NO303066B1

NO303066B1 - Gjenformet menneskeantistoff med spesifisitet for human placental alkalisk fosfatase eller fragment derav

Info

Publication number: NO303066B1
Application number: NO921941A
Authority: NO
Inventors: Martine Elisa Verhoeyen
Original assignee: Unilever Nv
Priority date: 1989-11-17
Filing date: 1992-05-15
Publication date: 1998-05-25
Also published as: BG96346A; CA2066670A1; HU9201619D0; HUT64600A; KR970007782B1; NO921941D0; GR3017407T3; FI922220A0; DE69020112D1; WO1991007500A1; EP0429242A2; NO980656D0; BG60687B1; JPH05501357A; NO980656L; ES2075169T3; NO921941L; DE69020112T2; EP0429242B1; FI922220A

Description

Denne oppfinnelse vedrører gjenformet menneskeantistoff eller et fragment derav med spesifisitet for human placental alkalisk fosfatase (PLAP). Videre vedrører oppfinnelsen plasmider og stabile vertscellelinjer nyttige i fremstillingen av nevnte antistoff eller antistoff-fragment, samt anvendelse av samme i fremstilling av en diagnostisk blanding.

Antistoffstruktur

Naturlige antistoffmolekyler består av to identiske tungkjedete og to identiske lettkjedete polypeptider som er kovalent bundet med disulfidbindinger. Fig. 13 på de vedlagte tegninger viser skjematisk den typiske struktur for et antistoff av IgG-klassen. Hver av kjedene er foldet i flere atskilte områder. De N-terminale områder av alle kjedene er variable i sekvens og kalles derfor de variable regioner (V-regioner). V-regionene til én tung (VH) og én lett (VL) kjede knytter seg sammen og danner antigenbindingssetet. Modulen som formes av de kombinerte VH- og VL-områder kalles Fv (variabelt fragment) av antistoffet. De C-terminale ender av både tunge og lette kjeder er mer konservert i sekvens og kalles derfor de konstante områder. Tunge kjeders konstante regioner er satt sammen av flere områder, f.eks. består den tunge kjeden av gamma-isotypen (IgG) av tre områder (CH1, CH2, CH3) og et hengslingsområde som forbinder CH1- og CH2-områdene. Hengslene til de to tunge kjeder er bundet kovalent sammen med disulfidbroer. Lette kjeder har et konstant område som ligger mot CHl-området. Det konstante område av antistoffmolekylet inngår i effektorfunksjoner såsom komplement-lysing og klaring av antistoffavhengig cellecytotoksisitet (ADCC). Klassisk: oppbryting av et antistoff med proteasen papain gir tre fragmenter. Ett fragment inneholder CH2- og CH3-områder, og ble ettersom de lett krystalliserer kalt Fc-fragmentet. De andre to fragmenter kalles Fab (antigenbindings) fragmenter, de er identiske og inneholder hele den lette kjeden kombinert med VH og CHl-området. Når pepsin brukes, er den proteolytiske spalting slik at de to Fab'er forblir forbundet gjennom hengslet og danner (Fab)2~fragmentet. Hvert av områdene er representert ved et separat ekson på det genetiske nivå.

Selve de variable områdene inneholder hver 3 sammen-klumpninger av hypervariable rester i et nettverk av flere konserverte sekvenser. Disse hypervariable regioner samvirker med antigenet og kalles de komplementaritetsbestemmende regioner (CDR'er). De mer konserverte sekvenser kalles rammeverks-regionene (FR'er). Se Kabat et al., (1987). Røntgenundersøkelser av antistoffer har vist at CDR'er danner sløyfer som stikker frem fra toppen av molekylet, mens FR'ene gir et strukturelt beta-ark rammeverk.

Modifiserte antistoffer

I én utførelsesform vedrører oppfinnelsen såkalte"gjenformete" eller "forandrete" menneskeantistoffer, dvs. immunoglobuliner med hovedsakelig humankonstante og rammeverks-regioner, men hvori de komplementaritetsbestemmende regioner (CDR'er) svarer til dem som finnes i et ikke-menneske-immunoglobulin, og også tilsvarende gjenformete antistoffragmenter.

De generelle prinsipper ved hvilke slike gjenformete menneskeantistoffer og fragmenter kan fremstilles er nå velkjente, og det kan vises til Jones et al. (1986), Riechmann et al. (1988), Verhoeyen et al. (1988) og EP-A-239400 (Winter). En omfattende liste av relevante litteratursitater er gitt senere i denne beskrivelsen.

Gjenformete menneskeantistoffer og fragmenter har spesiell anvendelse i in vivo-diagnose og behandling av menneskers syk-dommer, fordi de vesentlige menneskeproteiner mindre sannsynlig vil indusere uønskete skadelige reaksjoner når de gis til en menneskepasient, og den ønskete spesifisitet som CDR'ene gir kan frembringes i et vertsdyr såsom en mus, hvorfra antistoffene med utvalgt spesifisitet lettere kan erholdes. Genene med den variable region kan klones fra ikke-menneske-antistoffet, ogCDR'ene podet i et menneskevariabelt regionrammeverk ved genteknikker som gir det gjenformete menneskeantistoff eller fragment. For å oppnå dette ønskelige resultat er det nødvendig å identifisere og sekvensbestemme i det minste CDR'ene i det valgte ikke-menneske-antistoff, og fortrinnsvis hele den ikke-menneske-variable regionsekvens for å muliggjøre identifikasjon av potensielt viktige CDR-rammeverksreaksjoner.

