PT98275B

PT98275B - Processo para a preparacao de polimetileno-iminas dissubstituidas

Info

Publication number: PT98275B
Application number: PT98275A
Authority: PT
Inventors: Alain Pierre; Gilbert Regnier; Ghanem Atassi; Alain Dhainaut; Stephane Leonce
Original assignee: Adir
Priority date: 1990-07-11
Filing date: 1991-07-10
Publication date: 1998-12-31
Also published as: DE69104286D1; EP0466586A1; DE69104286T2; ATE112275T1; CA2046746A1; OA09379A; JPH04230376A; IE69847B1; FR2664594B1; EP0466586B1; IE912410A1; DK0466586T3; ES2064948T3; AU636775B2; PT98275A; US5225411A; NZ238909A; ZA915407B; AU8029091A; FR2664594A1

Description

PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DE POLIMETILENO-IMINAS

DISSUBSTITUÍDAS

A presente invenção diz respeito a um processo para a preparação de polimetileno-iminas de fórmula geral

(I) na qual

a) X representa um grupo CH ou um átomo de azoto;

b) A representa um grupo polimetileno-imina de fórmula geral

na qual

B representa um heteroátomo oxigénio, ou enxofre ou um radical de fórmula geral NR' na qual R’ representa um átomo de hidrogénio ou um radical alquilo ou alquenilo contendo até 5 átomos de carbono, q representa um número inteiro compreendido entre 1 e 3;

c) R-p R£, Rg e R^ iguais ou diferentes, representam, cada um :

um átomo de hidrogénio;

um radical alquilo comportando 1 a 6 átomos de carbono de cadeia linear ou ramificada, eventualmente substituído por um átomo de halogéneo, um ou vários radicais hidroxi ou um radical aminado de fórmula geral : -N(R^Rg)

na qual Rg e Rg iguais ou diferentes, representam, cada um, um átomo de hidrogénio ou um radical alquilo comportando 1 a 6 átomos de carbono de cadeia linear ou ramificada ou Rg e Rg considerados em conjunto com o átomo de azoto a que estão ligados formam um heterociclo comportando 4 a 6 átomos de carbono e eventualmente um outro heteroátomo : oxigénio ou enxofre;

um radical alquenilo ou alquinilo contendo, cada um, 2 a 6 átomos de carbono;

ou ou um radical cicloalquilo comportando 3 a 6 átomos de carbono;

cada um dos pares R^, R2 e/ou Rg, R^ considerados em conjunto com o átomo de azoto a que estão ligados formam um heterociclo comportando 4 a 6 átomos de β

carbono e eventualmente um outro heteroá tomo : oxigénio ou enxofre;

d) Z representa um radical hidrocarbonado comportando 1 a 5 átomos de carbono de cadeia linear ou ramificada;

e) R representa um átomo de hidrogénio, um radical alquilo comportando 1 a 5 átomos de carbono de cadeia linear ou ramificada, um radical alquenilo comportando 2 a 5 átomos de carbono de cadeia linear ou ramificada, ou um radical fenilo eventualmente substituído por (Y)_mou ₍r>_n,

f) Y e Y*, iguais ou diferentes, representam, cada um, um átomo de hidrogénio ou de halogéneo, um radical trifluorometilo ou um radical alquilo ou alcoxi comportando, cada um, 1 a 5 átomos de carbono;

g) m e n, iguais ou diferentes, representam, cada um, o número inteiro 1 ou 2;

estado anterior da técnica ê ilustrado particularmente pela patente de invenção francesa NQ 2 524 467 que tem

-5έpor objecto as polimetileno-iminas de fórmula geral

na qual

- A* representa um radical alquenilo Cg-Cg eventualmente substituído por um ou vários radicais hidroxi;

- X* representa um grupo CH ou um átomo de azoto;

- n’ representa o número zero, um ou dois;

- Y” representa um átomo de oxigénio ou um grupo de fórmula geral N-R’·^ [na qual R'representa um átomo de hidrogénio, um radical alquilo (C-^-Cg) ou hidroxialquilo, alquenilo (Cg-Cg), ou cicloalquilo (Cg-Cy) ou cicloalquenilo];

- R* representa um átomo de hidrogénio, ou um radical alquilo (C-^-C^), cicloalquilo (C^-Cy) ou fenilo eventualmente substituído;

- B representa, especialmente, um grupo alquilo , alquenilo fenilo, naftilo, benzofuranilo, benzotienilo, benzodioxolilo, benzodioxanilo, benzodioxinilo,Ag cromenilo, tio-cromenilo ou cromanilo;

polímetileno-iminas essas que favorecem a captação de oxigénio e podem, assim, ser utilizadas no tratamento do declínio cerebral.

Modificações importantes de estrutura conduziram aos derivados de fórmula geral I preparados pelo processo de acordo com a presente invenção, os quais apresentam uma actividade farmacológica e terapêutica particularmente interessante e totalmente diferenciada da dos derivados próximos anteriormente conhecidos, como 0 prova o estudo farmacológico descrito no Exemplo 26.

