PT98899A - Processo para a obtencao de uma cassete de expressao de um precursor de endotiapepsina, bacterias transformadas e processo para a sua producao - Google Patents

Description

-2- 0 presente invento diz respeito a uma nova cassete de expressão de um precursor de endotiapepsina em Crvphonectria parasitica, a uma estirpe desta espécie transformada pela cassete, a um processo para a preparação de endotiapepsina utilizando essa estirpe bem como a um processo para preparar uma tal estirpe desprovidade narcador de selecção dominante. O fungo filamentoso Crvphonectria paras ita. também designado Endothia parasitica. que pertence ao grupo dos ascomi-cetes, secreta naturalmente uma aspartilprotease: a endotiapepsina, capaz de fazer coagular o leite por meio da hidrólise específica das micelas de caseína, e por conseguinte útil no fabrico de certos queijos, em particular os queijos de massa cozida ("fromages à pâte cuite") do tipo Emmental. Esta enzima, cuja sequência de 330 aminoácidos foi descrita por Barkolt, V., 1987, Eur. J. Biochem. 167, 327-338, substitui então a quimosina.

Produz-se actualmente essa enzima à escala industrial recorrendo a processos de fermentação de estirpes de Crvphonectria parasitica escolhidas pelo seu bom nível de expressão de endotiapepsina.

Tais processos apresentam desvantagens, e nomeadamente o da imobilização de um volume importante do reactor, uma vez que a quantidade de endotiapepsina por unidades de biomassa, e por conseguinte a quantidade de endotiapepsina por unidade de volume do reactor para uma quantidade de biomassa dada, são fracas.

As técnicas clássicas de mutação-selecção não permitem aumentar em mais do que cerca de 3 0% a quantidade de endotiapepsina produzida por unidade de biomassa. -3-

Existe por conseguinte uma necessidade de instrumentos de engenharia genética que permitam obter estirpes de Crvphonec-tria oarasitica sobreprodutoras de endotiapepsina com um factor de sobreprodução significativo. Este é definido como a proporção entre a quantidade de endotiapepsina produzida pela estirpe transformada sobreprodutora e a quantidade dessa proteína produzida pela estirpe testemunha não transformada, para uma mesma quantidade de biomassa. A Crvphonectria oarasitica é um fungo filamentoso cuja genética é ainda muito pouco conhecida, ao contrário da de outros fungos filamentosos do grupo dos ascomicetes, tais como os que pertencem aos géneros Aspercrillus. Neurospora ou Trichoderma. Só muito recentemente foram descritas as primeiras transformações de Crvphonectria por Churchill et al., 1990, Curr. Gen., 17, 25-31. Estes autores transformaram estirpes de laboratório de Crvphonec-tris utilizando plasmideos transportando marcadores de resistência a higromicina, benomil ou G 418. Até hoje, não foi ainda produzida uma proteína com interesse comercial recorrendo a uma estirpe de Crvphonectria recombinada por meio de técnicas de manipulação genética.

Recentemente, no congresso "Annual Meeting of the American Phytopathological Society and the Canadian Phytopatholo-gical Society" (Encontro Anual da Sociedade Americana de Fitopato-logia e da Sociedade Canadiana de Fitopatologia), que decorreu entre 4 e 8 de Agosto de 1990, G.H. Choi et al parecem (de acordo com o resumo publicado da sua comunicação) ter apresentado a sequência codificadora da endotiapepsina, uma suposta sequência pré-pró de 88 aminoãcidos e uma parte do promotor da endotiapepsina que incluia a caixa TATA mas não as regiões activadoras necessárias para que o promotor pudesse funcionar. Um tal fragmento de DNA genómico, mas incluindo uma sequência pré-pró de 89 aminoácidos, tinha já sido isolado e a sequência determinada pela Requerente em 1989, que tinha verificado que ele não permitia a expressão da endotiapepsina (cf. secções 1 e 6 a seguir). O presente invento diz respeito a uma nova cassete de expressão de um precursor de endotiapepsina em Cryphonectria oarasitica. caaracterizada por incluir um promotor funcional a montante de uma sequência que codifica o precursor de endotiapepsina, a qual tem a sequência (Pl) seguinte: -5-

>

Ser Thr Gly Ser Ala Thr Thr Thr Pro He Asp Sar Leu Asp Asp Ala Tyr fie Thr Pro val GÍn Ile. Gly Thr Pro Ala sln Thr' Leu Asn Leu Aap Phe Asp Thr Gly Ser Ser Asp Leu Trp Val Phe Ser Ser Glu Thr Thr AU Ser Gtu val Asp Gly Gin Thr lie Tyr Thr Pro Ser Lys Ser Thr Thr AU Lys Leu Leu Ser Gly Ala Thr Trp Ser Ile Ser Tyr Sly Asp Gly Ser Ser Ser Sêr Gly Â5P Val Tyr Thr Asp Thr val Ser Val Gly Gly Leu Thr val Thr Sly Glrt AU Val Glu Ser AU Lys Lys Val Ser Ser Ser Phe Thr Glu A»p Ser Thr Ile Asp Gly Leu Leu Gly Leu Ala Phe Ser Thr Leu Asn Thr Val Ser Pro Thr Gin Gin Lys Thr Phe Phe Asp Asn Ala Lys Ala Ser Leu Asp Ser Pro Val Phe Thr Ala Asp Leu Gly Tyr Hi$ AU Pro Sly Thr Tyr Asn Phe Gly Phe Ile À3D Thr Thr AU Tyr Thr Sly Ser Ile Thr Tyr Thr AU Vai Ser Thr L/a Gin Gly Phe T rp Glu Trp Thr Ser Thr Gly Tyr AU Val Gly Ser Gly Thr Phe Lys Ser Thr 5er Ile Aso Gly Ile Ala Asp Thr Gly Thr Thr Leu Leu Tyr Leu Pro Ala Thr Val Val ser Ala Tyr; Trp AU Gin val Ser Gly Ala Lys Ser Ser Ser 5er Val Gly Gly Tyr Val Phe Pro Cys Ser AU Thr Leu Pro Ser Phe Thr Phe Gly Val Gly Ser Ala Arg Ile Val rie Pro Gly Asp Tyr Ile ASP Phe Gly Pro ile Ser Thr Sly Ser Ser Ser C/5 Phe Gly Gly Ile Gin Ser Ser Alá Gly Ile Gly lie Asn Ile Phe Gly Asn val Ala Leu Lys Ala Ala Phe Val val Phe Asn Gly AU Thr Thr Pro Thr Leu Gly Phe Ala Ser LyS/ -6-

Uma cassete de expressão de um precursor de endotiapep-sina designa aqui uma sequência de DNA que inclui a sequência que codifica esse precursor, flanqueada de sinais que permitem a transcrição e a tradução dessa sequência codificadora em Cryphonectria parasita.

Por precursor de endotiapepsina entende-se uma proteína susceptível de ser secretada e de gerar, após uma ou mais etapas de maturação, a endotiapepsina no meio de cultura.

Utilizar-se-á de preferência o precursor natural da endotiapepsina, denominado pré-endotiapepsina, de sequência (P4) seguinte:

-7-

«êt Ser Ser Pro Leu 1/5· Asn AU Leu AU Liu Ser Ser Pro Thr Lys Gin His Pro 1 Glu Val Gly Pro Gly lys Tyr Ser Tyr Lyí Phe Asn Gly Pro Leu Ser Vil vai Pro ile Pro AU Trp Leu Glu Asp Leu AU Glu Arg Ser Thr Gly Ser Ala Thr Thr Thr Pro Ile Thr Pro val Gin IU. Gly Thr Pro Aíp Thr Sly Ser Ser Asp Leu Trp val Glu Vil Aso Gly Gin Thr IU Tyr Thr Liu Leu Ser Gly Ala Thr Trp Ser He Sèr Gly Âsp Val Tyr Thr Aso Thr val Gly Gin AU Val Glu Ser AU Lys Lys Ser Thr Ile Asp Gly Leu Leu Gly Leu Sêr Pro Thr Gin Gin Lys Thr Phe Phe Ser Pro Val Phe Thr AU Aso Leu Gly Phe Gly Phe Ué Asp Thr Thr AU Tyr Val Ser Thr Lys Gin Gly Phi Trp Glu Gly Sèr Gly Thr Phe Lys Ser Thr Ser Thr Thr Leu Liu Tyr Leu Pro Ala Thr Vai Sèr Gly AU Lys Ser ser Ser Ser Ser AU Thr Liu Pro Ser Phe Thr Phe ue Pro GU Asp Tyr IU Aso Phe Gly cys Phe Gly Gly IU Gin Ser Ser Ala Asp Val AU Leu Lys AU AU Phe Val Thr Leu Gly Phe Ala Ser Lys

V3l Thr AU fleC Leu Ali Gly Gly

Vil Gly ile Pro Vil Asn AIj Ser

Phe Lys Gin Vil Arg Am Prij Asn

LyS LyS Thr Tyr Leu Lys 7yr Sly AU Vil Gin Asn Ser Thr Ser Sly

Ha Asp Ser Leu Asp Asp Ali Tyr

Ali Sln Thr Leu Asn Leu Asp Phe

Phe Ser Ser Slu Thr Thr Ala Ser

Pr a Ser Lys Ser Thr Thr AU Lys

Ser Tyr Sly Asp Gly Ser Ser Ser

Ser Val Sly Sly L«U Thr Vai Thr

Val Sér Ser Ser Phe Thr Glu Aso AU Phe Ser Thr Leu Asn Thr Vai

Asp Asn AU Lys Ais Ser Leu Aip

Tyr Hls AU Pro Gly Thr Tyr Asn

Thr Sly Ser lie Thr Tyr Thr AU

Trp Thr Ser Thr Sly tyr AU Vai lie Aao Gly IU AU Asp Thr Gly

Vil Vai Ser Al* Tyr Trp AU Gin

Vai Sly Sly Tyr Vai Pht Pro Cys

Gly Vil Sly Ser Al* Arg Ile Vai

Pro IU Ser Thr Gly S#r”s*r Ser -Gly He Sly He Asn Ile Phe Gly

Vai Phe Asn Gly Ala. Thr. Th^ Pro'

Por analogia com aquilo que se conhece para outras aspartilproteases tais como quimosina de vitelo (Foltmann, 1970, Methods in Enzymol., 19, 421-436), pepsinogénio de porco (James e Sielecki, 1986, Nature, 319, 33-38) e a protease A de S. cerevi-siae (woolford et al., 1986, Mol. Cel. Biol., 6, 2500-2510), pode-se supor que o precursor natural da endotiapepsina dá origem a uma forma secretada inactiva, denominada pró-endotiapepsina, a qual se auto-activa em endotiapepsina madura.

Por causa da degenerescência do código genético, existe um grande número de sequências de DNA que codificam uma proteína cuja sequência corresponde à formula atrás referida. Entre elas, uma sequência adaptada é aquela que inclui a sequência (N4a) a seguir indicada: -9 -9

ATGTCTT CCCC7CTCAA GAACGCCTTG GTGACCGCCA TGTTGGCTGG TGGTGCTCTC AGCTCGCCTA CAAAGCAACA CGTTGGAATT CCCGTCAACG CCTCTCCTGA AGTTGuCCCC GGAAAGTACT CGTTCAAGCA AGTCCGSAAC CCCAÂCTACA AGTTCAACGS GCCTCTGTCG GTCAAGAAGA CGTACCTCAA gtacggcgtg ccgatcccag cctggctgga ggatgctgtc cagaactcta CCTCGGGCCT GGCTGAGCGC TCGACCGGTT CTGCGACCAC AACTCCCATC gacagcctcg ATGATGCTTA CATCACTCC5 gttcagatcg GCACCCCTGC gcagactctg aacctggact ttgacactgg atcttcggat ctgtgggtct TCAGCAGCGA GACTACAGCC AGCGAGGTCG ATGGGCAGAC CATCTACACC cccagcaaga gcaccaccgc caagctgctg tcggcgctac ctggtccatc TCCTACGGAG ACGGTAGCTC 7TCCAGCGGC GATGTCTACA CTGACACCGT ctcggttgga ggccttaccg tgacgggcca ggctgtcgag tcggccaaga aggtttcttc cagcttcacc gaggactcga ccattgacgg tctcctgggc

CTGGCCTTCA GCACCCTGAA CACTG7GTCG CCTACCCAGC AAAAGACTTT C7TCGACAAT GCGAAGGCG7 CC7TGGACTC GCCTG7G7TC ACGGC7GATC’ 7TGGCTACCA TGCCCCTGGT ACC7ACAACT TCGGCTTCAT CGATACCAC7 GCCTACACGG GCTCCATCAC CTACACCGC7 G7CTCGACCA AGCAAGSGTT ctgggagtgg acttcgaccg gctacgccgt cggctccggc accttcaagt CGACTTCCAT CGACGGCATC GCTGACACTG GCACGACCCT CCTGTACC7C CCTGCCACCG TCGTGTCGGC CTACTGGGCC CAGGTCTCGG GCGCCAAGTC CAGCTCTTCC GTCGGCGGCT ACGTCTTCCC CTGCAGCGCG ACCCTGCCTT CCTTCACCTT CGGCGTTGGC TCAGCTCGCA TTGTGATKC TGGCGACTAC A7TGAT7TCG GCCCCATCTC CACTGGAAGC TCG7CTTGCT TTGGCGGCAT CCAGTCCAGC GCTGGTATCG GCATCAACAT CTTCGGTGAT GTCGCTCT5A AGGCTTTGTC GTCTTCAACG gggctacaac tcccactctt ggctttgctt CCAAG -10- É preferível que a sequência que codifica o precursor de endotiapepsina esteja interrompida por pelo menos um intrão. De facto, sabe-se que a presença de intrões na parte codificadora de um gene pode nalguns casos aumentar a expressão deste (ver, por exemplo, os trabalhos de J. Callis et al., 1987, Genes and Development, 1, 1183-1200).

Uma sequência interessante que codifica a pré-pró-en- dotiapepsina é aquela que por pelo menos um intrão. da deste tipo é aquela que inclui a sequência (al) interrompida Uma sequência particularmente aprecia-inclui a sequência (N4b) que se segue:

I

AT GTCTTCCCCT CTCAAGAACG CCTTGGTGAC CGCCATGTTG GCTGGTGSTG CTCTCAGCTC GCCTACAAAG CAACACGTTG GAATTCCCGT CAACGCCTCT CCTGAAGTTG GCCCCGGAAA GTACTCGTTC AAGCAAGGTG AGTAGAGCTG CTTCTGTGTG TTGCAACAGA AGACCAACGC AAAAAGAAGA GGTCAAGGCA AGACGGATAT TT7ACTGACA ATTATACTTT TGAAGTCCGG AACCCCAACT ACAAGTTCAA CGGGCCTCTG TCGGTCAAGA AGACGTACCT CAAGTACGGC GTGCCGATCC CAGCCTGGCT

ggaggatgct gtcgagaact ctacctcggg cctggctgag CGCTCGACCG

GTTCTGCGAC CACAACTCCC ATCGACAGCC TCGATGATGC TTACATCACT ccggttcaga tcggcacccc tgcgcagact ctgaacctgg actttgacac tggâtcttcg gatctgtggg tcttcagcag cgagactaca gccagcgagg

TTGGTCAACC CTCSCCCGCA TTTTATTGCA TACATTTTTA GTTTTTTTGG TAATCAGAAT ACTAACATTG GGAATTTCCC AACTGTAGGT CGATGGGCAG ACCATCTACA CCCCCAGCAA GAGCACCACC GCCAAGCTGC TGTCGGGCGC TACCTGGTCC ATCTCCTACG G.AGACGGTAG CTCTTCCAGC GGCGATGTCT acactgacac cgtctcggtt ggaggcctta ccgtgacggg CCAGGCTGTC gagtcggcca agaaggtttc ttccagcttc accgaggact cgaccattga CGGTCTCCTG ggcctggcct tcagcaccct gaacactgtg tcgcctaccc agcaaaagac tttcttcgac aatgcgaagg cgtccttgga ctcgcctgtg TTCACGGCTG ATCTTGGCTA CCATGCCCGT GAGTGACCCC TCTTGATACA TATACTTTTT GATGAATCTT GTTGGAGAAG CATTCCCCAC TAATATGGAA ATTGTTTGTA TCTACAGCTG GTACCTACAA CTTCGGCTTC ATCGATACCA CTGCCTACAC GGGCTCCATC ACCTACACCG CTGTCTCGAC CAAGCAAGGG ttctgggagt ggacttcgac cggctacgcc gtcggctccg gcaccttcaa gtcgacttcc atcgacggca tcgctgacac tggcacgacc ctcctgtacc TCCCTGCCAC cgtcgtgtcg gcctactggg cccaggtctc gggcgccaag TCCAGCTCTT CCGTCGGCGG CTACGTCTTC CCCTGCAGCG CGACCCTGCC TTCCTTCACC TTCGGCGTTG GCTCAGCTCG CATTGTGATT CCTGGCGACT ACATTGATTT CGGCCCCATC TCCACTGGAA GCTCGTCTTG CTTTGGCGGC ATCCAGTCCA GCGCTGGTAT CGGCATCAAC ATCTTCGGTG ATGTCGCTCT GAAGGCCGCC TTTGTCGTCT TCAACGG5GC TACAACTCCC ACTCTTGGCT TTGCTTCCAA G

Um promotor funcional significa aqui um promotor, constitutivo ou regulável, susceptível de provocar em Crvphonec-tria parasitica a transcrição da sequência que codifica o precursor de endotiapepsina. Este promotor inclui um elemento TATA situado numa zona rica em AT, uma região de iniciação da transcrição a jusante daquele e a montante deste último, sequências ditas sequências de activação a montante UAS ("Upstream Activa-ting Sequence") ou de repressão a montante URS ("Upstream Repres-sing Sequence") que regulam a força do promotor sob o efeito de proteínas de reguladoras.

Para determinar a funcionalidade de uma sequência de DNA como promotor utilizar-se-á comodamente o método descrito na secção 11. Este consiste na transformação de uma estirpe de Cryphonectria parasitica tornada deficiente na produção de endotiapepsina por intermédio de uma mutação do gene de estrutura dessa proteína, pela cassete de expressão transportando a sequência que se pretende testar e um marcador de selecção, e depois a localizae entre os transformantes aqueles que são produtores de endotiapepsina por intermédio do teste de selecção sobre meio gelifiçado contendo a caseína e que é descrito na secçaõ 7.

Um promotor apreciado é o promotor do gene que codifica a pré-pró-endotiapepsina ou uma parte funcional deste promotor. Esta inclui, por exemplo, uma parte transportando a caixa TATA da sequência (N5) seguinte:

AAGCTTATCC GCCGCCGGCG GG5GAATTCT ATTGAACTTG TTCGAATCAT TGGTCCGTGG TCTTTTCGTC CATGCGGGCT CCGCTGGCGG ATGAATGACC TTCTGGCTTC TAGCCTGGCG AAGCGÂTGTT ACTCTGTTGT CTATACTATA CGATATGGTC AAGAGAGCAC ATGTGCCGCC AGATGAAGAC ATGTATATAA

AAGGAGTGGC ctcgacggtt gctcaaccat cttctgtctg tcccaacgcç ATCGACTCTT CAACTTCTCC TTCGTGTTCC ACCACCATCA CCTTGCTCCA gacttaggac tttcagcaac cttcaaag e a montante a sequência (N5), um segmento X do fragmento C compreendido entre a extremidade 5' do fragmento A e a extremidade 5' do fragmento c, escolhido de modo a que o segmento X contenha uma região de activação. O fragmento C é uma parte do DNA genómico de Crvphonectria parasitica contido na estirpe depositada na CNCM em 31.08.1990 sob ο N2 1-998. O seu mapa de restrição, bem como o do frgamento A contido no fragmento C estão representados na Figura 4. A sequência de nucleótidos do fragmento A, que inclui o DNA genómico de Crvphonectria parasitica que codifica a pré-pró-endotiapepsina está representada na Figura 2.

Uma localização mais precisa desta região de activação poderá ser realizada por intermédio da obtenção de uma série de segmentos do fragmento C (preparados, por exemplo, por digestão com endonucleases ou exonucleases) que inclua o fragmento A frgamento A flanqueado em 5' por segmentos de comprimentos diferentes da parte do fragmento C compreendida entre a extremidade 5' do fragmento A e a extremidade 5' do fragmento C, e da determinação da funcionalidade do promotor obtida recorrendo ao método atrás referido.

Um exemplo de segmento X do fragmento C que inclui uma região de activação é o fragmento com a sequência a seguxr indicada:

GCATGCTTGG CTCTTTAACG TCCTGCCCAT TCAGGGCCTT CAGCCGGCAC TGGTCCTTCA TCAAGGGGGA CCTCATGACC AXGAACTAAT CTGTGATATC TGATATATTC TAGAAGGCTT GGCTCCTCAA AGTTTCCAGC TAATGAATCA GCGGCCCGCC GCCCTTAAAC CGCATCAGGC AAGTCGTTTG GTGTTGCCAG GCGATGGCGA CAGGAGAGTG GTGTTGATGG GACAAGGGGA GGGAGGCTTA GCCGACTTCA TCCATAGCAC CCACCTGCTT GGCGCCGATA AGTCTGACGA TCCGCTTGAG CTGCAAAACG GCTCCTTGAC CTTTGTTTGG TCGACCGAGG GAAA TCT CTTTTTGCGT GATCGTGCGC GCTTCGTATA GCAATAGGAG ccag:accag caggacgggc cgttgtcacg gtcacatcgt tcgcaacatg CCGAGCGTAG GGATGAACGA ATGACTCGAG CCTTGCCTGA CAGTCTGGCA ATCAATCTAT GGTCACGCAC GATCACAAGC CAATCGCTGT GACTGCGTTA CTAGCCCAAT AATCCCTTGT TCGATCAGAG TGTTCTACAG ACTTCAAGTG AGGTTCAÇ São exemplos de partes funcionais do promotor do gene que codifica a pré-prõ-endotiapepsina os fragmentos BglII-Scal e BamHI-Scal do fragmento C (cf. Figura 4).

Pode também haver interesse na utilização de um promotor proveniente de um outro gene conhecido por ser expresso em Crvphonectria oarasitica ou noutro fungo filamentoso do grupo dos ascomicetes, por exemplo o o promotor do gene que codifica a desidrogenase de gliceraldeído-3-fosfato de Crvphonectria parasita, descrito por Choi et al., 1990, Nucleic Acids Research, 18, 18, Oxford University Press, ou o do gene que codifica a desidrogenase de gliceraldeído-3-fosfato de Asperaillus nidulans. descrito por Mullaney et al., 1985, Mol. Gen. Genet., 199, 37-45. A cassete de expressão é introduzida em Crvphonectria parasita de preferência por cotransformação com um vector que transporta o gene de selecção. A cassete de selecção é ele própria transportada por um vector ou, de preferência, sob a forma de um fragmento linear. A cassete de expressão é, de preferência, mantida no estado integrado no cromossoma. 0 vector que transporta o gene de selecção é mantido, seja por integração no cromossoma, seja sob forma linear extracromossõmica recorrendo a sequências do tipo sequências teleoméricas. Após a esporulação selecciona-se, de preferência, os organismos que perderam o marcador de selecção. 0 invento diz respeito também a uma estirpe de

Crvphonectria parasitica produtora de endotiapepsina, caracteri-zada por ser transformada pela cassete atrás definida e por sobreproduzir a endotiapepsina relativamente a uma estirpe não-transformada, isto é, por secretar mais endotiapepsina do que esta última.

