PT98070B

PT98070B - Processo para a producao de genotipos melhorados de milho zea (l.) com capacidade regenerativa de plantas altamente eficiente e a longo prazo

Info

Publication number: PT98070B
Application number: PT98070A
Authority: PT
Inventors: Denes Dudits; Gunter Donn; Sandor Morocz; Janos Nemeth
Original assignee: Hoechst Ag
Priority date: 1990-06-23
Filing date: 1991-06-21
Publication date: 1998-12-31
Also published as: ES2184167T3; JPH04299928A; ATE223148T1; DE69130521T2; EP0873682A2; PT98070A; EP0873682B1; DE69133102D1; ZA914786B; DK0873682T3; ES2124693T3; EP0465875B1; IE912165A1; HU912082D0; TR28031A; JP3865264B2; EP0873682A3; ATE173581T1; HU215163B; DK0465875T3

Description

PROCESSO PARA A PRODUÇÃO DE GENOTIPOS MELHORADOS DE

MILHO ZEA (L.) COM CAPACIDADE REGENERATIVA DE PLANTAS

ALTAMENTE EFICIENTE Ε A LONGO PRAZO

Embora tenham vindo a ser reivindicadas diversas abor dagens alternativas tais como a microinjecção no interior das células, a macroinjecção ou o bombardeamento com partículas revestidas de ADN dos tecidos cultivados ou intactos, como mé todos para transformação genética de plantas de cereais, de acordo com os dados experimentais disponíveis, os protoplastos constituem o material ideal e mais utilizado nos métodos de ma nipulação genética parassexual incluindo a transformação do ADN e a hibridização somática. Estas manipulações genéticas requerem uma metodologia para o isolamento dos protoplastos e para a sua cultura. A aplicação prática, tendo em vista a obtenção de regenerantes férteis a partir de protoplastos manipu lados, constitui um pré-requisito básico. Entre as espécies de sementes monocotiledóneas, o milho constitui uma das culturas de tecidos mais estudadas. Demonstrou-se em diversas publicações que o potencial para a regeneração das plantas a partir de diversos órgãos cultivados incluindo as anteras e os embrióides imaturos é altamente dependente do genotipo [(Green and Phillips, Crop Sei. 15, 417 (1975), Morocz, Tag-Ber., Acad. Lan dwirtsch.-Wiss. DDR, Berlin (1983), Duncan et al., Planta 165,

322 (1985)]. Os melhoramentos das condições de cultura podem apenas tornar possível ultrapassar parcialmente estas limitações [(Duncan et al., Planta 165, 322 (1985)].

Nos últimos anos a pesqueisa tem sido intensa no que se refere ao desenvolvimento dos genotipos e de processos para controlar o problema da regeneração das plantas. Na paten te de invenção europeia 29 24 435 descreve-se um processo seguro segundo o qual se pode obter plantas férteis tomando como material de partida borreletes cicatriciais de milho relativamente não-mucilagineos friáveis e granulares. [Shillito et al. (Bio/Techonology 581 (1989)] and Prioli et al. Bio/Technology Ί_, 589 (1989] descreve a regeneração de plantas a partir de protoplastos de milho. No entanto, nestes casos, os pro toplastos regeneráveis podiam ser isolados apenas após um longo período de cultura, in vitro, de 7 a 8 ou de 20 a 40 meses. Para além disso, as plantas regeneradas apresentavam anomalias na sua morfologia e na sua fertilidade.

Descobriu-se agora que o novo genotipo de Zea mays (L.) pode produzir culturas de tecidos e de suspensões celulares com capacidade reproduzível para regenerar plantas-estáveis normais a predominantemente férteis.

A presente invenção refere-se deste modo a

- a produção de um genotipo de Zea mays (L.) que é auxina- autotrófico e a partir do qual s.e podem produzir protoplastos que são reproduzíveis e que regeneram de um modo estável plantas férteis normais assim como plantas regeneradas e partes e a progénie dessas plantas;

- um protoplasto produzido através de um genotipo tal como se caracteriza em 1, assim como as células regeneradas a partir deste protoplasto possuindo as referidas células a capacidade de regenerarem uma planta

fértil;

- o método para a produção de uma cultura de borreletes cicatriciais de Zea mays (L.) a partir da qual se podem isolar protoplastos, protoplastos esses que são capazes de se regenerarem em plantas férteis carácter izando- se o referido método pelos seguintes pa_s sos:

a) obtenção de borreletes cicatriciais, auxina-auto trõficos relativamente não mucilagineos, granula res e friáveis no meio de conservação de borrele tes cicatriciais e,

b) desenvolvimento dos borreletes cicatriciais do passo a) num meio de conservação de borreletes ci catriciais.

A linha de células DSM 6009 é uma linha de células preferencialmente representativas do genotipo anteriormente carac terizado e encontra-se depositado no Deutsche Sammlung von MikroorganismenundZellkulturen GmbH on June 1, 1990 nas condições do tratado de Budapeste com o número de registo anteriormente referido.

Deste modo a presente invenção também se refere ã linha celular DSM 6009.

Os genotipos, tal como anteriormente se caracterizaram e as técnicas de iniciação e de conservação de cultura, os dados da cultura em suspensão, o isolamento dos protoplastos e as técnicas de cultura desenvolveram-se de acordo com os seguintes pas.

sos:

Passo a) : verificação de um ampla variedade de genotipos habi. tualmente utilizados para potenciais culturas de tecidos.

Ensaiaram-se estirpes de milho natural, de sementeira e espontâneas, quanto â sua capacidade para formar culturas de borreletes cicatriciais a partir das anteras e de órgãos somáticos tais como embriões imaturos meristemas apicais e laterais. Para a cultura de anteras, colocaram-se as anteras com micro-esporas mononucleados num meio de iniciação de cultura de anteras e incubaram-se fora do alcance da luz, de preferên cia entre 21° e 28°C durante 40 a 90 dias.