A presente invenção diz respeito a um processo para a preparação de derivados de fórmula geral I, caracterizado pelo facto de se condensar :

-7¢% quer uma polimetileno-imina de fórmula geral

(II) na qual X, A, Rp R£, R^ θ R^ têm os significados definidos antes, com um derivado de fórmula geral

(Y)m (III) na qual Z, R, Y, Y’, m e n têm os significados definidos antes e T representa um átomo de halogêneo tal como por exemplo um átomo de cloro ou de bromo ou um resto tosiloxi.

quer um derivado halogenado de fórmula geral

na qual X, Rp R2, R^ e R^ têm os significados definidos antes, com uma polimetileno-imina de fórmula geral

na qual A, Z, R, Y, Y’, m e n têm os significados definidos antes.

-9,χ»

A condensação dos derivados de fórmulas gerais II e III efectua-se, de preferência, no seio de um dissolvente escolhido entre os álcoois contendo 4 ou 5 átomos de carbono, a dimetilformamida, a dimetilacetamida, o acetonitrilo ou o tetra-hidrofurano .

Procede-se, com vantagem, a uma temperatura compreendida entre 80° C e 120° C na presença de um receptor do ácido formado durante a reacção. Este receptor pode ser escolhido entre os carbonatos alcalinos como o carbonato de potássio, a trietilamina ou um excesso do derivado de fórmula geral II utilizado para a condensação.

Por outro lado, no caso em que o símbolo B representa um átomo de oxigénio ou de enxofre (o que leva a BH = OH ou SH) é sensato utilizar o hidreto de sódio para sodar previamente o derivado de fórmula geral II.

A condensação dos derivados de fórmulas gerais IV e V efectua-se de modo particularmente adequado no seio de um dissolvente escolhido entre os álcoois comportando 4 ou 5 átomos de carbono tal como o butanol ou o pentanol, e as amidas alifáticas como a dimetilformamida ou a dimetilacetamida Recomenda-se trabalhar a uma temperatura compreendida entre 120° C e 150° G na presença de um agente de fixação do hidrácido que se forma durante a reacção. Este receptor pode ser

escolhido entre os carbonatos alcalinos como o carbonato de potássio, a trietilamina ou um excesso do derivado de fórmula geral V utilizado para a condensação.

No caso em que o símbolo B representa um átomo de oxigénio ou de enxofre (o que leva a BH = OH ou SH) é vantajoso utilizar o hidreto de sódio para sodar o derivado de fórmula geral V.

A presente invenção diz igualmente respeito a um processo para a preparação dos derivados de fórmula geral I na qual o símbolo B representa um radical de fórmula geral NR’, quer dizer mais especificamente dos derivados de fórmula geral 1’

Ri

na qual X, Z, R, Rp R2, Rp R^, Y, Y’, m e n têm os significados definidos antes e A* representa um grupo polimetileno-imina de fórmula ύ· .

na qual q e R’ têm os significados definidos antes, caracterizado pelo facto de se fazer reagir cianoboro-hidreto de sódio com uma mistura de :

uma cetona de fórmula geral

(VI)

na qual X, Rp R£, R^, R^ e q têm os significados definidos antes, e de uma amina de fórmula geral

(VII) na qual R', Z, R, Y, Y', m e n têm os significados definidos antes.

Procede-se com especial vantagem no seio de um dissolvente apropriado como os álcoois de baixo peso molecular tal como por exemplo o metanol ou o etanol, ou o tetra-hidrofurano, a uma temperatura compreendida entre 20° C e 25° C a um pH próximo de 6.

Os compostos iniciais utilizados nos processos anteriormente descritos são quer produtos conhecidos, quer compostos preparados a partir de substâncias conhecidas, de acordo com os processos descritos para preparar compostos

análogos como se indica nos exemplos que se seguem.

Os derivados de formula geral I podem transformar-se em sais de adição com os ácidos, sais que fazem, como tal, parte da presente invenção. Como ácidos utilizáveis para a formação destes sais, pode-se citar, por exemplo, na série inorgânica os ácidos clorídrico, bromídrico, sulfúrico e fosfórico e na série orgânica, os ácidos acético, propiónico, maleico, fumãrico, tartárico, nítrico, oxálico, benzóico, metano-sulfónico e isetiónico.

Por outro lado, no caso em que o símbolo Z representa uma cadeia ramificada e os símbolos Y e Y' são diferentes um do outro, e não representam um átomo de hidrogénio, os derivados de fórmula geral I podem apresentar-se sob a forma de diastereoisómeros ou de enantiõmeros que fazem, como tal, igualmente parte da presente invenção.

Os novos derivados de fórmula geral I podem ser purificados mediante métodos físicos tais como a cristalização das bases, cromatografia (em particular cromatografia rápida sobre sílica 35-70yn, sob uma pressão compreendida entre 0,5 e 1 atmosfera de azoto, tendo como sistema de eluição : cloreto de metileno/metanol ou acetato de etilo), ou químicos tais como a formação de sais de adição com ãcidos e decomposição destes sais pelos agentes alcalinos.

-14,*

Os derivados de fórmula geral I e os seus sais de adição aceitáveis sob o ponto de vista fisiológico possuem propriedades farmacológicas e terapêuticas interessantes, que permitem a sua utilização para suprimir a resistência das células tumorais aos agentes anti-cancerosos e para suprimir a resistência dos parasitas aos agentes anti-parasitários.

A presente invenção diz igualmente respeito a um processo para a preparação de composições farmacêuticas contendo, como ingrediente activo, um derivado de fórmula geral I ou um dos seus sais aceitáveis sob o ponto de vista fisiológico, misturado ou associado a um excipiente aceitável sob o ponto de vista farmacêutico.