Sammenfatnin<g>av oppfinnelsen

Oppfinnelsen gir i én utførelsesform et syntetisk spesifikt bindende polypeptid med spesifisitet for menneskets placentale alkaliske fosfatase (PLAP). Med syntetisk mener vi spesielt at polypeptidet fremstilles ved rekombinant DNA-teknologi, og i den grad i det minste er forskjellig fra et naturlig forekommende eller naturlig indusert spesifikt bindingsmiddel med identisk spesifisitet. Alternativt har det syntetiske polypeptid blitt produsert ved kunstig sammensetning av en sekvens av aminosyrer som gir et nytt eller naturidentisk molekyl. Den syntetiske polypeptid kan være ekvivalent med et intakt vanlig antistoff, eller ekvivalent med et multipelt eller enkeltkjedet fragment av et slikt antistoff, eller kan ganske enkelt være et materiale som inneholder én eller flere sekvenser som gir den ønskete spesifikke bindingsevne.

Oppfinnelsen tilveiebringer som en viktig forbedring et gjenformet menneskeantistoff, eller et gjenformet menneske-antistof f -f ragment med anti-mennekseplacental alkalisk fosfatase (PLAP) spesifisitet, idet det nærmere bestemt tilveiebringer et gjenformet menneskeantistoff eller gjenformet menneskeantistoff-fragment med anti-menneskeplacental alkalisk fosfatase-spesifisitet som inneholder ett eller flere av CDR'ene vist på fig. 1 og 2 i de medfølgende tegninger. Fortrinnsvis inneholder det gjenformete antistoff eller fragment ifølge oppfinnelsen alle tre CDR'ene vist på fig. 1 av de medfølgende tegninger i et menneskets variable tungkjedeområde-rammeverk. Alternativt, eller i tillegg, inneholder det gjenformete antistoff eller fragment ifølge oppfinnelsen alle tre CDR'ene vist på fig. 2 av de vedlagte tegninger i et menneskets variable lettkjederegion-rammeverk.

En annen utførelsesform av oppfinnelsen er et gjenformet antistoff eller gjenformet antistoff-fragment som inneholder en proteinsekvens som vist på fig. 10 og/eller fig. 11 av de medfølgende tegninger.

Andre viktige utførelsesformer av oppfinnelsen er en ekspresjonsvektor som inneholder en DNA-sekvens som vist på fig.

10 og/eller fig. 11 av de medfølgende tegninger, og en ekspresjonsvektor som inneholder en DNA-sekvens som koder for én eller flere av proteinsekvensene som er konstruert for å være et CDR på fig. 1 og/eller fig. 2 av de medfølgende tegninger.

Et viktig aspekt av oppfinnelsen er en stabil vertscellelinje som inneholder et fremmed gen som får vertscellelinjen til å produsere et gjenformet menneskeantistoff ifølge oppfinnelsen. Dette kan være en stabil vertscellelinje som inneholder et fremmed gen som koder for minst én av aminosyresekvensene utformet til å være et CDR på fig. 1 og/eller fig. 2 av de medfølgende tegninger, sammen med et proteinrammeverk som muliggjør den uttrykte kodete aminosyresekvens å fungere som et CDR med spesifisitet for PLAP.

Oppfinnelsen tilveiebringer spesielt en immortalisert pattedyrcellelinje, eller en gjær, eller annen eukaryot celle, eller en prokaryot celle såsom en bakterie, som produserer et gjenformet antistoff eller fragment ifølge oppfinnelsen.

Et annet viktig aspekt av oppfinnelsen er et gjenformet menneskeantistoff eller gjenformet menneskeantistoff-fragment med ekvivalent spesifisitet til sådant for gamma-1, kappa anti-PLAP monoklonalt antistoff utskilt av musedyrs hybridomacellelinje H17E2.

Oppfinnelsen tilveiebringer også to nye plasmider, pSVgptHu2VHPLAP-HuIgGl og pSVneoHuVkPLAP-HuCk, og disse plasmider kan brukes i fremstillingen av et gjenformet menneskeantistoff eller gjenformet menneskestoff-fragment ifølge oppfinnelsen.

Disse plasmider inneholdes i nye E. coli-stammer henholdsvis NCTC 12389 og NCTC 12390.

Andre aspekter av oppfinnelsen er:

a) en DNA-sekvens som koder for en gjenformet variabel menneskeantistoff tungkjederegion med spesifisitet for human placental alkalifosfatase, som inneholdes i E. coli NCTC 12389. b) En DNA-sekvens som koder for en gjenformet variabel menneskeantistoff lettkjederegion med spesifisitet for

human placental alkalifosfatase, som inneholdes i E. eli NCTC 12390.

c) En gjenformet variabel menneskeantistoff tungkjederegion med spesifisitet for human placental alkalifosfatase, som

kan fremstilles ved hjelp av ekspresjonsvektoren som inneholdes i E. coli NCTC 12389.

d) En gjenformet variabel human antistoff lettkjederegion med spesifisitet for human placental alkalisk fosfatase som kan

fremstilles ved hjelp av ekspresjonsvektoren som inneholdes i E. coli NCTC 12390.

e) Et gjenformet menneskeantistoff eller gjenformet menneske-antistof f -f ragment omfattende minst én variabel region

ifølge c) eller d) ovenfor.

