporează CDR-urile din fig. 2;
- fig. 5, reprezintă plasmida pU12IgEnh care conține o secvență de mărire, utilizată în căile de preparare, din figurile 4a și 4b;
- fig. 6, reprezintă sursa de plasmidă pBGS18-HulgGl utilizată în calea de preparare din fig. 3b;
- fig. 7, reprezintă sursa de plasmidă pBGS18-HuCk utilizată în calea de preparare din fig. 4b;
- fig. 8, reprezintă două secvențe de oligonucleotidă sintetică I și II, utilizate în donarea secvențelor cADN din fig. 1 și 2;
- fig. 9, reprezintă șase secvențe de oligonucleotidă sintetică de la III la VIII utilizate în procedeele de preparare redate în fig. 3a-4b;
- fig. 10 și 11, reprezintă cADN și secvențele de aminoacid ale regiunilor variabile reformate, rezultate, cu catenă lungă și respectiv scurtă, umane;
- fig. 12, reprezintă în formă grafică activitate de legare relativă, specifică antiPLAP a anticorpului uman reformat obținut;
- fig. 13, arată sub formă de diagramă structura unei molecule de anticorp (imunoglobulina) specific.
Invenția se referă, la o polipeptidă sintetică de legare specifică, care are specificitate pentru fosfataza alcalină umană de placentă (PLAP). Prin faptul că este sintetică se înțelege în mod special că polipeptidă este obținută prin tehnologia ADN recombinam și în această situație, este cel puțin diferită de agentul de legare specific existent în natură sau indus pe cale naturală, care are specificitate identică. Lucrând pe o altă cale, polipeptidă sintetică a fost produsă prin asamblarea artificială a secvenței de aminoacizi pentru a obține o moleculă nouă sau identică cu cea naturală. Polipeptidă sintetică poate fi echivalentă cu un anticorp intact tipic, sau echivalentă cu un fragment cu mai multe catene, sau una singură al unui astfel de anticorp, sau poate fi pur și simplu un material care cuprinde una sau mai multe secvențe care conferă capacitatea dorită de legare specifică.
Invenția se referă și la un anticorp uman reformat, sau la un fragment de anticorp uman reformat, care are specificitatea fosfatazei alcaline anti-umane de placentă (PLAP).
Mai concret, prin prezenta invenție se obține un anticorp uman reformat sau un fragment de anticorp uman reformat, care are specificitate de fosfatază alcalină placentară anti-umană, conținând una sau mai multe CDR-uri scoase în evidență în fig. 1 și 2 ce însoțesc prezenta descriere. De preferință, anticorpul sau fragmentul reformat, conform invenției, conține toate cele 3 CDR-uri marcate în fig. 1 din desenele ce însoțesc descrierea, într-un cadru de regiune variabilă umană cu catenă grea. Un alt mod, pe lângă cele de mai sus, este ca anticorpul sau fragmentul reformat, conform invenției, să conțină toate cele 3 CDR-uri marcate în fig. 2, într-un cadru de regiune variabilă umană cu catenă ușoară (scurtă).
Un alt obiect al prezentei invenții, este un anticorp refonnat sau un fragment de anticorp reformat, care conține o secvență de proteină așa cum este scoasă în evidență în fig. 10 și/sau fig. 11 din desenele însoțitoare ale descrierii.
Alte realizări importante, ale invenției, sunt un vector de expresie care conține o secvență ADN de tipul celei arătate în fig. 10 și/sau fig. 11 din desenele însoțitoare și un vector de expresie care conține o secvență
ADN, ce codifică una sau mai multe secvențe de proteină notate ca fiind un CDR în fig. 1 și/sau fig. 2 din desenele însoțitoare.
Un obiect important, al prezentei invenții, îl constituie o linie celulară gazdă stabilă care conține o genă străină ce provoacă linia celulară gazdă să producă un agent de legare specific, conform invenției. Aceasta poate fi o linie celulară gazdă stabilă care conține o genă străină ce codifică cel puțin una din secvențele de aminoacizi notate ca fiind o CDR în fig. 1 și/sau fig. 2 din desenele însoțitoare, împreună cu un cadru de proteină care permite secvenței de aminoacizi codificate, când este exprimată, să funcționeze ca o CDR care are specificitate pentru PLAP.
Invenția de față, realizează în mod special o linie celulară de mamifere imortalizată, sau o drojdie, sau altă celulă eucariotică, sau o celulă procariotică cum este o bacterie, care produce un anticorp sau un fragment refonnat, conform invenției.
Un alt obiect important al prezentei invenții, este un agent de legare specific sintetic, anticorp uman refonnat sau fragment de anticorp uman refonnat, care are specificitatea echivalentă cu aceea a anticorpului monoclonal kappa-anti-PLAP, gama 1, secretat de linia celulară a hibridonului de murină H17E2.
Invenția se referă, de asemenea, la două noi plasmide, psVgptHu2VHPLAPHUIgGl și pSVneoHuVkPLAP-HuCk. Aceste plasmide se pot utiliza la producerea unui agent sintetic de legare specifică, anticorp uman refonnat sau fragment de anticorp uman refonnat.
Aceste plasmide sunt conținute în noile tulpini E . coli NCTC 12389 și NCTC 12390 respectiv.
