PT99195A - Processo para a preparacao de proteinas inibidoras da formacao de factor de necrose de tumores e de composicoes farmaceuticas que os contem - Google Patents

Description

-Descrição referente à patente de invenção de HOECHST AKTIEN GESELLSCHAFT, alemã, industrial e comercial, com sede em D--6230 Frankfurt am Main 80, República Federal Alemã, (inventor: Dr. Ulrich F. Schade, residente na República Federal Alemã), para "PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DE PROTEÍNAS INIBI-DORAS DA FORMAÇÃO DE FACTOF DE NECROSE DE TUMORES E DE COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS QUE AS CONTEM"

DESCRIÇÃO A presente invenção refere=se a inibidores da formação de factor de necrose de tumores (TNF), a processos para a sua preparação através de macrofagos ou fagócitos mono-nucleares previamente estimulados com lipo-polissacárido, e sua utilização para tratamento e profilaxia de doenças provocadas pelo factor de necrose de tumores .

As reacções inflamatórias resultam em primeiro lugar do facto de os mecanismos imunológicos, que existem originalmente para protecção do organismo hospedeiro, serem so-

bre-expréssos. Ao longo dos últimos anos constatou-sé que pro-teinas formadas pelo organismos hospe;déiro podem provocar na sua forma isolada, sintomas patológicos por desencadearem a libertação de mediadores inflamatórios terminais. Esta classe de proteínas de tipo harmonal é englobada pela designação cito-quinas (Gupta, Scand. J. Reumatol. Suppl., (1988), (76, 189).

Actualménté é considerado comprovado que' as citoquinas detêm um papel decisivo na formação de proce'ssos inflamatórios.

Entre as citoquinas, o factor de necrose de tumore's (TNF) adquiriu uma importância espe!cial na formação de' processos inflamatórios agudos, pois esta substância formada so bretudo por macrófagos é‘ susceptível de induzir nos mamíferos um estado de choque' como o característico das bacteriémias e' sépticémias (Tracey et al., Scie'nce', 234, (1986), 470). Para além disso, descobriu-se que um anticorpo monoclonal anti-TNF reprime a letalidade no macaco em caso de septicemia bacteriana (Tracey et al., Nature', 330, (1987), 662). Destes achados resul ta que' o TNF representa por um lado um factor suficiente, e por outro um factor essencial para o desenvolvimento de' muitas das características do choque ehdotóxico. A ligação óbvia entre' a formação endógena de TNF e o desenvolvimento de! quadros clínicos inflamatórios crónicos e' agudos conduziu à realização de numerosos ensaios com vista a bloquear a formação endógena de' TNF atráves de' ini bidore's farmacológicos. Podemos reférir aqui' a título de' exemplo o tratamento com esteróidés, derivados da xantina e inibi-dore's das lipoxigenase's (Zabel et al., Lancét, 23, (1989), 14- 74). Para além disso, vériflcou-sé qué a citoquina IL 4 é um inibidor do TNF (Essner e't al., J. Immunol. 142, (1989), 3857).

Objéctivo da presente invenção era descobrir novos inibidores fisiológicos que' permitissem inibir a for mação endógena de' TNF.

Surpreendentemente, descobriu-se' que os macrófagos ou fagócitos mononuclearés podem produzir inibidores • contra a formação dé TNF. 2

Assim, a pre'sente' invenção refere-se a: 1. Inibidores contra a formação de factor de necrose de' tumores obtidos por cultura de macrófagos ou fagócitos mononucléares de vertebrados tolerantes aos lipopolissacáridos, que1 passam a ser designados por TIM. 2. Um processo para a preparação dos inibidores de'finidos em 1 caracterizado por se' cultivarem macrófagos ou fagócitos mono nucleares de ve'rtebrados tole'rante's aos lipopolissacáridos, e’ em seguida se lhe adicionarem lipopolissacáridos. 3. Utilização dos inibidores definidos em 1., para preparação de uma composição farmacê'utica para tratamento e’ profilaxia de doe'nças provocadas pelo factor de necrose de' tumores.