Para a utilização desta estirpe na indústria agroali-mentar, há vantagem em que esta estripe esteja desprovida de marcador de selecção dominante, tal como um exemplo puro de um gene de resistência a um antibiótico. A estirpe hospedeira é, de preferência, a estirpe SEBR103, obtida a partir de um processo clássico de mutação-se-lecção e depositada na CNCM em 31.08.1990 sob o Ns 1-997.

Verifica-se então que a estirpe transformada sobreproduz a endotiapepsina relativamente à estirpe SEBR103 numa relação de sobreprodução pelo menos igual a dois. 0 invento diz igualmente respeito a um processo de preparação de endotiapepsina, caracterizado por incluir uma etapa de cultura da estirpe atrás definida, seguida de uma etapa de isolamento e de purificação dessa proteína. Este processo substitui com vantagem os processos actuais de produção de endotiapepsina. 0 invento diz igualmente respeito a um processo para obter uma estirpe de Cryphonectria oarasitica sobreprodutora de endotiapepsina, transformada pela cassete atrás definida e desprovida de marcador de selecção dominante, caracterizado por incluir pelo menos um ciclo incluindo uma etapa de cotransforma-ção por uma cassete de acordo com uma das Reivindicações la 11, e um marcador de selecção dominante, seguida de uma etapa de purificação por espurulação que permite eliminar o marcador de selecção dominante. Este processo inclui, de preferência, pelo menos dois ciclos desse tipo. O invento será melhor entendido recorrendo à descrição que se segue, dividida em secções, que inclui os resultados experimentais e uma discussão dos mesmos. Algumas das secções dizem respeito a experiências efectuadas com o objectivo de realizar o invento, outras dizem respeito a exemplos de realização do invento, sendo fornecidas evidentemente a título meramente ilustrativo.

Uma grande parte do conjunto de técnicas a seguir referidas, bem conhecidas dos especialistas neste campo, são descritas pormenorizadamente na obra de Sambrook e Maniatis "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" (Clonagem Molecular:

Um Manual para o Laboratório), publicada em 1989 nas edições Cold Spring Harbor Press em Nova Iorque (2â edição). . A descrição que se segue será melhor compreendida com referência às Figuras 1 a 12. A Figura 1 representa a sequência de aminoácidos da endotiapepsina. A Figura 2 representa a sequência de nucleótidos do fragmento A, sendo o local BstEII utilizado na secção 10 representado por linhas ponteadas verticais, bem como a sequência de aminoácidos traduzida. A Figura 3 representa a sequência de aminoácidos da pré-pró-endotiapepsina. A Figura 4 representa um mapa de restrição do fragmento C, sendo os locais BamHI, HindIII, PstI, Sphl, Saci, BglII e Seal simbolizados pelas letras B, Η, P, Sp, C, G, G e S, bem como os fragmentos A, D, E e F contidos no fragmento C. A Figura 5 representa a sequência de DNA genómico que codifica a pré-pró-endotiapepsina, interrompida por três intrões, que estão sublinhados. A Figura 6 representa um mapa de restrição do plasmídeo pl63,1. Os diferentes segmentos de restrição estão marcados de modo arbitrário de acordo com a legenda que se segue:

Segmepto DMA proveniente do plasmideo pBR322 ocaiizacão da origem de replicação □ RI)

Segmento de DNA contendo a sequência que codifica um precursor natural de hGH

Segmento de DNA do fago fd contendo um termined,T de transcrição

Segmento de DNA contendo um promotor -- operador hibrido triptofano-lactose

UVS

Segmento de DNA codificando a β-lactamase (Apr: resistência à ampicilina. -19- -19-

A Figura 7 representa o mapa de restrição de um plasmídeo pl60 cujos fragmentos Pvul-Xhol-BamHI(1) e Pvul-ORI--BamHI(2) provêm respectivamente dos plasmídeos pl63,l e pBR327 e cujo pequeno fragmento BamHI(2)-BamHI(l) é o fragmento 3 descrito adiante. A Figura 8 representa o mapa de restrição do plasmídeo p373,2. Os diferentes segmentos de restrição estão marcados de modo arbitrário de acordo com a legenda que se segue:

J ι _ I___ι 1---i---Γ" sequência Pvul-Bam-HI proveniente do plasmídeo pBR327 sequencia plasmídeo

Pvul-Xhol Droveniente dop163,1 / / t ti "7~i 1 / - sequência Xhol-HincII proveniente do ! f Ll' f! plasmídeo p 1 3é , 1

ClaL

Ndel Pstl (HincII) fragmento 4 descrito adiante X Λ )\ X Ά X = fragmento 3 descrito adiante

• V = segmento de DNA do fago fd contendo um terminador de transcrição A Figura 9 representa um mapa de restrição do plasmídeo p462, sendo o fragmento sintético BglII-HindIII a seguir definido representado por:

A Figura 10 representa um mapa de restrição do plasmídeo p466, sendo o fragmento Ndel-Kpnl que inclui o gene que codifica a oxidase de urato representado por: k k k k k k k k k k k k A Figura 11 representa a sequência de DNA complementar que codifica a pré-pró-endotiapepsina.

Sphl- A Figura 12 representa a sequência do segmento -HindIII do fragmento F.

Seccãol; Isolamento do fragmento A, fragmento de DNA genómico com aproximadamente 2,1 kb, contendo a sequência que codifica o precursor de endotiapepsina. 1) Preparação do DNA genómico A estirpe denominada SEBR 103 foi identificada pelo Centraal Bureau Voor Schimmellcultures (Bureau Central para Culturas de Fungos) como pertencendo à espécie Crvphonectria parasitica e depositada na Collection Nationale de Culture de Microorganismes (Colecção Nacional de Cultura de Microorganismos) C.N.C.M. sob o NS 1-997. A partir de conidiosporos da estirpe Crvphonectria parasitica SEBR 103, recolhidos da superfície de uma caixa de Petri contendo um meio gelatinoso, denominado meio G, e cuja composição é indicada no Quadro 3 a seguir, previamente inoculado com um implante de micelas ou uma suspensão de conidiosporos da mesma estirpe, e depois incubado durante 4 semanas à temperatura ambiente e à luz, faz-se uma sementeira por deposição de uma gota de suspensão de conidiosporos numa caixa de Petri contendo 25 ml de um meio gelatinoso, denominado meio A, cuja composição é indicada no Quadro 1 a seguir. Após 3 dias de incubação a 30°C, o micélio obtido é utilizado para semear um frasco de 1 1 contendo 100 ml de um meio líquido, designado meio B, cuja composição é indicada no Quadro 2 a seguir. Ao fim de 24 horas de incubação a 28°C sob agitação a 220 rot/min, 25 ml do caldo de cultura são usados para semear 250 ml de meio B novo contido num frasco de 1 1. No dia seguinte, após incubação nas condições atrás definidas, a totalidade do caldo de cultura (250 ml) é centrifugada a 5000 g durante 5 minutos. O material depositado é resuspenso numa solução de acetato de sódio 0,15 M contendo lmM de EDTA. 0 micélio é recuperado por meio de filtração sobre papel Whatman 3ΜΜ, congelado em azoto liquido e reduzido a pó com um pilão num almofariz.

Utilizam-se 10 g de pó de micélio em 40 ml de solução de acetato de sódio 0,15 M contendo 4% de lauroilsarcosina de sódio de pH 5. Adiciona-se, após 30 minutos sob agitação suave à temperatura ambiente, cloreto de sódio com um valor final de 0,1 M. Ao fim de 30 minutos de agitação suave, à temperatura ambiente, extrai-se as proteínas com uma solução de fenol (49% v/v) contendo álcool isoamllico (2% v/v) e clorofórmio (49% v/v). Após 3 extracções com esta mistura, extrai-se com uma solução de clorofórmio contendo álcool isoamílico (96% v/v de clorofórmio 4% de álcool isoamílico). Após 2 extracções deste tipo, adicionam-se à fase aquosa 2 volumes de etanol. .As 2 soluções são misturadas suavemente voltando o recipiente ao contrário, o que provoca a aparição de um filamento de DNA precipitado. Este filamento é recolhido recorrendo a uma pipeta Pasteur e depositado num tubo Eppendorf. Centrifuga-se este tubo durante 5 minutos a 100 g. O material depositado é lavado numa solução de etanol a 70% e depois secado sob vácuo. 0 material depositado é colocado em 1 ml da solução tampão, denominado tampão TE, de composição (Tris (HC1) 10 mM, pH 8; EDTA 1 mM]. QUADRO 1

Composição do meio A

Anidrido de glucose 50 g/i Farinha de soja (Soyoptim da Sociéte Industrielle des Oleágineux) 20 g/i Nitrato de cálcio 9 g/i Agar (Bacto-agar de Difco) 15 g/i Solução salina 1 (composição indicada a seguir) 0 ,5 g/i Verificar ou ajustar o pH para o valor 6,0 NaOH IN com : HCl IN ou

Composição da solução salina 1 3 0 ml 79 ml í a ZnCl„ H3B03 MnCl2,4H20

Na2Mo04,2H20 FeCl3 anidro CuSO.,5H„0 4' 2 Água destilada gsp 200 ml 20 ml 50 ml 200 ml 500 ml

Esta suspensão é conservada no máximo um mês a + 4°C) QUADRO 2

Composição do meio B

Glucose 10 g/1 Tiamina 2 mg/1 Solução salina 2 (composição indicada a seguir) 62,5 ml/1 extracto de levedura (Difco) 2,5 g/1 extracto de malte (Difco) 7,5 g/1 Verificar ou ajustar o pH para o valor IN. 6,0 com HCl IN ou NaOH Esterilizar 30 minutos a 110°C. Comoosicão da solução salina 2 NH4N°3 24 g/1 kh3po4 16 g/i NaH2S04 4 g/i KCl 8 g/i MgS04,7H20 2 g/i Cad2 1 g/i Solução salina 1 (composição indicada no Quadro 1) 8 ml/l QUADRO 3

Composição do meio G Parte A Extracto de malte 20 g Extracto de levedura 2 g Agar 16 g Água 1 1 Ajustar o pH para o valor 5,5 Submeter a autoclave durante 20 minutos a 120°C Parte B Ácido aspártico 1000 mg Biotina 10 mg Água 1 1 Diluir para 1/10 a parte B, reparti-la enquanto se filtra a 0,2 M em fracções de 1 ml e conservá-la a - 20°C.

No momento de utilização, juntar 1 ml da parte B diluída a 1 1 da parte A em sobrefusão a 45°C e depois repartir o conjunto por caixas de Petri.

2) Preparação da sonda 1 e da sonda 2

Estas sondas são "pools" de oligonucleótidos sintéticos que incluem o conjunto das sequências de codificação para dois péptidos escolhidos na sequência de aminoácidos da endotiapepsina madura exportada para o meio de cultura de C. parasitica, descrita por V. Barkholt, 1987, Eur. J. Biochem., 167, 327-338, representada na Figura 1. Os péptidos escolhidos nesta sequência denominados péptido 1 e péptido 2 e correspondendo respectivamen-te à sonda 1 e à sonda 2 são os seguintes: Péptido 1: Val-Asp-Gli-Gln-Tre Péptido 2: Gli-Fen-Trp-Glu-Trp-Tre o A estes péptidos correspondem respectivamente 256 (4 x 2 2 2 . . 2 ) e 64 (4 x 2 ) oligonucleótidos que codificam estes, representados pelas fórmulas a seguir indicadas:

A A A

C C C G C GT GA GG CA AC sonda 1

G T G A G

T T T

A A

C C A C CG TT TGGGA TGGAC sonda 2

G T T

G

GT -28-

3) Marcacao da sonda 1 e da sonda 2

As sondas são marcadas com desoxinucleótido transferase terminal (TdT) (comercializada por stratagene, ref.: 600 132). A reacção é realizada sobre 100 ng de uma mistura de oligonucleótidos em solução em solução tampão de reacção "Copalt" (fornecida 10 vezes concentrada por IBI Inc.: cocodilato de potássio 1,4 M pH 7,2, ditiotreitol 300 mM, 1 μΐ de enzima desoxinucleótidil-terminal-transferase (Stratagene) e 50 μΟΐ de . . . . . 32 desoxicitidiltrifosfato dCTP marcado com P. A reacção é levada a cabo a 37°C durante 10 minutos e depois é interrompida por adição de 1 μΐ de EDTA 0,5 M. A extracção é feita com fenol e realiza-se uma diãlise sobre coluna de poliacrilamida Biogel P 10 (Biorad: 150-1050).

Obtêm-se deste modo a sonda 1 radiomarcada e a sonda 2 radiomarcada. 4) Hidrólise do DNA crenómico de Chrvphonectria parasitica

J O DNA genómico obtido a partir de 1) foi submetido separadamente a uma digestão com cada uma das enzimas de restrição seguintes: EcoRI, HindIII e BamHI. Em cada caso, 10 μg do produto de digestão foram colocados sobre gel de agarose a 0,8% e submetidos a uma electroforese na presença de uma gama de segmentos de diferentes tamanhos radiomarcados (Amersham ref. SJ5000). O DNA foi de seguida transferido para um filtro de nitrocelulose (Biorad, ref. 162-0117) seguindo-se a técnica bem conhecida dos especialistas neste campo sob a designação de "Southern Blot", descrita em Maniatis, op. cit., sendo esta operação repetida de modo a serem obtidos dois filtros de nitrocelulose destinados a serem hibridizados, um com a sonda 1, o outro com a sonda 2. 5) Hibridacão

Cada filtro de nitrocelulose tratado de acordo com as técnicas habituais (maniatis et al., op. cit.) foi em primeiro lugar lavado numa solução de pré-hibridação contendo 6 x SSC; 10 x Denhardt's e 100 /xg de DNA de esperma de salmão sonicado e desnaturado (Sigma D9156) durante algumas horas a 42°C, e depois incubado na mesma solução e sob condições idênticas às gue foram anteriormente referidas em presença de uma das sondas marcadas l e 2. A hibridação tem lugar de um dia para o outro. A solução 6 x SSC é obtida a partir da diluição de uma solução 20 x SSC. A preparação da solução tampão 20 x SSC é descrita em Maniatis, op. cit. Em resumo, esta solução tampão contém 175,3 g/1 de NaCl; 88,2 g/1 de citrato de sódio e o seu pH é ajustado para o valor 7 com algumas gotas de NaOH 1 N. A solução 10 x Denhardt's contém 1 g de Ficoll, 1 g de polivinilpirrolidona, l g de albumina de soro bovino para 500 ml de volume final.

Após a hibridação, cada um dos filtros é lavado individualmente numa solução contendo 0,5 SSC a 42°C. Os filtros são seguidamente expostos a uma película fotográfica (Kodak XAR5) de um dia para o outro. A análise da película revelada mostra, no caso do hidrolisato obtido com a enzima HindIII, que uma banda cujo peso molecular corresponde aproximadamente a um fragmento de dimensão ligeiramente superior a 2,1 kb reage positivamente com as duas sondas radiomarcadas. -30- 6) Clonaqem de um fragmento de DNA HindIII-HindIII. com cerca de 2,1 kb, crue se hibridisa com as sondas radiomarcadas 1 e 2: a) Constituição de um banco de DNA genómico 10 μg de DNA de Crvphonectria parasitica são hidrolisa-dos por meio da enzima HindIII e os fragmentos são separados mediante electroforese sobre gel de agarsose a 0,8%. A região que corresponde aos fragmentos de dimensão ligeiramente superior a 2,1 kb é cortada e separada e o DNA é purificado por meio de adsorção sobre leite de silício (Geneclean Tm, Biolad P.O. Box 2284, La Jolla, Califórnia 92038-2284). Estes fragmentos são ligados recorrendo à ligase de DNA do fago T4 (Gibco-BRL) em pBR322 hidrolisado por HindIII e desfosforilado (Biolabs Ref.: 321). Células competentes (isto é, capazes de serem transformadas) (células RRI, Gibco BRL, Ref. 520-8261 SA) são transformadas, tal como é indicado pelo fornecedor, pela solução de ligação e espalhadas sobre um meio gelatinoso, denominado meio gelatinoso LB (Maniatis, op. cit.) com a composição indicada no Quadro 4 a seguir. 0 conjunto das colónias obtidas constitui o banco de DNA genómico.

J -31- -31-

OUADRO 4

Composição do meio crelatinoso LB

Hidrolisato de caseína Bactotryptone (Difco) 10 g/1 Extracto de levedura Bacto (Difco) 5 g/1 NaCl 10 g/1 Ajustar o pH para o valor 7,0 recorrendo a NaOH 5 N Agar Bacto (Difco) 15 g/1 Submeter a autoclave durante 20 minutos a 120°C b) Selecção de clones que transportam o fragmento Hindlll-Hindlll e que se hibridisam com as sondas radiomarcadas 1 e 2, denominado fragmento A.

As colónias obtidas após transformação são absorvidas sobre um filtro de nitrocelulose (Schleicher e Schull, Ref. 40117) e replicadas sobre dois outros filtros de nitrocelulose. Uma primeira série de filtros é hibridisada com a sonda 1 radio-marcada e uma segunda série de filtros é hibridisada com a sonda 2 radiomarcada. As condições de pré-hibridação, hibridação e lavagem são as mesmas que foram utilizadas anteriormente (cf. 5 atrás referido).

Os clones que reagem positivamente com as duas sondas são purificados. O DNA plasmídico de um destes clones é isolado. 0 plasmídeo correspondente é denominado p472. Após certificação de que ele se hibridisa bem com qualquer uma das duas sondas -32- radiomarcadas 1 e 2, o fragmento HindiII-HindiII de 2,1 kb transportado nesse plasmídeo foi isolado, subclonado em M13mpl9 (Pharmacia). Este fragmento é designado fragmento A. A sequência de nucleõtidos foi determinada pela técnica do ciclone ("Cyclone I Biosystem" de IBI). A sequência de nucleõtidos do fragmento A está representada na Figura 2, a qual indica igualmente a numeração dos nucleõtidos, escolhida arbitrariamente, de modo a atribuir o n2 1 ao nucleótido da extremidade 5' do fragmento A, bem como a sequência traduzida de aminoácidos. 7) Descrição da sequência do fragmento A (cf. Figura 2): 1 0 fragmento A transporta a sequência de nucleõtidos que codifica a sequência peptídica da endotiapepsina madura exportada para o meio de cultura descrita por Barkolt (cf. Figura 1), a qual se inicia no nucleótido 694 e termina no nucleótido 1861, sendo interrompida por dois intrões situados nos nucleõtidos 850-938 e 1279-1367. A montante do do nucleótido 694, a fase aberta continua até ao nucleótido 566 onde se encontra um sinal característico do fim de um intrão: AG. Nos nucleõtidos 468-469 encontra-se um sinal característico do início de um intrão: GT. Deve-se notar que a sequência a cavalo sobre o início do intrão e o fim do exão: AAGGTGAGT corresponde à sequência consenso 5' da junção de entrelaçamento ("épissage") descrita por Mount S.M., 1982, Nucl. Ac. Res., 10, 459-472. A montante do nucleótido 468, há apenas uma fase aberta (fase não interrompida por um codão stop) que inclui pelo menos um ATG. Esta inclui um ATG na posição 365-367 (cujo ambiente nucleotidico é compatível com M. Kozak, 1984, Nucl. Ac. Res. 12, p. 2) e um ATG na posição 329-331, estando esta fase de leitura interrompida pelo codão stop TAG na posição 305-307. O programa U.W.G.C.G. da

Universidade do Wisconsin: Devereux et al.f 1984, Nucl. Ac. Res., 12, 8711-8721 - Opção: Pesquisa de péptido-sinal segundo o método de G. von Heijne, 1986, Nucl.; Ac. Res., 14, 483-490, prevê nesta fase aberta uma única sequência que codifica um péptido-sinal, a sequência a seguir indicada, designada sequência nucleotídica pré (que começa no nucleótido 329):

ATGTCTT CCCCTCTCAA GAACGCCTTG GTGACCGCCA TGTTGGCTGG TGGTGCTCTC AGC que codifica o péptido-sinal de 20 aminoácidos com a seguinte sequência, denominada sequência peptídica pré:

Met Ser Ser Pro Leu Lys Asn Ala Leu Vai Tre Ala Met Leu Ala Gli Gli Ala Leu Ser

Um péptido-sinal é esperado pelos especialistas neste campo, uma vez que a endotiapepsina é uma proteína secretada, o que exige a presença de um péptido-sinal.

Entre a sequência que codifica o péptido-sinal atrás referida e aquela que codifica a proteína madura, existe a sequência nucleotídica a seguir indicada, denominada sequência nucleotídica pró (que começa no nucleótido 389):

CCTCTCCTGA

CCCAACTACA

GTACGGCGTG

CCTCGGGCCT

TCGCCTA

AGTTGGCCCC

AGTTCAACGG

CCGATCCCAG

GGCTGAGCGC

CAAAGCAACA

GGAAAGTACT

GCCTCTGTCG

CCTGGCTGGA

CGTTGGAATT CGTTCAAGCA GTCAAGAAGA GGATGCTGTC

CCCGTCAACG

AGTCCSGAAC

CGTACCTCAA

CAGAACTCTA -34- que codifica a sequência peptídica a seguir indicada, denominada sequência peptídica pró

Ser Pro Thr Lys GLn His Vai Gly ILe Pro Vai Asn Ala Ser Pro Glu Vai

Gly Pro Gly Lys Tyr Ser Phe Lys Gin Vai Arg Asn Pro Asn 7yr Lys Phe

Asn Gly Pro Leu Ser Vai Lys Lys Thr Tyr Leu Lys Tyr Gly Vai Pro Ile

Pro Ala Trp Leu Glu Asp Ala Vai Gin Asn Ser Thr Ser Gly Leu Ala Glu

Arg >

Uma sequência peptídica (389-693) pró é igualmente esperada pelos especialistas neste campo, uma vez que ela tem por função inibir a endotiapepsina, provavelmente tóxica para c. parasitica. antes da sua exportação para o meio exterior na sequência da qual essa sequência é clivada.