Alte aspecte ale prezentei invenții sunt:
a) o secvență ADN care codifică o regiune variabilă cu catenă grea a unui anticorp uman refonnat având specificitate pentru fosfataza alcalină placentară umană, așa cum este conținută în E.coli NCTC 12389.
b) o secvență ADN care codifică o regiune variabilă cu catenă ușoară de anticorp uman reformat având specificitate pentru fosfataza alcalină placentară umană, așa cum este conținută în E. coli NCTC 12390.
c) o regiune variabilă cu catenă grea de anticorp uman reformat având specificitate pentru fosfataza alcalină placentară umană, care se poate produce cu ajutorul vectorului de expresie conținut în E. coli NCTC 12389.
d) o regiune variabilă cu catenă ușoară de anticorp uman reformat având specificitate pentru fosfataza alcalină placentară umană, care se poate produce cu ajutorul vectorului de expresie conținut în E. coli NCTC 12390.
e) un anticorp uman reformat sau un fragment de anticorp uman reformat, care conține cel puțin o regiune variabilă, conform punctelor c) sau d) de mai sus.
De aceea, o realizare specială a prezentei invenții, este un anticorp uman reformat sau un fragment de anticorp uman reformat care posedă specificitate anti-PLAP și care încorporează o combinație de CDR-uri (care pot, de exemplu, să fie donate dintr-o imunoglobulină anti-PLAP de murină) care are secvențele de aminoacizi identificate ca CDR1, CDR2 și respectiv CDR3 în figurile 1 și 2 ale desenelor însoțitoare, care reprezintă, respectiv regiunea variabilă cu catenă grea (VH) și regiunea variabilă cu catenă ușoară (Vk) a unui anticorp monoclonai de murină anti-PLAP care a fost donat și secventat în cadrul invenției. In cazul unui anticorp intact, sau al unui fragment care conține cel puțin o regiune variabilă cu catenă grea și cel puțin o regiune variabilă cu catenă ușoară, anticorpul sau fragmentul reformat conține, de preferință, toate cele șase CDR-uri de la sursa neumană. Pentru a avea eficiență maximă la legare, trebuie să fie, de preferință, așezate una față de alta în același aranjament existent în anticorpul original neuman, de exemplu, CDR-urile VH trebuie să fie într-un cadru VH uman și în ordinea în care există în natură în anticorpul neuman.
Așa cum pentru specialiștii în acest domeniu este evident, secvențele CDR și secvențele cadru care le înconjoară pot fi supuse unor mici modificări și variații fără a se reduce semnificativ capacitatea de legare specifică esențială. Aceste modificări și variații mici pot exista fie la nivel genetic, fie în secvența de aminoacizi, fie în ambele. Ca atare, invenția cuprinde anticorpii sintetici (rcfonnați) și fragmentele sintetice care sunt echivalente ducțional cu cele descrise aici având o definire precisă genetică sau a secvențelor de aminoacizi.
Invenția se mai poate aplica la producerea anticorpilor i>/-specifici, care au două porțiuni Fab de specificitate diferită, în care una din specificități este conferită de o regiune umană reformată cu catenă variabilă, ce cuprinde una sau mai multe CDR-uri, subliniate în figurile 1 și 2 ale desenelor însoțitoare.
Invenția se mai poate aplica la producerea așa-numiților anticorpi cu o singură catenă (de exemplu, așa cum sunt descriși în Genex EP-A-281604), precum și la anticorpii legați de polizaharide (vezi Hybritech EP-A315456) și alți anticorpi modificați.
Se pot întrebuința orice regiuni umane constante (de exemplu, de tipul gama 1, 2, 3 sau 4).
Fragmentele de anticorpi care rețin proprietățile de legare specifică utile, pot fi fragmentele (Fab)2, Fab, Fv, VH sau Vk. Acestea pot fi derivate de la un anticorp intact reformat, de exemplu, prin digerarea cu pretează, sau pot fi produse ca atare prin inginerie genetică.
Un aspect important, al prezentei invenții, îl constituie un anticorp sau un fragment refonnatuman anti-PLAP, așa cum sa definit mai sus, legat, de sau încorporând un agent capabil să întârzie sau să termine creșterea celulelor canceroase, sau de un agent conceput capabil de a fi detectat în timp ce se află în coipul uman. Invenția de față se referă și la compoziții injectabile, care conțin oricare din aceste combinații, într-un suport acceptabil farmaceutic, cum este o soluție salină, prelungitor de plasă sau lipozomi. Invenția cuprinde, de asemenea, utilizarea, într-o metodă de terapie a cancerului uman sau într-o concepere a acesteia, a unui anticorp sau unui fragment uman reformat anti-PLAP, așa cum sa descris mai sus. De asemenea, invenția include utilizarea acestui anticorp sau fragment pentru fabricarea unui medicament pentru terapia de oprire a cancerului la om, sau utilizarea acestui anticorp sau fragment la fabricarea unei compoziții de diagnostic pentru diagnosticarea in vivo la oameni.
Regiunea Fc a anticorpului, ea însăși, utilizând căi și mecanisme disponibile în corp, cum ar lî liza complementului și cilotoxicitatea celulară dependentă de anticorp, poate fi folosită pentru a afecta negativ creșterea celulelor canceroase.
In această realizare, nu este necesar să se lege nici un reactiv suplimentar de anticorpul reformat.
Ca exemple de agenți capabili să afecteze negativ creșterea celulelor canceroase, sunt radioizotopii, cum aunt itriu 90 și iodul 131; medicamente cum este metotrexatul; toxine cum este ricinul sau părți ale sale; și enzime care pot, de exemplu, să transforme un medicament inactiv în medicament activ pe locul de legare a anticorpului.