En spesiell utførelsesform av oppfinnelsen er derfor et gjenformet humanantistoff eller fragment som har anti-PLAP-spesifisitet og inneholder en kombinasjon av CDR'er (som f.eks. kan være klonet fra et musedyrs anti-PLAP immunoglobulin) med aminosyresekvensene identifisert som henholdsvis CDR1, CDR2 og CDR3 på fig. 1 og 2 på de vedlagte tegninger, som henholdsvis representerer den variable tungkjedete region (VH) og den variable lettkjedete region (VK) av et musedyrs anti-PLAP monoklonale antistoff som vi har klonet og sekvensbestemt.

I tilfelle av et intakt antistoff eller et fragment omfattende minst en variabel tungkjederegion og minst en variabel lett-kj ederegion, inneholder det gjenformete antistoff eller fragment fortrinnsvis alle seks CDR'er fra ikke-humankilden. For å være mest effektiv ved binding bør CDR'ene fortrinnsvis sitte i forhold til hverandre i samme anordning som forekommer i det opprinnelige ikke-menneskeantistoff, dvs. VH CDR'ene bør være i et menneske-VH-rammeverk, og i den rekkefølge hvori de naturlig forekommer i ikke-menneskeantistoffet.

Som det vil fremgå for en fagmann på området kan CDR-sekvensene og de omgivende rammeverksekvenser være gjenstand for mindre modifikasjoner og variasjoner uten at den essensielle spesifikke bindingsevne er nevneverdig redusert. Slike små modifikasjoner og variasjoner kan foreligge enten på det genetiske nivå eller i aminosyresekvensen eller begge. Følgelig omfatter oppfinnelsen syntetiske (gjenformete) antistoffer og fragmenter som er funksjonelt ekvivalente med sådanne som er beskrevet heri med nøyaktig definerte genetiske eller aminosyre-sekvenser.

Oppfinnelsen kan også anvendes ved produksjon av bispesifikke antistoffer med to Fab-deler med forskjellig spesifisitet, hvori én av spesifisitetene betinges av en gjenformet variabel menneskekjederegion som inneholder ett eller flere av CDR'ene vist på fig. 1 og 2 av de vedlagte tegninger.

Oppfinnelsen kan også anvendes ved produksjon av det såkalte enkeltkjedete antistoffet (f.eks. som beskrevet i Genex EP-A-281604) og også polysakkarid-bundete antistoffer (seHybritech EP-A-315456) og andre modifiserte antistoffer.

Alle konstante menneskeregioner (f.eks. gamma 1, 2, 3 eller 4-type) kan brukes.

Antistoff-fragmenter som beholder anvendelige spesifikke bindingsegenskaper kan være (Fab)2, Fab, Fv, VH eller Vk-fragmenter. Disse kan stamme fra et intakt gjenformet antistoff, f.eks. ved proteaseoppbrytning, eller fremstilt som sådan med genteknikk.

Praktiske anvendelser av oppfinnelsen

Et viktig aspekt av oppfinnelsen er et gjenformet humant anti-PLAP-antistoff eller fragment som definert ovenfor knyttet til eller inneholdende et billeddannelsesmiddel som er istand til å påvises når det er inne i menneskekroppen. Oppfinnelsen innbefatter også injiserbare blandinger omfattende alle slike kombinasjoner i en farmasøytisk akseptabel bærer såsom en saltløsning, plasma-middel eller liposomer. Oppfinnelsen medfører også anvendelsen i en fremgangsmåte for billeddannelse på mennesker av et gjenformet menneskeanti-PLAP-antistoff eller fragment som definert ovenfor. Oppfinnelsen innbefatter videre bruken av et slikt antistoff eller fragment for fremstilling av en diagnostisk blanding for in vivo-diagnostisk anvendelse på mennesker.

Eksempler på billeddannelsesmidler innbefatter radioaktive isotoper som danner gammastråler, såsom Indium 111 og Technetium 99; radioaktive isotoper som danner positroner, såsom kobber 64; og passive midler såsom barium som virker som kontrastmidler for røntgenstråler, og Gadolinium i nmr/esr-prøving.

For å knytte et metallisk reagens såsom en radioaktiv isotop til et spesifikt bindingsmiddel, kan det være nødvendig å anvende et koblings- eller gelatiseringsmiddel. Mange egnete gelatiseringsmidler er blitt utviklet, og det kan f.eks. vises til US 4824986, US 4831175, US 4923985 og US 4622420. Teknikker som innbefatter bruk av gelatiseringsmidler er f.eks. beskrevet i US 4454106, US 4722892, Moi et al. (1988), McCall et al.

(1990), Deshpande et al. (1990) og Meares et al. (1990).

Bruken av radioaktivt merket antistoff og fragmenter ved kreftavbildning og terapi på mennesker er beskrevet f.eks. i EP 35265. Det kan være fordelaktig å bruke det radioaktivt merkede kreftspesifikke antistoff eller fragment i sammenheng med et ikke-spesifikt middel radioaktivt merket med en forskjellig isotop for å gi en kontrastbakgrunn for såkalt

subtraksjonsavbildning.

Antistoffreagensene i oppfinnelsen kan brukes til å identifisere, f.eks. ved serumte stingJ^PLAP-produserende kreftformer^eller avbildning^* Slike kreftformer kan opptre f.eks. som brystkreft, eggstokk-kreft og tykktarmkreft, eller kan manifestere seg som væsker såsom pleurale effusjoner.

