PT99618B - Processo para a realizacao de um ensaio de ligacao a recptores celulares isentode celulas e de identificacao caracterizacao e deteccao de agentes biologicos por meio desse ensaio - Google Patents

Processo para a realizacao de um ensaio de ligacao a recptores celulares isentode celulas e de identificacao caracterizacao e deteccao de agentes biologicos por meio desse ensaio Download PDF

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Description

Descrição
A presente invenção refere-se a ensaios de ligação a receptores celulares isentos de células que permitem a investigação do comportamento de ligação de proteínas recepto ras situadas na membrana celular frente a ligandos naturais ou sintéticos. Nestes ensaios, cada receptor liga-se com uma molé cuia de suporte adequada, de preferência a cadeia pesada de uma imunoglobulina, e fixa-se por meio do suporte a uma fase só lida adequada com conservação das suas propriedades biológicas.
J.M.
A determinação do comportamento de ligação de proteínas receptoras situadas na membrana celular frente a ligandos naturais ou sintéticos é para muitas questões em biolo
logia e em medicina de grande importância. Para investigar este comportamento normalmente prepara-se um ligante marcado com isótopos radioactivos e determina-se a sua ligação específica por métodos apropriados, como por exemplo centrifugação de gradientes, diálise de gradiente ou filtração. As moléculas dos receptores podem neste caso permanecer ligadas às células e neste caso o ensaio é efectuado com células inteiras, mas também podem estar situadas em fracçôes celulares, como vesículas da membrana, ou ser extraídas a partir da membrana celu lar com detergentes adequados e ser estabilizadas em micelas de detergente. Os ensaios de ligação de receptores conhecidos são realizados com crescente dificuldade à medida que se consideram moléculas cada vez mais numerosas de receptores de membra na celular. Muitos receptores, especialmente os de maior inte. resse em medicina, são normalmente expressos apenas em escala reduzida (na ordem de grandeza de alguns centos até alguns milhares de moléculas por célula) sobre a superfície celular. É o que acontece com, por exemplo, os receptores para o factor de estimulação de colónias de granulócitos/macrófagos (GM-CSF), muitas interleuquinas, a eritropoietina, o factord de necrose de tumores (TNF), etc..
objectivo preferido de acordo com a pr£ sente invenção era· o desenvolvimento de um ensaio de ligação apropriado para os receptores referidos. Um ensaio de ligação específico, sensível e de fácil realização possibilitaria por e xemplo ensaiar numerosos compostos para investigação das suas propriedades de ligação, identificando deste modo candidatos a agonistas e antagonistas (screening de receptores). Para além disso, com ensaios deste tipo seria também possível em consequência investigar anticorpos dirigidos contra receptores ou ligandos, para verificar se estes eram dirigidos contra epítopos que desempenhassem uma função na ligação. De acordo com a presente invenção procurou-se atingir o objectivo de desenvolver um sistema de ensaio que preenchesse as condições referidas. Nas publicações de Patentes Europeias EP-A 0325 262 e EP-A 0314 317 e no pedido de Patente Alemã (DE) P 4020 607
.desore vem-se ou reivindicam-se proteínas de fusão constituídas a partir de diferentes fracções dos domínios extraeelulares de proteínas de membrana humanas ou de proteínas solúveis (parcei ro de fusão) e a fracção constante (Fc) da.cadeia pesada de uma Ig. Nestes casos a sequência de codificação·do parceiro de fusão é fundida ao nível do ADN com um ADN que codifica? para a fracção Fc de tal modo que o parceiro de fusão de preferência a fracção aininoterminal da proteína de fusão. 0 ADN recombinante é então expresso num sistema celular apropriado. Os parceiros de fusão para a fracção Fc são por umlado proteí nas que pertencem à família das imunoglobulinas como o antigé nio das células T CD4 (EP-A 0325 262 e 0314 317) e por outro lado também proteínas não estruturais como a tromboplastina ou o receptor para a interleuquina 4 (IL-4) (DE P 4020607.6). As referidas proteínas de fusão são de preferência expressas em células animais. 