Ca exemple de agenți concepuți sunt radioizotopii care generează raze gamma, cum sunt indiu 111 și tehnețiu 99; radioizotopii care generează pozitroni, cum este cuprul 64; și agenții pasivi cum este bariul care acționează ca agenți de contrast pentru razele X și gadoliniul în analiza nnn/esr.
Pentru a lega un agent metalic, cum este un radioizotop, de un agent de legare specific, conform invenției, poate fi necesar să se întrebuințeze un agent de cuplare sau de chelatizare. Au fost elaborați mulți agenți de chelatizare corespunzători și se poate face referire, de exemplu, la brevetele SUA nr. 4824986, 4831175, 4923985 și
4622420- Procedeele care cuprind întrebuințarea agenților de chelatinizare sunt descrise, de exemplu, în brevetele SUA nr.4454106, 4722892, Moi și alții (1988), McCall și alții (1990), Deshpande și alții (1990) și Meares și alții (1990).
Utilizarea anticorpilor și a fragmentelor marcate radioactiv în prezentarea și terapia cancerului la oameni, este descrisă, de exemplu, în EP 35265. Poate fi avantajos să se utilizeze anticorpul sau fragmentul specific de cancer marcat radioactiv împreună cu un agent nespecific marcat radioactiv cu un izotop diferit, pentru a oferi o bază de contrast pentru așa-numita fonnare a imaginii în scădere.
Reactivii anticorpi, conform invenției de față, se pot utiliza pentru a identifica, de exemplu, prin testarea sau prezentarea imaginii aerului, și/sau pentru a trata cancerele producătoare de PLAP. Aceste cancere pot avea, de exemplu, forma cancerului de piept, cancerului ovarian și cancerului de colon, sau se pot manifesta ele însele ca lichide, cum sunt efuziunile pleurale.
Porțiunile regiunilor VH și VL care s-a convenit (Kabat 1987) să fie denumite CDRuri, pot să nu fie singurele elemente ce trebuiesc transferate din anticorpul monoclonal neuman. Uneori, o perfonnanță mărită a anticorpului, adică specificitatea și/sau afinitatea lui, se poate obține la anticorpul uman reformat dacă se conservă anumite secvențe cadru neumane în anticorpul uman refonnat. Obiectivul este să se conserve structura de proteină tridimensională importantă asociată cu CDR-urile, care este susținută de contactele cu resturile cadrului.
Punctul de pornire normal de la care se poate prepara un anticorp reformat, conform invenției, este o celulă (de preferință, o linie celulară imortalizată), derivată de la un animal gazdă neuman (de exemplu, un șoarece), care exprimă un anticorp având specificitate contra PLAP umană. O astfel de linie celulară, poate, de exemplu, să fie o linie celulară de hibridom preparată prin tehnologia cunoscută a anticorpului monoclonal. De preferință, anticorpul exprimat are o afinitate mare și o specificitate mare pentru PLAP, pentru că trebuie să se anticipeze că se va produce o oarecare pierdere de afinitate și/sau specificitate în timpul transferului acestor proprietăți la un anticorp sau un fragment uman prin procedeele, conform invenției. Prin alegerea unui anticorp cu afinitate mare și specificitate mare ca anticorp de plecare, probabilitatea ca anticorpul sau fragmentul reformat final să prezinte, de asemenea, proprietăți de legare eficace, este mărită.
Următoarea etapă este donarea cADNului din celula care exprimă anticorpul neuman selectat și secventarea și identificarea genelor regiunii variabile incluzând secvențele care codifică CDR-urile. Procedeele întrebuințate pot fi acum considerate de rutină în acest domeniu, cu toate că sunt încă laborioase.
Dacă se urmărește să se producă un anticorp uman reformat, complet, sau cel puțin un fragment al unui asemenea anticorp care va conține, atât domeniul variabil greu, cât și cel ușor, va fi necesar să se secvențeze cADN-ul corelat cu ambele aceste domenii.
De îndată ce secvența sau secvențele cADN relevante au fost analizate, este necesar să se prepare unul sau mai mulți vectori de expresie replicabili (reproductibili) care conțin o secvență ADN ce codifică cel puțin un domeniu variabil al unui anticorp, domeniu variabil care cuprinde regiunile cadrului uman împreună cu una sau mai multe CDR-uri derivate de la anticorpul neuman ales antiPLAP. Secvența ADN în care vectorul trebuie să includă secvențele regulatoare corespunzătoare necesare pentru a asigura transcripția și translația eficiente ale genei, în special, o secvență promotoare și conducătoare (oder) se leagă operabil de secvența de domeniu variabil. Intr-un procedeu clasic de producere a unui anticorp sau fragment reformat, conform invenției, poate fi necesar să se producă doi astfel de vectori de expresie, unul care conține o secvență ADN pentru o catenă ușoară umană reformată și celălalt, o secvență ADN pentru o catenă grea umană reformată. Vectorii de expresie trebuie să fie capabili să transforme o linie celulară aleasă în care va avea loc producerea de anticorp sau fragment reformat. Această linie celulară poate fi, de exemplu, o linie celulară stabilă care nu produce mielom, exemple (cum sunt NSO și sp2-0) care se găsesc cu ușurință în comerț. O altă variantă este să se utilizeze un sistem bacterian, cum este E. coli, ca vehicul de expresie pentru anticorpul sau fragmentul reformat. De aceea etapele finale ale procedeului cuprind transformarea liniei celulare alese sau a organismului ales folosind vectorul sau vectorii de expresie și, după aceea, cultivarea liniei celulare sau a organismului transformate pentru a obține anticorpul sau fragmentul uman reformat.
