PT981600E - Microrganismos transformados com prioridades melhoradas - Google Patents

Description

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DESCRIÇÃO "MICRORGANISMOS TRANSFORMADOS COM PROPRIEDADES MELHORADAS"

Campo da Invenção A presente invenção refere-se à engenharia genética para a produção de microrganismos utilizados na biotecnologia para melhorar as suas propriedades de modo a que eles produzam produtos úteis mais eficientemente. Em particular a invenção refere-se ao aumento das produtividades de processos biotecnológicos e aos rendimentos dos seus produtos tais como o etanol ou os amino ácidos a partir de fontes do carbono e de azoto tais como a biomassa que compreende hexoses, pentoses ou os seus polímeros.

Antecedentes da Invenção A eficiência de muitos processos biotecnológicos é limitada pela necessidade de se produzirem organismos para equilibrar as suas reacções de redox metabólicas. Em particular, para cada um dos pares de nucleótido de piridina (NAD/NADH e NADP/NADPH) a taxa total de oxidação deve ser igual à taxa total de redução: de outra forma, os pares serão completamente convertidos em uma forma (por exemplo, todos na forma de NAD ou todos na forma de NADH) , e as reacções que requerem a outra forma tornar-se-ão infinitamente lentas, o que causa que a rede metabólica total das reacções seja distorcida de uma maneira indesejável (isto é, a de não fornecer de forma alguma o produto desejado).

Por exemplo, embora as leveduras de Saccharomyces cerevisiae e de 2

Schizosaccharomyces pombe sejam muito eficientes na conversão de hexoses em etanol e tenham muitas vantagens para este processo (tais como a tolerância de elevadas concentrações de etanol e de outras estirpes) elas são incapazes de fermentar a xilose em etanol. A xilose é um componente principal das plantas, e a incapacidade de convertê-las em etanol diminui a eficiência com a qual a biomassa renovável, tais como os desperdícios da agricultura, pode ser utilizada. No entanto, estas leveduras podem utilizar a xilulose. Algumas leveduras (por exemplo a Pichia stipitis) podem converter a xilose em etanol, embora não muito eficientemente, e conterem a reductase de xilose das enzimas (XR) e a desidrogenase do xilitol (XDH). Estes enzimas catalisam a redução sequencial da xilose em xilitol e a oxidação do xilitol em xilulose. As estirpes de S. cerevislae transformadas foram construídas que contêm a XR e a XDH heterológas, as quais possuem assim uma via para converter a xilose na xilulose fermentável (Kõtter e Ciriacy [1993]; Tantirungkij et al. [1994]; Walfridsson et al. [1995]). Embora estas estirpes pudessem utilizar a xilose para o crescimento e para a formação de xilitol, elas não produziram muito etanol. Todas as enzimas de XDH conhecidas são específicas para o NAD, enquanto que todas as enzimas de XR conhecidas são específicas quer para o NADPH ou têm uma preferência para o NADPH. Acredita-se (Bruinenberg et al. [1983]; Bruinenberg [1986]) que a conversão de xilose em xilulose por esta via resulta por conseguinte na coligação celular de NADPH a ser convertido em NADP e que a de NAD a ser convertido em NADH, depois do qual um metabolismo adicional de xilose é extremamente impedida. 0 NADH pode ser re-oxidisado sob condições aeróbicas, mas isto exige o controlo crítico de níveis de oxigénio para manter o metabolismo fermentatívo e a produção de etanol. Em contraste, as bactérias que fermentam a xilose em etanol contêm eficientemente a isomerase da 3 xilose e convertem directamente a xilose em xilulose sem as reacções da oxidação-redução. As tentativas para criar a levedura que pode eficientemente converter a xilose em etanol focalizaram-se na descoberta ou na engenharia de enzimas de XR ou de XDH com especificidade alterada da coenzima (Metzger e Hollenberg [1995]) ou em expressar o gene da isomerase da xilose na levedura. No entanto, todas as tentativas relatadas (ver, por exemplo, Amore et al. [1989]; Ho et al. [1983]; Sarthy et al. [1987]; Walfridsson et al. [1996]) para contruir boas estirpes que fermentam a xilose por expressarem os genes da isomerase da xilose bacterianos nas leveduras, falharam.

Como um segundo exemplo, um processo biotecnológico principal é a fermentação de açúcares de hexose em etanol através de levedura. A via glicolítica da glicose em etanol é o redox neutro, isto é a quantidade de NAD reduzido na formação de uma determinada quantidade de piruvato da glicose é exactamente a mesma que a quantidade de NADH oxidado na formação de etanol a partir da mesma quantidade de piruvato, e o NADP (H) não é directamente envolvido no processo. No entanto, o crescimento da levedura não é um processo neutro de redox; a formação de 100 g de matéria seca de levedura da glicose e da amónia é acompanhada pela produção liquida de 1,3 moles de NADH e de 0,9 moles de NADP (Oura [1972]). Este excesso de NADH é produzido principalmente por catabolismo que rende a energia, enquanto que o excesso de NADP é produzido principalmente por vias biossintéticas (ver Oura [1972]). Como outros organismos, a levedura tem os sistemas distintos de nucleótido da piridina (NAD (H) e NADP (H) ) que evoluiu para facilitar estes dois aspectos do metabolismo. O excesso de NADH produzido por se fermentar a levedura é reoxidisado em NAD principalmente através da desídrogenase de glicerol-3-fosfato, que 4 tem por resultado a produção de glicerol. Em fermentações de destilaria isto representa um desvio dissipador de 3 - 5 % da fonte de carbono (Oura [1977]). As tentativas para diminuir a proporção de glicerol para etanol produzidas durante as fermentações foram encontradas com pouco ou nenhum sucesso. Por exemplo, Bjõrkqvist et al. (1997) suprimiram cada um e ambos os genes que codificam a desidrogenase de glicerol-3-fosfato. No entanto, as leveduras a que faltam esta enzima não foram somente incapazes de crescer sob condições anaeróbicas, mas também pararam de fazer o etanol.

Um terceiro exemplo é a produção biotecnológica de amino ácidos. Os amino ácidos têm aplicações extensivas nas indústrias dos alimentos, da alimentação de animais, médicas e químicas. Os processos de fermentação foram desenvolvidos para produzir a maior parte dos amino ácidos que ocorrem nas proteínas. As vias metabólicas para os amino ácidos primeiramente convertem uma fonte do carbono tal como a glicose em intermediários tais como o 3-fosfoglicerato, o piruvato, o oxaloacetato ou o 2-oxoglutarato que são mais oxidados do que a glicose. A sua formação produz o NADH. A maior parte dos amino ácidos são mais reduzidos do que os intermediários, mas as reacções que conduzem a eles a partir dos intermediários produzem quase invariavelmente o NADP. Aparte da via da histidina, a qual é um produtor de NADPH líquido, e das vias para a glutamina, o glutamato, a tirosina e a fenilalanina, as quais nem sequer consomem nem produzem o NADPH, as biossínteses de todos os outros 15 amino ácidos de glicose produzem entre 1 e 8 moles de NADP por mole de amino ácido e produzem simultaneamente o NADH (Neidhardt et al. [1990]). Outras reacções são depois necessárias para oxidar o NADH e para reduzir o NADP com a finalidade de se conseguir um equilíbrio metabólico. Isto torna-se um factor principal com a produção de organismos tais como as 5

Corynebactería modificadas e/ou seleccionadas para produzir quantidades enormes de amino ácidos a uma escala comercial. Para dispor de excesso de NADH, as fermentações de amino ácidos são operadas sob condições aeróbicas, e o oxigénio é consumido em grandes quantidades. Para assegurar a formação máxima do produto, é essencial fornecer continuamente as quantidades adequadas de oxigénio, tipicamente na forma de ar enriquecido com oxigénio (Hirose [1986]). As deficiências de oxigénio, por exemplo, em fermentações de elevada densidade da célula ou nos casos em que o suplemento de oxigénio não é económico, resulta tipicamente em rendimentos mais baixos do produto e das produtividades, como parte da fonte de carbono é convertida em compostos tais como o succinato, o lactato ou ambos para se libertar o excesso de NADH.

Outros exemplos incluem a biossintese aumentada dos nucleótidos, dos lipidos e dos metabólitos secundários através de microrganismos modificados seleccionados ou projectados para produzirem estes compostos em escala industrial. Durante estes processos os microrganismos produzem geralmente o NADH e um intermediário metabólico central (tal como o piruvato) que é mais oxidisado do que a fonte de carbono e reduzem este intermediário ao produto desejado por se utilizar o NADPH. Mais uma vez, os microrganismos necessitam de oxidisar o excesso de NADH e de reduzir o excesso de NADP, e os rendimentos em fonte de carbono são diminuídos através das transformações metabólicas adicionais da fonte do carbono necessária para se conseguir o equilíbrio de redox.

Em todos estes exemplos, o excesso de NADH é reoxidisado quer pela respiração, que requer uma renovação de ar eficiente, ou através da formação de produtos colaterais não desejados, tais como o glicerol. A renovação de ar em grandes escalas industriais é cara, 6 e difícil de controlar exactamente. Em alguns processos, tais como a fermentação de xilose em etanol, a redução de excesso de NADP também causa problemas. As reacções bioquímicas importantes que regeneram o NADPH são a ramificação oxidativa da via do fosfato de pentose (PPP), isto é as reacções sucessivas da desidrogenase de glicose-6-fosfato e da desidrogenase de 6-fosfogluconato, e da desidrogenase do isocitrato ligado ao NADP. Ambas as reacções produzem C02. Em operações à escala industrial, isto representa tanto uma perda directa de fonte do carbono como uma poluição do ambiente. Além disso, o C02 também acidifica o meio de cultura, que necessita da utilização de quantidades maiores de agentes de neutralização para controlar o pH da fermentação, e tem um impacto significativo na fisiologia da célula em geral e na produção do amino ácido em particular. Por exemplo, o C02 inibe as enzimas na biosíntese da metionina e da purina e tem sido relatado para inibir a formação do produto em diversos processos de fermentação incluindo a produção de isoleucina, de inosina, de fumarato, de penicilina e de outros antibióticos e da biomassa de levedura (Hirose [1986]).

Um método geral para aliviar estes problemas sem utilizar a renovação de ar, a qual é cara e difícil de controlar a níveis óptimos, seria muito benéfico. Os benefícios potenciais incluem os rendimentos aumentados na fonte do carbono, a consumo diminuído de energia, as diminuições significativas na produção de C02 e a produtividade específica aumentada, o qual é particularmente importante nos processos que utilizam os microrganismos imobilizados.

Nas vias principais do metabolismo de carbono e de azoto é uma regra geral que a maior parte das vias catabólicas utilizem o par 7 da coenzima de NAD/NADH nos passos de oxidação-redução, enquanto que as reacções anabólicas, sintéticas utilizam mais frequentemente o par de NADP/NADPH. Embora os potenciais de redox (E'o) destes dois pares estejam ambos perto de -0,32 (Kaplan [1960]), as proporções das formas reduzida e oxidada dos dois pares são mantidas em níveis muito diferentes em células vivas. Por exemplo, na S. cerevisiae aeróbica, o NADH/NAD = 0,9 e o NADPH/NADP = 3,2 (Saez e Lagunas [1976]). A maior parte das desidrogenases do nucleótido da piridina têm uma especificidade marcada, muitas vezes quase absoluta, para um ou para o outro nucleótido da piridina. Algumas desidrogenases com o mesmo substrato ocorrem tanto como enzimas específicas de NAD e de NADP. Geralmente somente uma das enzimas está presente sob determinadas condições, ou as enzimas são expressas em diferentes compartimentos de células. Os bons exemplos são as desidrogenases do glutamato as quais são sujeitas a mecanismos de controlo complicados geralmente resultando em somente uma das enzimas a ser dominante sob qualquer condição de crescimento (por exemplo Courchesne e Magasanik [1988]; Coschigano et al. [1991]; Miller e Magasanik [1991]; Schure et al. [1995]; Dang et al. [1996]; Avendano et al. [1997]). A S. cerevisiae contém desidrogenases de isocitrato ligado a NAD e a NADP: o citosol (que é pensado como de um único compartimento) contém somente a enzima ligada a NADP e há uma outra enzima ligada a NADP nos peroxisomas enquanto que a mitocôndria (onde o espaço da matriz, da cristã e da intermembrana forma três sub-compartimentos) contém ambas as enzimas ligadas de NAD e de NADP (Minard et al. [1998]). As células são por conseguinte capazes de manter as proporções de NADH/NAD muito mais baixas do que as proporções de NADPH/NADP, porque as reacções que transferem equivalentes de redução entre os dois sistemas (e assim 8 tenderiam a equilibrá-los) são restritas. Algumas células de bactérias e de animais contêm as trans-hidrogenases de NAD (P) (EC 1.6.1.1. e 1.6.1.2). As trans-hidrogenases são muitas vezes enzimas ligadas por membrana com várias subunidades as quais estão ligadas à produção de energia melhor do que ao equilíbrio dos sistemas do nucleótido da piridina. Para as finalidades deste pedido de patente, o termo "desidrogenases" não inclui as trans-hidrogenases de EC 1.6.1.1 e 1.6.1.2. Muitos organismos de produção utilizados na biotecnologia, tais como a S. cerevisiae e a Corynebacteria não contêm as trans-hidrogenases de NAD (P), e assim parecem ser incapazes de converter o NADH mais o NADP directamente em NAD mais NADPH e vice versa. A existência de dois sistemas do nucleótido da piridina e a ausência de processos não regulados que os equilibrem, sugere que o crescimento e a reprodução eficientes de organismos vivos presentemente desenvolvidos requerem dois sistemas distintos. A razão pode ser a de que uma proporção elevada de NADPH/NADP é necessária para dirigir as reacções biosintéticas, enquanto que uma proporção mais baixa de NADH/NAD é melhor adequada para a geração da energia por vias tais como a glicólíse e o ciclo do ácido tricarboxílico (Metzler [1977]).

Boles et al. (1993) estudou um mutante de S. cerevisiae a que falta a fosfoglucoisomerase, a enzima que interconverte a glicose-6-fosfato (Glc6P) e a fructose-6-fosfato (Fru6P). Esta estirpe (um mutante de apagamento do pgil) é incapaz de crescer em qualquer hexose ou pentose, embora possa crescer em determinadas misturas de fructose e de glicose (por exemplo 2 % de fructose mais 0,1 % de glicose). Os autores verificaram que a transformação do mutante com um banco genómico preparado a partir do próprio mutante resultou em 9 determinados transformantes que foram capazes de crescer na glicose sozinha, embora 3 a 4 vezes mais lentamente do que o tipo selvagem, e contiveram os plasmídeos que compreendem o gene de GDH2. Este gene codifica uma desidrogenase de glutamato ligada a NAD. Os autores debateram que a presença simultânea de actividades substanciais de ambas as desidrogenases de glutamato ligadas a NADP e a NAD permitiu ao mutante de apagamento de pgil crescer em glicose pela sua metabolisação através do PPP e por se converter o NADPH resultante em NADH, o qual poderia depois ser re-oxidisado através de mitocôndria funcional. Assim, estes mutantes foram propostos para converter o NAD mais NADPH em NADH mais o NADP, a qual é a transformação oposta àquela requerida dos microrganismos de produção industrial (ver em cima). Além disso, a sua capacidade de sobreviver na glicose foi estritamente dependente da presença de mitocôndria funcional e de oxigénio e foram incapazes de fermentar os açúcares em etanol (Boles et al. [1993]).

Sumário da Invenção

De acordo com a presente invenção um microrganismo tal como um fungo ou uma bactéria é transformado pelo menos com uma molécula de ADN recombinante que codifica ou de outra maneira causa a expressão de pelo menos uma enzima que causa o acoplamento funcional da oxidação e da redução dos substratos por duas reacções de desidrogenase ligadas ao nucleótido de piridina com especificidades diferentes para os pares da coenzima de NAD/NADH e de NADP/NADPH e assim facilitar a transferência dos electrões entre os dois pares da coenzima através dos referidos substratos. A enzima ou as enzimas podem assim ser um ou mais membros de um par de desidrogenases ligadas ao nucleótido de piridina que têm pelo menos um substrato comum mas diferentes especificidades do nucleótido de 10 piridina. Os processos biotecnológicos em que uma oxidação líquida de um par de coenzima do nucleótido de piridina ocorre em conjunto com uma redução líquida do outro são levados a cabo mais eficientemente através do microrganismo transformado de acordo com a invenção do que através do microrganismo não transformado correspondente, e a renovação de ar de tais processos pode ser diminuída e tornada mais flexível. Estes processos incluem a fermentação de hidrato de carbono em etanol por se fazer crescer os microrganismos, a fermentação de xilose para produtos úteis e a produção comercial de amino ácidos, de nucleótidos, de lípidos e de metabólitos secundários através do microrganismos.

Os microrganismos preferíveis para as finalidades desta invenção são as leveduras, os fungos filamentosos e as bactérias. As leveduras preferíveis pertencem ao género de Saccharomyces, e são especialmente estirpes das espécies de Saccharomyces cerevisiae; os géneros de Schizosaccharomyces, e são especialmente estirpes das espécies de Schizosaccharomyces pomhe; e do género de Pichia, e são especialmente estirpes das espécies de Pichia stipítis, assim como de Candida spp. ou de Pachysolen spp. Os fungos filamentosos úteis incluem por exemplo Trichoderma, Aspergillus, Neurospora, Fusarium, Paecilomyces e Penicillium. Os géneros de bactérias particularmente apropriados incluem a Corynebacteria, especialmente as estirpes de Corynebacterium glutamicum, assim como as Brevibacteria, tais como a Brevibacterium flavum e a B. lactofermentum.

