JPH04299928A - 長期にわたり高度に効率的な植物再生能力を持つ改善されたゼア・メイズ・エルの遺伝子型 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】完全な又は培養した組織のＤＮＡ被覆粒子
を用いる細胞へのマクロインジェクション又はボンバー
ドメントは、幾つかの別のやり方例えばマイクロインジ
ェクションがあるという事実にもかかわらず、作物植物
の遺伝的形質転換の方法であると主張されており、入手
し得る実験データによると、プロトプラストがＤＮＡ形
質転換と体細胞雑種形成を含む疑似有性的遺伝子操作の
理想的で最も広く使用される対象である。これらの遺伝
子操作はプロトプラスト分離と培養の方法体系を必要と
する。操作したプロトプラストから稔性の再生体を得る
実際の適用は基礎的必要条件である。単子葉植物作物種
の中でトウモロコシは最もよく研究された組織培養の一
つである。幾つかの刊行物は種々な培養した葯と未成熟
胚様体を含む器官からの植物再生の可能性は高度に遺伝
子型依存性であることを示している（Ｇｒｅｅｎ及びＰ
ｈｉｌｌｉｐｓ、Ｃｒｏｐ　Ｓｃｉ．（１９７５年）１
５巻、４１７ページ：Ｍｏｒｏｃｚ，　Ｔａｇ−Ｂｅｒ
．，　Ａｃａｄ．　Ｌａｎｄｗｉｒｔｓｃｈ．　−Ｗｉ
ｓｓ．　ＤＤＲ，　Ｂｅｒｌｉｎ（１９８３）；Ｄｕｎ
ｃａｎ等、Ｐｌａｎｔａ（１９８５年）１６５巻、３２
２ページ）。培養条件の改善によりこれらの制限は部分
的にのみ克服することができる（Ｄｕｎｃａｎ等、Ｐｌ
ａｎｔａ（１９８５年）１６５巻、３２２ページ）。

【０００２】最近の数年間において、管理された植物再
生の問題に当てる遺伝子型と方法の開発について多くの
研究がなされた。欧州特許第２９　２４　４３５号は比
較的非粘液質で、もろく粒状のトウモロコシカルスから
出発して稔性植物を得ることができる方法を記述してい
る。Ｓｈｉｌｌｉｔｏ等（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇ
ｙ（１９８９年）７巻、５８１ページ）及びＰｒｉｏｌ
ｉ等（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９８９年）７
巻、５８９ページ）はトウモロコシプロトプラストから
植物の再生について記述している。しかしながら、これ
らの再生可能なプロトプラストの場合７〜８又は２０〜
４０ヶ月の長いインビトロ培養期間の後においてのみ分
離することができる。その上再生した植物はその生態と
稔性に異常を示す。

【０００３】新規なゼア・メイズ・エル（Ｚｅａ　ｍａ
ｙｓ（Ｌ．））遺伝子型は正常で優勢且つ十分に稔性の
植物を安定に再生する再現性のある能力を持つ組織及び
細胞懸濁培養物（ｔｉｓｓｕｅ　ａｎｄ　ｃｅｌｌ　ｓ
ｕｓｐｅｎｓｉｏｎ　ｃｕｌｔｕｒｅｓ）を作り得るこ
とを見出した。

【０００４】従って本発明はオーキシン独立栄養性であ
り、それより正常な稔性植物に再現性よく安定に再生す
るプロトプラストを作ることができるゼア・メイズ・エ
ルの遺伝子型、並びに再生した植物と部分及びこれら植
物の子孫；１で特徴を述べた遺伝子型から作られるプロ
トプラスト、並びにこのプロトプラストから再生し、稔
性植物を再生する能力のある細胞； ａ）　　オーキシン独立栄養性であり、比較的非粘液性
、粒状でもろいカルスをカルス維持培地上で得、及びｂ
）　　段階ａ）のカルスをカルス維持培地上で増殖させ
ることからなるゼア・メイズ・エルのカルス培養物の製
造法であって、前記カルス培養物から稔性植物に再生し
得るプロトプラストを分離することができるカルス培養
物の製造法に関する。