Existe portanto a montante da sequência que codifica a endotiapepsina madura a sequência que codifica a sequência peptídica prêpró seguinte:

1et Ser Ser Pro Leu Lys Asn Ala Leu Vai Thr Ala Met Leu Ala Gi./ uly Ua Leu Ser Ser P-o Thr Lys Gin His Vai Gly Ile Pro Vai Asn Ala Ser

Pro Glu Vai Gly Pro Gly Lys Tyr Ser Phe Lys Gin Vai Arg Asn Pro Asn

Tyr Lys Phe Asn Gly Pro Leu Ser Vai Lys LyS Thr Tyr Leu Lys Tyr Gly

Vai Pro Ile Pro Ala Trp Leu Glu Asp Ala Vai Gin Asn Ser Thr Ser Gly

Leu Ala Glu Arg A sequência nucleotídica que começa no nicleótido 329 (Figura 2) e termina no nucleótido 1861 (Figura 2) e que está

interrompida por três intrões, está representada na Figura 5, estando os intrões sublinhados, e codifica portanto a pré-pró-en-dotiapepsina, cuja sequência de aminoácidos está representada na Figura 3. 0 fragmento A inclui além disso uma sequência de 328 nucleótidos a 5' do AGT (329-331) de iniciação e uma sequência de 275 nucleótidos a 3' do codão stop TAA (1862-1864), que inclui vários sítios potenciais de poliadenilação. >

A parte do fragmento A a 5' do AGT de iniciação inclui por um lado a extremidade 5' não traduzida do RNA mensageiro e por outro lado a montante desta uma sequência TATAA (187-191), normalmente designada caixa TATA, sequência consenso presente na maior parte dos promotores dos eucariotas (Ballance, D.J., 1986, Yeast, 2, 229-236). Pelo contrário, essa parte não inclui uma sequência do tipo daquelas que são habitualmente designadas sequências de activação a montante ("UAS ou Upstream Regulatory Sequence"), que se encontram, por exemplo, em Saccharomvces (Guarente, L., 1988, all, 52, 303-305) e em Neurosnora (Frede-rick, G.D., 1990, Mol. Gen. Gent., 221, 148-154). Não há, por conseguinte, no fragmento A uma região de activação do promotor a montante da caixa TATA. 0 promotor não é, por conseguinte, funcional, como se mostrará na secção 6.

Seccão 2: Isolamento do fragmento B, fragmento de DNA genómico com aproximadamente 32,6 kb, que contém a sequência que codifica o precursor da endotiapepsina. 1) Preparação do DNA de c. parasitica 0 DNA genómico de C. parasitica SEBR 103 foi preparado de acordo com um protocolo próximo daquele que é descrito por B.

Turcq (Tese universitária: especialidades Ciências da Vida, defendida a 6 de Janeiro de 1989 na Universidade de Bordeaux II), que a seguir se resume.

Preparação de protoplastos 0 micélio proveniente de 250 ml do caldo de cultura da estirpe Crvphonectria parasitica SEBR 103, preparado tal como se descreveu na Secção 1, é filtrado sobre gaze, depois enxaguado com 50 ml de MgSC>4 1 M. Após incubação durante 30 minutos a 37°C, é filtrado de novo sobre gaze e retomado em 20 ml de MgSO^ 1 M. Adicionam-se então 20 ml de MgSC>4 1 M contendo 10 mg/ml de mistura enzimãtica CAYLASE C3 (Société CAYLA) constituída por quitinases, Bl,3, Bl,6, al,3 e al,4 glucanases bem como outros polissacaridases, e incuba-se durante 1 h 30 a 37°C sob agitação suave. Após filtração da mistura, o filtrado é centrifugado durante 10 minutos a 3000 g, depois o material depositado constituído por protoplastos que é obtido é retomado em 20 ml de uma solução tampão, denominada solução tampão ST, cuja composição é: sorbitol 0,8 M, Tris HC1 100 mM, pH 7,5.

Extraccão do DNA aenómico dos protoplastos

Após uma nova centrifugação durante 10 minutos a 3000 g, o material depositado constituído por protoplastos é retomado em 14 ml de solução tampão de lise (Tris HC1 100 mM pH 9, EDTA 35 mM pH 8; SDS a 4% (peso/volume) ; proteinase K (sigma) 600 jtig/ml, depois a mistura é incubada durante 1 h a 50°C. Após uma centrifugação durante 10 minutos a 12 000 g, o volume de material sobrenadante é ajustado para 15,5 ml com solução tampão TE de composição Tris HCl 10 mM, pH 8, EDTA 1 mM, a que se acrescentam depois 19,53 g de CsCl. Após uma ultracentrifugação (16 horas a 50 000 rot/min num rotor vertical), o gradiente é recolhido por fracções que são dialisadas contra uma solução tampão de composição: Tris HCl 10 mM, pH 8 EDTA 1 mM, e analisadas sobre gel de agarose a 0,8%. A fracção que apresenta uma relação espectromé-trica entre a absorção a 260 nm e a absorção a 280 nm vizinha de 1,8 foi conservada.

Construção do banco cosmídico

Cerca de 10 ^g de DNA genõmico da fracção atrás referida foram submetidos a uma digestão parcial com a enzima de restrição Mbol e ligados recorrendo à ligase T3 ao cosmídeo pHC79-ura 5, vector cosmídico com cerca de 8 kb, construído por inserção do fragmento EcoRI-EcorI contendo o gene ura 5 (Begueret et al., 1984, Gene, 32 487-492) no local EcoRI do cosmídeo pHC79 disponível no mercado (comercializado por BRL' e construído por Hohn B. et al., 1980, Gene, 11, 291-298)), tendo o cosmídeo pHC79-ura 5 sido previamente linearizado por meio da endonuclease BamHI e desfosforilado com fosfatase alcalina (Promega Ref. CIP -M 204) . A mistura de ligação foi empacotada em partículas fágicas recorrendo ao "kit" "Gigapak plus" de Stratagene, e foi usada para transformar a estirpe receptora E. coli LE 392 (Murray et al., 1977, Mol. gen. Genet. 150, pág. 153), disponível no mercado e distribuída por Genofit. Após ser espalhada sobre meio gelatinoso LB (cf. Quadro 4), foram-lhe adicionados 100 mg/ml de ampicilina.

Cerca de 4500 clones resistentes à ampicilina assim obtidos foram repicados individualmente sobre placas de microti-tulação contendo meio líquido LB de composição indicada no Quadro 4, mas sem agar, e conservados a - 80°C. Demonstrou-se, por digestão de cosmídeos extraídos de cerca de 12 clones escolhidos -38- ao acaso, que a dimensão média das inserções do banco era de cerca de 37 kb.

2) Passagem ao crivo do banco por hibridacão com o fracrmento A > 0 fragmento A contendo o gene de estrutura de endotia-pepsina foi utilizado como sonda para experiências de hibridação. Num primeiro momento, os clones contidos nas placas de microtitu-lação foram replicados em caixas de Petri contendo meio LB gelatinoso (cf. Quadro 4) a que se adicionou ampicilina, e depois transferidos para membranas de nylon (Hybond N+, Amersham). As bactérias foram então submetidas a lise recorrendo a uma solução contendo NaCl 1,5 M e NaOH 0,5 M. Apõs tratamento com uma solução de proteinase K (Sigma) durante 30 minutos a 37°C, os filtros são lavados com 2 x SSC (naCl a 17,5 g/1, citrato de sõdio a 8,82 g/1 pH 7) e pré-hibridisados a 42°C de um dia para o outro com o fragmento A isolado de acordo com o Exemplo 1 e marcado com peroxidase de rábano (Amersham) e revelados recorrendo ao "kit" de sondas quimioluminescentes ECL "Sistema de Detec-ção de gene" (RPN 2101, Amersham). Os sinais de hibridação obtidos são visualizados sobre uma película apropriada. Dos 4500 clones do banco, 2 clones proporcionaram um sinal positivo. Estes dois clones, no que se segue designados 8H12 e 41H7 e contendo respectivamente os cosmídeos designados p8H12 e p41H7 foram repicados em meio líquido LB contendo 100 mg/1 de ampicilina. Após uma cultura de um dia para o outro a 37°C, os cosmídeos são extraídos pelo método de lise em meio alcalino, purificados por meio de ultracentrifugação com cloreto de césio e brometo de etídio de acordo com as técnicas descritas em Maniatis, op. cit. Os cosmídeos assimpurifiçados foram digeridos pela enzima HindIII e os fragmentos obtidos foram submetidos a uma electroforese sobre gel de agarose a 0,8%. Realizou-se um ensaio Southern Blot sobre uma membrana de nylon e o filtro foi hibridisado com o

fragmento A utilizando a técnica descrita anteriormente. A presença deste fragmento em cada um dos cosmídeos p8H12 e p41H7 foi deste modo confirmada. 3) Análise fisica dos cosmideos positivos P8H12 e P41H7

Verificou-se que os perfis de restrição dos cosmídeos p8H12 e p41H7, obtidos recorrendo às enzimas Notl, Smal, Sfil, Xbal, BamHI e Pvul eram idênticos, o que indica que esta região do DNA genõmico contendo o gene que codifica a endotiapepsina de C. parasitica foi clonada sem rearranjo para estes dois clones. 0 perfil de restrição para o cosmídeo p8H12, cosmídeo que foi retido para se prosseguir o estudo, é indicado no Quadro 5 a seguir. QUADRO 5

Perfil de restrição do cosmídeo p8H12

Enzima de Número de locais Dimensão em kb TOTAL restrição de corte em Kb J | Notl 1 não determinada - | Smal 2 não determinada - | Sfil 3 20; 16; 4,1 40,1 | Xbal 4 23; 14; 2,9; 1,2 41,1 I BamHI ) 1 5 15; 9; 7; 7; 2,6 40,6 | Pvul 5 23; 7/4; 6,4; 2,1; 40,4 1,5 Média 40,6 |

L -40-

Este perfil permite calcular a dimensão média do cosmídeo p8H12, igual a cerca de 40,6 kb, sendo por conseguinte a do fragmento inserido genômico igual a cerca de 40,6 - 8,0 = 32,6 kb. Este fragmento inserido genômico é denominado fragmento B.

Demosntrou-se, por outro lado, mediante um ensaio Southern Blot sobre uma membrana de nylon, que o fragmento BamHI-BamHI com cerca de 9 kb (cf. Quadro 5), no que se segue designado fragmento C, era o único fragmento BamHI-BamHI que se hibridisava com o fragmento A utilizado como sonda, pelo que continha, por conseguinte, este fragmento na sua totalidade.

Seccão 3: Clonagem do fragmento C, fragmento de DNA genômico com cerca de 9 kb contendo a sequência que codifica o precursor da endotiapepsina. 10 μg do cosmídeo p8H12 foram digeridos com a endonu-clease Bamhl e os diferentes fragmentos foram separados sobre gel de agarose a 0,8%.

O produto da digestão por meio da enzima BamHI contendo o fragmento C foi ligado recorrendo à ligase de DNA T4 (Gibco--BRL) ao plasmídeo pBR322 aberto no local BamHI e desfosforilado (comercializado por Biolabs - Ref. 320). O produto da ligação serviu para transformar células competentes da estirpe E. coli K12 RR1 (Gibco-BRL, Ref. 520-8261A). Apôs a mistura de transformação ter sido espalada sobre caixas de Petri contendo meio LB gelatinoso a que se adicionou ampicilina (10 0 jug/ml) e incubação das caixas a 37°C durante 24 horas, as colónias são replicadas sobre membranas de nylon; as bactérias são então submetidas a lise e depois as membranas são hibridisadas com o fragmento A, como se descreveu anteriormente no Exemplo 2.2). 18 colónias contendo DNA que se hibridisa com o fragmento A foram assim -41-

identifiçadas. 0 seu conteúdo de DNA plasmídico foi extraído e analisado sobre gel de agarose a 0,8% após digestão com endonu-clease BamHI. Verificou-se assim que todas essas colónias continham um plasmídeo derivado de pBR322 que tinha inserido no local BamHI um fragmento com cerca de 9 kb. Escolheu-se para prosseguir o estudo um clone denominado SEBR 3104 que continha o plasmídeo designado pEpl. 0 clone SEBR 3104 foi depositado na C.N.C.M sob o ns 1-998.

Submeteu-se o plasmídeo pEpl a digestões simples e/ou múltiplas com as enzimas BamHI, HindIII, PstI, Saci, Sphl, BglII e Seal. 0 mapa de restrição obtido está representado na Figura 4, representando os símbolos B, Η, P, Sp, C, G, e S respectiva-mente BamHI, HindIII, PstI, Saci, Sphl, BglII bem como Seal, sendo o codão de iniciação do gene de endotiapepsina de c. parasitica indicado por um i e indicando a seta o sentido da transcriçaõ do gene da endotiapepsina. O fragmento A descrito na Secção 2, bem como os fragmentos D, E e F descritos nas secções 4 e 5 estão igualmente representados nessa figura.

Supõe-se que o local BamHI (B) que forma a extremidade 5' do fragmento C está situado a cerca de 4 kb do codão de iniciação e que o local BglII (G) em 5' está situado a cerca de 3 kb do codão de iniciação. Parece por conseguinte interessante isolar e clonar o fragmento BglII-BglI com cerca de 5,1 kb contendo a totalidade do fragmento A, designado fragmento D, e que contém muito provavelmente a informação necessária para a expressão do precursor da endotiapepsina. -42-

Seccão 4: Clonagem do fragmento D, fragmento de DNA genómico com cerca de 5,2 kb contendo a sequência que codifica o precursor da endotiapepsina.

20 μg do plasmídeo pEpl foram digeridos com a enzima BglII (cf. Figura 4) e os produtos da digestão foram separados sobre gel de agarose de baixo ponto de fusão (Sigma - Ref. A9414) a 0,8%. Após coloração do gel de agarose com brometo de etídio, a banda de agarose contendo o fragmento D com cerca de 5,2 kb é cortada com um escalpelo sob iluminação ultravioleta a 310 nm. 0 DNA . é então extraído seguindo as instruções do "kit" NACS.52PREPAC (Gibco-BRL) e depois diluído em 10 μΐ de solução tampão TE, de composição Tris HC1 10 mM pH 8, EDTA 1 mM; 1 μΐ da suspensão obtida foi ligado recorrendo à ligase de DNA T4 (Gibco--BRL) ao plasmídeo pBT6, derivado do plasmídeo pBT3 por inserção de um "linker" BglII nò local Smal do "polilinker" de pUC12. O plasmídeo pBT3 descrito por Orbach M.J. et al., 1986, Mol. Cell. Biol., 6, 2452-2461, transporta um gene mutado de β-tubulina de Neurospora crassa (fungo filamentoso dos ascomycetes) que confere resistência ao benomil (marcador de selecção dominante). Antes da ligação, o plasmídeo pBT6 foi linearizado por meio da endonu-clease BglII e desfosforilado com fosfatase alcalina (Promega, Ref. CIP-M204). o produto da ligação serviu para transformar células competentes da estirpe E. coli K12 RR1 (Gibco-BRL - Ref. 530--8261SA). Após espalhar a mistura de transformação sobre caixas de Petri contendo meio LB gelatinoso a que se adicionou ampicili-na (100 μΐ/ml) e incubação das caixas a 37°C durante 24 horas, as colónias são replicadas sobre membranas de nylon. As bactérias são então submetidas a lise, depois as membranas são hibridisadas com o fragmento A, tal como se descreveu na Secção 2.2. Duas colónias contendo o DNA que se hibridisa com o fragmento A foram assim identificadas. 0 seu conteúdo de DííÁ plasmídico foi extraído e analisado sobre gel de agarose a 0,8% após digestão com endonuclease BglII. Verificou-se deste modo que estas duas colónias continham um plasmídeo derivado de pBT6 que tinha inserido nas duas orientações possíveis no local BglII o fragmento D com cerca de 5,2 kb. Escolheu-se para prosseguir o estudo um clone contendo este plasmídeo, designado plasmídeo pEp2.

Secção 5: cionagem do fragmento F, fragmento de DNA genõmico com cerca de 3,5 kb contendo a sequência que codifica o precursor da endotiapepsina. A cionagem foi realizada em duas etapas. Primeiro, o fragmento E com cerca de 3,7 kb contendo a totalidade do fragmento F foi clonado no plasmídeo pUC18 no local sphl do "poli-linker". 0 plasmídeo pEp3 assim obtido permitiu purificar o fragmento F que foi então subclonado por sua vez no plasmídeo pUCl8 no local BamHI do "polilinker". Obteve-se assim o plasmídeo pEp4. 1) Construção do plasmídeo pEp3 1 μg do plasmídeo pEpl foi digerido com a enzima Sphl (cf. Figura 4) e depois o DNA foi purificado com 0,1 volume de acetato de sódio 3 M e 2 volumes de etanol. Obteve-se deste modo um fragmento Sphl com cerca de 3,7 kb, designado fragmento Ε. O DNA foi então dissolvido em 40 μΐ de solução tampão TE de composição (Tris HCl 10 mM, pH 8, EDTA 1 mM) e depois dialisado sobre uma coluna PIO (Pharmacia). Ligou-se então recorrendo à ligase de DNA T4 (Gibco-BRL) 1 μΐ da mistura atrás obtida com cerca de 25 ng do plasmídeo pUCl8 previamente linearizado com a endonuclease Sphl e desfosforilado com fosfatase alcalina (Promega, Ref. CIP-M204). O produto da ligação serviu para transformar -44- células competentes da estirpe E. coli DH5a (Gibco-BRL, Ref. 530-8263 SA) . Apõs espalhar a mistura de transformação sobre caixas de Petri contendo meio LB gelatinoso a que se adicionou ampicilina (100 Mg/ml), Xgal (40 ^g/ml) e IPTG (2 Mg/ml) e incubação das caixas a 37°C durante 24 horas, 350 colónias brancas foram repicadas sobre o mesmo meio. As colónias foram então replicadas sobre membranas de nylon, depois as bactérias foram submetidas a lise e finalmente as membranas foram hibridi-sadas com o fragmento A, tal como se descreveu anteriormente na Secção 2.2. 37 colónias contendo DNA que se hibridisa com o fragmento A foram assim identificadas. O DNA plasmídico de 30 clones foi extraído e analisado sobre gel de agarose a 0,8% após digestão com a endonuclease Sphl. Duas colónias contendo um plasmídeo derivado de pUC18 tendo inserido (nas duas orientações possíveis) no local Sphl o fragmento E de 3,7 kb foram conservadas. Estes plasmídeos foram designados pEp3 (a) e pEp3 (b). No plasmídeo pEp3 (b), o local BglII do fragmento E está afastado cerca de 3,5 kb do local BamHI situado sobre o "polilinker” de pUC18. 2) Construção do plasmídeo pEp4

10 μg do plasmídeo pEp3 (b) foram submetidos a três digestões sucessivas com as endonucleases BglII, BamHI e Pvul e os produtos da digestão foram separados sobre gel de agarose a 0,8%. Após coloração do gel com brometo de etídio, a banda de agarose contendo o fragmento Sphl com cerca de 3,5 kb, designado fragmento E, acrescida de um fragmento Sphl-BamHI do "polilnker·' de pUC18 foi cortada com um escalpelo sob iluminação ultravioleta a 310 nm. O DNA foi então extraído e depois dissolvido em 20 °1 de solução tampão TE de composição (Tris HC1 10 mM pH 8, EDTA 1 mM). 5 μΐ da suspensão obtida foram ligados a cerca de 750 ng do -45-

plasmídeo pUC18 previamente linearizado com a endonuclease BamHi e desfosforilado com fosfatase alcalina. 0 produto da ligação serviu para transformar células competentes da estirpe E. coli DH5a segundo o protocolo atrás descrito. O DNA plasmídico de 30 colónias brancas foi extraído e analisado sobre gel de agarose a 0,8% após digestão com as endonucleases BamHI, BglII ou Smal. Uma colónia foi aproveitada na qual existe um plasmídeo derivado de pUC18 que tem inserido no local BamHi o fragmento F com cerca de 3,5 kb acrescido de um fragmento Sphl-BamHI do "polilinker" de pUC18. Este plsmídeo foi denominado pEp4.

3) Determinação da sequência do segmento Sphl-HindIII do fracrmento F

Esta sequência, determinada tal como atrás se indicou (cf. Secção 1) está representada na Figura 12. Contém sinais de activação do promotor do gene que codifica a pré-pró-endotiapep-sina, como se msotrará na secção 10,

Secção 6: Transformação de C. parasitica por cada um dos vectores contendo um dos fragmentos A, B e C.

Preparação dos protoplastos

0 micélio proveniente de 250 ml do caldo de cultura da estirpe C. parasitica SEBR 103, preparado tal como se descreveu na Secção 1, foi enxaguado com 50 ml de MgS04 1 M. Após incubação durante 30 minutos a 37°C, procede-se â sua filtração sobre gaze e retoma-se o micélio em 20 ml de MgSO^ 1 M. Junta-se então 20 ml de MgS04 1 M contendo 10 mg/ml da mistura enzimática caylase C3 (Sociéte CAYLA) constituída por quitinases, βι,3, Bl,6, al,3 e al,4 glucanases bem como outras polissacaridases, e incuba-se durante 1 h 30 a 37°C sob agitação suave. Após filtração da mistura, o filtrado é centrifugado durante 10 minutos a 3000g, depois o material depositado constituído por protoplastos obtido é retomado em 15 ml de solução tampão, designada solução tampão ST, de composição: sorbitol 0,8 M, Tris HCl 100 mM, pH 7,5. Após uma nova centrifugação durante 10 minutos a 3000 g, o material depositado é retomado em 10 ml de uma solução tampão, designada solução tampão STC10, de composição: sorbitol 0,8 M Tris HCl 100 mM pH 7,5 CaCl2 lOmM. Os protoplastos são então recenseados utilizando uma célula Malassez g de modo a ajustar-se a sua concentração para o valor 10 /ml apôs centrifugação durante 10 minutos a 3000 g e retoma do material depositado numa solução tampão, designada solução tampão STC50, de composição: sorbitol 0,8 M, Tris HCl 100 mM pH 7,5, CaCl2 50 mM.

Cotransformacão dos protoplastos pelo cosmídeo P8H12 e pelo plasmídeo pBT3 0 cosmídeo p8H12 que contêm o fragmento B (cf. Secção 2) não transporta um marcador de selecção dominate (utilizável para a selecçaô directa). 0 plasmídeo pBT3 descrito por Orbach M.J. et al., 1986, Mol. Cell. Bil., 6, 2452-2461, que transporta um gene mutado de β-tubulina de Neurospora crassa (fungo filamentoso de ascomycetes) que confere resistência ao benomilo (marcador de selecção dominante) foi por conseguinte utilizado conjuntamente com o cosmídeo p8H12 (método de cotransformação: ver os trabalhos sobre a cotransformação de Asperoillus niqer de Wernars K. et al, 1987, Mol. Gen. Genet., 209, 71-77).

Uma mistura composta por l μg do plasmídeo pBT3 previa-mente purificado por meio de ultracentrifugação numa solução tampão contendo cloreto de césio e brometo de etidínio de acordo com as técnicas descritas em Sambrook, op. cit., e de 4 ^g de cosmídeo p8Hi2, purificado do mesmo modo, em 10 ml de solução tampão TE, de composição (Tris HC1 10 mM pH 8, EDTA 1 mM) é incubado durante 20 minutos a 0°C com 100 ml da preparação de protoplastos preparada antenormente (ou seja 10 protoplastos). Após a adição de 1 ml de uma solução constituída por 60% (pe-so/volume) de PEG 4000 (polietilenoglicol de massa molecular 4000) e solução tampão de composição: Tris HC1 20 mM pH 7,5, CaCl2 100 mM, e incubação da mistura durante 10 minutos ã temperatura ambiente, mistura-se com esta última 1 ml de solução tampão STC10 (anteriormente definida). Os protoplastos assim tratados são incluídos em 60 ml de meio gelatinoso contendo 1 mg/ml de Benlate (agente antifúngico comercializado por Dupont Nemours), designado meio D, cuja composição á indicada no Quadro 6 a seguir, mantido no estado de sobrefusão a 45°C. A mistura em sobrefusão é espalhada sobre caixas de Petri contendo um meio gelatinoso a que se adicionou 1 mg/ml de Benlate (agente antifúngico comercializado por Dupont Nemours que contém 50% de benomi-lo), designado meio C e cuja composição é indicada no Quadro 7 a seguir. As caixas de Petri são incubadas a 28°C durante o tempo necessário para que apareçam protoplastos regenerados resistentes ao benomilo. Os transformantes regenerados assim obtidos são designados 29Pn, representando η o número do clone considerado. A resistência ao benomilo dos clones é confirmada por meio de repicagem de implantes micelianos de cada clone sobre o meio B tornado gelatinoso pela adição de 20 g/1 de agar e a que se adicionou 1 mg/1 de Benlate.