Mai departe în această descriere se prezintă, numai cu titlu de exemplu, etapele detaliate cu ajutorul cărora se pot prepara vectorii de expresie corespunzători. Manipularea materialului ADN într-un laborator dotat adecvat este acum bine cunoscută pentru specialiști și procedeele folosite sunt la îndemâna specialiștilor în acest domeniu. Se pot procura în cantitate mare de la furnizorii de materiale de laborator multe colonii de cADN și genomice adecvate, plasmide, enzime de restricție și diferiți reactivi și medii care sunt necesare pentru a efectua aceste manipulări.
De exemplu, colonii genomice și de cADN se pot procura de la Clontech
Laboratories Inc. Etapele date cu titlu de exemplu mai jos, sunt pur și simplu pentru ghidarea cititorului acestei descrieri și invenția nu este în nici un fel dependentă în mod critic de existența unuia sau a mai multor materiale de plecare speciale. In practică, o persoană specializată are o gamă largă de materii prime din care să aleagă și poate folosi sau adapta tehnologia publicată utilizând experiența dobândită și materialele pe care le poate procura cel mai ușor în domeniul științific. De exemplu, multe plasmide intră în această categorie, fiind anterior, atât de mult utiizate și circulate în lumea științifică cunoscută, încât acum pot fi considerate materiale uzuale.
Se dau, în continuare, 4 exemle de realizare, a invenției.
Procedeul utilizat pentru a prepara anticorpii umani anti-PLAP reformați este descris detaliat mai jos, numai cu titlu de exemplu.
Procedeele experimentale necesare pentru aplicarea invenției nu reprezintă prin ele însele tehnologii neobișnuite și ele cuprind practic tehnicile de donare și mutageneză descrise în general, de exemplu de Verhoeyen și alții (1988), Riechmann și alții (1988) și EPA-239400 (Winter). Lucrând pe altă cale, dacă o secvență ADN este deja cunoscută în detaliu (figurile care însoțesc această descriere conțin o secvență asociată cu specificitatea antiPLAP), genele regiunii variabile umane reformate se pot sintetiza in vitro (vezi Jones și alții, 1986). Aparatura de laborator pentru sintetizarea oligonucleotidelor lungi și reactivii necesari se pot procura ușor, iar ca procedee în acest domeniu devine din ce în ce mai practicabilă sintetizarea progresivă a catenelor mai lungi.
Manualele de laborator detaliate, cuprind toate aspectele de bază ale tehnicilor ADN-ului recombinant, cum ar fi, de exemplu Molecular Clening a iui Sambrook și alții (1989).
Cu ajutorul invenției, regiunile de legare ale antigenului ale unui anticorp de șoarece anti-PLAP au fost grefate pe regiuni cadru umane. Anticorpul uman reformat obținut (notat Hu2PLAP) are caracteristicile de legare similare cu acelea ale anticorpului original dc șoarece.
Exemplul 1. a) Clonarea și determinarea secvenței genelor regiunii variabile de la șoarece.
ARN mesager se izolează din linia hibridomului de murină H17E2 care secretă un anticorp gama-1, kapa anti-PLAP, descris de Travers și alții (1984). Prima bandă cADN se sintetizează prin începerea cu cligonucleotidele I și II (vezi fig. 8) complementare la capetele 5' ale exonilor CH] și respectiv Ck. A doua bandă cADN se obține așa cum au descris Gubler și Hoffmann (1983).
Agenții de legătură EcoRI chinazați se leagă de cADN care are acum banda dublă (care mai întâi a fost tratat cu mediază EcoRI pentru a proteja locurile interne posibile EcoRI), după care se face donarea în pUC9 tăiată de EcoRI (Vieira și alții 1982) și transformarea tulpinii E. coli TG2 (Gibson, 1984).
Coloniile care conțin genele ce codifică pentru VH anti-PLAP de murină (MoVHPLAP) și pentru Vk anti-PLAP de murină (MoVkPLAP) se identifică prin hibridizarea coloniei cu 2 probe care constau respectiv din prima bandă a cADN marcată cu P32 a anti-PLAP VH și a anti-PLAP Vk. Clonele pozitive sunt caracterizate pe baza preparării plasmidei, urmată de digestia EcoRI și de analiza pe gel de agaroizi 1,5%. Inserturi în mărime completă (aproximativ 450 bp) se subclonează în locul EcoRI al M13mpl8 (Norrander și alții, 1983). Astfel se obțin clone cu inserturi în ambele orientări, ușurând determinarea secvenței de nucleotide a întregului insert prin metoda cu terminația catenei dideoxi (Sânger și alții, 1977).
Secvențele de nucleotidă și translatarea lor în secvențele de aminoacid ale genelor regiunii variabile mature MoVHPLAP și MoVkPLAP sunt arătate în fig. 1 și 2. Inserturile de 450 bp conțin o secvență semnal și secvențele netranslatate 5' și legăturile, nereprezentate în figuri.
