PT99293A

PT99293A - Processo para a preparacao de proteinas e acidos nucleicos

Info

Publication number: PT99293A
Application number: PT99293A
Authority: PT
Inventors: Richard Mark Edwards; Keith Martyn Dawson; Anthony Fallon
Original assignee: British Bio Technology
Priority date: 1990-10-24
Filing date: 1991-10-22
Publication date: 1992-09-30
Also published as: AU8769791A; GB9023149D0; ZA918423B; IE913675A1; WO1992007874A1; NZ240307A

Description

Este invento diz respeito a proteínas tendo uma activi-dade farmacológica que pode ser aumentada pela posse de um local de afinidade para a integrina. Refere-se também a ácidos nuclei-cos que codificam tais proteínas. Em concretizações preferidas, o invento refere-se a proteínas tendo actividade antitrombótica, tal como hirudina, que tem uma sequência de afinidade para a integrina localizada no terminal carboxilo, e a ácidos nucleicos que codificam tais proteínas.

As hirudinas são polipéptidos que ocorrem naturalmente, de 65 ou 66 aminoácidos de comprimento que são produzidos pelo parasita Hirudo medicinalis. A hirudina é um agente anticoagulan-te que se liga à trombina e impede a coagulação do sangue inibindo a trombina de catalisar a conversão de fibrinogénio em fi-brina, impedindo assim a formação da estrutura de proteína dos coágulos sanguíneos. A ligação de hirudina também impede outras actividades protrombóticas da trombina, incluindo a activação dos factores V, VIII, XIII e plaquetas. Existem três variantes principais de hirudina (denominadas HV-1, HV-2 e HV-3), cujas sequências serão descritas pósteriormente. J-Y. Chang, FEB Letters 164, 307-313 (1983) descreve que o segmento do terminal-C de hirudina é essencial para a interacção hirudina-trombina. A remoção dos 5 aminoácidos do terminal-carboxilo pela digestão com protease reduz a actividade inibidora de trombina da hirudina em 92%. T.J. Rydel et al., Science 249: 277-280 (20 de Julho de 1990) descrevem a estrutura cristalina do complexo entre a hirudina recombinante e a trombina. Ele descreve que o segmento do terminal carboxilo da hirudina causa numerosas interacções electroestácticas com um sítio exterior de ligação a anião da trombina, que é uma extensão da fenda de sítio activo, dominada pelas cadeias laterais carregadas positivamente. A cauda do terminal carboxilo da hirudina adopta uma configuração extendida e longa no complexo e está firmemente fixa na extremidade do sítio exterior da trombina por contactos hidrofóbicos da região helicoidal 31() (Glu61-Glu65). Nove dos 11 resíduos finais do terminal carboxilo estão envolvidos nas interacções ao sítio exterior (Glu61 e Glu62 não estão envolvidos) terminando numa ponte salina entre o carboxilato de Glu65 com Lys36 de trombina. Descreve-se que o passo inicial do processo de formação do complexo pode centrar-se próximo da ligação da hélice 3^^ volumosa do terminal carboxilo no sítio exterior. H.G. Grutter et al., The EMBO Journal 9(8): 2361-5 (1990) descrevem investigações na estrutura cristalina do complexo trombina-hirudina. Descreve-se que a hirudina inibe a trombina por um mecanismo anteriormente não observado. Em contraste com outros inibidores das serina-proteases, a especificidade da hirudina não é devida à interacção com o receptáculo de especificidade primária da trombina, mas sim através da ligação a locais quer perto quer distantes do sítio activo. A ligação próxima ao sítio activo envolve os três resíduos do terminal amino da hirudina. A ligação a um sítio distante do sítio activo (o sítio exterior) envolve os resíduos do terminal carboxilo da hirudina. A cauda carboxilo da hirudina (resíduos 48-65) envolve-se à volta da trombina ao longo do local de ligação secundária de fibrinogé-nio, putativo, e causa um certo número de interacções iónicas e hidrofóbicas com a trombina nesta área. S.J.T. Mao et al., Biochemistrv 27, 8150-3 (1988) descrevem a inibição da trombina por fragmentos do terminal-C da hirudina. Descreve-se que um péptido compreendendo os 10 aminoá-cidos do terminal-C (S56-Q65) da hirudina inibe a polimerização induzida por trombina do fibrinogénio mas não inibe a proteólise catalisada por trombina dos substratos cromogénicos de tripépti-do. Isto indica que a região do terminal-C da hirudina se liga a um local não catalítico na trombina que está envolvido na inte-racção com o fibrinogénio. J.Y. Clang, Biochemistrv 30, 6656-61 (1991), descreve que os aminoácidos de terminal-C dos fragmentos do terminal-C da hirudina são essenciais para a actividade anticoagulante. A delecção de Q65 de Hir54-65 reduziu a actividade anticoagulante em 46% e a remoção de quer L64 quer Q65 reduziu a actividade em mais do que 96%. R.O. Hynes, Cell 48, 549-54 (1987) descreve as integri-nas como uma família de glicoproteínas de transmembrana que estão envolvidas nas interacções célula-célula ou célula-matriz. Têm sido descritas várias que se ligam a proteínas da matriz extra-celular em locais que incluem a sequência Arg Gly Asp (RGD). Estes incluem os receptores de fibronectina, vitronectina e fibrinogénio. Outras reacções de ligação integrina-ligando podem não envolver sequências RGD. 0 receptor de fibrinogénio, allb B3, (GpIIb/IIIa) liga-se ao fibrinogénio, fibronectina, vitronectina e ao factor de von Willebrand. Quando as plaquetas não são activadas, a glicoproteína da membrana da plaqueta GpIIb/IIIa não se liga ao fibrinogénio. Contudo, após a activação da plaqueta, a GpIIb/IIIa torna-se competente para se ligar ao fibrinogénio, um processo requerido para a agregação plaquetária. R.O. Hynes, Thromb. Haemostas. 66: 40-42 (1991) descreve as integrinas como uma família de proteínas de superfície de célula heterodimérica, cada uma composta por uma subunidade a e β. A integrina aIIb/B3, também conhecida como GPIIb/IIIa, liga-se ao fibrinogénio, fibronectina, factor de von Willebrand e vitronectina. A integrina a553 liga-se aos mesmos ligandos e também à trombospondina. A integrina a2Bl (GPIa/IIa) liga-se ao colagénio e à laminina. E. Ruoslahti e H.D. Pierschbacher, Science 238, 491-7 (1987) descrevem que a conformação da sequência de RGD em proteínas individuais é crítica para o reconhecimento pelas integri-nas. Muitas proteínas contêm sequências RGD mas a maioria delas não são provavelmente reconhecidas pelos receptores de superfície de célula dirigidos a RGD. Uma sequência RGD inactiva pode não estar disponível na superfície da molécula que a contém, ou, se disponível, a sua conformação pode estar assim restringida pela estrutura secundária e terciária da proteína de forma a que não se encaixe em qualquer um dos receptores. A. Andrieux et ai.. J. Biol. Chem. 264, 9258-65 (1989) descrevem que a cadeia A a de fibrinogénio tem duas sequências RGD; A a 572-5, RGDS, e A α 95-8, RGDF, mas que só a sequência RGDF se liga à Gp Ilb/IIIa. Como ambos os péptidos livres RGDS e RGDF se podem ligar à Gp Ilb/IIIa sugere-se que as sequências que rodeiam a RGDF, mas não a RGDS, no fibrinogénio possam proporcionar a restrição estrutural necessária para uma orientação apropriada da RGD tal que esta se possa ligar â Gp Ilb/IIIa. A. Hautanen et_al., J. Biol. Chem. 264, 1437-1442 (1989) descrevem que o receptor de fibronectina só se liga à fibronectina e não às proteínas contendo RGD, vibronectina, a2-glicoproteína Zn e proteína Tamm-Horsfall. T. Maeda et_al., J. Biol. Chem. 264, 15165-8 (1989) descrevem a inserção de um heptapéptido contendo RGDS (SLRGDSA) numa forma truncada de Proteína A utilizando a mutagénese in vitro. Isto é alcançado pela inserção de ácido nucleico que codifica a sequência heptapeptídica num dos locais HindIII no 6 vector de expressão plasmídica pRIT2T. A Proteína A resultante possui a sequência SLRGDSA na porção média da proteína de Proteína A truncada, e adquiriu a propriedade do péptido RGDS de ligação aos receptores de ligação celulares.

Contudo, K. Sekiguchi et al., Protein Enaineerinq 3:298 (1990) descrevem que o contexto no qual a sequência RGDS está presente na Proteína A truncada tem um efeito maior na actividade de ligação celular da molécula. As variantes de Proteína A com as sequências inseridas, YAVTGRGD SPAS SK e RGDSPASSKPISIN tinham ligeiramente menos actividade de ligação a célula do que a variante com a sequência SLRGDSA enquanto que uma variante com a inserção YTITVYAVTGRGDS tinha só uma fraca actividade de ligação a célula. As variantes de Proteína A possuem uma sequência RGDS numa porção média da Proteína A. R.J. Shebuski et al., Thromb. Haem. 61, 183-8 (1989), descrevem que o péptido Ac-RGDS-NH2 se pode ligar ao receptor GpIIb/IIIa de plaquetas e inibir a agregação de plaquetas in vitro. 0 péptido Ac-RGDS-NH2 pode também inibir a formação de trombos dependentes de plaquetas nas artérias coronárias de cão quando administrado em doses elevadas por infusão intracoronária directa. Contudo, a actividade do péptido está limitada pela sua rápida depuração e a formação de trombo ocorre rapidamente após paragem da infusão. A US-A-4703039 descreve um processo para prolongar o tempo de vida circulatório de péptidos contendo uma sequência tal como RGDS conjugando-os quimicamente para transportar macromolé-culas (por exemplo, albumina) que tem a propriedade de um tempo de vida prolongado dentro do sistema circulatório. A EP-A-0333356 (Biogen, Inc.) descreve péptidos que são de 8 a 26 aminoácidos de comprimento e homólogos a pelo menos uma porção dos 26 aminoácidos do terminal carboxilo da hirudina nativa. Tais análogos podem ter uma AsP53 °u Asn53 substituída por um resíduo de arginina de modo que o péptido contenha uma sequência (RGD) Ar g53-G1Υ54“AsP55 que se pode ligar a uma glico-proteína de superfície de plaqueta (GpIIb/IIIa) e impedir a agregação de plaquetas independentemente da acção inibidora da trombina do péptido. A sequência RGD pode por conseguinte alvejar o péptido hirudina para plaquetas activadas. Um exemplo de um tal péptido que é preparado é N-acetil-Arg53 hirudina53_g4. Contudo, estes péptidos pequenos são menos activos do que a proteína de sequência completa (hirudina natural) e têm tempos de vida plasmáticos menores. F.C. Church et al., J. Biol. Chem. 266: 11975-11979 (1991) descrevem um péptido quimérico artificial que contém uma sequência RGD acoplada ao terminal amino de um fragmento de terminal carboxilo da hirudina (resíduos 53-64) . 0 componente hirudina era activo visto que o péptido inibia a trombina e o componente RGD era funcional visto que o péptido inibia a aderência da célula mediada por integrina. Contudo, sabe-se que os péptidos de terminal-C da hirudina são menos activos do que a proteína de sequência completa. A EP-A-0332533 (Transgene SA) descreve variantes hirudina que podem ter a sequência RGDS introduzida numa porção central da molécula, por exemplo a hirudina com as variantes Arg33, Asp35 e Ser3g. São também descritas variantes hirudina que têm o terminal-C da molécula modificado pela adição de aminoácidos, por exemplo prolina (tal como a introdução de Pro--) de

OO forma a impedir a degradação pelas carboxipeptidases, na expressão.

Sabe-se assim que a região de terminal carboxilo da hirudina é essencial para a sua interacção com a trombina e, por consequência, também para a sua actividade anti-trombótica. Sabe-se também que a presença de uma sequência RGD numa proteína pode ou não conferir àquela proteína a capacidade de se ligar a uma integrina: não é normalmente possível prever se uma sequência de ligação à integrina, tal como RGD, numa proteína será capaz de se ligar a uma integrina.

Sabe-se também que a eficácia farmacológica da hirudina e de muitas outras proteínas e suas variantes é dependente da dose e limitada pela sua frequente curta duração de acção causada pela rápida depuração da circulação. Isto é particularmente verdade para a hirudina que tem uma curta semi-vida plasmática devido à rápida depuração renal (Markwardt et al., Thrombosis Research 52: 393-400 (1988)). Kelly et al.. Blood 77: 1006-12 (1991), calcularam que a semi-vida da hirudina era de 4-5 minutos em babuínos e descobriram que a infusão intravenosa era necessária para inibir os processos trombóticos dependentes das plaquetas. Por consequência, de forma a produzir uma actividade farmacológica prolongada, por exemplo, uma actividade anti-trombótica como é geralmente desejável, a proteína deve ser administrada por infusão intravenosa contínua ou por injecçóes subcutâneas repetidas. Nenhum destes modos de administração é desejável. Há, por consequência, uma necessidade geral para aumentar a duração de acção da proteína ou suas variantes, que pode resultar na necessidade de uma dosagem inferior. Isto pode ser alcançado por aumento do tempo de permanência (ou da vida plasmática) da proteína no corpo.

De acordo com um primeiro aspecto do presente invento é fornecida uma proteína compreendendo um primeiro péptido tendo actividade farmacológica, e um segundo péptido de não mais do que quinze aminoácidos de comprimento, estando o segundo péptido localizado no terminal carboxilo da proteína e compreendendo uma sequência de afinidade para a integrina, sendo a proteína diferente de uma proteína que possui naturalmente uma sequência de afinidade para a integrina no terminal carboxilo.

Os Requerentes descobriram que a colocação de uma sequência de afinidade para a integrina no terminal carboxilo da proteína pode aumentar surpreendentemente a duração de acção da proteína, sem afectar significativamente a actividade biológica da proteína, que pode permitir menos e/ou menores doses da proteína a ser administrada. A duração de acção aumentada alcançada pode também permitir a administração da proteína por bólus intravenoso em vez de infusão.

Os Requerentes descobriram também que o fornecimento da sequência de afinidade para a integrina ao terminal carboxilo pode também impedir a degradação da proteína pelas carboxipepti-dases quando a proteína é expressa em células hospedeiras transformadas, melhorando ainda nas técnicas preparativas existentes. Assim, por exemplo, se a proteína for sintetizada pela tecnologia de DNA recombinante em células de levedura transformadas, não há necessidade de utilizar mutantes deficientes na actividade de carboxipeptidase.

Estas vantagens podem ser compreendidas apesar do facto de se saber que o terminal carboxilo da hirudina desempenha um papel crucial na interacção com a trombina (ver Chang, Rydel et al., Grutter et al. e Mao et al., supra). O primeiro péptido pode ser uma proteína que ocorre naturalmente ou um seu fragmento, por exemplo uma proteína anti-trombótica tal como um péptido anticoagulante marcado, antiestasina (uma proteína parasita) e em particular hirudina. Outras proteínas que ocorrem naturalmente incluem uma proteína fibrinolítica tal como o activador do plasminogénio do tecido (t-PA), uroquinase ou estreptoquinase; uma forma solúvel de um receptor de superfície de célula utilizado como um receptor por um vírus tal como CD4 solúvel; uma forma solúvel de um receptor de superfície de célula tal como citocina, factor de crescimento, imunoglobulina e/ou receptor do complemento; um factor de crescimento tal como factor de crescimento epidermal; um factor estimulante de colónias (por exemplo, GM-CSF ou G-CSF); uma citocina tal como interleucina-1; um inibidor da citocina tal como inibi-dor da IL-l; uma hormona tal como a hormona do crescimento; um antigénio tal como um antigénio de HIV (por exemplo, HIV p24); uma forma solúvel de uma adesina tal como ELAM; uma enzima tal como asparaginase; um inibidor enzimático tal como antitripsina alfa-1; um factor de coagulação do sangue tal como o factor VII; um neuropéptido tal como o polipéptido intestinal vasoactivo; ou uma quinina tal como bradiquinina. Verificar-se-á que esta lista não é exaustiva mas meramente exemplificativa.

Alternativamente, o primeiro péptido pode ser uma variante de uma proteína que ocorre naturalmente ou de um seu fragmento, que pode diferir estruturalmente, mas ter uma activi-dade biológica similar a uma proteína que ocorre naturalmente tal como aquelas registadas acima. O primeiro péptido pode também incluir uma proteína não natural construída por elaboração de proteínas cuja actividade farmacológica pode ou não ser similar â das proteínas naturais dadas.

Pelo termo "fragmento", quando em relação a um fragmento de um péptido, quer-se dizer uma porção daquele péptido que mantém substancialmente, pelo menos, uma (e preferivelmente toda) actividade daquele péptido. (

Por "variante" quer-se dizer um polipéptido tendo um ou mais aminoácidos substituídos, adicionados ou deleccionados de modo que a variante mantenha substancialmente, pelo menos, uma e preferivelmente toda a actividade daquele péptido. Preferivelmente, não é significativamente alterada, a sequência de aminoácidos do primeiro péptido ou de um seu fragmento.