As composições farmacêuticas assim obtidas apresentam-se geralmente sob a forma doseada. Podem, por exemplo, apresentar-se sob a forma de comprimidos, drageias, gêlulas, supositórios, soluções injectãveis ou bebíveis e ser administradas por via oral, rectal ou parenteral.

A posologia pode variar especialmente em função da idade e do peso do paciente, da via de administração, da natureza da doença e dos tratamentos associados e está compreendida entre 0,1 g e 7 g por toma.

Os exemplos seguintes ilustram o processo de acordo com a presente invenção sem contudo o limitarem de modo algum.

Os pontos de fusão são determinados em tubo capilar (cap.) ou na platina quente de Kofler (K)’

EXEMPLO 1 :

1-(bis-4,6-alilamino-2-s.triazinil)-[2,2-(bis-p.fluoro-fenil)-etil]-4-amino-piperidina

A) PRIMEIRO MÉTODO :

A uma solução de 4,6 g de cianoboro-hidreto de sódio em 150 ml de metanol contendo 20 g de peneiro molecular de óX, adiciona-se sucessivamente a uma temperatura compreendida entre 15° C e 20° C, 17 g de bis 2,2-(p.fluorofenil)-etilamina (P.E. Zy_|úlh = 158° - 160° C) e depois 23,7 g de cloridrato de

1-(bis-4,6-alilamino-2-triazin.il)-4-piperidona, que funde (cap) a 219° - 222° C.

Ajusta-se o pH a 6 por adição de metanol clorídrico e deixa-se sob agitação durante 24 horas à temperatura ambiente.

Ao fim deste tempo, filtra-se o composto insolúvel e evapora-se o filtrado sob pressão reduzida.

Retoma-se o resíduo com éter, lava-se com água e depois com uma solução a 10 l de hidrogenocarbonato de sódio.

Seca-se sobre sulfato de magnésio. Após evaporação, submete-se o resíduo a uma cromatografia sobre sílica eluindo com acetato de etilo. Após evaporação dos líquidos eluídos, recristaliza-se o resíduo cristalino em etanol a 90 L Obtém-se deste modo 5,3 g de mono-bidrato que funde (cap) a 66° - 68° C.

Prepara-se o cloridrato de bis-1-(4,6-alilamino-2-triazinil)-4-piperidona inicial mediante condensação da 4,6-dialilamino-2-cloro-triazina com a 4,4-dietoxi-piperidina, seguida de hidrólise do derivado dietoxilado assim obtido, com ácido clorídrico diluído, para se obter a piperidona correspondente .

Β)

SEGUNDO MÉTODO :

Aquece-se durante 8 horas a 120° C uma solução de 2,9 g de bis 4,6-alilamino-2-(4-amino-piperidino)-l,3,5-triazina, fundente (cap) a 120° C e de 3 g de 2,2-(bis-p.fluorofenil)-1-bromo-etano em 50 ml de dimetilformamida, na presença de 1,2 g de trietilamina.

Uma vez terminada a reacção, evapora-se o dissolvente sob pressão reduzida, retoma-se o resíduo com éter e lava-se depois com água. Após evaporação do éter, submete-se o resíduo oleoso a uma cromatografia sobre sílica e elui-se com acetato de etilo.

A evaporação dos líquidos eluídos deixa um resíduo cristalino que se cristaliza em etanol a 90 t Obtém-se deste modo 1,9 g de cristais de mono-hidrato que funde (cap) a 66° - 68° C.

Prepara-se a bis-4,6-alilamino-2-(4-amino-piperidino) -1,3,5-triazina inicial mediante condensação da 4-4-acetamido-piperidina com a 4,6-alilamino-2-cloro-triazina em dimetilformamida, seguida de uma hidrólise do composto resultante com uma solução de hidróxido de sódio em etanol.

EXEMPLO 2 :

1-(bis 4,6-alilamino-2-s.triazinil)-(3,3-difenilpropil)-4-tio-piperidina

Aquece-se a refluxo, durante 10 horas, uma solução de 3,6 g de bis 4,6-alilamino-2-cloro-triazina e de 5 g de 4-(3,3-difenil-propiltio)-piperidina em 100 ml de butanol, na presença de 4,4 g de K^CO^. Uma vez terminada a reacçao, filtra-se o sal e evapora-se o dissolvente sob pressão reduzida. Retoma-se o resíduo com éter. Obtém-se deste modo 9 g de óleo cujo fumarato, preparado no seio do etanol, dá 7,8 g de cristais que fundem (K) a 168° C.

A piperidina inicial, cujo fumarato funde (K) a 160° C, prepara-se mediante hidrólise, com (CHg)g-SiCl, do derivado N-carbetoxilado correspondente.

EXEMPLO 3 :

(bis-4,6-alilamino-2-s.triazinil)-4-amino-l-(2,2-difenil-etil)-piperidina

Aquece-se, durante 10 horas, a refluxo, uma solução de 2,3 g de 4,6-dialilamino-2-cloro-l,3,5-triazina e de 2,8 g de 4-amino-l-(2,2-dífenil-etil)-piperidina na presença de

1,4 ml de trietilamina, em 50 ml de butanol. Uma vez terminada a reacção, evapora-se o butanol sob pressão reduzida e retoma-se o resíduo com éter.