Exemplul 2. b) Grefarea CDR-urilor anti-PLAP de șoarece pe regiunile cadru umane
Procedeele generale necesare pentru a realiza aceasta au fost descrise foarte corespunzător de Jones și alții (1986), Verhoeyen și alții (1988), Riechmann și alții (1988) și în EP-A-239400 (Winier).
Construcțiile de bază sunt utilizate pentru reformarea M13mp9HuVHLYS (Verhoeyen și alții, 1988) și M13mp9
HuVkLYS (Riechmann și alții, 1988), care conțin, respectiv, regiunile cadru ale regiunii variabile cu catenă lungă a NEW uman și ale regiunii variabile cu catenă scurtă a RE1 uman. Amândoi acești anticorpi umani au fost caracterizați minuțios și relatați de Saul și alții, 1978, Epp și alții (1974).
CDR-urile din aceste construcții (fig. 3 a și 4 a) au fost înlocuite prin mutageneză orientată spre un loc cu oligonucleotide care codifică CDR-urile anti-PLAP flancate de cel puțin 12 nucleotide la fiecare capăt, care codifică resturile corespunzătoare ale cadrului uman. Aceste oligonucleotide sunt arătate în fig. 9, în care secvențele corespunzătoare CDRurilor sunt subliniate.
In cazul de față s-a constatat că este, de asemenea, util să se conserve aminoacizii Phe 27 și Thr 30 în VHPLAP de murină în domeniul VH al anticorpului uman reformat anti-PLAP. In oligonucleotida III, cu 24 nucleotide care flanchează capătul 5' al CDR 1, codonii de murină Phe 27 și The 30 sunt arătați în fig. 9 cu litere cursive.
Mutageneza s-a făcut așa cum a descris Riechmann și alții (1988). Regiunile variabile rezultate au fost denumite Hu2VHPLAP și HUVkPLAP și sunt arătate în fig. 10 și 11.
Exemplul 3. c) Ansamblu de gene de anticorpi umani reformați în vectorii de expresie
Următoarea etapă cuprinde utilizarea unui element de mărire a catenei mari de murină IgEnh, descris de Neuberger și alții (1983) în care acest element este conținut întrun fragment Xbal lkb de plasmidă psV-Vzul. Subfragmentul 700 bp Kbal/EcoRI al acestui fragment Xbal de 1 kb este suficient pentru a conferi activitatea de mărire.
Genele umane reformate preparate în secțiunea (b) de mai sus sunt tăiate de la vectorii Ml3 ca HindIII-BamHI fragmente. Genele din regiunea variabilă a catenei mari sunt donate într-un vector bazat pe pSV2gpt (Mulligan și alții, 1981) și genele regiunii variabile a catenei ușoare sunt donate într-un vector bazat pe p3V2neo (Scuthem și alții, 1981).
Ambele conțin intensificatorul IgEnh catenei mari a imunoglobinei. In vectorul de expresie a anticorpului bazat pe pSV2gpt (vezi fig. 3a-3b), intensificatorul (elementul de mărire) Ibal/EcoRI în fragmentul conținut se donează în locul unic EcoRI al vectorului pSV2gpt (după ligarea elementelor de legătură EcoRI la capătul complet în Xbal al fragmentului). Vectorul pSVgptMoV HLYSMolgGl (Verhoeyen și alții, 1988) se utilizează ca sursă de vector bazat pe pSVgpt care conține intensificatorul IgEnh.
In vectorul de expresie a anticorpului bazat pe pSVneo (vezi fig. 4a-4b), intensificatorul Xbal 1 kb care conține fragmentul a fost mai întâi donat în pUC12 (Vieira și alții 1982), producând plasmida pUC12-IgEnh, vezi fig. 5. Intensificatorul poate fi apoi desprins sub formă de fragment EcoRI/Hind III 700 bp (sau se poate face orientarea intensificatorului), și donat în vectorul derivat pSV2neo (pSVneoMSN409 așa cum este redat în fig. 4a) obținut prin înlăturarea locului MindIII din pSVneo. Este posibil să se utilizeze pSV2gpt ca un alt vector pentru exprimarea catenei ușoare, pentru că în practică nu este necesară o selecție neo.
Gena Hu2VHPLAP a fost legată de o regiune constantă umană gamma 1 (Takahashi și alții, 1982), donată inițial ca fragment HindIII 8kb în locul HindIII al pBGS18 (Spratt și alții, 1986) și apoi în vectorul de expresie pSV2gpt ca un fragment BamHi (vezi fig. 3b și 6). Trebuie să se remarce faptul că în referința bibliografică a lui Takahashi și alții (1982) există o eroare în fig. 1: ultimele două locuri (31) sunt BamHI urmat de HindIII și nu invers. Acest lucru a fost confirmat de Flanagan și alții (1982).
Gena HuVkPLAP s-a legat de o regiune constantă umană C Kappa (Hieter și alții, 1080) colonată, de asemenea, în ea ca fragment BamHi (vezi fig. 4b și 7). Sursa de Ck umană utilizată în fig, 7 este dată de Hieter și alții (1980). Fragmentul EomHI 12 kb din ADN embrionic (donat într-un sistem de vector gamma Ch28) a fost subclonat în locul BamHi al plasmidei pBR322.
d) Expresia în celulele de mielom.
Co-transferarea plasmidelor de expresie pSVgptHu2VHPLAPHuIgGl și pSVneoHuVKPLAP-HuCk (fig. 3b și 4b) în celulele de mielom NSO s-a făcut prin electroparație (Potter și alții, 1984), după linearizarea cu Pvul. Transferatele au fost selecționate în acid micofenolic care conține mediul pentru selectarea de celule ce exprimă produsul genei gpt, apoi selectate pentru producerea anticorpului și activitate anti-PLAP prin încercările ELISA.