Por lipolissacáridos (LPS) compreendem-se' componentes da parede' celular de bactérias Gram-negativas. São compostos por um lipóide' A e' diféréntes polissacáridos, que podem conter diferéntés componénte's glicosídicas consoante a estirpe bacteriana. Os LPS actuam como éndotoxinas, podem induzir fébré, leucopénia e leucocitosé, e provocam no coelho a reacção local de Schwarzmann. Por exemplo, é possível extrair da Salmo-nella friedenau um lipopolissacárido pelo método de fenol/água, que pode se:r liofilizado e‘ transformado na sua forma salina com trietil-amina (Galanos et al., Zehtralbl. Bakteriol. Parasi-temkd. Infe'ktionskd. Hyg. Abt. 1: Orig. Reihe' A: 243, (1979), 226). 0 factor de' necrose' de tumores (TNF) é' uma citotoxina, que é formada sobretudo por macrófagos, e' que' actua de' forma li tica sobre determinadas linhas celulares transformadas. A IL 4 é um factor de crescimento das células B, que actua de forma activadora sobre os macrófagos e que possui um peso molecular de 15 ooo a 20 000. A IL 6 e um factor dè diferenciação das células B, que' actua como factor de' crescimento sobre' linhas celulares de' hibridomas e que' possui um peso molécular de' 22 000 a 34 000. 0 inibidor do TNF a que1 se' refére1 a presente invenção é! um produto que pode' ser caracte rizado do seguinte modo: 3

- possui um peso molecular entre 40 000 e 80 000; - inibe a síntese’ de TNF pelos macrófagos; - não actua como a intérléucina IL 6 como factor de crescimento sobre as linhas ce'lulares de hibridomas. A preparação do inibidor faz-se’ por e'xe'mplo através de macrófagos que1 podem sér obtidos a partir dé vertebrados tolerantes aos lipopolissacáridos. São adequados p.e'. os macrófagos obtidos a partir de' ratinhos NMRI tolerantes aos li-po-polissacáridos ou dé ratinhos C3H/He'J (NMRI significa Naval Marina Research Institu). Para além disso, podem também ser utjl lizados fagocitos mononuclearés humanos para a preparação dos inibidores a que’ se refere' a pre'sente invenção.

Para a preparação dos inibidores a que se’ refére a presente invenção procede'-se' de preferência induzindo em primeiro lugar uma tolerância aos LPS nos vertebrados. Assim podem p.e. tornar-se tolerantes aos LPS ratinhos fêmeas NMRI (6-8 semanas, da 'Lippische Vérsuchstiéranstalt', Dextertal, Alemanha), através dé uma injecção intraperitoneal de aprox. 80 μg dé LPS, obtidos dé Salmonella friédénau através do método do fénol/água, ém 200 μ,Ι de tampão isento dé pirógenos. Passadas 96 horas, os ratinhos encontram-sé ém éstado dé tolerância aos LPS, qué sé caracteriza por nénnhum dos animais tolerantés pérecér após uma injécção de 2 mg de LPS/ratinhos. Nos ratinhos normais, 0,7 mg dos LPS utilizados corréspondem a uma Pêlos métodos conhecidos da literatura, obtêm-se os macrófagos péritonéais dos ratinhos tolerantés aos LPS (Conrad, Manuél of macrophages methodology, Ed. Hérscowitz e’t al. (1981)). Os macrófagos isolados são transferidos para ré cipiéntes dé cultura esterilizados, é ém seguida incubados durante 2 a 3 horas ém meios de cultura conhecidos para células de mamíferos, linhas célularés é culturas dé técidos, ém estufa de CO^. 0 méio de cultura é removido, as células não aderéntés são lavadas com tampão, adiciona-se meios dé cultura frésco e' éstimula-se com LPS. 4 >