Apenas os clones que se desenvolvem neste meio são postos a esporular segundo o método descrito na Secção 1.1. Os conidiosporos obtidos são recolhidos em massa numa solução tampão contendo pelo menos 15% de glicerol e são conservados a - 80°C. QUADRO 6

Composição do meio D Γ 250 g/1 20 g/1 2 g/1 100 mg/1 0,2 g/1 20 g/1 62,5 ml 6,0 recorrendo a HC1 1 N ou

Sacarose

Glucose

Tiamina

Asparagina

Extracto de malte

Agar

Solução salina 1 (composição indicada no Quadro 2)

Ajustar o pH para o valor NaOh l N.

Submeter a autoclave durante 30 minutos a 110°C, e depois

Adicionar 1 mg/ml de Benlate ao meio arrefecido para 60 °c

QUADRO 7

Composição do meio C

Meio D 750 ml/1

Solução tampão STC10 250 ml/1 (de composição: sorbitol 0,8 M, Tris HCl 100 mM pH 7,5,

CaCl2 10 mM)

Ajustar o pH para o valor 6,0

Adicionar 1 mg/ml de Benlate ao meio submetido a autoclave a 60°c cotransformacão dos protoplastos pelo Plasmídeo p472 e o plasmídeo pBT3 por um lado, bem como pelo plasmídeo pEpI e o plasmídeo pBT3. por outro♦ O plasmídeo p472 que contém o fragmento A (cf. Secção 1) e o plasmídeo pEpl que contém o fragmento C (cf. Secção 3) também não transportam o marcador de selecção dominante.

J A estirpe C. parasitica SEBR 103 foi cotransformada de acordo com um protocolo idêntico àquele que foi descrito no parágrafo precedente, com as seguintes misturas de plasmídeos: 4 Mg de pEpl s 1 /jg de pBT3, 4 μ% de p472 e 1 Mg de pBT3. Os transformantes assim obtidos são designados 30Pn para a cotrans-formação pelos plasmídeos pEpl e pBT3, e 31Pn para a cotransfor-mação pelos plasmídeos p472 e pBT3, representando η o número do clone considerado.

I

Secção 7: Selecção de estirpes transformadas sobreprodutoras de endotiapepsina. 1) Método geral a) Selecção em meio gelatinoso contendo caseína.

Implantes micelianos de cerca de 100 colónias resistentes ao benomilo foram repicados sobre um meio gelatinoso contendo caseína, denominado meio E, cuja composição é indicada no Quadro 8 a seguir. Neste meio, as colónias de Cryphonectria parasitica que produzem a protease dão origem a um halo de precipitação cuja superfície é proporcional à quantidade de endotiapepsina secre-tada.

As estirpes sobreprodutoras são escolhidas com base na relação entre o diâmetro do halo de precipitação e o diâmetro da colónia, significativamente maior do que o da estirpe testemunha não transformada. Uma preparação de conidiosporos destas estirpes sobreprodutora é obtida seguindo o método utilizado na Secção 1 1). Além disso, verificou-se que, por adição ao meio E de 5 jug/ml de pepstatina, substância inibidora específica das aspar-til-proteases, se obtinha uma redução no crescimento dos halos observados nas estirpes sobreprodutoras. Este resultado indica que se trata efectivamente de uma sobreprodução de uma aspartil--protease. b) Selecção em meio líquido. a) Estudo em frascos: A fim de confirmar estes resultados, realizaram-se testes de produção em frascos da seguinte maneira: fez-se uma -51-

sementeira nos frascos de 250 ml contendo 40 ml de meio E cuja composição se indica a seguir. Os frascos são a seguir incubados a 28°C sobre um agitador rotativo excêntrico regulado para a velocidade de 220 rot./min. durante 48 horas. Para cada estirpe, as culturas foram realizadas em três frascos diferentes e calculou-se a média dos resultados de dosagem da actividade coagulante para os três frascos. 0 testemunho era constituído pela estirpe Cryphonectria parasitica SEBR 103 não-transformada. A dosagem da actividade coagulante é realizada utilizando o método oficial de determinação do teor em enzima das soluções coagulantes publicado no Journal Officiel de la Republique Française (Jornal Oficial da República Francesa) de 20 de Março de 1981 (parágrafo C), que a seguir se resume: - 1 ml de material sobrenadante da cultura diluído com água de modo a ter um tempo de coagulação compreendido entre 5 e 10 minutos é adicionado a 10 ml de leite estandardizado (fornecido pelo INRA - Station Expérimentale Laitière (Estação Leiteira Experimental) - 39800 POLIGNY), colocado num frasco adequado;

- mede-se o tempo de coagulação assinalada pelo aparecimento de uma floculação do leite sobre a parede do frasco em rotação em banho-maria a 30°C; - a actividade coagulante designada AC, expressa em mg/ml, é dada pela fórmula:

K AC ------------x a T - a sendo K e a factores dependentes do leite e da enzima considerados (expressos respectivamente em mgs/1 e em s) . T: tempo de coagulação (expresso em segundos) a: factor de diluição. β) Estudo em fermentador: A produção de endotiapepsina foi avalida num fermentador de 2 1 (Biolaffite) contendo 1,2 1 de um meio de cultura obtido por concentração do meio F, esterilizado recorrendo a uma autoclave que é utilizada durante 45 minutos a 120°C. As condições de cultura são as seguintes: agitação a 800 rot./min; arejamento: 2 wm (vvm: volume de ar por volume de meio por minuto). Realiza-se uma sementeira no fermentador a 5% (v/v) com uma pré-cultura em frasco tal como foi atrás descrita (em a). A temperatura é mantida a 28°C. A medição da actividade coagulante realiza-se após cerca de 90 horas de fermentação usando o método de dosagem atrás descrito.

Verificou-se por determinação do peso seco da cultura que a quantidade de biomassa produzida pelos transformantes sobreprodutores não difere significativamente daquela que é produzida pela estirpe testemunha. QUADRO 8

Composição do meio E 1 1 KIi2P04 0,36 g/i ~1 |Na2HP04,2H20 0,71 g/1 |MgS04,7H20 0,50 g/1 | NaCl 0,10 g/i |Hidrolisato de caseína 0,05 g/i j (casamino-ácidos da Difco) |Caseína (Hammarsten) 6,0 g/i caci2 0,06 g/i |Solução salina 2 10 ml/l |(composição indicada no Quadro 2 do |Exemplo 2) |Deixar sob agitação durante 15 minutos de modo a evitar a |formação de uma "mousse". |Juntar 15 g de Agar (Bacto-agar da Difco) • |Ajustar o valor do pH para 6,2 com HC1 1 N OU NaOH 1 N. |Introduzir numa autoclave durante 20 minutos a 120°C. QUADRO 9

Composição do meio F

Farinha de sementes de algodão 10 g/1 Glucose 35 g/i Ca(N03) 3,5 g/i CaC03 0,75 g/i Óleo de linho 2,5 ml/l Oleato de sódio 1,5 g/i

Ajustar o valor do pH para 6,20 com HC1 1 N ou NaOH 1 N. Introduzir numa autoclave durante 45 minutos a 120°C.

Análise da enzima secretada pelos transformantes: O mosto de fermentação obtido após cultura (quer em frascos, quer em fermentadores) dos transformantes sobreproduto-res e da estirpe testemunha C. oarasitica SEBR 103 não-transfor-mada foi sub,etido a uma centrifugação de modo a eliminar a massa miceliana. Após a desnaturação das proteínas do material sobre-nadante na presença de SDS durante 5 minutos a 100°C, efectuou-se uma electroforese sobre gel de poliacrilamida na presença de SDS. Observa-se, após aplicação de corante azul de Coomassie, a existência de uma banda maioritária de massa molecular que se aproxima de 36 kDa, que corresponde à massa molecular da endo-tiapepsina matura deduzida da sua sequência (cf. Figura 1), de coloração mais intensa para os transformantes sobreprodutores do que para a estirpe testemunha; e das bandas minoritárias idênticas para os transformantes sobreprodutorès e para a estirpe testemunha.

Verificou-se por outro lado, mediante reacções do tipo antigénio-anticorpo ("kit" Rennetest, France Biochem) sobre o material sobrenadante das culturas de transformantes sobreprodu-tores e a estirpe testemunha não-transformada, que a enzima secretada é idêntica à de Cryphonectria parasitica de acordo com o método de identificação descrito no Journal Officiel de la Republique Française (Jornal Oficial da República Francesa) de 20 de Março de 1981.

Além disso, determinou-se a relação entre a actividade coagulante e a actividade proteolitica da enzima secretada. A actividade coagulante, expressa em g/1, é medida segundo o método anteriormente descrito no parágrafo b) a); a actividade proteo-lítica, expressa em miliequivalentes de glicina por litro, é medida recorrendo ao reagente TNBS, descrito por R. Fields, Biochem. J. (1971) 124: 581-590, mediante dosagem dos grupos aminados surgidos após proteólise da dimetilcaseína.

Essa relação situa-se entre 0,045 e 0,050 para os transformantes sobreprodutores, o que está bastante próximo daquela que se obtém com a estirpe testemunho não-transformada. Destes três estudos, pode concluir-se que é efectivamente a produção de endotiapepsina que sofreu especificamente um incremento nos transformantes sobreprodutores. c) Verificação da integração do fragmento A, B ou c pela técnica de "Southern Blot". 0 DNA genómico dos transformantes seleccionados é preparado de acordo com um protocolo próximo daquele que é -56-

descrito por Raeder e Broda, 1965, Letters in Applied Microbio-logy 1, 17-20, que se resume a seguir: 0 micélio proveniente de uma cultura em frascos, realizada tal como se descreve na Secção 1 1), é liofilisado e filtrado através de gaze. Após enxaguamento com uma solução de EDTA 20 mM pH 8, o micélio é novamente filtrado e depois congelado a - 80°C e liofilisado. 50 mg do liofilisato obtido são então triturados e depois colocados em suspensão em 500 μΐ da seguinte solução tampão de extracção: Tris HCl 200 mM, pH 8,5, NaCl 250 mM, EDTA 25 mM, SDS a 0,5%, proteinase K (Sigma) 200 jug/ml. 0 conjunto é incubado durante 45 minutos a 45°C e depois o DNA é extraído com fenol clorofórmio, e depois precipitado com isopro-panol. O material precipitado é recolhido em 100 μΐ de TE (Tris HCl 10 mM pH 8, EDTA 1 mM).

0 DNA é em seguida digerido pelas endonucleases apropriadas e os fragmentos obtidos são separados por meio de elec-troforese sobre gel de agarose a 0,8%. os fragmentos são transferidos por capilaridade para uma membrana de Nylon (Hybond N+ -Amersham) de acordo com o método preconizado pelo fabricante. Os filtros são então hibridizados a 42°C durante uma noite com, sucessivamente, o fragmento A e o fragmento HindIII-HindIII contendo o gene mutado da β-tubulina de Neurospora do plasmídeo pBT3, marcados com peroxidase de rábano (Amersham e revelados com o "kit*' de sondas quinioluminescentes ECL "Système de détectio de gene" (Sistema de detecção de gene) (RPN 2101, Amersham). Os sinais de hibrídização obtidos são visualizados sobre uma película apropriada. -57- 2) Seleccão de sobreprodutores entre os transformantes 29Pn (contendo o cosmídeo p8H12-que transporta o fragmento B - cf. Seccâo 4) . 164 colónias resistentes ao benomilo foram obtidas quando da co-transformação pelo cosmídeo p8H12 e pelo plasmídeo pBT3. Foram escolhidos ao acaso 127 clones entre aqueles para o teste de selecção sobre meio gelatinoso contendo caseína, que permitiu a retenção de 14 clones. Entre estes, 7 escolhidos ao acaso foram submetidos ao teste de selecção em meio líquido. Deste modo foram retidos 3 clones; os clones 29P1, 29P2 e 29P3 que apresentavam após cultura em frascos actividades oagulantes de, respectivamente, 0,9, 1,07 e 0,94 g/1 enquanto a estirpe testemunha não-transformada apresentava uma actividade de 0,62 g/1 (o factor de sobreprodução, relação entre a actividade coagulante da estirpe sobreprodutora e a actividade coagulante da estirpe testemunha é, por conseguinte, repectivamente de 1,45, 1,73 e 1,54). os clones 29P2 e 29P3 foram então testados num fermentador de 2 litros e obtiveram-se actividades coagulantes de 1,76 e 2,19 g/1, respectivamente, enquanto que a estirpe testemunha não produz mais do que 1,20 g/1 (os factores de sobreprodução são, por conseguinte, de + 1,47 e + 1,83).

0 clone 29P3 e a estirpe testemunha C. parasitica SEBR 103 foram cultivados num fermentador de 20 litros em condições experimentais menos limitativas, em particular no que diz respeito a agitação, arejamento e transferência de massa, e próximas das condições utilizadas num processo industrial.

Este ensaio permitiu obter uma quantidade de endotia-pepsina igual a cerca de 2 vezes a quantidade produzida pela estirpe testemunha.

Os 7 clones anteriormente seleccionados de modo arbitrário foram analisados utilizando a técnica de Southern Blot. 0 seu DNA genómico e o da estirpe testemunha C. parasitica SEBR 103 não-transformada foram digeridos pela enzima Smal que proporciona unicamente dois locais de corte no cosmídeo p8H12 e nenhum no fragmento A. Após a hibridização com este último, observaram-se duas bandas de hibridização com os clones 29P1, 29P2 e 29P3 e apenas uma banda de hibridização, de dimensões idênticas às de uma das duas bandas atrás referidas, com a estirpe testemunha e os outros clones não conservados após o teste de selecção em meio liquido. Os três clones sobreprodutores, 29P1, 29P2 e 29P3 passaram por conseguinte a integrar uma cópia do cosmídeo p8H12 num sítio diferente do do seu genoma, uma vez que as bandas supranumerárias observadas têm dimensões diferentes. Finalmente, o Southern Blot atrás obtido foi hibridizado com o fragmento HindIII do plasmídeo pBT3 que confere resistência ao benomilo, o que permitiu verificar que os 7 clones resistentes ao benomilo receberam todos pelo menos uma cópia do plasmídeo pBT3, uma vez que apresentam várias bandas de hibridização suplementares relativamente à estirpe testemunha, a qual não apresenta senão uma banda que corresponde ao gene da β-tubulina endógena. (A β-tubulina é uma proteína estrutural presente nos fungos filamentosos, em particular em Neurosnora crassa e C. parasitica.)

Estes resultados demonstram que o fragmento B contém por conseguinte os sinais necessários à expressão (e secreção) de endotiapepsina. Contém, por conseguinte, um gene funcional de endotiapepsina, isto é, uma sequência que codifica um precursor de endotiapepsina enquadrada por um promotor e um terminador funcionais. Este promotor funcional inclui, por conseguinte, uma região activadora situada a montante da caixa TATA localizada no fragmento A (cf. Secção 1) . -59- A adição de uma copia suplementar deste fragmento ao genoma da estirpe C. parasitica SEBR 103 por transformação permite obter estirpes transformadas que sobreproduzem a enditia-pepsina com um factor de sobreprodução próximo de 2. 3) Seleccão de sobreprodutores entre os transformantes 30Pn (contendo o plasmídeo pEpI que transporta o fracrmento C: fcf. Seccão 6). 663 colónias resistentes ao benomilo foram obtidas no decurso da co-transformação pelo plasmídeo pEpl e o plasmídeo pBT3. 108 foram escolhidos ao acaso entre aqueles para o teste de selecção em meio gelatinoso contendo caseína, o qual permitiu que fossem seleccionados 32 clones. Deve notar-se que este teste permitiu reter uma taxa de sobreprodutores entre os transformantes 30Pn claramente mais elevada (32/108) do que aquela que fora obtida com os transformantes 29Pn (14/127). Isto indica que a frequência de co-transformação obtida com o plasmídeo pEpl com cerca de 13,4 kb é mais elevada do que aquela que se obtém com o cosmídeo p8H12 com cerca de 40,6 kb.

Entre esses 32 clones, 12 clones escolhidos ao acaso foram submetidos ao teste de selecção em emio líquido. Retive-ram-se deste modo 7 clones: os clones 30Ρ^, 30P2, 30P3' 30P4 30P(_, 30Ρ^, 30P^ que apresentavam, após cultura em frascos, actividades coagulantes de, respectivamente, 1,12; 1,06; 0,96; 1,12; 1,05; 0,88; e 0,90 g/1, enquanto a estirpe testemunha não-transformada apresentava uma actividade de 0,62 g/1 (o factor de sobreprodução está, por conseguinte, compreendido entre + 1,42 e + 1,81).

Os clones 30P1, 30P2 e 30P.J foram então testados num fermentador de 2 litros e proporcionaram uma actividade coagulante de, respectivamente, 3,05, 3,0 e 3,04 g/1, enquanto a estirpe testemunha não proporcionou uma actividade senão de 1,20 g/1 (o factor de sobreprodução é, por conseguinte, de + 2,54, + 2,50 e + 2,53, respectivamente). É provável (cf. 2 atrás) que, nas condições experimen-taos não limitativas do fermentador de 20 1, fosse possível atingir um factor de sobreprodução de cerca de 3.

Os 7 clones anteriormente escolhidos ao acaso foram analisados por intermédio da técnica de Southern Blot. Os seus DNAs genómicos e o da estirpe testemunha C. parasitica SEBR 103 não-transformada foram digeridos pela enzima Saci, escolhida por não proporcionar senão um local de corte no plasmídeo pEpl, localizado no fragmento C fora do fragmento A (cf. Figura 4) . Apôs a hibridização para cada um dos 7 clones com o fragmento A, observaram-se pelo menos duas bandas de hibridização ( 2 a 4 dependendo do clone), entre as quais a banda do gene que codifica a endotiapepsina presente igualmente para a estirpe testemunha, sendo o perfil diferente para cada ura dos clones. Para os clones 30Plf 30^2' 3OP5, pode observar-se entre elas uma banda de hibridização de dimensões idênticas às da do plasmídeo pEpl linearisado, o que indica a integração provável em tandem de pelo menos duas copias suplementares deste plasmídeo.

De facto, é bem conhecido dos especialistas da técnica que a integração en tandem de várias cópias de um plasmídeo após transformação é um acontecimento frequente entre os fungos filamentosos (fincham, J.R.S., Março 1989, Microbiological Reviews, 148-170) e que a digestão do DNA genómico no qual o plasmídeo foi desse modo integrado, por uma endonuclease que não proporciona senão um local de corte neste plasmídeo, liberta o referido plasmídeo. -61-

Estes resultados demonstram que o -fragmento C contém todos os sinais necessários para a expressão (e a secreção) de endotiapepsina. Ele contém por conseguinte um gene funcional de endotiapepsina, por conseguinte um promotor completo funcional. A região de activação do promotor está por conseguinte situada no fragmento c. )

A adição de pelo menos duas cópias suplementares deste fragmento ao genoma da estirpe C. parasitica SEBR 103 permite obter estirpes transformadas que sobreproduzem endotiapepsina com um factor próximo de 3. 4) Seleccão de sobreorodutores entre os transformantes 31Pn fcontendo o plasmídeo p472 crue transporta o fragmento A: cf. Seccão 6

840 colónias resistentes ao benomilo foram obtidas aquando da co-transformação pelo plasmídeo p472 e o plasmídeo pBT3. 108 clones foram escolhidos ao acaso para o teste de selecção sobre meio gelatinoso contendo caseína. Ao contrário do que acontecera com os resultados obtidos anteriormente com os co-transformantes 29Pn e 30Pn, não foi possível identificar qualquer sobreprodutor. Todavia, 5 clones 30?^ 30P2, 30p3' 30P4, 30Ρ^ escolhidos entre aqueles que proporcionam um halo de hidrólise de grandes dimensões embora não significativamente superiores às do halo da estirpe testemunha não-transformada, foram submetidos ao teste de selecção em meio líquido. Os clones precipitados apresentam, respectivamente, após cultura em frascos, uma actividade coagulante de 0,38; 0,66; 0,66; 0,56 e 0,65 g/1 enquanto a estirpe testemunha apresenta um actividade de 0,62 g/1 (a diferença verificada é, por conseguinte, de -38, +6, +6, +6, -22 e +4%). Não foi posta em evidência por meio deste teste em meio líquido qualquer sobreprodução significativa, o que -62- -62-

confirma o resultado negativo do teste de selecção em meio gelatinoso de caseína. A análise por meio da técnica de Southern Blot mostrou que os 5 clones integraram pelo menos uma cópia do plasmídeo pBT3 e que 3 clones em cinco são realmente co-transformados pelo plasmídeo pBT3 e pelo plasmídeo p472. A adição de uma cópia suplementar do fragmento A incluído no plasmídeo p472 não conduz por conseguinte a uma sobreprodução de endotiapepsina, o que indica que faltam neste fragmento sequências de DNA essenciais para a expressão da endotiapepsina. 0 fragmento A não inclui por conseguinte um gene funcional da endotiapepsina, o que confirma que falta ao fragmento A uma região de activação a montante do promotor necessária para tornar este funcional (cf. Secção 17). A região de activação a montante do promotor está por conseguinte situada no fragmento C entre a sua extremidade 5' (local BamHI) e a extremidade 5' (local HindIII) do fragmento A que ele contém.

Uma localização mais precisa desta região de activação poderá ser determinada mediante a obtenção de uma série de subfragmentos do fragmento C (preparados, por exemplo, por digestão por meio de endonucleases ou exonucleases) incluindo o fragmento A flanqueado na extremidade 5' por fragmentos de dimensões diferentes da parte do fragmento C compreendida entre a extremidade 5' do fragmento A e um nucleótido situado entre a extremidade 5' do fragmento A e a extremidade 5' do fragmento C, transformação de Crvphonectria parasitica SEBR 103 por estes subfragmentos e selecção do elementos transformados que exprimem a protease recombinante. Constituem exemplos de tais subfragmentos do fragmento C os fragmentos D e F, cuja preparação é descrita nas secções 4 e 5.

Seccão 8: Método de purificação (eliminação da marcador de selecção) de um transformante sobreprodutor de endotiapepsina e amplificação do gene que codifica a endotiapepsina por meio de transformações sucessivas. 1) Generalidades:

Sabe-se (cf. nomeadamente Fincham J.R.S., Março de 1989, Microbiological Reviews, 148-170) que as células fúngicas incluem diversos núcleos contendo, de um modo geral, o mesmo material genético. Os protoplastos obtidos após digestão enzimã-tica da sua parede podem ser anucleados (incapazes de se regenerar) , uninucleados ou polinucleados. Após a transformação destes últimos, é possível, por conseguinte, obter células transformadas de tipo heterocarionte, contendo núcleos transformados, eventualmente de tipos diferentes (de acordo com o modo de integração e a natureza do material integrado, que podem variar) e núcleos não transformados. No caso de C. parasitica os conidiosporos são uninucleados (Puhalla J.E. et al., Phytopathology, 1971, 61, 169-173).