Breve Descrição dos Desenhos

Figura 1. O mapa genético de pAOS66 com os genes, as cassetes de expressão e os locais de restrição relevantes indicados. 11

Figura 2. 0 alinhamento da sequência do amino ácido deduzida a partir de uma sequência parcial do gene que codifica a enzima málica de Aspergillus nidulans com algumas enzimas málicas conhecidas. Os números da base de dados (SwissProt) í para as enzimas málicas conhecidas são: P23368 (enzima málica humana), P40375 (enzima málica de S. pombe) , P36013 (enzima málica de S. cerevisiae). A sequência parcial do gene que codifica a enzima málica de Trichoderma reesei foi obtida em VTT, Pesquisa Alimentar e Biotecnologia. Os amino ácidos idênticos pelo menos em três das sequências são sombreados a cinzento.

Figura 3. As fermentações de xilose com a estirpe recombinante de Saccharomyces cerevisiae que expressam o GDH2 (H1803, símbolos fechados) e a estirpe de controlo (H1805, símbolos abertos): comparação de taxas de utilização da xilose e de crescimento.

Figura 4. As fermentações de xilose com a estirpe recombinante de Saccharomyces cerevisiae que expressam o GDH2 (H1803, símbolos fechados) e a estirpe de controlo (H1805, símbolos abertos): comparação de taxas de produção do xilitol e do etanol.

Figura 5. As fermentações de xilose com a estirpe recombinante de Saccharomyces cerevisiae que expressam o GDH2 (H1803, de linha contínua) e a estirpe de controlo (H1805, de linha pontilhada): comparação de taxas de evolução do dióxido de carbono.

Figura 6. As actividades enzimáticas específicas da desidrogenase do glutamato de NADP (NADP-GDH) e da desidrogenase do glutamato de NAD (NAD-GDH) para as estirpes H1805 (controlo) e H1803 em pontos de tempo de 26 e de 96 horas. 12

Figura 7. As fermentações de glicose com a estirpe recombinante de Saccharomyces cerevisiae que expressa o GDH2 (H1791, de linha continua) e a estirpe de controlo (H1793, linha pontilhada): comparação das taxas de evolução do dióxido de carbono.

Figura 8. Os perfis da biomassa para as fermentações do grupo de xilose da estirpe recombinante de Saccharomyces cerevisiae que expressa ο MAE1 (H2195) e da estirpe de controlo (H2191).

Figura 9. As taxas metabólicas especificas totais (C-mmol/g-célula h) das fermentações do grupo da estirpe recombinante de Saccharomyces cerevisiae que expressa ο MAE1 (H2195) e da estirpe do controlo (H2191).

Figura 10. Os perfis de tempo para a produção de etanol de xilose em fermentações do grupo da estirpe recombinante de Saccharomyces cerevisiae que expressa ο MAE1 (H2222) e da estirpe do controlo (H2221). As concentrações de etanol são normalizadas com níveis correspondentes da biomassa.

Figura 11. As taxas metabólicas específicas totais (C-mmol/g de célula h) das fermentações do grupo da estirpe recombinante de Saccharomyces cerevisiae que expressa ο MAE1 (H2222) e da estirpe de controlo (H2221).

Figura 12. Os perfis de tempo da biomassa para as fermentações do grupo de xilose da estirpe recombinante de Saccharomyces cerevisiae que expressa ο MAE1 (H2222) e da estirpe de controlo (H2221).

Figura 13. Os perfis da biomassa para as fermentações do grupo de xilose da estirpe recombinante de H2369 de Schizosaccharomyces 13 pombe que expressa a enzima málica, e da estirpe H2370 de controlo.

Figura 14. Os perfis de tempo para a produção de etanol volumétrico de xilose na estirpe recombinante de H2369 de Schizosaccharomyces pombe que expressa a enzima málica, e da estirpe H2370 de controlo.

Figura 15. A separação de produtos de digestão de BamHI dos vectores dos transformantes de Corynebacteríum descritos no exemplo 21. Linha 1: digestão do vector do transformante de ATCC 21253, Linha 2: Não relevante para esta experiência, Linha 3: digestão do vector do transformante de ATCC 21799 (VTT E-992103).

Descrição Detalhada da Invenção 0 ensinamento central da presente invenção é um método para aumentar os processos biotecnológicos por se transformarem os microrganismos de produção com os genes para as enzimas que tendem a equilibrar os dois sistemas do nucleótido de piridina que coexistem em células vivas. Surpreendentemente, embora as células tenham evoluido em dois sistemas distintos do nucleótido de piridina, os quais são mantidos em potenciais de redox distintos, e tais reacções de equilíbrio sejam aparentemente proibidas em células naturalmente desenvolvidas, é agora divulgado que estas reacções promovem as vias metabólicas desejadas para a formação do produto através dos microrganismos projectados ou seleccionados utilizados em muitos processos biotecnológicos, e desse modo beneficiam aqueles processos.

Na sua primeira forma de realização a presente invenção fornece um microrganismo o qual é transformado pelo menos com uma molécula de ADN recombinante que codifica ou de outra maneira causa a expressão 14 pelo menos de um par das desidrogenases com especificidades da coenzima opostas para o NAD/NADH eo NADP/NADPH mas pelo menos um substrato comum (S nas equações (1) e (2)) de tal maneira que ambos os membros do par são simultaneamente expressos no mesmo compartimento subcelular, de um modo preferido o citosol. Isto resulta num acoplamento funcional das reacções que catalisam as desidrogenases (1) e (2). Não é uma parte necessária da invenção, mas também não é excluída, que as duas desidrogenases se devem associar fisicamente dentro da célula transformada. O acoplamento funcional permite que as reacções seguintes ocorram, as quais tendem a equilibrar os pares da coenzima de NAD/NADH e de NADP/NADPH:

(1) NADP + SH2 « S + NADPH

(2) S + NADH « SH2 + NAD A operação simultânea das reacções (1) e (2) pode ser esperada prosseguir até que as proporções de NAD/NADH e de NADP/NADPH sejam quase idênticas, porque os potenciais de redox dos dois pares são muito semelhantes. No entanto, os inventores mostram aqui que quando os microrganismos de produção são transformados desta maneira, a eficiência com a qual a matéria prima é convertida em produtos úteis e os rendimentos dos produtos na biomassa são substancialmente aumentados.

Deve ser notado que a tendência para equilibrar os dois pares do nucleótido de piridina trazido pelas reacções (1) e (2) (e também pelas reacções (3) a (5), (6) a (8) e (11) a (12) a seguir) é causada pela transferência dos electrões através dos substratos das desidrogenases ligadas ao nucleótido de piridina (o SH2 nas reacções (1) e (2) e nas reacções (3) a (5), o malato nas reacções (6) a (8) e o glutamato nas reacções (11) e (12)). Isto distingue a 15 presente invenção dos sistemas em que os electrões são transferidos de NAD (P) H para NAD (P) pelas assim chamadas trans-hidrogenases (por exemplo, EC 1.6.1.1 e 1.6.1.2). Kojima et al. (1996: EP 0 733 712 Al) descreveram um sistema em que a trans-hidrogenase pode ser utilizada em determinadas bactérias como um meio para converter o NADH gerado através do ciclo de TCA em NADPH.

Diversos pares das desidrogenases são conhecidos os quais compartilham de substratos comuns mas têm especificidades do nucleótido de piridina diferentes. Por exemplo, existem ambas as formas ligadas de NAD e de NADP da desidrogenase do glutamato (EC 1.4.1.2 e 1.4.1.4), da desidrogenase do isocitrato (EC 1.1.1.41 e 1.1.1.42), da desidrogenase de aldeído (EC 1.2.13 e 1.2.1.4), da desidrogenase do álcool (EC 1.1.1.1 e 1.1.1.2), da desidrogenase do malato (EC 1.1.137 e 1.1.1.82), da desidrogenase de glicerol-3-fosfato (EC 1.1.1.8 e 1.1.1.94), da desidrogenase de xilose-1 (EC 1.1.1.175 e 1.1.1.179), da desidrogenase de gliceraldeído-3-fosfato (EC 1.2.1.12 e 1.2.1.13), da reductase do orotato (EC 13.1.14 e 13.1.15) e da reductase da ferredoxina (EC 1.18.1.2 e 1.18.13) mas qualquer par apropriado das desidrogenases pode ser utilizado. Muitas desidrogenases são conhecidas que (ver por exemplo a Nomenclatura da Enzima 1992, Academic Press Inc.) e as suas propriedades podem ser encontradas a partir da literatura ou determinadas por ensaios espectrofotométricos simples (ver, por exemplo Bergmeyer [1974]). Além das enzimas que naturalmente ocorrem com as especificidades do nucleótido de piridina desejadas, a invenção inclui também a utilização de enzimas geneticamente projectadas com especificidades do nucleótido de piridina alteradas. Como um exemplo de mudanças de especificidade do cofactor, ver por exemplo Chen et al. (1994) e Chen et al. (1997). 16

As actividades catalíticas responsáveis para as reacções (1) e (2) podem ocorrer na mesma proteína polimérica ou mesmo numa única cadeia do polipéptido ou serem combinadas numa tal proteína polimérica ou numa única cadeia do polipéptido, por exemplo através de engenharia genética. A invenção também pode ser realizada por se expressar em excesso uma desidrogenase que opera eficazmente com ambos os sistemas do nucleótido de piridina. As desidrogenases que aceitam ambos os nucleótidos de piridina são conhecidas e incluem isozimas da desidrogenase do glutamato (EC 1.4.1.3), da desidrogenase do aldeído (EC 1.2.1.5) e da desidrogenase do álcool (EC 1.1.1.71). Pouco é conhecido sobre como as suas actividades são reguladas in vivo de modo a que não perturbem as concentrações de nucleótidos de piridina.

Na sua segunda forma de realização a invenção fornece um microrganismo o qual é transformado pelo menos com uma molécula de ADN recombinante que codifica ou de outra maneira que causa a expressão de pelo menos uma enzima que catalisa pelo menos um passo de uma série cíclica das reacções em que o NADP é reduzido a NADPH e o NADH é oxidado ao NAD, ou vice versa. As reacções (3) a (5) mostram um tal ciclo: (3) NADP + SH2 *-* S + NADPH (4) S + X Z 4· Y (5) NADH + Z - sh2 + NAD No sentido escrito, as reacções (3) a (5) convertem o NADP mais o NADH em NADPH mais o NAD, e no sentido oposto elas levam a cabo a transformação oposta. As reacções que catalisam as enzimas (3) e (5) são mais uma vez um par de desidrogenases com um substrato comum (SH2 5 mas as especificidades da coenzima opostas, como na 17 primeira forma de realização da invenção, mas agora os produtos de reacção (S e Z) são diferentes. Para as finalidades desta invenção, a reacção (4) pode ser uma série de passos em vez de um único passo, desde que somente o S seja convertido em Z sem uma mudança liquida em NAD ou em NADP. Assim, esta série de reacções tende também a equilibrar os pares de NAD/NADH e de NADP/NADPH da mesma maneira que as reacções (1) e (2) , excepto o facto de estes serem agora acoplados à transformação de X » Y. Assim, em equilíbrio não é necessariamente o caso de que as proporções de NAD/NADH e de NADP/NADPH sejam quase iguais: em vez disso vão também depender do equilíbrio entre X e Y. Um exemplo desta forma de realização da invenção é fornecido pela enzima málica, pela carboxilase do piruvato e pela desidrogenase do malato, que catalisam as seguintes reacções:

(6) enzima málica: malato + NADP C02 + NADPH (7) carboxilase de piruvato: piruvato + C02 + ATP -» oxaloacetato + ADP + Pi

(8) desidrogenase de malato: oxaloacetato + NADH «· malato + NAD

Nas reacções (6) a (8), o piruvato + C02 correspondem a S nas reacções (3) a (5), o oxaloacetato corresponde a Z e o ATP e o ADP + Pi, respectivamente, correspondem a X e Y.

Nas reacções (3) a (5) o substrato reduzido, SH2, é comum às duas desidrogenases. A invenção também pode ser praticada por se transformar um microrganismo com uma ou mais enzimas para criar uma série cíclica de reacções (3') a (5') nas quais a forma oxidada do substrato é comum às duas desidrogenases:

NADH + S «· SH2 + NAD (3' ) 18 (4 ' ) SH2 + X' «. ZH2 + Y'

(5 ' ) NADP + ZH2 « S + NADPH

Mais uma vez, para as finalidades desta invenção a reacção (4') pode ser uma série de passos em vez de um único passo, desde que somente o SH2 seja convertido em ZH2 sem uma mudança liquida em NAD ou em NADP.

Além disso, é agora uma extensão óbvia da invenção a de combinar os esquemas cíclicos (3’ ) 3 (5) e (3') a (5 ') para que nem a forma oxidada nem a reduzida dos substratos sejam comuns às duas desidrogenases, mas as formas oxidadas dos substratos das desidrogenases podem ser interconvertidas através de reacções sem nenhuma modificação de redox líquida e assim podem as formas reduzidas:

(3") NADP + SH2 «. S + NADPH

(4") ZH2 + Y' « X' + SH2 S + X «. Y + Z

(5") NADH + Z ~ ZH2 + NAD

Assim, na sua forma mais geral a invenção consiste em transformar um microrganismo com uma expressão que causa o gene de pelo menos uma enzima que catalisa uma das reacções (3") a (5") para que todas estas reacções possam ocorrer no mesmo compartimento da célula. Quando as reacções ocorrem da esquerda para a direita como escrito em cima, os equivalentes de redução são transferidos de NADH através de ZH2 e de SH2 para NADP, reduzindo-os a NADPH. Quando as reacções ocorrem da direita para a esquerda, o NADH é formado à custa de NADPH.

Também nesta forma de realização da invenção, é visado que uma 19 enzima geneticamente projectada com especificidades de coenzima modificadas pode ser utilizada.

No primeiro aspecto especifico da invenção, o microrganismo hospedeiro transporta uma enzima de XR a qual de um modo preferido utiliza o NADPH, e uma enzima de XDH a qual de um modo preferido utiliza o NAD. 0 microrganismo hospedeiro pode converter a xilose em xilulose através destas enzimas, mas como descrito em cima, este processo é ineficiente e os rendimentos de etanol em xilose são baixos ou nulos. Um exemplo deste aspecto da invenção é fornecido no Exemplo 8. Uma estirpe projectada de S. cerevisiae que transporta os genes para XR e XDH, e a xiluloquinase (XK) , é transformada com um plasmideo de multicópia que transporta o gene do GDH2 que codifica a desidrogenase do glutamato dependente de NAD de S. cerevisiae, e de um gene marcador. Os transf ormantes são seleccionados por meio do gene marcador. Os transformantes fermentam a xilose em etanol mais eficientemente do que a levedura hospedeira não transformada, em particular com um rendimento mais elevado de etanol em xilose, ou menor produção de CO2 ou ambos. Dependendo das condições do processo escolhido, a eficiência melhorada também pode ser realizada de outras formas tal como uma produtividade de volume aumentada ou uma taxa especifica aumentada. A taxa especifica aumentada é especialmente significativa em processos que utilizam microrganismos imobilizados, em que há um limite superior para a quantidade da biomassa que pode ser mantida pelo material de transporte. A eficiência aumentada pode ser explicada através da seguinte sequência de reacções:

(9) xilose + NADPH - xilitol + NADP

(10) xilitol + NAD -» xilulose + NADH

(11) NADH + 2-oxoglutarato + NH3 -*· glutamato + NAD 20 (12) NADP + glutamato -> 2-oxoglutarato + NH3 + NADPH SOMA: xilose -* xilulose

Assim, o desequilíbrio de redox é evitado, e uma conversão sem dificuldades de xilose em xilulose pode ter lugar. O fluxo através das reacções de descarboxilação, tais como o G6PDH e a desidrogenase de isocitrato para regenerar o NADPH é reduzido, com a produção de CO2 reduzida, e a fermentação ocorre eficientemente, e sem renovação do ar. Um tanto surpreendentemente, a produção de xilitol também foi aumentada em cerca de 25 % na estirpe transformada de acordo com a invenção com o GDH2 por comparação com a estirpe de controlo. Este aumento em xilitol é debatido a seguir.

Neste exemplo, o microrganismo hospedeiro já tinha sido transformado com genes que codificam o XR, o XDH e o XK. Não é uma exigência da invenção que o organismo hospedeiro seja ele próprio um transformante. É notável que a invenção causa um aumento substancial nos rendimentos de etanol com o microrganismo hospedeiro do Exemplo 8, porque o XR neste hospedeiro é a enzima de P. stipitis, a qual é capaz de trabalhar com o NAD (H) embora tenha uma preferência para o NADP (H) (Verduyn et ai. [1985]). Assim, este aspecto da invenção é realizado até com um XR que pode utilizar o NADH. Um efeito mais substancial pode ocorrer quando o organismo hospedeiro contém um XR com uma especificidade mais elevada para o NADP (H) , tal como quando o suporte de leitura aberto de S. cerevisiae, XHR 104w, que codifica a actividade de XR é altamente expresso. Além disso, foi reivindicado que a transformação de leveduras com um gene que codifica o XK melhora a eficiência com a qual eles fermentam a xilose em etanol (Ho e Tsao, WO 95/13362). É notável que a presente invenção causa uma fermentação melhorada de xilose em etanol mesmo quando o organismo 21 hospedeiro contém níveis elevados de XK. No entanto, a invenção fornece a fermentação melhorada de xilose em etanol também em organismos hospedeiros que não foram transformados com um gene que codifica o XK. É agora conhecido que as leveduras tais como a S. cerevisiae e a Schiz. pombe contêm genes homólogos que codificam o XDH, o XK e o XR (S. cerevisiae) . A capacidade de uma levedura hospedeira que não contém nenhum gene heterólogo para o XR, o XDH ou o XK para fermentar a xilose em etanol também pode ser utilmente aumentada através da transformação de acordo com a presente invenção. Várias enzimas, incluindo as isomerases e as epimerases, são conhecidas que interconvertem os diferentes açúcares de pentose e os diferentes fosfatos de pentose. Será entendido por um especialista na técnica que a presente invenção fornece um método geral para melhorar a eficiência da produção de etanol, não só a partir de xilose mas também a partir de outras pentoses.