Modifisert antistoff- fremstilling

Delene av VH- og VL-regionene som gjennom konvensjon (Kabat, 1987) er angitt som å være CDR'ene kan ikke være de eneste trekk som behøver å overføres fra det monoklonale ikke-menneskeantistof f . Noen ganger kan øket antistoffvirkning uttrykt som spesifisitet og/eller affinitet oppnås i det gjenformete menneskeantistoff, hvis bestemte ikke-menneske-rammeverksekvenser er bevart i det gjenformete menneske-antistof f. Hensikten er å bevare den viktige tredimensjonale proteinstruktur i forbindelse med CDR'ene som underbygges ved kontakter med rammeverkrester.

Det normale startpunkt hvorfra et gjenformet antistoff ifølge oppfinnelsen kan fremstilles, er en celle (fortrinnsvis en immortalisert cellelinje) som stammer fra et ikke-menneske-vertsdyr (f.eks. en mus), som uttrykker et antistoff med spesifisitet mot menneske-PLAP. En slik cellelinje kan f.eks. være en hybridomacellelinje fremstilt ved vanlig monoklonal antistoffteknologi. Fortrinnsvis har det uttrykte antistoff en høy affinitet og høy spesifisitet for PLAP, fordi det bør forventes at noe tap av affinitet og/eller spesifisitet kan forekomme under overføringen av disse egenskaper til et menneskeantistoff eller fragment ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen. Ved å velge ut et antistoff med høy affinitet og høy spesifisitet som stam-antistoffet, økes sannsynligheten for at det endelige gjenformete antistoff eller fragment også vil vise effektive bindingsegenskaper.

Det neste trinn er kloningen av cDNA'et fra cellen som uttrykker det utvalgte ikke-menneskeantistoff, og sekvensbestemmelse og identifikasjon av gener med variabel region innbefattende sekvensene som koder for CDR'ene. De medfølgende fremgangsmåter kan nå anses som rutine på området, selvom de fortsatt er arbeidskrevende.

Hvis hensikten er å fremstille et gjenformet fullstendig menneskeantistoff, eller minst et fragment av et slikt antistoff som vil inneholde både tunge og lette variable områder, vil det være nødvendig å sekvensbestemme cDNA'et i forbindelse med begge disse områder.

Så snart de(n) relevante cDNA-sekvens eller sekvenser er blitt analysert, er det nødvendig å fremstille én eller flere replikerbare ekspresjonsvektorer som inneholder en DNA-sekvens som koder for minst ett variabelt område av antistoffet, hvilket variable område omfatter menneskerammeverk-regioner sammen med ett eller flere CDR'er som stammer fra det valgte ikke-menneske anti-PLAP-antistoff. DNA-sekvensen i hver vektor bør innbefatte tilsvarende reguleringssekvenser som er nødvendig for å sikre effektiv transkripsjon og translasjon av genet, spesielt en promotor og ledersekvens som er operabelt knyttet til den variable områdesekvensen. I en typisk fremgangsmåte for å fremstille et gjenformet antistoff eller fragment ifølge oppfinnelsen, kan det være nødvendig å fremstille to slike ekspresjonsvektorer, én som inneholder en DNA-sekvens for et menneskes gjenformete lette kjede, og den andre DNA-sekvens for et menneskes gjenformete tunge kjede. Ekspresjonsvektorene bør være istand til å transformere en valgt cellelinje hvori produksjon av det gjenformete antistoff eller fragment vil forekomme. En slik cellelinje kan f.eks. være en stabil ikke-produserende myelomacellelinje, eksempler (såsom NSO og sp2-0) som er lette å få kjøpt. Et alternativ er å bruke et bakterie-system såsom E. coli som ekspresjonsbærer for det gjenformete antistoff eller fragment. Sluttrinnene i fremgangsmåten medfører derfor transformering av den valgte cellelinje eller organisme ved bruk av ekspresjonsvektoren eller vektorene, og deretter dyrke den transformerte cellelinje eller organisme, hvilket gir det gjenformete menneskeantistoff eller fragment.

Kun som eksempler er detaljerte trinn ved hjelp av hvilke tilsvarende ekspresjonsvektorer kan fremstilles gitt senere i denne beskrivelsen. Manipuleringen av DNA-materiale i et riktig utstyrt laboratorium er nå en velutviklet teknikk, og fremgangsmåten som kreves ligger innenfor kunnskapen til fagfolk på dette området. Mange tilsvarende genomiske og cDNA-samlinger, plasmider, restriksjonsenzymer og forskjellige reagenser og medier som kreves for å utføre slike manipuleringer kan kjøpes fra leverandører av laboratoriematerialer. F.eks. kan genomiske og cDNA-samlinger kjøpes fra Clontech Laboratories Inc. Trinnene som kun er gitt som eksempler nedenunder er bare som rettledning for leseren av denne beskrivelsen, og oppfinnelsen er på ingen måte kritisk avhengig av tilgjengeligheten av ett eller flere spesielle utgangsmaterialer. I praksis har fagmannen et vidt områdemateriale å velge fra og kan utnytte og tilpasse den publiserte teknologi ved å bruke tilegnet erfaring og materialer som er meget lett tilgjengelig i det vitenskapelige miljø.

F.eks. faller mange plasmider innenfor denne kategorien, som er blitt så utstrakt brukt og sirkulert innenfor det relevante fagmiljø at de nå kan anses som helt vanlige materialer.