0 paròeiro de fusão aminoterminal eonserva em geral a sua actividade biológica; se tem origem por exemplo numa proteína receptora situada normalmente na membrana, liga-se a ligandos com Uma afinidade que iguala a do receptor ligado à membrana. É também caracterizada ao nível do ADNs uma proteína receptora cuja propriedade principal consiste na possibilidade de produzir grandes quantidades das moléculas dotadas de act.ividade biológica no sistema de expre^ são recombinante. Estas podem em seguida, conforme descrito mais adiante, ser utilizadas num ensaio de ligação. As proteínas de fusão descritas são segregadas em células animais e podem ser purificadas facilmente a partir do sobrenadante da cultura por meio de eromatografia de afinidade, uma vez que se ligam através da sua fracção Fc à proteína A, a qual pode por sua vez ser acolada por exemplo a Sepharose. A síntese das proteínas de fusão pode também ter lugar em sistemas de expressão procarióticos (E. Coli, Pseudomonas, Bacillus, etc.) ou em leveduras (por exemplo Saccharomyces cerivisiae) usando vectores de expressão conhecidos apropriados. Para além da fracção Fc descrita preferida para a presente invenção (como suporte) podem acoplar-se de acordo com a presente = 3 = invenção também parceiros de fusão de qualquer outra proteína de suporte (por exemplo albumina, proteína A, proteína-B, transferase de glutatião S, nuclease de Staphylococcus aureus)
Para a realização do ensaio de ligação de receptores de acordo com a. presente invençaõ usa-se em primeiro lugar um anti-soro (ou anticorpo monoclonal) dirigido contra a fracção de suporte ou um outro agente apropriado para o revestimento de uma fase sólida, por exemplo uma placa de aná lise por ELISA. Uma vez que se' considera preferida para supor te a fracção Fc de um anticorpo e especialmente preferida a fracção de Fc de uma IgG1 humana, usa-se de preferência um soro de coelho dirigido contra o domínio de uma IgG1 humana. Em seguida ligam-se sobre a fase sólida pré-revestida as proteínas de fusão através da sua fracção de suporte.
Deste modo, os locais de ligação para os ligandos conservam-se acessíveis localizados sobre a fracção do receptor. A fim de poder detectar então os ligandos li gados, estes devem estar marcados. Esta marcação pode ser conseguida po.r exemplo por introdução de um nuclídeo radioactivo (por exemplo por introdução de um nuclídeo Siekierka, J.J. e DeGudicibus, S., Anal. Biochem. Vol. 172 (1988), 514-517), de preferência no entanto por biotinilação dos ligandos (King e Catino, Anal. Biochem. Vol. 188 (1990), 97-100). A detecção é por sua vez efectuada por meio de um conjugado de estreptavidina-enzima, de preferência por estreptavidima-peroxidase.
A realização do ensaio da presente invenção é descrita resumidamente na Figura 1.
Os ensaios de acordo com a presente invenção possuem amplas possibilidades de utilização, de que se apresentam seguidamente as preferidas e que fazem parte igualmente da presente invenção:
- Utilização em screening de receptores:
a) Receptor na fase sólida: Busca entre um grande número de substâncias para identifica íwa»»
ção de agonistas e antagonistas do ligando.
b) Ligando na fase sólida : Busca entre um grande número de substâncias para identificação de agonistas e antagonistas do receptor.
Utilização em screening de anticorpos:
Identificação de anticorpos que influenciam o metabolismo de ligandos e receptores.
Utilização para a análise quantitativa da actividade de ligação de formas de receptores solúveis.
- Utilização para a análise quantitativa da actividade biológica de ligandos específicos.
Análise funcional de ligandos modificados (muteinas) ou de fracções (por exemplo oligopeptideos) destes.
Identificação de substâncias que influenciam o metabolismo de oeganismos patogénicos (por exemplo vírus ou bactérias) com os seus receptores celulares.
Identificação de substâncias que influenciam o metabolismo de moléculas de adesão celular.
Os exemplos que se seguem destinam-se mais completamente a elucidar a presente invenção, que se encon tra, por outro lado, definida por meio das reivindicações.