【０００５】細胞系統（ｃｅｌｌ　ｌｉｎｅ）ＤＳＭ　
６００９は上で特徴を述べた遺伝子型の好ましい代表例
であり、ブタペスト条約の規定に従い、上述の寄託番号
で「ドイツ微生物及び細胞培養コレクション（Ｄｅｕｔ
ｓｃｈｅ　Ｓａｍｍｌｕｎｇ　ｖｏｎ　Ｍｉｋｒｏｏｒ
ｇａｎｉｓｍｅｎ　ｕｎｄ　Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ
　ＧｍｂＨ）」に１９９０年７月１日寄託した。

【０００６】従って、本発明は細胞系統ＤＳＭ　６００
９に関する。

【０００７】上で特徴を述べた遺伝子型及び培養の開始
と維持の方法、懸濁培養の確立、プロトプラストの分離
及び培養法を次の段階で明らかにする。 段階（ａ）：広範囲の通常使用される遺伝子型の組織培
養可能性の評価 トウモロコシの同系交配種、保存株及び在来種（ｌａｎ
ｄ　ｒａｃｅ）につき、葯及び体器官例えば未成熟胚、
先端及び側生分裂組織からカルス培養を形成する能力を
試験する。葯培養の場合、単核化小胞子を持つ葯を葯培
養開始培地に置き、暗所で好ましくは２１〜２８℃で４
０〜９０日間インキュベートする。

【０００８】体細胞培養の場合、接種源（例えば１〜３
ｍｍの未成熟胚、０．５〜０．７ｃｍの側生分裂組織）
をそのまま又はスライスして体細胞培養開始及び維持培
地上に、明所で２１〜２８℃で３０〜６０日間置く。生
成する培養を植物再生培地上でその再生能力を試験する
。再生可能な組織培養に対応する遺伝子型は交配雑種形
成に使用され、この雑種の胚はその再生能力に関する追
加の点につき試験した後組織培養で少なくとも１年間保
存する。葯培養から得られる形成物を半数体維持培地で
維持する。再生可能な同系交配種、保存株又は在来種の
雑種は通常不定胚形成培養を形成する頻度が増加する。 それらは最初の数回の継代後再生能力を失うことがなく
、又その親より容易にそれらの組織培養から植物に再生
する。

【０００９】段階（ｂ）：段階（ａ）で選択される遺伝
子型からの出発合成種の生産 段階（ａ）で再生可能なことが判明した培養した葯と体
細胞接種源から得られる幾つかの遺伝子型を連続する数
世代にわたり交雑させると葯と体組織培養の合成種が得
られ、その各々は６〜８の遺伝子型を含む。

【００１０】段階（ｃ）：すぐれた組織培養特性を持つ
改良された組換え体の選択 段階（ｂ）で記述した合成種から得られる葯と未成熟胚
様体又は側生分裂組織は改良された再生可能な不定胚形
成培養を得るための接種源として使用される。数百の再
生可能な培養の中から、早く不定胚を形成し、豊富に増
殖するカルスとして維持することができる特定の種類の
培養が得られる。１年間維持した後、表面及び懸濁培養
の両方で成長したカルスから正常に発育する再生体を作
る培養物のみを選択し保持することによりＨ　２２９と
ＯＫ　２８１などの遺伝子型とＤＳＭ　６００９の親の
遺伝子型が得られる。これらの選択された稔性で再生可
能であり、早期不定胚形成性の培養から分離したプロト
プラストは再びその生存能力と培養可能性に変動を示す
。 プロトプラスト実験で正の反応を示す遺伝子型は保存す
るのが好ましい。選別工程の後、第一周期の遺伝子型か
らの再生体を交雑させると第二周期の遺伝子型例えばＤ
ＳＭ　６００９（ＨＥ　８９）が得られ、これらは等し
く再生可能な半数体又は体の細胞と組織培養の開始及び
適当な培養から全能性プロトプラストを作るのに適して
いる。