Por "actividade farmacológica" quer-se dizer que o primeiro péptido induz um efeito farmacológico no humano ou animal ao qual a proteína é administrada. As sequências de proteína que não induzem qualquer resposta biológica ou reacção biológica ou química não estão incluídas nesta definição.

As actividades farmacológicas preferidas incluem actividades antitrombóticas e fibrinolíticas, assim como actividades hormonais, de factor de crescimento e antigênicas. 0 invento tem particular aplicação na preparação de proteínas antitrombóticas com vidas plasmãticas aumentadas e, assim, o primeiro péptido tem preferivelmente actividade anti-trombótica. Nesta concretização a proteína do presente invento pode proporcionar assim um efeito antitrombõtico desejado e como resultado da presença da sequência de afinidade para a integrina pode aumentar a vida plasmática da proteína, e também o período de tempo durante o qual a proteína é activa e, por consequência, inibir a coagulação do sangue. A presença da sequência de afinidade para a integrina pode proporcionar uma vantagem adicional visto que pode servir para alvejar a proteína no local de um coágulo sanguíneo por 12 ligação das plaquetas presentes num tal coágulo, por exemplo por ligação a um receptor tal como à integrina GpIIb/IIIa que está exposta aos coágulos de sangue na superfície das plaquetas activadas. Esta ligação pode tornar assim mais eficazes na sua actividade antitrombõtica tais proteínas do presente invento e pode reduzir a quantidade de proteína que necessita de ser administrada de forma a proporcionar o nível desejado de inibição (ou mesmo prevenção) da coagulação sanguínea. A sequência de afinidade para a integrina será geralmente capaz de se ligar a uma integrina. 0 termo "integrina*' inclui receptores (tais como receptores de superfície de célula) e outras glicoproteínas capazes de interagir com ligandos. São especificamente contemplados os receptores de adesão à superfície de célula que podem ser capazes de mediar a interacção célula-célula e/ou célula-matriz extracelular.

Os receptores adequados incluem GpIIb/IIIa, receptor da vitronectina, receptor da fibronectina, receptor do fibrinogénio, receptor da laminina, receptor do colagénio e receptor de von Willebrand. A sequência de afinidade para a integrina será geralmente capaz de se ligar a uma célula endotelial e/ou a uma plaqueta (por exemplo uma plaqueta activada). São também preferidas as sequências de afinidade para a integrina que compreendem a sequência RGD (ou outras sequências, que serão explicadas mais tarde) e/ou são específicas para integrinas que ligam ligandos possuindo a sequência de aminoáci-dos RGD ou outras sequências. Para a sequência RGD (ou outras sequências) são exemplos de tais integrinas os receptores da fibronectina, do fibrogénio, da vitronectina e do factor de von Willebrand. Outras sequências que podem ser utilizadas em vez de RGD na sequência de afinidade para a integrina e que estão no 13 âmbito do presente invento incluem derivados da sequência RGD (tal como sequências RGD prolongadas) e sequências onde os aminoácidos foram substituídos ou invertidos e que são capazes de ligar integrinas. As sequências adequadas incluem: 1. HHLGGAKQAGDV (SEQ.ID:7), uma sequência de afinidade para a integrina de plaqueta de cadeia gama de fibrinogénio (400-411) (Kloczewiak et al.. Biochemistrv 23: 1767-74 (1984)); 2. GRGDSP (SEQ.ID:8), uma sequência de afinidade para a integrina de fibronectina (A. Hautenen et al., supra); 3. KNQDK (SEQ.ID:9), uma sequência de caseína kapa (EP-A-343085); 4. SGDR (SEQ.ID:47), uma sequência "invertida" (K.M. Yamada e D.W. Kennedy, J. Cellular Phvsiolocrv 130: 21-28 (1987)); 5. HGDF (SEQ.ID:48) e/ou HQAGDV (SEQ.ID:10) (sequências substituídas, ver Yamada K.M. e Kennedy D.W., supra e Tranqui L. et al.. J. Cell. Biol. 108: 2519-25 (1989)); 6. DGEA (SEQ.ID:20), a sequência de reconhecimento mínima do colagénio requerido para se ligar ao receptor do colagénio a2Bl (Staatz et al.. J. Biol. Chem. 266: 7363-7367 (1991)); 7. GREDV (SEQ.ID:45) e REDV (SEQ:2l) sendo a última uma sequência de afinidade para a integrina de fibronectina alternativa (Hubbell et al.. Bio/technoloav 9: 568-572 (1991)); 1'

8. KGDW (SEQ.ID:22), uma sequência de afinidade selec-tiva para GpIIb-IIIa da barburina de veneno de cobra (Scarborough et al.. J. Biol. Chem. 266: 9359-9362 (1991)); 9. CKGDWPC (SEQ.ID:23) e/OU CRGDWPC (SEQ.IDS24), que l são sequências peptídicas cíclicas nas quais os dois resíduos de cisteína estão covalentemente ligados um ao outro por uma ligação dissulfureto. Os péptidos RGD cíclicos ligam-se quer ao receptor GPIIb-IIIa quer ao receptor da vitronectina enquanto que os ^ péptidos KGD cíclicos se ligam aos receptores GPIIIb-llla mas não aos receptores da vitronectina (WO-A-90/15620); ou 10. GKDGEA (SEQ.ID:46).

Contudo, devia-se compreender que a sequência de afinidade para a integrina pode ser capaz de se ligar âs integri-nas que não são específicas para as sequências RGD. Um exemplo é a integrina Mac-1. Esta integrina é uma integrina restringida por leucócitos capaz de se ligar ao fibrinogénio (de uma maneira dependente de RGD) num local de reconhecimento no fibrinogénio não compartilhado com outras integrinas que se sabe funcionarem como receptores do fibrinogénio (Alteiri D.C. et al., J. Biol. | Chem. 265: 12119-12122 (1990)). A sequência de afinidade para a integrina é preferivelmente adequada para se ligar a uma integrina, tal como o receptor da fibronectina, do colagénio ou do fibrinogénio. Estes receptores são glicoproteínas que se encontram na superfície das células endoteliais e plaquetas. Uma sequência de afinidade para a integrina preferida compreende a sequência -RGDX onde X não representa nada ou representa um qualquer aminoácido. É preferível que X represente S, F, W ou V; S é o resíduo de aminoácido de escolha. Observar-se-á assim que a sequência de afinidade para a integrina tem preferivelmente, pelo menos, três (tal como RGD) e frequentemente quatro (tal como RGDS, RGDF, RGDV, RGDW, SGDR, DGEA, REDV e/ou KGDW) aminoácidos de comprimento. A sequência completa da hirudina dos tipos HV-1, HV-2 e HV-3 cada um com um -RDGS no terminal carboxilo é dada como SEQ.ID:l-3, respectiva-mente. Contudo, verificar-se-á que uma tal sequência pode ser uma sequeNencia de doze aminoácidos (por exemplo, HHLGGAKQAGDV, SEQ.ID:7), uma sequência de cinco aminoácidos (por exemplo, -RGDX X , onde X e X representam independentemente um do outro o mesmo que X) ou uma sequência de seis aminoácidos (por exemplo, GRGDSP (SEQ.ID:8), KQAGDV (SEQ.ID:18), CKGDWPC (SEQ.ID:23), GKDGEA (SEQ.ID:46) e/ou CRGDWPC (SEQ.ID:24)). São, contudo, contempladas sequências de afinidade para a integrina, maiores, tais como HHLGGAKQAGDV (SEQ.ID:7).

Assim, verificar-se-á que a sequência de afinidade para a integrina tem preferivelmente 3 ou 4 a 12 ou 15 aminoácidos de comprimento.

Nas concretizações particularmente preferidas o segundo péptido é (i.e. ele consiste só em) a sequência de afinidade para a integrina, embora isto não seja essencial. 0 segundo peptídeo é 15 ou menos, tal como 12 ou menos e, de preferência, não mais do que 6, aminoácidos de comprimento.

As proteínas que não estão incluídas no presente invento são aquelas que, na sua forma natural, possuem uma sequência de afinidade para a integrina no seu terminal carboxilo. Contudo, o invento pode também excluir qualquer proteína que possua naturalmente uma sequência de afinidade para a integrina (em qualquer lado da proteína), nalgumas concretizações. Tais proteínas podem ser coagulantes (do sangue) ou promover a formação do coágulo sanguíneo. Elas podem ter também a sequência de afinidade para a integrina HHLGGAKQAGDV (SEQ.ID:7). Um exemplo desta é o fibrinogénio.

Será evidente que a proteína pode ter uma(s) sequência (s) de péptido(s) adicional(adicionais) colocada(s) ou no terminal amino do primeiro péptido e/ou entre o primeiro e segundo péptidos.

Verificar-se-á que o primeiro e segundo péptidos estão separados e não se sobrepõem: isto é o mesmo que dizer que um dos péptidos não inclui o outro. Assim, as proteínas preferidas do presente pedido de patente podem ter a fórmula geral seguinte: <Ja)n - Pep1 - <Jb)m - Pep2 I em que: cada Ja e J13 representam individualmente um aminoácido (ou uma sequência de aminoácido) que pode ser o mesmo ou diferente; 1

Pep representa o primeiro péptido tendo actividade farmacológica, tal como antitrombótica; 15 aminoácidos de afinidade para a 2

Pep representa o segundo péptido, até comprimento, compreendendo uma sequência de integrina; e cada um de n e m representa individualmente números inteiros que podem ser o mesmo ou diferentes, tendo valores de 0 a 1000.

Verificar-se-á que a proteína de fórmula I inclui, assim, as três proteínas seguintes tendo as fórmulas gerais:

(Ja) - Pep1 1 2 - Pep2 II pep - Pep III - Pep2 IV

Podem ser preferidas as proteínas da fórmula geral III.

Os pêptidos (Ja)n e (J13) podem ser quaisquer sequências peptídicas adequadas, de qualquer comprimento adequado, de um dos aminoácidos acima, desde que não interfiram substancialmente com, ou inibam, a afinidade para a integrina do segundo péptido (Pep ). Prefere-se também que não interfiram com, ou inibam, a actividade farmacológica do primeiro péptido (Pep1). Assim, n e/ou m têm preferivelmente um valor de 0 até 10, 50, 100

a K ou mesmo 1000. (J )n e/ou (J ) podem ter, eles próprios, actividade antitrombótica, e podem ser assim um péptido como definido para o primeiro péptido (Pep ) .

Alternativa ou adicionalmente, (Ja)n e/ou (J °)m podem compreender uma sequência de afinidade para a integrina como definida para o segundo péptido (Pep ). Assim, numa concretização, (Ja)n e/°u (jb)m podem representar individualmente um polipéptido que ocorre naturalmente, ou uma variante, ou um seu fragmento, tendo uma sequência de afinidade para a integrina como discutido acima, ou podem representar a fibronectina (ou um seu fragmento).

Se a proteína tiver uma ou mais sequências de afinidade 2 para a integrina adicionalmente a Pep , então uma destas sequências é preferivelmente fornecida no terminal N quer de (Ja)n quer de Pep1.

Se (Ja)n for fornecido com uma sequência de afinidade para a integrina, então este pode ser fornecido no terminal N. 18

Nesta situação, prefere-se que a proteína não contenha hirudina (ou uma sua variante ou fragmento). O primeiro pêptido (Pep1) pode ser de um qualquer tamanho adequado desde que possua actividade farmacológica. Contudo, prefere-se que o primeiro péptido tenha preferivelmente, pelo menos, 6 (tal como, pelo menos 8) aminoácidos de comprimento.

Nesta descrição o termo "actividade antitrombótica" em relação aos péptidos deve ser interpretado como aquela actividade possuída pelos péptidos que são capazes de pelo menos proibir parcialmente, ou reduzir, a coagulação sanguínea; esta actividade é de outro modo conhecida como actividade anticoagulante. Os péptidos preferidos têm actividade antitrombõtica. Por consequência, eles podem ser inibidores da trombina, isto é, eles são capazes de se ligar à trombina de modo a que a trombina não catalise a conversão do fibrinogénio a fibrina. Tais péptidos irão também inibir, ou impedir, normalmente a activação dos factores V, VIII, XIII e plaquetas. 0 primeiro péptido, se tiver actividade antitrombótica, é preferivelmente um péptido antitrombótico que ocorre naturalmente ou um seu fragmento (que mantém actividade antitrombótica). A hirudina é o péptido preferido. 0 fragmento pode ser de um qualquer comprimento adequado desde que tenha actividade anti-trombotica. Um tal fragmento pode ser, por exemplo, um fragmento de 12 a 26 aminoácidos de comprimento. 0 fragmento corresponde preferivelmente a, ou é substancialmente homólogo a, pelo menos uma porção dos 26 aminoácidos do terminal carboxilo de uma proteína que ocorre naturalmente, tais como os 26 aminoácidos do terminal carboxilo da hirudina. 19

Alternativamente, o fragmento pode corresponder a, ou ser substancialmente homólogo a, pelo menos uma porção do terminal amino da proteína que ocorre naturalmente; isto é, alguns aminoácidos do terminal N podem ser deleccionados embora o fragmento mantenha actividade antitrombótica. contudo, prefere-se a sequência de comprimento total nativa do péptido que ocorre naturalmente. Para a hirudina esta será de 65 ou 66 aminoácidos de comprimento.

Os tipos preferidos de hirudina incluem HV-1, HV-2 e HV-3. Quer o HV-1 quer o HV-2 contêm 65 aminoácidos, enquanto que o HV-3 tem 66.

Nesta descrição, para além da secção de listagem de sequências, o código de uma letra será frequentemente utilizado para indicar o aminoácido, e para segurança de referência os códigos de uma letra dos aminoácidos são como se segue: >

Abreviatura Símbolo

Aminoácido de três letras de uma letra

Alanina Ala A Arginina Arg R Asparagina Asn N Ácido aspártico Asp D Asparagina ou ácido aspártico Asx B Cisteína Cys C Glutamina Gin Q Ácido glutâmico Glu E Glutamina ou ácido glutâmico Glx Z Glicina Gly G Histidina His H Isoleucina Ile I Leucina Leu L Lisina Lys K Metionina Met M Fenilalanina Phe F Prolina Pro P Serina Ser S Treonina Thr T Triptofano Trp W Tirosina Tyr Y Valina Vai V 0 invento contempla também uma proteína compreendendo um primeiro péptido tendo actividade farmacológica e uma sequência de afinidade para a integrina localizada no terminal carboxi-lo do primeiro péptido, diferente de uma proteína que possui naturalmente uma sequência de afinidade para a integrina no terminal carboxilo.

As proteínas de acordo com o primeiro aspecto do invento podem ser preparadas por qualquer processo adequado. A tecnologia de DNA recombinante proporciona os processos de escolha.

De acordo com um segundo aspecto do presente invento é fornecido um ácido nucleico (que pode ser RNA ou, preferivelmente, DNA) que codifica uma proteína do primeiro aspecto. Tal ácido nucleico é preferivelmente ácido nucleico recombinante e/ou isolado. O ácido nucleico pode estar na forma de um vector, tal como um plasmídeo, cosmídeo ou vírus, e nalgumas concretizações está numa forma expressável. Assim, um terceiro aspecto do presente invento refere-se a um vector compreendendo o ácido nucleico do segundo aspecto. O invento estende-se também a células hospedeiras que incluem células de mamíferos ou outros animais tais como células de insectos, mas preferivelmente organismos unicelulares, que contêm e expressam preferivelmente, ou são capazes de expressar, o ácido nucleico do segundo aspecto. Assim, um quarto aspecto do presente invento refere-se a um hospedeiro transformado com um vector do terceiro aspecto. Os hospedeiros unicelulares podem ser células eucarióticas ou procarióticas e são preferivelmente células de mamíferos ou leveduras (tais como do género Saccharo-mvces ou Pichia). Um hospedeiro particularmente preferido é a levedura das espécies Saccharomvces cerevisiae e/ou Pichia pastoris. O hospedeiro não necessita de ser uma célula mutánte, por exemplo, célula de levedura mutante com reduzida, ou sem, actividade carboxipeptidase. Podem ser utilizadas leveduras não mutantes uma vez que a sequência de afinidade para a integrina pode impedir a degradação da proteína por quaisquer carboxipepti-dases presentes. 0 ácido nucleico do segundo aspecto pode ser preparado por síntese química. Por exemplo, pode ser preparado um grande número (por exemplo, um número par tal como 8-14) de oligonu-cleótidos, preferivelmente por síntese química, e depois união destes (adequadamente por quinase dos pares de oligonucleótidos e ligação dos pares).