Exemplo 1
Ensaio de ligação de IL-4 isento de células
A proteína IL-4RFc é conhecida da Patente DE P 4020 607.6. Esta proteína é constituída pela fracção extracelular do receptor humano para a IL-4 fundida à fracção Fc da cadeia pesada de uma molécula de IgG1 humana. Revestiram-se de um dia para o outro placas de análise por ELISA (Nunc, tipo B) a 4θ0 com 100/ul de um soro de coelho contra um
domínio CH2 de IgG huamna purificado por afinidade (Dakopatts). A concentração era de 10 /Ug/ml em PBS (NaCl 137 mM, KC1 2,7 mM, Na2HP04 6,1 mM, KH2PO4 3,9 mM, MgC12 0,5 mM, CaC12 0,1 mM, de pH 7,0). Após cinco lavagens com PBS contendo 0,05 $ de Tween 20 incubou-se a placa de análise com 275 ul de PBS contendo 5 $ de suco gástrico seco durante 60 min. à temperatura ambiente e em seguida lavou-se como anteriormente. Em segui da efectuou-se em primeiro lugar uma titulação de tabuleiro de xadrez” a fim de determinar uma combinação adequada das con centrações do receptor e do ligando para a realização do ensaio Para este fim, incubou-se em primeiro lugar durante 60 min. à temperatura ambiente a placa de análise com diferentes concentrações de proteína IL-4RFc purificada (100 /il) em meio de Eagle (modificado segundo Dulbecco) contendo 10 $ de sofco fetal de vitela (MEMD/SFV) e em seguida lavou-se como anteriormente. Biotinilou-se a IL-4 por meio de N-hidroxissuccinimida-biotina (Sigma) (Niendorf, A. et al., J. Histochem.· Cytochem. Vol. 34 (1986), 357-361) e ligou-se à placa de análise pré-incubada com IL-4RFc em diferentes concentrações em MEMD/ /sfv (100/ul) usualmente durante 60 min. à temperatura ambiente Após lavagem como anteriormente incubou-se durante 30 min. à temperatura ambiente com 100 ul de estreptavidina-peroxidase (Amersham; 1:250 em MEMD/SFV) e em seguida lavou-se como anteriormente. Efectuou-se a detecção da- peroxidase ligada por desenvolvimento de coloração em 100 /ul de solução de substrato de tetrametilbenzidina (Behringwerke). Após 30 min. de incubação à temperatura ambiente, determinou-se a extinção a 450 nm. Os resultados da experiência são apresentados na Figura 2. Obtiveram-se numerosas curvas típicas de ligação em função das quantidades utilizadas de receptor e de ligando. 0 sinal que reflete os ligandos ligados atinge um patamar que é tanto mais elevado quanto maior quantidade de receptor se utilizou para o revestimento da placa de análise. Para continuação da experiên cia com o ensaio competitivo apresentado esquematicamente na Figura 1 utilizou-se uma combinação de 300 ng/ml de IL-4RFc para o revestimento e 300 ng/ml de IL-4-biotina para a ligação.
= 6 =
Para o cálculo da concentração da IL-4-biotina como também dos ligantes apresentados nos exemplos 3 e 5 admitiu-se que todo o ligando utilizado para a biotinilação tinha sido realmente recuperado. A combinação usada deu um sinal (cerca de 2000 mU) que (i) pode ser medido com nitidez e (ii) que se situa antes de atingir o patamar para a concentração usada para o receptor. A fim de determinar a especificidade e a sensibilidade do ensaio, experimentou-se até que ponto diferentes ligandos podiam competir com a IL-4-biotina na ligação de IL-4RFc (Fig. 3). Para este fim utilizou-se uma concentração constante (300 ng/ml) de IL-4-biotina na presença de diferentes concentrações de IL-1-alfa, IL-3 e IL-4. A Fig. 3 mostra que apenas a IL-4 pode competir de modo activo, enquanto que a IL-1-alfa e a IL-3 nas concentrações utilizadas não apresentam qualquer aotividade de ligaçãõ. A concentração de IL-4 à qual se observa uma inibição semi-máxima da ligação de IL-4-biotina (IC50) é de 1 ng/ml.
Exemplo 2
Detecção de receptor de IL-4 solúvel no ensaio de ligação isen to de células
Pretendia-se verificar se com o ensaio se podia, para além da detecção de ligandos competitivos, detectaC também formas recombinantes solúveis de receptores.