【００１１】段階（ｄ）：選択された培養の遺伝子型の
発生段階制御のための条件の最適化 維持培地上のＨ　２２９、ＯＫ　２８１及びＤＳＭ　６
００９組織培養の頻繁で定期的な継代（１〜２週間間隔
で２〜３回）は初期の胚様体のそれ以上の分化を抑制し
、後期発生段階の初期段階への再分化を引き起こす。一
旦均質な早期不定胚形成性の培養が得られると、それは
種々な培地で頻繁でない継代間隔（例えば１ヶ月）で容
易に維持することができる。まれな継代又は好ましくは
植物形成培地への移植により後期不定胚形成性培養から
早期不定胚形成性培養が発生する。後期不定胚形成性培
養は非同調的に発芽する胚様体から構成され、このもの
は植物再生培地に２回目の移植後多数の再生植物を生ず
る。これらの遺伝子型の早期不定胚形成性培養は培地に
対するそれらの高度の順応性により特徴付けられる。一
般に使用される培地例えばＭＳ（Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ／
Ｓｋｏｏｇ、Ｐｈｙｓｉｏｌ．　Ｐｌａｎｔ（１９６２
年）１５巻、４７３ページ）、Ｂ５、ＳＨ又はＮ６（Ｃ
ｈｕ　Ｃ．Ｃ．　等、Ｓｃｉ．　Ｓｉｎ．（１９７５年
）１６巻、６５９ページ）はすべてＨ　２２９、ＯＫ２
８１及びＤＳＭ　６００９組織培養を開始又は維持する
ために使用することができる。Ｎ６Ｍ培地が、この培地
でこれらの培養をその稔性、植物再生能力を失うことな
く数年間維持する（例えばＨ　２２９の場合約４年間）
ことが可能であることから好ましい。これらの遺伝子型
における不定胚形成特性の高水準の発現と再生可能な不
定胚形成性培養形成の明示のためのＮ６Ｍ培地の最適な
組成との間の密接な相互作用は、ホルモンのないＮ６Ｍ
培地が植物の再生のみならずこれらの遺伝子型から不定
胚形成培養の開始と維持に適用可能なことにより証明さ
れる。この結果、これらの遺伝子型の重要な特性はそれ
らのオーキシン自立栄養的増殖能力である。

【００１２】段階（ｅ）：延長した培養期間の後稔性植
物の再生を許容する懸濁培養の維持の改良細胞集団が急
激に増殖する場合細胞性変異株が蓄積する傾向があるこ
とより懸濁培養が正常な表現型と十分な稔性を持つ植物
を再生できる時間を長くするため液体培地を改善するこ
とが必要であった。予期しなかったことであるが、これ
はＮ６−微量栄養素をＭＳ−微量栄養素に置き換え、及
び培地の２，４−ジクロロフェノキシ酢酸（２，４−Ｄ
）含量を表面培養の場合より減らし、シュクロースを増
量（約３％）することにより達成されることを見出した
。このいわゆるＮ６Ｍ培地はＤＳＭ　６００９のもろい
早期不定胚形成性カルス培養にも適していた。この培地
に約２回継代した後、懸濁液を使用してこの遺伝子型か
ら良好な収率で再生可能なプロトプラストを分離するこ
とができた。