Para as culturas somáticas colocaram-se os inóculos (por exemplo: embriões imaturos com 1 a 3 mm de tamanho, meristemas com 0,5 a 0,7 cm de tamanho) intactos ou cortados em meio de con servação e de iniciação de culturas somáticas ã luz, entre 21°C e 28°C, durante 30 a 60 dias. Ensaiaram-se as culturas resultantes para se verificar a sua capacidade de regenerarem no meio de regeneração de plantas. Utilizaram-se os genotipos que correspondiam às culturas de tecidos regeneráveis para se efectuar a hibridização cruzada e ensaiaram-se os embriões híbridos do mesmo modo com um registo adicional para a sua regenerabilidade seguido pelo menos de um ano de conservação em cultura de tecidos. 0 material derivado da cultura de anteras foi conservado em meio de conservação haplóide. Os híbridos das estirpes de milho natural, de sementeira ou das estirpes espontâneas, produziram culturas embriogénicas com uma frequência superior. Não perderam a capacidade para se regenerarem após as primeiras pa_s sagens e, regeneraram-se mais facilmente em plantas a partir das suas culturas de tecidos e dos seus progenitores.

Passo b) : Produção de materiais de partida de síntese a partir dos genotipos seleccionados no passo a)

Cruzaram-se, ao longo de sucessivas gerações diversos·

genotipos de culturas de anteras e de inóculos somáticos que provaram ser regeneráveis no passo a), para se obterem materiais de síntese para as culturas de anteras e de tecidos somáticos, envolvendo-se em cada uma delas 6 a 8 genotipos.

Passo c) : Selecção de recombinantes aperfeiçoados com proprie dades de culturas de tecidos superiores.

Utilizaram-se anteras e embriões ou meristemas imaturos, a partir de materiais de síntese tal como se descreveu no passo b), como inóculos para se obter culturas embriogénicas re generáveis melhoradas. Entre as diversas centenas de culturas regeneráveis obteve-se um tipo especial de cultura que se podia conservar tal como na fase embriogénica inicial, de borreletes cicatriciais abundantemente proliferativos. Decorrido um ano de conservação, os genotipos tais como H 229 e OK 281, os genotipos progenitores de DSM 6009, foram obtidos seleccionando e conservando apenas as culturas que produziam regenerantes que se desenvolviam normalmente a partir dos borreletes cicatriciais desenvolvidos na superfície e na cultura em suspensão. Os proto plastos isolados dessas culturas férteis seleccionadas, regenera veis, em fase embriogénica inicial, mostraram ser variáveis na sua viabilidade e culturabilidade. Os genotipos que reagiram positivamente nos ensaios dos protoplastos foram preferencialmente conservados. Após o processo de selecção, os regenerantes dos genotipos do primeiro ciclo foram hibridizados de modo cruzado para se obter um segundo ciclo de genotipos, tal como DSM 6009 (HE 89) que eram igualmente adequados para a iniciação de haplóides regeneráveis ou de culturas de células somáticas e de tecidos e que produziam protoplastos totipotentes a partir de culturas adequadas.

Passo d) : Optimização das condições para regulação das fiasses de desenvolvimento do genotipo nas culturas seleccionadas.

As frequentes e regulares passagens (2 a 3 vezes com intervalos de 1 a 2 semanas) das culturas de tecidos H 229 OK 281 DSM 6009 em meio de conservação, suprimem a posterior diferenciação dos embrióides iniciais e originou rediferencia ções nas últimas fases de desenvolvimento para as fases iniciais. Uma vez obtida a cultura embriogénica inicial homogénea, pode conservar-se esta cultura facilmente em meios de cul tura diferentes a intervalos de passagem menos frequentes (por exemplo: 1 mês). Com passagens menos frequentes ou de preferên cia por transferência para meio de regeneração de plantas, as culturas embriogénicas finais desenvolveram-se a partir das cul. turas embriogénicas iniciais. As culturas embriogénicas finais consistem em embrióides que germinam de modoassincrono que, após uma segunda transferência para meio de regeneração de plantas, produzem um grande número de plantas regeneradas. As culturas embriogénicas iniciais destes genotipos são caracterizadas pela sua aLta flexibilidade em relação aos meios de cultura. Os meios de cultura usualmente utilizados tais como MS [Murashige/ /Skoog, Physiol. Plant 15, 473 (1962) , B5, SH ou N6 (Chu C.C. et al., Sei. Sin. 16, 659 (1975)] podem ser todos utilizados pa ra se iniciar ou conservar as culturas de tecidos H 229, OK 281 e DSM 6009. Da-se preferência ao meio N6M devido ao facto de ser possível conservar estas culturas sem perda da capacidade para regenerarem plantas férteis durante vários anos neste meio (por exemplo : 4 anos no caso de H 229). A estreita interaeção entre o elevado nível de expressão das características embriogê nicas nestes genotipos e a óptima composição do meio N6M para a manifestação da formação de culturas embriogénicas regeneráveis demonstra-se pela aplicabilidade de meio N6M sem hormonas não apenas para a regeneração de plantas mas também para a ini ciação e conservação de culturas embriogénicas destes genotipos. Assim, como consequência, uma importante característica deste genotipos reside no facto da sua capacidade de desenvolvimento autotrófico em auxina.

Passo e) : Melhoramento da conservação das culturas em suspen são que permite a regeneração de plantas férteis após períodos prolongados de cultura.

Devido ao facto das populações celulares que crescem rapidamente terem tendência para acumular mutantes celulares , existe uma necessidade de se melhorar o meio de cultura líquido, no sentido de se prolongar o tempo durante o qual uma cultura em suspensão pode ser regenerada em plantas fenotipicamen te normais e totalmente férteis. Descobriu-se, inesperadamente, que se pode atingir este objectivo substituindo os N6-micro nutrientes por MS-micronutrientes e diminuindo, em comparação com as culturas à superfície, o teor de ácido 2,4-diclorofenoxiacêtico (2,4-D) e aumentando o teor de sacarose (concentração final de aproximadamente 3%) no meio. Este meio, designado por N6M, também ê adequado para as culturas de borreletes cicatriciais embriogênicos iniciais, friáveis, de DSM 6009. Após apro ximadamente duas passagens neste meio, pode utilizar-se a suspensão para se isolar, com bom rendimento, os protoplastos regeneráveis deste genotipo.