Alternativamente, o ácido nucleico pode ser preparado utilizando a mutagênese dirigida ao local. Um iniciador de ácido nucleico contendo a mutação pode ser desnaturado/renaturado ao ácido nucleico matriz que contém o ácido nucleico que codifica a proteína do primeiro aspecto. Apôs preparação do ácido nucleico complementar para dar o ácido nucleico de cadeia dupla, a cadeia contendo o iniciador pode ser utilizada para preparar o ácido nucleico de cadeia dupla para inserção num vector (preferivelmente um vector de expressão). O vector é preferivelmente capaz de replicar quer em E. coli quer em levedura (por exemplo, Saccharomvces cerevisiael. Adequadamente, o vector tem um marcador seleccionável para manutenção no hospedeiro de levedura (por exemplo, o gene leu2) e/ou um lôcus resistente à ampicilina. O vector tem também preferivelmente um promotor, por exemplo, o promotor GAL-10 e/ou PGK, para expressão. Um vector adequado é o pSW6 (N2 de Acesso NCIMB 40326) ou pJKl. 0 hospedeiro preferido é Saccharomvces cerevisiae.

Como indicado acima, as proteínas do invento são úteis em medicina. De acordo com um quinto aspecto do presente invento, é fornecida uma proteína de acordo com o primeiro aspecto para 23

utilização em medicina humana ou veterinária, por exemplo, particularmente como um agente antitrombotico.

De acordo com um sexto aspecto do invento, é fornecida uma composição farmacêutica compreendendo uma ou mais das proteínas de acordo com o primeiro aspecto do invento e um veículo farmacêutica ou veterinariamente aceitável. Uma tal composição pode ser adaptada para administração intravenosa e, por consequência, pode ser estéril. Os exemplos de composições de acordo com o invento incluem as preparações de proteína(s) estéril(estéreis) do primeiro aspecto em solução salina fisiológica isotónica e/ou tampão. A composição pode incluir um anestésico local para aliviar a dor de injecção.

As proteínas do invento podem ser fornecidas na forma de dosagem unitária, por exemplo como um pó seco ou concentrado isento de água num recipiente hermeticamente selado tal como uma ampola ou saqueta que indica a quantidade de proteína em unidades de actividade. Estas unidades podem ser, por exemplo, unidades antitrombina (ATUs), se a proteína tiver actividade antitrombóti-ca. Onde a proteína do primeiro aspecto é para ser administrada por infusão, ela pode ser dispensada por meio de uma frasco de infusão contendo água estéril para injecção ou solução salina. Onde é para ser administrada por injecção, ela pode ser dispensada com uma ampola de água para injecção ou solução salina. A composição para infusão ou injecção pode ser preparada por mistura dos ingredientes antes da administração. A quantidade de proteína a ser administrada vai depender do efeito requerido, tal como a quantidade de antitrombose, da velocidade de acção requerida e da gravidade de uma condição de um paciente (por exemplo, em termos da extenção de coagulação, quer no número quer no tamanho dos coágulos) . A dose exacta a ser administrada será determinada pelo médico, por causa da própria natureza da condição que as proteínas do invento se destinam a tratar. Contudo, como guia, um paciente a ser tratado no tratamento antitrombótico pode receber geralmente uma dose diária de 500 a 50000 ATUs/kg de peso corporal, por exemplo cerca de 10000 ATUs/kg, quer por injecção até, por exemplo, cinco doses, quer por infusão. O invento pode ser utilizado num processo para o tratamento ou profilaxia de um humano ou animal, tal como doença ou desordem trombótica, compreendendo o processo a administração de uma quantidade não tóxica eficaz de uma proteína do primeiro aspecto. Assim, as proteínas do presente invento podem ter utilização no tratamento de doenças que são causadas quer pela oclusão parcial quer pela oclusão total de um vaso sanguíneo por um coágulo de sangue, por exemplo doenças vasculares tais como enfarte do miocãrdio, apoplexia, embolia pulmonar, trombose das veias profundas, oclusão das artérias periféricas e outras tromboses do sistema sanguíneo.

De acordo com um sétimo aspecto do invento, é, por consequência, proporcionada a utilização de uma proteína do primeiro aspecto na preparação de um medicamento, tal como um agente antitrombótico.

De acordo com um oitavo aspecto do invento, é fornecido um processo para a preparação de uma proteína de acordo com o primeiro aspecto, compreendendo o processo o acoplamento sucessivo de resíduos de aminoãcidos e/ou oligo- e/ou polipéptidos, em conjunto. Isto pode ser realizado por síntese química, mas faz-se preferivelmente por tradução de um ácido nucleico do segundo aspecto in vivo.

De acordo com um nono aspecto do presente invento, é fornecido um processo para a preparação de um ácido nucleico de acordo com o segundo aspecto do invento, compreendendo o processo o acoplamento sucessivo de nucleótidos e/ou a ligação de oligonu-cleótidos e/ou polinucleótidos, em conjunto. O ácido nucleico pode ser quimicamente sintetizado, embora seja preferível utilizar uma polimerase dirigida ao ácido nucleico, preferivelmente in vivo. 0 ácido nucleico pode ser adequadamente modificado utilizando a mutagénese dirigida ao local.

Um décimo aspecto do presente invento refere-se a um processo para a preparação de uma composição farmacêutica do sexto aspecto, compreendendo o processo a mistura de uma proteína do primeiro aspecto com um veículo farmacêutica ou veterinaria-mente aceitável.

Um décimo primeiro aspecto do presente invento refere--se a um processo para a preparação de um vector do terceiro aspecto, compreendendo o processo o acoplamento sucessivo de nucleótidos e/ou a ligação de oligonucleótidos e/ou polinucleótidos, em conjunto.

Um décimo segundo aspecto do presente invento refere-se a um processo para a preparação de um hospedeiro do quarto aspecto, compreendendo o processo a transformação ou transfecção de uma célula com um vector do terceiro aspecto.

As propriedades e características preferidas de um aspecto do presente invento são como para um outro aspecto mutatis mutandis.

Nos desenhos que se seguem: 26

As Figuras 1 e 2 são mapas dos vectores pSW6 e pJKl, respectivamente, utilizados nos Exemplos e Exemplos Comparativos a seguir descritos; e A Figura 3 é um diagrama de conjunto dos pares de oligómeros desnaturados/renaturados que podem ser quinados para preparar um gene de huridina sintético.

EXEMPLO COMPARATIVO 1 - CONSTRUÇÃO DE UM GENE DE HIRUDINA

As técnicas de engenheiria genética e manipulação genética utilizadas na preparação de um gene HV-1 sintético e sua posterior manipulação para construção de um vector de expressão em levedura são bem conhecidas daqueles peritos na arte. As descrições das técnicas modernas podem ser encontradas nos manuais de laboratório "Current Protocols in Molecular Biology" publicado por Wiley Interscience e em "Molecular Cloning, A Laboratory Manual" (segunda edição) editado por Sambrook, Fritsch e Maniatis publicado por Cold Spring Harbour Laboratories, New York. > a. Elaboração do Gene

Um gene de hirudina sintético HV-1 foi elaborado por incorporação de locais de restrição únicos úteis para facilitar a manipulação (ver SEQ.ID:4). Os codãos seleccionados são favorecidos quer pela S. cerevisiae quer por E. coli e são, assim, adequados para expressão em qualquer organismo. b. Construção do Gene A sequência de gene foi dividida em 12 oligodesoxirri-bonucleótidos (ver SEQ.ID: 6). Cada oligonucleótido sobrepôs-se ao seu parceiro adjacente em 7 pares de bases, proporcionando assim uma extremidade coesiva após desnaturação/renaturação dos pares complementares de oligonucleótidos. c. Síntese de Oligonucleótidos

Os oligonucleótidos foram sintetizados por química de fosforamidite automática num sintetizador de DNA Applied Systems 380B, utilizando fosforamidites de cianoetilo. A metodologia é agora largamente utilizada e já foi descrita (Beaucage, S.L. e Caruthers, M.H., Tetrahedron Letters 24, 245 (1981)). Os oligonucleótidos foram desprotegidos e removidos do suporte de CPG por incubação em NH3 concentrado. Tipicamente, foram desprotegidos 50 mg de CPG transportando 1 micromole de oligonucleótido, por incubação durante 5 horas a 70°C em 600 μΐ de NH^ concentrado. 0 sobrenadante foi transferido para um tubo fresco e o oligómero precipitado com 3 volumes de etanol. A seguir à centrifugação a pelota foi seca e ressuspensa em 1 ml de água. A concentração do oligómero em bruto foi então determinada por medição da absorvân-cia a 260 nm.

Para a purificação em gel foram secas 10 unidades de absorvância do oligonucleótido em bruto e ressuspensas em 15 μΐ de corante marcador (formamida desionizada a 90%, Tris 10 mM, borato 10 mM, EDTA 1 mM, azul de bromofenol a 0,1%). As amostras foram aquecidas a 90°C durante 1 minuto e depois introduzidas num gel de poliacrilamida desnaturante de 1,2 mm de espessura com cavidades de 1,6 mm de largura. O gel foi preparado a partir de um lote de acrilamida a 15%, bis-acrilamida a 0,6% e ureia 7M em 1 XTBE (Tris-HCl 90mM, pH 8,3, ácido bórico 90mM, EDTA 2,5mM) e foi polimerizado com persulfato de amónio a 0,1% e TEMED a 0,025%. O gel foi pré-corrido durante l h. As amostras foram corridas a 1500 V durante 4 a 5 horas. As bandas foram visualizadas por ensombramento com UV e aquelas correspondentes ao produto de comprimento total cortadas e transferidas para tubos de microteste. Os oligómeros foram eluídos a partir da fatia de gel por embebição em AGEB (acetato de amónio 0,5 M, acetato de magnésio 0,01 M e SDS a 0,1%) durante a noite. O tampão de AGEB foi então transferido para tubos frescos e o oligómero precipitado com três volumes de etanol a -70°C durante 15 minutos. O precipitado foi recolhido por centrifugação numa microcentrífuga Eppendorf durante 10 minutos, a pelota foi lavada em etanol a 80%, o oligómero purificado foi seco, redissolvido em 1 ml de água e finalmente filtrado através de um microfiltro de 0,45 micron. A concentração do produto purificado foi medida por determinação da sua absorvância a 260 nm. d. Montagem do Gene

Os oligonucleótidos foram quinados para os prover com um 5' fosfato permitindo assim a subsequente ligação (ver Figura 3).

Ouinase dos Oligómeros

Foram secas 100 pmoles de oligómero e ressuspensas em 20 μΐ de tampão de quinase (Tris 70 mM, pH 7,6, MgCl2 10 mM, ATP l mM, espermidina 0,2 mM, ditiotreitol 0,5 mM) . Foram adicionados 10 /xl de polinucleotido-quinase T4 e a mistura foi incubada a 37°C durante 30 minutos. A quinase foi então inactivada por aquecimento a 70°C durante 10 minutos.

Os pares complementares de oligonucleótidos quinados foram desnaturados/renaturados aos pares (90°C, 5 minutos, seguido por arrefecimento lento). Os 6 pares de oligómeros foram então misturados em conjunto, incubados a 50°C durante 5 minutos e deixados arrefecer. Eles foram então ligados durante a noite a 16°C com DNA-ligase T4. Isto é diagramaticamente mostrado na Figura 3 (observar que P = 5'-fosfato). Os oligómeros elaborados BB2011 e BB2020 não foram quinados para impedir a multimerização. As sequências dos oligómeros mostrados na Figura 3 correspondem àquelas dadas em SEQ.ID:6.

Os produtos de ligação foram separados num gel de agarose de baixa temperatura de gelificação, a 2%, e a banda correspondente ao gene de hirudina HV-1 foi cortada e extractada a partir do gel. 0 fragmento purificado foi então ligado ao DNA do plasmídeo pUC19 tratado com HindIII-EcoRI. (o pUC19, código n2 27-4951-01, foi adquirido a partir da Pharmacia Ltd., Midsummer Boulevard, Central Milton Keynes, Bucks, MK9 3HP, Reino Unido). A transformação das estirpes hospedeiras de E. coli foi realizada utilizando procedimentos padrão. A estirpe utilizada como um recipiente na clonagem que utiliza vectores plasmídicos foi HW87, que tem o genótipo seguinte: 30 araD139(ara-leu)delta7697 (laçIPOZY)delta74 aalu qalK hsdR rosL srl recA56 O produto HV-1 de pUC19 recombinante foi transferido no hospedeiro E. coli estirpe HW87 e colocado em placas de ampici-lina de caldo-L. As doze colónias foram colhidas e utilizadas para preparar o DNA plasmídico para análise da sequência. A análise de sequência didesoxi de cadeia dupla foi utilizada para identificar um clone correcto utilizando um iniciador de sequen-ciação universal BB22 (CAGGGTTTTCCCAGTCACG), (SEQ.ID:11) complementar à região iniciadora universal de pUC19. O recombinante pUC19 foi utilizado para construir o vector de expressão. 31 exemplo comparativo 2 - Construção de um Vector de Expressão da Hirudina

Foi elaborado um vector de expressão para possibilitar a secreção de hirudina no meio extracelular apôs expressão em S. cerevisiae. A secreção de hirudina é desejável para facilitar a produção de proteína com um terminal N autêntico, para facilitar a purificação, para limitar a proteõlise intracelular, para reduzir os potenciais efeitos tóxicos no hospedeiro de levedura e para permitir o dobramento óptimo da proteína através da formação de ligações dissulfureto nativas. A secreção de hirudina através da membrana de levedura foi dirigida por fusão da hirudina ao pré-pró-péptido de factor alfa de tipo próximo de levedura (um péptido de levedura secretado naturalmente). 0 vector de expressão em levedura pSW6 (Figura 1) é baseado no circulo de 2 micra de S. cerevisiae. (0 pSW6 foi depositado em S. cerevisiae estirpe BJ2168 em The National Collections of Industrial and Marine Bactéria Limited, 23 St. Machar Drive, Aberdeen, AB2 1RY, Escócia, Reino Unido a 23 de Outubro de 1990 sob o P de Acesso NCIMB 40326). O pSW6 é um vector vai-e-vem capaz de replicar quer em E. coli quer em S. cerevisiae e contém uma origem de replicação para os dois organismos, o gene leu2 (um marcador seleccionável para manutenção no hospedeiro de levedura) e o lócus resistente à ampicilina para selecção da manutenção do plasmídeo em E. coli. (A sequência de DNA do vector foi determinada, as sequências de E. coli são derivadas do replicão à base de ColEl de E. coli pAT153). A sequência total é dada como SEQ.ID:19. A capacidade de passagem deste vector através de E. coli facilita muito a manipulação genética neste vector. 0 pSW6 contém um pré-pró-péptido de factor alfa fundido na estrutura do factor de crescimento epidérmico 32 (EGF). A expressão desta fusão está sob controlo de um promotor regulado pela galactose, eficaz, que contém sequências de DNA híbridas do promotor GAL 1-10 de S. cerevisiae e do promotor fosfoglicerato-quinase (PGK) de S. cerevisiae. A transcrição é terminada neste vector pelo terminador PGK de levedura, natural. O gene EGF em pSW6 pode ser removido por digestão com HindIII e BamHI. Isto remove o DNA que codifica quer EGF quer os 5 aminoá-cidos do terminal C do pró-péptido de factor alfa. Os genes a serem inseridos no vector de expressão pSW6 devem, por consequência, ter a composição geral: local HindIII - adaptador do factor alfa - gene - local BamHI.