【００１３】段階（ｆ）：プロトプラストの分離と培養
上述の遺伝子型から得られるプロトプラストは溶解酵素
例えばセルラーゼ及びペクチナーゼと共にインキュベー
トすることにより作ることができる。この酵素は混合物
として使用することもでき、この場合単一酵素の濃度は
０．０５〜４％（重量／容量）である。インキュベーシ
ョン水溶液及び酵素濃度の最適組成は各各の種類の組織
につき、簡単な試験により確立することができる。プロ
トプラストの浸透安定化のためインキュベーション溶液
は浸透圧物質例えばマンニトール、ソルビトール、グル
コース、シュクロース、フラクトース、ＫＮＯ３又は他
の代表的な植物栄養培地の塩を含むべきである。酵素溶
液の浸透圧モル濃度は好ましくは５００〜７５０ｍＯｓ
ｍであり、特に好ましくは６００〜７００ｍＯｓｍであ
る。ｐＨは４．５〜６．０の範囲で変動させることがで
きる。好ましくはｐＨは５．５〜６．０の範囲であり、
１〜７５ｍＭのリン酸塩と１〜１０ｍＭのモルホリノエ
タンスルホン酸（ＭＥＳ）の添加により安定化される。

【００１４】酵素濃度により、プロトプラストは３〜２
０時間後に生成する。インキュベーションの間注意深く
振盪により懸濁液にすること、特に１０〜５０ｒｐｍの
軌道振盪機によるのが好ましい。

【００１５】インキュベーション後、プロトプラストは
塩、ビタミン、アミノ酸、合成オーキシン例えば２，４
−Ｄ又はジカンバ（ｄｉｃａｍｂａ）、並びに糖、好ま
しくはフラクトース、グルコース及びシュクロースの混
合物を含む成長培地に移植することができる。

【００１６】もっとも好ましくは、プロトプラストを無
菌のガラス又はプラスチック培養容器であってプロトプ
ラスト培養からの蒸発を防ぐため適当に密封したそれの
中でｐｐＮ６Ｍプロトプラスト培地の薄層（例えば０．
１〜１ｍｍ）中で、暗い光りの中、２１〜２６℃の温度
で培養する。細胞とコロニーの形成に必要なプロトプラ
ストの濃度はプロトプラスト培地ｍｌ当たり５〜７×１
０５ないし３〜５×１０６のプロトプラストである。２
０〜４０日間培養後、肉眼で見えるコロニーがプロトプ
ラスト培地に発生する。可視的コロニー形成に必要な期
間はプロトプラスト培養開始後３週間に小量の懸濁液又
はプロトプラスト培地を逐次添加する（例えば３〜４日
間隔で０．２〜０．５ｍｌ）ことにより短くすることが
できる。可視的コロニーは維持又は再生培地に置くか、
又は新しい懸濁培養を始めるために使用することができ
る。

【００１７】段階（ｇ）：プロトプラストから誘導され
る培養からの植物の再生及び再生した植物の成熟に至る
成長 プロトプラストから誘導されるコロニーを植物再生培地
に置くと、そこでそれらは発生して成熟した不定胚とな
り、このものは究極的に発芽して小植物となる。無ホル
モン培地上で比較的均質な早期不定胚形成性培養はその
表面によく発達した不定胚形成組織クラスターを形成す
る。成熟し発芽した胚様体を新鮮な無ホルモン培地に置
くと多数の健康な植物が分化する。小植物が５〜７ｃｍ
の大きさとなり、最初の節に数本の根が生えたとき、そ
れらを培養容器から除き、相互に及び付着している寒天
片から分離する。それらの根系は弱い無節根がなく、培
地は水道水を使用する。次に小植物を土壌に移植する。 適当な土壌はピート、砂及びパーライトの等量混合物又
は任意の市販の園芸用土壌である。植物はナイロンバッ
グ又は湿気のある大気中で１０日間成長させ、その間連
続的に２日間、その後定期的に強烈に照明して植物の正
常な緑色化と活発な成長を実現させる。植物には定期的
に水と肥料を与えて正常な成長を確実にする。その最初
の葉が緑色に保持する注意深く栽培した植物のみを自家
又は交差授粉により種子を作るために使用する。培養容
器中でのエージングが始まる前に土壌に移植し、適当に
栽培した大部分の植物は生殖器官に異常のない良好に発
育した植物を作る。