Eksempler

Fremgangsmåten som brukes for å fremstille gjenformete anti-PLAP menneskeantistoffer er beskrevet i detalj nedenunder kun som eksempel under henvisning til de vedlagte tegninger, hvorav:

Fig. 1 viser cDNA-sekvensen som koder for et musedyrs variable tungkjedeområde med anti-PLAP-spesifisitet. De tre klassiske CDR'er er vist sammen med en aminosyresekvens som passer til cDNA-koden. Fig. 2 viser cDNA-sekvensen som koder for et musedyrs variable lettkjedeområde med anti-PLAP-spesifisitet. Fig. 3a og 3b viser sammen en vei ved hvilken en ekspresjonsvektor som koder for en gjenformet tung menneskekjede inneholdende CDR'ene fra fig. 1 kan fremstilles. Fig. 4a og 4b viser sammen en liknende transformasjonsvei for å fremstille en ekspresjonsvektor som koder for en gjenformet lett menneskekjede inneholdende CDR'ene på fig. 2, kan fremstilles. Fig. 5 viser plasmidet pU12-IgEnh, som inneholder en forsterket sekvens brukt i veiene på fig. 4a og 4b. Fig. 6 viser kilden for plasmid pBGS18-HulgGl brukt i veien på fig. 3b. Fig. 7 viser kilden for plasmid pBGS18-HuCk brukt i veien på fig. 4b. Fig. 8 viser to syntetiske oligonukleotidsekvenser I og II brukt i kloning av cDNA-sekvensene på fig. 1 og 2. Fig. 9 viser seks syntetiske oligonukleotidsekvenser III-VIII anvendt i veiene vist på fig. 3a-4b. Fig. 10 og 11 viser cDNA og aminosyresekvensene til henholdsvis de resulterende gjenformete menneske-tung- og lettkjedete variable regioner. Fig. 12 viser i grafisk form den relative spesifikke anti-PLAP-bindingsaktivitet på det resulterende gjenformete menneske-antistof f . Fig. 13 viser i skjematisk form strukturen av et typisk antistoff (immunoglobulin) molekyl.

De eksperimentelle fremgangsmåter som kreves for å utøve oppfinnelsen representerer ikke i seg selv noen uvanlig teknologi, og de medfører likefrem kloning og mutagenese-teknikker som generelt beskrevet f.eks. i Verhoeyen et al.

(1988); Riechmann et al. (1988) og EP-A-239400 (Winter). Alternativt, hvis en tilsvarende DNA-sekvens allerede er kjent i detalj (tegningene som følger denne beskrivelsen inneholder en sekvens i forbindelse med anti-PLAP-spesifisitet), kan de gjenformete variable menneskeregiongener syntetiseres in vitro (se Jones et al, 1986). Laboratorieutstyr og reagenser for syntese av lange oligonukleotider er lett tilgjengelige, og ettersom teknikker på dette området utvikles, blir det mulig å syntetisere gradvis lengre sekvenser.

Detaljerte laboratorieforskrifter som dekker alle grunnleggende aspekter av rekombinante DNA-teknikker er tilgjengelige, f.eks. "Molecular doning" av Sambrook et al

(1989) .

Ved hjelp av oppfinnelsen ble de antigenbindende områder av et muse-anti-PLAP-antistoff podet på menneskerammeverks-regioner. Det resulterende gjenformete menneskeantistoff

(kalt Hu2PLAP) har liknende bindingsegenskaper som hos det opprinnelige museantistoff.

Slike gjenformete antistoffer kan brukes for in vitro-diagnose og påvisning av menneskekreft, f.eks. eggstokk-kreft og seminoma, og er ventet i det minste å redusere problemet med immunreaksjon hos pasienten som ofte observeres etter' administrering av ikke-humant antistoff. En liknende fordel har vært vist for gjenformet CAMPATH-1-antistoff hos Hale et al

(1988) .

Metoder

a) Kloning og sekvensbestemmelse av variable museområdegener

Budbringer-RNA ble isolert fra musehybridomalinjen "H17E2"

som utskiller et gamma-1, kappa anti-PLAP-antistoff, beskrevet i Travers et al (1984) . Førstekjede-cDNA ble syntetisert ved priming med oligonukleotider I og II (se fig. 8) som er komplementære med 5'-endene av henholdsvis CH1 og Ck-eksoner. Andrekjede-cDNA erholdtes som beskrevet av Giibler og Hoffmann

(1983) .

Kinasebehandlete EcoRI-linkere ble ligert til det nå dobbeltkjedete cDNA (som først var behandlet med EcoRI-metylase for å beskytte eventuelle interne EcoRI-seter), etterfulgt av kloning i EcoRI-kappet pUC9 (Vieira et al, 1982) og transformasjon av E. coli-stamme TG2 (Gibson, 1984).

Kolonier som inneholder gener som koder for muse anti-PLAP VH (MoVHPLAP) og for muse anti-PLAP Vk (MoVkPLAP) ble identifisert ved kolonihybridisering med 2 prober som henholdsvis besto av 32P-merket førstekjede-cDNA av anti-PLAP VH og Vk. Positive kloner blekarakterisert vedplasmid-fremstilling, etterfulgt av EcoRI-spaltning og 1,5% agarosegel-analyse. Fullstørrelses-innskudd (ca. 450 bp) ble subklonet i EcoRI-setet av M13mpl8 (Norrander et al, 1983). Dette ga innskudd i begge orienteringer, som lettet nukleotidsekvensbestemmelsen til hele inn-skuddet med dideoksykjedeavslutningsmetoden (Sanger et al, 1977).