Para reconstruir o DNA que codifica os 5 aminoácidos na extremidade do terminal C do prõ-péptido de factor alfa e fundir este no gene hirudina sintético, foi construído um adaptador de oligonucleótidos (5' AGCTTGGATAAAAGA 3' (cadeia do topo, SEQ.ID:12), 5' TCTTTTATCCA 3' (cadeia do fundo, SEQ.ID:13) contendo parte de um local HindIII e dos codãos que codificam a Ser, Leu, Asp, Lys e Arg da extremidade do terminal C do pró-pé-ptido de factor alfa. O adaptador de factor alfa foi ligado ao gene HV-1 sintético de modo que o gene recombinante codificou uma fusão, em estrutura, do pró-péptido de factor alfa à hirudina. O plasmídeo de HV-1 pUC19 foi primeiro clivado com Bsoml e as extremidades pendentes foram em seguida completadas com DNA-poli-merase I para criar um fragmento de DNA linear de extremidades coesivas. Este fragmento foi separado do plasmídeo não cortado num gel de agarose de baixa temperatura de gelificação a 1%, cortado e extractado a partir da matriz de gel de agarose, depois adicionalmente tratado com HindIII. O fragmento foi então ligado ao adaptador de factor alfa (sintetizado como dois oligonucleótidos complementares, descritos acima) e desnaturado/renaturado antes da ligação. O plasmídeo recombinante resultante foi o pJC80. A sequência de hirudina - adaptador de factor alfa foram 33 removidos do pJC80 num fragmento HindIII-BamHI (SEQ.ID:5). 0 fragmento foi purificado num gel de agarose de baixa temperatura de gelificação a 1% e ligado ao pSW6 tratado com HindIII-BamHI para criar pJKl (Figura 2). Este plasmídeo é o vector básico utilizado para a expressão da hirudina HV-1 de tipo selvagem. EXEMPLO COMPARATIVO 3 - Expressão do Gene Sintético de

Hirudina > 0 vector de expressão plasmídica pJKl foi transformado em levedura (S. cerevisiae) estirpe BJ2168 (orc-1-407. prbl-1122 pep4-3 leu2 trpl ura3-52 cir+) utilizando o processo de Sherman F. et al. ÍMethods in Yeast Genetics. Cold Spring Harbour Labora-tory, (1986)). Todos os meios com levedura foram como descrito por Sherman et al. Utilizando um frasco de agitação de 500 mlf uma cultura de 100 ml de levedura contendo pJKl foi deixada crescer em meio de levedura à base de azoto, completo e sintético a 0,67%, com todos os aminoácidos menos a leucina e glucose a 1%, como fonte de carbono. Após crescimento durante a noite a 30°C, as células foram transferidas para um frasco de agitação de 2 ) litros contendo 1 litro do mesmo meio completo e sintético com a excepção de ter galactose a 1% e glucose a 0,2%, como a fonte de carbono. Isto induz a expressão do promotor PGK híbrido. As células foram deixadas crescer no meio de indução durante 3 dias. Após este período, o sobrenadante foi recolhido e analisado. EXEMPLO COMPARATIVO 4 - Purificação da Hirudina A hirudina foi purificada a partir do caldo de cultura de leveduras. As células foram primeiro removidas pôr centrifugação. 0 sobrenadante foi então analisado quanto à actividade biológica (ver Exemplos de Farmacologia). Os níveis de produção das culturas dos frascos de agitação estavam habitualmente entre 10-l5mg/litro de cultura. A hirudina foi purificada por HPLC preparativa (DYNAMAX (Marca Registada) C18, 300 Angstroms de tamanho de poro, 12 μη de tamanho de partícula, 21,4 mm de diâmetro interno, 25cm de comprimento). A coluna foi primeiro equilibrada em acetonitrilo a 15%, ácido trifluoroacético a 0,1%. Depois foram introduzidos até 21 de sobrenadante na coluna com acetonitrilo a 15%, a lOml/minuto. A proteína foi eluída utilizando um gradiente de acetonitrilo 15-40% a 10 ml/minuto. 0 pico de hirudina eluída foi diluído com um volume igual de TFA a 0,1% antes da introdução numa coluna DYNAMAX (Marca Registada) C18 de 10 mm de Dl, a 3 ml/minuto. A proteína foi eluída com um gradiente de 23-35%. A pureza da proteína isolada foi determinada por HPLC analítica (VYDAC (Marca Registada) C18 de fase inversa) e análise da sequência do terminal N. A espectrometria de massa foi utilizada para confirmar a sequência total. a. Determinação da Pureza por HPLC Analítica

As amostras foram analisadas numa coluna VYDAC (Marca Registada) C18 (15 x 0,46cm, tamanho de partícula 5 μιη) equilibrada com acetonitrilo a 10%, ácido trifluoroacético (TFA) a 0,1%. A proteína purificada (20 μg) foi introduzida em acetonitrilo a 10%, TFA a 0,1%. A proteína foi eluída a uma velocidade 35 de escoamento de lml/minuto utilizando um gradiente de acetoni-trilo de 10-40% em TFA a 0,1%, durante 30 minutos. A amostra de proteína eluída foi monitorizada por absorvância a 254 nm.

b. Análise da Pureza por FPLC Mono O

As amostras foram analisadas numa coluna de FPLC Mono Q (5 x 0,5cm, Pharmacia) equilibrada em Tris HC1 20 mM (pH 7,5). Foram reconstituídos aproximadamente 15 μg da proteína liofili-zada em 1 ml de Tris HC1 20 mM (pH 7,5) e introduzidos na coluna. A proteína foi eluída utilizando um gradiente de NaCl de 0-250mM em tampão de Tris HC1 20 mM (pH 7,5) a uma velocidade de escoamento de lml/minuto durante 30 minutos.

c. Análise da Sequência do Terminal N A análise da sequência do terminal N foi realizada por degradação de Edman automática utilizando um Sequenciador de Proteína Applied Biosystems, modelo 471 A (Applied Biosystems, Foster City, Califórnia). O material purificado que era mais do que 95% puro, foi seco num Speedivac e reconstituído em 0,5ml de solução salina a 0,9%, para análise. EXEMPLO 5 - Construção e Expressão do RGDS de Hirudina

Os análogos hirudina que são alterados para incluir uma extensão de aminoácidos de terminal C foram construídos de forma a aumentar a duração da actividade antitrombótica da hirudina. A hirudina-RGDS é uma variante de hirudina na qual a sequência de aminoácidos Arg-Gly-Asp-Ser foi adicionada ao terminal C da hirudina HV-1. As sequências completas dos tipos de hirudina HV-1, HV-2 e HV-3 com um -RGDS no terminal carboxilo são dadas em SEQ.ID.1-3, respectivamente. A estratégia para a modificação é descrita abaixo.

Estirpes hospedeiras O RZ1032 é um derivado de E. coli que carece de duas enzimas do metabolismo do DNA: (a) dUTPase (dut) que resulta numa elevada concentração de dUTP intracelular, e (b) uracil-N-glico-silase (ung) que é responsável pela remoção dos uracilos mal incorporados no DNA (Kunkel et al.. Methods in Enzvmol.. 154, 367-382 (1987)). 0 principal benefício é o de que estas mutações conduzem a uma maior frequência de mutantes na mutagénese dirigida ao local. O RZ1032 tem o genótipo seguinte:

HfrKL16PO/45 flvsA61-62), dutl, uncrl, thil, recA. Zbd-279i sTnlO, SUPE44 JM103 é uma estirpe recipiente padrão para manipulações que envolvam os vectores à base de M13. O genótipo de JM103 é JM103 delta (lac-pro). thi, supEf strA, endA. sbcB15. hspR4, F' traD36r proAB. lacl^. ZdeltaM15. 37

Mutagénese Dirigida ao Local O iniciador de mutagénese quinado (2,5pmoles) foi desnaturado/renaturado ao DNA matriz de cadeia única, que foi preparado utilizando RZ1032 como hospedeiro, (1 μg) numa mistura reaccional final de 10 μΐ contendo Tris 70 mM, MgCl2 10 mM. A mistura reaccional, num tubo de microteste de polipropileno (Eppendorf), foi colocada numa proveta contendo 250 ml de água a 70°C durante 3 minutos, seguidos por 37°C durante 30 minutos. A mistura desnaturada/renaturada foi então colocada em gelo e foram adicionados os reagentes seguintes: 4 μΐ de 10 X HM (HEPES 200 mM, MgCl2 100 mM, pH 7,6), 5 μΐ de uma mistura de todos os 4 desoxirribonucleótidos-trifosfatos, cada um a 5mM, 5 μΐ de ATP (10mM), 5 μΐ de DTT (lOOmM), 2 μΐ de DNA-ligase T4 (lOOu), 1,0 μΐ de fragmento Klenow de DNA-polimerase e água até um volume final de 50 μΐ. A mistura reaccional de polimerase foi então incubada a 15°C durante 4-16 h. Após estar completa a reacção, foram adicionados 150 μΐ de TE (Tris 10 mM, EDTA 1 mM, pH 8,0) e a mistura de mutagénese armazenada a -20°C.

Para o isolamento dos clones de mutantes a mistura foi depois transformada no recipiente JM103 como se segue. Uma cultura de uma noite de 5 ml de JM103 em 2 X YT (Bactotriptona a 1,6%, Extracto de Levedura a 1%, NaCl a 1%), foi diluída a 1 para 100 em 50 ml de 2 X YT pré-aquecido. A cultura foi deixada crescer a 37°C com arejamento até a A600 atingir 0,4. As células foram pelotizadas e ressuspensas em 0,5 vol de CaCl_ 50 mM e mantidas em gelo durante 15 minutos. As células foram então repelotizadas a 4°C e ressuspensas em 2,5 ml de CaCl 50 mM, frio. Para a transfecção, foram adicionadas alíquotas de 0,25, 1, 2, 5, 20 e 50 μΐ da mistura de mutagénese a 200 μΐ de células competentes que foram mantidas em gelo durante 30 min. As células foram então aquecidas por choque a 42°C durante 2 minutos. A cada 38

tubo foram então adicionados 3,5 ml de ágar mole YT contendo 0,2 ml de uma última cultura exponencial de JM103, os conteúdos foram rapidamente misturados e depois deitados na superfície de um prato pré-aquecido contendo 2 X YT solidificado com ãgar a 1,5%. A camada de ágar mole foi deixada assentar e os pratos foram então incubados a 37°C durante a noite. O DNA de cadeia única foi então preparado a partir dos clones isolados como se segue: As placas simples foram colhidas em 4 ml de 2 X YT que tinha sido semeado com 10 μΐ de uma cultura de uma noite, fresca, de JM103 em 2 X YT. A cultura foi agitada vigorosamente durante 6 h. Foram então removidos 0,5 ml da cultura e adicionados a 0,5 ml de glicerol a 50% para dar uma reserva de referência que foi armazenada a -20°C. A cultura restante foi centrifugada para remover as células e foi transferido 1 ml de sobrenadante possuindo as partículas de fago para um tubo Eppendorf fresco. Foram então adicionados 250 μΐ de PEG6000 a 20%, NaCl 250mM, misturados e os tubos incubados em gelo durante 15 minutos. 0 fago foi então pelotizado a 10 000 rpm durante 10 minutos, o sobrenadante rejeitado e os tubos re-cen-trifugados para se recolher os resíduos finais de solução PEG que podiam então ser removidos e rejeitados. A pelota de fago foi completamente ressuspensa em 200 μΐ de TEN (Tris 10 mM, EDTA 1 mM, NaOAc 0,3 M). O DNA foi isolado por extracção com um volume igual de fenol saturado com Tris, As fases foram separadas por uma breve centrifugação e a fase aquosa transferida para um tubo limpo. O DNA foi re-extractado com uma mistura de 100 μΐ de fenol, 100 μΐ de clorofórmio e as fases foram, de novo, separadas por centrifugação. Os resíduos de fenol foram removidos por três extracções subsequentes com clorofórmio e o DNA finalmente isolado por precipitação com 2,5 volumes de etanol a -20°C, durante a noite. 0 DNA foi pelotizado a 10 000 rpm durante 10 39

minutos, lavado em etanol a 70%, seco e finalmente ressuspenso em 50 μΐ de TE.

Um gene gue codifica a hirudina RGDS foi construído por mutagénese dirigida ao oligonucleótido. O gene hirudina do i Exemplo Comparativo 1 foi primeiro transferido para M13 mpl9 num fragmento de DNA HindiII-BamHI. O oligonucleótido de 42pb (pares de bases) CGGGGATCCCTATTAGCTGTCACCGCGCTGCAGATATTCTTC 3' (SEQ.ID:17) foi utilizado para dirigir a mutagénese. >

Os clones gue possuem a mutação desejada foram identificados por análise da seguência de DNA. O clone completo foi sequenciado para assegurar que não tinha sido inadvertidamente introduzida qualquer outra mutação. Após confirmação da sequência de DNA correcta nas matrizes de cadeia única, foi preparada a forma replicativa de DNA de um mutante e o DNA que codifica as variantes hirudina foi removido num fragmento HindIII-BamHI. O fragmento foi purificado em gel e ligado a pSW6 tratado com HindIII-BamHI substituindo assim o gene EGF em pSW6 para criar pJK009. O pJK009 foi primeiro transformado num hospedeiro de E. coli HW87 e caracterizado por digestão de restrição. Foram preparados 50 ml de uma preparação de plasmídeo e utilizados para ^ transformar a estirpe de levedura BJ2168.

Os procedimentos dos Exemplos Comparativos 3 e 4 foram seguidos para expressão e purificação da hirudina RGDS. A caracterização in vitro e in vivo desta variante é descrita nos Exemplos Comparativos de Farmacologia A e B. 40 -

EXEMPLO 6 - construção e Expressão da Hirudina RGDF A hirudina-RGDF é um derivado da hirudina no qual a sequência de aminoácidos que se liga à integrina Arg-Gly-Asp-Phe foi ligada ao terminal C da hirudina HV-1. Foi utilizado o procedimento do Exemplo 5 com a excepção de que o iniciador utilizado para mutagénese era o iniciador de 42pb 5' CGGGGATCCCT-ATTAGAAGTCACCGCGCTGCAGATATTCTTC 3 ' (SEQ. ID: 15) . >

EXEMPLO 7 - Construção e Expressão da Hirudina RGDV A hirudina-RGDV é um derivado da hirudina no qual a sequência de aminoácidos que se liga â integrina Arg-Gly-Asp-Val foi ligada ao terminal C da hirudina nativa. Foi utilizado o procedimento do Exemplo 5 com a excepção de que o iniciador oligonucleotídico compreendia 42pb 5' CGGGGATCCCTATTAAACGTCACCGC-GCTGCAGATATTCTTC 3' (SEQ.ID:16).

EXEMPLO 8 - Construção e Expressão da Hirudina RGDW > A hirudina-RGDW é um derivado da hirudina no qual a sequência de aminoácidos que se liga à integrina Arg-Gly-Asp-Trp foi ligada ao terminal C da hirudina nativa. Foi utilizado o procedimento do Exemplo 5 com a excepção de que o iniciador oligonucleotídico compreendia 42pb 5' CGGGGATCCCTATTACCAGTCACCGC-GCTGCAGATATTCTTC 3' (SEQ.ID:14). 41 EXEMPLO 9 - Análise Espectroscópica de Massa das Variantes Kirudina O terminal C da hirudina recombinante pode ser suscep-tível à proteólise por carboxipeptidases durante a produção da levedura (R. Bischoff et al.. J. Chromatoqraphv 476: 245-55, 1989). Como a presença dos resíduos C-terminais das variantes hirudina-RGDX é importante para a sua actividade, analisámos as variantes hirudina purificadas por espectroscopia de massa para determinar se elas são do peso molecular previsto.

As amostras purificadas foram analisadas por espectro-metria de massa de bombardeamento rápido de átomos por M-Scan Ltd, Silwood Park, Sunninghill, Ascot, UK. As amostras foram dissolvidas em ácido acético aquoso a 5% e foram introduzidos 2 μΐ num alvo previamente coberto com 2-4 μΐ de álcool M-nitroben-zílico. A análise foi realizada num espectrõmetro de massa de campo elevado VG Analytical ZAB-2SE que opera a Vacc-8kV. Foi utilizada um arma de iões césio para gerar iões para os espectros de massa que eram registados utilizando um sistema de dados PDP 11-250J. A calibragem de massa foi realizada utilizando iodeto de césio ou glicerol de iodeto de césio. Os espectros foram primei-ramente obtidos no intervalo de massa m/z 7800-3400 e depois re-analisados a m/z 8350-7300. A hirudina-RGDF mostrou ter uma massa de 7439,3 para o ião molecular protonado comparada ao peso molecular calculado de 7439. Para a hirudina-RGDW o centro do ião molecular tinha uma massa de 7476,6-7478,5 comparada ao valor calculado de 7478. Os pesos moleculares observados e calculados das variantes hirudina são essencialmente os mesmos indicando que para cada variante o terminal C da molécula está intacto. A adição de uma sequência RGDX ao terminal C da hirudina impede, por consequência, a proteólise do terminal C.