As indicações de quantidades para LPS que se seguem, reférém-se ao LPS de Salmonélla friedénau, obtido pé lo método do fenol/água. A indicação dos macrófagos faz--se com aprox. 1-100 μg de LPS/ml de meio de' cultura, de’ preferência 5-60 μg/ml. Os macrófagos são cultivados em estufa de COg a 372C é com 8% dé COg . Os macrófagos sécrétam o inibidor a qué sé reféré a présénté invenção para o meio de cultura circundante. A concentração máxima dé inibidor é atingida 15-36 ho ras após a indução. Os macrófagos são separados do meio de cultura, por exemplo através de centrifugação ou de filtração. Os inibidores a que se réferé a presente invenção ficam no meio dé cultura, do qual podém ser isolados através dos métodos corrén-tés para acumulação dé protéínas. Podém também sér aplicados ou tros métodos de cultura de linhas célularés conhecidos da literatura. Revelou-sé vantajoso, induzir os macrófagos após a primeira sintese de TIM, novaménté com LPS, é procéder a uma nova produção de TIM em meio de cultura fresco. Desta forma, foi po£ sível observar a produção de TIM durante uma semana.

Para além disso, o TIM pode sér produzida por macrófagos de ratinhos C3H/He'J (Bomholtgard ltd., Dinamarca). Neste caso não sé procede' ao tratamento dos ratinhos com. LPS. Os macrófagos peritoneais são isolados como descrito para os ratinhos NMRI, induzidos com LPS é dépois isola-sé o TIM.

Um outro método para a preparação dos inibi dorés a qué sé refere a presente invenção consiste em obte--los a partir de fagocitos mononucléarés humanos. Néste' caso, provoca-sé de' preférência ém primeiro lugar uma tolérância aos LPS nos indivíduos do énsaio. Para tal, podém p.e. injectar-se 100 ng dé Salmonélla abortus équi por via intravenosa. 3 dias após a indução récolhém-se 50 ml dé sangue', dos quais sé isolam os fagocitos mononucléarés (monocitos) através dos processos conhécidos da literatura. As células podém p.é. sér isoladas p através de um gradiente Perkoll . Os monocitos isolados (1 x 106 células/ml dé meio de cultura) são em séguida incubados ém * meios dé cultura conhécidos da literatura para células de mamí- 5 feros, linhas celulares é culturas dé tecidos, nas condições usuais de incubação, durante 2 a 3 horas. A indução da síntese' do inibidor faz-se com LPS. Para tal, adiciona-se ao meio de cultura 100 μΐ/ml dé méio, dé préferência 5-60 μg/ml, é os mono eitos são cultivados nas mésmas condiçõés de cultura como os macrófagos dos ratinhos tolérantés aos LPS, é ém séguida isola--se o TIM. 0 modo dé acção característico dos inibido-res pode sér représéntado através do seu éféito sobré a síntese de TNF pelos macrófagos. A acção dos inibidores a qué se‘ refere a présénte' invenção pode' sér détérminada, p.e1., através linha celular RAW 264.7 (Américan Type Culturé Colléction 71 TIB ( ATCC), Maryland, USA). Esta linha célular forma TNF após éstimu lação com LPS. A formação dé TNF nesta linha célular podém ser inibida através de soluções contendo TIM. EXEMPLO 1

Ratinhos NMRI fê!méas (6-8 sémanas, da 'Lip-pisché Versuchstiéranstalt', Dextértal, Alemanha), são tornadas tolerantes aos LPS através dé injécção intraperitoneal dé aprox. 80 μg de LPS, obtidos dé Salmonélla friedénau pélo método do fénol/água, ém 200 μΐ de também isénto de pirogenéos. Pas sadas 96 horas, os ratinhos encontram-se no estado de tolérân-ci'a aos LPS, que sé caractériza por nenhum dos animais tolerantes pérécér após uma injécção dé 2 mg dé LPS/ratinho. Nos ratinhos normais, 0,7 mg dos LPS utilizados correspondem a uma DL100* macrófagos péritonéais são obtidos a partir dos ratinhos tolerantes aos LPS. Para tal, os ratinhos são sacrificados pelo eféito de CO^, fixados sobre uma placa de cortiça e vapori zados com álcool a 70%. Numa bancada de trabalho esterilizada abre-se éntão a pelé através de um corte na zona abdominal, e injéctam-sé na cavidadé péritoneal 5 ml dé méio dé lavagem ( méio dé Iscove + 1,5 U/ml dé héparina; Sigma). 0 peritoneo assim chéio é' cuidadosamente massajado, por forma a libertar as 6

células aderentes aos tecidos. 0 líquido conténdo as células é aspirado através de uma pipéta de' Pastéur e'stérilizada. 7