Passo f) : Isolamento e cultura de protoplastos

Podem produzir-se os protoplastos dos genotipos descri-8tos por incubação com enzimas de lise, tais como as celulases e as pectinases. Também se podem utilizar os enzimas como misturas, sendo a concentração de um único enzima de aproxima damente 0,05 a 4% (peso em volume). A composição óptima da so lução aquosa de incubação, assim como a concentração de enzima, pode ser estabelecida para cada um dos tipos de tecidos em ensaios simples. Para a estabilização osmótica dos protoplastos, a solução de incubação deverá conter substâncias osmóticas tais como o manitol, o sorbitol, a glicose, a sacarose, a frutose ,

KNO^ ou outros sais caracteristicos dos meios nutrientes das plantas. A osmolaridade da solução enzimática encontra-se de preferência compreendida entre 500 e 750 mOsm, especialmente no intervalo compreendido entre 600 e 700 mOsm. O pH pode variar num intervalo compreendido entre 4,5 e 6,0. Preferencialmente o pH encontrar-se-ã no intervalo compreendido entre 5,5 e 0,6 e é es tabilizado pela adição de 1 a 75 mM de fosfato e de 1 a 10 mM de ácido morfolinoetassulfónico (MES).

Dependendo da concentração do enzima, os protoplastos produzem-se decorridas 3 a 20 horas. Durante o período de incu bação dã-se preferência a uma suspensão cuidadosa, por agitação, especialmente no agitador orbital entre 10 e 50 rpm.

Após a incubação podem transferir-se os protoplastos. para um meio de crescimento contendo sais, vitaminas, aminoácidos, uma auxina de sintese, tal como 2,4-D ou dicamba, assim como açúcares, de preferência uma mistura de frutos, glicose e sacarose.

Preferencialmente cultivam-se os protoplastos em camadas finas (por exemplo: 0,1 « lmm) de meio de cultura de protoplastos ppN6M, em tubos de cultura esterilizados de vidro ou de plã£

tico, adequadamente vedados para evitar a evaporação das cultu ras de protoplastos, na obscuridade a temperaturas compreendidas entre 21° e 26°C. A densidade dos protoplastos necessária para a formação de células e de colónias encontra-se situada entre 5-7x10^ e 3-5x10^ protoplastos por mililitro de meio de cultura de protoplastos. Após um período de cultura de 20 a 40 dias, desenvolveram-se no meio de cultura de protoplastos , colónias visíveis a olho nu. 0 período necessário para a formação de colónias visíveis pode ser encurtado pela adição, pa.s so a passo, de pequenas quantidades de suspensão ou de meio de cultura de protoplastos (por exemplo: 0,2 a 0,5 ml a intervalos de 3 a 4 dias) três semanas após o início da cultura de protoplastos. Colocam-se as colónias visíveis em meio de conservação ou regeneração ou podem utilizar-se, alternativamente para se iniciar uma nova cultura em suspensão.

Passo g) : regeneração e desenvolvimento de plantas regeneradas até à maturidade a partir de culturas derivadas de protoplas^ tos

Colocam-se as colónias derivadas dos protoplastos em meio de regeneração de plantas, onde estas se desenvolvem em em briões somáticos maduros que germinam eventualmente em plântulas. Em meios sem hormonas as culturas embriogénicas iniciais, relativamente homogéneas, formam na sua superfície cachos de te eido erabriogénico bem desenvolvido. Quando se colocam os embri oides germinativos e maduros em meio de regeneração de plantas isento de hormonas e recentemente preparado, um grande número de plantas saudáveis diferencia-se. Quando as plântulas atingem uma altura de 5 a 7 cm e diversas raízes nos primeiros nódulos, removem-se dos recipientes de cultura e separam-se umas

-iodas outras e das peças de agar aderentes. Desembaraça-se o seu sistema de raízes, das raízes não nodais fracas e do meio de cultura utilizando água da torneira. Transplantam-se depois as plantas jovens para o solo. Um solo adequado consiste numa mis tura em partes iguais de turfa, areia e perlite ou qualquer mistura para horticultura comercialmente disponível. Desenvolvem-se as plantas em sacos de nylon ou numa atmosfera húmida duran te dez dias iluminando-as constantemente durante dois dias e de pois periodicamente com uma intensidade de modo a proporcionar a coloração verde normal e o crescimento vigoroso das plãntas. Regam-se e alimentam-se regularmente as plantas com fertilizantes para assegurar o seu crescimento e desenvolvimento normais. Apenas as plantas cuidadosamente cultivadas que conservam a cor verde nas suas primeiras folhas são utilizadas para produzir sementes através de auto-polinização ou de polinização cruzada. A maioria das plantas que são transplantadas para o solo antes de começarem a crescer nos tubos de cultura e que são cultivadas adequadamente produzem plantas bem desenvolvidas desprovidas de anomalias nos órgãos reprodutores.

Passo h): Identificação da estirpe e protecção do geno tipo com a ajuda do polimorfismo de comprimento do fragmento de restrição (PCFR)

Para além das características morfológicas e fisiológicas habituais à medida que se tornam visíveis no início da cultura de tecidos e durante a sua conservação, a regeneração das plantas e as características de estabilidade das plantas dos ge notipos seleccionados e a distribuição dos fragmentos de restri. ção híbridos após a utilização de sondas moleculares definidas,

-11permite a identificação dos genotipos descritos. Isola-se o ADN a partir das linhas progenitoras (H 229 e OK 281) e da linha era briogénica resultante altamente híbrida DSM 6009. Como exemplo, apresenta-se os padrões de hibridização após a digestão do ADN da planta com os enzimas de restrição HindIII e BambHI utilizan do um clone de cADN para um suposto gene receptor da auxina cio nado a partir do milho (U. Tillmann et al. The EMBO J. 1988, 2463-2467]. Como se pode observar na figura 2, todos os genotipos analisados apresentavam um padrão único e característico de bandas de hibridização.