Nukleotidsekvenser og deres translasjon til aminosyre-sekvenser av fullstendig variable regiongener MoVHPLAP ogMoVkPLAP er vist på fig. 1 og 2. 450 bp innskuddene inneholdt en signalsekvens og 5'-ikke-translaterte sekvenser og linkere som ikke er vist på figurene.

b) Poding av museanti- PLAP- CDR' er på menneskerammeverkreqioner

De generelle teknikker som er nødvendig for å oppnå dette

er blitt beskrevet meget fullstendig i Jones et al (1986) ,Verhoeyen et al (1988), Riechmann et al (1988) og i EP-A-239400 (Winter).

Grunnkonstruksjonene som brukes for gjenforming varM13mp9HuVHLYS (Verhoeyen et al, 1988) og M13mp9HuVkLYS (Riechmann et al, 1988), som henholdsvis inneholder rammeverkregionene til den variable tungkjedete region av menneske "NEW" og den variable lettkjedete region av menneske "REI". Begge disse menneskeantistoffer har blitt fullstendigkarakterisertog rapportert (Saul et al, 1978; og Epp et al, 1974, henholdsvis).

CDR'ene i disse konstruksjonene (fig. 3a og 4a) ble erstattet ved seterettet mutagenese med oligonukleotider som koder for anti-PLAP CDR'ene flankert med minst 12 nukleotider ved hver ende som koder for de tilsvarende menneskerammeverk-rester. Disse oligonukleotider er vist på fig. 9, hvori alle sekvenser svarende til CDR'ene er understreket.

I det foreliggende tilfelle fant vi det nyttig også å konservere aminosyrene Phe 27 og Thr 3 0 av muse VHPLAP i VH- området av det gjenformete menneskeanti-PLAP-antistoff. I oligonukleotid III, med 24 nukleotider som flankerer 5'-enden av CDR 1, er muse Phe 27 og Thr 30 kodoner vist i kursiv på fig. 9.

Mutagenesen ble foretatt som beskrevet i Riechmann et al

(1988). De resulterende variable regioner ble kalt Hu2VHPLAP og HuVkPLAP og er vist på fig. 10 og 11.

c) Sammensetning av gjenformete menneskeantistoffgener i ekspresi onsvektorer

Det neste trinn innbefattet bruk av en musedyr tungkjede-forsterker IgEnh, beskrevet i Neuberger et al (1983), hvor forsterkeren sitter i et lkb Xbal-fragment av plasmid pSV-V/xl. 70 0 bp Xbal/EcoRI-underfragmentet av dette lkb Xbal-fragment er tilstrekkelig til å gi forsterkeraktivitet.

De gjenformete menneskegener som er fremstilt i avsnitt (b) ovenfor ble skåret fra M13-vektorene som Hindlll-BamHI-fragmenter. Genene med variabel tungkjederegion ble klonet i en vektor basert på pSV2gpt (Mulligan et al, 1981), og genene med variabel lettkjederegion ble klonet i en vektor basert på pSV2neo (Southern et al, 1981). Begge inneholdt immunoglobulin tungkjedeforsterkeren IgEnh. Den pSV2gpt-baserte antistoffekspresjonsvektor (se fig. 4b-4c), det Xbal/EcoRI forsterkerholdige fragment ble klonet i det eneste EcoRI-setet av pSV2gpt-vektoren (etter ligering av EcoRI-linkere til den oppfylte Xbal-ende av fragmentet). Vektoren pSVgptMoVHLYS-MoIgGl (Verhoeyen et al, 1988) ble brukt som kilde for en pSVgpt-basert vektor

inneholdende IgEnh-forsterkeren.

I den pSVneo-baserte antistoffekspresjonsvektor (se fig. 5a-5b) ble det lkb Xbal-forsterkerholdige fragment først klonet i pUC12 (Vieira et al, 1982), som ga plasmidet pUC12-IgEnh, se fig. 5. Forsterkeren kan så skjæres ut som et 700bp EcoRI/ Hindlll-fragment (begge orienteringer av forsterkeren vil virke), og klones i den pSV2neo-avledete vektor (pSVneoMSN409 som vist på fig. 4a) oppnådd ved fjerning av HindiII-setet i pSVneo. Det er mulig å bruke pSV2gpt som en alternativ vektor for lettkjede-ekspresjon, da det i praksis ikke er noe behov for neoseleksjon.

Hu2VHPLAP-genet ble knyttet til en menneske gamma 1 konstant region (Takahashi et al, 1982), først klonet som et 8kb Hindlll-fragment i Hindlll-setet av pBGS18 (Spratt et al, 1986), og deretter i pSV2gpt-ekspresjonsvektoren som et BamHI-fragment (se fig. 3b og 6). Det bør bemerkes at i Takahashi et al (1982) henvisningen er det en feil i fig. 1: de siste (3') to seter er BamHI etterfulgt av Hindlll, og ikke motsatt. Dette ble bekreftet av Flanagan et al (1982) .

HuVkPLAP-genet ble knyttet til en menneske C kappa konstant region (Hieter et al, 1980) også klonet inn som et BamHI-fragment (se fig. 4b og 7). Kilden til det humane Ck anvendt i fig. 7 er angitt i Hieter et al (1980). 12 kb BamHI-fragmentet fra embryonisk DNA (klonet i et gamma Ch28 vektor-system) ble subklonet i BamHI-setet av plasmid pBR322.

d) Ekspresjon i myelomaceller

Ko-transfeksjon av ekspresjonsplasmidene pSVgptHu2VHPLAP-HuIgGl og pSVneoHuVkPLAP-HuCk (fig. 3b og 4b) i NSO myelomaceller ble foretatt ved elektroporering (Potter et al, 1984), etter linearisering med Pvul. Transfektanter ble selektert i mykofenolsyreholdig medium for å selektere for celler som uttrykker gpt genproduktet og undersøkt etter antistoff-produksjon og anti-PLAP-aktivitet med ELISA-målinger.