As experiências a seguir descritas utilizam essas características da células fúngicas para construir estirpes contendo unicamente DNA recombinante que seja de interesse e não o marcador de selecção. 2) Purificação do transformante 29P3 (eliminação do marcador de seleccão^ tendo em vista a busca de sobreprodutores sensíveis ao benomilo;

Uma preparaçao de conidiosporos do transformante inicial sobreprodutor de endotiapepsina 29P3 (cf. Secção 11) e -64- -64-

Secção 7 2)), suficientemente diluída para se obterem colónias isoladas, serviu para fazer sementeiras em caixas de Petri contendo meio B (cf. Quadro 2 atras) tornado gelatinoso pela adição de 20 g/1 de agar. Após incubação durante 5 dias a 30°C, implantes micelianos de 50 colónias foram repicados em paralelo sobre o mesmo meio B gelatinoso, tendo-se adicionado a este último 1 μg/ml de Benlate (contendo 50% de benomilo). Após incubação durante 5 dias a 30ÔC, 6 clones apresentam um crescimento normal sobre o meio B gelatinoso e um crescimento nulo sobre o meio B gelatinoso a que se adicionou Benlate. Estes 6 clones sensíveis ao benomilo, provenientes cada qual da germinação de um esporo, são do tipo homocarionte, e por conseguinte puros.

Os 6 clones e o transformante inicial 29P3 foram submetidos ao teste de selecção de sobreprodução de endotiapep-sina sobre meio gelatinoso contendo caseína (cf. Secção 7 1) a)), o que permitiu seleccionar um clone sensível ao benomilo designa- o do 29P3 ben que apresentava uma sobreprodução que nao era significativamente diferente da do transformante inicial. Submeteu-se o clone 29P3 ben , o clone 29P3 e a estirpe testemunha C. parasitica SEBR 103, após esporulação, ao teste de selecção em meio líquido. Os clones 29P3 e 29P3 bens produzem uma actividade coagulante idêntica (levando em linha de conta a margem de erro experimental) , mas claramente superior à da estirpe testemunha. Além disso, uma análise por meio da técnica de Southern Blot, efectuada sobre estes dois clones e a estirpe testemunha, após digestão do seu DNA genómico pela endonuclease Smal, apresenta para cada um dos dois clones o mesmo perfil de hibridação com o fragmento A como sonda, o qual apresenta uma banda supranumerária relativamente à testemunha (cf. Secção 7 2)), o que indica que nos dois clones a integração do gene funcional da endotiapepsina é idêntica, e um perfil de hibridação -65-

diferente com o fragmento HindII-HindIII do. plasmídeo pBT3 que confere resistência ao benomilo (cf. Secção 6), apresentando o transformante inicial 29P3 diversas bandas de hibridação com o referido fragmento e o clone 29P3 ben bem como a estirpe apresentando testemunha apresentando uma única banda de hibridação de dimensões idênticas (correspondente ao gene endógeno da fi-tubuli-na) .

Estes resultados demonstram que o método de purificação permitiu obter um transformante puro (no que diz respeito ao seu genótipo), desprovido de marcador de selecção (gene que confere resistência ao benomilo) e que o carácter de sobreprodutor de endotiapepsina está integrado de modo estável no clone 29P3 ben uma vez que foi obtido a partir da germinação de um conidiosporo uninucleado e todas as células micelianas possuem núcleos que integraram o cosmídeo p8H12 no seu DNA. 3) Amolificacão:

Protoplastos preparados a partir do clone 29P3 benS foram transformados pelo plasmídeo pBT3 segundo o protocolo descrito na Secção 6. Obtiveram-se 400 clones resistentes ao benomilo para 1 Mg de DNA plasmídico.

É, por conseguinte, possível obter, após co-transforma-ção por um cosmídeo contendo o gene funcional da endotiapepsina e um plasmídeo contendo um marcador de selecção, um transformante sobreprodutor de endotiapepsina desprovido de marcador de selecção, capaz de ser novamente transformado. É portanto possível, mediante a realização de diversos ciclos sucessivos incluindo uma etapa de co-transformação recorrendo aos dois vectores atrás indicados, seguida por uma etapa de purificação que permita

eliminar o marcador de selecção, amplificar de modo selectivo em C.parasitica o gene que codifica o precursor de endotiapepsina.

Secção 9: Identificação de estirpes deficientes na produção de endotiapepsina após transformação de C. parasitica SEBR 103

Uma análise exaustiva dos clones benomilo-resistentes obtidos após a co-transformação (cf. Secção 6) da estirpe C. parasitica SEBR 103 com o cosmídeo p8H12 e o plasmídeo pBT3 permitiu obter um clone que não produzia um halo de hidrólise sobre o meio E gelatinoso contendo caseína. Este clone foi purificado de acordo com o método descrito na Secção 8, obtendo--se numerosos clones benomilo-sensíveis que não produziam halo de hidrólise. Um clone, designado 29P(end-), foi escolhido ao acaso entre estes clones benomilo-sensíveis. Após cultura em frasco, o clone 29P(end-) apresentava uma actividade coagulante inferior a 0,01 g/1 enquanto que a estirpe testemunha Crvphonectria parasitica SEBR 103 não transformada apresentava uma actividade coagulante de 0,62 g/1 (a redução verificada na produção é, por conseguinte, superior a 98%). Observou-se, além disso, que as características morfológicas e fisiológicas deste clone se tinham modificado relativamente âs da estirpe de C. parasitica SEBR 103.

A análise por meio da técnica de Southern Blot do DNA genómico do clone 29P(end-) e da estirpe testemunha SEBR 103, após hibridação com o fragmento A, por um lado, e o fragmento contendo o gene de resistência ao benomilo do plasmídeo pBT3, por outro, não revelou diferenças.

Estes resultados revelam que o clone 29P(end-) selec-cionado e purificado foi tornado deficiente para a produção de endotiapepsina após co-transformação da estirpe C.parasitica com o cosmídeo ρ8Η12 e ο plasmídeo ρΒΤ3. É óbvio para os especialistas da técnica que se podem obter transformantes deficientes na produção de endotiapepsina por co-transformação de C. parasitica SEBR 103 com um marcador de selecção, tal como o plasmídeo pBT3, e um DNA que inclua o gene da pré-pró-endotiapepsina tornado não-funcional, por exemplo mediante eliminação de uma parte da sequência codificadora, e depois por selecção dos transformantes benomilo-resistentes que não produzem halo de hidrólise de caseína. Um tal DNA transportando um gene não-funcional pode ser facilmente obtido por meio de linearização do DNA do plasmídeo pEpl, por exemplo mediante uma dupla digestão com Seal e Sfil, seguida de purificação do fragmento maior por meio de electrofo-rese sobre gel de agarose a 0,8% e finalmente tratamento das extremidades desse fragmento com polimerase de Klenow na presença dos quatro trifosfastos de desoxiribonucleótidos dNTP para permitir uma religação do vector e obter desse modo um plasmídeo transportando um gene não-funcional de endotiapepsina

Seccão 10: Construção da estirpe SEBR 3700, deficiente na produção de endotiapepsina e desprovida de marcador de selecção dominante 1) Construção de um fragmento, denominado fragmento EM. no qual a secruência codificadora da endotiapepsina é interrompida oor dois codões de interrupção da tradução.

Introduziu-se no início da sequência de codificação para o precursor da endotiapepsina mutações dando origem a uma interrupção da tradução, o que faz com que a endotiapepsina não seja produzida a partir do RNA mensageiro portador dessas mutações. 0 fragmento A da endotiapepsina inclui um fragmento HindIII - Bstell com cerca de 360 pb (cf. Fig. 2), estando o -68- local BstelI localizado a 25 pb a jusante do início da sequência de codificação. A sequência natural em questão é a seguinte:

BstEII

5'- G ATG TCT TCC CCT CTC AAG AAC GCC TTG GTG ACC

I O tripleto ATG sublinhado representa o codão que abre a fase de codificação. A sequência mutada desejada é a seguinte:

BstEII

5'- G ATG TCT TCC CCT CTC TAA TGA ACG CCT TGG TGA CC

Esta sequência difere da sequência natural pela introdução de 2T, um entre os 52 e 62 codões, o outro no interior do 62 codão (entre as 2a e 3a bases). Estas introduções resultam na criação de 2 codões stop que interrompem a fase de leitura do gene da endotiapepsina.

Um fragmento HindIII - BstEII que não difere da sequência de tipo selvagem a não ser pelas duas modificações referidas foi obtido através da técnica de amplificação por meio de PCR descrita na Secção 15, utilizando-se como um dos segmentos iniciais um oligonucleótido contendo as mutações desejadas:

0 oligonucleótido 1 tem a sequência seguinte: HindIII 5'

GCT AAA GCT TAT CCG CCG CCG GCG GGG GAA TTC

Esta sequência encontra-se na extremidade HindIII do fragmento HindIII - BstEII. 0 local HindIII é indicado por uma barra vertical. 0 oligonucleótido 2 tem como sequência:

BamHI BstEII

5' - CAA TGG ATC CGG TCA CCA AGG CGT TCA TTA GAG AGG GGA AGA CAT C

Este oligonucleótido é complementar da sequência mutada desejada, tendo-se juntado um local BamHI que flanqueia o local natural BstEII. Os nucleótidos sublinhados correspondem às adições criando codões stop sobre a cadeia complementar. 0 DNA que serve de matriz é o DNA do plasmídeo p472 descrito na Secção 1. A mistura de amplificação inclui: 300 ng (ou seja 3 μΐ) do DNA de p472 100 ng (ou seja 1 μΐ) da cada um dos oligonucleótidos 5 μΐ de solução tampão bipv2 concentrada 10 vezes 40 μΐ de água 2 unidades (ou seja 0,5 μΐ) de enzima: polimerase Taq. A solução tampão bipv2 10 vezes concentrada tem a composição seguinte: tris-HCl 670 mM pH 8,8; sulfato de amónio 165 mM; 2 mercaptoetanol 10 mM; gelatina 2 mg/ml; Triton -X100 1,5%; EDTA 67 μΜ; MgCl2 20 mM; dATP 2 mM; dCTP 2 mM; dGTP 2 mM; DTTP 2 mM.

Três testes de purificação são realizados em paralelo. Efectuam-se 15 ciclos de amplificação, decompondo-se cada ciclo em 1 minuto de desnaturação a 92°c, 1 minuto de hibridação a 55°C, 1 minuto de elongação a 72°C. Após a amplificação por intermédio de PCR, os 3 tubos são reunidos num tubo Eppendorf e precipitados com 2 volumes de etanol absoluto contendo acetato de amónio 0,3 M (durante 20 minutos a 0°C) e depois centrifugados a 10 000 g (durante 20 minutos). 0 resíduo é lavado com etanol a 70%, e depois secado sob vácuo durante 10 minutos. O DNA é retomado em 60 μΐ de solução de TE (Tris HC1 10 mM pH 7,5 EDTA 1 mM) e analisado sobre gel de agarose. A banda que corresponde ao fragmento de 360 bp ê eluída do gel, purificada e clonada na forma replicativa de um fago M13 (M13mpl9) entre os locais HindIII e BamHI após a acção destas enzimas. A sequência do fragmento assim clonado foi determinada a partir do fragmento de cadeia simples, e verificou-se que a sequência correspondia ao fragmento mutado nos locais esperados. 0 fragmento A com cerca de 2,1 kb descrito na Secção 1 está delimitado por 2 locais HindIII e apresenta um local único BstEII localizado a 360 pares de bases de uma das extremidades. 0 local único BstEII delimita, por conseguinte, 2 fragmentos do fragmento A, o mais curto dos quais corresponde à sequência submetida a amplificação por meio de PCR. Ao preparar o grande segmento BstEII - HindIII do fragmento A e o pequeno segmento HindIII - BstEII mutado, e ao ligar o conjunto em pBR322 cortado por HindIII, reconstitui-se um fragmento A que inclui as 2 mutações, designado fragmento A - M. O fragmento A - M apresenta um local PstI que é único para esse fragmento. Este local PstI delimita, por conseguinte, 2 segmentos do fragmento A - M, entre os quais um segmento HindIII - PstI com cerca de 1,67 kb que contém a dupla mutação. 0 plasmídeo ρΕρ3 descrito na secção 5 deriva de um plasmídeo pUC no qual foi clonado um fragmento Sphl com cerca de 3,7 kb designado fragmento E. Este fragmento de 3,7 kb inclui, como subfrag-mento, o fragmento A. Este fragmento A foi substituído pelo fragmento A - M do modo seguinte: O plasmídeo pEp3b foi digerido simultaneamente pelas enzimas Seal e PstI, por um lado, e pelas enzimas Seal e HindIII, por outro. A partir da primeira digestão, isolou-se o fragmento Seal - PstI com cerca de 2250 kb. A partir da segunda digestão, isolou-se o fragmento Seal - HindIII com cerca de 2,42 kb. A ligação destes dois fragmentos com o segmento HindIII - PstI de 1,67 kb que inclui a dupla mutação permite obter um novo plasmídeo designado pEpM3b que não difere do pEP3b a não ser pela dupla mutação. 0 fragmento Sphl que inclui a dupla mutação, designado fragmento E - M, foi preparado a partir de uma digestão Sphl de pEpM3b seguida de separação dos 2 fragmentos de DNA sobre gel de agarose a 0,8% e extraeção do fragmento de 3,7 kb mut.ado em 20 μΐ de solução TE. 2) Co-transformação de Crvononectria parasitica pelo fraermento E - M e pelo fragmento Sfil portador de um gene de resistência ao benomilo enquadrado por sequências teloméricas. 0 fragmento E - M purificado foi utilizado em co-trans-formação com o DNA do plasmídeo p578.12 digerido por Sfil. O plasmídeo p578.12 é um derivado do plasmídeo pBT3 atrás descrito. O DNA de pBT3 foi linearizado por meio da endonuclease Xbal, as extremidades foram tornadas francas por meio da DNA polimerase de Klenow. Integrou-se um fragmento Xhal, reparado por meio da polimerase e que inclui as sequências teloméricas de Tetrahvmena provenientes do plasmídeo pPAT ura descrito por Perrot, Barreau e Bégueret, Mol. Cel. Biol. (1987) 7 pp. 1725-1730, modificado de modo a que os locais BamHl fossem substituídos por Sfil. A digestão de p578.12 por meio de Sfil liberta um fragmento linear que transporta um gene de resistência ao benomilo e que termina em cada uma das suas extremidades por meio de uma sequência telomérica. Perrot et al. (referência atrás indicada) demonstraram que um tal fragmento podia ser mantido no estado de plasmídeo linear (não integrado no cromossoma) no fungo filamentoso Podospora anserina. Por outro lado, Powell e Kistler (J. Bacteriology, 1990, vol. 172, pp. 3163-3171) demonstraram que sequências repetidas de tipo telomérico permitiam a replicação autónoma de plasmídeos lineares em C. parasitic-a. Tirou-se partido desta propriedade para construir estirpes por meio de co-transformação com o fragmento linear. A ausência de integração do marcador de resistência ao benomilo no cromossoma deve permitir recuperar as estirpes benomilo-sensíveis com uma frequência muito grande a partir de conídeos obtidos após esporu-lação dos transformantes.

Realizaram-se duas experiências de co-transformação da estirpe Crvohonectria parasitica SEBR 103 com, para cada caso, cerca de 0,5 jug (3 μΐ) do fragmento E - Me0,5 μ g (4 μΐ) do fragmento Sfil do plasmídeo p57812. 397 colónias resistentes ao benomilo foram obtidas. Repicaram-se 395 dessas colónias sobre o meio E (cf. Secção 7) a fim de testar a presença de halo, tal como se descreveu na Secção 7.

Identificou-se uma colónia que não produzia halo de coagulação de caseína; essa colónia, designada colónia AJ7.272 foi transferida sobre meio de esporulação (conidiação), segundo o -73-

-73- I

método descrito na Secção 1. Os conidioporos foram recolhidos em massa e diluídos no meio de germinação. Foram testadas 152 colónias resultantes da conidiação sobre meio de caseína: nenhuma apresentava halo de coagulação. Testou-se igualmente a resistência ao benomilo destas colónias: 58 das 152 tinham perdido esta característica de transformação. Retomaram-se 5 das 58 colónias, que se designaram colónia AJ7272/A, colónia AJ7272/B, colónia AJ7272/J, colónia AJ7272/L e colónia AJ7272/M. Extraiu-se o DNA genómico de cada colónia e compararam-se os perfis de hibridação através da técnica de Southern Blot e o da estirpe SEBR 103 utilizando diversas enzimas de restrição. Não foi detectada qualquer diferença entre a estirpe SEBR 103 e os 5 mutantes, sondados com o fragmento A (gene da endotiapepsina), com o pUC18 (sequências bacterianas) ou com o gene da B-tubulina de Neurospora. Com o fragmento A, iluminam-se as sequências do gene da endotiapepsina; sendo o perfil de hibridação o mesmo em todas as estirpes, pode-se concluir pela não existência de recombinação "ectópica" do fragmento mutado (isto é, de recombi-nação não-homóloga) nos mutantes. Com o pUC18, não se obtém qualquer hibridação qualquer que seja a estirpe, o que indica não existir qualquer sequência de origem bacteriana integrada nos mutantes. Com o gene da B-tubulina ilumuna-se uma sequência em todas as estirpes, tratando-se muito provavelmente do gene "endógeno” da B-tubulina de C. parasitica.

Para garantir que as estirpes derivadas da colónia AJ7272 se apresentavam realmente mutadas no gene estrutural da endotiapepsina, verificou-se que era possível complementar a sua deficiência por meio de transformação. Cada uma das colónias anteriormente referidas foi utilizada como receptora para uma co-transformação implicando os DNA do plasmídeo pBT3 e do plasmí-deo pEP2. -74-

o Quadro que se segue revela que a maioria dos trans-formantes resistentes ao benomilo obtidos deste modo produzem novamente endotiapepsina:

Estirpe Colónias resistentes ao benomilo (teste sobre caseína) AJ7.272/A 2 2 AJ7.272/B 8 7 AJ7.272/J 13 11 AJ7.272/L 17 16 AJ7.272/M 10 10

Controlo: a transformação dos segregantes com o plasmídeo pBT3 por si só não proporciona qualquer transformante produtor de protease.

J

Colónias produtoras de protease A análise dos materiais sobrenadantes de cultura por meio de electroforese sobre gel de acrilamida confirmou que as estirpes mutadas não produziam uma quantidade detectável de endotiapepsina antes da transformação.

Construiu-se, por conseguinte, uma estirpe AJ7.272 a qual, após esporulação, deu origem a 5 colónias que não diferiam da estirpe SEBR 103 a não ser por uma ou mais mutações que afectavam o gene estrutural da endotiapepsina. Foi conservada uma dessas colónias, que foi designada SEBR 3700. Essa colónia é deficiente na produção de endotiapepsina e está desprovida de marcador de selecção dominante.

Seccão 11: Verificação da funcionalidade dos fragmentos D e F por complementação da estirpe SEBR 3700 deficiente na produção de endotiapepsina

Demonstrou-se na Secção 7 parágrafo 3 que o fragmento C contido no plasmídeo pEpl possui todos os sinais necessários á expressão da endotiapepsina. Verificou-se recorrendo à estirpe SEBR 3700 deficiente para a produção da endotiapepsina obtida na Secção 10, a funcionalidade dos fragmentos De F contidos nos plasmídeos pEp2 e pEp4. 1) Transformação dos protoplastos da estirpe SEBR 3700 pelos plasmídeos pEp2 e pBT3 O plasmídeo pEp2 possui simultaneamente o gene de resistência ao benomilo e o fragmento D e pode por conseguinte servir para transformar directamente. O plasmídeo pBT3 que não possui o gene que codifica a endotiapepsina é utilizado como testemunha negativa. A estirpe SEBR 3700 foi transformada de acordo com um protocolo idêntico ao que foi descrito para a estirpe SEBR 103 (cf. Secção 6) com cerca de 1 μg do plasmídeo pEp2 e 1 jLzg do plasmídeo pBT3. 2) Co-transformacão dos protoplastos da estirpe SEBR 3700 pelos plasmídeos pEp! e pBT3 e pelos plasmídeos pEp4 e pBT3

Os plasmídeos pEpl e pEp4 não possuem marcador de selecção dominante. O plasmídeo pEpl é utilizado como testemunho positivo de complementação da estirpe SEBR 3700. A estirpe SEBR 3700 foi co-transformada com as misturas de plasmídeos que se seguem: 4 βg de pEpl e 1 Mg de pBT3, 4 μg de pEp4 e 1 Mg de pBT3. 3) Deteccão dos transformantes que produzem endotiapepsina

Implantes micelianos de vários transformantes seleccio-nados para cada uma das transformações e co-transformações atrás descritas foram repicados sobre o meio E, meio gelatinoso contendo caseína. Após incubação, as colónias apresentando um halo de precipitação característico da secreção de endotiapepsina foram identificadas. Os resultados obtidos foram os seguintes: - transformantes obtidos com o plasmideo pBT3: nunhum clone produziu um halo de precipitação - transformantes obtidos seja com os plasmídeos pEpl e pBT3, seja com os plasmídeos pEp4 e pTB3: uma percentagem de cerca de 30% dos clones produziu halos de precipitação - transformantes obtidos com o plasmideo pEp2: 92% dos clones testados produziram halos de precipitação.

Estes resultados revelam que os plasmídeos pEpl, pEp2 e pEp4 complementam a estirpe SEBR 3700 deficiente na produção de endotiapepsina e portanto que os fragmentos C, D e F contidos nesses plasmídeos possuem todos um promotor funcional de endotiapepsina. Todavia, não se pode concluir deste ensaio qualitativo a força relativa do promotor presente em cada um dos fragmentos.

Pode-se concluir destes resultados que o segmento Sphl - HindIII do fragmento F, cuja sequência foi determinada na

Secção 5, possui sinais implicados na activação do promotor do gene que codifica a pré-pró-endotiapepsina.

Secção 12: Selecção de transformantes sobreprodutores de endotiapepsina desprovidos de marcador de selecção dominante 1) Protocolo de seleccão

As diferentes etapas do protocolo são apresentadas no Quadro que se segue. 0 princípio do mesmo é o seguinte:

Os protoplastos de C. parasitica SEBR 103 são co-trans-formados de acordo com um protocolo idêntico ao que foi descrito na Secção 6, por meio de uma mistura composta por 0,5 a 2 jiig de fragmento C, D ou F, previamente purificada sobre gel de agarose após digestão dos plasmídeos pEpl ou pEp2 e extraída de acordo com as instruções do "kit gene-clean" da Biorad, e 0,5 /íg de plasmídeo de selecção pBT3 ou pBT6, seja sob forma circular, seja sob forma linear.