A figura 2a, b apresenta o polimorfismo do fragmento de restrição visível após hibridização com uma inserção de cADN 32 marcada com P para um suposto gene do receptor da auxina (U. Tillmann et al. The EMBO J. 1988, 2463-2467).

OK

H 229 Hind III

DSM 6009

OK

H 229 Bamb HI

DSM 6009

O tempo de exposição a que se refere a figura 2b foi aproximadamente 3 vezes superior ao tempo de exposição a que se refere a figura 2a.

Exemplo 1:

Produção da cultura somática opaca de síntese, MR Syn e da cultura OK 281 numa fase predominantemente embriogénica inicial.

Ζ

-12- >

Desenvolveram-se plantas de diferentes genotipos de mi lho no campo. Três a quatro plantas foram auto-polinizadas e recolheram-se as espigas fertilizadas 12 a 14 dias após a poli nização. Após a remoção do invólucro è das sedas recristalizou-se a super ficie das espigas com uma solução de hipocloreto de sódio a 0,15% contendo 0,5 % de detergente doméstico, durante 10 minutos seguida de três lavagens com ãgua desionizada esterilizada. Dissecaram-se depois assepticamente dez embriões por espiga e colocaram-se com o seu lado achatado com plúmula e a radícula voltadas para baixo em contacto com a superfície de um meio de iniciação e manutenção de cultura somãtica solidificado com o volume de 50 ml (0,8% de agar) em partes de petri de 10 x 2 cm. Incubaram-se as culturas de embriões durante 30-60 dias, com iluminação a 25° mais ou menos 2°C. Após observação, transferiram-se as culturas embriogénicas para meio recentemente preparado a intervalos de um mês e ensaiou-se a capacidade de regeneração das plantas num meio de regeneração de plantas. A par tir dos genotipos ensaiados, verificou-se que os naturais A188, GK3/H e W64A, a reserva genética de ensaio de Mangelsdorf (MT) e uma variedade local de milho de grão duro branco (WLFV) formavam culturas regeneráveis nas condições descritas. No entan to, estes genotipos formaram predominantemente culturas embrio génicas finais muitas vezes referidas como as culturas de tipo I na literatura a que se refere a culturas de tecidos de milho.

O seu potencial regenerador decresceu gradualmente após sucessivas transferências para o meio recentemente preparado e, decor ridos seis meses de conservação, apenas alguns pequenos sectores ocasionalmente regeneráveis se encontravam presentes. Quando se produziram os híbridos dos dois genotipos regeneráveis e se en-13

_._ν •φ saiaram as suas culturas de embriões do mesmo modo, observou-se um melhoramento na proporção de propagação e regenerabilidade. Por exan. pio, a cultura do híbrido A188 x w64A, conservou-se durante três anos sem perda de potencial regenerador. Para facilitar posteriormente a combinação de genes possivelmente vantajosos a partir dos genotipos originais iniciou-se um programa múltiplo de geração cruzada. Englobaram-se duas fontes opacas (OgOg) que não eram regeneráveis nestas condições (Oh 43C>₂0₂) ou que não tinham sido ensaiadas quanto ã sua capacidade para se regenerarem a partir de culturas de tecidos (H Temp AOgOg).

Para se combinar os genes opacos com os genes responsáveis pe las caractsrísticas regeneráveis, tinha de se cruzar em primei, ro lugar os genotipos das fontes opacas com os genotipos regeneráveis. Por isso, plantaram-se estes genotipos, cultivaram-se e isolaram-se as suas espigas antes do aparecimento das se das. As espigas isoladas dos genotipos regeneráveis foram sub metidas a polinização cruzada com pólen de genotipos portadores do gene opaco. Obtiveram-se deste modo os únicos híbridos cruzados (SCI-SG10)) por cruzamento de A188, GK3/H, W64A, MT, e WFLV com Oh43O₂O₂ e H Temp AQgOg· Recolheram-se os grãos des. tes 10 diferentes cruzamentos simples, plantaram-se, desenvolveram-se e isolaram-se tal como anteriormente para a segunda série de polinizações cruzadas para se obter as sementes hibri das duplamente cruzadas (DC1-DC5) a partir, respectivamente, dos cruzamentos SCI x SC7, SC2 x SC8, SC3 x SC9, SC4 x SC10 e SC5 x SC6. A partir da primeira e segunda séries de poliniza ção apenas se recolheu uma espiga de cada uma das polinizações cruzadas para posterior geração. A partir das sementes DC reco lhidas, seleccionaram-se as sementes OgC-ghomozigóticas, com ba

se nos seus fenotipos e plantaram-se. No período de floração numa terceira série de polinizações, cruzou-se cada um dos hi bridos (DCl a DC5) com todos os outros de modo a proporcionar uma recolha de quatro espigas a partir de cada uma das vinte combinações cruzadas. A partir das oitenta espigas resultantes, juntaram-se dez grãos por cada espiga, plantaram-se e polinizaram-se entre si, aleatoriamente, para proporcionar uma possibilidade de recombinação dos genes desejados. Recolheram-se as cem melhores espigas do material das plantas cruzadas en tre si, juntaram-se dez grãos de cada espiga e tomaram-se como material de partida de cultura somática de síntese (MR Syn S°2°2/87j-. 0 material de síntese obtido foi plantado e auto-polinizaram-se as plantas em florescência. A partir de cada uma das cem espigas resultantes da auto-polinização, colocaram-se em placas dez embriões imaturos do modo anteriormente descrito. Aproximadamente 30% dos embriões cultivados (286 em 950) produziram culturas regeneráveis, sendo a maioria delas do tipo embriogénico na fase final. As culturas espontâneas embriogénicas na fase inicial obtidas, muitas vezes referidas como as culturas de tipo II ou culturas embriogénicas friáveis, na literatura que lhes diz respeito, seleccionou-se a cultura OK 281 com base no seu crescimento vigoroso, não existência de necrose, fácil regenerabilidade em plantas e fertilidade em plantas regeneradas.