Lava-se a solução etérea com água e evapora-se depois o éter. Purifica-se o resíduo oleoso mediante cromatografia sobre sílica eluindo com acetato de etilo.

Após evaporação dos líquidos eluídos, obtém-se 2,6 g de um composto sob a forma de resina.

Prepara-se a 4-amino-l-(2,2-difenil-etil)-piperidina inicial, P.F. (cap) : 41° - 45° C, mediante redução com alquilação, com NaBH^CN em metanol, de uma mistura de difenilacetaldeído e de 4-acetamido-piperidina, seguida de uma hidrólise, com HCl 4 N, da difenil-l-etil-4-acetamido-piperidina formada.

EXEMPLO 4 :

1-(bis 4,6-alilamino-2-s.triazinil)-4-[N-(2,2-difenil-etil)-N-metilamino] -piperidina

H2C — HC - H2C - HN

Aquece-se durante 8 horas a 130° C uma solução de 2,3 g de 4,6-dialilamino-2-cloro-l,3,5-triazina, que funde (cap) a 206° - 208° C, e de 3 g de 4-[N-(2,2-difenil-etil)-N-metilamino]-piperidina em 50 ml de dimetilformamida, na presença de 1,4 g de carbamato de potássio. Uma vez terminada a reacção, filtra-se o sal e evapora-se o dissolvente sob pressão reduzida.

Submete-se o resíduo a uma cromatografia sobre sílica eluindo com uma mistura de cloreto de metileno/metanol (95 : 5).

Obtém-se deste modo 3,2 g de um composto oleoso, cujo difumarato funde (cap) a 172° - 176° C.

Preparou-se a piperidina inicial (óleo) mediante redução em condições de alquilação, com NaBH^CN em metanol, da l-acetil-4-piperidona com a N-(2,2-difenil-etil)-N-metil-amina[P.F. (cap) do oxalato : 215° C] seguida de uma hidrólise alcalina com a mistura hidróxido de sódio/etanol.

Preparou-se igualmente a l-(bis 4,6-alilamino-2-s.triazinil)-4-[N-(difenil-etil)-N-metil-amino]-piperidina de acordo com o processo descrito no Exemplo 1 método B).

EXEMPLOS 5 a 28

Procedendo de acordo com um dos vários processos de preparação descritos nos Exemplos 1 a 4, preparou-se os seguintes derivados :

5) 1-(bis-4,6-alilamino-2-s. triazinil)-4[ (2,2-difenil-etil) amino]-4-piperidina, P.F. (cap) : 69° - 72° C.

6) 1-(bis-4,6-alilamino-2-s.triazinil)-4[(3,3-difenil-propil)amino]-4-piperidina, P.F. (cap) : 88° - 92° C.

7) l-(4-propilamino-6-alilamino-2-s.triazinil)-4[(2,2-difenil -etil)-amino]-4-piperidina, P.F. (cap) : 56° - 58° C.

8) 1- (4-propilamino-6-alilamino-2-s . triazinil) -4 [ (3,3-difenil-propil)-amino]-piperidina, P.F. (cap) : 78° - 83° C.

9) 1-(bis-2,4-alilamino-6-pirimidinil)-4[(3,3-difenil-propil) amino]-piperidina, P.F. (cap) do fumarato : 209° - 211° C.

10) (bis-4,6-alilamino-2-s.triazinil)-4[2-(3,5-dimetoxi-fenil)(2-metil-fenil)-etilamino]-piperidina, P.F. (cap) do fumarato : 178° - 184° C.

-23Çr

11) 4-[(4-alilamino-6-propilamino-2-s.triazinil)amino]-1- (2,2-difenil-etil)-piperidina.

12) 1- (bis-4,6-aliiamino-2-s. triazinil) -4 [bis-3,3-( 3,4-dimetoxi-fenil)-propil-amino]-piperidina, P.F. (cap) do fumarato : 180° - 182° C.

13) 1-[bis-4,6-(dialilamino)-2-s.triazinil]-4[(2,2-difenil-etil)amino]-piperidina, P.F. (cap) do fumarato :

206° - 210° C.

14) 4-[(bis-4,6-alilamino-2-s.triazinil)tiol]-1-(2,2-difenil-etil)-piperidina.

15) 4-[(bis-4,6-alilamino-2-s.triazinil)oxí]-1(2,2-difenil-etil)-piperidina.

16) 1-(bis-4,6-alilamino-2-s.triazinil)-4(3,3-difenil-propil-oxi ) - piperidina.

17) 1-(bis-4,6-alilamino-2-s.triazinil)-4[(2,2,2-trifenil-etil)-amino]-piperidina.

18) 1-(4-alilamino-6-amino-2-s.triazinil)-4-[(2,2-difenil-etil)-amino]-piperidina.

19) 1-[bis-4,6-(3,3-dimetil-alilamino)-2-s.triazinil]-4-[(2,2-difenil-etil)-amino]-piperidina.

20) 1-[bis-4,6-(3-metil-alilamino)-2-s.triazinil]-4-[(2,2-difenil-etil)-amino]-piperidina.

21) 1-[bis-4,6-(2,2-hidroxi-etil-amino)-2-s.triazinil]-4[(2,2-difenil-etil)-amino]-piperidina.

22) 1-[bis-4,6-(3-cloro-alilamino)-2-s.triazinil]-4[(2,2-difenil-etil)-amino]-piperidina.