Uma quantidade dé liquido contendo 10 celu las é pipétada numa caixa de Petri é incubada com meio dé cultu ra (meio de Iscové, 2 h, 372C, 8% de C02). A fim dé purificar as culturas de macrófagos de tipos celularés contaminantes, são removidos os sobrénadantés das células adéréntés, as células são lavadas duas vézés com réspectivamenté 10 ml de tampão (372 C), é cobe'rtas com 10 ml de‘ méio dé Iscové fresco. Em séguida juntam-se 50 ^g/ml de' LPS/ml de meio dé cultura.

Utilizam-se! LPS dé Salmonella friedenau, isolados pélo método do fénol/água. A cultura dos macrófagos faz-se' ém estufa de co^ a 372C é com 8% dé CO^ · Os macrófagos sécretam o inibidor a que se reféré a presente' invénção para o meio dé cultura circundante. A concentração máxima de inibidor é atingida 15-36 horas após a indução. Os sobrénadantés das cul_ turas celularés são cehtrifugados (1000 x g). Os macrófagos sedimentam e o inibidoro fica no méio dé cultura. A determinação da concentração de TIM obtida faz-sé através do efeito do TIM sobre a produção dé TNF da linha célular RAW 264.7 (ATCC 71 TIB ). A quantidade dé inibidor contida no méio de cultura réduziu a síntésé de' TNF péla RAW 264.7 para 30% do valor dé controle'.

Indução do TNF: Células RAW 264.7 são pipé-tadas para placas dé microtitulo cheias com meio de Iscové ( méio de Iscové com 10% dé soro fétal de vitelo (FCS); Gibco/BRL Eggenstéin, RFA). Acerta-sé uma concentração célular de aprox. g 1*10 células/ml dé meio de cultura. Passadas 2 horas, as células são lavadas com solução tampão, cobertas com meio de' cultura frésco é incubadas com 200 ng dé LPS/ml na présénça de TIM. Utiliza-sé meio dé Iscové isento dé soro. Passadas 18 horas de témpo de incubação séparam-se! os sobrénadantés e armazenam-sé a ~702C até à determinação do TNF. Déterminação do TNF: A determinação do TNF faz-sé em bio-ensaio com a linha celular de’ fibroblastos L929 7 >

da ATCC. As células são pipetadas ém 100 μΐ de meio dé cultura (RPMI 1640 + 10% de FCS + 5 μΐ/ml de actinomicina; Gibco), ém placas de 96 concavidades (2 x 10 ^células /concavidades; fundo plano). As células são incubadas durante 4 h a 372C com 5% de ΟΟ^ no ar. Em seguida, pipetam-se sobre as células réspéctiva-menté ΙΟΟμΙ das séries de diluição das amostras a ensair. As preparações são incubadas nas me’smas condições durante 18 ho ras, é dépois incubadas durante' mais 4 horas após adição de' 10 μΐ dé uma solução dé 5 mg/ml de MTT (MTT = brometo dé (3-(4,5--dimetiltiazol-2-il )-2,5-dife'nil-tetrazólio; dissolvido em solu ção tampão; Sigma, Déisénhofén) por 100 μΐ de meio de cultura.