Exemplo 2

Produção da cultura de anteras de síntese MR Syn A/85 e de cultura haplóide em fase embriogénica inicial, H 229

Plantaram-se diferentes genotipos de milho e cultivaram-se até ao estado fisiológico adequado para se recolherem os pendões com a parte superior das folhas a descoberto. Desdobraram-se as folhas exteriores e retiraram-se. Os restantes pendões que ainda cobriam o vérticilo foram colocados em sacos de plástico e tratados por arrefecimento a uma temperatura com preendida entre 4° e 8°C no frigorífico, durante 10-30 dias. Após este tratamento, removeram-se as folhas de cobertura e se leccionaram-se os sectores dos pendões com anteras portadoras de microsporos mononucleados de fase final utilizando um exame microscópico das anteras mergulhadas em uma solução aquosa de orceina a 2%. Esterilizou-se a superfície das flores portado.ras dos microsporos desejados numa solução de hipocloreto de sódio a 0,1%, contendo 0,5% de detergente doméstico, durante dez minutos, seguida de uma lavagem das flores em água esterilizada de sionizada 3 vezes durante dez minutos. A partir das flores es terilizadas da superfície disseçaram-se aproximadamente cem an teras e colocaram-se em cinquenta mililitros de meio de inicia ção de cultura de anteras em placas de Petri de vidro de 10 x 2 centímetros. Colocaram-se as anteras em placas, incubaram-se fora do alcance da luz durante 40-90 dias a 25°C. Duas varieda des locais, Golden Glow (GG) e a variedade local de dente branco (WDLV) produziram, embora a uma baixa percentagem (inferior a 1%) borreletes cicatriciais haplóides a partir da cultura das anteras. Nenhuma delas regenerou plantas no meio de regeneração. Cruzaram-se as duas variedades locais (GG e WDLV), planta ram-se os grãos híbridos e ensaiaram-se as anteras Fl resultantes do mesmo modo. A partir dos embriões haplóides obtidos podia utilizar-se uma cultura para a regeneração múltipla de plan

tas para a regeneração múltipla de plantas durante um período de um ano antes de perderem o seu potencial regenerativo para se combinar o potencial de formação de embrióides, a capacida de de regeneração das plantas e as características das plantas necessárias para a sobrevivência e crescimento dos regenerantes transplantados para o solo, dez plantas a partir dos híbri^ dos das duas variedades locais foram polinizadas, cruzadamente com uma população de plantas obtida pela hibridização cruzada dê dois híbridos independentes [GK3/H x MT e A188 x A619) x x BMSC] cada um dos quais se descobriu corresponder a uma cultura de antera. Reuniram-se dez grãos a partir das espigas recolhidas, plantaram-se no campo e seleccionaram-se as plantas em função da ausência de condições agronómicas indesejadas (tais como a germinação, ferrugens, perfurações) e cruzaram-se entre si. Após a colheita, conservaram-se as trinta melhores espigas e utilizaram-se para se recolher um igual número de grãos por espiga. Estes grãos representavam a cultura de ante ras de síntese MR Syn A/85. 0 conjunto de grãos de síntese foi plantado e os pendões foram.' recolhidos e tratados de acordo com o método descrito. A partir das culturas de anteras observou-se uma resposta de 0 a aproximadamente 20% de formação de embrióides por placa de Petri. Mais do que 300 embrióides haplóides derivados de diferentes pendões de MS Syn A/85, aproximadamente 20%, desenvolveram-se em culturas embriogénicas rege neráveis após transferência do meio de iniciação para o meio de conservação haplõide. A partir das culturas regeneráveis seleccionou-se a cultura H 229, com base no seu fenotipo do bor relete cicatricial predominantemente em fase embriogênica ini. ciai na sua rápida proporção de propagação na sua capacidade de regeneração de plantas após uma cultura a longo prazo em super fície e em suspensão (mais do que dois anos antes de se utilizar para um posterior ciclo de cruzamento) e na sua capacidade para se dividir e formar colónias e para regenerar plantas a partir de protoplastos.

Exemplo 3: Produção da cultura altamente embriogênica DSM 6009

Foram submetidos a polinização cruzada dois genotipos previamente seleceionados que se desenvolviam em culturas predominantemente embriogênicas de tipo inicial a partir de embriões ou de anteras, no sentido de se combinar as características desejáveis de ambos. As flores femininas das plantas H 229 regeneradas, 30 meses após a iniciação, foram polinizadas com o polen das plantas OK 281 regeneradas 10 meses após a iniciação. Incubaram-se embriões híbridos imaturos obtidos numa cultura de iniciação somática e num meio de conservação somática assim como em meio de regeneração de plantas. Um dos embriões que formavam a cultura embriogênica em fase inicial no meio de regeneração de plantas, DSM 6009 (HE 89), foi seleccio nado, conservado e utilizado para se iniciar as culturas em suspensão. Apenas dois meses após a inoculação do embrião híbrj. do doador (HL29 x OK 281) se iniciou a primeira cultura de pro topiastos, com êxito que conduziu à formação desplantas férteis derivadas de protoplastos. As plantas DSM 6009 possuíam todas as características desejadas dos seus progenitores e mostravam-se superiores a estes em diversas características em cultura de tecidos que anteriormente se referiram.