Será entendido por um especialista na técnica que os efeitos benéficos semelhantes podem ser obtidos por se utilizarem outros pares de desidrogenases de acordo com a primeira forma de realização da invenção descrita em cima. Por exemplo, em vez de transformar a S. cerevisiae com o GDH2 para que ambas as desidrogenases de glutamato ligadas por NAD e NADP sejam apropriadamente expressas no citosol, o mesmo efeito pode ser conseguido por se transformar a levedura com um ou ambos os membros de um outro par de desidrogenases que compartilham os mesmos substratos mas utilizam diferentes nucleótidos de piridina, com a condição de que ambas das enzimas sejam reversíveis, ou pelo menos que elas catalisem as reacções nas direcções mostradas nas equações (11) e (12). Por exemplo, a maior parte das desidrogenases de 22 isocitrato ligadas por NAD são enzimas alostéricas que não podem catalisar a carboxilação reductiva de 2-oxoglutarato (que corresponde à reacção (11)), mas só a descarboxilação oxidativa de isocitrato, e por isso, seriam impróprias para este aspecto da presente invenção. No entanto, vários outros pares de desidrogenases podem ser utilizados, incluindo as desidrogenases de álcool e de aldeído. A informação apropriada pode ser obtida a partir da literatura ou rapidamente determinada através de teste com ensaios espectrofotométricos simples. As actividades das desidrogenases podem ser facilmente medidas em ambas as direcções, com a condição de que sejam reversíveis, por se seguir o aparecimento ou o desaparecimento de NAD (P) H na presença dos substratos apropriados para determinar se as enzimas candidatas catalisam as reacções necessárias para aliviar o desequilíbrio da coenzima.

De acordo com a segunda forma de realização da presente invenção, os efeitos benéficos semelhantes podem ser obtidos por se transformar a S. cerevisiae com uma molécula de ADN recombinante que codifica uma enzima málica liagada a NAD (P) . A S. cerevisiae já contém carboxilase de piruvato e desidrogenase de malato. A levedura pode catalisar agora as reacções (6) a (8) como se mostra em cima, resultando na conversão de NADP mais NADH em NADPH mais NAD. 0 exemplo 14 ilustra os efeitos benéficos desta transformação. Em comparação com a estirpe de controlo, a estirpe que expressa em excesso o gene para a enzima málica apresentou uma taxa específica maior do que 55 % de utilização de xilose e taxas específicas maiores do que 20 % e 25 % da formação de etanol e de xilitol.

As taxas aumentadas da formação de xilitol observadas nos Exemplos 8 e 14 por estirpes construídas de acordo com a primeira e a 23 segunda formas de realização da invenção foram inesperadas, porque estas estirpes particulares contiveram também o XDH e o XK heterólogos. O XDH e o XK são conhecidos para assistirem à conversão de xilose em etanol, portanto estas estirpes foram um bom teste para mostrar que a presente invenção pode melhorar além disso a fermentação de xilose para etanol em condições realistas. Espera-se que o XDH e o XK facilitem a conversão de xilitol derivado de xilose para xilulose-5-fosfato, portanto é significativo que mesmo na presença destas duas enzimas, a transformação de acordo com a presente invenção aumentou a retenção de xilose em mais do que aumentou a produção de etanol, aparecendo a diferença como um aumento na produção de xilitol. O xilitol é um produto atractivo, quer por si mesmo ou em conjunto com o etanol. A transformação de acordo com a invenção de estirpes que não contêm o XDH e o XK heterólogos é esperada para fornecer pelo menos tão bons melhoramentos na produção de xilitol como os conseguidos nos Exemplos 8 e 14.

As leveduras e outros microrganismos produzem outros pentitóis, em particular o arabitol e o ribitol, bem como o xilitol. Estes podem ser produzidos a partir de outras pentoses naturais (por exemplo a arabinose) que ocorrem em matérias primas, ou através de interconversões metabólicas de pentitóis que muitas vezes procedem através de reacções de desidrogenase com a diferenciada especificidade das coenzimas (ver, por exemplo, Chiang e Knight [1960]). Em qualquer caso, os problemas de equilíbrio de redox semelhantes ocorrem como os descritos em cima, e as produtividades e os rendimentos melhorados podem ser obtidos através da prática da presente invenção.

Será entendido por um especialista familiarizado com a técnica que 24 devido ao facto de se explorarem princípios bioquímicos fundamentais, a presente invenção tem uma aplicação muito vasta e pode ser praticada em outros microrganismos bem como a S. cerevisiae. 0 exemplo 18 ilustra que a transformação de Schiz. pombe com o gene que codifica a enzima málica de acordo com a invenção melhora a eficiência da fermentação de xilose em etanol. As produtividades volumétrica e específica foram significativamente aumentadas também com este microrganismo, e de forma importante foram capazes de manter a sua biomassa e a capacidade metabólica nas condições do processo, ao passo que a biomassa da estirpe de controlo diminuiu relativamente rapidamente.

Em outro aspecto específico da invenção, o microrganismo hospedeiro fermenta os açúcares de hexose em etanol. Como o microrganismo cresce durante a fermentação ele produz excessos tanto de NADH como de NADP (Oura, [1972]). Com o microrganismo não transformado, a produção de etanol é acompanhada pela produção de glicerol, a qual é necessária para reoxidar o excesso de NADH, e pela produção de mais do que um mole de CO2 por mole de etanol, o qual é necessário para reduzir o excesso de NADP. Estas reacções reduzem o rendimento de etanol no carboidrato fermentável. Com o microrganismo transformado, o rendimento de etanol no carboidrato fermentável é aumentado em comparação com aquele do microrganismo não transformado. As ilustrações deste aspecto da invenção são fornecidas nos Exemplos 9 e 13.

No Exemplo 9 a levedura de S. cerevisiae é transformada com um plasmídeo de multicópia que compreende o gene de GDH2 que codifica a desidrogenase de glutamato dependente de NAD de S. cerevisiae e um gene marcador. Os transformantes são seleccionados por meio do gene marcador. Os transformantes fermentam a glicose em etanol com 25 a eficiência melhorada em particular um rendimento melhorado de etanol em carboidratos fermentáveis e com a produção reduzida de alguns produtos colaterais não desejados, incluindo o C02 · Dependendo das condições de processo escolhidas, a eficiência melhorada também pode ser realizada de outras formas, tal como uma produtividade de volume aumentada ou uma taxa específica aumentada. Isto pode ser explicado através da sequência seguinte de reacções que convertem as partes substanciais do excesso de NADH e de NADP em NAD e NADPH sem consumo não desejado de açúcares fermentáveis:

NADH + 2-oxoglutarato + NH3 -» glutamato + NAD

NADP + glutamato -» 2-oxoglutarato + NH3 + NADPH

No Exemplo 13, a S. cerevisíae é transformada com um gene que codifica a enzima málica de acordo com a segunda forma de realização da invenção. As vantagens significativas são conseguidas, incluindo mais uma vez a produção reduzida (indesejada) da biomassa e a taxa especifica aumentada da produção de etanol.

Será entendido por um especialista na técnica que os efeitos benéficos semelhantes na fermentação de hexose em etanol podem ser obtidos por se utilizarem outros pares de desidrogenases de acordo com a primeira forma de realização da invenção divulgada em cima ou por se utilizarem outras enzimas apropriadas de acordo com a segunda forma de realização da invenção e que a invenção pode ser praticada com outros microrganismos assim como com a 5. cerevisiae. É uma parte significativa da invenção que a mesma transformação que aumenta a eficiência da fermentação de xilose em etanol (Exemplos 8, 14 e 18) também aumenta a eficiência da fermentação de hexose em 26 etanol (Exemplos 9 e 13). Assim, a invenção fornece simultaneamente a utilização melhorada tanto da glicose como da xilose, as quais são açúcares principais derivados de muitas biomassas renováveis, tais como materiais agrícolas e florestais e resíduos urbanos.

Para a produção industrial de etanol, a presente invenção é de um modo preferido praticada por se utilizar uma estirpe industrial, por exemplo uma levedura de destilação ou de cerveja, ou uma levedura de vinho, ou uma estirpe de Schiz. pombe utilizada para produção de rum. Os métodos para transformar leveduras industriais, as quais são muitas vezes poliplóides e que precisam de marcadores auxotróficos são bem conhecidos. Uma primeira revisão de tais métodos foi feita por Knowles e Tubb (1987) . A estirpe industrial transformada de acordo com a invenção é depois utilizada por exemplo no mesmo processo de fermentação industrial que a estirpe não transformada e fornece as vantagens reveladas em cima, tais como o rendimento aumentado, a produtividade aumentada e os produtos colaterais indesejáveis reduzidos. Em comparação com a estirpe não transformada, a estirpe transformada também pode ser utilizada vantajosamente para a fermentação económica de uma variedade mais ampla de matérias primas, tais como matérias primas com elevados níveis de pentoses, polímeros de pentose ou ambos.

Num terceiro aspecto específico da invenção um microrganismo que produz em excesso um amino ácido tal como a alanina, valina, leucina, isoleucina, serina, treonina, lisina, arginina, triptofano, cisteina, metionina ou prolina é transformado pelo menos com uma molécula de ADN recombinante que codifica pelo menos um de um par de desidrogenases com especificidades de nucleótido de piridina contrárias (isto é, de acordo com a primeira forma de realização da invenção) , ou pelo menos com uma molécula de ADN 27 recombinante que codifica pelo menos uma enzima que catalisa pelo menos um passo de uma série ciclica de reacções nas quais o NADP é reduzido a NADPH e o NADH é oxidado a NAD de acordo com as reacções (3) a (5), (3'} a (5' ) ou (3") a (5") (isto é de acordo com a segunda forma de realização da invenção). 0 microrganismo transformado pode produzir o amino ácido desejado com a eficiência melhorada, em particular com o rendimento aumentado na fonte de carbono, com a produtividade aumentada, com uma exigência reduzida de renovação de ar, com a produção reduzida de dióxido de carbono ou com vários destes benefícios.

Por exemplo, a lisina é presentemente produzida através de processos de fermentação microbianos que são principalmente baseados em várias Corynebacteria, tais como Co rynebacter íum glutamicum e Brevibacterium flavum. As técnicas genéticas para estas bactérias são bem desenvolvidas (ver, por exemplo, Follettie et al. [1991]; Follettie e Sinskey [1986]; Jetten et al. [1994]; Jetten e Sinskey [1995]) e os vectores de ADN estão disponíveis para a transformação destes organismos de produção eficientemente quer através de plasmídeos de multicópia ou através de integração cromossómica. Por exemplo, os vectores disponíveis incluem o pAJ655, pAJ1844 e o pCGll para utilização com a C. glutamicum, Brevibacterium spp., e Escherichía coli ou o vector do plasmídeo de pAJ440 para a utilização em Bacillus subtilis, Brevibacterium spp., e C. glutamicum, ou o vector do plasmídeo de pMS2 para a utilização em Rhodococcus spp., Corynebacteríum spp., e E. coli. Os efeitos de transformação de estirpes que produzem a lisina de acordo com a presente invenção podem ser realizados em estirpes tais como ATCC 31269, ATCC 21253, ATCC 21800, ATCC 21801 ou ATCC 21086 ou em outras estirpes que produzem um excesso de lisina ou outros amino ácidos e são utilizadas industrialmente. 28

Este aspecto da invenção é ilustrado nos Exemplos 19 a 23. A Corynebacterium glutamicum foi transformada com um gene de Peptostreptococcus asaccharolyticus que codifica uma desidrogenase de glutamato dependente de NAD. A Co rynebacterium glutamicum transformada mostra a actividade da desidrogenase de glutamato ligada a NAD, e este organismo naturalmente possui actividade de desidrogenase de glutamato ligada a NADP. 0 organismo transformado, por isso, possui um par de desidrogenase de acordo com a primeira forma de realização da invenção que pode converter o NADP mais NADH em NAD mais NADPH. Diferentemente de algumas bactérias, a Corynebacterium glutamicum não contém trans-hidrogenase de NADP/NADH, portanto a operação sequencial das duas desidrogenases de glutamato fornece a bactéria com os novos meios para equilibrar os pares de coenzima de NAD/NADH e de NADP/NADPH. É bem conhecido que a síntese da lísina (e a maior parte de outros amino ácidos) produz o NADP, e que quando a lisina é produzida em excesso em grandes quantidades a exigência para a redução de NADP para NADPH pode limitar a produção de amino ácido. É também conhecido que nas condições de cultura utilizadas no Exemplo 23, a produção de lisina não começa enquanto a treonina está ainda presente no meio e que os rendimentos são relativamente baixos até que as bactérias deixem de crescer (Vallino, J. J. [ 1991]; ver especíalmente as páginas 207 a 213). Surpreendentemente, a Corynebacterium glutamicum transformada de acordo com a invenção já produziu grandes quantidades de lisina enquanto a treonina ainda esteve presente e antes da bactéria ter alcançado mesmo 25 % do rendimento da biomassa esperado. Estes exemplos revelam que a presente invenção pode ser praticada com a vantagem também em bactérias assim como em fungos e para melhorar a produção de amino ácidos assim como compostos não azotados tais como o etanol e o xilitol. 29

Para a produção industrial de amino ácidos, uma estirpe bacteriana que produz em excesso um ou vários amino ácidos é transformada de acordo com a invenção. A estirpe transformada pode ser utilizada nos mesmos processos industriais como a estirpe progenitora não transformada. Por exemplo, podem ser utilizadas as matérias primas que compreendem qualquer de uma variedade de açúcares ou de ácidos orgânicos tais como o ácido cítrico, succínico ou fumárico como fonte de carbono e amónia, sais de amónio ou hidrolisados de proteína económica como fonte de azoto. Os materiais orgânicos de prova (por exemplo a tiamina) e inorgânicos (por exemplo os sais de ferro e de manganês) podem ser adicionados da mesma forma que para o processo original com a estirpe progenitora não transformada. Em comparação com a estirpe não transformada, a estirpe transformada de acordo com a presente invenção fornece as vantagens reveladas em cima, tais como o rendimento aumentado, a produtividade aumentada, a exigência de oxigénio reduzida.

Uma desídrogenase de glutamato ligada a NAD também pode ser introduzida a Corynebacterium glutamicum (e outra Corynebacteria spp.) através de qualquer método bem conhecido na técnica. Por exemplo, o gene de Peptostreptococcus asaccharolyticus foi transferido para a C. glutamicum sob um promotor de Tac por Marx et ai. (1999) . Significativamente, estes funcionários utilizaram uma estirpe de Corynebacterium glutamicum a partir da qual o gene que codifica para a desídrogenase de glutamato ligada a NADP foi primeiro eliminada, ao passo que a presente invenção ensina a presença simultânea de desidrogenases de glutamato ligadas a NADP e ligadas a NAD. A invenção também pode ser praticada por se transformarem as estirpes bacterianas que produzem em excesso outros amino ácidos diferentes da lisina com este ou um outro gene que codifica a desídrogenase de glutamato ligada a NAD ou com o 30 gene para qualquer outra enzima que causa a união funcional de duas desidrogenases com especificidades diferentes para os pares de nucleótido de piridina.

Os poli-hidroxialcanoatos (PHAs) são comercialmente produzidos para fazer plásticos biodegradáveis, mas os preços são demasiado altos para o utilização comum excepto onde isto é imposto pela legislação (por exemplo na Alemanha). É, por isso, desejável melhorar a eficiência dos processos microbianos que produzem os PHAs. Na bi ossíntese de PHAs, a glicose é metabolizada a acetilCoA, que produz 2 moléculas de NADH/molécula de acetilCoA, e a acetilCoA é depois condensada a acetoacetílCoA a qual é reduzida através de NADPH a 3-hidroxibutirilCoA. A síntese de cada molécula de 3-

hidroxibutirilCoA, por isso, produz 4 moléculas de NADH e necessita de 1 molécula de NADPH. A 3-hidroxibutirilCoA é depois polimerisada a poli-hidroxibutirato (PHB) ou copolimerisada com outra acilCoAs tal como a propionilCoA para formar os PHAs misturados. A necessidade de uma molécula de NADPH e a produção de 4 moléculas de NADH por unidade de monómero significa que os microrganismos que sintetizam os PHAs têm de divergir a parte do seu fluxo de carbono através de reacções tais como a desidrogenase de glicose-6-fosfato ou a desidrogenase de isocitrato para gerar o NADPH, com o consequente excesso de produção de CO2 e a perda da fonte de carbono, como explicado em cima. Ao mesmo tempo, o NADH deve ser reoxidado, causando novas perdas de carbono ou a exigência de oxigénio aumentado ou ambos. Esta perda pode ser reduzida por se transformar o microrganismo de produção de acordo com a presente invenção, provendo-o assim com um novo mecanismo que converte a parte do excesso de NADH produzido no NADPH necessário {para pesquisas, ver por exemplo Anderson e Dawes [1990]; Poirier et al. [1995]). 31

Neste aspecto da invenção, um microrganismo que produz um ou vários PHAs é transformado de acordo com a primeira ou a segunda forma de realização, e o microrganismo transformado é utilizado para fermentar a glicose na presença ou na ausência de ácidos orgânicos tais como os ácidos propiónico ou valérico. Em comparação com o organismo progenitor não transformado, o organismo transformado de acordo com a invenção fornece as vantagens reveladas em cima, tais como a produção de rendimentos aumentados de PHA na glicose, as produtividades aumentadas e a formação reduzida de produtos colaterais não desejados, tais como o CO2- O exemplo 24 ilustra como isto pode ser feito. Neste exemplo o microrganismo de produção é uma estirpe recombinante de Saccharomyces cerevisiae transformada com a sintase de PHB e os genes de reductase de Alcaligenes eutrophus. No entanto, não é necessário que uma levedura recombinante seja utilizada. Qualquer microrganismo que produz os PHAs pode ser utilizado, por exemplo a Alcaligenes eutrophus ou a Pseudomonas oleovarans, ou as estirpes bacterianas projectadas que produzem um excesso de PHAs. 0 microrganismo transformado de acordo com a presente invenção é depois utilizado para fermentar a glicose com ou sem ácidos orgânicos essencialmente sob as mesmas condições de processo como as utilizadas para o organismo progenitor não transformado.