Positive kloner ble subklonet ved begrensende fortynning, og rene kloner ble målt igjen etter anti-PLAP-aktivitet, og de best produserende kloner ble dyrket i serumfritt medium for antistoffproduksj on.

e) Bindingsevne av de gjenformete menneskeantistoffer

Den praktiske anvendelse av de gjenformete menneskeanti-stof f er krever tilstrekkelig bindingseffektivitet. Hvis stam-antistoffet har en meget høy effektivitet, kan en viss reduksjon under gjenformingen tolereres. Bindingseffektiviteten vil være diktert av mange faktorer, hvorav én vil være antistoff-affiniteten for antigen, i dette tilfelle placental alkalifosfatase. En brukbar måte å demonstrere bindingsevnen til det gjenformete antistoff er å vise at det har en liknende antistoff-fortynningskurve ved binding til antigen adsorbert på en plastbrønnoverflate. Slike kurver ble dannet som følger ved bruk av musestam-anti-PLAP-antistoffet og et gjenformet menneskeantistoff fremstilt ved den foregående fremgangsmåte.

Multibrønnplater (Costar 6595, PETG) ble belagt med placental alkalif osf atase (5/xg/ml i f osf atbuf f ret saltvann pH 7,4 37°C, 2 timer). Platene ble renset i fosfatbuffret saltvann før blokkering med gelatin (0,2% i fosfatbuffret saltvann) i 1 time ved romtemperatur, deretter vasket fire ganger med fosfatbuffret saltvann tilsatt Tween 20 (0,15%) og deretter brukt.

Antistoffbinding ble utført i fosfatbuffret saltvann med Tween 2 0 ved romtemperatur i 1 time, etterfulgt av fire vasker i buffer.

Visualisering av bundet antistoff foregikk med pepperrot-peroksydasekonjugerte antiglobuliner (anti-human IgG for gjenformet antistoff og antimuse-IgG for stammolekylet). Konjugatet (Sigma) i buffer (1:1000) ble inkubert 1 time ved romtemperatur etterfulgt av fire vasker som ovenfor. Farge-utvikling (45 minutter) foregikk med tetrabenzidin (0,01%) og hydrogenperoksyd (1:200 eller 100 volumer) i citratbuffret pH 6,5. Reaksjonen ble stoppet med 2M saltsyre.

Kontroller viste insignifikant farge på grunn av ikke-spesifikk binding av konjugat eller på grunn av binding av antistoff til brønner som ikke inneholdt placental alkalisk fosfatase. Resultatene som er vist på fig. 12 er uttrykt som en prosentdel av maksimumfargen (binding) man ser. De to kurver er liknende, hvilket viser et signifikant og bruktbart nivå for bindingseffektivitet for det gjenskapte antistoff i oppfinnelsen.

f) Deponerte plasmider

E. coli-stammer inneholdende plasmider brukt i fremgangsmåten ovenfor er blitt deponert ifølge forskriftene for Budapest-avtalen i National Collection of Type Cultures den 19. april 1990 som følger: NCTC 12389: K12, TG1 E. coli inneholdende plasmid

pSVgptHu2VHPLAP-HuIgGl

NCTC 12390: K12, TG1 E. coli inneholdende plasmid pSVneoHuVkPLAP-HuCk

Referanser:

Deshpande et al (1990) - J. Nucl. Med., 31, s. 473-479

Epp et al (1974) - Eur. J. Biochem. 45, s. 513-524 Flanagan et al (1982) - Nature, 300, s. 709-713

Gibson T (1984) - PhD thesis, LMB-MRC Cambridge

Gubler et al (1983) - Gene, 25, s. 263-269

Hale et al (1988) - Lancet, 2, s. 1394

Hieter et al (1980) - Cell, 22, s. 197-207

Jones et al (1986) - Nature, 321, s. 522-525

Kabat et al (1987) - i Sequences of Proteins of Immunological Interest, s. ix - US Dept

of Health and Human Services

McCall et al (1990) - Bioconjugate Chemistry, 1, s. 222-226 Meares et al (1990) - Br. J. Cancer, 62, Suppl. X, s. 21-26 Moi et al (1988) - J. Am. Chem. Soc., 110, s. 6266-6269 Mulligan et al (1981) - Proe. Natn. Acad. Sei. USA, 78,

S. 2072-2076

Neuberger et al (1983) - EMBO Journal, 2, s. 13 73-13 78 Norrander et al (1983) - Gene, 26, s. 101-106

Potter et al (1984) - PNAS, 81, s. 7161-7163

Riechmann et al (1988) - Nature, 332, s. 323-327

Sambrook et al (1989) - Molecular Cloning, 2. utg.,

Cold Spring Harbour Laboratory Press,

New York

Sanger et al (1977) - PNAS USA, 74, s. 5463-5467

Saul et al (1978) - J. Biol. Chem. 253.,s. 585-597 Southern et al (1981) - J. Molec. Appl. Genetics, 1,

s. 327-345

Spratt et al (1986) - Gene, 41, s. 337-342

Takahashi et al (1982) - Cell, 29, s. 671-679

Travers et al (1984) - Int. J. Cancer, 33, s. 633 Verhoeyen et al (1988) - Science, 239, s. 1534-2536