Após regeneração dos protoplastos sob meio C, os transformantes obtidos que são designados transformantes iniciais são repicados simultaneamente sobre o meio B tornado gelatinoso mediante adição de 20 g/1 de agar (meio não-selectivo) e sobre o meio E, meio gelatinoso contendo caseína a que se adicionou eventualmente 5 jug/ml de pepstatina. Os clones que apresentam uma relação entre o diâmetro do halo de precipitação e o diâmetro da colónia significativamente mais elevada do que o da estirpe testemunha não-transformada são designados transformantes iniciais sobreprodutores e postos s esporular. Uma preparação de conidiosporos destas estirpes é obtida de acordo com o método utilizado na Secção 1.1 e uma diluição de cada suspensão de -78-

conidiosporos é espalhada sobre meio G de forma a serem obtidas colónias isoladas. Implantes micelianos provenientes de uma cinquentena de colónias são repicadas para cada transformante inicial sobreprodutor simultaneamente sobre meio B tornado gelatinoso pela adição de 20 g/1 de agar a que se adicionou eventualmente 0,5 mg/1 de benlato (teste de sensibilidade ao benomilo) e sobre meio E (teste sobre meio de caseína) . Neste estádio, os clones que são sensíveis ao benomilo e sobreproduto-res de endotiapepsina são designados segregantes de benomilo(s) sobreprodutores e são postos a esporular. Uma preparação de conidiosporos é de seguida obtida para se verificar a sobreprodu-ção de endotiapepsina após cultura em frasco, para se verificar a integração de uma ou mais cópias do fragmento C, D ou F por hibridação de DNA genómico com uma sonda constituída a partir de fragmento A, e para garantir a ausência de DNA heterólogo utilizando uma sonda constutuída total ou parcialmente pelo plasmídeo de selecção. A estirpe que reage positivamente a estes três critérios é designada estirpe própria sobreprodutora. Um novo ciclo de co-transformação-selecção pode então ser efectuado a partir desta estirpe própria sobreprodutora a fim de amplificar novamente o fragmento C, D ou F.

A vantagem deste processo, para além daquela que advém da amplificação do fragmento relevante, consiste na construção de transformantes desprovidos de marcador de selecção dominante mais aceitáveis de um ponto de vista de regulação. >

Protocolo de selecção de transformantes sobreprodutores desprovidos de marcador de selecção dominante

Duração (semanas) 1 > 2 5 a 6 5 a 6 3 a 4 16 a 19

SEBR 103 PROTOPLASTOS co-transformação: plasmídeo de selecção + fragmento C, D ou F TRANSFORMANTES repicagem sobre meio não-selectivo; teste sobre meio de caseína TRANSFORMANTES INICIAIS SOBREPRODUTORES etapa de esporulação; teste de sensibilidade ao benomilo; teste sobre meio de caseína SEGREGANTES DE BENOMILO(S) SOBREPRODUTORES etapa de esporulação; teste de produção en erlens; análise da integração por Southern; teste em fermentador de 2 litros ESTIRPE PRÓPRIA SOBREPRODUTORA etapa de esporulação; colocação na colecção SEBR PREPARAÇÃO DE LOTE DE SEMENTES PRIMÁRIO teste em fermentador de 20 litros; análise do produto; estudo de estabilidade do transformante; outros estudos ... ESCOLHA DE UMA ESTIRPE DE PRODUÇÃO 2) Selecção de transformantes sobreprodutores desprovidos de marcador de seleccão dominante amós co-transformacão de SEBR 103 pelo fracrmento C, D ou F e o plasmídeo oBT3 0 Quadro a seguir apresentado resume os resultados obtidos:

1 |Co-transformação 1 |fragmento F I —!- |fragmento C 1 1-1 |fragmento D| 1 I |Quantidade 1 |0,5 μg I 1 | 2 /xg I 1 1 |0,5 Mg | I 1 |Plasmideo de |selecção 1 1 |circular I 1 1 |circular I 1 1 1 1 | linear | |Transformantes |iniciais 1 1 1 4 I 1 1 | 137 I 1 1 1 1 1 106 1 I 1 |Transformantes |iniciais sobre-|produtores 1 1 1 1 1 1 1 1 1 | 26 I 1 1 1 1 1 1 1 33 I I 1 |Segregantes de j benomilo(s) 1 1 | i I 1 1 | 41 I 1 1 1 1 I 82 I I 1 |Segregantes de |benomilo(s) |sobreprodutores 1 1 1 1 ° I 1 1 1 1 2 I 1 1 1 1 1 1 1 7 1 I 1 |Estirpes próprias |sobreprodutoras 1_ 1 1 1 0 _J_ 1 1 1 1 _1_ 1 1 1 1 1 4 1 _1_I

Nenhuma estirpe própria sobreprodutora pode ser obtida com o fragmento C, o que não é de modo algum surpreendente tendo em conta o número pouco elevado de transformantes iniciais. 1 selecção efectuada sobre a descendência de 12 transfor 2 mantes iniciais sobreprodutores ** selecção efectuada sobre a descendência de 21 transfor-mantes iniciais sobreprodutores A estirpe própria sobreprodutora obtida com o fragmento D foi testada num fermentador de 2 litros e produziu uma activi-dade coagulante de 1,9 g/1, enquanto que a estirpe testemunha não produzia senão uma actividade coagulante de 1,2 g/1 (o factor de sobreprodução é, por conseguinte, de + 1,58). A analise do DNA genómico da estirpe SEBR 3574 por meio da técnica de Southern Blot revelou que ela tinha integrado pelo menos 3 cópias suplementares do fragmento D, 2 das quais em tandem.

Entre as quatro estirpes próprias sobreprodutoras obtidas com o fragmento F, a estirpe SEBR 3912 foi testada num fermentador de 2 litros e produziu uma actividade coagulante de 2,4 g/1 (o factor de sobreprodução relativamente à estirpe testemunha é, por conseguinte, de + 2) . A análise do DNA genõmi-co por meio da técnica de Southern Blot revelou que ela tinha integrado pelo menos 5 cópias suplementares do fragmento F em tandem segundo uma orientação cabeça-cauda.

Nas estirpes sobreprodutoras obtidas, não se detectou qualquer integração do plasmídeo de selecção. Estas estirpes podem, por conseguinte, ser submetidas a um novo ciclo de co--transformação-selecção. Por outro lado, se se comparar o factor de sobreprodução observado nestas estirpes com o número suposto de cópias integradas, verifica-se que a relação obtida está próxima de 0,2, enquanto se situa em cerca de 1 para os transfor-mantes 30Pn que integraram duas cópias suplementares do plasmídeo pEpl contendo o fragmento C. Pode-se por conseguinte pensar que a montante do local BglII situado na extremidade 5' do fragmento D até ao local BamHI existem sequências de regulação importantes para uma forte expressão do gene da endotiapepsina.

Secção 13: Construção do plasmídeo pEMR713 vector de expressão da endotiapepsina em C. oarasitica que inclui a região promotora do gene que codifica a gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase de Aspercrillus nidulans 0 plasmídeo pAN52 (Punt et al., 1987, Gene, 56, 117- -124) inclui para além do gene que codifica a resistência â ampicilina e a origem de replicação de pUC18, a região promotora do gene que codifica a gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (gpd) de Aspercrillus nidulans [Punt et al., Gene, 93, (1990) 101-109] e a região de terminação do gene trpC de Asnercrillus nidulans. Mullaney et al., Mol. Gen. Genet. (1985) 189: 37-45. A região promotora e a região de terminação estão separadas por uma sequência de DNA que inclui sequências de nucleótidos reconhecidas pelas enzimas de restrição Ncol r MluI, as quais são únicas no plasmídeo pAN52. A sequência do local Ncol: CCATGG é particularmente interessante na medida em que inclui o codão ATG que codifica uma metionina que é o codão de iniciação da maior parte das proteínas. 0 objectivo desta experiência é exprimir o gene que codifica a endotiapepsina utilizando os sinais de expressão atrás descritos. A integração do gene que codifica a endotiapepsina faz-se segundo a técnica de PCR (Polymerase Chain Reaction) que é descrita pormenorizadamente na Secção 15 a seguir.

1) Descricão dos segmentos iniciais utilizados para a técnica de PCR A amplificação génica por meio de PCR permite obter a modificação da sequência a amplificar. Esta propriedade é usada para introduzir na extremidade 5' da sequência pré-pró- do gene que codifica a endotiapepsina,um local Ncol e na extremidade 3' que não codifica do gene que codifica a endotiapepsina, um local Mlul. As sequências dos dois segmentos iniciais são por conseguinte as que se seguem: - Segmento inicial 5' que inclui o local Ncol 5 ' -ACG-TCC-ATG-GCT-TCC-CCT-CTC-AAG-AAC-GCC-3'

Este segmento inicial é principalmente constituído por:

a) a sequência reconhecida pela enzima de restrição Ncol: CCATGG b) a sequência modificada da extremidade 5' do péptido sinal da endotiapepsina. A modificação consiste na modificação do primeiro codão, após a metionina; com efeito, o codão TCT que codifica uma serina é substituído pelo codão GCT que codifica uma alanina. Esta modificação não tem efeito sobre a eficácia do péptido sinal. - Segmento inicial 3' que inclui o local MluI 5 ' -ACG-TAC-GCG-TCC-ACG-CCT-ACC-CAA-CAA-GAC-3 '

Este segmento inicial é principalmente constituído por: a) a sequência reconhecida pela enzima de restrição

MluI: ACGCGT b) a sequência da extremidade 3' que não codifica da endotiapepsina, que é a sequência complementar da sequência situada entre os nucleótidos 1921 e 1940 da Figura 2. 2) Obtenção do fragmento amplificado contendo o gene que codifica a endotiapepsina modificada

Utiliza-se como matriz o plasmídeo p472, cujo modo de obtenção é descrito na Secção 1.

a) A reacção PCR 100 ng de plasmídeo p472, previamente purificados sobre uma coluna PIO são misturados com 100 ng do segmento inicial 5', 100 ng do segmento inicial 3', MgCl2 2 mM, dNTP 0,2 mM, 5 μΐ de mistura de reacção concentrada 10 vezes (quantidade final: Tris HC1 67 mM pH 8,8, (NH4)2S04 16,6 mM, β-mercaptoetanol 1 mM, EDTA 6,7 mM, Triton xlOO a 0,15%, 200 g/ml de gelatina). O volume da mistura é de seguida aumentado para 50 μΐ por adição de água. -85- A mistura de reacção assim obtida é incubada durante 4 minutos a 94°C e depois atemperatura é colocada no valor 50°C e assim mantida durante 4 minutos.

Juntam-se então 0,5 μΐ, ou seja 2,5 unidades, de polimerase Taq (Boehringer Mannheim ref. 1146-165). Cobre-se então a mistura de reacção com parafina a fim de evitar a evaporação da solução aquosa. A amplificação tem lugar ao longo de 18 ciclos de reacção, cujas etapas são as seguintes: 2 minutos a 92°C ----- desnaturação 2 minutos a 50°C ----- hibridação 2 minutos a 72°C ----- polimerização.

Após os 18 ciclos, a reacção enzimática e interrompida por meio da adição de uma solução de 20 mM de EDTA.

O fragmento de DNA assim amplificado, que apresenta a dimensão esperada de cerca de 1620 pb, é em seguida isolado e purificado sobre gel de agarose a 1%, dialisado sobre uma coluna PIO (Pharmacia) e depois hidrolisado simultaneamente pelas enzimas Ncol e Mlul. Após a hidrólise, o fragmento é purificado sobre uma coluna PIO. b) Obtenção do plasmídeo pEMR713

O DNA do plasmídeo pAN52 ê hidrolisado pelas enzimas de restrição Ncol e Mlul. O fragmento que inclui a região promotora do gene gpd, a origem de replicação de E. coli. o gene que codifica a resistência â ampicilina e o terminador trpC é purificado. 100 ng deste fragmento são ligados, na presença de DNA ligase, a 100 ng do fragmento amplificado que inclui o gene da endotiapepsina (cf. parágrafo 2 atrás). A mistura de ligação é em seguida utilizada para transformar a estirpe RRI. o plasmídeo resultante é o pEMR713 no qual o gene que codifica a endotiapepsina modificada ê colocado sob o controlo da região promotora do gpd e da região terminadora de trpC.

Preparação de protoplastos

Cf. Secção 6.

Co-transformacão dos protoplastos da estirpe SEBR 3700 pelo plasmídeo PEMR713 e pelo plasmídeo pBT3

Cf. Secção 6.

Cerca de 2000 transformantes obtidos são capazes de se desenvolver sobre o meio B gelatinoso contendo 0,5 mg/1 de benlato, o que indica que todas as colónias possuem pelo menos um plasmídeo pBT3.

Seleccão de estirpes transformadas, produtoras de endotiapepsina A) Método geral a) Selecção sobre meio gelatinoso contendo caseína.

Implantes micelianos das 2000 colónias resistentes ao benomilo são repicados sobre um meio gelatinoso contendo caseína, denominado meio E, cuja composição é indicada no Quadro B a seguir. Sobre este meio, as colónias de Crvphonectria parasitica que produzem a protease dão origem a um halo de precipitação cuja superfície é proporcional à quantidade de endotiapepsina secreta da.

As estirpes produtoras são conservadas com base na presença do halo de precipitação. Uma preparação de conidiospo-ros destas estirpes produtoras é obtida de acordo com o método utilizado na Secção 1 1). Além disso, verificou-se por adição ao meio E de 5 jtig/ml de pepstatina, substância inibidora específica das aspartil-proteases, que o crescimento dos halos observado na estirpes sobreprodutoras era reduzido. Este resultado indica que se trata efectivamente de uma sobreprodução de uma aspartil-pro-tease.

Isolaram-se 3 transformantes capazes de produzir um halo de coagulação. Experiências de controlo revelaram que a dimensão do halo dos clones recombinantes transformados pelos plasmídeos pBT3 e pEMR713, designados clone 1, clone 2 e clone 3, é comparável à que se obtém com a estirpe SEBR 103. b) Selecção em meio líquido por estudo em frasco A fim de confirmar este resultado, testes de produção em frascos foram levados a cabo da maneira que se segue: sementeira de frascos de 250 ml contendo 40 ml de meio F (cf. Secção 7) . Os frascos são em seguida incubados a 28°C num agitador rotativo excêntrico regulado para a velocidade de 220 rot/min durante 48 horas. Para cada estirpe, as culturas foram realizadas em três frascos diferentes e a média dos resultados de dosagem da actividade coagulante para os três frascos foi calculada. O testemunho é constituído pela estirpe Cryphonectria parasitica SEBR 103 não transformada. A dosagem da actividade coagulante é realizada de acordo com o método oficial de determinação do teor em enzimas de soluções coagulantes publicado no

Journal Officiel de la Republique Française (Jornal Oficial da República Francesa) de 20 de Março de 1981 (parágrafo C), resumido na Secção 7. c) Análise da enzima secretada pelos clones 1, 2 e 3 O mosto de fermentação obtido após a cultura dos transformantes produtores e o da estirpe testemunha C. parasitica SEBR 103 não transformada foram submetidos a uma centrifugação de modo a eliminar a massa miceliana. Após desnaturação das proteína do material sobrenadante na presença de SDS durante 5 minutos a 100°C, efectuou-se uma electroforese sobre gel de poliacrilami-da na presença de SDS. Observa-se, após aplicação de corante azul de Coomassie, a presença de uma banda maioritária de massa molecular próxima de 36 kDa, que corresponde â massa molecular da endotiapepsina madura, deduzida da da sua sequência (cf. Figura 1), com a mesma intensidade para os transformantes produtores e para a estirpe testemunha, e de bandas minoritárias idênticas para os transformantes sobreprodutores e a estirpe testemunha.

Verificou-se, por outro lado, por meio de reacção antigénio-anticorpo ("kit” Rennetest, França, Biochem) sobre os materiais sobrenadantes das culturas de transformantes sobreprodutores e da estirpe testemunha não transformada, que a enzima secretada é idêntica à de Crvphonectria parasitica. de acordo com o método de identificação descrito no Journal Officiel de la République Française (Jornal Oficial da República Francesa) de 20 de Março.

Além disso, determinou-se a relação entre a actividade coagulante e a actividade proteolítica da enzima secretada. A actividade coagulante expressa em g/1 é medida recorrendo ao reagente TNBS, descrito por R. Fields, Biochem. J. (1971) 124: 581-590, por meio da dosagem dos grupos aminados que aparecem após proteõlise da dimetilcaseína.

Esta relação situa-se entre 0,040 e 0,045 .para os transformantes sobreprodutores, o que está muito prõximo daquela que se obtém com a estirpe testemunha não transformada. Pode-se concluir destes três estudos que ê efectivamente a endotiapepsina que é especificamente produzida pelos clones 1, 2 e 3.

Esta experiência mostra é é possível exprimir em C. parasitica o gene que codifica a endotiapepsina, utilizando uma região promotora e uma região de terminação heteróloga (que não pertence a C. parasitica^.

Secção 15: Amplificação pela técnica de PCR do DNA complementar que codifica o precursor da endotiapepsina 1) Isolamento dos RNA mensageiros de C. parasitica A estirpe de C, parasitica SEBR 103 foi cultivada em condições de produção de endotiapepsina. O micélio foi recuperado por meio de filtração sobre gaze, lavado com água e congelado em azoto líquido. 15 g de micélio (peso húmido) congelados são postos em suspensão em 45 ml de solução tampão de lise e depois retomados em igual volume de pequenas esferas (0,45 /zm de diâmetro). A solução tampão de lise ê constituída por tiocianato de guanidina 4 M, Tris HCl 10 mM pH 7,6, EDTA 10 mM, β-mercaptoetanol a 50 ml/1. A suspensão miceliana é triturada durante 5 minutos. O material triturado é recuperado e as pequenas esferas são separadas por meio de decantação. Cerca de 45 ml de material sobrenadante são recuperados, adicionados a um valor final de 3 M de cloreto de lítio e conservados a 0°C.

Passados dois dias, centrifuga-se a solução precedente durante 60 minutos a 10 000 rot/min. Retira-se o material sobrenadante e retoma-se o resíduo em 40 ml de LiCl 3 Μ. A suspensão obtida é recentrifugada a 10 000 rot/min durante 1 h 30. Adiciona-se proteinase K (SIGMA) a 40 jug/ml, SDS (a 0,1% p/v) e EDTA 20 mM. Incuba-se a 37°C durante 3 horas. Precipita--se com 2 volumes de etanol, depois efectua-se uma lavagem com etanol a 70%. Retoma-se o resíduo em 0,5 ml de solução tampão TE (Tris HCl 10 mM, EDTA 1 mM pH 7,5), extrai-se por 2 vezes com clorofórmio e precipita-se com etanol. Os RNA são conservados a -80°C em etanol.

2) Purificação da fraccão poliA+ dos RNA

Cerca de 1 mg de RNA é precipitado durante 20 minutos a 4°C (15000 rot/min), depois é lavado com etanol a 70% e finalmente secado. 0 resíduo é retomado em 1 ml de solução tampão TE e posto em supenso mediante agitagção num vórtice. A oligo dT-ce-lulose tipo 3 (comercializada por Collaborative Research Inc., Biomedicals Product Division) é preparada de acordo com as recomendações do fabricante. 0 RNA é depositado sobre a oligo dT, agitado suavemente a fim de colocar novamente em suspensão as pequenas esferas e depois aquecido durante 1 minuto a 65ÔC.

A suspensão é ajustada com NaCl 0,5 M e depois agitada suavemente durante 10 minutos. A suspensão é então centrifugada durante 1 minuto a 1000 rot/min, o material sobrenadante é eliminado, o resíduo é lavado por duas vezes com 1 ml de solução tampão TE contendo NaCl 0,5 M. Os materiais sobrenadantes são eliminados. A eluição da fracção poliadenilada dos RNA (constituída por RNA mensageiros) é obtida mediante suspensão das pequenas esferas em 1 ml de solução tampão TE, seguida de aquecimento dessa suspensão a 60°c durante 1 minuto, seguida de agitação durante 10 minutos sobre uma placa basculante. Centrifuga-se em seguida durante 1 minuto a 1000 rot/min, o que permite recuperar, por um lado o material sobrenadante contendo mRNA livres em solução, e por outro o depósito de pequenas esferas de celulose. O conjunto de operações atrás referidas (a partir da eluição) é repetido. Os materiais sobrenadantes assim obtidos são reunidos, elimina-se o excesso de pequenas esferas por meio de centrifugação e precipita-se o material sobrenadante com etanol contendo NaCl de acordo com as técnicas habituais. (Maniatis,. op. cit.). 3) Descricão da técnica de reaccão de oolimerase em cadeia fPolvmerase Chain Reaction - PCR) A técnica de reacção de polimerase em cadeia (PCR) é um método bem conhecido dos especialistas da técnica que permite copiar simultaneamente as duas cadeias de uma sequência de DNA previamente desnaturada utilizando dois oligonucleótidos como segmentos iniciais (cf. nomeadamente a obra de H.A. Erlich: "PCR Technology: Principies and Applications for DNA Amplification" (Tecnologia PCR: Princípios e Aplicações para Amplificação de DNA) publicada em 1989 pelas edições MacMillan Publishers Ltd, Reino Unido e a obra de M.A. Innis et al., "PCR Protocols" (Protocolos PCR) publicada em 1990 pela Academic Press Inc., San Diego, Califórnia 92101, EUA). 0 princípio desta técnica é a seguir apresentado de forma resumida.

Numerosos ciclos, cada um dos quais é constituído por três etapas, provocam a amplificação das cadeias do DNA em questão; essas três etapas são: 92- a) desnaturação da matriz b) hibridação dos segmentos iniciais sobre a matriz c) extensão dos segmentos iniciais

Apôs algumas horas de ciclos, foram produzidas centenas de milhares de cópias da matriz original graças a uma DNA polime- i rase termoestável de Thermus aguaticus. hebitualmente designada polimerase Taq. A técnica de PCR baseia-se na repetição de três etapas. » a) Desnaturação da matriz: O DNA de cadeia dupla é desnaturado para dar origem a DNA de cadeia simples por meio de incubação a temperatura elevada (de 92°C a 96°C) durante aproximadamente 2 minutos. b) Hibridação dos segmentos iniciais:

Estes segmentos iniciais são um par de oligonucleótidos sintéticos que se hibridizam com as extremidades da região a amplificar. Os dois segmentos iniciais hibridizam-se com as cadeias opostas. os segmentos iniciais são adicionados em excesso, de modo a que a formação do complexo segmento inicial -matriz seja favorecida. c) Extensão dos segmentos iniciais: A etapa no decurso da qual a polimerase Taq assegura a extensão do complexo segmento inicial - matriz de 5' para 3' é levada a cabo a 72°C. -93-

Na técnica de PCR, o produto em questão' aparece no terceiro ciclo e é então amplificado de maneira significativa. No decurso dos ciclos, o produto de amplificação torna-se rapidamente a matriz predominante com a qual se hibridizam os segmentos iniciais.