Clonele pozitive au fost subclonate prin diluarea limitativă și clonele pure au fost din nou supuse încercării pentru activitatea antiPLAP, iar clonele cele mai bune producătoare au fost supuse creșterii într-un mediu fără ser pentru producerea de anticorpi.
Exemplul 4. Legarea anticorpilor umani reformați
Aplicarea în practică a anticorpilor umani reformați necesită suficientă eficacitate la legare. Dacă, anticorpul inițial are o eficacitate foarte mare, atunci se poate tolera o oarecare reducere în timpul reformării. Eficacitatea de legare va fi legată de mulți factori, unul dintre aceștia fiind afinitatea anticorpului pentru antigen, în acest caz fosfataza alcalină placentară. O cale utilă pentru demonstrarea ușurinței de legare a anticorpului reformat este să se arate că el are o curbă de diluție a anticorpului similară când se leagă de antigenul adsorbit pe o suprafață de material plastic a unei cavități. Aceste curbe sau trasat după cum urmează, utilizând anticorpul inițial anti-PLAP de murină și un anticorp uman reformat preparat prin procedeul de mai sus.
Plăci cu multe cavități (Costar 6595, PETG) s-au acoperit cu fosfatază alcalină placentară (5 pg/ml, în tampon fosfat salin pH 7,4, 37°C, 2 h). Plăcile au fost clătite în soluție salină tamponată cu fosfat înainte de blocarea lor cu gelatină (0,02% în soluție salină tamponată cu fosfat) timp de o oră la temperatura camerei, apoi s-a spălat de patru ori cu soluție salină tamponată cu fosfat având adăugat Tween 20 (0,15%) și apoi s-a utilizat.
Legarea anticorpului s-a efectuat în soluție salină tamponată cu fosfat cu Tween 20, la temperatura camerei, timp de o oră, unnată de patru spălări în tampon.
Vizualizarea anticoipului legat s-a făcut cu anti-globuline conjugate cu peroxidază roșcată de cal (IgG anti-uman IgG pentru anticorpul refonnat și IgG anti-șoarece pentru molecula inițială). Conjugatul (Sigma) în tampon (1:1000) s-a incubat timp de o oră la temperatura camerei, după care au urmat patru spălări ca mai sus. Dezvoltarea culorii (45 min) s-a făcut cu tetrametilbenzidină (0,01%) și peroxid de hidrogen (1:200 sau 100 volume) în tampon citrat pH 6,5. Reacția s-a întrerupt cu acid clorhidric 2.M.
Probele martor au prezentat puțină culoare din cauza legării nespecifice a conjugatului sau din cauza legării anticorpului de cavități care nu conțin fosfatază alcalină placentară. Rekzultatele, arătate în fig. 12, sunt exprimate ca procente din culoarea maximă văzută (legare). Cele două curbe sunt asemănătoare, indicând un grad însemnat și util de eficacitate a legării pentru anticorpul reformat, conform invenției.
Plasmidele depozitate
Tulpinile E. coli care conțin plasmidele utilizate în procedeul de mai sus au fost depozitate, în conformitate cu prevederile Tratatului de la Budapesta, în Colecția Națională de culturi tip (ATCC) la 19 aprilie 1990 după cum urmează:
NCTC 12389: K12, TG1 E. coli conținând plasmida psVgptHu2VHPL·AP-HuIhCl
NCTC 1290: K12, TC1 E. coli conținând plasmida psVneoHnVkPLAP-HuCk.

Claims (9)

  1. Revendicări
    1. Anticorp uman reformat, sau sintetic, sau fragment de anticorp uman reformat, sau sintetic, caracterizat prin aceea că, are specificitate pentru fosfataza alcalină plancentară umană (PLAP), care este conferită de prezența:
    a) a cel puțin unei regiuni variabile cu catenă grea, cuprinzând următoarea CDR:
    CDR1: Ser Tyr Gly Val Ser
    CDR2: Val Ile Trp Glu Asp Gly Ser Thr Asn Tyr His Ser Ala Leu Ile Ser
    CDR3: Pro His Tyr Gly Ser Ser Tyr Val Gly Ala Met Glu Tyr și
    b) a cel puțin unei regiuni variabile cu catenă ușoară, cuprinzând unnăloarea CDR:
    CDR1: Arg Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Tyr Val Ala
    CDR2: Asn Ala Lys Ser Leu Ala Glu
    CDR3: Gin His His Tyr Val Ser ProTrp Thr
  2. 2. Anticorp, conform revendicării 1, caracterizat prin aceea că include cel puțin o regiune variabilă cu catenă grea ce cuprinde secvența de aminoacizi: Gin Val Gin Leu Gin
    Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Arg Pro Ser Gin Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Thr Phe Thr Ser Tyr Gly Val Ser Trp Val Arg Gin Pro Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Ile Gly Val Ile Trp Glu Asp Gly Ser Thr Asn Tyr His Ser Ala Leu Ile Ser Arg Val Thr Met Leu Val Asp Thr Ser Lys Asn Gin Phe Ser Leu Arg Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Pro His Tyr Gly Ser Ser Tyr Val Gly Ala Met Glu Tyr Trp Gly Gin Gly Ser Leu Val Thr Val Ser Ser și cel puțin o regiune variabilă cu catenă ușoară, ce cuprinde secvența de aminoacizi: Asp Ile Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Gys Arg Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Tur Val Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Ays Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Asn Ala Lys Ser Leu Ala Glu Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gin Pro Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Gys Gin His His Tyr Val Ser Pro Trp Thr Phe Gly Gin Cly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg.