lf

Exemplo 4: Observação de um meio de cultura em suspensão,

N6M, para a retenção da regenerabilidade em cul turas de tecido de milho seleccionadas

Para além do desenvolvimento do meio de cultura em sus pensão N6M, ensaiaram-se três genotipos regeneráveis independentemente seleccionados (incluindo culturas haplóides e soma ticas em fase inicial embriogénica e em fase embriogênica final) , durante mais de dois anos em cultura em suspensão para se observar as suas propriedades regeneradoras e de fertilidade. Conservaram-se em meio de cultura em suspensão N6M a cultura somática principalmente na fase embriogênica final 4C1 , a cultura somática C2-A, em fase embriogénica final, e a cultura H229 haplóide principalmente numa fase embriogénica inicial. Apesar das culturas em suspensão apresentarem uma proporção superior de propagação, a capacidade de regeneração das plantas destes genotipos seleccionados mostrou-se superior quando se colocavam em placas os embrióides retirados das cu_l turas em suspensão do que a partir das passagenspouco frequen tes (aproximadamente em intervalos de dois meses) das culturas em superfície de agar. Nos três casos, após dois anos de conservação em cultura em suspensão N6M, podiam obter-se plantas férteis. Efectuaram-se observações idênticas com outros tipos de culturas após um ano de conservação nesta cultura em suspen são. No entanto, o meio de cultura em suspensão N6M e preferencial para a conservação de culturas antes do isolamento dos protoplastos.

Preparação e conservação de culturas em suspensão HE/89

Ç

Incubaram-se embriões inferiores a 1 mm (H 229 x OK 281) obtidos a partir de plantas desenvolvidas em estufa doze dois apôs a polinização, em N6M, sem 2,4-D durante três semanas seguindo-se-lhe duas sub-culturas em meios N6M e MSG em intervalos de 10-14 dias antes de se iniciar a cultura em suspensão em meio N6M. Para uma conservação regular utilizaram-se 4 g de cê lulas para se iniciar um novo ciclo de cultura de 5-7 dias em 50 ml em meio N6M em balões de Erlenmeyer de 100 ml. Desenvolve ram-se todas as culturas com eliminação contínua ou periódica, por meio de tubos de luz fluorescente a 22-25°C.

Isolamento e cultura de protoplastos

Esmagou-se com forcepes 2 g de material celular recente mente pesado a partir de culturas em suspensão, dois dias após a última transferência, num mililitro de solução de lavagem (SL) à qual se adicionou 1% de uma solução de reserva nPG. Este tra tamento reduziu o tamanho das colónias de dois a três milímetros. Lavou-se a suspensão de células esmagadas duas vezes com nPG-SL. Incubaram-se as células lavadas em dez mililitros de meio de isolamento de protoplastos, durante quatro horas, fora do alcance da luz com ou sem agitação lenta. Após o tratamento enzimático, fez-se passar a solução através de um crivo de 210 micra e 60 micra, seguindo-se-lhes a centrifugação a 1000 rpm. Suspendeu-se novamente o sedimento em 10 ml de sacarose de 0,6 M+nPG e colocou-se 1 ml de SL + nPG para a segunda centrifugação. Recolheram-se e sedimentaram-se os protoplastos flutuantes novamente em 15 ml de SL + nPG na terceira centrifugação. Contou-se o número de protoplastos utilizando uma câmara de Buerker ou de

-20’

Thoma antes da terceira centrifugação. Cultivaram-se os proto plastos em 2 ml de meio líquido ou embeberam-se em agarose de baixo ponto de gelificação a 0,5-0,7% (Sigma) misturando os protoplastos cuidadosamente com 2 ml de uma solução 1:1, dupla mente resistente, de ppN6M/89 e de 1,2% de agarose fundida , após um prévio ajustamento de temperatura para 45°C em ambas as soluções. Cultivaram-se os protoplastos na obscuridade, a 25°C. Para se alimentarem os protoplastos no meio líquido adi. cionou-se 0,5 ml de meio N6M após três semanas, seguindo-se-lhe a adição de mais 1 ml, dois a três dias mais tarde. Decorridos 3-4 dias, colocou-se a totalidade da cultura em 10 ml de meio N6M recentemente preparado e agitou-se. Colocaram-se as culturas embebidas em agarose quer em N6M solidificadocom ou sem 2,4-D, quer em 10-50 ml de meio N6M líquido apõs 2-4 semanas , na maioria dos casos após 3 semanas.

Regeneração e crescimento das plantas

A partir dos borreletes cicatriciais regenerados em meio de agar, colocou-se 0,2-1 g de borreletes cicatriciais embriogé nicos em 100 ml de meio N6M que não possuía 2,4-D, em recipientes de vidro com uma tampa que continha um rolhão de esponja pa ra arejamento ou em recipientes de plástico. Repete-se este passo até se obterem plantas bem desenvonvidas a partir dos embrióides e das plantas jovens. As plantas maiores (com mais de 7 cm) foram removidas para transplantação para vasos de diferen tes tamanhos contendo diversas espécies de misturas para horticultura ricas em húmus. As plantas com as sedas em emergência e com os pendões a derramar pólen foram auto-polinizadas ou po-

linizadas entre si.

Figura 1 A-K: mostra os diversos tipos de células e as fases de desenvolvimento envolvidas na cultura de DSM 6009, na cultura de milho embriogénico DSM 6009 e na regenração de plan tas normais a partir deste através do processo de cultura de protoplastos. A: cultura embriogénica em fase inicial confirmada, B: cultura em suspensão semi-fina pronta para o isolamen to de protoplastos, C: protoplastos seis horas após o isolamen to, D: As primeiras divisões trinta e duas horas após o isolamento, E: colónias oito dias após o isolamento, F, G: culturas de protoplastos em fase embriogénica inicial e final decorridos dois meses respectivamente, plantas regeneradas a partir dos protoplastos antes (H) e após (I) da transplantação para o solo, K: plantas maduras derivadas de protoplastos, com sementes , três meses e meio após a transferência para o solo.