Para este fim seleccionou-se a própria proteína IL-4RFc. A realização do ensaio foi idêntica à descrita no Exemplo 1,com a diferença de que depois da incubação das placas de análise com a concentração normal de IL-4RFc (300 ng/ml)·. se saturaram os locais de ligaçãõ' de Fc que tinham ficado livres por incubaçãõ com soro humano a 10 % em MEMB/SFV (60 min. à temperatura ambiente-). Em seguida efectuou-se o ensaio de ligação na presença de diferentes concentrações de IL-4RFc. A Figura 4 mostra que é realmente possível detecrtar a protéina IL-4RFc neste ensaio competitivo, enquanto que a proteína IL-7RFc, uma proteína de fusão do receptor humano da IL-7, não apresenta = 7 =
em 250 ng/ml.
Exemplo 3:
Ensaio de ligação de TNF isento de células
Isolou-se rapidamente ADNc da forma de 80 kD do receptor humano do RNF (Smith, C.A. et al., Science, Vol. 248 (1990), 1019-1023). Este ADNc codifica para uma proteína típica de membrana constituída por o domínio extracelular aminoterminal, uma região transmembrana e um domínio citoplasmático carboxiterminal. Na região de codificação· para o receptor do TNF situa-se imediatamente antes do codão para os cinco últimos resíduos de ácidos aminados da região extracelular um local de corte singular para a enzima de restrição PvuII. Cortou-se com PvuII o plasmídeo de expressão HuTNFRcavnot que contém o ADNc e ligou-se com adaptadores BamHI (5’ CGGATCCB 3’)· Em seguida digeriu-se ainda com Notl, que cortou imediatamente antes da região 3*enão traduzida do recep tor TNF. As extremidades reentrantes resultantes forma preenchidas por meioda enzima de Klenow e em seguida efectuou-se uma digestão com BamHI. 0 fragmento Notl (preenchido)/ /BamHI (~ 800 pb) codifica para todo o domínio extracelular do receptor do TNF (com excepção dos cinco resíduos d.e ácidos aminados imediatarnente antes da região'transmembrana) com um quadro de leitura livre desde o codão de iníeio até à sequência nucleotídica GAT contida na sequência de reconhecimento BamHI., que neste quadro de leitura codifica para um resíduo de asparagina. Este fragmento foi clonado no vector p4EGammaH descrito na patente de DE P 4020607. Para este fim digeriu-se o vector p4EGaammaH com HindIII, preencheram-se. as extremidades desalinhadas com a enzima de Klenow e em seguida digeriu-se novamente desta vez com BamHI. 0 plasmídeo de expressão obtido pTHFRFc codifica para a fracção extracelular do receptor de TNF acoplada por meio da região de charneira (hinge) à fracção Fc da cadeia pesada de uma IgG1 humana.
= 8 =
vector pTNFRFc é representado esquematicamente na Fig. 5 θ a sequência de ácidos aminados do TNFRFc codificado por aquele vector é representada na Fig. 6. 0 vector pTNFRFc foi transfec_ tada em células BHK e obtiveram-se elones estáveis após selecção dupla com metotrexato e G418 (EP-A Ο33θ 977)· As taxas típicas de expressão situam-se em cerca de 20 ug/ml de sobrenadan te, a partir do qual se isolou TNFRFc por meio de cromatografia sobre proteína A-Sepharose '(DE P 4020607.6). Conforme se descreve no Exemplo 1, efectuou-se em primeiro lugar com TNFRFc e TNF-alfa biotinilado uma titulação em tabuleiro de xadrês, a fim de definir as condiçSes adequadas para um ensaio de ligação. A Fig. 7 mostra uma série de curvas de ligação que foram obtidas nesta experiência. Para continuação da investigação seleccionou-se para a ligação a combinação de 200 ng/ml de TNFRFc para o revestimento e 20 ng/ml de TNF-alfa-biotina para a ligação de TNF tambm é sensível e específico para o TNF-alfa. Na Fig. 8 apresenta-se o resultado de um ensaio competitivo. Apenas o TNF-alfa inibe a ligação de TNF-alfa-biotina com uma IC50 de 5 ng/ml, enquanto que a IL-1-alfa, a IL-3, a IL-4 e o GM-CSF não apresentam qualquer efeito nas concentrações usadas.
Exemplo 4:
Detecção do receptor de TNF solúvel num ensaio de ligação isento de células
Esta experiência foi efectuada de forma análoga à descrita no Exemplo 2 (Fig. 9). 0 TNFRFc provoca uma inibição com uma IC50 de 35 ng/ml, enquanto que uma proteína de fusão do receptor da IL-1 humano e da fracção Fc de uma IgG1 humana não apresenta qualquer actividade inibitória.