23) 1-(bis-4,6-ciclopropilamino-2-s.triazinil)-4-[(2,2-difenil -etil)-amino]-piperidina.

24) 1-[bis-4,6-(2,2-dimetilamino-etilamino)-2-s.triazinil]-4[(2,2-difenil-etil)-amino]-piperidina.

25) 1-[bis-4,6-(N-alil-N-metilamíno)-2-s-triazinil]-4—[(2,2— -etil)-amino]-piperidina.

26) 1-(bis-4,6-dialilamino-2-s.triazinil)-4-[(2,2-difenil-etil)-amino]-piperidina, P.F. (cap) do fumarato :

206° - 210° C.

27)

-25A A

1-(bis-4,6-alilamino-2-s.triazinil)-4-[(2,2,2-trifenil-etil)-amino]-piperidina, P.F. (cap) : 135° - 136° C.

28) 1- (bis-4,6-alilamino-2-s. triazinil) -4| [bis-2,2- (2,6-dimetilfenil)-etil]-aminoJ-piperidina, P.F. (cap) do fumarato :

205° - 207° C.

EXEMPLO 29 :

ESTUDO FARMACOLÕGIGO

A resistência aos agentes anticancerosos é um obstáculo maior à eficácia das drogas antitumorais. As células tumorais quando expostas in vitro ou in vivo a um agente anticanceroso tornam-se resistentes, em diversos graus, a estes compostos.

Foram descritos numerosos mecanismos de aquisiçao por uma célula de resistência aos agentes anticancerosos. Entre os diferentes tipos de resistência, a Multidrug Resistance (MDR) é particularmente interessante. O fenómeno da resistência é devido à acçâo de uma proteína membranar inductível, a gP 170, cujo papel é aumentar o efluxo do citotóxico, por conseguinte diminuir a sua concentração intracelular, de onde a perda de sensibilidade destas células à droga.

Medicamentos, utilizados em outras patologias, sao conhecidos por reverter, parcial ou totalmente esta resistência [Int. J. Câncer Res.” (1988) + 9 pp 285-296; I.N.C.I. (1989)

PP 907 - 910; Trends Pharmacol Sei” (1989) 9_ pp 54 - 58; ”Annu. Rev. Biochem.” (1980) 59 pp 137 - 171].

O agente modulador, quando adicionado ao mesmo tempo que o citotóxico, diminui ou suprime totalmente a resistência do tipo MDR. Certos medicamentos utilizados para o tratamento de outras doenças como a amiodasona, o verapamil ou a ciclosporina, foram utilizados em clínica para aumentar esta resistência, mas as suas propriedades farmacológicas intrínsecas (agentes hipotensores, ou imuno-supressores) frequentemente indesejáveis quando do tratamento do cancro e as suas toxicidades, limitam consideravelmente a sua utilização.

Além disso o mecanismo de resistência â cloroquina, desenvolvido pelo Plasmodium falciparum ê semelhante. 0 verapamil restaura a sensibilidade de uma linha resistente, o que demonstra o interesse potencial de compostos que transportam o fenotipo MDR das células tumorais, para uma utilização em parasitologia. [Science (1987), 238, pp 1283 - 1285; Science (1987), 235, pp 899 - 901].

Os ensaios descritos a seguir demonstram que os derivados preparados pelo processo de acordo com a presente

invenção transportam a resistência adquirida aos diferentes medicamentos.

A) Determinação do aumento da citotoxicidade da adriamicina sobre a linha P388/ADR-10 in vitro

Quando deste ensaio, determinou-se a citotoxicidade da adriamicina, na ausência e na presença do composto transportador. Para este ensaio, utilizou-se a leucemia murina P388/ADR-10 cuja resistência foi induzida pela adriamicina. 0 seu factor de resistência ê de 260 em relação à linha sensível (resistência média).

As células são cultivadas em um meio de cultura (RPM1 1640) completo, contendo 10 % de soro fetal de vitela, nM de glutamina, 50 Ul/ml de penicilina, 50ytg/ml de estrepto micina, 10 nM de Hepes e 20 nM de beta-mercaptoetanol.

As células são repartidas em microplacas e expostas à adriamicina em 9 concentrações diferentes.

Os compostos ensaiados pela sua capacidade para transportar a MDR são adicionados ao mesmo tempo que o citotóxico.

As células sao, em seguida, incubadas, durante 48 horas.

-28ζΑ \

Ο número de células viáveis é, em seguida, quantificado por um ensaio clorimétrico, o Microculture Tetrazolium Assay [Câncer Res. (1987), 47, pp 936 - 942].

Os resultados são expressos em ΟΙ^θ, concentração em citotóxico que inibe em 50 Z a proliferação das células testemunhas. Os resultados são expressos em Factor de Reversão (FR)

CIca Citotóxico só

FR - ---29^CI50 citotóxico na presença do composto transportador

Quadro I apresenta os valores dos factores de reversão obtidos com os diferentes compostos de fórmula geral I, preparados pelo processo de acordo com a presente invenção, e dos compostos de referência e demonstra a actividade muito interessante dos compostos de fórmula geral I.

No que diz respeito à reserpina (um dos compostos de referência), este composto tem uma actividade muito boa in vitro mas in vivo é inutilizável devido à sua grande toxicidade.