Em seguida rejeitam-se os sobrénadantes e substituém-sé por 100 μΐ de HC1 0,04N ém isopropanol. Após agitação intensiva, déterminam-sé as absorções a 570 nm com um "ELISA-Reader" (MR 700, Dynatéch Laboratories). Os cálculo do ' título dé TNF das amostras faz-sé dé acordo com a seguinte fórmula: % Citotoxicidadé celular = A _ - AJ4n „ —con-dii x iuu

A con

Acon rePreiservi::a a absorção do branco de con trolé. repre'senta a absorção das concavidades das dilui ções contendo TNF. Uma unidade dé TNF é définida como o valor recíproco da diluição com a qual sé atinge' uma lise de 50%. EXEMPLO 2

Indução ém função da dose

Os macrófagos peritoneais são preparados a partir dé ratinhos tolerantés aos LPS como descrito no éxemplo 1 (1 x 10 células/ml) e1 incubados in vitro com diferentes doses dé LPS (18 h, 372C, 8% de C02 ). A actividadé do inbidor é determinada nos sobrénadantés obtidos. 8 » i

Os macrófagos de ratinhos tolerantes aos LPS carecem in vitro de uma estimulação com pelo menos 50 μg/ml de LPS, a fim de: produzirem com bom rendimento o inibidor a que se refere a presente invenção (TIM) (inibição da síntese de TNF de 45 + 4,9%, n = 5; P 4 0,026 e!m comparação com o controle' de LPS). 0 TIM obtido das culturas de macrófagos que foram estimuladas com 5 μg/ml de LPS reduziu a libertação de TNF de 660 U/ ml de TNF para 511 + 43 U/ml (= 78 + 6% do controle, n = 2). Os controles apreséntavam uma actividade' de 660 U/ml de' TNF. EXEMPLO 3

Indução dos inibidores a qué se refere' a presente invenção e'm macrófagos de ratinhos C3H/HeJ (Bomholt-gard Ltd, Dinamarca) caractérizam-se por uma tolerância aos LPS de‘ origem genética. Os macrófagos peritone'ais foram preparados a partir de ratinhos C3H/He'J, é cultivados in vitro durante 18 horas (1 x 10 /ml, 37ac, 8% de CO^ ) com diferentes concentrações dé LPS (0,5 μg/ml e 50 μg/ml). 0 tratamento foi e'féctuado como descrito para os macrófagos dé ratinhos tolerantes (exemplo 1).

Após o tratamento, testou-se' a actividade dos liofilizados reconstituídos. A se'creção de1 TNF das células RAW 264.7 estimuladas com LPS (200 μg/ml) (controle) era dé 3050 U/ml de TNF. 0 Quadro 1 revela que os ratinhos C3H/HeJ pro duzem uma quantidade' re'duzida de TIM. Através da estimulação in vitro com LPS é possível auméntar bastante a produção de TIM.

Quadro 1: Indução da actividade1 inibidora de TNF nos sobrenadan tes dé ratinhos C3H/HeJ 9

Estirpe dos ratinhos LPS (|j,g/ml) Núméro dé células (*106) Título dé TNF em énsaio com RAW 264.7 (U/ml) NMRI 50 3,0 300 NMRI 50 1,0 100 NMRI 50 0,5 400 C3H/HéJ 0 3,0 2100 C3H/HeJ 0 1,0 2300 C3H/He'J 0 0,5 2100 C3H/He'J 5 3,0 800 C3H/HeJ 5 1,0 800 C3H/HéJ 5 0,5 1100 C3H/He'J 50 3,0 335 C3H/HeJ 50 1,0 398 C3H/HeJ 50 0,5 335 EXEMPLO 4 TLM de' monócitos periféricos humanos

Trê's dias após o tratamento, colhéram-sé respéctivaménté amostras com um volume de 50 ml de' sangue1 de' . dois individuos tratados com endotoxinas (100 ng de LPS de1 Sal-mone'lla abortus equi/indiví-duo), a partir das quais sé prepararam os fagocitos mononucleares (monócitos). Estés foram purificados por méio de aderência e' estimulados com LPS em meio dé cultura isento dé soto (20 h, 50 |ig|ml, 379C, 8% dé C02 ). Conforme descrito para os macrófagos dos ratinhos, prepara-se a partir dos sobrenadantés um éxtracto bruto é pesquisa-sé a acti vidadé de TIM, em culturas de monócitos humanos é ém células RAW, qué são estimuladas com LPS para a sintésé de TNF. Como sé pode verificar no Quadro 2, os sobrénadantés parcialmente' puri-• ficados dé monócitos estimulados com LPS, obtidos de seres huma - 10 -