Exemplo 5 :
Ensaio de ligação de GM-CSF isento de células
Isolou-se o ADNc para um receptor humano para o GM-CSF (Gearing, D.P. et al., Embo J. Vol. 8 (1989), = 9 =
3667-3676). 0 receptor do GM-CSF é uma proteína de membrana tí pica com um domínio extracelular aminoterminal, uma região trans membrana e um domínio intracelular carboxiterminal. Sintetizaram-se dois oligonucleótidos que podem hibridar com regiões na região não traduzida 5’ (oligonucleotido A : 5’AGCAGGTGGAAGGA
GAGGAAGCGG 3’) ou com a região não traduzida 3T (oligonucleótido B: 5’AAGAATGGGAACAGGCAGGCCTGGGC 3’)· Por amplificação do ADN plasmídico de um banco génico de ADNc de placenta humana (Simmons, D. e Seed, B. , Nature Vol. 333 ( 1988), 568-570) com polimerase de Taq-ADN termoestável obteve-se um fragmento de ADN (cerca de 1400 pb), que corresponde na sua dimensão ao ADNc do peceptor do GM-CSF. Por análise de restrição confirmou-se a identidade do fragmento de ADN amplificado. Após liga ção de adaptadores BstXI (Aruffo, A. e Seed, B. , Proc. Natl. 'Acad. Sei. USA Vol. 84, 8573-8577) incorporou-se o fragmento no vector de expressão eucariótica CDM8 tratado com BstXI (Seed B., Nature Vol. 329 (1987), 840-842). Na Fig. 10 representa-se esquematicamente o plasmídeo pCDM(GM-CSFR.
A fim de poder preparar uma fusão da Fc com o receptor de GM-CSF, efectuou-se uma nova amplificação de ADN com polimerase de Taq-ADN termostável em pCDM8.
Para este fim;, sintetizaram-se dois novos oligonocleótidos. 0 oligonucleotido C (5’GATCGATTAAGCTTAG AGGTGGAAGGAGAGGAAGCGGATGCCG 3’) hibrida com a região não traduzida 5’ e incorpora antes desta um local de corte HindIII e o oligonucleotido D (5’GCCATTGAATTTGGTTCTGAGGATCCAGATATGC 3’) híbrida com o ADNc antes da região de codificação para o domínio transmembrana de incorpora imediatamente antes desta um local de corte BamHI. Obteve-se o fragmento de 1131 previsto e após tratamento com BamHI e HindIII introduziu-se no vector p4EGammaH cortado com BamHI/HindIII foi obtido. 0 plasmídeo de expressão pGM-CSFRFc assim obtido codifica para a proteína de fusão GM-CSFRFc constituída pelo domínio extracelular do: receptor do GM-CSF, que se encontra acoplado através da região de charneira (hing) na fraeção Fede umá IgG1 humana. Nas
Figs. 11 e 12 representam-se o veetor pGM-CSFRFc e a sequência peptídica da proteína de fusão GM-CSFRFc.
Exprimiu-se o veetor pGM-CSFRFo transitoriamente em células COS. Para este fim transfectaram-se as células COS com o auxílio de dextrano-DEAE com o veetor pGM-CSFRFc (EP A 0325 262). Utilizaram-se os sobrenadantes para os ensaios de ligação de GM-CSF isento de células.
A Fig. 13 apresenta o resultado da titulação em tabuleiro de xadrês com GM-CSFRFc e GM-CSF biotinilado. Para continuação das investigações seleccionou-se a combina çâo de 1000 ng/ml de GM-CSFRFc para revestimetno e 150 ng/ml de GM-CSF-biotina para a ligação.
ensaio de ligação é especificado para o GM-CSF. Nas condições seleccionadas o GM-CSF não marcado inibe a ligação de GM-CSF com uma IC50 de 200 ng/ml, enquanto que o TNF-alfa, o G-CSF, a IL-1-alfa e a IL-4 nas concentrações utilizadas não apresentam qualquer actividade inibitória (Fig. 14).