'1

QUADRO I

COMPOSTOS	2,5 yiM	5 yUM	10 yMM
COMPOSTOS DE REFERÊNCIA
FONOTIAZINA	9,4	23,1	-
PROGESTERONA	-	1,7	2,5
FLUNARIZINA	-	-	25
QUINIDINA	-	6	17,4
QUININA	-	-	14,5
VERAPAMIL	13,5	36,3	67,2
AMIODARONA	37,7	104,7	TOX
RESERPINA	-	215,5	189
CICLOSPORINA	149,4	TOX	TOX
COMPOSTOS DOS EXEMPLOS
EXEMPLO 1	110,8	244,4	170,7
EXEMPLO 2	15,4	65,1	86,4
EXEMPLO 3	39	70	134,8
EXEMPLO 4	34,7	32,3	171,1
EXEMPLO 5	100	189	277,4
EXEMPLO 6	54,4	TOX	TOX
EXEMPLO 7	102,8	135,6	TOX
EXEMPLO 8	75,9	TOX	TOX
EXEMPLO 9	80,4	TOX	TOX
EXEMPLO 10	125,1	75,3	TOX
EXEMPLO 11	87	65,2	TOX
EXEMPLO 12	1,4	8	TOX

-30ς *

Β) Determinação do aumento da cito toxicidade da actinomicina D sobre a linha de pulmão de hamster chinês, DC-3F/AD protocolo utilizado para este estudo é igual ao descrito para o ensaio do Exemplo 1 mas o meio de cultura não contém beta-mercaptoetanol e as células são incubadas durante 4 dias em vez de 48 horas. 0 citotóxico utilizado ê a actinomicina D.

A linha DC-3F/AD é uma linha extremamente resistente. 0 seu factor de resistência é superior a 10.000.

Os resultados deste estudo são apresentados no Quadro II ;

Os resultados do Quadro II demonstram que os compostos de fórmula geral I diminuem de maneira significativa ou suprimem a resistência ao citotóxico.

QUADRO II

COMPOSTOS	2,5 yllM	5 y*M	10 yllM	20 yUM
COMPOSTOS DE REFERÊNCIA
FENOTIAZINA	- —	Z 12	<12	<12
CLOROPROMAZINA	—	< 13	< 13	<13
YOIMBINA	—	<12	<12	<12
NIFEDIPINA	—	<n	TOX	TOX
PROGESTERONA	—	<10	< 10	13
QUININA	—	<10	< 10	< 11
DILTRIAZEM	—	<11	<10	<11
FLUNARIZINA	—	<13	16	TOX
DIPIRIDAMOL	—	<12	< 11	<12
QUINIDINA	—	Z 12	<12	<12
QUINACRINA	—	< 13	<12	TOX
TRIFLUOPERAZINA	—	<12	38	TOX
VERAPAMIL	—	<13	31	117
AMIODARONA	—	298	388	TOX
PIMOZIDA	2 10	28	78	TOX
RESERPINA	‘ 258	1085	1649	2024
CICLOSPORINA	< 11	<n	11	10
COMPOSTOS DOS EXEMPLOS
EXEMPLO 1	171	905	2575	TOX
EXEMPLO 2	-	17	171	-
EXEMPLO 3	38	104	240	-
EXEMPLO 4	-	218	1256	-
EXEMPLO 5	-	658	1504	TOX
EXEMPLO 6	<16,5	220	TOX	TOX
EXEMPLO 7	-	992	2339	-
EXEMPLO 8	16,5	TOX	TOX	TOX
EXEMPLO 9	94	472	TOX	-
EXEMPLO 10	259	1347	TOX	-
EXEMPLO 11	-	281	926	-
EXEMPLO 12	-	<16,5	i. 16,5	-

C) CITOMETRIA EM FLUXO

Certos compostos anti-cancerosos como a adriamicina (ADR) tem a propriedade de ser fluorescentes após excitação com uma fonte luminosa de comprimento de onda conhecido.

Para a determinação desta fluorescência, é possível determinar de modo relativo a concentração intracelular em ADR. A citometria em fluxo (CMF) é um instrumento de escolha para efectuar este tipo de medida e assim determinar rapidamente se certos compostos activos actuam aumentando a concentração intracelular em adriamicina.

As células (500.10 ) por ml sao expostas simultaneamente à adriamicina a uma concentração fixa (50 ytM) e aos compostos a ensaiar, em contrações de 2,5, 10 e 20 y«M. Depois de 5 horas de incubação, determina-se a absorção (uptake) da adriamicina intracelular mediante CMF.

As análises são realizadas em um citómetro de fluxo ATC 3000 (Bruker-France) equipado com um laser de árgon 2025 (Spectra-Physics-France ) optimizado a 488 nm para uma potência de 600 mw.

A análise de cada uma das amostras efectua-se sobre um total de 10.000 células a uma velocidade de 1000 células/ /segundo.

Os resultados foram reunidos sob a forma de histogramas lineares da fluorescência da ADR intra-celular.

EXPRESSÃO DOS RESULTADOS :

Para cada um dos histogramas, determina-se o canal médio (MEAN) de fluorescência, pelo sistema informático do aparelho.

PARA TODAS AS EXPERIÊNCIAS :

Um controlo negativo (células sem ADR) fixa o limiar de auto-fluorescência.

Um controlo positivo (células com ADR) determina o valor MEAN = MNl.