nos tratados com endotoxinas (hTIM), são suscéptíveis de' inibir a síntese de TNF ém culturas celulares dé monócitos humanos ( lít^ + LPS: 870 + 64 U/ml, hM:^ + LPS + hTIM: 230 + 42 U/ml). No caso de ser utilizado TIM murina (preparado como no exemplo 1), pode verificar-se na mesma medida uma inibição da síntese de TN F (hM$ + LPS + hTIM; 190 + 53 U/ml). Por outro lado, o hTIM é; também susceptível dé bloquear na mesma medida a produção de' TNF em mM0 como o mTIM (mM0 + LPS: 1026 + 132 U/ml, mM0 + LPS + hTIM: 98 + 24 U/ml; mM0 + mTIM: 134 + 16 U/ml).

Assim, verifica-sé que os monócitos de indi_ víduos previamente tratados com endotoxinas são capazes de' sintetizar TIM e qué o hTNF e mTHF reagem quanto à sua eficácia biológica de forma cruzada relativamehté à inibição da formação de TNF.

Quadro 2: Efeito dé TIM humana é murina sobre1 a síntese dé TNF em monócitos humanos e células RAW 264.7

Incubação TNF (U/ml) hM0 44 + 26 hM0 + LPS 870 + 64 hM0 + LPS + hTIM 230 + 42 hM0 + LPS + mTIM 190 + 53 56 + 13 1026 + 132 98 + 24 134 + 16 mM0

mM0 + LPS

mM0 + LPS + hTIM

mM0 + LPS + mTIM - 11 -

EXEMPLO 5

Purificação de TIM obtido de macrófagos pé-ritonéais de ratinhos 0 sobrenadante' contendo o inibidor pode ser concentrado através dé ultrafiltração, mantendo-se a actividade biológica. 0 sobrenadante da cultura celular dé culturas de macrófagos péritonéais éstimulados com LPS, préparado de acordo com o exemplo 1 (1 x 106/ml, 50 μ£/ιη1 S. friedénau, 37sc, 8% de COg) é filtrado através de' uma membrana com um limite de exclusão dé 10 kD. A filtração é' terminada assim que o volume da amostra se encontra concentrado a 10% do volume de' partida. 0 filtrado e a.solução rétida são filtrados para esterilizar, e' pésquisa-sé a actividadé de TIM ém culturas celulares com RAW, ém 100 μΐ de solução rétida e ém a ml do filtrado. A actividade biológica é' recuperada na solução rétida, i.e., as células RAW 264.7 cujo meio dé cultura contém 10% do sobrenadante da cultura célular, secretam após estimulação com LPS apénas 17,8 _+ 11,5 % (n=6) do téor sécrétado pelas células RAW estimuladas com LPS, que libertam 1142 + 87 U/ml dé TNF (N=6). 0 sobrénadan te concentrado, contendo o inibidor, contém grandés quantidades de lipopolis.sacáridos, que é eliminado através dé cromatografia por afinidadé com R Polimixina B-agarosé (Sigma).

R

Aplicam-se 2 ml de Polimixina B-agarosé sobre a membrana dé um filtro redondo de 0,2 μηι, lava-se com 15 ml de água isenta de agéntés pirógenos é depois cromatografam--se as soluções retidas contendo LPS com uma velocidade' dé escoamento de aproximadaménté 1 ml/min. 0 material obtido após a cromatografia por afinidade' com polimixina aprésenta uma activji dade' inibidora, e' inibe' a síntese das células RAW em 71% (IX 10 células, 100 μΐ dé eluado; 200 ng/ml de S. friedenau, 18 h, 37SC, 8% de CO ).

Após a cromatografia sobre' Polimixina B-aga rose' ségué-sé uma diálisé contra água, qué' é! réalizada durante' 12

tanto tempo até qué não seja já visível qualquér vermelho de fe nol, qué se encontra no meio dé cultura. Em seguida, o material dializado é liofilizado. 0 matérial liofilizado apresenta acti-vidade' inibidora. 0 liofilizado reconstituído em meio fresco conseguiu reduzir a produção dé TNF ém células RAW para 18+6 % (n=5) dos controles estimulados com LPS (pC0,009).