I 4) Descricão dos segmentos iniciais utilizados

Prepararam-se dois oligonucleôtidos sintéticos a partir da sequência do fragmento A (cf. Figura 2). ► 0 primeiro oligonucleótido, designado segmento inicial 1, cuja sequência é a seguinte: 5' AGAAAGCTTG GAGGAGCGAGGGCCC 3' região 1 região 2

possui duas regiões distintas: a região 1, que apresenta um local de clonagem AAGCTT que corresponde ao local de reconhecimento da endonuclease HindIII e a região 2, que é uma região destinada a hibridizar-se com a região que não codifica da cadeia que codifica do fragmento A, situada a 3' da sequência que codifica a pré-pró-endotiapepsina (cf. Figura 2 - posição 1870--1881). O segundo oligonucleótido, designado segmento inicial 2, cuja sequência é a seguinte: 5' GCAGAATTCACATATG TCTTCCCCTCTCAAG 3' região 1 região 2 é igualmente constituído por duas regiões distintas: a região 1, que possui um local de clonagem CATATG que corresponde ao local de reconhecimento da endonuclease Ndel, no qual está incluída a sequência do codão iniciador ATG, e a região 2, que possui uma sequência nucleotídica idêntica a que codifica os cinco primeiros aminoácidos da pré-pró-endotiapepsina que se seguem â metionina inicial. Esta região destina-se a hibridizar-se com a cadeia que não codifica do fragmento A. 5) Obtenção do fragmento amplificado que representa o DNA complementar da endotiapepsina

Utiliza-se como matriz um conjunto ("pool") de RNA mensageiros que se sabe conter o RNA mensageiro que codifica a endotiapepsina; uma reacção enzimática utilizando a transcripta-se inversa é levada a cabo sobre o RNA mensageiro antes da amplificação. a) Identificação da presença do RNA mensageiro que codifica a endotiapepsina na preparação de RNA total a) 0 Northern Blot: A técnica do Northern Blot ê utilizada (Maniatis). Ela consiste essencialmente na separação, por meio de electroforese sobre gel de agarose a 1,0% em condições de desnaturação (MOPS 20 mM pH 7, acetato de sódio 5 mM, EDTA 1 mM, formaldeído a 6,6%) de aproximadamente 10 μg de RNA total. Os RNA assim separados são transferidos para uma folha de nitrocelulose (Maniatis, op. cit.). Preperam-se deste modo dois filtros de nitrocelulose diferentes que são hibridizados, um com a sonda radiomarcada 1, e -95- o outro com a sonda radiomarcada 2 (cf. Exemplo 12) e 3) para a 32 preparaçao das sondas e a sua marcação com P) . β) Hibridacão com a sonda radiomarcada 1 e a sonda radiomarcada 2:

As condições de hibridação são idênticas as que foram descritas no Exemplo 15). Após a hibridação, cada um dos filtros é lavado individualmente numa solução contendo 0,5 x SSC a 42°C. Os filtros são em seguida expostos a uma película fotográfica (Kodak XAR5) de um dia para o outro. A análise das películas revela que uma população de RNA reage de modo específico às duas sondas, o que indica por conseguinte que o RNA mensageiro que codifica a endotiapepsina está presente na preparação. b) A reacçao utilizando a transcriptase inversa.

Leva-se a cabo a reacção da transcriptase inversa com 1 jLtg de RNA mensageiro na presença de ditiotreitol DTT 10 mM, de RNasine (inibidor de RNAse Genofit) 0,0040 ϋ/μΐ, de mistura dos quatro trifosfatos de desoxirribonucleotidilos dNTP 10 mH, de solução tampão de composição: Tris HC1 50 mM pH 8,3, KC1 20 raM e MgCl2 10 mM, de 0,7 unidades de transcriptase inversa (Stratage-ne) e de 0,1 ng de segmento inicial 1 bem como 0,1 ng de segmento inicial 2 para um volume final de 10 jul. Após meia hora de incubação a 46°C, a reacção é interrompida adicionando 20 mM de EDTA e depois a mistura é incubada durante 5 minutos a 65ÔC. c) A reacçao de PCR. A mistura previamente descrita é submetida a uma cromatografia sobre coluna de gel de poliacrilamida Pio a fim de serem eliminadas as moléculas de pequenas dimensões (nucleótidos, EDTA, etc.). A solução obtida é incubada durante 2 minutos a 92 °C a fim de ser desnaturada a matriz composta por uma cadeia de DNA complementar e uma cadeia de RNA mensageiro. No tubo, adicionam-se então 100 ng de segmento inicial 1, 100 ng de segmento incial 2, MgCl2 2 mM, dNTP 0,2 mM, 5 μΐ de mistura de reacção concentrada 10 vezes (quantidade final: Tris HC1 67 mM pH 8,8, (NH.)„S0. 16,6 mM, β-mercaptoetanol 1 mM, EDTA 6,7 mM, Triton xlOO a 0,15%, 200 g/ml de gelatina). O volume da mistura é em seguida aumentado para 50 μΐ por meio da adição de água. A mistura de reacção assim obtida é incubada durante 4 minutos a 94°C e depois colocada à temperatura de 41°c e mantida assim durante 4 minutos. A temperatura de 41°C corresponde à temperatura de semi-desnaturação do oligonucleótido diminuída de 5 graus, calculada através de uma fórmula empírica bem conhecida dos especialistas da técnica.

Juntam-se então 0,5 μΐ, ou seja 2,5 unidades, de polimerase Tag.

Cobre-se então a mistura de reacção com parafina a fim de evitar a evaporação da solução aquosa (Boehringer Manheim ref. 1146-165). A amplificação tem lugar ao longo de 30 ciclos de reacção, sendo as seguintes as etapas de um ciclo: 2 minutos a 92°C ----- desnaturação 2 minutos a 41°C ----- hibridação 2 minutos a 72°c ----- polimerização.

Apôs os 30 ciclos, a reacção enzimática é interrompida mediante a adição de EDTA 20 mM. O fragmento de DNA assim amplificado, que apresenta a dimensão esperada de cerca de 1300 pb, é em seguida isolado e purificado sobre gel de agarose a 1%, submetido a diálise sobre uma coluna de PIO e depois hidrolisado simultaneamente com as enzimas Ndel e HindIII segundo as técnicas habituais bem conhecidas dos especialistas (maniatis, op. cit.) a fim de se formarem as extremidades coesivas Ndel e HindIII. Apôs hidrólise, o fragmento é purificado sobre uma coluna de PIO.

Seccão 16: Construção do plasmídeo p572, vector de clonagem e de expressão do DNA complementar que codifica o precursor de endotiapepsina em E. coli. Determinação da sequência desse DNA complementar e expressão do mesmo. 1) Construção do plasmídeo p572 0 plasmídeo p572 foi preparado a partir do plasmídeo p466, vector de clonagem e de expressão do DNA complementar da oxidase de urato de Aspergillus flavus em E. coli. descrito no Pedido de Patente PCT-FR-90-00532, que inclui um fragmento do plasmídeo pBR327 incluindo a origem de replicação e o gene de resistência â ampicilina, um promotor sintético de E. coli (R. Rodriguez e M. Chamberlin, "Promoters - Structure and Function" (Promotores - Estrutura e Função) (1982) Preager), uma sequência de Shine-Dalgarno, seguida de um "polilinker" que apresenta os locais únicos Ndel e HindIIl, um terminador de transcrição (derivado do fago fd) e o gene lac i. a) Construção do plasmídeo p466.

Preparou-se o plasmídeo p466, vector de expressão em E. coli. Este inclui um fragmento de pBR327 que inclui a origem de replicação e o gene de resistência à ampicilina, e inclui igualmente um promotor sintético de E. coli (R. Rodriguez e M. Cham-berlin, "Promoters - structure and Function" (Promotores -Estrutura e Função) (1982) Preager), uma sequência de Shine--Dalgarno, seguida de um "polilinker" que apresenta os locais únicos Ndel e Kpnl, um terminador de transcrição (derivado do fago fd) e o gene lac i.

Este plasmídeo foi construído a partir de um plasmídeo de expressão de hGH em E. coli (p462) por substituição de um fragmento que inclui o gene de hGH pelo cDNA da oxidase de urato. A construção do plasmídeo p466 será agora descrita mais pormenorizadamente no que se segue, sendo feita referência às Figuras 6, 7, 8, 9, 10. 1) Construção do plasmídeo p373,2 A estratégia posta em prática recorre a fragmentos obtidos a partir de plasmídeos pré-existentes acessíveis ao público e a fragmentos preparados por vias de síntese de acordo com técnicas agora vulgarmente utilizadas. As técnicas de clonagem utilizadas são as que são descritas por T. Maniatis, E.F. Fritsch e J. Sambrook, Cold Spring Harbor Laboratory (1982). A síntese dos oligonucleótidos ê levada a cabo recorrendo a um sintetizador de DNA Biosearch 4600. -99-

Submeteu-se o plasmídeo pl63,l (Figura 6), descrito no Pedido de Patente EP-A-0245138 e depositado no CNCM sob a referência 1-530 em 17 de Fevereiro de 1986, a uma digestão com as enzimas Pvul e BamHI. Este plasmídeo contém o gene que codifica hGH. O fragmento Pvul - BamHI - no que se segue designado fragmento 1 -, que contém o local de acção da enzima de restrição Xhol, representado na Figura 6, foi purificado.

Analogamente, submeteu-se o plasmídeo pBR327, bem conhecido dos especialistas na técnica, (cf. Soberon, X. et al., Gene, 9, (1980) 287-305) a uma digestão com as enzimas Pvul e BamHI. 0 fragmento Pvul - BamHI - no que se segue designado fragmento 2 -, que contém a origem de replicação, foi purificado.

Depois preparou-se o fragmento 3, que é um fragmento sintético BamHI(1) - BamHI(2)', que contém o gene lac i e o seu promotor, cuja sequência é a seguinte na qual as duas extremidades da cadeia são identificadas pelos números 1 e 2 a fim de indicar a orientação do fragmento nos plasmídeos descritos nas Figuras 7 e 8.

J -100- FRAGMENTO 3

BamHKD

>

5' GA7CC GCGGAAGCA7 AAAG ί u ί λλλ GC v_ ι GGGG t G C . J Anιunu1 GAGC7AAC77 ACA77AA77G CG7TGCGC7C AC i GCCCGC7 ιιCCAGíCGu GAAnCCiG7C GιGl CAGuιG l1Μ ι I ηη ι iCGGCCAACG Luuuuuunun GGCGG777GC G \ A t ι Guuu o CCAGuwιGuι ι μ i C ί ι ; ι C ACuAGί GAGA CGGGCAACAG C7GA77GCCC 77CACCGCC7 GGCCC7GAGA /-1/-—---1,-- unu t I UUnuL rtnuuoo ι u L n CGC7GG777G CCCCACCACC CGAAAA7CC7 Gi ι ι GAiGGι Guι i AACGGC i— /1i1 · - λ- i · r UUUn 1 n . nnu A7GAGC7GιC 7 i CGG i A7CG 7CG7A7CCCA L i nCvjnGn I A7CCGCAC»A nLuUUCnUUC CGGACiCGGι 1 1—— MnlUUUUUUU i — — 1 n i GCGCCA7>.. G ATCGιιGul A AClAGCAιCG — s.nu ι UUUnnL 1 jn > u u 1- s. ι Lm «·· — — — llLrtULrtt.ι - 1 — - - — -1 -/- JUMIOUl í . U [ ÍlJrtnMnCvO — — 1l- Unun í u U U Λ V, c . A G < l G u C rrrrr^r —r 1 i w w >W 1 · . . /- — — Λ — i- — — — — uiirtiicuu GAA777GA77 G'-GAG: GAGA « .1 « ι ι ή ι U U A G - ^ n G 1. . .ι G ACGCAGAC3C GCCGAGACAG « « /1 -» — 1 · — r> nn\. ι ι n/i lyy O - ...Cu i nu A G u G C c . '«3 v1 ' G U . O rv C . ei ι^τγ'·'1 1 r A i — 1 — - - T Γ η i nUη ι o1 > -wn ^ Jw.wrtG ι L O 1 Λ v. ^ J . . * CA 1 L U U r· G <-i A rt A ι A A ι 1λ C 1 G ι ι GA . vívjG i J · . . OvJ i viG núnlfl 1 „ Λ Γ1 w η Μ ι rt %j v OUnni,.i i Írtvj ‘ UunúuunGv· •·w^nCnuin ATGGu n . . „. — — — CU l u η l \. w n\j — <— <— 1 — ^ s w oun inuι » a n \ Gn ι vΛGC n·-—-ir--n ·„ n iun\.uuu 1 5 G C U L J n u n A G n \ ι U ι U U n CCGC"GCTTT *i u n u u w · . C G A C o w o C ; . C G ι 1 C » nC s,n \ uUnCnC.nLv. ACGC7GGCAC »- L Au í iUrt 7C */-1·· yuicuvjnljn ι l ι ηη ι v. uu .u v· U A C η η ί ί ι u C3ACGGCGCG t U L n u U U v- CA unL íúunuui UUUnnLJws.n n i cnL:unnLu n u ι Ο l ι i'o\.v L U U >· — u < > G l ι G ι 'oCv.rtCGC Gu t l UUU.A η 1 U 1 A η ! 5 L n U U i Lu'jCA í Lu L L U u « "· L ι. :ac 3' 1

i i i Gi i i .CjCnG AAACGiuG'-'. Gui·'- ι i ι l ACuACj^juG

AAACGGiCTG A7AACAGACA ‘-CGGCAiACí CiGCGACATC GiAiAACGm AC ·, GG ι ι i CA CATiCACCAC CCiGAATTGA C7CTCT7CCG GGCGC.A7CA i uC C.-i i AC Co CGAAAGu ι ι ι iGCGCCAi7C GAiGG7GiCC G 5c“HI\Z) -101-

Os fragmentos 1, 2 e 3 foram então ligados de modo a ser obtido o plasmídeo pl60 representado na Figura 7.

Este plasmídeo foi submetido a digestão parcial com as enzimas de restrição HincII e PstI. O fragmento grande HincXX -Pstl, contendo a origem de replicação e representado na Figura 7, foi em seguida ligado ao fragmento 4, a seguir representado, que é um fragmento sintético de DNA que inclui uma sequência que codifica os 44 primeiros aminoácidos de um precursor natural de hGH e a montante desta sequência sinais de regulação.

102-FRAGMENTO 4 5'

CGAGCTGACTGACCTG7TGC

C Lai T ATATTAC n TCGA ) AGl i uortC i GAC ! GvjnCAAÇ\jHn ι A AA i G t AGC í λ Ncs I _____________ _ _ ^ ......... _ T_ TAGCGTAT AA i G i G i G\^AA i \ G i GAGCun í AACAA í i i CACACnG ι í i AAC * 11 AnGAj-GlAGA ι A ι ACA ι

AiCGATATTACACACLι iAACAC ι CGCC ι A77G7TAAAG iG iGTCAAATTuAAA ι > C · CC i C7A7AT51A >

A7G GC7 ACC GGA 7CC CGG AC7 AG7 C7G C7C C7G GC7 777 GGC C”G C7C 7GC C7G

TAC CGA TGG CC7 AGG GCC TGA 7CA GAC GAG GAC CGA AAA CC3 L MATGSRTSLLLAFG

·-**<* /“ 1 «li-»*· /—· * Λ 0."Λ. OMG mgO L L C L -26 CCC TGG Ciι CAA GAG GGC AGi GCw ι ί rr .n .-iLv,

GGG ACC GAA G77 C7C CCG 7CA CGG AAG GG7 7Gi PWLQEGSAFPT 1

'AA

I i TCT GAA A Λ Λ nnn r A ρ L

GAC AAC GC7 ATG C7C CGC GCC CAT CGT C7G CAC CAG C7G GCC

GAC ACC TAC

CTG T7G CGA TAC GAG GCG CGG G7A GCA GAC G7G GTC GAC CGG AAA C7G TGG ATC DNAMLRAHRLHQIAPLTY

PstI CAG GAG TTT GAA GAA GCC TAT ATC CCA AAG GAA CAG AAG TAT TCA 77C CTG CA

GTC CTC AAA CTT CTT CGG ATA TAG GGT 7TC CTT GTC TTC ATA AGT AAG G QEFEEAYIPKEQKYSF 44

Neste fragmento, os aminoãcidos são designados por letras de acordo com o seguinte código: A = Alanina C = Cisteina D = Ácido aspártico E = Ácido glutâinico F = Fenilalanina G = Glicina H = Histidina I = Isoleucina K = Lisina L = Leucina São sucessivamente sequências -35 (TTGCTT) e -10 a sequência de Shine-Dalgarno técnica. M = Metionina N = Asparagina P = Prolina Q - Glutamina R = Arginina S = Serina T = Treonina V = Valina W = Triptofano Y = Tirosina sublinhadas neste fragmento as (TATAAT) da sequência promotora, e bem conhecida dos especialistas na 0 plasmídeo p380,l foi assim obtido. 0 plasmídeo p380,l foi em seguida submetido a uma digestão com as enzimas de restrição ciai e Ndel de modo a ser eliminado o pequeno fragmento Ciai - Ndel do fragmento 4 atrás referido e a ser substituído pelo fragmento Ciai - Ndel a seguir apresentado: -104- -104-

Clal

5' CGATAGCGTATAATGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACA

TATCGCATATTACACACCTTAACACTCGCCTATTGT

Ndel ATTTCACACAGTTTTTCGCGAAGAAGGAGATATACA TAAAGTGTGTCAAAAAGCGCTTCTTCCTCTATATGTAT 5' O plasmídeo resultante é o plasmídeo p373,2 (Figura 8). 2) Construção do plasmídeo p466: O plasmídeo p373,2 foi submetido a uma dupla digestão com as enzimas BglII e HindIII. O fragmento grande resultante desta digestão foi purificado e ligado com um fragmento do DNA sintético, cuja sequência a seguir indicada se destina a reconstituir o fim do gene de hGH seguido em 3' por locais de clonagem Kpnl e SnaBI.

J

3 G L II

4 t «a «»«**« m— nnui i IO l u I UUH lu I l^u u n L o u .ά L i ml l trtngnnl ; n L U U U L iOl l L i ftl — — y-A a — - i l IfAnOl i'J l'C i ! ·/· -·*— /*y\/“ — A Ar·*

'-Ol i I

iGAG » GiGiiGw i A ACAiGGACAÂGGiC r -r.r ^ rπ i rr*irrrr r~1 -Λ onuoc-n^v , -u * Gol . j C . mu i

AA C.l « G í rAu unloio *·

ίCACGGCGAGACACC

H ί S n K n d a I n B I I I I

GGTACCCTGCCCTACGTACCA ---------+---------+-

CCATGGGACGGGATGCATGGTTCGA -106-

Este fragmento inclui as extremidades coesivas BglII e HindIII. 0 novo plasmídeo assim formado p462 (cf. Figura 9) inclui por conseguinte um local Kpnl e um local Ndel que vão servir para a clonagem do fragmento que inclui o cDNA da oxidase de urato no vector de expressão. O plasmídeo híbrido derivado de pTZ19R que inclui o cDNA com cerca de 1,2 kb (clone 9C) da oxidase de urato inclui um local Kpnl único. Este local está situado alguns pares de bases a jusante do local de clonagem do cDNA. Por outro lado, o cDNA da oxidase de urato contém um local Accl situado na proximidade da extremidade 5'.

Por conseguinte, isolou-se e purificou-se o fragmento Accl - Kpnl que inclui a maior parte desse cDNA. Por outro lado, sintetizaram-se dois oligonucleótidos complementares cuja sequência é a seguir indicada:

5'-TATGTCTGCGGTAAAAGCAGCGCGCTACGGCAAGGACAATGTTCGCGT ACAGACGCCATTTTCGTCGCGCGATGCCGTTCCTGTTACAAGCGCAGA-5'

e se destina a recosntituir a extremidade 5' do cDNA. Este fragmento sintético assim obtido possui uma extremidade Ndel e uma outra AccII. O fragmento e a sequência sintética foram ligados com o vector de expressão cortado por Kpnl e por Ndel. Esta ligação de três fragmentos permite obter o vector de expressão designado p466, de oxidase de urato para E. coli (cf. Figura 10). Este plasmídeo foi submetido a uma série de hidrólises enzimáticas com enzimas de restrição, que permitiram verificar a presença dos locais de restrição previstos, em particular aqueles que estavam incluídos no gene que codifica a oxidase de urato.

0 plasmídeo ρ466 contém, por conseguinte, e por construção, um gene que codifica a oxidase de urato com a sequência a seguir indicada:

I

I

ATG ι C i Gv.Gu ! AAAAGv-AGu GuG^-íACGuu AAGuACAAiG TiCGCjiCiA

CArtGu i iCAC AAGGACGAGA AGACCGG f G » CCAGACuutG TAC0AGA1GA

CCGiC i GTGT GCTTCιGGAG GGTGAGAιTG AGACCTCT7 A CAC «-rtAijuvi* GACAACAGCG 7CA77G7CGC AACCGACTCC A ι ι AAGAACA CCA777ACA7 CACCGCCAAG CAGAA C C C C 3 TTACTCCTCC C3AGCTGTTC Gu CιC x A ι C C TGGGCACACA Ci i C AιT G A G AAGTACAACC ACATCCATGC CSC7CACG7C AACAι i G i C i GCCACCGC7G GACCCGGATG G A C A ι ι o A C lo GCAAGCCACA CCCTCACTCC TTCATCCGCG ACAGCGAGGA GAAGCGGAAT G7GCAGG7GG n r ** ~ "~ * *· * nLolUUiLljn GGuCAAGGGC nil'onlnll/4 AGTCGTCTCT GιCCGuCCTG ACCoiGC t GA s,nn C i CG\-nG ι i C i GGGuCι »CC ι Glj í ^iACuA GιACACCACA C ι ι AAGumG* vv lUUUrtluNj T ATC CTGAG C AClGAC37CG A7GCCACι7G GCAG7GGAAG AATι ιCAG ι G GACiCCAGGA GGιCCGCTC5 CrtCuιúCC ι A A G ι .CGAtG-, 7 AC C7Guui. C rt v. 1 vj 1 v VJ O n G ^ » u AC TC ι GAAGAC7777 /· <· ^ Λ · */"·"* U L \ CflflUrt l r\ ACAG ι GCCAG C^iUUnGuL·· ι Λ 1 \J 1 rtwfl AGA i GGCAGA ** »* · a * * i* ^ nftrt ι w m > /-r ^ Λ vj V, u C U w n vj AGC7GA7CGA GAC7G7CGAG í A C * C G ι i G C \. t mACAmol..^ C7A777CGAA η i lunLw ιCM GC7GGCACAA GGGCC7C CAA AACAuuoGCA AGAACGCCGA GG7C77CGC7 CCιCAGιCGG ι - i si Μ ι LnrtU ι G » A C Vw G ι C v3 GCCGGιC C í C 1 C · ϋπηζ ι « i A r\ r* 1 (Os nucleótidos diferentes dos nucleótidos de cDNA isolado de A. flavus estão sublinhados na sequência atrás apresentada. Estas diferenças foram introduzidas no fragmento sintético Accl - KpnX de modo a que existisse a jusante de ATG uma sequência nucleotí-dica mais conforme relativamente às que são habitualmente encontradas num gene de procariota) . 0 plasmídeo p466 foi hidrolisado com as enzimas Ndel e HindIII e o fragmento que inclui o gene lac i, a origem de replicação e o gene que codifica a resistência à ampicilina foi purificado de acordo com as técnicas conhecidas dos especialistas (Maniatis, op. cit.).