EXEMPLOS 10 a 25 - Construção e Expressão da Hirudina-RGDX

As hirudina-RGDX são derivados hirudina nos quais a sequência de aminoácidos que se liga à integrina RGDX foi ligada ao terminal C da dissulfato-hirudina recombinante (X pode ser um qualquer aminoácido). As variantes hirudina possuindo extensões de terminal C de RGDS (Exemplo 5), RGDF (Exemplo 6), RGDV (Exemplo 7) e RGDW (Exemplo 8) já foram descritas (SEQ.ID Nos:25-28). As variantes hirudina possuindo os aminoácidos do terminal C, possíveis, restantes foram construídas de forma a se investigar o efeito na duração de acção da actividade antitrombótica. A Tabela 1 dá a relação entre o número do Exemplo e as sequências de afinidade para a integrina (incluindo as sequências RGDX) empregues. TABELA 1 EXEMPLO NS TERMINAL CARBOXILO SEO.IDíNS 5 RGDS 25 6 RGDF 26 7 RGDV 27 δ RGDW 28 10 RGDR 29 11 RGDE 30 12 RGDC 31 13 RGDK 32 14 RGDL 33 15 ' RGDG 34 16 RGDM 35 17 RGDQ 36 18 RGDT 37 19 RGDD 38 20 RGDN 39 21 RGDY 40 22 RGDP 41 23 RGDI 42 24 RGDA 43 25 RGDH 44 26 GREDV 45 27 HHLGGAKQAGDV 7 28 CRGDWPC 24 29 CKGDWPC 23 30 GKDGEA 46 31-34 [Variante hirudina]-RGDW 28

Os péptidos hirudina-RGDX foram construídos e clonados em vectores de expressão, de acordo com o procedimento do Exemplo 44

5 com a excepção de que a estratégia de mutagénese foi complicada pelo número de clones procurados. 0 clone de bacteriõfago M13 contendo a sequência de DNA de hirudina-RGDW do Exemplo 8 foi utilizado para a matriz de mutagénese. Foi utilizada uma primeira volta de mutagénese com um iniciador oligonucleotídico BB4395 de 3Opb (5' GGATCCCTATTANNNGTCACCGCGCTGCAG 3') (SEQ.IDN2:49), onde N representa uma mistura equimolar dos quatro nucleótidos, A, T, G e C, para construir quatro novas variantes hirudina nas quais as sequências de aminoãcidos Arg-Gly-Asp-Arg (RGDR), Arg-Gly-Asp--Glu (RGDE) e Arg-Gly-Asp-Cys (RGDC) (SEQ.ID:Nos.29-31) tinham sido adicionadas ao terminal C da hirudina HV-1. 0 exame da utilização do codão das substituições de aminoãcidos desejadas, restantes, na posição X permitiu a elaboração de dois iniciadores oligonucleotídicos BB4882 de 28pb (5' GGATCCCTATTAC(H:C/A/T) (B:T/C/G)GTCACCGCGCTGC 3') (SEQ.ID N2:50) e BB4883 de 28pb (5' GGATCCCTATTAA(D:G/A/T)NGTCACCGCGCTGC 3'), onde N é um qualquer dos quatro nucleótidos A, T, G ou C (SEQ.ID N2;51). As variantes hirudina nas quais as sequências de aminoá-cidos Arg-Gly-Asp-Lys (RGDK), Arg-Gly-Asp-Leu (RGDL), Arg-Gly--Asp-Gly (RGDG), Arg-Gly-Asp-Met (RGDM) e Arg-Gly-Asp-Gln (RGDQ) (SEQ.ID Nos.32-36) tinham sido adicionadas ao terminal C da hirudina HV-1 foram identificadas após mutagénese com BB4882.

As variantes hirudina nos quais as sequências de aminoãcidos Arg-Gly-Asp-Thr (RGDT), Arg-Gly-Asp-Asp (RGDD), Arg-Gly-Asp-Asn (RGDN), Arg-Gly-Asp-Tyr (RGDY), Arg-Gly-Asp-Pro (RGDP) e Arg-Gly-Asp-Ile (RGDI) (SEQ.ID Nos.37-42) tinham sido adicionadas ao terminal C da hirudina HV-1 foram identificadas após mutagénese com BB4883.

Os dois iniciadores oligonucleotídicos mutagénicos, específicos, BB5258 de 28pb (5' GGATCCCTATTAAGCGTCACCGCGCTGC 3') 45 (SEQ.ID Νδ:52) e BB5259 de 28pb (5' GGATCCCTATTAGTGGTCACCGCGCTGC 3') (SEQ.ID N2:53) foram elaborados e utilizados para construir variantes hirudina nas quais Arg-Gly-Asp-Ala (RGDA) (SEQ.ID N2:43) e Arg-Gly-Asp-His (RGDH) (SEQ.ID N2:44), respectivamente, tinham sido adicionadas ao terminal C da hirudina HV-1.

Os genes que codificam as variantes hirudina RGDX descritos açima foram transferidos em vectores de expressão de acordo com o procedimento do Exemplo 5. >

EXEMPLO 26 - Construção e Expressão da Hirudina GREDV A hirudina-GREDV é um derivado da hirudina no qual a sequência de aminoácidos Gly-Arg-Glu-Asp-Val (SEQ.ID N2;45) foi ligada ao terminal C da hirudina nativa HV-1. Foi utilizado o procedimento do Exemplo 5 com a excepção de que o iniciador oligonucleotídico compreendia um BB6282 de 42pb (5' GGATCCCTATTA-AACGTCTTCGCGACCTGCAGATATTCTTC 3') (SEQ.ID NS:54) e o clone de bacteriófago M13 que codifica a sequência de hirudina-RGDW do Exemplo 8 foi utilizado como matriz. >

EXEMPLO 27 - Construção e Expressão da Hirudina-HHLGGAKQAGDV A hirudina-HHLGGAKQAGDV é um derivado da hirudina no qual a sequência de aminoácidos His-His-Leu-Gly-Gly-Ala-Lys-Gln--Ala-Gly-Asp-Val (SEQ.ID NS:7) foi ligada ao terminal C da hirudina nativa HV-1. Foi utilizado o procedimento do Exemplo 5 com a excepção de que o iniciador oligonucleotídico compreendia um BB6283 de 63pb (5' - 46 - i - 46 - i

GGATCCCTATTAAACATCACCTGCCTGTTTTGCACCACCCAGGTGGTGCTGCAGATATTCTTC 3') (SEQ.ID N2;55) e o clone de bacteriófago M13 que codifica a sequência de hirudina-RGDW do Exemplo 8 foi utilizado como matriz.

EXEMPLO 28 - Construção e Expressão da Hirudina-CRGDWPC A hirudina-CRGDWPC é um derivado da hirudina no qual a sequência de aminoãcidos Cys-Arg-Gly-Asp-Trp-Pro-Cys (SEQ.ID N2:24) foi ligada ao terminal C da hirudina nativa HV-1. Foi utilizado o procedimento do Exemplo 5 com a excepção de que o iniciador oligonucleotídico compreendia um BB6284 de 48pb (5' GGATCCCTATTAACATGGCCAGTCACCGCGACACTGCAGATATTCTTC 3') (SEQ. ID N2:56) e o clone de bacteriófago M13 que codifica a sequência de hirudina-RGDW do Exemplo 8 foi utilizado como matriz.

EXEMPLO 29 - Construção e Expressão da Hirudina-CKGDWPC A hirudina-CKGDWPC é um derivado da hirudina no qual a sequência de aminoácidos Cys-Lys-Gly-Asp-Trp-Pro-Cys (SEQ.ID N2:23) foi ligada ao terminal C da hirudina nativa HV-1. Foi utilizado o procedimento do Exemplo 5 com a excepção de que o iniciador oligonucleotídico compreendia um BB6285 de 48pb (5' GGATCCCTATTAACATGGCCAGTCACCCTTACACTGCAGATATTCTTC 3') (SEQ.ID N2:57) e o clone de bacteriófago M13 que codifica a sequência de hirudina-RGDW do Exemplo 8 foi utilizado como matriz.

EXEMPLO 30 - Construção e Expressão da Hirudina-GKDGEA A hirudina-GKDGEA é um derivado da hirudina no qual a sequência de aminoácidos Gly-Lys-Asp-Gly-Glu-Ala (SEQ.ID Na:46) foi ligada ao terminal c da hirudina nativa HV-l. Foi utilizado o procedimento do Exemplo 5 com a excepção de que o iniciador oligonucleotídico compreendia um BB6281 de 45pb (5' GAATCCCTATTA-TGCTTCACCGTCTTTACCCTGCAGATATTCTTC 3') (SEQ.ID N2;58) e O clone de bacteriófago M13 que codifica a sequência de hirudina-RGDW do Exemplo 8 foi utilizado como matriz. 0 BB6281 continha uma substituição de bases indesejável que foi corrigida por uma volta adicional de mutagénese com BB6420 de 22pb (5' GTACCCGGGGATCCCTA-TTATG 3') (SEQ.ID N2;62).

EXEMPLO 31 - Construção e Expressão de IEGR-Hirudina-RGDW IEGR-hirudina-RGDW é um derivado da hirudina no qual a sequência de aminoácidos Ile-Glu-Gly-Arg foi ligada ao terminal N da hirudina-RGDS do Exemplo 5. Foi utilizado o procedimento do Exemplo 5 com a excepção de que o iniciador oligonucleotídico compreendia um BB4404 de 42pb (5' GTCGGTGTAAACAACTCTTCCTTCGATTCT-TTTATCCAAGCT 3') (SEQ.ID N2;59) e o clone de bacteriófago M13 que codifica a sequência de hirudina-RGDW do Exemplo 8 foi utilizado como matriz. EXEMPLO 32 - Construção e Expressão da Hirudina

[II, T2]-RGDW A hirudina [II, T2]-RGDW é um derivado da hirudina no qual o terminal N da hirudina-RGDW do Exemplo 8 Val-Val foi substituído pela sequência de aminoácidos Ile-Thr. Foi utilizado o procedimento do Exemplo 5 com a excepção de que o iniciador oligonucleotídico compreendia um BB4401 de 34pb (5' GTACAGTCGGTG-TAGGTGATTCTTTTATCCAAGC 3') (SEQ.ID N2;60) e o clone de bacterió-fago M13 que codifica a sequência de hirudina-RGDW do Exemplo 8 foi utilizado como matriz. EXEMPLO 33 - Construção e Expressão da Hirudina

[K24]-RGDW A hirudina [K24]-RGDW é um derivado da hirudina HV-1 no qual o aminoácido Gln24 da hirudina-RGDW do Exemplo 8 foi substituído por Lys. Foi utilizado o procedimento do Exemplo 5 com a excepção de que o iniciador oligonucleotídico compreendia um BB4402 de 29pb (5' GCATTTGTTACCTTTACCACAGACGTTAG 3') (SEQ.ID N2:61) e o clone de bacteriêfago M13 que codifica a sequência de hirudina-RGDW do Exemplo 8 foi utilizado como matriz. 49 EXEMPLO 34 - Construção e Expressão da Hirudina

[II, T2, K24]-RGDW A hirudina [II, T2, K24]-RGDW é um derivado da hirudina no qual o terminal N da hirudina-RGDW do Exemplo 8 (Val-Val) foi substituído pela sequência de aminoácidos Ile-Thr e a Gln24 da hirudina-RGDS do Exemplo 5 foi substituída por Lys. Foi utilizado o procedimento do Exemplo 5 com a excepção de que o iniciador oligonucleotídico compreendia um BB4402 de 29pb (SEQ.ID N2:61) como utilizado no Exemplo 33 e o clone de bacteriófago M13 que codifica a sequência de hirudina [II, T2]-RGDW do Exemplo 32 foi utilizado como matriz. EXEMPLO COMPARATIVO DE FARMACOLOGIA - Inibição In Vitro da

Trombina

Foi determinada a capacidade da hirudina e das variantes para inibir a hidrólise catalisada por trombina do substrato cromogénico tosil-Gly-Pro-Arg-p-nitroanilida (CHROMOZYM (Marca Registada) TH, Boehringer-Mannheim). As amostras de hirudina (50 μΐ) diluídas em Tris-HCl 0,1M pH 8,5, NaCl 0,15M, PEG 6000 0,1% foram misturadas com 50 μΐ de trombina humana (Sigma, 0,8U/ml no tampão acima) e 50 μΐ de CHROMOZYM TH (2,5mM em água) em pratos de 96 cavidades. Os pratos foram incubados à temperatura ambiente durante 30 minutos. A reacção foi terminada pela adição de 50 μΐ de ácido acético 0,5M e a absorvância lida a 405nm utilizando um leitor de pratos automático. A quantificação foi realizada por comparação com uma preparação de hirudina padrão ([Lys-47]-HV-2 recombinante adquirida da Sigma: Sigma Chemical Co. Ltd, Fancy Road, Poole, Dorset BH11 7TG, Reino Unido). A actividade específica da hirudina e das quatro variantes hirudina-RGD é mostrada na Tabela 2. As actividades específicas da hirudina-RGDW, hirudina-RGDS, hirudina-RGDF e hirudina-RGDV determinadas neste ensaio mostraram não ser significativamente diferentes daquela da hirudina não modificada indicando que a adição de uma sequência de ligação à integrina no terminal C da hirudina não diminui a sua actividade como um inibidor da trombina. TABELA 2

Proteína

Actividade Específica (U/mq)

Hirudina 7693 Hirudina-RGDW 7858 Hirudina-RGDF 7667 Hirudina-RGDV 7275 Hirudina-RGDS 7547 EXEMPLO DE FARMACOLOGIA B - Teste In Vivo da Actividade

Antitrombótica para a Hirudina-RGDS A actividade antitrombótica da hirudina-RGDS produzida utilizando o procedimento do Exemplo 5 foi medida por determinação do tempo de formação de coágulo utilizando uma derivação 51

arterio-venosa em ratazana (como descrito em Markwardt et al., Thromb. Haemostasis 47: 226-229 (1982)).

As ratazanas Sprague-Dawley macho (250 - 400g) foram anestesiadas com uretana a uma concentração de 1,6 g/kg. Através de uma incisão a meia-linha no pescoço, a traqueia foi canulada e os animais respiraram espontaneamente ar enriquecido com oxigénio para manter a pC>2 do sangue arterial entre 100 e 150 mmHg. Uma artéria carõtida foi canulada para medir a pressão sanguínea e a velocidade cardíaca. Uma veia jugular foi canulada para a infusão de anestésico suplementar e da proteína antitrombótica a ser testada, neste caso a proteína hirudina-RGDS do Exemplo 5.

Uma derivação, consistindo em duas cânulas de nilão de 12,5 cm, ligadas por um tubo de vidro de 2 cm de comprimento e de 1 mm de diâmetro, foi ligada entre uma artéria carótida e uma veia jugular contralateral. Uma pinça (clip) arterial colocada na artéria carótida próximo à derivação impediu o escoamento sanguíneo através da derivação até ser requerido. A derivação foi desafiada com solução salina a 0,9%. Foi colocada uma pérola termistor para medir a temperatura na superfície do catéter de nilão da veia jugular, adjacente à secção de vidro da derivação. Registou-se a saída do termistor e uma quebra na saída indicou que o escoamento sanguíneo tinha cessado e se tinha formado um coágulo. 0 tempo para a formação do coágulo foi medido a partir do tempo necessário para ocorrer uma quebra na temperatura após abertura da derivação por remoção da pinça (clip) arterial.

Este tempo foi repetidamente medido nas ratazanas por canulação repetida da artéria carótida e veia jugular no mesmo animal. Foi utilizada uma nova derivação para cada determinação do tempo para a formação do coágulo. 0 tempo para a formação do coágulo foi analisado a 30, 60 e 120 minutos a seguir à administração iv de 10 000 ATU/kg de hirudina-RGDS. Os valores foram de 8,311,9, 6,911,1 e 8,510,8 minutos, respectivamente. O valor a 120 minutos foi significativamente diferente e consideravelmente superior ao do Exemplo Comparativo de Farmacologia F correspondente indicando um aumento no efeito anticoagulante e uma duração de acção prolongada até 120 minutos, após administração. Os resultados dos testes in vivo incluindo aqueles com hirudina-RGDV e hirudina-RGDF (Exemplos de Farmacologia Ce D), estão sumariados na Tabela 3. EXEMPLO DE FARMACOLOGIA c - Teste In Vivo da Actividade

Antitrombótica para a Hirudina-RGDF

Foi repetido o procedimento do Exemplo de Farmacologia B para a proteína hirudina-RGDF, preparada de acordo com o procedimento do Exemplo 6. 0 tempo para a formação do coágulo 120 minutos a seguir à administração intravenosa de 10 000 ATU/kg foi de 5,811,4 minutos. EXEMPLO DE FARMACOLOGIA D - Teste In Vivo da Actividade

Antitrombótica para a Hirudina-RGDV

Foi repetido o procedimento do Exemplo de Farmacologia B para a proteína hirudina-RGDV, preparada de acordo com o procedimento do Exemplo 7. 0 tempo para a formação do coágulo 120 minutos a seguir à administração intravenosa de 10 000 ATU/kg foi de 8,112,5 minutos. 53 EXEMPLO COMPARATIVO DE FARMACOLOGIA E - Placebo de Solução

Salina

Foi realizado o processo de teste in vivo previamente descrito no Exemplo de Farmacologia B utilizando a administração de veículo só como um controlo (solução salina). o tempo para a formação do coágulo 30, 60 e 120 minutos a seguir à administração de veículo foi de 4,2±0,6, 3,7±0,5 e 3,3±1,4 minutos, respectiva-mente. EXEMPLO COMPARATIVO DE FARMACOLOGIA F - Hirudina (dos

Requerentes)

Foi realizado o Exemplo Comparativo de Farmacologia B utilizando, com excepção, a variante de hirudina HV-1 produzida por utilização do procedimento dos Exemplos Comparativos la 4. Esta foi administrada a uma dose de 10 000 ATU/kg que resultou num prolongamento significativo do tempo para a formação do coágulo 30 minutos após a administração da hirudina para 10,9±1,4 minutos e 60 minutos após a administração para 9,0±1,7 minutos. Não foi observado qualquer prolongamento significativo 120 até 4,9±1,3 minutos após administração da hirudina quando comparado com o controlo no Exemplo Comparativo de Farmacologia E. 54 TABELA 3

Tempo ãe formação do coágulo (1 minutos)