  3. 3. Anticorp, conform revendicării 1, caracterizat prin aceea că, specificitatea sa este echivalentă cu cea anticorpului gamma-1 kappa anti-PLAP secretat de linia celulară H17E2 a hibridomului de murină.
  4. 4. Anticorp, conform revendicării 1, caracterizat prin aceea că, poate fi folosit în compoziții pentru tratarea și diagnosticul cancerului.
  5. 5. Genă care codifică anticorpul, descris în revendicarea 1, caracterizat prin aceea că, include una sau mai multe secvențe de nucleotide dintre următoarele:
    I) AGT TAT GGT GTA AGC
    II) GTA ATA TGG GAA GAC GGG AGC ACA AAT TAT CAT TCA GCT CTC ATA TCC
    III) CCC CAC TAC GGT AGC AGC TAC GTG GGG GCT ATG GAA TAC
    IV) CGA GCA AGT GAA AAT ATT TAC AGT TAT GTA GCA
    V) AAT GCA AAA TCC TTA GCA GAC
    VI) CAA CAT CAT TAT GTT AGT CCG TGG ACG codificând a) cel puțin una din secvențele de aminoacizi:
    Ser Tyr Gly Val Ser
    Val Ile Trp Glu Asp Gly Ser Thr Asn
    Tyr His Ser Ala Leu Ile Ser Pro His Tyr Gly
    Ser Ser Tyr Val Gly Ala Met Glu Tyr
    Arg Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Tyr Val Ala
    Asn Ala Lys Ser Leu Ala Glu
    Gin His His Tyr Val Ser Pro Trp Thr, și b) un cadru de proteină care permite secvenței de aminoacizi codificate când este exprimată să funcționeze ca un CDR având specificitate pentru fosfataza alcalină placentară umană.
  6. 6. Genă, conform revendicării 5, caracterizată prin aceea că, include secvența de nucleotide: CAG GTC CAA CTG CAG GAG AGC GGT CCA GGT CTT GTG AGA CCT AGC CAG ACC CTG AGC CTG ACC TGC ACC GTG TCT GGC TTC ACC TTC ACC AGT TAT GGT GTA AGC TGG GTG AGA CAG CCA CCT GGA CGA GGT CTT GAG TGG ATT GGA GTA ATA TGG GAA GAC GGG AGC ACA AAT TAT CAT TCA GCT CTC ATA TCC AGA GTG ACA ATG CTG GTA GAC ACC AGC AAG AAC CAG TTC AGC CTG AGA CTC AGC AGC GTG ACA GCC GCC GAC ACC GAG GTC TAT TAT TGT GCA AGA CCC CAC TAC GGT AGC AGC TAC GTG GGG GCT ATG GAA TAC TGG GGT CAA GGC AGC CTC GTC
    ACA GTC TCC TCA.
  7. 7. Genă, conform revendicării 5, caracterizată prin aceea că, include secvența de nucleotide: GAC ATC CAG ATG ACC CAG AGC CCA AGC AGC CTG AGC GCC AGC GTG GGT GAC AGA GTG ACC ATC ACC TGT CGA GCA AGT GAA AAT ATT ATT TAC AGT TAT GTA GCA TGG TAC CAG CAG AAG CCA GGT AAG GCT CCA AAG CTG CTG ATC TAC AAT GCA AAA TCC TTA GCA GAC GGT GTG CCA AGC AGA TTC AGC GGT AGC GGT AGC GGT ACC GAC TTC ACC TTC ACC ATC AGC AGC CTC CAG CCA GAG GAC ATC GCC ACC TAC TAC TGC CAA CAT CAT TAT GTT AGT CCG TGG ACG TTC GGC CAA CGG ACC AAG GTG GAA ATC AAA CGT.
  8. 8. Genă, confonn revendicării 5, caracterizată prin aceea că este conținută în plasmida pSVgptHu2VHPLAP-HUlgGl, ca vector de expresie conținut în Escherichia coli NCTC 12389.
  9. 9. Genă, conform revendicării 5, caracterizat prin aceea că, este conținută în plasmida pSVneoHuVKPLAP-Huck ca vector de exprsie conținut în Escherichia coli NCTC 12390.