Para posterior purificação do material con-tendo TIM, cromatografa-sé sobre gel Séphadéx S-200 (tampão fosfato 0,5 mmol + 0,2 mol de NaCl, 3 ml/h). A actividade biológica é observada essénci-almente na fracção 6: mesmo 100 μΐ (correspondentes a 10% do vo lume total) são susceptíveis dé provocar uma inibição dé aprox. 86% da libertação de TNF (RAW 264.7, x 106 + 200 ng/ml LPS: 1149 U/ml TNF; RAW 264.7, 1 x 106 + 200 ng/ml LPS + 100 μΐ TIM: 152 U/ml TNF). Na eléctroforesé sobre gél SDS obtém-se um peso molecular de 40 000 a 80 000. EXEMPLO 6

Inibição da síntésé de TNF induzida por for bol-éster A síntese dé TNF é induzida por uma combinação dé forbol-éster (PMA) e' interférona (INF- f ; Amer-sham, Alemanha). As células RAW 264.7 (1 x 10 /ml) foram incubadas (18 h, 372 c 8% dé CO^) com LPS (10 μg/ml) e' intérférona-- f”(50 U/ml), bem como com diférentés concentrações de forbol--éster (500 ng/ml, 100 ng/ml é 20 ng/ml) em combinação com in-terferona-(50 U/ml). As células RAW 264.7 produzem TNF tanto após estimulação com LPS/intérferona-)T , como também após incubação com PMA/interferona- f (LPS/IFN-)T: 2450 + 274 U/ml TNF « 100%, n=4; 500 ng/ml PMA/50 U/ml IFN-T”: 1460 + 60 U/ml (n=2) = 60 + 2,5 % da quantidade induzida com LPS/IFN-Í" ). A quantidade de TNF induzida por PMA/IFN-^ é dependente' da dose: com 100 ng/ ml PMA / 50 U/ml IFN-f" foram libertos 1140 + 213 U/ml TNF (= 47 13

+ 8,6 % do controle com LPS/IFN- f, n=2); 20 ng/ml PMA/50 U/ml IFN-íf provocam a secreção de 680 + 164 U/ml TNF (=28 + 7 % do controle com LPS/IFN- f).

Para o estudo do efeito do TIM sobre a formação de TNF induzida por PMA/INF- , as células RAW são incuba das com PMA/INF-lT na presença do inibidor (1 x 10 /ml; 18 h, 372C, 8% de C02). 0 inibidor a que se refere' a presente invenção inibe tanto a sintese e' libertação de TNF induzida por LPS/ INF-ΐΓ , como a induzida por PMA/INF-1” . A quantidade de inibidor que reduz a libertação de TNF induzida por LPS/INF-Γ em 70% para 29 + 6% (n=2; p<0,08) do valor do controle com LPS, inibe a libertação de TNF estimulada por PMA/INF- f” em cerca de 90%, para 10 + 4%, i.e. 40 U/ml de TNF (n=5; p <0,04), EXEMPLO 7

Inibição da sintese de TNF em macrófagos in duzidos com tioglicolato

Foram incubados com LPS macrófagos perito-neais induzidos com tioglicolato (1 x 10 /ml; 200 ng/ml LPS; 372C; 8% C02 ). As quantidades de inibidor utilizadas correspon dem às quantidades que secretam em macrófagos peritoneais 7 fi

de ratinhos tolerantes 1 x 10 /ml (= TIM 1), 5 x 10 /ml (=TIM 5 3) e 5 x 10 /ml (= TIM 4). Nestes ensaios são também utilizados no meio de cultura liofilizados reconstituídos de macrófagos pe ritoneais de ratinhos tolerantes estimulados com LPS. Os LPS in duziram nestas células a formação de' TNF (6700 U/ml = 100 %). Sob a influencia do inibidor, a quantidade' detéctáve'1 de' TNF no sobrenadanté das culturas diminuiu ém função da quantidade de' inibidor aplicada: tanto a concentração na amostra de TIM 1, co mo também de' TIM 2, era capaz de' reduzir a libertação de' TNF pa ra <40 U/ml (4 1% do controle com LPS; n = 4; p< 0,04). 0 produ to dé 2,5 x 10 macrófagos péritonéais provoca uma redução da formação de TNF para 1440 + 100 U/ml TNF (correspondente' a 21 14