Tempo após a administração da proteína de teste (minutos) 30 60 120 Exemplo de Farmacologia B Hirudina- RGDS 8,311,9 6,911,1 8,610,8 Exemplo de Farmacologia C Hirudina- RGDF - - 5,811,4 Exemplo de Farmacologia D Hirudina- RGDV - - 8,112,5 Exemplo Comparativo de Farmacologia E Solução Salina 4,210,6 3,710,5 3,311,4 Exemplo Comparativo de Farmacologia F Hirudina (dos Requerentes) 10,911,4 9,011,7 4,911,3

ESPECIFICAÇÕES DAS SEQUÊNCIAS SEQ.ID: 1 TIPO de SEQUÊNCIA: proteína COMPRIMENTO da sequência: 69 aminoácidos FONTE: experimental PROPRIEDADES: antitrombótica CARACTERISTICAS: HV-1 de tipo hirudina com R6DS no terminal carboxilo (66-69)

Vai Vai Tyr Thr Asp Cys Thr Glu Ser Gly Gin Asn Leu Cys Leu 5 10 15

Cys Glu Gly Ser Asn Vai Cys Gly Gin Gly Asn Lys Cys Ile Leu 20 25 30

Gly Ser Asp Gly Glu Lys Asn Gin Cys Vai Thr Gly Glu Glu Thy 35 40 45

Pro Lys Pro Gin Ser His Asn Asp Gly Asp Phe Glu Glu Ile Pro 50 55 60

Glu Glu Tys Leu Gin Arg Gly Asp Ser 65 56 SEQ.ID: 2 TIPO DE sequência: proteína COMPRIMENTO DA SEQUÊNCIA: 69 aminoácidos FONTE: hipotética PROPRIEDADES: antitrombótica CARACTERÍSTICAS: HV-2 de tipo hirudina com R6DS no terminal carboxilo (66-69)

Ile Thr Tyr Thr Asp Cys Thr Glu Ser Gly Gin Asn Leu Cys Leu 5 10 15 Cys Glu Gly Ser Asn Vai Cys Gly Lys Gly Asn Lys Cys Ile Leu 20 25 30 Gly Ser Asn Gly Lys Gly Asn Gin cys Vai Thr Gly Glu Gly Thr 35 40 45 Pro Asn Pro Glu Ser His Asn Asn Gly Asp Phe Glu Glu Ile Pro 50 55 60

Glu Glu Tyr Leu Gin Arg Gly Asp Ser 65 > SEQ.ID: 3 TIPO DE SEQUÊNCIA; proteína COMPRIMENTO DA SEQUÊNCIA: 70 aminoácidos FONTE: hipotética PROPRIEDADES: antitrombótica CARACTERÍSTICAS: HV-3 de tipo hirudina com R6DS no terminal carboxilo (67-70)

Ile The Tyr Thr Asp Cys Thr Glu Ser Gly Gin Asp Leu Cys Leu 5 10 15

Cys Glu Gly Ser Asn Vai Cys Gly Lys Gly Asn Lys Cys Ile Leu 20 25 30

Gly Ser Gin Gly Lys Asp Asn Gin Cys Vai Thr Gly Glu Gly Thr 35 40 45

Pro Lys Pro Gin Ser His Asn Gin Gly Asp Phe Glu Pro Ile Pro 50 55 60

Glu Asp Ala Tyr Asp Glu Arg Gly Asp Ser 65 70 4

4 SEQ.ID: TIPO DE SEQUÊNCIA nucleótido com a proteína correspondente COMPRIMENTO DA SEQUÊNCIA: 201 pares de bases CADEIA: dupla TOPOLOGIA: linear TIPO DE MOLÉCULA: DNA sintético FONTE: sintética CARACTERÍSTICAS: gene HV-1 de tipo hirudina com codãos de paragem não traduzidos de 195 a 201 pb. GTT GTT TAC ACC GAC TGT ACT GAA TCC GGA CAA AAC CTG TGT TTG 45 CAA CAA ATG TGG CTG ACA TGA CTT AGG CCT GTT TTG GAC ACA AAC Vai Vai Tyr Thr Asp Cys Thr Glu Ser Gly Gin Asn Leu Cys Leu 5 10 15 TGT GAG GGT TCT AAC GTC TGT GGT CAG GGT AAC AAA TGC ATC CTG 90 ACA CTC CCA AGA TTG CAG ACA CCA GTC CCA TTG TTT ACG TAG GAC Cys Glu Gly Ser Asn Vai Cys Gly Gin Gly Asn Lys Cys Ile Leu 20 25 30 GGT TCC GAC GGT GAA AAG AAC CAA TGT GTC ACT GGT GAA GGT ACC 135 CCA AGG CTG CCA CTT TTC TTG GTT ACA CAG TGA CCA CTT CCA TGG Gly Ser Asp Gly Glu Lys Asn Gin Cys Vai Thr Gly Glu Gly Thr 35 40 45 CCA AAG CCG CAG TCC CAC AAC GAT GGA GAT TTC GAA GAA ATC CCA 180 GGT TTC GGC GTC AGG GTG TTG CTA CCT CTA AAG CTT CTT TAG GGT Pro Lys Pro Gin Ser His Asn Asp Gly Asp Phe Glu Glu Ile Pro 50 55 60 GAA GAA TAT CTG CAG TAATAG 201 CTT CTT ATA GAC GTC ATTATC Glu Glu Tyr Leu Gin 65

SEQ.ID: S TIPO DE SEQUÊNCIA: nucleótido COMPRIMENTO DA SEQUÊNCIA: 223 pares de bases CADEIA: TOPOLOGIA: TIPO DE MOLÉCULA FONTE: CARACTERÍSTICAS: simples linear DNA sintético sintética gene HV-1 de tipo hirudina com um adaptador de 5 aminoácidos (correspondente ao terminal c do factor a) no terminal amino; de 1 a 6 pb (AAGCTT) é o sítio

HindIII de 118 a 123 pb (GGATCC) é o sítio BamI. AAGCTTGGAT AAAAGAGTTG TTTACACCGA CTGTACTGAA TCCGGACAAA 50 ACCTGTGTTT GTGTGAGGGT TCTAACGTCT GTGGTCAGGG TAACAAATGC 100 ATCCTGGGTT CCGACGGTGA AAAGAACCAA TGTGTCACTG GTGAAGGTAC 150 CCCAAAGCCG CAGTCCCACA ACGATGGAGA TTTCGAAGAA ATCCCAGAAG 200

AATATCTGCA GTAATAGGGA TCC 223 6 60 SEQ.ID: TIFO DE SEQUÊNCIA: COMPRIMENTO DA SEQUÊNCIA CADEIA: TOPOLOGIA: , TIPO DE MOLÉCULA: FONTE: CARACTERÍSTICAS: nucleótido 223 pares de bases dupla linear DNA sintético sintética oligómeros concebidos para a construção do gene HV-l de tipo sintético. BB2011 BB2013 AGCTTACCTG CCATGGTTGT TTACACCGAC TGTACTGAAT C CGGACAAAA 50 !11[11 iiiiiiiiii mmmi mmmi i n ATGGAC GGTACCAACA AATGTGGCTG ACATGACTTA GGCCTGTT TT BB2012 BB2015 I CCTGTGTTTG TGTGAGGGTT CTAACGTC TG TGGTCAGGGT AACAAATGCA 100 iiiimni mmiiii iiiiini mu iimmii

GGACACAAAC ACACTCCCAA GATTGCAGACACC AG TCCCA TTGTTTACGT BB2014 BB2017 TCCTGGGTTC CGACGGTG AA AAGAACCAAT GTGTCACTGG TGAAGGTACC 150 1111111111 llllllll i 111! 11 (! 11! 11 { IMIlillll BB2018 AGGACCCAAG GCTGCCACTTTTCT T GGTTA CACAGTGACC ACTTCCATGG BB2016 61 ΒΒ2019 CCA AAGCCGC AGTCCCACAA CGATGGAGAT TTCGAAGAAA TC CCAGAAGA 200 ui miiimi iiiiiiiin iniiiiiii n i

GGTTTCGGCG TÇAGGGTGTT GCTACCTCTA AAGCTTCTTT AGGGTCTTC T BB2020 BB2021 ATATCTGCAG TAATAGGGAT CCG 223 mimmim iiimim mi

TATAGACGTC ATTATCCCTA GGCTTAA BB2022 SEQ.ID:

TIPO DE SEQUÊNCIAS COMPRIMENTO DA SEQUÊNCIA: CARACTERÍSTICASS

PROPRIEDADES S ) 7 proteína 12 aminoácidos resíduos 400-411 da cadeia gama do fibrinogénio sítio de ligação a plaquetas (HHLGGAKQAGDV)

His His Leu Gly Gly Ala Lys Gin Ala Gly Asp Vai 5 10 SEQ.ID: 8 TIPO DE SEQUÊNCIA: proteína COMPRIMENTO DA SEQUÊNCIA: 6 aminoácidos PROPRIEDADES: sequência de afinidade para a integrina na fibronectina

Gly Arg Gly Asp Ser Pro 5 SEQ.ID: TIPO DE SEQUÊNCIA: COMPRIMENTO DA SEQUÊNCIA: PROPRIEDADES: 9 proteína 5 aminoácidos sequência de afinidade para a integrina na cadeia kapa da caseína

Lys Asn Gin Asp Lys 5 SEQ.ID: 10 TIPO DE SEQUÊNCIA: proteína COMPRIMENTO DA SEQUÊNCIA: 6 aminoácidos

His Glu Arg Gly Asp Vai 5 63

SEQ.ID: TIPO DE SEQUÊNCIA: COMPRIMENTO DA SEQUÊNCIA: CADEIA: TOPOLOGIA: TIPO DE MOLÉCULA: CARACTERÍSTICAS:

CAGGGTTTTC CCAGTCACG SEQ.ID: TIPO DE SEQUÊNCIA: COMPRIMENTO DA SEQUÊNCIA: CADEIA: TOPOLOGIA: TIPO DE MOLÉCULA: CARACTERÍSTICAS:

AGCTTGGATA AAAGA

I SEQ.ID: TIPO DE SEQUÊNCIA: COMPRIMENTO DA SEQUÊNCIA: CADEIA: TOPOLOGIA: TIPO DE MOLÉCULA: CARACTERÍSTICAS : 11 nucleõtido 19 pares de bases simples linear DNA sintético iniciador (primer) complementar à região de puci9 19 12 nucleõtido 15 pares de bases simples linear DNA sintético codifica 5 aminoácidos do terminal carboxilo do factor alfa 15 13 nucleõtido 11 pares de bases simples linear DNA sintético complementar a parte da SEQ.ID: 12 11

TCTTTATCC A 64

SEQ.ID: 14 TIPO DE SEQUÊNCIA: nucleótido COMPRIMENTO DA SEQUÊNCIA: CADEIA: TOPOLOGIA: 42 pares de bases simples linear TIPO DE MOLÉCULA: DNA sintético CARACTERÍSTICAS: iniciador de mutagénese utilizado para hirudina-RGDW CGGGGATCCC TATTACCAGT CACCGCGCTG CAGATATTCT TC 42

SEQ.ID: 15 TIPO DE SEQUÊNCIA: nucleótido COMPRIMENTO DA SEQUÊNCIA: CADEIA: 42 pares de bases simples topologia: linear TIPO DE MOLÉCULA: DNA sintético CARACTERÍSTICAS: iniciador de mutagénese utilizado para hirudina-RGDF CGGGGATCCC TATTAGAAGT CACCGCGCTG CAGATATTCT TC 42 SEQ.ID: 16 TIPO DE SEQUÊNCIA: nucleótido COMPRIMENTO DA SEQUENCIA: 42 pares de bases

CADEIA: simples TOPOLOGIA: linear TIPO DE MOLÉCULA: DNA sintético CARACTERÍSTICAS: iniciador de mutagénese utilizado para hirudina-RGDV

65 CGGGGATCCC TATTAAACGT CACCGCGCTG CAGATATTCT TC 42

SEQ.ID: TIFO DE SEQUÊNCIA: COMPRIMENTO DA SEQUÊNCIA CADEIA: TOPOLOGIA: TIPO DE MOLÉCULA: CARACTERÍSTICAS:

17 nucleótido 42 pares de bases simples linear DNA sintético iniciador de mutagénese utilizado para hirudina-RGDS

CGGGGATCCC TATTAGCTGT CACCGCGCTG CAGATATTCT TC 42 SEQ.ID: TIPO DE SEQUÊNCIA: COMPRIMENTO DA SEQUÊNCIA: 18 proteína 6 aminoácidos

Lys Gin Ala Gly Asp Vai 5 SEQ.ID: TIPO DE SEQUÊNCIA: COMPRIMENTO DA SEQUÊNCIA CADEIA: TOPOLOGIA: FONTE: 19 nucleótido 7984 pares de bases simples circular experimental 66

1 TTCCCATGTC TCTACTGGTG GTGGTGCTTC TTTGGAATTA TTGGAAGGTA 50 51 AGGAATTGCC AGGTGTTGCT TTCTTATCCG AAAAGAAATA AATTGAATTG 100 101 AATTGAAATC GATAGATCAA TTTTTTTCTT TTCTCTTTCC CCATCCTTTA 150 151 CGCTAAAATA ATAGTTTATT TTATTTTTTG AATATTTTTT ATTTATATAC 200 201 GTATATATAG ACTATTATTT ACTTTTAATA GATTATTAAG ΑΤΊΤΊΤΑΤΤΑ 250 251 AAAAAAAATT CGTCCCTCTT TTTAATGCCT TTTATGCAGT TTTTTTTTCC 300 301 CATTCGATAT TTCTATGTTC GGGTTTCAGC GTATTTTAAG TTTAATAACT 350 351 CGAAAATTCT GCGTTTCGAA AAAGCTCTGC ATTAATGAAT CGGCCAACGC 400 401 GCGGGGAGAG GCGGTTTGCG TATTGGGCGC TCTTCCGCTT CCTCGCTCAC 450 451 TGACTCGCTG CGCTCGGTCG TTCGGCTGCG GCGAGCGGTA TCAGCTCACT 500 501 CAAAGGCGGT AATACGGTTA TCCACAGAAT CAGGGGATAA CGCAGGAAAG 550 551 AACATGTGAG CAAAAGGCCA GCAAAAGGCC AGGAACCGTA AAAAGGCCGC 600 601 GTTGCTGGCG TTTTTCCATA GGCTCCGCCC CCCTGACGAG CATCACAAAA 650 651 ATCGACGCTC AAGTCAGAGG TGGCGAAACC CGACAGGACT ATAAAGATAC 700 701 CAGGCGTTTC CCCCTGGAAG CTCCCTCGTG CGCTCTCCTG TTCCGACCCT 750 751 GCCGCTTACC GGATACCTGT CCGCCTTTCT CCCTTCGGGA AGCGTGGCGC 800 801 TTTCTCATAG CTCACGCTGT AGGTATCTCA GTTCGGTGTA GGTCGTTCGC 850 851 TCCAAGCTGG GCTGTGTGCA CGAACCCCCC GTTCAGCCCG ACCGCTGCGC 900 901 CTTATCCGGT AACTATCGTC TTGAGTCCAA CCCGGTAAGA CACGACTTAT 950 951 CGCCACTGGC AGCAGCCACT GGTAACAGGA TTAGCAGAGC GAGGTATGTA 1000 1001 GGCGGTGCTA CAGAGTTCTT GAAGTGGTGG CCTAACTACG GCTACACTAG 1050 1051 AAGGACAGTA TTTGGTATCT GCGCTCTGCT GAAGCCAGTT ACCTTCGGAA 1100 1101 AAAGAGTTGG TAGCTCTTGA TCCGGCAAAC AAACCACCGC TGGTAGCGGT 1150 1151 GGTTTTTTTG TTTGCAAGCA GCAGATTACG CGCAGAAAAA AAGGATCTCA 1200 1201 AGAAGATCCT TTGATCTTTT CTACGGGGTC TGACGCTCAG TGGAACGAAA 1250 1251 ACTCACGTTA AGGGATTTTG GTCATGAGAT TATCAAAAAG GATCTTCACC 1300 1301 TAGATCCTTT TAAATTAAAA ATGAAGTTTT AAATCAATCT AAAGTATATA 1350 1351 TGAGTAAACT TGGTCTGACA GTTACCAATG CTTAATCAGT GAGGCACCTA 1400 1401 TCTCAGCGAT CTGTCTATTT CGTTCATCCA TAGTTGCCTG ACTCCCCGTC 1450 1451 GTGTAGATAA CTACGATACG GGAGGGCTTA CCATCTGGCC CCAGTGCTGC 1500 1501 AATGATACCG CGAGACCCAC GCTCACCGGC TCCAGATTTA TCAGCAATAA 1550 1551 ACCAGCCAGC CGGAAGGGCC GAGCGCAGAA GTGGTCCTGC AACTTTATCC 1600 1601 GCCTCCATCC AGTCTATTAA TTGTTGCCGG GAAGCTAGAG TAAGTAGTTC 1650 1651 GCCAGTTAAT AGTTTGCGCA ACGTTGTTGC CATTGCTACA GGCATCGTGG 1700 1701 TGTCACGCTC GTCGTTTGGT ATGGCTTCAT TCAGCTCCGG TTCCCAACGA 1750 1751 TCAAGGCGAG TTACATGATC CCCCATGTTG TGCAAAAAAG CGGTTAGCTC 1800 1801 CTTCGGTCCT CCGATCGTTG TCAGAAGTAA GTTGGCCGCA GTGTTATCAC 1850 1851 TCATGGTTAT GGCAGCACTG CATAATTCTC TTACTGTCAT GCCATCCGTA 1900 1901 AGATGCTTTT CTGTGACTGG TGAGTACTCA ACCAAGTCAT TCTGAGAATA 1950 1951 GTGTATGCGG CGACCGAGTT GCTCTTGCCC GGCGTCAACA CGGGATAATA 2000 2001 CCGCGCCACA TAGCAGAACT TTAAAAGTGC TCATCATTGG AAAACGTTCT 2050 2051 TCGGGGCGAA AACTCTCAAG GATCTTACCG CTGTTGAGAT CCAGTTCGAT 2100 2101 GTAACCCACT CGTGCACCCA ACTGATCTTC AGCATCTTTT ACTTTCACCA 2150 2151 GCGTTTCTGG GTGAGCAAAA ACAGGAAGGC AAAATGCCGC AAAAAAGGGA 2200 2201 ATAAGGGCGA CACGGAAATG TTGAATACTC ATACTCTTCC TTTTTCAATA 2250 2251 TTATTGAAGC ATTTATCAGG GTTATTGTCT CATGAGCGGA TACATATTTG 2300 2301 AATGTATTTA GAAAAATAAA CAAATAGGGG TTCCGCGCAC ATTTCCCCGA 2350 2351 AAAGTGCCAC CTGACGTCTA AGAAACCATT ATTATCATGA CATTAACCTA 2400 2401 TAAAAATAGG CGTATCACGA GGCCCTTTCG TCTTCAAGAA TTCTGAACCA 2450 2451 GTCCTAAAAC GAGTAAATAG GACCGGCAAT TCTTCAAGCA ATAAACAGGA 2500 2501 ATACCAATTA TTAAAAGATA ACTTAGTCAG ATCGTACAAT AAagctAGCT 2550 2551 TTGAAGAAAA ATGCGCCTTA TTCAATCTTT GCTATAAAAA ATGGCCCAAA 2600 2601 ATCTCACATT GGAAGACATT TGATGACCTC ATTTCTTTCA ATGAAGGGCC 2650 2651 TAACGGAGTT GACTAATGTT GTGGGAAATT GGAGCGATAA GCGTGCTTCT 2700 2701 GCCGTGGCCA GGACAACGTA TACTCATCAG ATAACAGCAA TACCTGATCA 2750 2751 CTACTTCGCA CTAGTTTCTC GGTACTATGC ATATGATCCA ATATCAAAGG 2800 2801 AAATGATAGC ATTGAAGGAT GAGACTAATC CAATTGAGGA GTGGCAGCAT 2850 2851 ATAGAACAGC TAAAGGGTAG TGCTGAAGGA AGCATACGAT ACCCCGCATG 2900 2901 GAATGGGATA ATATCACAGG AGGTACTAGA CTACCTTTCA TCCTACATAA 2950