Exemplo 6:
Caracterização de anticorpos monoclonais contra GM-CSF em ensaios de ligação dereceptores isento de células
Preparou-se uma série de diferentes anticorpos monoclonais contra o GM-CSF (Behringwerke). Usaram-se simultaneamente com GM-CSF-biotina no ensaio de ligação nas con dições descritas no Exemplo 5 (Fig. 15).
anticorpo monoclonal 699/779 inibea a ligação e é portanto dirigido muito provavelmente contra um receptor-epítopo de ligação de GM-CSF. Os anticorpos monoclonais 691/A40, 799/3, 3.G11, 932/453 bem como o anticorpo de oompa ração BMA031 (dirigido contra um receptor humano das células T) não inibem esta ligação. 0 anticorpo monoclonal 932/453 e em escala mais reduzida também o 691/A40 activam sim uma
aumento do sinal medido.
Legendas das Figuras
Legenda da Fig. 1:
Construção resumida do ensaio de ligação de receptores isento de células:
A) Ligou-se um receptor/suporte-proteína de fusão (3) a um anti-suporte-anticorpo (4) ou a outro agente apropriado sobre uma fase sólida. No local de ligação do receptor é possível ligar um ligando marcado (2), que por sua vez pode ser determinado através de um sistema de detecção/ /amplificação (1).
B) é possível detectar um ligando não marcado do receptor através da competição para o local de ligação 'do receptor .
C) é possível detectar um receptor solúvel através da competição para os ligandos marcados.
Legenda da Fig. 2:
Ensaio de ligação de IL-4 isento de células: Relação entre a ligação de IL-4-biotina e a concentração de IL-4RFc usada para o revestimento da placa de análise de ELISA.
Legenda da Fig. 3:
Ensaio de ligação de IL-4 isento de células:
Relação entre a ligação de IL-4-biotina e a concentração dos ligandos usados para a competição.
Legenda da Fig. 4:
Ensaio de ligação de IL-4 isento de células:
Relação entre a ligação de IL-4-biotina e a concentração de receptor/Fc-proteína de fusão usada para a competição.
Legenda da Fig. 5:
Construção esquemática do plasmídeo de expressão pTNFRFc.
Legenda da Fig. 6:
Sequência de ácidos aminados da proteína de fusão TNFRFc.
Legenda da Fig. 7:
Ensaio de ligação de TNF-alfa isento de células:
Relação entre a ligação de TNF-alfa-biotina e a concentração de TNFRFc usada para o revestimento da placa de análise de ELISA.
Legenda da Fig. 8:
Ensaio de ligação de TNF-alfa isento de células:
Relação entre a ligação de TNF-alfa-biotina e a concentração dos ligandos usados para a competição.
Legenda da Fig. 9:
Ensaio de ligação de TNF-alfa isento de células:
Relação entre a ligação de TNF-alfa-biotina e a concentração de receptor/Fc-proteína de fusão usada para a competição.
Legenda da Fig. 10:
Construção esquemática do plasmídeo de expressão pCDM8GM-CSFR.
Legenda da Fig. 11:
Construção esquemática do plasmídeo de expressão pGM-CSFRFc.
Legenda da Fig. 12:
Sequência de ácidos aminados da proteína de fusão GM-CSFRFc.
Legenda da Fig. 13s
Ensaio de ligação de GM-CSF isento de células:
Relação entre a ligação de GM-CSF-biotina e a concentração de GM-CSFRFc usada para o revestimento da placa de análise de
ELISA.
Legenda da Fig. 14:
Ensaio de ligação de GM-CSF isento de células:
Relação entre a ligação de GM-CSF-biotina e a concentração dos ligandos usados para a competição.
Legenda da Fig. 15:
Ensaio de ligação de GM-DSF isento de células:
Relação entre a ligação de GM-CSF-biotina e a concentração de anticorpo anti-GM-CSF usado para o ensaio de ligação.

Claims (1)

  1. = R E I VI NDI C AÇ ÕE S =
    - Processo para a realização de um ensaio de ligação caracterizado por (1) acoplar a uma fase sólida apropriada uma proteína de fusão recombinante (interveniente na ligação I) duma proteína de suporte por meio de um agente apropriado, de preferência um anti-soro ou um anticorpo monoclonal, com conservação da actividade de ligação da fracção fundida na proteína de fusão, e (2) marcar o outro interveniente de ligação II de modo apropriado para a medição da ligação.
    - 2§ Processo de acordo com a reivindicação 1 caracterizado por a fracção fundida na proteína de fusão recom binante ser um domínio extracelular de um receptor celular ou uma sua fracção.