RO92-200678A 1989-11-17 1990-11-14 Anticorp uman, reformat si gena care il codifica RO110262B1 (ro)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GB898926045A GB8926045D0 (en) 1989-11-17 1989-11-17 Specific binding agents
GB909019552A GB9019552D0 (en) 1990-09-07 1990-09-07 Specific binding agents
PCT/GB1990/001755 WO1991007500A1 (en) 1989-11-17 1990-11-14 Specific binding agents

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RO110262B1 true RO110262B1 (ro) 1995-11-30

Family

ID=26296218

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RO92-200678A RO110262B1 (ro) 1989-11-17 1990-11-14 Anticorp uman, reformat si gena care il codifica

Country Status (16)

Country Link
EP (1) EP0429242B1 (ro)
JP (1) JPH05501357A (ro)
KR (2) KR970007782B1 (ro)
AT (1) ATE123815T1 (ro)
AU (1) AU652923B2 (ro)
BG (1) BG60687B1 (ro)
CA (1) CA2066670A1 (ro)
DE (1) DE69020112T2 (ro)
DK (1) DK0429242T3 (ro)
ES (1) ES2075169T3 (ro)
FI (1) FI922220A0 (ro)
GR (1) GR3017407T3 (ro)
HU (1) HUT64600A (ro)
NO (2) NO303066B1 (ro)
RO (1) RO110262B1 (ro)
WO (1) WO1991007500A1 (ro)

Families Citing this family (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB9019553D0 (en) * 1990-09-07 1990-10-24 Unilever Plc Specific binding agents
US6800738B1 (en) 1991-06-14 2004-10-05 Genentech, Inc. Method for making humanized antibodies
DK0590058T3 (da) 1991-06-14 2004-03-29 Genentech Inc Humaniseret heregulin-antistof
WO1994004679A1 (en) * 1991-06-14 1994-03-03 Genentech, Inc. Method for making humanized antibodies
GB0510790D0 (en) 2005-05-26 2005-06-29 Syngenta Crop Protection Ag Anti-CD16 binding molecules
JP5297742B2 (ja) * 2008-09-26 2013-09-25 株式会社青木科学研究所 金型用粉体含有油性潤滑剤、これを用いた静電塗布方法、及び静電塗布装置
JP6983779B2 (ja) * 2015-11-30 2021-12-17 ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニアThe Regents Of The University Of California 非常に特異的な腫瘍細胞表面抗原を標的とするヒト抗体を用いた腫瘍特異的ペイロード送達及び免疫活性化
CN112601546B (zh) * 2018-06-12 2024-04-16 湖南远泰生物技术有限公司 Plap-car-效应细胞
US20240101677A1 (en) 2021-01-27 2024-03-28 Innovent Biologics (Suzhou) Co., Ltd. Single-domain antibody against cd16a and use thereof
IL311570A (en) * 2021-10-14 2024-05-01 Arsenal Biosciences Inc Immune cells with common expression chain and logic gate systems
CN114014933B (zh) * 2021-11-17 2023-05-02 福州迈新生物技术开发有限公司 抗plap蛋白单克隆抗体、细胞系及其制备方法和应用

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB8607679D0 (en) * 1986-03-27 1986-04-30 Winter G P Recombinant dna product

Also Published As

Publication number Publication date
DE69020112D1 (de) 1995-07-20
ATE123815T1 (de) 1995-06-15
EP0429242A2 (en) 1991-05-29
DE69020112T2 (de) 1995-11-02
EP0429242A3 (en) 1991-06-05
NO303066B1 (no) 1998-05-25
CA2066670A1 (en) 1991-05-18
KR970007783B1 (ko) 1997-05-16
KR920703837A (ko) 1992-12-18
JPH05501357A (ja) 1993-03-18
DK0429242T3 (da) 1995-10-16
FI922220A (fi) 1992-05-15
BG60687B1 (bg) 1995-12-29
HUT64600A (en) 1994-01-28
NO980656L (no) 1992-05-15
HU9201619D0 (en) 1992-08-28
FI922220A0 (fi) 1992-05-15
GR3017407T3 (en) 1995-12-31
ES2075169T3 (es) 1995-10-01
WO1991007500A1 (en) 1991-05-30
EP0429242B1 (en) 1995-06-14
NO980656D0 (no) 1998-02-16
KR970007782B1 (ko) 1997-05-16
NO921941D0 (no) 1992-05-15
NO921941L (no) 1992-05-15
BG96346A (bg) 1993-12-24
AU652923B2 (en) 1994-09-15
AU6736990A (en) 1991-06-13

Similar Documents

Publication Publication Date Title
FI114611B (fi) Muotoiltu ihmisen vasta-aine tai muotoiltu ihmisen vasta-ainefragmentti
CA2035899C (en) Chimeric anti-cea antibody
EP0388151A1 (en) Modified antibodies
JPH02503514A (ja) 抗体におけるまたは抗体に関する改良
CA2000913C (en) Family of high affinity antibodies for cancer treatment
RO110262B1 (ro) Anticorp uman, reformat si gena care il codifica
US5993813A (en) Family of high affinity, modified antibodies for cancer treatment
US6051225A (en) Family of high affinity, modified antibodies for cancer treatment
JPH03503956A (ja) ヒト　ガンマ，デルタｔ細胞抗原レセプターポリペプチドおよび核酸
US5645817A (en) Granulocyte-binding antibody constructs, their preparation and use
CA2080260C (en) Monoclonal antibodies against tumor-associated antigens, processes for the preparation thereof and the use thereof
JPH10155489A (ja) 組換え抗体及びそれをコードする核酸
RU2102479C1 (ru) Химерное моноклональное антитело, взаимодействующее с человеческой плацентарной щелочной фосфатазой, вариабельная область тяжелой гамма-цепи химерного моноклонального антитела, вариабельная область легкой k-цепи химерного моноклонального антитела, фрагмент кднк, кодирующий вариабельную область тяжелой гамма-цепи химерного моноклонального антитела и фрагмент кднк, кодирующий вариабельную область легкой k-цепи химерного моноклонального антитела
JP2564412B2 (ja) 薬剤耐性癌に対するキメラ抗体およびその製造
JPH04330295A (ja) マウス−ヒトキメラ抗体