Os tubos testes (células com ADR e com composto de acordo com a presente invenção) determinam para cada um dos compostos e para cada uma das concentrações, os valores MEAN = MN2.

Os resultados são expressos sob a forma de variação da média da fluorescência obtido para cada um dos tubos testes (MN2) em relação à média da fluorescência obtida com o controlo

positivo (MNl) : VAR-NEAN = MN2 - MNl. 0 parâmetro expresso é, por conseguinte, o aumento da fluorescência da adriamicina na presença dos compostos ensaiados.

Quadro III apresenta o aumento da fluorescência do ADR obtido com os diferentes compostos sobre a linha DC-3F/AD e o Quadro IV sobre a linha P 388/ADR-10.

QUADRO III

COMPOSTOS	2 yUM	5 yiM	io y*M	20 y*M
COMPOSTOS DE REFERÊNCIA
VERAPAMIL	2,00	2,60	7,55	11,45
AMIODARONA	8,80	16,65	21,55	26,35
PIROZIDA	5,85	8,85	15,65	21,60
RESERPINA	26,18	29,43	31,73	29,95
CICLOSPORINA	1,90	3,20	8,05	15,10
QUINACRINA	2,00	10,5	19,1	25,8
TRIFLUOPERAZINA	0,00	0,00	4,10	13,40
COMPOSTOS DOS EXEMPLOS
EXEMPLO 1	18,27	26,13	35,57	43,63
EXEMPLO 2	0,2	10,4	25,1	35,0
EXEMPLO 3	8,0	19,9	21,6	19,3
EXEMPLO 4	12,3	24,1	41,9	49,0
EXEMPLO 5	15,5	31,3	34,65	37,9
EXEMPLO 6	3,9	21,5	29,75	TOX
EXEMPLO 7	14,47	26,0	34,17	36,63
EXEMPLO 8	4,5	17,85	27,15	TOX
EXEMPLO 9	7,2	15,1	16,3	26,2
EXEMPLO 10	14,8	24,7	26,5	28,2
EXEMPLO 11	12,6	18,9	29,9	40,5
EXEMPLO 12	6,1	3,8	5,5	9,6

QUADRO IV

COMPOSTOS	2 yuM	5 jíVL	10 yiM	20 y»M
COMPOSTOS DE REFERÊNCIA
FENOTIAZINA	0,00	0,00	0,00	0,00
CLOROPROMAZINA	3,30	5,15	4,60	6,20
YOIMBINA	2,30	0,05	4,70	3,45
NIFEDIPINA	0,00	0,80	5,95	3,40
PROGESTERONA	1,85	1,00	6,85	11,80
QUININA	4,85	5,40	12,00	18,90
DILTIAZEM	3,10	6,65	13,45	23,15
FLUNARIZINA	7,35	10,10	19,90	41,00
DIPIRIDAMOL	2,35	7,55	21,75	40,00
QUINIDINA	6,65	12,80	22,00	29,90
QUINACRINA	11,83	15,73	27,73	52,77
TRIFLUOPERAZINA	11,45	14,75	34,55	51,05
VERAPAMIL	9,89	21,90	39,62	56,50
AMIODARONA	33,40	65,25	76,33	95,85
PIMOZIDA	25,60	49,42	73,13	73,64
RESERPINA	73,46	80,48	91,90	85,39
CICLOSPORINA	79,43	97,63	96,68	90,27
COMPOSTOS DOS EXEMPLOS
EXEMPLO 1	53,1	74,7	85,49	78,5
EXEMPLO 3	29,9	46,2	66,0	73,1
EXEMPLO 5	45,25	60,7	79,47	76,25
EXEMPLO 6	32,9	60,1	55,8	TOX
EXEMPLO 7	48,75	72,6	80,9	87,3
EXEMPLO 8	38,9	60,1	TOX	TOX
EXEMPLO 9	39,2	55,8	65,8	TOX
EXEMPLO 10	52,0	75,3	84,0	78,0

D)

%

Reversão da resistência adquirida aos medicamentos, in vivo composto do Exemplo 1 foi ensaiado sobre um tumor apresentando o fenotipo MDR, a leucemia murina P 388/ADR. Foram utilizadas várias relações de doses do composto do Exemplo 1 e da adriamicina.

A leucemia P 388/ADR (resistente ao ADR) provém do National Câncer Institute (USA).

Enxertam-se 10° células por via intraperitoneal aos murganhos B^D2F^ fêmeas no dia 0 e o tratamento começa no dia seguinte de acordo com os esquemas de administração indicados. 0 composto do Exemplo 1 é preparado em hidroxipropil celulose e a suspensão é, em seguida, homogeneizada em Ultra Turrax. 0 composto do Exemplo 1 é administrado por via intraperitoneal 30 a 60 minutos antes do citotóxico (0,2 ml nos dois casos).

parâmetro determinado é o tempo de sobrevivência que permite calcular o T/C :

T/C

Tempo médio de sobrevivência dos animais tratados - _{x 100}

Tempo médio de sobrevivência dos animais testemunhas

-38>7

Calcula-se a variação ponderai, que esclarece sobre a toxicidade do tratamento. Os grupos testemunhas comportam entre 15 e 27 animais e os grupos tratados entre 5 e 10 animais.