Definições

H 229:

Obteve-se uma cultura de tecidos de Zea mays (L.) haplóide regenerável e o genotipo através de uma cultura de anteras a par tir de uma cultura de anteras MS Syn A/85 de síntese que se pro duziu por polinizações sucessivamente cruzadas e entre si com a inclusão dos seguintes genotipos: A188, A629, GK 3/H (naturais), milho Black Mexican Sweet (BMSC), de ensaios de Mangelsdorf (MT) (reservas genéticas), de uma variedade local de dente branco (WDLV) e das variedades locais Golden Glow (GG). A cultura H 229 é predominantemente de fase inicial embriogénica, enquanto que os protoplastos de cultura em suspensão se desenvolveram em

-22plantas nas condições definidas. As plantas H 229 obtidas a partir das culturas de tecidos H 229 são plantas femininas férteis, produzindo sementes após polinização com grãos de pó len viáveis.

OK 281:

Uma cultura de tecidos Zea mays (L.) somática predomi nantemente em fase inicial embriogênica, regenerável, obtida através da cultura de embriões imaturos a partir de MR Syn SO₂SO₂/87 que se produziu por sucessivas polinizações cruzadas, polinização entre si e auto-polinização, com a inclusão dos se guintes genotipos: A 188, GK 3/H, W 64 A, 43O₂O₂ (naturais) ,

MT (reserva genética), variedade local de dente branco (WFLV) (variedade local) e H Temp AO₂O₂ (0^0^ de síntese).

As plantas OK 281 obtidas a partir das culturas de OK 281 produziram sementes através de auto-polinização, polinização cruzada e polinização entre seres da mesma espécie em condições adequasas. 0 genotipo OK 281 é homozigõtico para o gene opaco recessivo (O₂O₂).

DSM 6009 (HE/89):

Um genotipo e uma cultura de Zea mays (L.) somática pre dominantemente na fase embriogênica inicial, altamente embriogé nica, regenerável, obtidos através da cultura de embriões imatu ros seguida de polinização cruzada entre os dois genotipos previamente seleccionados: H 229 e OK 281. Conservaram-se os genotipos H 229 e OK 281 durante, respectivamente, trinta e dez meses, em cultura antes de se regenerarem as plantas por polinização

cruzada. 0 genotipo de DSM 6009 encontra-se especialmente adap tado para as necessidades das culturas in vitro devido ao facto de descender de ancestrais que tinham sido seleccionados devido às suas características em cultura de tecidos. Deste modo,

DSM 6009 possui uma combinação única das seguintes características

1. Formação do borrelete cicatricial embriogênico autotrófίσο hormonal que se desenvolve bem em meios de cultura de tecidos de plantas normalizados.

2. Formação reproduzível de culturas embriogénicas em fase inicial semelhantes a borreletes cicatriciais (borreletes cica triciais de tipo II) a partir de embriões somáticos maduros em meios contendo auxina.

3. Considerável capacidade para regeneração de plantas a lon go prazo.

4. Conversão reproduzível de culturas embriogénicas em fase inicial semelhantes a borreletes cicatriciais (borreletes cicatriciais de tipo II) em culturas em suspensão.

5. Libertação abundante de protoplastos um mês após a trans ferência do borrelete cicatricial para um cultura líquida.

6. Elevada frequência de regeneração de plantas totalmente férteis a partir de borreletes cicatriciais, suspensões e proto plastos.

Culturas na fase embriogénica inicial e na fase embriogénica final:

Um tipo especial de culturas de tecido de milho (Zea mays (L.) na qual se observa uma rápida proporção de propaga ção das fases iniciais dos embriões somáticos. Estes embrójL des não amadurecem em embriõides claramente visíveis que se caracterizam pelo seu tamanho, maciez, estruturas idênticas ao escutelo portadoras de folhas e de raízes primordiais. Em contraste, as culturas embriogénicas de fase inicial possuem a aparência de uma cultura de borreletes cicatriciais homogénea. Este tipo de cultura é referido na literatura como uma cultura de tipo II ou uma cultura de borreletes cicatriciais embriogê nicos friáveis. As culturas em fase embriogénica inicial desenvolvem-se em culturas em fase embriogénica final antes da regeneração das plantas. Nas culturas na fase embriogénica fi nal os embriõides alargam-se com corpos bem desenvolvidos, idênticos ao escutelo, com máculas ou folhas verdes e com rebentos primordiais, assimcomo com raízes primordiais ou peque nas raízes. Nas culturas de DSM 6009 ambos os tipos de borre letes cicatriciais são facilmente acessíveis e intermutáveis depedendo das condições da cultura.

Meio de iniciação e de manutenção da cultura somática meio MS modificado [Murashige, T. and Skoog, F. Physiol. Plant., 15 (1962) 473-479] as published by Green, C. E. and Phillips R. L. Crop Sei., 15 (1975) 417-421] mas com as seguintes modificações e adições (concentração final miligrama/1: Bacto-triptona 500 mg, L-asparagina 150 mg.

Meio de iniciação de cultura de anteras

Macro-elementos N6, glicina e vitamina tal como em [Chu et al., Scientia Sinica, 18 (1975) 659], micro-elementos MS, EDTA e FeSO^. 7^2° ^ta·*· ^{como em} [Murashige, T., and Skoog, F., Physiol. Plant, 15 (1962) 473], e os seguintes componentes (por litro): L-proline 100 mg, bacto-triptona (BT) 600 mg, sacarose 120 mg, benzil-adenina 1 mg, acido naftilacético 1 mg. ácido 2,4-diclorofenoxiacetico (2,4-D) 2 mg, carvão activado 5 g. Ajustou-se o pH para 5,8 mais ou menos 0,05 com hidróxido de po tássio antes de se efectuar a autoclavagem e a adição de carvão activado. Solidificou-se o meio com 5 g/1 de agarose.