g + 1,4%, η = 2; ρ7· 0,15); ο produto de 5 χ 10 macrófagos péri-toneais reduziu ainda a libertação dé TNF para 34 + 4,6% (2260 + 310 U/ml TNF; p7 0,22). EXEMPLO 8 TIM não possui qualquer actividadé de IL-6

V

Numa parte aliquota da fracção 6 obtida a-pós cromatografia sobre G 200, no éxémplo 5, que' possui activi-dades TIM, pesquisou-se' sé possuia também a actividadé biológica da intérléucina 6 (IL 6). Utilizou-se um volume que no ensaio com células RAW inibiu a síntése de TNF em aprox. 70%. Este volume foi incubado numa diluição seriada (1:2) com células da linha celular dé hibridoma B 13.29 (fornecidas por Dr. L. Aarden, Central Laborastory Blood Transfusion Service, P.O.Box 9406, 1006 AK Amsterdão, Holanda), ém placas de microtítulo com 96 concavidades, e ainda com 100 μΐ de meio de cultura (méio de Iscivé com BSA, transferrina, lipídeos de soja, β-mércapto-eta-nol; soluções já prontas da firma Boéhringér, Mannhein), durante 48 horas a 372C e com 8% dé CO^ como valorés dé controle uti lizaram-se culturas dé B 13.29 tratadas com uma série’ de concen trações de IL 6 recombinante (IC Chémikalién, Munique). A coloração é quantificação das células féz-sé como no exemplo 1. Através de comparação com a série' dé concéntrações dé IL 6 pode determinar-se: o teor absoluto dé II 6. Vérificou-se' que' a multiplicação das células B 13.29 não é: estimulada pela fracção com actividadé TIM do sobrénadante' dos macrófagos, como é o caso nas culturas às quais é adicionada IL 6 recombinante. Assim, conclui-sé qué a parte aliquota téstada não contém qualquer IL 6, e que TIM não é; IL 6. 15 -

Claims (4)

1. REIVINDICAÇÕES - lã - Proce'sso para a preparação de’ um inibidor contra a formação de factor de1 ne'crosé de tumorés, caractériza-do por sé cultivarem macrófagos ou fagócitos mononucléares dé vertebrados tolerantes aos lipopolissacáridos na présença dé li popolissacáridos.
2. - 2» - Processo dé acordo com a reivindicação 1, caracte'rizado por sé utilizarem para a cultura macrófagos dé ra tinhos tolérantés aos lipopolissacáridos.
3. - 3» - Processo de acordo com as reivindicações 1 ou 2, caracterizado por sé utilizarém para a cultura fagócitos mononuclearés dé sérés humanos tolérantés aos lipopolissacáridos.
4. - 4¾ - Procésso dé acordo com uma ou mais das reivindicações 1 a 3, caracterizado por se utilizarem lipopolissacáridos dé salmonélas numa concentração dé 1 a 100 μg por ml dé meio dé cultura. - 5ã - Procésso dé acordo com a reivindicação 4, caracterizado por sé utilizarém lipopolissacáridos de salmone-las numa concentração dé 5 a 60 ^g por ml de; meio dé cultura. - 6 ã - Processo de acordo com uma ou mais das réi-• vindicações 1 a 5, caracterizado por os macrófagos ou fagócitos 16 I» 4 ft mononucleares serem cultivados durante 10 horas a 1 semana, de preferência durante' 15 a 36 horas. A requerente reivindica a prioridade do pedido dê patente alêmão apresentado ém 12 dê Outubro dê 1990, sob o Nt P 40 32 354.4. Lisboa, 10 dê Outubro de' 1991 V,-

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