Em outro aspecto da invenção um microrganismo de produção é transformado de acordo com a invenção e nas condições de um processo biotecnológico, o microrganismo transformado mantém um nivel mais alto da capacidade metabólica necessária para o referido processo do que faz o microrganismo não transformado correspondente. 0 exemplo 14 ilustra este aspecto. A S. cerevisiae transformada de acordo com a invenção com um gene que expressa a enzima málica é utilizada para fermentar a xilose em etanol em 32 condições anaeróbicas, as quais são vantajosas porque previnem uma redução causada por processos oxidativos no rendimento de etanol. Nestas condições de processo a biomassa da estirpe de controlo diminui com o tempo durante a operação do processo com uma perda correspondente da sua capacidade metabólica para converter o substrato (xilose) no produto (etanol). Na prática isto levaria a exigências de processo inconvenientes e caras tal como a adição repetida de mais organismo de produção. No entanto, o organismo transformado de acordo com a invenção é capaz de manter a sua biomassa e a capacidade metabólica exigida pelo processo (Fig. 8). Presumivelmente isto deve-se ao facto do organismo transformado ser capaz de obter a energia suficiente a partir da biotransformação do processo (no caso do Exemplo 14, a conversão de xilose em etanol) para manter a sua própria integridade e a capacidade metabólica, ao passo que o organismo não transformado não pode. Nas condições do Exemplo 14, com um microrganismo de produção unicelular e um meio liquido homogéneo, foi fácil demonstrar a redução na biomassa do microrganismo de controlo e a manutenção da biomassa do organismo transformado de acordo com a invenção.

No entanto, é claro para um especialista familiarizado com a técnica, primeiro que em muitos processos, por exemplo, os que empregam os meios não homogéneos ou os fungos filamentosos ou ambos, pode ser muito difícil de demonstrar a manutenção da biomassa, e segundo que o parâmetro significativo não é a própria biomassa mas a sua capacidade metabólica para converter o substrato do processo no produto. Nesta conexão a capacidade metabólica significa a capacidade total do organismo de produção presente num processo (por exemplo por volume de unidade de um fermentador) para levar a cabo um conjunto determinado de biotransformações, a saber aquelas que são exigidas pelo processo biotecnológico particular, e 33 pode ser medida por se medir a taxa de conversão do substrato de processo no produto de processo em condições padrão.

Outros aspectos da invenção incluem a transformação de microrganismos de produção que foram desenvolvidos para produzir em excesso nucleótidos, lípidos ou metabólitos secundários de vários tipos a uma escala industrial. Depois da transformação de acordo com as formas de realização acima mencionadas desta invenção, estes microrganismos vão fornecer rendimentos aumentados dos produtos comerciais desejados, ou taxas de produção especificas aumentadas, formação reduzida de produtos colaterais indesejáveis (tais como o CO2 ou a biomassa de excesso) ou várias destas vantagens simultaneamente.

Estes exemplos revelam como a eficiência dos processos biotecnológicos pode ser melhorada por se transformarem os microrganismos de produção pelo menos com uma molécula de ADN recombinante que codifica as enzimas que facilitam as reacções de redução - oxidação entre os sistemas da coenzima de NAD (H) e de NADP (H) . A invenção pode ser realizada por se transformar o hospedeiro com um único gene (por exemplo o GDH2 no Exemplo 3; o MAE1 110 Exemplo 12) e por se utilizarem enzimas que são naturalmente expressas no hospedeiro sob as condições de produção específicas para completar os esquemas de reacção (isto é as reacções (1) + (2) ou (3) + (4) + (5) em cima). No entanto, a invenção também pode ser realizada por se transformar o hospedeiro com mais do que uma molécula de ADN para que ambas as reacções (1) e (2) ou duas ou mais das reacções (3), (4) e (5) (ou (3') , (4' ) e (5 *), ou (3"), (4") e (5")) sejam levadas a cabo através de enzimas expressas de genes transformados. 34

Além de GDH2 e de um gene que codifica a enzima málica, os genes que codificam outras enzimas podem ser vantajosos. As enzimas convenientes (os exemplos são dados em cima) são conhecidas e os seus genes foram clonados e podem ser encontrados em bancos de dados e obtidos através de métodos de PCR bem conhecidos na técnica (os Exemplos 6 e 7 e 10 confirmam como rapidamente isto pode ser feito para os genes tanto de leveduras como de fungos filamentosos). Um especialista nas técnicas da fisiologia microbiana e do metabolismo pode planear um esquema metabólico que corresponde às reacções (1) e (2), ou (3) a (5), (3') a (5') ou (3") a (5"). Muitos de tais esquemas necessitam de enzimas bem conhecidas. Os bancos de dados (por exemplo o Swissprot) também podem ser pesquisados para se encontrar a enzima ou enzimas requeridas. Assim, por exemplo, os números de acesso seguintes fornecem as sequências de amino ácido ou de nucleótido que correspondem a desidrogenases ligadas a NADP: P00369, P31026, P0037G, P50216, P08200, P14941, P75214, P27800, Q58820, P15719, P46919, P28861, L05667, U26463, YPL061w, P18819, M88600, X75327 e P55804. Estas sequências podem ser utilizadas para se clonar os genes correspondentes, por exemplo, através de PCR com iniciadores específicos de sequência.

Outras actividades de enzima convenientes podem ser encontradas por se levar a cabo ensaios de enzima apropriados (ver, por exemplo, Bergmeyer [1974], mas outros sistemas de ensaio convenientes podem ser rapidamente projectados por um especialista na técnica) em extractos preparados a partir de organismos convenientes, que incluem as bactérias, os fungos e as plantas e os animais superiores. A proteína responsável pode depois ser purificada através de métodos padrão, e os anticorpos preparados contra ela ou os dados de sequência de amino ácidos obtidos a partir dela. O gene 35 que codifica a proteína pode depois ser clonado através de métodos padrão tal como por se utilizarem anticorpos para proteger bibliotecas de expressão ou oligonucleótidos designados a partir das sequências de amino ácido para actuarem como iniciadores na clonagem de PCR ou provas de híbridização para protegerem os bancos de genes.

As novas actividades de enzima convenientes e os seus genes também podem ser encontrados por se explorar a informação sobre o banco de dados de outras formas que são familiares e rotineiras aos especialistas na técnica. Por exemplo, o alinhamento de várias sequências que codificam as enzimas málicas revela uma assim chamada "assinatura de enzima málica", a qual permite a preparação de misturas de oligonucleótido que podem ser utilizadas, por exemplo, na clonagem de PCR de genes que codificam as enzimas málicas em outros organismos, como é descrito no Exemplo 7 para a enzima málica de Aspergillus nídulans. É bem conhecido de um especialista na técnica que durante a clonagem de genes através de PCR, as mutações de ponto podem ocorrer e ser perpetuadas pela técnica de amplificação. As pequenas diferenças da sequência entre os mesmos genes em estirpes diferentes do mesmo organismo também podem ocorrer naturalmente. Muitas dessas modificações não têm nenhum efeito significativo na função da proteína codificada e por isso são chamadas de mutações neutrais. Por exemplo, duas mutações de ponto no gene que codifica a enzima málica foram observadas no Exemplo 10, mas não afectaram significativamente a actividade da enzima málica codificada. Tais mutações neutrais podem também ser introduzidas deliberadamente. A nossa invenção envolve a utilização de tais variantes neutrais de genes assim como de genes neutrais. 36

De acordo com a invenção presente, o organismo hospedeiro é transformado de uma tal forma que as reacções (1) e (2) na primeira forma de realização da invenção ou as reacções (3) a (5) {ou (3') a (5' ) ou (3") a (5") ) na segunda forma de realização ocorrem simultaneamente de um modo preferido no mesmo compartimento sub-celular, de um modo preferido o citosol. A restrição que as reacções ocorrem no mesmo compartimento não é absoluta porque as reacções (4") podem incluir as reacções de transporte ou de ida e volta que movem os intermediários metabólicos entre os compartimentos sub-celulares. A invenção ensina que o gene de transformação pode ser modificado se necessário para causar a expressão no compartimento apropriado e sob as condições fisiológicas que prevalecem durante o processo de produção desejado. As assim chamadas sequências de "sinal" ou de "alvo" são conhecidas que normalmente codificam as sequências de amino ácido de terminal C ou de terminal N relativamente pequenas que dirigem as proteínas para compartimentos específicos tais como a mitocondria, os peroxisomas ou o espaço periplásmico (McAlister-Henn et al. [ 1995]). Estas sequências podem ser rapidamente retiradas ou adicionadas a genes através de técnicas padrão de engenharia genética para causar que as enzimas desejadas sejam expressas no compartimento desej ado. A enzima málica expressa a partir do gene MAE1 completo (como nos Exemplos 13, 14 e 18) é um exemplo de uma enzima com uma sequência de alvo mitocondrica (Boles et al. (1998 ] ) , para que pelo menos se espere que um pouco da sua actividade seja localizada dentro da mitocondria. Quando o gene é fortemente expresso, como nos Exemplos 13 e 14 é provável que uma parte da enzima permaneça no citosol, onde também a desidrogenase de malato da levedura e a carboxilase de piruvato são encontradas. Se se desejar expressar a enzima málica (ou algumas outras enzimas com uma sequência de alvo mitocondrica) só no citosol, então a 37 sequência de alvo pode ser removida por se truncar o gene apropriadamente. Além do mais, as enzimas sujeitas a ínactivaçâo catabólita podem ser modificadas para abrandar ou prevenir este circuito regulador (Minard e McAlister-Henn [1992]). A presente invenção também pode ser praticada por se transformar um microrganismo com uma molécula de ADN recombinante para que o promotor natural de um gene hospedeiro que codifica uma enzima conveniente que catalisa uma das reacções (3") a (4") seja substituído por um outro promotor que pode causar uma expressão mais forte ou uma expressão em condições fisiológicas diferentes das do referido promotor natural. Não é necessário que a molécula de ADN de transformação contenha uma sequência de nucleótido que codifica uma enzima funcional completa. Por exemplo, o efeito benéfico pode ser obtido por se transformar o hospedeiro de S. cerevisiae com uma molécula de ADN que só substitui através da recombinação ín vivo do promotor natural do hospedeiro de GDH2 com um promotor tal como o PGK ou o ADH, para que a desidrogenase de glutamato dependente de NAD do hospedeiro seja constitutivamente expresso. Quando o hospedeiro é transformado com um gene de um outro organismo, é desejável utilizar um promotor derivado do hospedeiro.

Para muitos fungos e bactérias de produção são conhecidos promotores convenientes. Os exemplos incluem o promotor dos genes de S. cerevisiae PGK, ACT, EN01, GAPDH, MET, tais como os promotores de MET25 e de ADH, e as suas versões modificadas (por exemplo Ruohonen et al. [1995]; Beier e Young [1982]). É contemplado na invenção que, no caso de S. cerevisiae por exemplo, a utilização destes promotores pode ser vantajosa mesmo quando o gene ou os genes transformados são obtidos a partir da levedura. 38

Eles podem ser vantajosos sobretudo quando os genes devem ser integrados no genoma do hospedeiro, porque estes promotores são conheidos como causando a expressão adequada sobre uma variedade de condições fisiológicas. Por exemplo, o assim chamado promotor de ADH1 de comprimento médio causa a expressão eficiente em S. cerevisíae tanto em condições de crescimento fermentativas como em gluconeogénicas. No entanto, a expressão adequada do gene ou genes transformados também pode ser obtida com os promotores naturais dos genes, por exemplo, através da transformação com um plasmídeo de multicópia, como revelado nos Exemplos 3 a 5. A expressão eficiente em condições fisiológicas desejadas também pode ser obtida através de modificações do promotor em questão ou através de modificações dos mecanismos reguladores de transacção (negativos ou positivos) implicados na expressão do gene particular.

Quando os genes exteriores são transformados num organismo, é desej ável transformá-los com uma sequência de ADN sem intrões, obtida por exemplo a partir de ADNc ou por síntese artificial.

Qualquer método conhecido na técnica para introduzir ou transformar genes no hospedeiro é conveniente para esta invenção e vários tipos de vectores podem ser utilizados, incluindo a duplicação autonomamente de vectores de plasmídeo ou de cromossomas artificiais. Os métodos descritos na técnica para integrarem cópias únicas ou múltiplas de genes de transformação em cromossomas em formas funcionais, expressiveis são também convenientes para esta invenção. Os exemplos de tais métodos para as leveduras, os fungos filamentosos e as Corynebacteria, e outros microrganismos foram descritos. Um gene marcador apropriado pode ser incluído no vector de transformação para que os transformantes possam ser facilmente seleccionados. A co-transformação com um segundo vector que contém 39 um gene marcador seleccionável também pode ser utilizada. Uma larga variedade de genes marcadores é conhecida. Os transformantes também podem ser seleacionados através da expressão de um fenotipo desejado, tal como a capacidade aumentada de crescer em xilose em condições anaeróbicas (ver o Exemplo 8). É contemplado na invenção que pode ser vantajoso em alguns casos causar a expressão dos genes transformados só em condições de cultura específicas. Por exemplo, pode ser útil primeiro fazer crescer o organismo a uma certa densidade de célula, e depois causar a expressão do gene de transformação. São conhecidos promotores que podem ser induzidos através de modificações na temperatura ou no pH, através de fontes de azoto ou de carbono particulares ou através da presença ou ausência no meio de certas substâncias orgânicas ou inorgânicas, tais como o fosfato ou o cobre. Os exemplos de promotores de levedura que foram utilizados para tal expressão induzível incluem o GALl, o GAL10, o CUP1 e o PH05. A presente invenção é além disso ilustrada através dos Exemplos seguintes que descrevem a construção das estirpes de produção da invenção, bem como a sua utilização nos aspectos específicos acima mencionados da invenção. Se não for indicado de outra maneira, todos os procedimentos biotecnológicos são levados a cabo por se utilizarem métodos convencionais na técnica.

Exemplo 1. Construção da estirpe integrante com os genes de XYL1 e de XYL2 de Píchía stipitis que codifica a reductase de xilose e a desidrogenase de xilitol 0 vector de expressão pAOS66 de levedura baseado em pMA91 (Mellor 40

et al. [1983]) (Figura 1) que contém o XYL1 sob o promotor de PGK1 e o XYL2 sob o promotor de ADH1 modificado (Ruohonen et al. [1995]} foi digerido com HindIII para isolar os 2,8 Kb da cassete de expressão que transporta o gene de XYL1 entre o promotor e o termínador de PGK1 e com BamHI para isolar os 2,2 Kb da cassete de expressão que transporta o gene de XYL2 entre o promotor de ADH1 modificado e o termínador de ADH1. O plasmideo B955 (Toikkanen et al. [1998]) foi utilizado para construir a cassete de integração. 0 B955 é o vector de clonagem bacteriano Bluescript SK (Stratagene) que transporta dois fragmentos do gene de URA3 (que codifica a descarboxilase de orotidina-5'-P, Rose et al. [1984]); os pares de bases 71-450 e 781-1135 da região de codificação do gene em locais de Sacl-Xbal e locais de XhoI-Asp718, respectivamente, da região de poli-lígação. Os locais de poli-ligação remanescentes de HindIII e BamHI no vector de clonagem foram utilizados para introduzir as cassetes de expressão de XYL1 e de XYL2 entre os dois fragmentos de URA3 através de ligações terminais contrárias. A construção resultante (pb 71-450 de 5' de URA3 - cassete de expressão de XYL2 de 3' - 5' - cassete de expressão de XYL1 de 5' - 3' - 781-1135 de 3' de URA3) foi libertada a partir de Bluescript SK através da digestão de Sacl-Hsil e isolada a partir de um gel de agarose. Um pg do fragmento foi utilizado para transformar a estirpe da levedura CEN. PK2 (VW-1B) (MATa leu2-3,112 ura3-52 trpl-289 his3-A1 MÂL2-S0 SUC2) (Boles et al. [1996]) através do procedimento de transformação de LiAc (Hill et al. [1991], Gietz et al. [1992]) . A estirpe CEN. PK2 (VW-1B) é chamada de " estirpe de Η1346" por nós, e tem uma estirpe de VTT com o número de colecção VTT C-98304.

A estratégia de integração é baseada na toxicidade de 5-FOA (ácido 5-fluoro-orótico) para as células de levedura (Boeke et al. [1984]). As células de tipo selvagem convertem o 5-FOA em 5-FUMP 41 (monofosfato de 5-fluoro-uridina), um inibidor potente da sintetase do timidilato. Assim só os mutantes de ura 3 (e ura5) podem crescer na presença de 5-FOA, enquanto que o uracilo é fornecido para a estirpe de mutante. A integração do fragmento acima mencionado no local de URA3 interrompe o gene de tipo selvagem e a estirpe torna-se auxotrófica de uracilo, permitindo-lhe crescer em placas de 5-FOA. A integração correcta, funcional foi verificada através de mancheamento de Southern, por se medirem as actividades de XR e de XDH em extractos de célula e por se mostrar que a estirpe integrante só cresceu em xilose em culturas em frasco de agitação, em contraste com a estirpe de CEN. PK2 VW-1B) não transformada (tensão. A estirpe integrante foi denominada como H1469.

Exemplo 2. Clonagem do gene de xiluloquinase de Saccharomyces

Cerevisiae (SGD no. YGR 194C) 0 gene de xiluloquinase (XK) foi amplificado a partir do ADN total da estirpe de levedura de tipo selvagem através de PCR, por se

utilizar o iniciador avançado 5' CCA GTG ATA TCG AGG ATG AGA TTA GTA C 3' e o iniciador inverso 5' CCA GTG ATA TCT GTA CIT GTC AGG GCA T 3'. Ambos os iniciadores contêm um local de restrição de EcoRV na extremidade de 5' . As condições de reacção de PCR foram: inicio a quente a 94 °C em 3'; 94 °C em 1', 55 °C em 1', 72 °C em 2', 30 ciclos, 72 °C em 10' de extensão final. O produto de PCR foi digerido com EcoRV e purificado a partir de um gel de agarose. O fragmento de XK foi ligado a um vector B609 (Bluescribe M13; Stratagene, com o promotor de ADH1 e o terminador de ADH1 modificado) o qual tinha sido tratado com a enzima de Klenow para tornar as extremidades planas. A orientação do fragmento foi 42 verificada com as enzimas de BglII e de EcoRI. Um clone com a orientação direita foi digerido com BamHI e o fragmento foi purificado a partir de um gel de agarose. O fragmento de BamHI foi clonado para o local de BamHI do vector de expressão de levedura de YEplacl9S (Gíetz e Sugino [1988]).