Meio de conservação de culturas haplóides

Macro-elementos, micro-elementos, EDTA, FeSO^. 7H₂O ' aminoácidos e vitaminas tal como no meio de iniciação de cultu ra de anteras. Os componentes que foram alterados foram (por litro) : 2,4-D 0,5 mg, sacarose 30 g, agar 8 g. Ajustou-se o pH para 5,8 mais ou menos 0,05 antes de se efectuar a autocláva gem.

Meio (ΝθΜ) de cultura em suspensão

Idêntico ao meio de conservação das culturas haplóides sem agar.

Meio de (ppN_gM) de cultura de protoplastos

Um meio ΝθΜ modificado com os seguintes ingredientes ad_i

cionais ou alterados (concentrações finais por 1).

MgSO^. 7H₂O: 370 mg; CaCl₂ . 2H₂O : 300 mg; sacarose 1 g; glicose 50 g ; frutose 30 g ; maltose 2,5 g ; galactose 2,5 g; ácido galacturónico 500 mg ; ácido glucurónico 500 mg; L-asparagina 500 mg; L-glutamina 100 mg, L-serina 100 mg; ácido diclo rofenoxiacético 0,4 g ; ácido naftilacético 0,7 mg e zeatina (isómeros misturados) 0,7 mg. O pH que não se ajustou, encontrava-se num intervalo compreendido entre 4,5-5,0.

Meio de isolamento dos protoplastos (solução celulósica)

Preparou-se aO ml de solução de isolamento de protoplas^ tos a partir das seguintes soluções de reserva esterilizadas

por filtração (j	Es)	ou autoclavadas (a):
0,3-0,5	ml	solução de reserva celulase dessalinizada/pectinase (fs)
2,0	ml	solução de lavagem (fs)
4,2-4,4	ml	dist.-dupla H^O (a)
0,5	ml	solução de reserva de BSA (fs)
0,1	ml	solução de n-PG (fs)
o,i	ml	solução 1 M de CaC^ (a)
0,1	ml	solução 1 M de MgSO^ (a)
2,5	ml	solução osmótica (fs)

Solução de reserva celulase/pectinase desalinizada

Dissolveu-se 10 g de celulose Onozuka RS e 1 g de Pecto liaza Y23 em H₂O duplamente destilada a 4°C. Removeram-se os vestígios insolúveis por centrifugação (6000 rpm durante 10 minu-27, tos). Dessalinizou-se o sobrenadante fazendo-o passar através de uma coluna Sefadex G25 (volume da coluna 200-250 ml). Agre garam-se as fracções contendo enzimas isentas de sal e ajustou-se para um volume final de 50 ml. Filtraram-se de modo esteri lizado através de membranas filtrantes de 0,22 jum e depois congelaram-se então em alíquotas de 0,5 ml.

Solução de lavagem (SL)

Meio N6M sem Fe, EDTA, 2,4-D e (NH^^SO^. Contém os seguintes açúcares: sacarose 10 g/1, glucose 55 g/1 e frutose 55 g/1.

Solução de reserva BSA

A partir de albumina de soro de bovino liofilizada, fracção V (Merck), preparou-se uma solução de reserva, contendo 40 mg de BSA em um mililitro de H₂O duplamente destilada. Reti raram-se alíquotas que se congelaram antes de se utilizar.

Solução nPG

Dissolveu-se 50 mg de gaiato de n-propilo em 2 ml de eta nol. Adicionou-se 8 ml de H₂O duplamente destilada e filtrou-se a solução de modo esterilizado. Adicionou-se 1% de uma solução de nPG recentemente preparada à solução de lavagem (SL-nPG) e uma solução de sacarose 0,6 M (0,6 Sa + nPG).

Solução osmótica

100 ml contém KNO₃ 4,04 g ; KH₂PC>₄ 2,72 g; K₂HPC>₄ 0,94 g,· frutose 7,2 g ; glicose 8,0 g; L-prolina 0,68 g. Filtrou-se a solução de um mocb esterilizado.

Claims

1. - Processo para a preparação de um genotipo de milho Zea (L.) auxina-antrotópico, a partir do qual se obtêm proto blastos e se regeneram com obtenção de partes de plantas e plantas férteis normais, caracterizado por:

- se produzir uma calose espessa a partir de anteras regeneráveis e/ou tecido somático; e

- se fazer a sua regeneração para proporcionar plantas normais, plantas férteis ou partes de plantas.

2. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se produzir o genotipo DSM 6009.

3. - Processo para a preparação de una cultura celular embriogénica de um genotipo de milho Zea (L.) , de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de, a partir de an-· 1 teras e/ou tecidos somáticos regeneráveis, em particular apõs múltiplos cruzamentos, se obter uma cultura celular embriogénica e se fazer a sua regeneração para proporcionar plantas normais, plantas férteis e partes de plantas.

4. - Processo de acordo com a reivindicação 3, carac terizado por se produzir o genotipo DSM 6009.

5. - Processo para a preparação de protoblastos do genotipo produzido de acordo com as reivindicações 1 ou 2, caracterizado pelo facto de., a partir de anteras e/ou tecidos somáticos, se produzir^- uma calose espessa e se isolar protoblastos a partir dela.

6. - Processo para a produção de células do genotipo preparado de acordo com as reivindicações 1 ou 2, caracterizado pelo facto de se regenerar as células a partir dos protoblastos produzidos de acordo com a reivindicação 5.

7. - Processo para a produção de uma calose espessa de milho Zea (L.) a partir da qual podem ser isolados protoblas tos, podendo esses protoblastos ser regenerados originando plan tas férteis, caracterizado por:

a) se obter uma calose espessa que· é auxina-antotrõfica, relativamente não mucilaginosa, granular e friável, num meio de manutenção da calose; e

b) se fazer crescer a calose do passo a) num meio de manutenção da calose.

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