Este fragmento foi ligado ao fragmento de DNA complementar amplificado previamente hidrolisado pelas endonucleases Ndel e HindIII. O produto desta ligação serviu para transformar na estirpe E. coli K12 RRI (Gibco-BRL - ref.: 520-8261 SA) . Conservou-se um transformante, designado clone 512, que contém o plasmídeo designado p572. 2) Determinação da sequência do DNA complementar O plasmídeo p572 foi hidrolisado, por um lado com as endonucleases Ciai e Kpnl, e por outro com as enzimas Kpnl e HindIII. (A endonuclease Kpnl corta a seauência que codifica do fragmento A): O fragmento Ciai - Kpnl incluindo a extremidade 5' do DNA que codifica a proteína e o fragmento Kpnl - HindIII que inclui a extremidade 3' do DNA que codifica a proteína foram clonados no fago M13mpl9 (Pharmacia) e a sua sequência foi determinada pela técnica do ciclone ("Cyclone I Biosystem" da IBI) . A sequência nucleotídica do DNA complementar assim obtida está representada na Figura 11. Verifica-se que a sequência que codifica do DNA complementar é exactamente idêntica à do DNA genómico, com a diferença de esta última estar interrompida por três intrões, os quais foram correctamente localizados (cf. Exemplo 1 7)). 3) Expressão do DNA complementar da pré-pró-endotiapepsina A estirpe E. coli K12 RRI (Gibco BRL ref.: 520-8261A) foi transformada para a resistência à ampicilina com o plasmideo p572 que inclui o DNA complementar da pré-pró-endotiapepsina, de que se determinou a sequência em 2), e com um plasmideo testemunha negativa pBR322.

Em ambos os casos obtiveram-se colónias resistentes à ampicilina.

Uma colónia de cada tipo foi posta em cultura em meio LB líquido (de composição indicada no Quadro 4, mas sem agar) a que se juntou ampicilina 100 ^g/ml. Após uma noite a 37°C sob agitação, as duas culturas foram diluídas 100 vezes em meio líquido LB a que se adicionou ampicilina 100μg/ml. Após uma hora de cultura, juntou-se IPTG (B-Dtiogalactosídeo de isopropilo) até ao valor de 1 mM ao longo de 3 horas.

Imunodetecção da pré-pró-endotiapepsina pela técnica de

Western Blot: a) Modo operatório

Retira-se do meio de cultura obtido após 3 horas de incubação com IPTG uma porção alíquota correspondente a 0,2 ml a um valor de DO = l. Centrifuga-se esta e elimina-se o material sobrenadante. Submete-se em seguida o resíduo a uma análise pela técnica de Western Blot, técnica que é bem conhecida dos especialistas, e que inclui as seguintes etapas: - Solubilização do resíduo por ebulição durante 10 minutos numa solução tampão designada solução tampão de carga e. constituída por Tris HCl 0,125 M pH 6,8, SDS a 4%. azul de bromofenol a 0,002%, glicerol a 20%, β-mercaptoetanol a 10% (de acordo com o protocolo descrito por Laemmli (U.K. Laemmli, Nature, 227, (1970), 680-685)), - Separação electroforética das diferentes proteínas contidas no material solubilizado de acordo com o protocolo descrito por Laemmli (U.K. Laemmli, Nature, 227, (1970), 680--685)), - Transferência das referidas proteínas contidas no gel para um filtro de nitrocelulose (de acordo com a técnica de H. Towbin et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 76., (1979), 4350- -4354), - Imunodetecção, realizada de acordo com a técnica de

Burnette (W.W. Burnette, Ana. Biochem. 112. (1981), 195-203), que implica, sucessivamente: - O enxaguamento do filtro de nitrocelulose durante 10 minutos com uma solução tampão de composição Tris HCl 10 mM, NaCl 170 mM, KC1 1 mM. - 0 contacto do filtro de nitrocelulose durante 30 minutos a 37°C com uma solução tampão A a que se adicionou soro de albumina bovina na razão de 3 g por íoo ml. - O contacto do filtro de nitrocelulose durante 1 hora a 37°C com os anticorpos policlonais do "kit" Rennetest France Biochem, de acordo com o método de identificação da endotiapepsina descrito no Journal Officiel de la République Française (Jornal Oficial da República Francesa) de 20 de Março de 1981. - O enxaguamento do filtro de nitrocelulose com a solução tampão A, a que se adicionaram 3 g/100 ml de soro de albumina bovina. - o contacto do filtro de nitrocelulose durante 1 hora a 37°c com uma solução de proteína G marcada com iodo 125 a 0,1 microCurie/ml. - O enxaguamento do filtro com solução tampão A. - A secagem do filtro entre duas folhas absorventes. - O contacto com uma película radiogrãfica. - A revelação da película, b) Resultados:

Verifica-se que a estirpe transformada pelo plasmídeo p572 sobreproduz uma proteína com um valor aproximado de massa molecular aparente de 43 kDa que corresponde ao valor de massa molecular esperado para a pré-pró-endotiapepsina, que é identificada pelos anticorpos dirigidos contra a endotiapepsina que está ausente na estirpe testemunha.

Claims (1)

1. REIVINDICAÇÕES lâ. - Processo para a obtenção de uma cassete de expressão de um precursor de endotiapepsina em Crvphonectria parasitica. caracterizada por se incorporar na referida cassete um promotor funcional a montante de uma sequência que codifica o precursor de endotiapepsina, a qual apresenta a seguinte sequência (Pl) : -114- Ser Thr Gly Sér Ala Thr Thr Thr Pro ile Aap Ser Leu ASO Asp Ala Tyr Ilé Thr Pro vat Gin Ile. Gly Thr Pro AU sin Thr’ Leu Asn Leu Asp Phe Asp Thr Gly Sér Ser Asp Leu Trp Vat Phe Ser Sér Glu Thr Thr AU Ser Gtu Vat Asp Gly Gtn Thr Ue Tyr Thr Pro Ser Lys Ser Thr Thr AU Lys Léu Lfu Ser Gly AU Thr Trp Ser Ile Ser Tyr Gly Asp Gly Ser Ser Ser S«r Gly Aso Vai Tyr Thr Asp Thr Vai Ser Val 6ly Ôly Leu Thr Val Thr Gty filn Ala Vai Glu Sér AU Lys Lys Vai Ser Ser Ser Phe Thr Glu Aso Ser Thr IU Asp Gly Leu Leu Gly Leu AU Phe Ser Thr Leu Asn Thr Val S#r Pro Thr Gtn Gin Lys Thr Phe Phe Asp Asn AU lys Ala 5er Lau Asp Sér Pro Val Phe Thr Ala Asp Leu Gly Tyr HU AU Pra Gty Thr Tyr Asn Phé Gly Phe Ilé Asp Thr Thr Ala Tyr Thr Gty Ser Ile Thr Tyr .Thr AU- Vai Sér Thr lys Gin Gly Phe T rp Glu Trp Thr Ser Thr Gly Tyr AU Vll Gly Sér Gly Thr Phe ly« Ser Thr Ser Ite Asp Gty Ue AU ASP Thr Gty Thr Thr Leu Léu Tyr Leu Pro AU Thr vat Val Sér AU Tyr Trp Ala 6 In Vát Sèr Gly Ala Lys Ser Ser Ser Ser Vai Gty Gly Tyr Val Phe Pro Cys Sér Ala Thr Leu Pro Ser Phe Thr Phe Gty vel Gly Ser AU Arg Ue Val Ué Pro Gly Asp Tyr Ile Asp Phe Gly Pr o lú Ser Thr Gly ser ser Ser Cy1 PHe Gly Gly Ile Gin Ser Ser Ala Gly Ile Gly Ile Asn Ite Phe Gty Aio vel Ala Leu Lr* AU AU Phe Vai val Phe Asn Gty Ata Thr Thr Pro Thr leu Gly Phé Atá Ser Lys. I -115-

   2β. - Processo para a para a obtenção de uma cassete de expressão de acordo com a Reivindicação 1, caracterizado por o precursor de endotiapepsina ser a pré-proendotiapepsina com a sequência (P4) seguinte:

   V

   Hít Ser Sor Pro Leu Lys· Asn AU Leu Val Thr AU ne: Leu AU Gly Gly AU Leu Ser Ser Pro Thr Lys Gin H)í Val Gly Ue Pro Val Asn AU Ser Pro Glu Vai Gly Pro Gly Lys Tyr Ser Phe Lys Gin Val Arg Asn Pro Asn Tyr Lys Ph« Asn Gly Pro Leu Ser val Lys Lys Thr Tyr Ltu Lya Tyr Gly V3t Pro Ue Pro AU Trp Leu Glu Asp Ala Val Gin Asn Ser Thr Ser Gly Leu Alá Glu Arg Ser Thr Gty Ser Ala Thr Thr Thr Pro Ue Asp Ser Leu Asp Asp Ala Tyr Ile Thr Pro vat Gin Ile. Gly Thr Pro AU Gin Thr Leu Ain Leu Asp Phe Asp Thr Giy Ser Ser Asp Leu Trp val Phe ser ser 6lU Thr Thr AU Ser Glu Vai ASp Gly Gin Thr ue Tyr Thr Pro Ser Lys Ser Thr Thr Ala Lys Leu Leu Ser Gly AU Thr Trp Ser Ile Ser Tyr Gly Asp Gly Ser Ser Ser Ser Gly Asp Val Tyr Thr Asp Thr Val Ser Val Gly Gty Ltu Thr Val Thr Gty Gin Ala Val Glu Ser AU Lys Lys Vat Ser Ser Ser Phe Thr Glu Asp Ser Thr Ue Asp Gly Leu Leu Gly Leu AU Phe Ser Thr Ltu Asn Thr val Ser Pro Thr Gin Gin Lys Thr Phe Phe Asp Asn Ala Lys Ala Ser Leu Asp Ser Pro val Phe Thr AU Asp Leu Gly Tyr Hia AU Pro Gty Thr Tyr Asn Phe Gly Phe Ile Asp Thr Thr Ala Tyr Thr Gly Ser Ile Thr Tyr Thr Ala Vai Ser Thr Lys Gin Gly Phe Trp Glu Trp Thr Ser Thr Gly Tyr AU Val Gly Ser Gly Thr Phe LyS Ser Thr Ser Ile Asp Gty Ue AU Aso Thr Gly Thr Thr Leu Leu Tyr Leu Pro Ala Thr Val Val Ser AU Tyr Trp Ala Gtn Vai Ser Gly Ala Lys Ser Ser Ser Ser Val Gly Gty Tyr Val Phe Pro Cys Ser Ala Thr Leu Pro Ser Phe Thr Phe Gly Val Gly Ser Ala Arg Ue Val Ue Pro Gly Asp Tyr Ue Asp Phe Gly Pro Ile Ser Thr Gly Ser Ser Ser Cys PHe Gly Gly Ile Gin Ser Ser Ala Gly Ile Gly Ue Asn Ile Phe Gly Asp vai Ala Leu Lys Ala AU Phe Val Val Phe Asn Gly Ala Thr Thr Pro Thr Leu Gly Phe AU Ser Lys 3â. - Processo para a obtenção de uma cassete de acordo com a Reivindicação 2, caracterizado por a sequência que codifica a pré-proendotiapepsina incluir a sequência (N4a) seguinte: ATGTCTT TGGTGCTCTC CCTCTCCTGA CCCAACTACA GTACGGCGTG CCTCGGGCCT GACAGCCTCG GCAGACTCTG TCAGCAGCGA CCCAGCAAGA TCCTACGGAG CTCGGTTGGA AGGTTTCTTC CTGGCCTTCA CTTCGACAAT TTGGCTACCA GCCTACACGG CTGGGAGTGG CGACTTCCAT CCTGCCACCG CAGCTCTTCC CCTTCACCTT ATTGATTTCG CCAGTCCAGC AGGCTTTGTC CCAAG CCCCTCTCAA AGCTCGCCTA AGTTG6CCCC AGTTCAACGG CCGATCCCAG GGCTGAGCGC ATGATGCTTA AACCTGGACT GACTACAGCC GCACCACCGC ACGGTAGCTC GGCCTTACCG CAGCTTCACC GCACCCTGAA GCGAAGGCGT TGCCCCTGGT GCTCCATCAC ACTTCGACCG CGACGGCATC TCGTGTCGGC GTCGGCGGCT CGGCGTTGGC GCCCCATCTC GCTGGTATCG GTCTTCAACG GAACGCCTTG CAAAGCAACA GGAAAGTACT GCCTCTGTCG CCTGGCTGGA TCGACCGGTT CATCACTCCG TTGACACTGG AGCGAGGTCG CAAGCTGCTG TTCCAGCGGC TGACGGGCCA GAGGACTCGA CACTGTGTCG CCTTGGACTC ACCTACAACT CTACACCGCT GCTACGCCGT GCTGACACTG CTACTGGGCC ACGTCTTCCC TCAGCTCGCA CACTGGAAGC GCATCAACAT GGGCTACAAC GTGACCGCCA CGTTGGAATT CGTTCAAGCA GTCAAGAAGA GGATGCTGTC CTGCGACCAC GTTCAGATCG ATCTTCGGAT ATGGGCAGAC TCGGCGCTAC GATGTCTACA GGCTGTCGAG CCATTGACGG CCTACCCAGC GCCTGTGTTC TCGGCTTCAT GTCTCGACCA CGGCTCCGGC GCACGACCCT CAGGTCTCGG CTGCAGCGCG TTGTGATTCC TCGTCTTGCT CTTCGGTGAT TCCCACTCTT TGTTGGCTGG CCCGTCAACG AGTCCGGAAC CGTACCTCAA CAGAACTCTA AACTCCCATC GCACCCCTGC CTGTGGGTCT CATCTACACC CTGGTCCATC CTGACACCGT TCGGCCAAGA TCTCCTGGGC AAAAGACTTT ACGGCTGATC CGATACCACT AGCAAGGGTT ACCTTCAAGT CCTGTACCTC GCGCCAAGTC ACCCTGCCTT TGGCGACTAC TTGGCGGCAT GTCGCTCTGA GGCTTTGCTT 4â. - Processo para a obtenção de uma cassete de acordo com a Reivindicação 3, caracterizado por a sequência que codifica a pré-proendotiapepsina incluir a sequência (N4a) interrompida pelo menos por um intrão. 5-. - Processo para a preparação de uma cassete de acordo com a Reivindicação 4, caracterizado por a sequência que codifica a prê-proendotiapepsina ser a sequência (N4b) seguinte: CGCCATGTTG GAATTCCCGT AAGCAAGGTG AAAAAGAAGA TGAAGTCCGG AGACGTACCT GTCGAGAACT CACAACTCCC TCGGCACCCC GATCTGTGGG CTCGCCCGCA ACTAACATTG CCCCCAGCAA ATCTCCTACG CGTCTCGGTT AGAAGGTTTC GGCCTGGCCT TTTCTTCGAC ATCTTGGCTA GATGAATCTT TCTACAGCTG GGGCTCCATC GGACTTCGAC ATCGACGGCA CGTCGTGTCG CCGTCGGCGG TTCGGCGTTG CGGCCCCATC GCGCTGGTAT TTTGTCGTCT G GTCTTCCCCT CTCTCAGCTC CCTGAAGTTG CTTCTGTGTG AGACGGATAT ACAAGTTCAA GTGCCGATCC CCTGGCTGAG TCGATGATGC CTGAACCTGG CGAGACTACA TACATTTTTA AACTGTAGGT GCCAAGCTGC CTCTTCCAGC CCGTGACGGG ACCGAGGACT GAACACTGTG CGTCCTTGGA GAGTGACCCC CATTCCCCAC CTTCGGCTTC CTGTCTCGAC GTCGGCTCCG TGGCACGACC CCCAGGTCTC CCCTGCAGCG CATTGTGATT GCTCGTCTTG ATCTTCGGTG TACAACTCCC CCTTGGTGAC CAACACGTTG GTACTCGTTC AGACCAACGC ATTATACTTT TCGGTCAAGA GGAGGATGCT GTTCTGCGAC CCGGTTCAGA TGGATCTTCG TTGGTCAACC TAATCAGAAT ACCATCTAÇA TACCTGGTCC ACACTGACAC GAGTCGGCCA CGGTCTCCTG AGCAAAAGAC TTCACGGCTG TATACTTTTT ATTGTTTGTA CTGCCTACAC TTCTGGGAGT GTCGACTTCC TCCCTGCCAC TCCAGCTCTT TTCCTTCACC ACATTGATTT ATCCAGTCCA GAAGGCCGCC TTGCTTCCAA AT GCTGGTGGTG CAACGCCTCT AGTAGAGCTG GGTCAAGGCA AACCCCAACT CAAGTACGGC CTACCTCGGG ATCGACAGCC TGCGCAGACT TCTTCAGCAG TTTTATTGCA GGAATTTCCC GAGCACCACC GAGACGGTAG GGAGGCCTTA TTCCAGCTTC TCAGCACCCT AATGCGAAGG CCATGCCCGT GTTGGAGAAG GTACCTACAA ACCTACACCG CGGCTACGCC TCGCTGACAC GCCTACTGGG CTACGTCTTC GCTCAGCTCG TCCACTGGAA CGGCATCAAC TCAACGGGGC CTCAAGAACG GCCTACAAAG GCCCCGGAAA TTGCAACAGA TTTACTGACA CGGGCCTCTG CAGCCTGGCT CGCTCGACCG TTACATCACT ACTTTGACAC GCCAGCGAGG GTTTTTTTGG CGATGGGCAG TGTCGGGCGC GGCGATGTCT CCAGGCTGTC CGACCATTGA TCGCCTACCC CTCGCCTGTG TCTTGATACA TAATATGGAA ATCGATACCA CAAGCAAGGG GCACCTTCAA CTCCTGTACC GGGCGCCAAG CGACCCTGCC CCTGGCGACT CTTTGGCGGC ATGTCGCTCT ACTCTTGGCT 6i. - Processo para a obtenção de uma cassete de acordo com uma das Reivindicações 2 a 5, caracterizado por o promotor ser o promotor do gene que codifica a prê-proendotiapepsina ou uma parte funcional desse promotor. 7 â. - Processo para a obtenção de uma cassete de acordo com a Reivindicação 6, caracterizado por a parte funcional do promotor do gene que codifica a pré-proendotiapepsina ser o segmento BglI-Scal do fragmento C. 8a. - Processo para a obtenção de uma cassete de acordo com a Reivindicação 6, caracterizado por a parte funcional do promotor do gene que codifica a pré-proendotiapepsina ser o segmento BamHI-Scal do fragmento C. 9 a. — processo para a obtenção de uma cassete de acordo com a Reivindicação 6, caracterizado por o promotor incluir uma parte que inclui a caixa TATA da sequência (N5) seguinte: aagcttatcc gccgccggcg ggggaattct attgaacttg ttcgaatcat TGGTCCGTGG TCTTTTCGTC CATGCGGGCT CCGCTGGCGG ATGAATGACC TTCTGGCTTC TAGCCTGGCG AAGCGATGTT actctgttgt CTATACTATA CGATATGGTC AAGAGA.GCAC ATGTGCCGCC AGATGAAGAC ATGTATATAA AAGGAGTGGC CTCGACGGTT GCTCAACCAT CTTCTGTCTG TCCCAACGCC ATCGACTCTT CAACTTCTCC TTCGTGTTCC ACCACCATCA CCTTGCTCCA GACTTAGGAC TTTCAGCAAC CTTCAAAG e a montante da sequência (N5), um segmento X do fragmento C compreendido entre a extremidade 5' do fragmento A e a -120- extremidade 5' do fragmento C, escolhido de modo a que o segmento X contenha uma região activadora. 10a. - Processo para a obtenção de uma cassete de acordo com a Reivindicação 9, caracterizado por o segmento X do fragmento C ser o fragmento com a seguinte sequência: 1 \ '121-

   I > GCATGCTTGG CTCTTTAACG TCCTGCCCAT TCAGGGCCTT CAGCCGGCAC TGGTCCTTCA TCAAGGGGGA CCTCATGACC ATGAACTAAT CTGTGATATC TGATATATTC TAGAAGGCTT GGCTCCTCAA AGTTTCCAGC TAATGAATCA GCGGCCCGCC GCCCTTAAAC CGCATCAGGC AAGTCGTTTG GTGTTGCCAG GCGATGGCGA CAGGAGAGTG GTGTTGATGG GACAAGGGGA GGGAGGCTTA GCCGACTTCA TCCATAGCAC CCACCTGCTT GGCGCCGATA AGTCTGACGA TCCGCTTGAG CTGCAAAACG GCTCCTTGAC CTTTGTTTGG TCGACCGAGG GAAATAGTCT CTTTTTGCGT GATCGTGCGC GCTTCGTATA GCAATAGCAG CCAGCACCAG CAGGACGGGC CGTTGTCACG GTCACATCGT TCGCAACATG CCGAGCGTAG GGATGAACGA ATGACTCGAG CCTTGCCTGA CAGTCTGGCA ATCAATCTAT GGTCACGCAC GATCACAAGC CAATCGCTGT GACTGCGTTA CTAGCCCAAT AATCCCTTGT TCGATCAGAG TGTTCTACAG ACTTCAAGTG AGGTTCAC -122-

   llâ. - Processo para a obtenção de uma cassete de acordo com uma das Reivindicações 2 a 5, caracterizado por o promotor provir de um gene expresso em CrvOhonectria parasitica ou num outro fungo filamentoso do grupo dos ascomicetes. 12a. - Processo para a obtenção de uma cassete de acordo com a Reivindicação 11, caracterizada por o promotor provir do gene que codifica a gliceraldeido-3-fosfato desidroge-nase de Asoercrillus nidulans. 13a. - Estirpe de Crvphonectria narasitica produtora de endotiapepsina, caracterizada por ser transformada por uma cassete de acordo com uma das Reivindicações 2 a 12, e por sobreproduzir endotiapepsina relativamente à estirpe não transformada. 14^. - Estirpe de acordo com a Reivindicação 13, caracterizada por ser desprovida de marcador de selecção dominante. 15a. - Estirpe de acordo com uma das Reivindicações 13 e 14, caracterizada por a estirpe hospedeira ser a estirpe SEBR103, depositada no CNCM em 31.08.1990 com ο P I 997. 16». - Estirpe de acordo com a Reivindicação 15, caracterizada por sobreproduzir a endotiapepsina relativamente à estirpe SEBR103, com um factor de sobreprodução pelo menos igual a 2. 17a. - Processo para a preparação de endotiapepsina, caracterizado por compreender uma etapa de cultura de uma estirpe de acordo com uma das Reivindicações 13 a 16, seguida de uma etapa de isolamento e de purificação da proteína. -123- 18a. - Processo para a obtenção dé uma estirpe de acordo com a Reivindicação 14, caracterizado por compreender pelo menos um ciclo que inclui uma etapa de co-transformação por meio de uma cassete de acordo com uma das Reivindicações 1 a 11/ e um marcador de selecção dominante, seguida de uma etapa de purificação por esporulação que permite eliminar o marcador de selecção dominante. Lisboa, 9 de Setembro de 1991

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