【００１８】段階（ｈ）：ＲＦＬＰ（制限断片長多型現
象）を利用する株の同定と遺伝子型保護組織培養の開始
と維持の間に認識し得るようになる典型的な生態的及び
生理的特性に加えて、選択された遺伝子型の植物再生と
植物安定性特性及び限定された分子プローブを使用した
後の混成制限断片の分布は上述の遺伝子型の同定を可能
にする。ＤＮＡを親ライン（Ｈ　２２９とＯＫ　２８１
）及びそれより得られる高度に不定胚形成性雑種ＤＳＭ
　６００９から分離する。実施例としてトウモロコシか
らクローン化した推定のオーキシンリセプター遺伝子の
ｃＤＮＡクローン（Ｕ．　Ｔｉｌｌｍａｎｎ等、Ｔｈｅ
　ＥＭＢＯ　Ｊ．　（１９８８年）、２４６３〜２４６
７ページ）を使用してこの植物ＤＮＡをＨｉｎｄ　ＩＩ
ＩとＢａｍ　ＨＩ制限酵素で分解した後のハイブリッド
形成パターンを示す。 図３に見られるように、すべての分析した遺伝子型は特
異で特徴的な混成バンドのパターンを示す。

【００１９】図３は推定のオーキシンリセプター遺伝子
を３２ＰでラベルしたｃＤＮＡ挿入断片でハイブリッド
形成させた後の可視的な制限断片多型現象を示す。

【００２０】１　　　　ＯＫ ２　　　　Ｈ　２２９　　　　　　　　　　Ｈｉｎｄ　
ＩＩＩ３　　　　ＤＳＭ　６００９ ４　　　　ＯＫ ５　　　　Ｈ　２２９　　　　　　　　　　Ｂａｍ　Ｈ
Ｉ６　　　　ＤＳＭ　６００９ 図３において、（Ｂ）の露出時間は（Ａ）より約３倍長
かった。