Exemplo 3. Co-transformação da estirpe integrante de H1469 com os genes que codificam a xiluloquinase (XK) e a desidrogenase de glutamato dependente de NAD (NAD-GDH) em dois vectores de expressão de multicópia separados

Dois vectores de expressão de levedura, o acima mencionado YEplacl95 que transporta o gene que codifica a xiluloquinase e o YEplacl81 que transporta o gene de GDH2 que codifica a desidrogenase de glutamato dependente de NAD (Boles et al. [1993]) foram co-transformados na estirpe integrante de H1469. O vector de YEplacl95 foi seleccionado por se omitir o uracilo e o YEplacl81 por se omitir a leucina do meio de crescimento. O resgate do plasmídeo dos transformantes de levedura verificou a integridade dos dois plasmídeos de expressão. A estirpe que transporta tanto os genes de codificação de XK como de NAD-GDH foi denominada como H1803 (VTT C-98302} . Uma estirpe de controlo que transporta o gene que codifica o plasmídeo de controlo de XK e de YEplacl81 sem GDH2 foi denominada como H1805 (VTT C-98303).

Exemplo 4. Transformação da estirpe integrante de H1469 com o gene que codifica a desidrogenase de glutamato dependente de NAD num vector de expressão de multicópia

O plasmídeo de YEplaclÔl acima mencionado que transporta o gene de GDH2 que codifica a desidrogenase de glutamato dependente de NAD 43 foi transformado na estirpe integrante de H1469. A selecção dos transformantes foi como acima mencionada. O resgate de plasmideo dos transformantes de levedura verificou a integridade do plasmideo de expressão. A estirpe que transporta o gene que codifica o NAD-GDH foi denominada como H1795 (VTT C-98300) . Uma estirpe de controlo que transporta o plasmideo de controlo de YEplacl81 foi denominada como H1797 (VTT C-98301).

Exemplo 5. Transformação da estirpe de levedura de H1346 (CEN. PK2 (VW-1B)) com o gene que codifica a desidrogenase de glutamato dependente de NAD num vector de expressão de multicópia

0 plasmideo de YEplacl81 acima mencionado que transporta o gene de GDH2 que codifica a desidrogenase de glutamato dependente de NAD foi transformado na estirpe de CEN. PK2 (VW-1B) (=H1346). A selecção dos transformantes foi como acima mencionada. O resgate de plasmideo dos transformantes de levedura verificou a integridade do plasmideo de expressão. Δ estirpe que transporta o gene que codifica o NAD-GDH foi denominada como H1791 (VTT C-98298), Uma estirpe de controlo que transporta o plasmideo de controlo de YEplacl81 foi denominada como H1793 (VTT C-98299).

Exemplo 6. Clonagem da estrutura de leitura aberta de YKL029C que codifica a enzima málica homóloga de Saccharomyces Cerevisiae

A enzima málica foi caracterizada a partir de S. cerevisiae (Fuck et al. [1973]}. A análise do genoma de levedura revelou uma estrutura de leitura aberta (ORF YKL029C) com a homologia ao gene que codifica a enzima málica a partir de Schizosaccharomyces pombe (Viljoen et al. [1994]). A S. cerevisiae ORF YKL029C foi amplificada a partir do ADN cromossórnico da levedura através de PCR 44 por se utilizar o iniciador avançado de 5' CAT GCT AAG CTT CTA GAA TGC TTA GAA CCA GAC TA 3' e o iniciador inverso de 5' GAT GCT AAG CTT CTA GAT GGT TAT GCT TCG TCT AC 3'. Ambos os iniciadores contêm os locais de restrição de HindiII e de BglII na extremidade de 5*. As condições de reacção de PCR foram: início a quente a 94 °C em 3'; 94 °C em 1', 40 °C em 1', 72 °C em 2', 30 ciclos, 72 °C em 10' de extensão final. O fragmento de ADN obtido foi do tamanho esperado. O fragmento de PCR foi digerido com a enzima de restrição apropriada {BglII) para permitir a sua clonagem entre o promotor e o terminador de PGKl no vector de expressão da levedura de pMA91.

Exemplo 7. Clonagem do gene que codifica a enzima málica do fungo filamentoso de Aspergillus Nidulans

Por enquanto todos os genes que codificam as enzimas málicas clonadas a partir de organismos diferentes contêm uma sequência de ADN que codifica para a "assinatura da enzima málica". É uma sequência de amino ácido única, altamente conservada, (FNDDIQGTGAVVMASLI) desta proteína particular (Pró-local: PDOC00294). A assinatura permite que os iniciadores degenerados específicos sejam planificados para a clonagem de qualquer gene particular que codifica uma enzima málica.

Os iniciadores degenerados foram designados por se utilizar a assinatura da enzima málica (região D) para o iniciador de extremidade de 31 e uma segunda região homóloga da proteína, a região C para o iniciador de extremidade de 5' (Vil joen et al. [1994]. 0 iniciador avançado foi o 5' GA(T/C) GTI GGI ACI AA(T/C) AA 3', e o iniciador inverso foi o 5' GTI CC(T/C) TG(A/G/T) AT(A/G) TC(A/G) TC(A/G) TT(A/G) AA 3'. As condições de reacção de PCR foram de início a quente a 94 °C em 3'; 94 °C em 1", 37 °C em 1 ’, 72 °C 45 em 2', 7 ciclos, 94 °C em 1', 40 °C em 1', 72 °C em 2' , 25 ciclos, 72 °C em 10' de extensão final. O ADN cromossómico de Aspergillus nidulans foi utilizado como o padrão na reacção de PCR. Um fragmento do tamanho esperado foi obtido (0,24 Kb) e a Figura 2 mostra o alinhamento do produto de PCR com algumas enzimas málicas conhecidas. Uma sequência de amino ácido parcial da enzima málica de A. nidulans é dada na Sequência No. 1. A sequência parcial obtida permite o desenho de iniciadores adicionais, e pode ela própria ser utilizada para experimentar através de hibridização de Southern clonar a enzima málica total a partir de qualquer banco de ADN (por exemplo ADNc, cromossómico, lambda). O gene que codifica a enzima málica de Trichoderma reesei, um outro fungo filamentoso também pode ser clonado. Uma sua sequência de amino ácido parcial está incluída na Figura 2, e dada também na Sequência No. 2.

Exemplo 8. Produção de etanol a partir de xilose

Parte 1. Culturas de frasco por agitação

As estirpes de H1803 e de H1805 (ver o Exemplo 3) foram cultivadas no meio de crescimento o qual foi SC-URA-LEU modificado (meios completos sintéticos, o uracilo e a leucina omissos, Sherman et al. [1983]) e a Base de Azoto de Levedura sem Amino Ácidos (Difco) e as fontes de carbono de D-glicose (20 g/L) ou de D-xilose (20 g/L). As células foram pré-cultivadas em frascos de agitação num meio que contém glicose como uma fonte de carbono. As células foram reunidas através de centrifugação e ressuspensas num volume de 100 mL de meio que contém a xilose como uma fonte de carbono. As células foram mantidas a 30 °C em frascos de Erlenmeyer de 100 mL agitadas suavemente com uma vara magnética. A anaerobiose foi realizada por se utilizar uma câmara de vácuo. 46

Depois de dois dias de incubação com xilose a estirpe com níveis elevados de NAD-GDH tinha produzido 2,35 g de etanol / g por peso seco, e a estirpe de controlo produziu 1,47 g de etanol / g por peso seco. A quantidade de etanol foi medida enzimaticamente com a ajuda de um analisador automatizado (Cobas - Mira). A actividade da desidrogenase de glutamato foi medida em um extracto de célula de levedura bruto, o qual foi obtido através de se vorticizarem em 500 mg de células frescas em 500 pL de 100 mM de fosfato Na, a pH 7,0 e 1 g de contas de vidro (diâmetro de 0,4 mm) durante 15 minutos. A mistura foi depois centrifugada em uma centrifugadora de topo de mesa e o sobrenadante ensaiado. 200 pL de um tampão que contém 200 pM de NA D (P) He 100 mM de fosfato Na, a pH 7,4 foi misturada com 10 pL do extracto de levedura cru 20 vezes diluído. Para se começar a reacção o α-cetoglutarato (concentração final de 10 mM) e o cloreto de amónio (concentração final de 20 mM) foram adicionados. A taxa para reduzir a absorvência a 340 nm foi medida e a actividade foi calculada a partir daqui. Está relacionada com o conteúdo de proteína do extracto de levedura como medido através de um ensaio de proteína de BIORAD. A actividade de NADP-GDH foi medida por se utilizar o NADPH como um substrato e a actividade de NAD-GDH foi medida com NADH como um substrato. A actividade de NAD-GDH foi estimada em 4 - 5 nkat/mg na estirpe de expressão em excesso, e 0,04 nkat/mg no controlo sem expressão em excesso de GDH2. A actividade de NADP-GDH foi de cerca de 2 nkat/mg. Todos os ensaios foram executados num analisador automatizado de Cobas-Mira.

Parte 2. Culturas do ferxnentador A fermentação de xilose anaeróbica para etanol foi conduzida em 1,8 litros de Fermentador de Chemap CMF (Suiça) por estirpes 47 geneticamente projectadas de Saccharomyces cerevísiae, designadas como H1803 e H1805. Ambas as estirpes são derivadas de S. cerevísiae CEN. PK2 (VW-1B) (Boles et al. [1996]), e expressam a reductase de xilose (XR) e a desidrogenase de xilítol (XDH) através da integração cromossómica dos genes correspondentes de Píchía stipítis. Além do mais, ambas as estirpes expressam em excesso a xiluloquínase nativa (XK) a partir de um plasmídeo de multicópia (YEplacl95 + XK). A estirpe de H1803 contém um plasmídeo adicional que expressa a desidrogenase de glutamato de NAD (NAD-GDH) de S. cerevísiae (YEplacl81 + GDH2) , ao passo que a estirpe de H1805 contém só o vector de clonagem {YEplacl81) e serve de uma estirpe de controlo. A omissão de uracilo (URA) do meios de crescimento pode minimizar a segregação do plasmídeo para o vector de YEplacl95, e de leucina (LEU) para o de YEplaclSl.

As culturas de semente das estirpes de H1803 e H1805 foram mantidas de forma rotineira em placas que foram renovadas a cada 2-3 semanas. 0 pré-inóculo foi preparado através da transferência de uma única colónia num frasco de Erlenmeyer de 250 mL que continha 50 mL de meio completo sintético modificado sem o uracilo e a leucina (SC-URA-LEU) + 20 g/L de glicose (Sherman et al. [1983]). Para cada estirpe foram preparados três frascos idênticos. As células foram cultivadas durante a noite num agitador rotativo a 150 rpm e a 30 °C, e o conteúdo de cada frasco foi depois transferido completamente para um frasco deflector de 3 L que continha 500 mL de SC-URA-LEU mais 50 g/L de glicose e cultivadas aerobicamente a 150 rpm e 30 °C até a glicose ter sido esgotada (ODgoo: 20-25) .

As células da cultura acima mencionada (seis frascos) foram colhidas através de uma centrifugação de 10 minutos a 4 500 rpm e a 48 4 °C, lavadas através de um tampão de 0,1 M de PCV- (pH=5,5) e ressuspensas no mesmo tampão cada uma para um volume final de 30 mL e posteriormente transferidas para o fermentador. O meio de fermentação continha SC-URA-LEU + 10 % de xilose. A temperatura do fermentador foi mantida a 30 °C, o pH foi controlado a 5,5 através da adição de 2 M de NaOH, e a agitação foi constante a 300 rpm. A cultura foi executada em condições anaeróbicas por se fazer brilhar o espaço livre do fermentador com o azoto a uma taxa de fluxo constante de 0,2 wm. O gás emitido foi conectado através de uma válvula de múltiplas portas a um espectrómetro de massa quadruplo de Balzers (Suécia) para análise em tempo real. As amostras líquidas foram retiradas do fermentador em intervalos de tempo para se medir o crescimento, o consumo de substrato, e a formação de produtos extracelulares. Para as amostras seleccionadas as actividades das desidrogenases de glutamato de NADP e de NAD também foram medidas através de técnicas enzimáticas padrão. 0 crescimento foi controlado por se medir tanto a absorvência a 600 nm, assim como o peso de célula seco (DCW) através de filtração e secagem subsequente a um peso constante. A xilose, o etanol, o xilitol, o glicerol e o acetato presentes no caldo fermentador foram separados em uma coluna de HPX-87H (55 °C), com 5 mM de H2S04 como eluente (0,6 mL/min), e quantificados através da detecção de índice refractivo (RI). As quantidades de etanol, glicerol, xilitol e acetato foram independentemente verificadas através de ensaios enzimáticos apropriados com a ajuda de um analisador automatizado (Cobas - Mira). O crescimento e o consumo de xilose das estirpes de H1803 e H1805 durante as 30 primeiras horas de cultura estão resumidos na Figura 3. Ambas as estirpes podem consumir a xilose efectivamente em taxas 49 comparáveis, no entanto, a estirpe que expressa em excesso o NAD-GDH (H1803) acumula cerca de 6 % menos de biomassa (7,13 contra 6, 72 g/L) . A diferença mais notável entre as duas estirpes é a da produção de etanol. Como ilustrado na Figura 4, no final do periodo de tempo de 30 horas a estirpe de GDH2 acumula cerca de 1,02 g de etanol por DCW em comparação com 0,73 para a estirpe de controlo. Isto representa um aumento da produção de etanol especifico de cerca de 40 % da estirpe de GDH2 (0,58 contra 0,83 mmol/g de célula h) . A produtividade volumétrica é também mais elevada para a estirpe de GDH2 em cerca de 30 % (3,94 contra 5,20 nunol/L h) . Os rendimentos correspondentes de etanol na xilose são de 0,21 e 0,29 (mol/mol} para o controlo e as estirpes de GDH2, respectivamente. Inesperadamente, a produção de xilitol também foi elevada para a estirpe de GDH2 em cerca de 25 % como mostrado mais uma vez na Figura 4.

Ainda uma outra divergência extraordinária entre as duas estirpes recombinantes está representada na Figura 5. Estes dados de dióxido de carbono vêm das medições do espectrómetro de massa do gás efluente. Como mostrado na Figura 5, a expressão em excesso de GDH2 atenua significativamente a evolução de dióxido de carbono. Os valores integrados da produção de C02 de 0 a 30 horas são de 100,4 e 80,7 mmol/L para o controlo e as estirpes de GDH2, respectivamente, isto é a estirpe de GDH2 desperdiça cerca de 20 % menos da fonte de carbono para a produção de dióxido de carbono.

Os ensaios enzimáticos para o NADP-GDH e o NAD-GDH foram executados em amostras escolhidas e os resultados dos tais dois conjuntos são mostrados na Figura 6. A mistura de ensaio conteve 100 mM de tampão de fosfato de sódio a pH=7, 0, 200 μΜ de qualquer NADPH (ensaio de NADP-GDH) ou de NADH (ensaio de NAD-GDH) , e lisado de célula a uma 50 concentração final de cerca de 0,5 mg/xtiL. A reacção foi começada através da adição de 20 irtM de α-cetoglutarato mais 40 mM de NH4C1, e o consumo de NAD (P) H foi controlado espectrofotometricamente a 340 nm. Ambas as estirpes têm actividades de NADP-GDH notáveis como esperado, embora a H1803 pareça ter uma actividade especifica surpreendentemente mais alta desta enzima (cerca de 40 % ou mais ou menos). Por outro lado, a actividade de NAD-GDH está essencialmente perto do limite de detecção de ensaio da estirpe de controlo, ao passo que, a H1803 tem uma actividade especifica regularmente alta para esta enzima de NAD.

Estes resultados mostram que a estirpe recombinante de H1803 que expressa em excesso a desidrogenase de glutamato de NAD aumentou significativamente as capacidades para a produção de etanol (e de xilitol), tanto em termos de produtividades especificas mais altas bem como em rendimentos de produto mais altos no substrato de carbono. A estirpe recombinante também produz significativamente menos (indesejada) massa de célula e muito substancialmente menos (indesejado) dióxido de carbono, não só aumentando por meio disso os rendimentos de produtos desejados mas também reduzindo as cargas de poluição e de disposição.