Realizaram-se seis experiências independentes. Os ensaios efectuaram-se em 4 dias de acordo com o esquema ’ sendo as células tumorais enxertadas em JO e o transportador e o citotóxico administrados em J^, J₂, e J^.

Os resultados obtidos estão reunidos no Quadro V sob a forma de resultados globais (T/C médios e medianos). A linha P388 é muito resistente, o ADR isolado não apresenta nenhuma actividade antitumoral (T/C X).

composto do Exemplo 1, testado de 50 a 200 mg/kg, não possui actividade anti-tumoral e apenas apresenta uma toxicidade moderada a 200 mg/kg.

Com o composto do Exemplo 1 obtém-se uma actividade modesta, a 50 e 100 mg/kg (120 X £ T/C Z 135 X) e uma boa actividade a 200 mg/kg de composto do Exemplo 1 e 2 mg/kg de ADR (T/C = 148,9 X). Neste caso o ganho de actividade devido ao composto do Exemplo 1 é 30,6 X. Além disso, o Quadro V demonstra que a actividade é reprodutível, sendo os T/C médios muito próximos dos T/C medianos quando o número de experiências independentes considerado é de quatro ou seis.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1.Processo para a preparação de polimetileno-imi^ nas de fórmula geral na qual

a) X representa um grupo CH ou um átomo de azoto;

b) A representa um grupo polimetileno-imina de fórmula geral na qual

- B representa um heteroátomo de oxigénio ou enxofre ou um radical de fórmula geral NR’ na qual R' representa um átomo de hidrogénio ou um radical alquilo ou alcenilo contendo até 5 átomos de carbono; e q representa, um número inteiro compreendido entre 1 e 3;

c) R^, R2Z R3 e R^ iguais ou diferentes, representam, cada um:

- um átomo de hidrogénio;

- um radical alquilo comportando 1 a 6 átomos de carbono de cadeia linear ou ramificada, eventual mente substituído por um átomo de halogéneo, um ou vários radicais hidroxi ou um radical aminado de fórmula geral: -N(RgRg) na qual

R₅ e R_g, iguais ou diferentes, representam, cada um, um átomo de hidrogénio ou um radical alquilo comportando 1 a 6 átomos de carbono de cadeia linear ou ramificada; ou r₅ e Rg considerados em conjunto com o átomo de azoto a que estão ligados formam um heterociclo comportando 4 a 6· átomos de carbono e eventualmente um outro heteroátomo: oxigénio ou enxofre;

- um radical alquilo ou alcenilo contendo, cada um, 2 a 6· átomos de carbono? ou

- um radical cicloalquilo contendo 3 a 6 átomos de carbono; ou

- cada um dos pares R^, R₂ e/ou R^, R^ considerados em conjunto com o átomo de azoto a que estão ligados formam um heterociclo comportando 4 a 6· átomos de carbono e eventualmente um outro heteroátomo; oxigénio ou enxofre;

d) Z representa um radical hidrocarbonado comportando 1 a 5 átomos de carbono de cadeia linear ou ramificada;

e) R representa um átomo de hidrogénio, um radical alquilo comportando 1 a 5· átomos de carbono de cadeia linear ou ramificada, um radical alcenilo comportando 2 a 5 átomos de carbono de cadeia linear ou ramificada ou. um radical fenilo eventualmente substituído por (Y)_m ou (Y')_n;

f) Y e Y', iguais ou diferentes, representam, cada um, um átomo de hidrogénio ou de halogéneo ou um radical trifluorometilo ou alquilo ou al coxi comportando, cada um, 1 a 5· átomos de car bono?

g) m e n, iguais ou diferentes, representam, cada um, o número inteiro 1 ou 2;

dos diastereoisómeros e enantiómeros correspondentes e dos sais de adição com ãcidos apropriados, caracterizado pelo facto de se condensar:

quer uma polimetileno-imina de fórmula geral na qual

X, A, R-jy e têm os significados definidos antes, com um derivado de fórmula geral (III) na qual

Z, R, Y, Y', m e n têm os significados definidos antes; e

T representa um átomo de halogéneo tal· como por exemplo um átomo de cloro ou de bromo ou um resto tosiloxi, ) quer um derivado halogenado de fórmula geral na qual

X, Rp Rg, Rg e R^ têm os significados definidos antes, com uma polimetileno-imina de fórmula geral na qual

A, Z, R, Y, Y’, m e n têm os significados defini6 '4 {!' antes, e, eventualmente, de se tratar os derivados assim obtidos com ãci dos apropriados para se obter os sais de adição de ãcido correspondentes .
2.- Processo de acordo com a reivindicação 1, para a preparação de derivados de •-•fórmula geral I correspondendo mais éspecificamente à fórmula geral na qual

X, Z, R, R^, Rg, Rg, R₄, Y, Y', m e n têm os significados definidos antes; e

A’ representa um grupo polimetileno-imina de fórmula geral \_7 !

na qual q e R' têm os significados definidos antes, caracterizado pelo facto de se fazer reagir com cianoboro-hidreto de sódio uma mistura de:

- uma cetona de fórmula geral z⁸’

N (VI) na qual

X, R^, R₂, R^, r₄ e q têm os significados definidos antes,

- e de uma amina de fórmula geral na qual

R', 2, R, Y, Y', m e n têm os significados defini dos antes, q, eventualmente, de se tratar os derivados assim obtidos com áci dos apropriados para se obter os sais de adição de ácido correspondentes .