    - 3- Processo de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por o receptor celular ser um receptor de uma citoquina.
    - 4ã Processo de aeordo com a reivindicação 2, caracterizado por o receptor celular ser um receptor de um factor de crescimento.
    _ 5ã Processo de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por o receptor celular ser um receptor de uma hor mona.
    - 6§ Processo de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por o receptor celular ser um receptor de um neurotransmissor.
    - 7ã _
    Processo de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por o receptor celular ser um receptor para um organismo patogénico ou uma sua fracção.
    - 8* Processo de aoordo com a reivindicação 1, caracterizado por a fracção fundida na proteína de fusão recombinante ser um domínio extracelular de uma molécula de adesão celular ou uma sua fracção.
    15 =
    Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a fracção fundida na proteína de fusão recombinante ser uma proteína solúvel ou uma sua fracção.
    _ 10* Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a proteína de suporte na proteína de fusão re combinante ser uma molécula de uma imunoglobulina ou uma sua fracção.
    - 11§ Processo de acordo com a reivindicação 10, caracterizado por a proteína de suporte na proteína de fusão recombinante ser a fracção constante da cadeia pesada de uma imunoglobulina ou uma sua fracção.
    - 12ã Processo de acordo com qualquer das reivin dicações 10 ou 11, caracterizado por a proteína de suporte na proteína de fusão recombinante ser a fracção constante da cadeia pesada da IgG 1 humana ou uma sua fracção.
    - 13â Processo de acordo com a reivindicação 1, em que se utiliza uma proteína de suporte numa proteína de fusão recombinante, caracterizado por a referida proteína de suporte não influenciar a actividade biológica da fracção fundida da proteína na fusão e por a proteína de fusão tornar possível uma purificação por meio de cromatografia de afinidade.
    - 14§ Processo de acordo com qualquer das reivin dicações 1 a 13, caracterizado por o interveniente de ligação (II) ser um ligando natural ou sintético de uma fracção de uma proteína de fusão de acordo com qualquer das reivindciações 2 a 9.
    _ 15i _
    Processo de acordo com qualquer das reivin dicações 1 a 14, caracterizado por o interveniente de ligação (II) ter uma marcação radioactiva e poder ser detectado por meio dessa marcação.
    - 16§ Processo de acordo com qualquer das reivin dicações 1 a 14, caracterizado por o interveniente de ligação (II) ser acoplado a um ligando de baixa massa molecular (por exemplo biotina) e em consequência poder ser detectado por meio de uma fase de reacção complementar.
    - 17^ Processo de acordo com qualquer das reivin dicações 1 a 14, caracterizado por o interveniente de ligação (II) ser acoplado a uma proteína dotada de actividade enzimática (por exemplo peroxidase, fosfatase alcalina ou luciferase) e poder ser detectado por meio dessa actividade enzimática.
    - 18^ Processo de acordo com a reivindicação 16, caracterizado por se utilizar para a fase de reacção complementar estreptavidina acoplada a peroxidase.
    - 19ã Processo para a identificação de agonistas ou antagonistas naturais ou sintéticos de cada acção recíproca caracterizado por se utilizar um ensaio de ligação de acordo con qualquer das reivindciações 1 a 18 para a selecção de receptores.
    - 205 Processo para a caracterização de anticorpos dirigidos contra um dos dois intervenientes de ligação caracterizado por se utilizar um ensaio de ligação de acordo com qualquer das reivindciações 1 a 18.
    - 215 Processo para a detecção de actividade bio lógica de receptores celulares solúveis caracterizado por se utilizar um ensaio de ligação de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 18.
    - 22^ _
    Processo para a detecção de actividade bi£ lógica de ligandos caracterizado por se utilizar um ensaio de ligação de acordo com qualquer das reivindciações 1 a 18.
    - 23- Processo para a análise funcional de ligandos modificados dirigidos ou de fracções destes caracterizado por se utilizar um ensaio de ligação de acordo com qualquer das reivindciações 1 a 18.
    - 245 Processo para a identificação de substâncias relevantes para diagnóstico ou terapia caracterizado por se utilizar um ensaio dé ligação de acordo com qualquer das
    18 = reivindicações 1 a 18.
    A requerente reivindica a prioridade do pedido alemão apresentado em 28 de Novembro de 1990, sob o número de série P 40 37 837-3.
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