Exemplo 9. Produção de etanol a partir da glicose A fermentação de glicose em etanol foi conduzida em 1,8 litros de Fermentador de Chemap CMF (Suíça) através de estirpes geneticamente projectaaas de Saccharomyaes cerevisíae, designadas como H1793 e H1791, ambas as quais são derivadas de S. cerevisíae CEN.PK2 (VW-1B) (Boles et al. [1996]). A estirpe de H1791 é transformada com um plasmídeo que expressa a desidrogenase de glutamato de NAD (NAD-GDH) a partir de S. cerevisiae (YEplacl81 + GDH2) , ao passo que a estirpe de H1793 contém só 0 vector de clonagem (YEplacl81) e serve 51 como uma estirpe de controlo. A segregação de plasmídeo pode ser minimizada por se omitir a leucina (LEU) do meio de crescimento. 0 inoculo foi preparado por se transferir uma colónia única para um frasco de Erlenmeyer de 250 mL que continha 50 irtL do meio completo sintético modificado sem a leucina (SC-LEU) 20 g/L de glicose. As células foram cultivadas durante a noite num agitador rotativo a 150 rpm e a 30 °C (OD600 : 10-15 ) . As células da cultura acima mencionadas foram colhidas através de uma centrifugação de 10 minutos a 4 500 rpm e a 4 °C, lavadas com 0,1 M de tampão de P042” (pH=5,5) e ressuspensas no mesmo tampão cada uma a um volume final de 2 5 mL e posteriormente transferidas para o fermentador. O meio de fermentação conteve (por litro) : 3,4 g de base de azoto de levedura (sem amino ácidos e sem amónia), 0,044 g de uracilo; 0,164 g de triptofano, 0,116 g de histidina, 5,055 g de KN03, 40 g de glicose. A temperatura do fermentador foi mantida a 30 °C, o pH foi controlado a 5,5 através da adição de 2 M de NaOH, e a agitação foi constante a 300 rpm. A cultura foi executada em condições anaeróbicas por se fazer brilhar o espaço livre do fermentador com o azoto a uma taxa de fluxo constante de 0,2 wm. O gás emitido foi conectado através de uma válvula de múltiplas portas a um espectrómetro de massa quadruplo de Balzers (Suécia) para análise em tempo real. As amostras liquidas foram retiradas do fermentador em intervalos de tempo para se medir o crescimento, o consumo de substrato, e a formação de produtos extracelulares. A biomassa, a glicose, o etanol, o glicerol e o acetato foram medidos como no exemplo prévio. A Tabela 1 resume os dados de fermentação primários destas duas fermentações. A estirpe (H1791) que expressa em excesso o NAD-GDH acumula na média cerca de 12 % menos de biomassa (0,52 contra 0,46 52 g/L) durante o período de tempo de 21 horas. As taxas de consumo de gii cose específicas são comparáveis para as duas estirpes (dentro de 5 %) . No entanto, a estirpe de GDH2 tem tanto uma taxa de produção de etanol (25 %) específica mais alta como volumétrica (11 %) mais alta. Ainda uma outra divergência extraordinária entre as duas estirpes recombinantes está representada na Figura 7. Estes dados de dióxido de carbono vêm das medições do espectrómetro de massa do gás efluente. Como mostrado na Figura 7, a expressão em excesso de NAD-GDH atenua sigriificativamente a evolução de dióxido de carbono. Os valores integrados para a produção de CO2 de 0 a 21 horas são de 93,7 e 70,6 ramol/L para o controlo e as estirpes de GDH2 respectivamente, isto é a estirpe de GDH2 desperdiça cerca de 25 % menos da fonte de carbono para o dióxido de carbono. A taxa de produção de C02 específica da estirpe de GDH2 também é atenuada até 15 %. Além do mais, prevê-se que o rendimento de etanol na glicose (mol/mol) seja de cerca de 19 % mais alta para a estirpe de GDH2 contra a estirpe de controlo.

Esses resultados mostram que a estirpe recombinante de H1791 que expressa em excesso a desidrogenase de glutamato de NAD (NAD-GDH) aumentou significativamente as capacidades para a produção de etanol a partir da glicose, quer em termos das produtividades específicas mais altas quer como rendimentos de produto mais altos no substrato de carbono. A estirpe recombinante também produz significativamente menos (indesejada) massa de célula e menos (indesejado) dióxido de carbono, não só aumentando por meio disso os rendimentos de produtos desejados mas também reduzindo as cargas de poluição e de disposição.

Tabela 1. Fermentações de glicose com a estirpe recombinente de

Saccharomyces cerevisíae que expressam em excesso o NAD-GDH (H1791) 53 e a estirpe de controlo (H1793): comparação do crescimento, do consumo de glicose, da produção de etanol e das taxas de evolução do dióxido de carbono. As duas últimas demonstrações mostram os fluxos médios calculados expressos quer em termos volumétrico (Jv, mmol/L h) quer em termos específico (Js, mmol/g de célula h) . As concentrações de glicose e de etanol representam valores médios de quatro medições: duas com HPLC e duas com ensaios enzimáticos.

Biomassa (g/L) Glicose (g/L) Etanol (g/L) C02 (% em mole) Tempo (h) 1793 1791 1793 1791 1793 1791 1793 1791 0 0,315 0, 300 39,27 37,57 0, 01 0, 01 0,000 0,000 6 0, 740 0, 670 37, 68 36, 48 0, 63 0, 72 1,333 0, 619 17 0, 790 0,760 33, 00 32, 49 2,39 2,37 1,552 0, 823 19 0,820 0, 690 32,22 31, 04 2,65 2,78 1,735 0,701 21 0, 800 0, 670 30, 98 29, 85 2, 98 3, 30 1, 818 0,711 Jv - - -2, 19 -2,04 3, 08 3, 41 4,46 3, 36 Js - - -4,21 -4,43 5, 92 7, 40 8, 58 7,31

Exemplo 10. Uma estratégia de clonagem alternativa da estrutura de leitura aberta de YKL029C que codifica a enzima málica homóloga de Saccharomyces Cerevisiae

Se a enzima de restrição de BglII é utilizada para a clonagem da enzima málica homóloga entre o promotor e o terminador de PGK1 no vector de expressão da levedura de pMA91, a digestão da enzima parcial tem de ser feita, uma vez que há um local de BglII interno em +227 pb da região de codif icação da enzima málica. Oma estratégia de clonagem alternativa foi como se segue: o fragmento de PCR foi digerido com a enzima de restrição de HindIII e tratado com a enzima de Klenow para tornar as extremidades planas. 0 vector 54 dô expressão de pMA91 (Mellor et al. [1983]) foi digerido com a enzima de restrição de HindIII e o fragmento de 1,8 Kb que contém o promotor e o terminador de PGK1 foi isolado a partir de um gel de agarose. A cassete de promotor-terminador foi ligada no vector de YEplacl95 (Gietz e Sugino [1988]) o qual tinha sido linearizado no seu local de multi-clonagem com o HindIII. A orientação do fragmento de promotor-terminador no vector de expressão é o promotor de PGK1 e o terminador de EcoRI de HindiII-PGK1. Este vector de expressão foi digerido com BglII e tratado com a enzima de Klenow para se obterem extremidades planas para a clonagem da enzima málica homóloga entre o promotor e o terminador de PGK1. O ORF YKL029C clonado através de PCR foi completamente sequenciado. Duas mutações de ponto, criadas durante a amplificação de PCR que alteram dois amino ácidos na enzima foram observadas; a leucina 341 para a valina e a glutamina 620 para a leucina. Estas mutações de ponto não estiveram nem em regiões de amino ácidos conservados de enzimas málicas (Viljoen et al. [1994]) nem alteraram significativamente os valores de Km evidentes da enzima amplificada por PCR quando comparado com a enzima nativa (actividade da enzima nativa medida a partir da estirpe de H1346; ver a Tabela 2 e Fuck et al. [1973]) e foram assim consideradas neutras. A invenção pode ser praticada com esta variante de gene, ou com um gene nativo que codifica a enzima málica ou com qualquer outra variante neutra.

Tabela 2. Os valores de Km evidente para o malato, NAD+ e NADP+ da málica nativa e amplificada por PCR de S. cerevisiae L Malato Km (mM) NAD+ Km (mM) NADP+ Km (mM) Enzima málica nativa 17, 1 0, 07 0, 06 55

Enzima málica amplificada 15,4 0,14 0,08 por PCR O vector de controlo de YEplacl95, e o mesmo vector com a enzima málica homóloga de S. cerevisiae sob o promotor e o terminador de PGK1 foi transformado na estirpe de levedura CEN. PK2 (VW-1B, H1346), para se obterem estirpes de H2189 (VTT C-99316) e de H2193 (VTT C-99317), respectivamente.

Exemplo 11. Integração do gene de xiluloquinase (YGR194C) na estirpe integrante de H1469

Uma cassete para a integração do gene de xiluloquinase foi construída com as regiões de flanqueamento de HIS3 e o gene de KMX2 de resistência à canamicina para a selecçâo. 0 vector de ida e volta de levedura de pRS423 (Christianson et al. [1992]) foi digerido com DrdI para se obter um fragmento de 1,5 Kb que contêm o gene de HIS3 que codifica a hidratase de imidazoleglicerol-P (Fink [ 1964]). O fragmento foi isolado a partir de um gel de agarose, planado na extremidade com a polimerase de T4 e ligado ao local de EcoRV do vector de clonagem bacteriano de Bluescript SK (Stratagene). 0 plasmídeo de pFÀ6-kanMX2 (Wach et al. [1994]) foi digerido com PvuII e Spel para isolar o 1,4 Kb do módulo resistente à canamicina. O fragmento de KMX2 foi isolado a partir de um gel de agarose e planado na extremidade com a enzima de Klenow. 0 Bluescript SK que transporta o fragmento de DrdI de HIS3 foi digerido com Nhel e Bell dentro do gene de HIS3 (remoção de 50 pb 56 da sua região de codificação) , planado na extremidade com a enzima de Klenow e tratado com fosfatase alcalina de camarão, antes da ligação com o fragmento de KMX2 isolado. O gene de xiluloquinase sob o promotor de ADH1 modificado e do termínador de ADH1 em YEplacl95 (ver o Exemplo 2) foi isolado depois de uma digestão de BamHI a partir de um gel de agarose. O Bluescript SK que transporta o fragmento de DrdI de HIS3 com o módulo de KMX2 foi digerido com BglII dentro do gene de HIS3 (dois locais de BglII adjacentes que retiram 60 pv da sua região de codificação) e tratado com a fosfatase alcalina de camarão, antes da ligação com o fragmento de xiluloquinase isolado com o promotor e o termínador de ADH1. A cassete de integração final assim construída conteve 900 pb da sequência de HIS3, o gene de xiluloquinase (termínador de ADH1, o gene de XK, o promotor de ADH1 modificado) 50 pb da região de codificação de HIS3, a cassete de KMX2 (promotor, o gene, termínador) e 550 pb da sequência de HIS3. Esta construção foi separada do Bluescript SK pela digestão de BstBI e de BssHI, deixando cerca de 400 pb da sequência de HIS3 em qualquer lado para a integração de alvo.

Uma pg da cassete de integração isolada a partir de um gel de agarose foi utilizada para transformar a estirpe de H1469, para se obter a estirpe de H2217 (VTT C-99318) . A filtração para os transformantes integrantes foi em placas de YPD com 200 pg/mL de G418. A integração correcta da cassete de XK para o local de HIS3 foi verificada através de hibridisação de Southern, através de PCR, e através de crescimento aumentado em xilulose quando comparado com o tipo selvagem. 57

Exemplo 12. Transformação das estirpes integrantes de H1469 e de H2217 com o gene que codifica a enzima málica num vector de expressão de multicópia O plasmídeo de YEplacl95 acima mencionado que transporta o gene de MAE1 que codifica a enzima málica sob o promotor e o terminador de PGK1 (ver o exemplo 6 ou 10) , e o plasmídeo de controlo de YEplacl95 foram transformados nas estirpes integrantes de H1469 e H2217. Os plasmídeos foram seleccionados por se omitir o uracilo do meio de crescimento. 0 resgate do plasmídeo dos transformantes de levedura verificou a integridade dos plasmídeos de controlo e de expressão. As estirpes obtidas foram denominadas como se segue; a H1469 com o plasmídeo de controlo como H2191 (VTT C-99319), a H1469 com o plasmídeo da enzima málica como H2195 (VTT C-99320), a H2217 com o plasmídeo de controlo como H2221 (VTT C-99321) e a H2217 com o plasmídeo da enzima málica como H2222 (VTT C-99322).

Exemplo 13. Efeito da Enzima Málica: Produção de Etanol a partir de Glicose A fermentação de glicose em etanol foi conduzida em 1,8 litros de Fermentador de Chemap CMF (Suíça) através de estirpes geneticamente projectadas de Saccharomyces cerevisiae derivadas de S. cerevisiae CEN.PK2/VW-lb (Boles et al. [1996]) indicada a seguir como H1346. Mais especificamente, as duas estirpes utilizadas são neste exemplo são como se segue: (i) H2193: a H1346 transformada com um plasmídeo que expressa a enzima málica de S. cerevisiae (MAE1, ORF YKL029c), ou, (ii) H2189: a H134 6 transformada com o vector de clonagem (YEplacl95) e serve como uma estirpe de controlo. A omissão de uracilo (URA) do meio de crescimento minimiza a segregação do plasmídeo. 58 0 inoculo foi preparado por se transferir uma única colónia para um frasco de Erlenmeyer de 250 mL que continha 50 mL do meio completo sintético sem o uracilo (SC-URA) + 20 g/L de glicose. As células foram cultivadas durante a noite num agitador rotativo a 150 rpm e a 30 °C (ODgoo: 10-15). As células da cultura acima mencionada foram colhidas através de uma centrifugação durante 10 minutos a 4 500 rpm e a 4 °C, lavadas com 0,1 M de tampão de fosfato (pH=5,5) e ressuspensas no mesmo tampão cada uma para um volume final de 25 mL e posteriormente trans feridas para o fermentador. O meio de fermentação conteve (por litro): base de azoto de levedura (sem amino ácidos), suplementos de amino ácidos, 30 g de glicose. A temperatura do fermentador foi mantida a 30 °C, o pH foi controlado a 5,5 através da adição de 2 M de NaOH, e a agitação foi constante a 300 rpm. A cultura foi levada a cabo em condições anaeróbicas por se lavar o caldo com o azoto a uma taxa de fluxo constante de 0,1 vvm. As amostras líquidas foram retiradas do fermentador a intervalos de tempo para se medir o crescimento, o consumo de substrato, e a formação de produtos extracelulares. A biomassa, a glicose, o etanol, o glicerol e o acetato foram medidos como no exemplo prévio. A Tabela 3 resume os resultados de fermentação para estas duas fermentações. A estirpe que expressa em excesso ο MAE1 (H2193) utiliza cerca de 20 % menos de carbono para a síntese de biomassa (3,27 contra 2,60 C-mol/g de célula h) , que resulta em densidades de biomassa finais que são signxficativamente ma is baixas comparadas com o controlo (1,33 contra 2,20 g/L). A taxa de consumo de glicose específica é de cerca de 20 % mals alta para a estirpe de MAE1. O que é mais importante, o MAEl tem uma taxa de produção de etanol específica mais alta de cerca de 25 % (18,85 contra 23,64 C-mmol/g de célula h) . As taxas de produção de etanol mais altas 59 específicas são vantajosas em processos que são fisicamente forçados pela quantidade de biocatalisador que pode ser utilizado, por exemplo sistemas de fermentação imobilizados por célula. Além disso, o rendimento de etanol na glicose para a estirpe que expressa em excesso ο MAE1 é de cerca de 4 % mais comparado com o controlo (0,478 contra 0,499 C-mol/C-mol).

Estes resultados revelam que a estirpe de H2193 de S. cerevisiae recombinante que expressa em excesso a enzima málica endógena (MAE1) aumentou significativamente as capacidades para a produção de etanol da glicose como o substrato de carbono. A estirpe recombinante também produz significativamente menos (indesejada) massa de célula, não só aumentando por meio disso os rendimentos de produtos desejados mas também reduzindo as cargas de disposição.

Tabela 3. Fermentações de glicose com a estirpe recombinante de

Saccharomyces cerevisiae que exprime ο MAE1 (H2193) e a estirpe de controlo (H2189): os fluxos médios expressos quer em termos volumétrico (Jv, C-mmol/L h) ou específico (Js, C-mmol/g de célula h) (intervalo de tempo: 3,3 a 2 9 horas). As concentrações de glicose e as de etanol representam valores médios de quatro medições: duas com HPLC e duas com ensaios enzimáticos.

Biomass Cg/L) Glicose (g/L) Etanol (g/L) H2193 H2186 H2193 H2186 H2193 H2186 Jv (C-mmol/L h) 1,68 3, 01 30, 61 36,32 15, 27 17,35 Js (C-mmol/g-célula h) 2, 60 3,27 47, 37 39, 47 23, 64 18,85 60 A experiência anteriormente descrita foi repetida com as modificações seguintes: (1) O tamanho do inoculo do bio-reactor foi aumentado em cerca de 0,1 g/L para cerca de 2 g/L, e, (2) Em adição à utilização de um grande inoculo (cerca de 2 g/L) , subsequente à exaustão de glicose (24 horas) uma solução concentrada de glicose foi adicionada ao fermentador para dar uma concentração de glicose final de cerca de 45 g/L e a fermentação foi deixada a proceder durante 2 4 horas adicionais (lote repetido). Os resultados primários foram como se segue para os dois casos: (1) A expressão em excesso da enzima málica resulta em taxas específicas ma is altas da produção de etanol ( + 9 %) e de consumo de glicose (+20 %) com menos glicose que é divergida para a biomassa para (-16 %); (2) A expressão em excesso da enzima málica aumentou as taxas de produção de etanol específicas em 6 e 8 % para a primeira e a segunda fases respectivamente, enquanto que as taxas de absorção de glicose correspondentes são também mais altas em 16 e 17 % nas duas fases. A concentração de biomassa inicial de 2 g/L para ambas as estirpes aumentou para 5,73 e 6,36 g/L para a estirpe que produz em excesso a enzima málica e o controlo respectivamente durante a primeira fase (isto é 10 % menos de MAE 1) . Os valores

correspondentes para a segunda fase foram de 7,66 contra 8,15 g/L (isto é 6 % menos de MAE1).

Para resumir, estas três experiências revelam que a estirpe de S. cerevisíae recombinante H2193 que expressa em excesso a enzima málica nativa (MAE1) tem capacidades significativamente aumentadas para a produção de etanol da glicose como o substrato de carbono (as taxas específicas aumentaram até 25 %, os rendimentos aumentaram em 4 %) . A estirpe recombinante também produz significativamente menos (indesej ada) massa de célula, não só 61 aumentando por meio disso os rendimentos de produtos desejados mas também reduzindo as cargas de disposição.