tí£'Sl ATAGACGCAT ATAAGTACGC ATTTAAGCAT AAACACGCAC TATGCCGTTC 3001 TTCTCATGTA TATATATATA CAGGCAACAC GCAGATATAG GTGCGACGTG 3051 AACAGTGAGC TGTATGTGCG CAGCTCGCGT TGCATTTTCG GAAGCGCTCG 3101 TTTTCGGAAA CGCTTTGAAG TTCCTATTCC GAAGTTCCTA TTCTCTAGAA 3151 AGTATAGGAA CTTCAGAGCG CTTTTGAAAA CCAAAAGCGC TCTGAAGACG 3201 CACTTTCAAA AAACCAAAAA CGCACCGGAC TGTAACGAGC TACTAAAATA 3251 TTGCGAATAC CGCTTCCACA AACATTGCTC AAAAGTATCT CTTTGCTATA 3301 TATCTCTGTG CTATATCCCT ATATAACCTA CCCATCCACC TTTCGCTCCT 3351 TGAACTTGCA TCTAAACTCG ACCTCTACAT TTTTTATGTT TATCTCTAGT 3401 ATTACTCTTT AGACAAAAAA ATTGTAGTAA GAACTATTCA TAGAGTGAAT 3451 CGAAAACAAT ACGAAAATGT AAACATTTCC TATACGTAGT ATATAGAGAC 3501 AAAATAGAAG AAACCGTTCA TAATTTTCTG ACCAATGAAG AATCATCAAC 3551 GCTATCACTT TCTGTTCACA AAGTATGCGC AATCCACATC GGTATAGAAT 3601 ATAATCGGGG ATGCCTTTAT CTTGAAAAAA TGCACCCGCA GCTTCGCTAG 3651 TAATCAGTAA ACGCGGGAAG TGGAGTCAGG CTTTTTTTAT GGAAGAGAAA 3701 ATAGACACCA AAGTAGCCTT CTTCTAACCT TAACGGACCT ACAGTGCAAA 3751 AAGTTATCAA GAGACTGCAT TATAGAGCGC ACAAAGGAGA AAAAAAGTAA 3801 TCTAAGATGC TTTGTTAGAA AAATAGCGCT CTCGGGATGC ATTTTTGTAG 3851 AACAAAAAAG AAGTATAGAT TCTTTGTTGG TAAAATAGCG CTCTCGCGTT 3901 GCATTTCTGT TCTGTAAAAA TGCAGCTCAG ATTCTTTGTT TGAAAAATTA 3951 GCGCTCTCGC GTTGCATTTT TGTTTTACAA AAATGAAGCA CAGATTCTTC 4001 GTTGGTAAAA TAGCGCTTTC GCGTTGCATT TCTGTTCTGT AAAAATGCAG 4051 CTCAGATTCT TTGTTTGAAA AATTAGCGCT CTCGCGTTGC ATTTTTGTTC 4101 TACAAAATGA AGCACAGATG CTTCGTTAAC AAAGATATGC TATTGAAGTG 4151 CAAGATGGAA ACGCAGAAAA TGAACCGGGG ATGCGACGTG CAAGATTACC 4201 TATGCAATAG ATGCAATAGT TTCTCCAGGA ACCGAAATAC ATACATTGTC 4251 TTCCGTAAAG CGCTAGACTA TATATTATTA TACAGGTTCA AATATACTAT 4301 CTGTTTCAGG GAAAACTCCC AGGTTCGGAT GTTCAAAATT CAATGATGGG 4351 TAACAAGTAC GATCGTAAAT CTGTAAAACA GTTTGTCGGA TATTAGGCTG 4401 TATCTCCTCA AAGCGTATTC GAATATCATT GAGAAGCTGC ATTTTTTTTT 4451 TTTTTTATAT ATATTTCAAG GATATACCAT TGTAATGCCT GCCCCTAAGA 4501 AGATCGTCGT TTTGCCAGGT GACCACGTTG GTCAAGAAAT CACAGCCGAA 4551 GCCATTAAGG TTCTTAAAGC TATTTCTGAT GTTCGTTCCA ATGTCAAGTT 4601 CGATTTCGAA AATCATTTAA TTGGTGGTGC TGCTATCGAT GCTACAGGTG

4651 TTCCACTTCC 4701 TTGTTAGGTG 4751 TGAACAAGGT 4801 TAAGACCATG 4851 AAGCCACAAT 4901 GGGAGGTATT 4951 CTTGGGATAG 5001 ATGGCCGCTT 5051 CTTGGATAAA 5101 TGGAGGAAAC 5151 TTGATTGATT 5201 TGGTATTATA 5251 CCTCCGTTAT 5301 TCTTTGCCAG 5351 TTCCGCTCCA 5401 TGTCTGCTGC 5451 AAAGCCATTG 5501 TGGTGATTTA 5551 CCGAAGAAGT 5601 TATTTGTACA 5651 AAAAAAAAAA 5701 TGTAGAAGTG 5751 TACTACATCG 5801 GATCAATAGA 5851 CTGAGCGGAA 5901 AGTCCGTGGA 5951 CTAACTGATC 6001 CAGGCAAATG 6051 CTCATTGGTC 6101 TCTTAATAAC 6151 GACAAAATCT 6201 CACAATGACA 6251 CTTTCATCCG 6301 TGCAAACCCT

AGATGAGGCG CTGGAAGCCT CTGTGGGTGG TCCTAAATGG TTACTAAAAA TCCGTAAAGA TAACTTTGCA TCCGACTCTC TTGCTAAAGG TACTGACTTC TACTTTGGTA AGAGAAAGGA TGAACAATAC ACCGTTCCAG TCATGGCCCT ACAACATGAG GCTAATGTTT TGGCCTCTTC CATCAAGAAC GAATTCCCTA CTGCCGCCAT GATCCTAGTT ATCACCAGCA ACATGTTTGG CCCAGGCTCC TTGGGTTTGT ACAAGAACAC CGCATTTGGT GATTTGCCAA AGAATAAGGT AATGATGTTG AAATTGTCAT AAGATGCAGT TAAAAAGGTT GGTGGTTCCA ACAGTACCAG TAAGAAAATC CTTGCTTAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAATGCAGC GTCACATCGG CctttTGCAT TTCTAGTCTC CGAAGATAGA ATCTTAGATC GTAACAAAAG AGTGGTAAGG GTGTATCGTA CAGTAGACGG ATTCTCATGT TTGACAGCTT TATCCAAAAC TGAAAATTAC TAATTTGTGG TATTTTGCCG ACATTACAAC CTGAAAATAC ATGTCCCCTT AATACTAGGA TCTTGACAAA CGTCACAATT GGTGTCATTT TGTGCTCTTA GTGATTGACC GCCACAGAGG TCTATACACT CACATCTACC

CCAAGAAGGC TGATGCCGTT GGTACCGGTA GTGTTAGACC ACTTCAATTG TACGCCAACT TTTTAGACTT ATCTCCAATC GTTGTTGTTA GAGAATTAGT AGACGATGGT GATGGTGTCG AAGTGCAAAG AATCACAAGA CCACCATTGC CTATTTGGTC AAGATTATGG AGAAAAACTG CATTGAAAGT TCAACATCAA AAGAACCCAA CCCACCTAAA TGATATCATC TCCGATGAAG TGCCATCTGC GTCCTTGGCC TTGTACGAAC CATGCCATGG CAACCCTATC GCCACTATCT TGAACTTGCC TGAAGAAGGT TTGGATGCAG GTATCAGAAC CGAAGTCGGT GATGCTGTCG AAGATTCTCT TTTTTTATGA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA ATAATAATGA TGGCAGCCAT TTTCTCGGTC TAGCTAGTTT ACACTGCCTT TGCTGAGCTG CCTCGTTAAA GGACAAGGAC AGTATACTAG TATAGTCTAT ATCATCGATA agctAGCTTT ATTCTTGATT AGGTTTATCA TTCAAAATCT GTAGAATTTT TTTATCTACA ATCATACCAT TCAGGCATGA ACGCATCACA GATCCCTCCC CATCCGTTAT TGGGACGATC CTTATTACCG GGCAGAGAGC AATCATCACC AGTGATCGAA TTGCATTCAG 4700 4750 4800 4850 4900 4950 5000 5050 5100 5150 5200 5250 5300 5350 5400 5450 5500 5550 5600 5650 5700 5750 5800 5850 5900 5950 6000 6050 6100 6150 6200 6250 6300 6350 70

6351 AAAACTGTTT GCATTCAAAA ATAGGTAGCA TACAATTAAA ACATGGCGGG 6400 6401 CATGTATCAT TGCCCTTATC TTGTGCAGTT AGACGCGAAT TTTTCGAAGA 6450 6451 AGTACCTTCA AAGAATGGGG TCTTATCTTG TTTTGCAAGT ACCACTGAGC 6500 6501 AGGATAATAA TAGAAATGAT AATATACTAT AGTAGAGATA ACGTCGATGA 6550 6551 CTTCCCATAC TGTAATTGCT TTTAGTTGTG TATTTTTAGT GTGCAAGTTT 6600 6601 CTGTAAATCG ATTAATTTTT TTTTCTTTCC TCTTTTTATT AACCTTAATT 6650 6651 TTTATTTTAG ATTCCTGACT TCAACTCAAG ACGCACAGAT ATTATAACAT 6700 6701 CTGCATAATA GGCATTTGCA AGAATTACTC GTGAGTAAGG AAAGAGTGAG 6750 6751 GAACTATCGC ATACCTGCAT TTAAAGATGC CGATTTGGGC GCGAATCCTT 6800 6801 TATTTTGGCT TCACCCTCAT ACTATTATCA GGGCCAGAAA AAGGAAGTGT 6850 6851 TTCCCTCCTT CTTGAATTGA TGTTACCCTC ATAAAGCACG TGGCCTCTTA 6900 6901 TCGAGAAAGA AATTACCGTC GCTCGTGATT TGTTTGCAAA AAGAACAAAA 6950 6951 CTGAAAAAAC CCCGGATCTT TTGAATTCCC ACGGATTAGA AGCCGCCGAG 7000 7001 CGGGTGACAG CCCTCCGAAG GAAGACTCTC CTCCGTGCGT CCTCGTCTTC 7050 7051 ACCGGTCGCG TTCCTGAAAC GCAGATGTGC CTCGCGCCGC ACTGCTCCGA 7100 7101 ACAATAAAGA TTCTACAATA CTAGGGGGAT CGGTCGTCAC ACAACAAGGT 7150 7151 CCTAGCGACG GCTCACAGGT TTTGTAACAA GCAATCGAAG GTTCTGGAAT 7200 7201 GGCGGGGAAA GGGTTTAGTA CCACATGCTA TGATGCCCAC TGTGATCTCC 7250 7251 AGAGCAAAGT TCGTTCGATC GTACTGTACT CTCTCTCTTT CAAACAGAAT 7300 7301 TGTCCGAATC GTGTGACAAC AACAGCCTGT TCTCACACAC TCTTTTCTTC 7350 7351 TAACCAAGGG GGTGGTTTAG TTTAGTAGAA CCTCGTGAAA CTTACATTTA 7400 7401 CATATATATA AACTTGCATA AATTGGTCAA TGGAAGAAAT ACATATTTGG 7450 7451 TCTTTTCTAA TTCGTAGTTT TTCAAGTTCT TAGATGCTTT CTTTTTCTCT 7500 7501 TTTTTACAGA TCATCAAGGA AGTAATTATC TACTTTTTAC AACAAATACA 7550 7551 AAAGATCTAT GAGATTTCCT TCAATTTTTA CTGCAGTTTT ATTCGCAGCA 7600 7601 TCCTCCGCAT TAGCTGCTCC AGTCAACACT ACAACAGAAG ATGAAACGGC 7650 7651 ACAAATTCCG GCTGAAGCTG TCATCGGTTA CTTAGATTTA GAAGGGGATT 7700 7701 TCGATGTTGC TGTTTTGCCA TTTTCCAACA GCACAAATAA CGGGTTATTG 7750 7751 TTTATAAATA CTACTATTGC CAGCATTGCT GCTAAAGAAG AAGGGGTAAG 7800 7801 CTTGGATAAA AGAAACAGCG ACTCTGAATG CCCGCTGAGC CATGATGGCT 7850 7851 ACTGCCTGCA CGACGGTGTA TGCATGTATA TCGAAGCTCT GGACAAATAC 7900 7901 7951 GCATGCAACT CCTGAAATGG GCGTAGTTGG TGGGAGCTCC TTACATCGGC GTTAATAAGG GAACGTTGCC ATCC 7984 AGTACCGCGA 7950 71 SEQ.ID: 20 TIPO DE SEQUÊNCIA: proteína COMPRIMENTO DA SEQUÊNCIA: 4 aminoácidos PROPRIEDADES: sequência de afinidade para a integrina no colagênio (DGEA) 21 proteína 4 aminoácidos sequência de afinidade para a integrina na fibronectina (REDV)

Asp Gly Glu Ala SEQ.ID: TIPO DE SEQUÊNCIA: COMPRIMENTO DA SEQUÊNCIA: PROPRIEDADES:

Arg Glu Asp Vai SEQ.ID: 22 TIPO DE SEQUÊNCIA: proteína COMPRIMENTO DA SEQUÊNCIA: 4 aminoácidos PROPRIEDADES: sequência de afinidade para a integrina na barbourina de veneno de cobra (KGDW)

Lys Gly Asp Trp 72 SEQ.ID: 23 tipo de SEQUÊNCIA: proteína comprimento DA sequência: 7 aminoácidos PROPRIEDADES: sequência de afinidade para a integrina selectiva para GPIIb-IIIa e para o receptor da vitronectina (CKGDWPC)

Cys Lys Gly Asp Trp Pro Cys 5 24 SEQ.ID: TIPO DE SEQUÊNCIA: COMPRIMENTO DA SEQUÊNCIA: PROPRIEDADES: proteína 7 aminoácidos sequência de afinidade para a integrina selectiva para GPIIb-IIa (CRGDWPC)