Vieira et al (1982) - Gene, 19, s. 259-268

Winter (1987) - EP-A-239400

Claims

1. Gjenformet menneskeantistoff eller et gjenformet menneske-antistof f -f ragment ,karakterisert vedat det har spesifisitet for human placental alkalisk fosfatase (CPLAP) betinget ved nærværet i et human variabel region-rammeverk av én eller flere av aminosyresekvensene:

2. Gjenformet menneskeantistoff eller et gjenformet menneske-antistof f -f ragment ifølge krav 1, karakterisert vedat det har minst én variabel region-tungkjede inneholdende de følgende CDR'er:

3. Gjenformet menneskeantistoff eller et gjenformet menneske-antistof f -f ragment ifølge krav 1, karakterisert vedat det har minst én variabel lettkjede inneholdende de følgende CDR'er:

4. Gjenformet menneskeantistoff eller et gjenformet menneske-antistof f -f ragment ,karakterisert vedat det har i det minste én variabel regiontungkjede ifølge krav 2 og minst én variabel regionlettkjede ifølge krav 3.

5. Gjenformet menneskeantistoff eller gjenformet menneske-antistof f -f ragment ifølge krav1, karakterisert vedat det inneholder minst én variabel regiontungkjede omfattende hele aminosyresekvensen som er vist på fig. 10 av de vedlagte tegninger.

6. Gjenformet menneskeantistoff eller gjenformet menneske-antistof f -f ragment ifølge krav 1, karakterisert vedat det inneholder minst én variabel regionlettkjede omfattende hele aminosyresekvensen som er vist på fig. 11 av de vedlagte tegninger.

7. Gjenformet menneskeantistoff eller gjenformet menneske-antistof f -f ragment ifølge krav 1, karakterisert vedat det har spesifisitet ekvivalent med den til gamma-1, kappa anti-PLAP monoklontalt antistoff utskilt av musehybridoma cellelinje H17E2.

8. Stabil vertscellelinje,karakterisert vedat den inneholder et fremmed gen som koder for et gjenformet menneskeantistoff eller gjenformet menneskeantistoff-fragment ifølge hvert av kravene 1-7.

9. Stabil vertscellelinje ifølge krav 8,karakterisert vedat det fremmede gen inneholder én eller flere av nukleotidsekvensene:

10. Stabil vertscellelinje ifølge krav 8,karakterisert vedat det fremmede gen inneholder hele nukleotidsekvensen vist på fig. 10 av de vedlagte tegninger.

11. Stabil vertscellelinje ifølge krav 8,karakterisert vedat det fremmede gen inneholder hele nukleotidsekvensen vist på fig. 11 av de vedlagte tegninger.

12. Stabil vertscellelinje ifølge krav 8,karakterisert vedat det fremmede gen koder for: a) minst én av aminosyresekvensene: b) et proteinrammeverk som muliggjør den kodete aminosyresekvensen når denne uttrykkes, i å virke som et CDR med spesifisitet for human placental alkalisk fosfatase.

13. Plasmidet pSVgptHu2VHPLAP-HuIgGl som inneholdt i E. coli NCTC 12389,karakterisert vedat det er nyttig i fremstillingen av et gjenformet menneskeantistoff eller gjenformet menneskeantistoff-fragment, idet nevnte plasmid inneholder en DNA-sekvens som koder for nevnte antistoff ifølge krav 1 og at det ytterligere omfatter kontroll- og reguleringssekvenser så vel som en signalsekvens.

14. Plasmidet pSVneoHuVkPLAP-HuCk som inneholdt i E. coli NCTC 12390,karakterisert vedat det er nyttig i fremstillingen av et gjenformet menneskeantistoff eller gjenformet menneskeantistoff-fragment, idet nevnte plasmid inneholder en DNA-sekvens som koder for nevnte antistoff ifølge krav 1 og at det ytterligere omfatter kontroll- og reguleringssekvenser så vel som en signalsekvens.

15. Anvendelse av et plasmid ifølge krav 13 eller 14 ved fremstilling av et gjenformet menneskeantistoff eller menneske-antistof f -f ragment ifølge krav 1.

16. Gjenformet menneskeantistoff tungkjede variabel region ifølge krav1som har spesifisitet for human placental alkalisk fosfatase,karakterisert vedat det kan fremstilles ved hjelp av ekspresjonsvektoren innholdt i E. coli NCTC 12389.

17. Gjenformet menneskeantistoff lettkjede variabel region ifølge krav 1 som har spesifisitet for human placental alkalisk fosfatase,karakterisert vedat det kan fremstilles ved hjelp av ekspresjonsvektoren innholdt i E. coli NCTC 12390.

18. Gjenformet menneskeantistoff eller gjenformet menneske-antistof f ragment ,karakterisert vedat det omfatter minst én variabel region ifølge krav 16 eller 17.

19. Gjenformet menneskeantistoff eller gjenformet menneske-antistof f -f ragment ifølge ethvert av kravene 1-7 eller 18,karakterisert vedat det er knyttet til en markør istand til å påvises inne i det menneskelige legeme.

20. Anvendelse av et gjenformet menneskeantistoff eller gjenformet menneskeantistoff-fragment ifølge hvert av krav1-7 eller krav 18, for fremstilling av en diagnostisk blanding for in vivo diagnostisk anvendelse på mennesker.