Exemplo 14. Efeito da Enzima Málica: Produção de Etanol a partir de Xilose A fermentação de xilose em etanol foi conduzida em 1,8 litros de Fermentador de Chemap CMF (Suíça) através de estirpes geneticamente projectadas de Saccharomyces cerevisíae derivada de S. cerevisiae CEN.PK2/VW-1b (Boles et al. [1996]) designada a seguir como H1346. Mais especificamente, as quatro estirpes utilizadas neste exemplo são como se segue: (í) H2195: a H1346 que transporta as integrações cromossómicas dos genes que codificam a reductase de xilose (XR) e a desidrogenase de xilitol (XDH) (estirpe de H1469) transformada com um plasmídeo que expressa a enzima málica de S. cerevisiae (MAE1, ORF YKL029c) (ii) H2191: a H1469 transformada com o vector de clonagem (YEplacl95) e que serve como um controlo para a estirpe de H2195. (iii) H2222: a H1346 que transporta as integrações cromossómicas dos genes que codificam a reductase de xilose (XR), a desidrogenase de xilitol (XDH), e a xiluloquinase (XK) (estirpe de 2217) transformada com um plasmídeo que expressa a enzima málica de S. cerevisiae (MAE1, ORF YKL029c); (iv) H2221: a H2217 transformada com o vector de clonagem (YEplacl95) e que serve como um controlo da estirpe de H2222. A omissão de uracilo (URA) do meio de crescimento minimiza a segregação do plasmídeo. 0 inoculo foi preparado por se transferir uma única colónia para um frasco de Erlenmeyer de 250 mL que continha 50 mL do meio completo sintético sem o uracilo (SC-URA) + 0,1 M de fosfato + 20 g/L de glicose. As células foram cultivadas durante a noite num agitador rotativo a 150 rpm, 30 °C e depois o caldo inteiro foi transferido 62 para um frasco de 2 L que continha 500 mL de SC-URA + 0,1 M de fosfato + 50 g/L de glicose. A cultura foi ma is uma vez cultivada durante a noite como em cima e as células foram depois colhidas através de uma centrifugação durante 10 minutos a 4 500 rpm e a 4 °C. As células foram depois lavadas com 0,1 M de tampão de fosfato (pH=5,5) e ressuspensas no mesmo tampão cada uma para um volume final de 100 mL e posteriormente transferidas para o fermentador. O meio de fermentação conteve (por litro): base de azoto de levedura (sem arrtino ácidos) , suplementos de amino ácidos, 50 g de xilose. A temperatura do fermentador foi mantida a 30 °C, o pH foi controlado a 5,5 através da adição de 2 M de NaOH, e a agitação foi constante a 300 rpm. A cultura foi executada em condições anaeróbicas por se lavar o caldo com o azoto a uma taxa de fluxo constante de 0, 1 wm. As amostras liquidas foram retiradas do fermentador a intervalos de tempo para se medir o crescimento, o consumo de substrato, e a formação de produtos extracelulares. A biomassa, a glicose, o etanol, o glicerol e o acetato foram medidos como no exemplo prévio. a) Fermentações de xilose anaeróbicas com estirpes de H2195 e H2191 A Figura 8 mostra os perfis de tempo da biomassa e a turvação para a estirpe (H2195) que expressa em excesso a MAEl e para a estirpe de controlo (H2191). Note-se que as Saccharomyces cerevisiae que expressam os genes que codificam o XR e o XDH em geral podem utilizar xilose, no entanto, são incapazes de crescer em xilose anaerobicamente. Como ilustrado pela Figura 8, a expressão em excesso da enzima málica nativa tem de facto um efeito positivo na viabilidade da célula nestas condições. A estirpe de H2195 retracta um crescimento inicial em xilose até em condições anaeróbicas que é 63 seguido por um declínio na biomassa a um nível depois de 32 horas que corresponde àquele do inoculo. Pelo contrário, a biomassa do controlo declina monotonicamente durante este mesmo período de tempo de um valor inicial de 2,11 para baixo a 1,47 g/L, isto é uma baixa da biomassa de cerca de 30 %. A Figura 9 resume as taxas metabólicas específicas totais (C-mmol/g de célula h) para estas duas fermentações de lote. Evidentemente, em adição à prevenção da degradação da célula, a expressão em excesso da enzima málica tem também um efeito positivo na utilização de xilose e na produção tanto de etanol como de xilitol. A utilização de xilose é aumentada em mais de 55 %, e as produtividades de etanol e de xilitol são aumentadas até 20 % e 25 %, respectivamente.

Estes resultados revelam que a estirpe de H2195 de S. cerevisiae recombinante que expressa em excesso a enzima málica nativa (MAE1) tem capacidades significativamente aumentadas para a utilização de xilose bem como para a produção de etanol e de xilitol da xilose. A estirpe recombinante também pode suster a sua viabilidade durante períodos de tempo prolongados. b) Fermentações de xilose anaeróbicas com as estirpes de H2222 e H2221

Esta experiência foi levada a cabo como descrita na parte (a) excepto o facto das estirpes de H2195 e H2191 terem sido substituídas com as estirpes de H2222 e H2221 que em adição aos genes que codificam o XR e o XDH também transportam uma integração cromossómica de um gene que codifica o XK nativo. A estirpe de H2222 expressa em excesso a enzima málica nativa. 64 É evidente a partir da Figura 10 que a expressão em excesso da enzima málica tem um efeito aumento significativo na produção de etanol da xilose, e também que isto pode ser sustentado durante vários dias sucessivamente.

Como indicado na Figura 11, o aumento da taxa de produção de etanol específica está perto de 30 % comparada com a do controlo, e a utilização de xilose especifica está até cerca de 5 %. Além disso, como indicado pela Figura 12, a estirpe de controlo acumula uma quantidade de biomassa signífícativamente mais alta sobre este período de tempo de 144 horas (2,03 contra 1,47 g/L, isto é cerca de 40 %). Este comportamento parece ser diferente quando comparado com as estirpes de H2195 e H2191 descrita na parte (a) em cima. Uma causa plausível desta diferença pode estar ligada com o XK que pode desempenhar um papel significativo na utilização de xilose (note-se que a H2222 e a H2221 transportam integrações cromossómicas de XK nativo). No entanto, a redução na biomassa observada na parte (b) está de bom acordo com a observada no exemplo 13 que trata com o efeito de MAE1 na conversão de glicose em etanol. Além do mais, o rendimento molar de etanol em xilose foi de cerca de 25 % mais alto para a estirpe que expressa em excesso a enzima málica: 0,114 contra 0,091 C~mol de etanol por C-mol de xilose.

Em resumo' estas experiências revelam que as estirpes de H2195 e de H2 2 2 2 de S cerevisiae recombinantes que expressam em excesso a enzima málica nativa (MAE1) em contextos genéticos sem e com o XK, respectivamente, têm capacidades significativamente aumentadas para a utilização de xilose e para a produção de etanol de xilose como o substrato de carbono (até 30 %). Além do mais, a estirpe de H2222 produz menos (indesejado) acetato (-30 %). Na base a que falta o XK so o microrganismo transformado de acordo com a invenção (H2195) é 65 capaz de sobreviver nas condições de processo. Por outro lado, na base com o XK, em que o microrganismo não transformado pode sobreviver, o microrganismo transformado de acordo com a invenção (H2222) produz significativamente menos (indesejada) massa de célula (até 40 %), não só aumentando por meio disso os rendimentos de produtos desejados mas também reduzindo as cargas de disposição.

Exemplo 15. Construção de um vector de integração para a expressão do gene que codifica a enzima málica de S. Cerevisiae em Schizosaccharomyces Pomhe O vector de YEplacl95 com a enzima málica que inclui o promotor e o terminador de PGK do exemplo 10 foi digerido com HindIII e 3,7 kpb de fragmento isolado a partir de um gel de agarose. Este fragmento foi tratado com a enzima de Klenow para tornar as extremidades planas. Este fragmento foi depois ligado ao local de Smal do vector de pJK210 (ATCC8 6957) . 0 vector foi digerido com Avrll para a integração através de recombínação homóloga no gene de URA4.

Exemplo 16. Construção de um vector de muiticópia para a expressão dos genes que codificam a reductase de xilose e a desidrogenase de xilitol de P. Stípltis em Schizosaccharomyces Pomhe 0 fragmento de Saci e de Nsil do Exemplo 1, que contém o gene para a reductase de xilose sob o promotor e o terminador de PGK e o gene para a desidrogenase de xilitol sob um promotor e um terminador de ADH1 modificado foram isolados a partir de um gel de agarose. Foi depois ligado ao vector de pSPl (ATCC77497), o qual contém o gene de LEU 2, o qual foi linearizado através de digestão com PstI e

Saci. 66

Exemplo 17. Transformação de Schizosaccharomyces Pombe O vector linearizado do exemplo 15 foi transformado através de electroporação (httgj_//www.bio. uva . nl/pombe/handbook) para a estirpe de ATCC2Q1400 de S. pombe. Uma estirpe de controlo foi feita de uma forma semelhante por se integrar o vector vazio de pJK210. Os transformantes foram seleccionados para auxotrofia de URA. 0 vector de multicópia do exemplo 16 foi transformado da mesma forma. Os transformantes foram seleccionados para auxotrofia de LEU adicional. A estirpe resultante é chamada de H2369 (VTT C-99323) e a estirpe de controlo sem actividade da enzima málica de H2370 (VTT C-99324).

Exemplo 18. Efeito da Enzima Málica: Produção de Etanol a partir de Xilose com Schizosaccharomyces Pombe A fermentação de xilose para etanol foi conduzida em 1,8 litros de Fermentador de Chemap CMF (Suiça) através de estirpes geneticamente projectadas de Schizosaccharomyces pombe derivadas da estirpe de H2153 (ATCC 201400) de S. pombe. Mais especif icamente, as duas estirpes utilizadas neste exemplo são como se segue: (i) H2369: a H2153 que transporta uma integração cromossómica do gene de S. cerevisiae que codifica a enzima málica e transformada com um plasmídeo de multicópia que expressa os genes que codificam a reductase de xilose (XR) e a desidrogenase de xilitol (XDH) de

Pi chia stipitis. (i i) H2370: a H2153 que transporta uma integração cromossómica do vector de clonagem de pJK210 e transformada com um plasmídeo de multicópia que expressa os genes que codificam a reductase de xilose (XR) e a desidrogenase de xilitol (XDH) de

Pichía stipitis. A omissão de uracilo (URA) e de leucina (LEU) do meio de crescimento minimiza a segregação do plasmídeo. 67 O inoculo foi preparado por se transferir uma única colónia para um frasco de Erlenmeyer de 250 ml que continha 20 mL de Meio Mínimo de Edimburgo (http://www.bio.uva.nl/pombe/handbook/sectlonl/sectionl -8.html) com a adição de 225 mg/L de adenina, histidina e cloridrato de lisina (EMM2 + ADE + HIS + LYS) + 20 g/L de glicose. As células foram cultivadas durante cerca de 50 horas num agitador rotativo a 200 rpm, 30 °C e depois o caldo inteiro foi transferido para um outro frasco de Erlenmeyer de 250 mL que continha 50 mL do mesmo meio. As células foram cultivadas durante cerca de 24 horas num agitador rotativo a 200 rpm, 30 °C e depois o caldo inteiro foi transferido para um outro frasco de 2 L que continha 700 mL de EMM2 + ADE + HIS + LYS + 50 g/L de glicose. A cultura foi cultivada durante cerca de 40 horas como em cima e as células foram depois lavadas com 0,1 M de tampão de fosfato (pH-5,5) e ressuspensas no mesmo tampão cada uma para um volume final de 100 mL, OD 600 de ambas as estirpes que foram ajustadas para o mesmo valor com o tampão e posteriormente transferidas para o fermentador. O meio de fermentação continha EMM2 + ADE (225 mg/L) + HIS (450 mg/L) + LYS (450 mg/L) + 50 g/L de xilose. A temperatura do fermentador foi mantida a 30 °C, o pH foi controlado a 5,5 através da adição de 1 M de KOH, e a agitação foi constante a 300 rpm. A cultura foi levada a cabo em condições mícroaeróbicas por se lavar o caldo a uma taxa de fluxo constante de 0,5 SLPM com a mistura de azoto e ar (7:1), a fracção de oxigénio na entrada sendo assim de 2,5 %. As amostras líquidas foram retiradas do fermentador a intervalos de tempo para se medir o crescimento, o consumo de substrato, e a formação de produtos extracelulares. A biomassa foi medida de acordo com o ODeoo e foi medido o peso seco das amostras. A xilose, o etanol, o xilitol, o giícerol e o acetato foram medidos com HPLC. 0 etanol também foi 68 medido através de ensaio enzimático com Cobas - Mira. A Figura 13 mostra os perfis de tempo da biomassa e a turvação para a estirpe de H2369 e para a estirpe de controlo de H2370. Como ilustrado pela Figura 13, a expressão da enzima málica tem de facto um efeito positivo na viabilidade da célula nestas condições. 0 declínio na biomassa é de 2,6 a 1,9 g/L com a H2369 e de 2,43 a 1,2 g/L com a estirpe de controlo de H237 0. Começando a partir de níveis de biomassa muito semelhantes, o controlo diminui em mais de 50 % e a estirpe transformada de acordo com a invenção em menos de 30 %. Assim, isto é um outro exemplo que revela que em condições em que as estirpes de controlo têm uma capacidade pobre de sobreviver e de manter a sua biomassa e a capacidade metabólica, as estirpes transformadas de acordo com a invenção têm uma capacidade melhorada de manter a sua biomassa e consequentemente a sua capacidade metabólica. As médias logarítmicas das biomassas durante a fermentação são de 2,23 g/L para a H2369 e de 1,74 g/L para a H2370. A Figura 14 mostra as taxas de produção de etanol volumétricas com a estirpe de H2369 e a estirpe de controlo de H2370. Como ilustrado pela Figura 14 a produção de etanol volumétrica com a H2369 é significativamente mais alta em comparação com a estirpe de controlo de H2370 ( + 62 %} . A taxa de produção de etanol específica é mais alta em 26 % (0,386 contra 0,305 C-mmol/g de célula h) .

Evidentemente, em adição à prevenção da degradação da célula, a expressão da enzima málica tem também um efeito positivo na produção de etanol. A utilização de xilose volumétrica é aumentada em 4 7 % (9,7 g/L contra 6, 6 g/L) . Também a taxa específica é aumentada (até cerca de 15 %; 1,45 contra 1,26 C-mmol/g de célula h, resultados não mostrados aqui), mostrando que a capacidade 69 metabólica da biomassa extra mantida através da estirpe transformada foi mesmo maior do que aquela da estirpe de controlo.

Estes resultados revelam que a estirpe de H2369 de S. pombe recombinante que expressa a enzima málica de S. cerevisiae tem capacidades significativamente aumentadas para a utilização de xilose bem como para a produção de etanol de xilose. Ά estirpe recombinante também pode suster a sua viabilidade durante períodos de tempo prolongados. Além do mais, a estirpe de H2369 produz menos (indesejado) acetato (-43 %). Estes resultados são comparáveis com as fermentações com a enzima málica nativa que expressa em excesso a S. cerevisiae. Com a S. cerevisiae a utilização de xilose foi aumentada em 55 % e a produção de etanol em 20 %.

Exemplo 19. Clonagem do gene para a desidrogenase de glutamato ligada a NAD a partir de Peptostreptococcus Asaccharolyticus A Peptostreptococcus asaccharolyticus (ATCC 14963} foi cultivada anaerobicamente e o ADN genómico isolado. O gene que codifica a desidrogenase de glutamato ligada a NAD foi depois clonado de acordo com a sequência publicada por Snedcor et ai. (1991) através de PCR, utilizando os oligonucleótidos seguintes: 5'-GAG GAT CCA TAG GAG CGC ATG TTG GAC C-3' e 5'-CAG GAT CCT CTG TTA GGG ATT TAC TCC-31. A polimerase de EXT de DiNAzima (Finzimas) foi utilizada e o produto de PCR de 2,4 kph resultante foi ligado ao vector de pCR 2,1 TOPO (Invitrogen) e transformado para células de E. coli TOPIOF (Invitrogen) de acordo com as instruções do fabricante.

Exemplo 20. Construção de um vector de ida e volta de E. coli -Corynebacterium glutamicum que contém o gene que codifica a desidrogenase de glutamato ligada a NAD a partir de 70

Peptostreptococcus Asaccharolyticus O plasmídeo de pAJ655, um vector de ida e volta de E. coli -Corynebacterium glutamicum, foi isolado a partir da estirpe de ATCC 39135 de Corynebacterium glutamicum e digerido com BamHI. O vector foi purificado num gel de agarose e as extremidades desfoforiladas com fosfatase alcalina de camarão. O vector de TOPO pCR 2.1 com o gene que codifica para a desidrogenase de glutamato ligada a NAD de Peptostreptococcus asaccharolyticus do Exemplo 19 foi digerido com BamHI e o fragmento de 2,4 kpb isolado a partir de um gel de agarose. O fragmento de 2,4 kpb foi depois ligado ao vector de ida e volta linearizado e transformado paras as células DH5oí de E. coli.

Exemplo 21. Transformação do vector de ida e volta para uma estirpe de Corynebacterium Glutamicum

As estirpes de Corynebacterium glutamicum de ATCC 21799 (E-991193) e ATCC 21253 (E-991192) foram transformadas com o vector de ida e volta obtido no Exemplo 20 através de electroporação (Follettie [1989]). Estas estirpes foram escolhidas porque foram desenvolvidas para produzir um excesso de lisina. O plasmídeo foi recuperado a partir das estirpes transformadas, digerido com BamHI e os produtos de digestão separados num gel de agarose como mostrado na Figura 15. Na linha 1 está o vector digerido de um transformante de ATCC 21253 e na linha 3 está o vector digerido a partir de um transformante de ATCC 21799 o qual é chamado de VTT E-991203. A figura mostra o vector de 10 kpb e a inserção de 2,4 kpb. Um segundo isolado de ATCC transformado foi 71 denominado VTT E-991204, e o plasmídeo recuperado a partir deste isolado comportou-se da mesma forma como mostrado para o VTT E-991203 na Figura 15.