【００２１】実施例　　１ オペーク体細胞培養合成種ＭＲ　Ｓｙｎ　Ｓｏ２ｏ２／
８７及び優勢に早期不定胚形成性培養ＯＫ２８１の生産
種々なトウモロコシ遺伝子型を野外で成長させた。３〜
４の植物を自家授粉させ、受精した雌穂を授粉後１２〜
１４日に収穫した。皮と毛を除いた後、雌穂を０．５％
の家庭用洗剤を含む０．１５％次亜塩素酸ナトリウム溶
液で１０分間殺菌し、次いで無菌脱イオン水で３回洗浄
した。次いで雌穂当たり１０の胚を無菌的に切除し、そ
の平坦な幼芽と幼根の側面を１０×２ｃｍのペトリ皿に
入れた５０ｍｌの固化した（０．８％寒天）体細胞培養
開始及び維持培地の表面に接触させた。胚培養を２５±
２℃で照明下で３０〜６０日間インキュベートした。評
価後、不定胚形成性培養を一か月間隔で新鮮培地に移植
し、植物再生培地上で植物再生能力を試験した。試験し
た遺伝子型から同系交配種Ａ１８８、ＧＫ３／Ｈ及びＷ
６４Ａ、遺伝的保存株マンゲルスドルフス・テスター（
Ｍａｎｇｅｌｓｄｏｒｆ’ｓ　Ｔｅｓｔｅｒ）（ＭＴ）
及び白色フリント在来種（ＷＦＬＶ）が記述された条件
下で再生可能な培養を形成することを見出した。しかし
ながらこれらの遺伝子型は優勢に後期不定胚形成性培養
を形成し、トウモロコシ組織培養文献ではしばしばＩ型
培養と呼ばれている。それらの再生能力は新鮮培地に連
続継代することにより徐々に低下し、６箇月保存後にお
いてはまれに小さい再生可能なセクターが存在するに過
ぎなかった。２つの再生可能な遺伝子型の雑種を作り、
その胚培養を同様な方法で試験した場合、増殖速度と再
生性の改善が認められた。例えば、Ａ１８８×Ｗ６４Ａ
雑種の培養は再生能力を失うことなく３年間維持された
。この元の遺伝子型から可能な有利な遺伝子の組合わせ
の一層の開発を容易にするため、多重世代交雑プログラ
ムを開始した。これらの条件下で非再生性であるか（Ｏ
ｈ　４３ｏ２ｏ２）、又は組織培養からの再生能力を検
査していない（Ｈ　Ｔｅｍｐ　Ａｏ２ｏ２）２つのオペ
ーク（ｏｐａｑｕｅ）源（ｏ２ｏ２）のいずれも含まれ
ていた。オペーク遺伝子を再生可能な特性の原因である
遺伝子と組み合わせるため、最初にオペーク源遺伝子型
を再生可能な遺伝子系と交雑することを必要とした。従
ってこれらの遺伝子型を植え付け、栽培し、毛がでる前
に雌穂を分離した。再生性遺伝子型から分離した雌穂を
オペーク遺伝子を持つ遺伝子型からの花粉と交差授粉さ
せた。このようにしてＡ１８８、ＧＫ３／Ｈ、Ｗ６４Ａ
、ＭＴ、及びＷＦＬＶをＯｈ４３ｏ２ｏ２及びＨ　Ｔｅ
ｍｐ　Ａｏ２ｏ２と交雑させて１回交差雑種（ＳＣ１−
ＳＣ１０）を得た。これらの１０の種々な１回交雑種の
種を前のように収穫し、植え付け、生長させ及び分離し
て第二回目の一連の交差授粉を行い、ＳＣ１×ＳＣ７、
ＳＣ２×ＳＣ８、ＳＣ３×ＳＣ９、ＳＣ４×ＳＣ１０及
びＳＣ５×ＳＣ６からそれぞれ２回交差（ＤＣ１−ＤＣ
５）雑種の種を得た。第一回及び第二回授粉系列から各
交差授粉につき１つの収穫雌穂のみを別の世代のため選
んだ。収穫したＤＣの種からホモ接合ｏ２ｏ２の種をそ
の表現型に基づいて選択し、植え付けた。第三の授粉系
列の開花時各ＤＣ雑種（ＤＣ１〜ＤＣ５）をすべての他
の種と交雑させ、２０の交差組み合わせの各々から４つ
の収穫した雌穂を得た。得られる８０の雌穂から雌穂当
たり１０の種をまとめ、植え付け、無作為に兄妹授粉さ
せて所望遺伝子の組合わせの可能性を求めた。１００の
最良の雌穂を兄妹交配し、収穫した植物材料から選び、
各雌穂から１０の穀粒をまとめ、始発体細胞培養合成種
と見做した（ＭＲ　Ｓｙｎ　Ｓｏ２ｏ２／８７）。得ら
れる合成種を植え付け、開花した植物を自家授粉させた
。１００の自家授粉させた雌穂の各々から１０の未成熟
胚を記述した方法で平板培養した。培養した胚の約３０
％（９５０中２８６）は再生可能な培養を作り、それら
の大部分は後期不定胚形成性の種類であった。得られた
突然変異の早期不定胚形成性培養であって関連する文献
中でしばしばＩＩ型又はもろい不定胚形成培養と呼ばれ
るそれからその活性な発育、ネクロシスの欠如、容易な
植物への再生性及び再生植物の稔性に基づいてＯＫ２８
１培養を選択した。