Cys Arg Gly Asp Trp Pro Cys 5 SEQ.ID: 25 TIPO DE SEQUÊNCIA: proteína COMPRIMENTO DA SEQUÊNCIA: 4 aminoácidos PROPRIEDADES: sequência de afinidade para a integrina (RGDS)

Arg Gly Asp Trp 73 SEQ.ID: 26 tipo DE sequência: proteína comprimento da sequência: 4 aminoácidos PROPRIEDADES! Arg Gly Asp Phe sequência de afinidade para a integrina (RGDF) SEQ.ID: 27 TIPO DE SEQUÊNCIA: COMPRIMENTO DA SEQUÊNCIA: proteína 4 aminoácidos PROPRIEDADES: Arg Gly Asp Vai sequência de afinidade para a integrina (RGDV) SEQ.ID: 28 TIPO DE SEQUÊNCIA: proteína COMPRIMENTO DA SEQUÊNCIA: 4 aminoácidos PROPRIEDADES: sequência de afinidade para a integrina (RGDW)

Arg Gly Asp Trp 74 74 SEQ.ID: TIPO DE SEQUÊNCIAS COMPRIMENTO DA SEQUÊNCIA: PROPRIEDADES: 29 proteína 4 aminoácidos sequência de afinidade para a integrina (RGDR)

Arg Gly Asp Arg SEQ.ID: TIPO DE SEQUÊNCIA: COMPRIMENTO DA SEQUÊNCIA: PROPRIEDADES: 30 proteína 4 aminoácidos sequência de afinidade para a integrina (RGDE)

Arg Gly Asp Glu SEQ.ID: TIPO DE SEQUÊNCIA: COMPRIMENTO DA SEQUÊNCIA: PROPRIEDADES: > 31 proteína 4 aminoácidos sequência de afinidade para a integrina (RGDC)

Arg Gly Asp Cys 75 SEQ.ID: 32 TIFO DE SEQUÊNCIA: COMPRIMENTO DA SEQUÊNCIA: proteína 4 aminoácidos PROPRIEDADES! Arg Gly Asp Lys sequência de afinidade para a integrina (RGDK) SEQ.ID: 33 TIPO DE SEQUÊNCIA: COMPRIMENTO DA SEQUÊNCIA: proteína 4 aminoácidos PROPRIEDADES: Arg Gly Asp Leu sequência de afinidade para a integrina (RGDL) SEQ.ID: 34 TIPO DE SEQUÊNCIA: COMPRIMENTO DA SEQUÊNCIA: proteína 4 aminoácidos PROPRIEDADES: sequência de afinidade para a integrina (RGDG)

Arg Gly Asp Gly 76 SEQ.ID: 35 TIFO DE SEQUÊNCIA: COMPRIMENTO DA SEQUÊNCIA: proteína 4 aminoãcidos PROPRIEDADES: Arg Gly Asp Met sequência de afinidade para a integrina (RGDM) SEQ.ID: 36 TIPO DE SEQUÊNCIA: COMPRIMENTO DA SEQUÊNCIA: proteína 4 aminoãcidos PROPRIEDADES: sequência de afinidade para a integrina (RGDQ) Arg Gly Asp Gin SEQ.ID: 37 TIPO DE SEQUÊNCIA: COMPRIMENTO DA SEQUÊNCIA: proteína 4 aminoãcidos PROPRIEDADES: Arg Gly Asp Thr sequência de afinidade para a integrina (RGDT) SEQ.ID: 38 TIPO DE SEQUÊNCIA: COMPRIMENTO DA SEQUÊNCIA: proteína 4 aminoãcidos PROPRIEDADES: sequência de afinidade para a integrina (RGDD)

Arg Gly Asp Asp 77 77 SEQ.ID: TIPO DE SEQUÊNCIA: COMPRIMENTO DA SEQUÊNCIA: PROPRIEDADES: 39 proteína 4 aminoácidos sequência de afinidade para a integrina (RGDN)

Arg Gly Asp Asn SEQ.ID: TIPO DE SEQUÊNCIA: COMPRIMENTO DA SEQUÊNCIA: PROPRIEDADES: 40 proteína 4 aminoácidos sequência de afinidade para a integrina (RGDY)

Arg Gly Asp Thr SEQ.ID: TIPO DE SEQUÊNCIA: COMPRIMENTO DA SEQUÊNCIA PROPRIEDADES: 41 proteína 4 aminoácidos sequência de afinidade para a integrina (RGDP)

Arg Gly Asp Pro 78 SEQ.ID: 42 TIPO DE SEQUÊNCIA: proteína COMPRIMENTO DA SEQUÊNCIA: 4 aminoácidos PROPRIEDADES: sequência de afinidade para a integrina (RGDI)

Arg Gly Asp Ile SEQ.ID: 43 TIPO DE SEQUÊNCIA: proteína COMPRIMENTO DA SEQUÊNCIA: 4 aminoácidos PROPRIEDADES: sequência de afinidade para a integrina (R6DA)

Arg Gly Asp Ala SEQ.ID: 44 TIPO DE SEQUÊNCIA: proteína COMPRIMENTO DA SEQUÊNCIA: 4 aminoácidos PROPRIEDADES: sequência de afinidade para a integrina (RGDH)

Arg Gly Asp His SEQ.ID: TIPO DE SEQUÊNCIA: COMPRIMENTO DA SEQUÊNCIA: PROPRIEDADES: 45 proteína 5 aminoácidos sequência de afinidade para a integrina (GREDV)

Gly Arg Glu Asp Vai 5 SEQ.ID: TIPO DE SEQUÊNCIA: COMPRIMENTO DA SEQUÊNCIA: PROPRIEDADES: 46 proteína 6 aminoácidos sequência de afinidade para a integrina (GKDGEA)

Gly Lys Asp Gly Glu Ala 5 SEQ.ID: TIPO DE SEQUÊNCIA: COMPRIMENTO DA SEQUÊNCIA: PROPRIEDADES: 47 proteína 4 aminoácidos sequência de afinidade para a integrina (SGDR)

Ser Gly Asp Arg SEQ.ID: TIPO DE SEQUÊNCIA: COMPRIMENTO DA SEQUÊNCIA: PROPRIEDADES: 48 proteína 4 aminoácidos sequência de afinidade para a integrina (H6DF)

His Gly Asp Phe SEQ.ID: TIPO DE SEQUÊNCIA: COMPRIMENTO DA SEQUÊNCIA CADEIA: TOPOLOGIA: TIPO DE MOLÉCULA: CARACTERÍSTICAS: 49 nucleôtido 30 pares de bases simples linear

DNA sintético : BB4395 iniciador de mutagénese utilizado para hirudina-RGDR/E/C 30

GGATCCCTAT TANNNGTCAC CGCGCTGCAG SEQ.ID: TIPO DE SEQUÊNCIA: COMPRIMENTO DA SEQUÊNCIA: CADEIA: TOPOLOGIA: TIPO DE MOLÉCULA: CARACTERÍSTICAS: 50 nucleôtido 28 pares de bases simples linear

DNA sintético : BB4882 iniciador de mutagénese H=C# A ou T B=T, C OU G 28

GGATCCCTAT TACHBGTCAC CGCGCTGC SEQ.ID: TIPO DE SEQUÊNCIA! COMPRIMENTO DA SEQUÊNCIA: CADEIA: TOPOLOGIA: TIPO DE MOLÉCULA: CARACTERÍSTICAS:

GGATCCCTAT TAADNGTCAC

51 nucleôtido 28 pares de bases simples linear DNA sintético : BB4883 iniciador de mutagénese N = G, T, A ou c D = G, A OU T CGCGCTGC 28 SEQ.ID: TIPO DE SEQUÊNCIA: COMPRIMENTO DA SEQUÊNCIA: CADEIA: TOPOLOGIA: TIPO DE MOLÉCULA: CARACTERÍSTICAS: 52 nucleôtido 28 pares de bases simples linear

DNA sintético : BB5258 iniciador de mutagénese para hirudina-RGDA utilizado

GGATCCCTAT TAAGCGTCAC CGCGCTGC 28 82

seq.id: TIPO DE SEQUÊNCIA: COMPRIMENTO DA SEQUÊNCIA CADEIA: TOPOLOGIA: TIPO DE MOLÉCULA: CARACTERÍSTICAS: 53 nucleótido 28 pares de bases simples linear

DNA sintético : BB5259 iniciador de mutagénese utilizado para hirudina-RGDH >

GGATCCCTAT TAGTGGTCAC CGCGCTGC 28 SEQ.ID: TIPO DE SEQUÊNCIA: COMPRIMENTO DA SEQUÊNCIA: CADEIA: TOPOLOGIA: TIPO DE MOLÉCULA: CARACTERÍSTICAS: 54 nucleótido 42 pares de bases simples linear DNA sintético : BB6282 iniciador de mutagénese utilizado

para hirudina-GREDV GGATCCCTAT TAAACGTCTT CGCGACCCTG CAGATATTCT TC 42

I SEQ.ID: TIPO DE SEQUÊNCIA: COMPRIMENTO DA SEQUÊNCIA CADEIA: TOPOLOGIA: TIPO DE MOLÉCULA: CARACTERÍSTICAS: 55 nucleótido 63 pares de bases simples linear

DNA sintético : BB6283 iniciador de mutagénese utilizado para hirudina-HHLGGAKQAGDV GGATCCCTAT TAAACATCAC CTGCCTGTTT TGCACCACCC AGGTGGTGCT 50 GCAGATATTC TTC 63 SEQ.ID: TIPO DE SEQUÊNCIA: COMPRIMENTO DA SEQUÊNCIA CADEIA: TOPOLOGIA: TIPO DE MOLÉCULA: CARACTERÍSTICAS: 56 nucleótido 48 pares de bases simples linear

DNA sintético : BB6284 iniciador de mutagénese utilizado para hirudina-CRGDWPC 48

GGATCCCTAT TAACATGGCC AGTCACCGCG ACACTGCAGA TATTCTTC SEQ.ID: 57 TIPO DE SEQUÊNCIA: nucleótido COMPRIMENTO DA SEQUÊNCIA: 48 pares de bases CADEIA: simples TOPOLOGIA s 1inear TIPO DE MOLÉCULA: DNA sintético : BB6285 CARACTERÍSTICAS: iniciador de mutagénese utilizado

para hirudina-CKGDWPC GGATCCCTAT TAACATGGCC AGTCACCCTT ACACTGCAGA TATTCTTC 48

SEQ.ID: TIPO DE SEQUÊNCIA: COMPRIMENTO DA SEQUÊNCIA: CADEIA: TOPOLOGIA: TIPO DE MOLÉCULA: CARACTERÍSTICASS 58 nucleótido 45 pares de bases simples linear

DNA sintético : BB6281 iniciador de mutagénese utilizado para hirudina-CKDGEA 45

GAATCCCTAT TATGCTTCAC CGTCTTTACC CTGCAGATAT TCTTC SEQ.ID: 59 TIPO DE SEQUÊNCIA: nucleótido COMPRIMENTO DA SEQUÊNCIA: 42 pares de bases CADEIA: simples TOPOLOGIA: linear TIPO DE MOLÉCULA: DNA sintético : BB4404 CARACTERÍSTICAS: iniciador de mutagénese utilizado

para IEGR hirudina-RGDW GTCGGTGTAA ACAACTCTTC CTTCGATTCT TTTATCCAAG CT 42 60 SEQ.ID: TIPO DE SEQUÊNCIA: COMPRIMENTO DA SEQUÊNCIA: CADEIA: TOPOLOGIA: TIPO DE MOLÉCULA: CARACTERÍSTICAS: nucleótido 34 pares de bases simples linear

DNA sintético : BB4401 iniciador de mutagénese utilizado para hirudina [I1,T1]-RGDW 34

GTACAGTCGG TGTAGGTGAT TCTTTTATCC AAGC SEQ.ID: 61 TIPO DE SEQUÊNCIA: nucleótido COMPRIMENTO DA SEQUÊNCIA: 29 pares de bases CADEIA: simples TOPOLOGIA: linear TIPO DE MOLÉCULA: DNA sintético : BB4402 utilizado CARACTERÍSTICAS: iniciador de mutagênese

para hirudina[K24]-RGDW 29

GCATTTGTTA CCTTTACCAC AGACGTTAG SEQ.ID: TIPO DE SEQUÊNCIA: COMPRIMENTO DA SEQUÊNCIA: CADEIA: TOPOLOGIA: TIPO DE MOLÉCULA: CARACTERÍSTICAS: 62 nucleótido 22 pares de bases simples linear

DNA sintético : BB6420 iniciador de mutagênese para hirudina-GKDGEA utilizado

GTACCCGGGG ATCCCTATTA TG 22

Claims

87 REIVINDICAÇÕES
14. - Processo para a preparação de uma proteína compreendendo um primeiro péptido tendo actividade farmacológica e um segundo péptido de não mais do que quinze aminoácidos de comprimento, estando o segundo péptido localizado no terminal carboxilo da proteína e compreendendo uma sequência de afinidade para a integrina, sendo a proteína diferente de uma proteína que possui naturalmente uma sequência de afinidade para a integrina no seu terminal carboxilo, caracterizado por compreender o acoplamento, uns com os outros, de resíduos de sucessivos aminoácidos e/ou oligo- e/ou polipéptidos.
24. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a actividade farmacológica ser actividade antitrom-bótica.
34. - Processo de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado por a proteína ser capaz de inibir a conversão do fibrinogénio a fibrina, por trombina.
44. - Processo de acordo com a reivindicação 1, 2 ou 3, caracterizado por o primeiro péptido ser hirudina, ou um fragmento de hirudina ou uma sua variante.
54. - Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado por o primeiro péptido ser hirudina do tipo HV-1, HV-2 ou HV-3.
64. - Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado por a sequência de afinidade para a integrina compreender a sequência -RGDX onde X não representa nada ou representa um qualquer aminoácido. 7». - Processo de acordo com a reivindicação 6, carac-terizado por X representar S, V, W ou F. 8*. - Processo de acordo com as reivindicações 6 ou 7, caracterizado por X representar S. 9a. - Processo de preparação de um ácido nucleico que codifica uma proteína, compreendendo a proteína um primeiro péptido tendo actividade farmacológica e um segundo péptido de não mais do que quinze aminoácidos de comprimento, estando o segundo péptido localizado no terminal carboxilo da proteína e compreendendo uma sequência de ligação à integrina, sendo a proteína diferente de uma proteína que possui naturalmente uma sequência de afinidade para a integrina no seu terminal carboxilo, caracterizado por compreender o acoplamento, uns com os outros, de sucessivos nucleótidos e/ou oligo- e/ou polinucleó-tidos ligantes.
103. - Processo de acordo com a reivindicação 9, caracterizado por o ácido nucleico codificar uma proteína preparada como em qualquer uma das reivindicações 2 a 8. lia. - Processo de preparação de um vector compreendendo um ácido nucleico de acordo com a reivindicação 9 ou 10, caracterizado por compreender o acoplamento, uns com os outros, de nucleótidos sucessivos e/ou oligo- e/ou polinucleótidos ligantes. 89 12a. - Processo de preparação de um hospedeiro, carac-terizado por compreender a transformação ou transfecção de um hospedeiro com um vector como preparado na reivindicação 11. 133. - processo de acordo com a reivindicação 12, caracterizado por o hospedeiro ser Saccharomvces cerevisiae ou Pichia pastoris.
143. - Processo de preparação de uma composição farmacêutica compreendendo uma ou mais proteínas, caracterizado por compreender a mistura de pelo menos uma proteína compreendendo um primeiro péptido tendo actividade farmacológica e um segundo péptido de não mais do que quinze aminoácidos de comprimento, estando o segundo péptido localizado no terminal carboxilo da proteína e compreendendo uma sequência de afinidade para a integrina, sendo a proteína diferente de uma proteína que possui naturalmente uma sequência de afinidade para a integrina no seu terminal carboxilo, com um veículo farmacêutica ou veterinaria-mente aceitável.
153. - Processo de acordo com a reivindicação 14, caracterizado por a proteína ser uma proteína de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 8.
163. - Método para o tratamento de um ser humano ou animal, caracterizado por compreender a administração de uma quantidade não tóxica, eficaz, de uma proteína compreendendo um primeiro péptido tendo actividade farmacológica e um segundo péptido de não mais do que quinze aminoácidos de comprimento, estando o segundo péptido localizado no terminal carboxilo da proteína e compreendendo uma sequência de afinidade para a integrina, sendo a proteína diferente de uma proteína que possui 90 naturalmente uma sequência de afinidade para a integrina no seu terminal carboxilo. 17». - Processo de acordo com a reivindicação 16 caracterizado por ser utilizado para o tratamento ou profilaxia de uma doença ou desordem trombótica tal como enfarte do miocár-dio, apoplexia, embolia polmunar, trombose das veias profundas ou oclusão das artérias periféricas. Lisboa, 22 de Outubro de 1991

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