Exemplo 22. Mediação da actividade da desidrogenase de glutamato ligada a NAD em extractos de célula de Corynebacterium Glutamicum

Os extractos de célula das células de Corynebacterium glutamicum foram preparados por se vortexizarem 500 mg de células de peso húmido, 500 pL de 100 mM de tampão de fosfato de sódio a pH 7,0 e 500 pL de contas de vidro durante 20 minutos a 4 °C em tubos de

Eppendorf de 15 mL. Os tubos foram centrifugados a 4 °C e a 13 000 rpm numa centrifugadora de topo de mesa e o sobrenadante analisado. O tampão para o ensaio da actividade continha 100 Mm de fosfato de sódio a pH 7,0, 20 mM de cloreto de amónio e 200 μΜ de NADH. A reacção foi começada por se adicionar o α-cetoglutarato a uma concentração final de 2 mM. A actividade foi calculada a partir da modificação na absorvência de NADH a 340 nm. Os ensaios da enzima foram feitos a 30 °C. A quantidade de proteína extraída foi medida com o ensaio de proteína de BioRad que utiliza o IgG como um padrão. As actividades da enzima entre 0,1-0,2 nkat/mg foram encontradas para um transformante da estirpe de ATCC 21253 e de 0,1-0,2 nkat/mg de transformantes da estirpe de ATCC21799 as quais são chamadas de VTT E-991203 e VTT E-991204.

Exemplo 23. Produção de lisina através de Corynebacterium

Glutamicum transformada

Fermentação em frascos de agitação: as estirpes de VTT E-991203 e de VTT E-991204 foram analisadas em fermentações de frasco de agitação como descrito por Kiss (1991), excepto no facto do 72 antibiótico utilizado ter sido 10 mg/L de cloramfenicol em vez de canamicina. Como um controlo a estirpe progenitora de ATCC 21799 foi cultivada na ausência de um antibiótico. 1 mL <je uma pré-cultura, cultivada em LB, foi díluido em 50 mL de meio de CGM1 {Kiss [1991] ) e cultivado a 30 °C em frascos de Erlenmeyer de 250 mL deflectores num agitador a 250 rpm. Os amino ácidos nos sobrenadantes foram analisados através de HPLC e a glicose com um ensaio de enzima. Os resultados são mostrados na Tabela 4.

Tabela 4. Produção de lisina através de uma estirpe de controlo (ATCC21799) e dois transformantes de acordo com a invenção de Corynebacteri um gl utamic.um

Biomassa Glicose Treonina Lisina Lisina produzida (g de peso utilizada utilizada produzida (g/g (g/g de glicose seco/L) (g/L) (mg/L) de biomassa) utilizada) VTT E-991203 0, 855 3, 3 73, 6 0, 408 0,105 16,5 %) (49 %) VTT E-991204 1,236 3,5 94,8 0,426 0,150 (17,5 %) (63 %) ATCC 21799 4,93 13,7 144,7 0,484 0,173 (68,5 %) (96 %)

As duas estirpes transformadas de VTT E-991203 e de VTT E-991204 cresceram mais lentamente do que o controlo porque (ao contrário do controlo) elas contêm vectores de ida e volta e foram cultivadas na presença de cloramfenicol. Quando a produção de lisina foi medida, os transformantes estavam ainda na fase I da fermentação, isto é a treonína estava ainda presente, ao passo que o controlo estava perto de ou na fase estacionária e tinha consumido quase toda a treonina. Na Corynebacteria a produção em excesso de L-lisina 73 começa só na fase II, depois da treonina ser utilizada (Vallino [1991]). Notavelmente, no entanto, os transformantes já produziram a lisina durante a fase I, e as quantidades de lisina produzida por grama de biomassa foram só de 16 % e de 12 % menos do que os produzidos pelo controlo na etapa que produz em excesso a lisina normal (fase II) . Além disso, os rendimentos de lisina na glicose utilizada obtidos com os transformantes aumentou marcadamente à medida que os transformantes cresceram através da fase I (de 0,105 g/g quando 49 % de treonina foram consumidos a 0,15 g/g quando 63 % de treonina foram consumidos). Para as estirpes de Corynebacterium glutamicum convencionais que produzem excesso de lisina os rendimentos de lisina na glicose utilizada esperados nesta etapa da fermentação estão perto de zero (Vallino [1991]). É evidente que quando os transformantes emergem a partir da fase I na etapa de produção em excesso de lisina normal (quando o crescimento está completo, e glicose não é mais divergida para a produção de biomassa) as taxas e os rendimentos da produção de lisina vão exceder aqueles do controlo. É claro para os especialistas na técnica que o crescimento lento dos transformantes pode ser acelerado por se integrar o gene para a desidrogenase de glutamato ligada a NAD nos genomas dos transformantes, evitando por meio disso a desvantagem de suportar um plasmideo e eliminar a necessidade de cloramfenicol no meio de crescimento.

Este exemplo revela que a transformação de uma estirpe de Corynebacterium glutamicum que produz um excesso de lisina com um gene para a desidrogenase de glutamato ligada a NAD de acordo com a invenção aumenta a produção de lisina através do transformante pelo menos durante as primeiras etapas de crescimento. É esperado que o aumento substancial dos rendimentos de lisina na glicose seja obtido quando as fermentações com os transformantes são continuadas 74 na fase II.

Exemplo 24. Co-expressão dos genes de Alcaligenes eutrophus que codificam a reductase de poli-hidroxibutirato (PHB) e a sintase de PHB com o gene que codifica a desidrogenase de glutamato dependente de NAD ou o gene que codifica a enzima málica de S. Cerevísíae O plasmídeo de pRS303 (Sikorski e Hieter [1989]) foi digerido com Saci e Xbal e isolado a partir de 0,7 % de gel de agarose. O fragmento de 4,8 kpb de GDH2 (que contém o gene com o seu próprio promotor) numa cassete de Saci / Xbal (Boles et al. [1993]) foi ligado ao vector de pRS303 que cria o plasmídeo de pGDH2-303. A origem de 2 microns da replicação foi cortada a partir do plasmídeo de pLGSD5 (Guarente et al. [1982)) com EcoRI e as extremidades tornaram-se planas com a Polimerase do Fragmento Grande de Klenow. O plasmídeo de pRS303 foi digerido com Xhol e as extremidades tornaram-se planas com a Polimerase do Fragmento Grande de Klenow. A origem de replicação foi depois ligada em pRS303 que cria o plasmídeo de pTL92. O plasmídeo de pGDH2-303 foi digerido com Smal e uma banda dupla de 4,8 kpb que contém tanto o fragmento de GDH2 (4,8 kpb) e o vector de espinha dorsal (4,5 kpb) foi isolado a partir de um gel de agarose. Os fragmentos recuperados foram depois digeridos com Kpnl. Esta digestão cliva o vector de espinha dorsal (pRS303) em dois fragmentos que assim permitem o isolamento da banda de 4,8 kpb que contém o fragmento de GDH2. O plasmídeo de pTL92 foi linearizado com Smal e isolado a partir de um gel de agarose. O vector linearizado foi desfosforilado com CIAP (fosfatase alcalina intestinal de bezerro) a 37 °C durante uma hora e depois purificado num gel de agarose. O fragmento de GDH2 plano e o vector plano de 75 pTL92 foram ligados para criarem o p2-GDH2. O plasmideo de p2-GDH2 pode ser transformado na estirpe de S. cerevisiae D603 (MATa/MATa, ura3-52, lys2-801, met, hís3, ade2-l01, regi-501; Sriene et al. [1986]) que expressa os genes heterólogos de Alcalígenes eutrophus que codificam a reductase de PHB e a slntase de PHB num plasmideo de multicópia de p2DPF com um promotor de galactose induzivel, bidireccional, (Carlson 1999]). 0 frasco de agitação e as culturas do bio-reactor com controlos apropriados podem ser executados em meio de SD enriquecidos (DaSilva [1988]) que contêm 10 g/L de cada glicose e galactose. O conteúdo de PHB das células de controlo e as células transformadas de acordo com a invenção é determinado através da análise de GC de extractos de dicloroetano do material de célula seco submetido a propanólise (Riis e Mai [1988] , Leaf et al, [1996]). G consumo de açúcar e as trocas de gás são medidos através de métodos padrão. Deste modo as vantagens esperadas da invenção, tais como o rendimento aumentado de PHB na glicose, a produtividade aumentada, a produção CO2 reduzida e a necessidade de oxigénio reduzido podem ser demonstradas. É claro que o fragmento de 3,8 kpb com o gene de MAE1 entre o promotor e o terminador de PGK1 (ver o exemplo 10) pode ser elenado e expresso na levedura de D603 corri uma estratégia semelhante como a utilizada para o gene de GDH2.

As estratégias semelhantes podem ser utilizadas para introduzir os genes para as desidrogenases de acordo com a invenção em outros microrganismos que produzem o PHB e outros PHAs, incluindo as bactérias já utilizadas na produção industrial de PHAs, tais como a Alcalígenes eutrophus. As enzimas vantajosas incluem a 76 desidrogenase de glutamato ligada a NAD de Peptostreptococcus asaccharolyticus utilizada no Exemplo 21 para transformar uma outra bactéria, Corynebacterium glutamicum.

Microrganismos depositados

Os microrganismos seguintes foram depositados sob as regras do Tratado de Budapeste era DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg lb, D-38124 Braunschweig, Alemanha.

Microrganismo Número de Acesso Data de < depósito Saccharomyces cerevisiae H1791 (VTT C-98298) DSM 12213 4 de Junho de 1998 H1795 (VTT C-98300) DSM 12214 4 de Junho de 1998 H1803 (VTT C-98302) DSM 12215 4 de Junho de 1998 H2193 (VTT C-99317) DSM 12722 5 de Março de 1999 H2195 (VTT C-99320) DSM 12723 5 de Março de 1999 H2222 (VTT C-99322) DSM 12724 5 de Março de 1999 Schizosaccharomyc.es pombe H2369 (VTT C-99323) DSM 12725 5 de Março de 1999 H2370 (VTT C-99324) DSM 12726 5 de Março de 1999 Corynebacterium VTT E- 991203 DSM 12728 12 de Março de 1999 VTT E- 991204 DSM 12729 11 de Março de 1999

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Lista de Sequência <110> Valtion teknillinen tutkimuskeskus 86 <120> Microrganismos transformados com propriedades melhoradas <16Q> 2 <210> 1 <211> 71

<212> PRT <213> Aspergillus nidulans <223> fragmento interno da enzima málica de A. nidulans <400> 1

Arg Gly Thr Asn Asn Glu Glu Leu Leu Asn Asp Lys Leu Tyr Leu Gly 1 5

Leu Arg Gin Arg Arg Ala Gin Gly 20 Lys Phe Vai Arg Met Ala Gly Arg 35 40 Cys Ser Glu Asp Phe Gly Leu Gin 50 55 10 15

Glu Glu Tyr Asp Lys Phe Vai Asp 25 30 Gly Phe Pro Met Pro Ile Ser Thr 45 Asn Ala Lys Arg Ile Leu Asp Arg 60

Tyr Arg Ser Gin Leu Pro Cys 65 70

<210> 2 <211> 156 <212> PRT <213> Trichoderma reesei málica de T. reesei <223> fragmento interno da enzima <400> 2

Ala Gly Ala His Arg Gly Gly Gly 1 5 Gly Cys Arg Asn Ser Ala Arg Gly 20 Ser Ser Arg Leu Ser Lys Ser Ser 35 40

Arg Ser Arg Thr Ser Gly Ser Pro 10 15 Met Asn Ser Ile Leu Arg Thr Thr 25 30 Asn Ile His Cys Thr Ser Thr Leu 45 87

Arg Tyr Ser Pro Gin Arg Ser Ser 50 55 Ser Ser Ser Ser Leu Thr Met Ser 65 70 His Leu Pro Leu Ser Thr Thr Gly 85 Thr Ala Leu Leu Asn Ser Pro Ile 100 Leu Ser Glu Arg Arg Gin Phe Asn 115 120 Glu Gin Thr Leu Asp Asn Gin Vai 130 135 Spr Arg Gly Asp Asp Trp 145 150

Ser Pro Leu cys Cys Lys Pro Arg 60 Ser Ser Lys Pro Thr Lys Phe Ser 75 80 Pro Leu Glu Cys AI a Leu Thr Gly 90 95 Phe Asn Lys Gly Ser Ala Phe Pro 105 110 Leu Thr Gly Leu Leu Pro Ala Asn 125 Lys Arg Ala Tyr Gin Gin Tyr Gin 140 Pro Arg Thr Vai Pro Asp 155

Lisboa, 2 de Fevereiro de 2007

Claims (36)

1 REIVINDICAÇÕES 1. Microrganismo transformado pelo menos com uma molécula de ADN recombinante que codifica ou de qualquer forma que causa a expressão de pelo menos uma enzima seleccionada a partir do grupo que consiste de enzima málica, desidrogenase de glutamato, desidrogenase de aldeído, desidrogenase de malato, desidrogenase de glicerol-3-fosfato, xilose-1-desidrogenase, desidrogenase de gliceraldeído de 3-fosfato, reductase de oroato e reductase de ferredoxina que causa a união funcional da oxidação e a redução de substratos através de duas reacções de desidrogenase ligadas ao nucleótido de piridina que partilha um substrato comum e tem especificidades diferentes para os pares de coenzima de NAD/NADH e de NADP/NADPH e assim facilita a transferência de electrões entre os dois pares de coenzima através dos referidos substratos, produzindo por esse meio o referido microrganismo transformado, produtos úteis mais eficientemente do que um microrganismo não transformado correspondente.

2. Microrganismo de acordo com a reivindicação 1, produzindo o referido microrganismo mais produto por unidade de matéria prima do que faz um microrganismo não transformado correspondente.

2. Microrganismo de acordo com a reivindicação 1, produzindo o referido microrganismo um produto mais rápido do que faz um microrganismo não transformado correspondente.

4. Microrganismo de acordo com a reivindicação 1, produzindo o referido microrganismo menos CO2 por unidade de um produto 2 produzido do que faz um microrganismo nao transformado correspondente,

5. Microrganismo de acordo com a reivindicação 1, tendo o referido microrganismo uma necessidade reduzida de oxigénio por unidade de um produto produzido do que tem um microrganismo não transformado correspondente.

6. Microrganismo de acordo com a reivindicação 1, que em condições de um processo biotecnológico mantém um nível mais alto da capacidade metabólica necessária para o referido processo do que faz um microrganismo não transformado correspondente.

7. Microrganismo de acordo com a reivindicação 6, em que a capacidade metabólica necessária de um microrganismo não transformado correspondente diminui com o tempo em condições do referido processo biotecnológico.

8. Microrganismo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 1, em que o produto é o etanol.

9. Microrganismo de acordo com a reivindicação 8, em que o etanol é derivado de uma pentose.

10. Microrganismo de acordo com a reivindicação 8, em que o etanol é derivado de uma hexose.

11 - Microrganismo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, em que o produto é um ou mais amino ácidos. 3

12. Microrganismo de acordo com a reivindicação 11, em que o amino ácido é a lisina.

13. Microrganismo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, em que o produto é o poli-hidroxialcanoato.

14. Microrganismo de acordo com a reivindicação 13, em que o poli-hidroxialcanoato é o poli-hidroxibutirato.

15. Microrganismo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, em que o produto é pentitol.

16. Microrganismo de acordo com a reivindicação 15, em que o pentitol é o xilitol.

17. Microrganismo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 16, cujo microrganismo é uma levedura.

18. Microrganismo de acordo com a reivindicação 17, cujo microrganismo é uma estirpe de Saccharomyces spp., de Schizosaccharomyces spp. ou de Pi chia spp.

19. Microrganismo de acordo com a reivindicação 9, 0 qual é uma estirpe de Saccharomyces spp., ou de Schizosaccharomyces spp. que expressam os genes que codificam a reductase da xilose e a desidrogenase de xilitol, e o qual é transformado pelo menos com uma molécula de ADN recombinante que codifica ou de outra forma que causa a expressão de uma enzima a qual é uma desidrogenase ligada ao nucleótido de piridina.

20. Microrganismo de acordo com a reivindicação 19, 0 qual 4 adicionalmente expressa o gene que codifica a xiluloquinase.

21. Microrganismo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 16, cujo microrganismo é uma bactéria.

22. Microrganismo de acordo com a reivindicação 21, cujo microrganismo é uma estirpe de Corynebacteia ou de Brevibacteria.

23. Estirpes de Saccharomyces cerevisiae seleccionadas a partir do grupo que consiste de H1791 (VTT 098298, DSM 12213), H1795 (VTT C-98300, DSM 12214), H1803 (VTT 098302, DSM 12215), H2193 (VTT 099317, DSM 12722), H2195 (VTT 099320, DSM 12723) e de H2222 (VTT 099322, DSM 12724) .

24. Estirpes de Schizosaccharomyces pombe seleccionadas a partir do grupo que consiste de H2369 (VTT 099323, DSM 12725) e de H2370 (VTT 099324, DSM 12726) .

25. Estirpes de Corynebacteria seleccionadas a partir do grupo que consiste de VTT E-991203 e de VTT E-991204.

26. Método para a produção de produtos úteis a partir de matérias primas, que compreende o passo de fermentar os referidos materiais com um microrganismo de acordo com a reivindicação 1.

27. Método de acordo com a reivindicação 26, em que as matérias primas compreendem pentoses, polímeros de pentose ou as suas misturas. 5

28. Método de acordo com a reivindicação 2 6, em que as matérias primas compreendem hexoses, polímeros de hexose ou as suas misturas.

29. Método de acordo com a reivindicação 27, em que é produzido um pentitol.

30. Método de acordo com a reivindicação 29, em que o pentitol é xilitol.

31. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 26 a 28, em que é produzido um etanol.

32. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 26 a 28, em que são produzidos um ou mais amino ácidos.

33. Método de acordo com a reivindicação 32, em que o amino ácido é a lisina.

34. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 26 a 28, em que são produzidos um ou mais poli-hidroxialcanoatos.

35. Método de acordo com a reivindicação 34, em que o poli-hidroxialcancato é poli-hidroxibutirato.

36. Método para produzir etanol a partir de matérias primas que compreendem pentoses, polímeros de pentose ou as suas misturas, que compreende o passo de fermentação dos referidos materiais com um microrganismo de acordo com qualquer uma das reivindicações 17, 19 e 20. Lisboa, 2 de Fevereiro de 2007