【００２２】実施例　　２ 葯培養合成種ＭＲ　Ｓｙｎ　Ａ／８５と早期不定胚形成
性半数体培養Ｈ　２２９の生産 種々なトウモロコシの遺伝子型を植え付け、適当な生理
的段階まで栽培して最上端の葉で覆われていない雄穂を
集めた。外側の葉は開かれ捨てられた。なお被覆された
渦巻状になっている残りの雄穂をプラスチック製バッグ
に入れ、冷蔵庫中４〜８℃で１０〜３０日間低温処理し
た。この処理後被覆している葉を除き、後期単核化小胞
子を含む葯を持つ雄穂切片を２％オルセイン水溶液でつ
ぶした葯の顕微鏡検査により選別した。所望の小胞子を
持つ小花を０．５％家庭用洗剤を含む０．１％次亜塩素
酸ナトリウム溶液で表面を１０分間殺菌し、次いで小花
を脱イオン水で１０分間３回洗浄した。表面殺菌した小
花から約１００の葯を切除し、１０×２ｃｍのガラス製
ペトリ皿に注入した５０ｍｌの葯培養開始培地上に置い
た。この平板接種した葯を２５℃の暗所で４０〜９０日
間インキュベートした。２つの在来種、ゴールデン・グ
ロー（Ｇｏｌｄｅｎ　Ｇｌｏｗ）（ＧＧ）と白色デント
在来種（ＷＤＬＶ）は培養した葯から低いパーセンテー
ジ（１％以下）で半数体カルスを形成した。それらのい
ずれも再生培地上で植物を再生しなかった。２つの在来
種（ＧＧとＷＤＬＶ）を交雑し、雑種の種を植え付け、
生ずるＦ１植物の葯を同様な方法で試験した。得られる
半数性胚様体から１つの培養をその再生能力が失われる
前の１年間多重植物再生に使用することができた。土壌
に移植した再生体の生存と生長に必要な胚様体形成潜在
能力、植物再生能力及び植物特性を組み合わせるため、
２つの在来種の雑種からの１０の植物を２つの独立の雑
種であってその各々は葯培養の反応を示すことが見出さ
れたそれ〔ＧＫ３／Ｈ×ＭＴ及び（Ａ１８８×Ａ６１９
）×ＢＭＳＣ〕の交差雑種形成により得られる植物集団
と交差授粉させた。収穫した雌穂から１０の種をまとめ
、野外に播種し、そして望ましくない農業経済特性（例
えば分けつ、黒穂病感染、倒伏）のない植物を選んで兄
妹交配した。 収穫後３０の最良の雌穂を選び、雌穂当たり等しい数の
種をまとめるのに使用した。これらのひとまとめは葯培
養合成種ＭＲ　Ｓｙｎ　Ａ／８５を表す。１つのひとま
とめの合成種を播種し、雄穂を集め、上述の方法で処理
した。培養した葯の内ペトリ皿当たり０〜約２０％の胚
様体形成の反応が認められた。ＭＳ　Ｓｙｎ　Ａ／８５
の種々な雄穂から得られる３００の半数性胚様体の中か
ら、約２０％が始発培地から半数体維持培地に移植した
後再生可能な不定胚形成培養に発育した。再生可能な培
養からその優勢に早期不定胚形成性カルスの表現型、速
い増殖速度、長期間表面及び懸濁培養後の植物再生能力
（更に交差周期に使用する前２年以上）及びプロトプラ
ストから分裂し、コロニーを形成し、植物を再生する能
力に基づいてＨ　２２９培養を選択した。

【００２３】実施例　　３ 高度に不定胚形成性の培養ＤＳＭ　６００９の生産胚又
は葯から優勢に早期不定胚形成性培養を発生する２つの
あらかじめ選択した培養を両方の望ましい特性を組み合
わせるため交差授粉させた。開始後３０ヶ月に再生した
Ｈ　２２９植物の雌花に開始後１０ヶ月に再生したＯＫ
　２８１植物の花粉を授粉させた。得られる未成熟雑種
胚を体細胞培養開始及び維持培地並びに植物再生培地上
でインキュベートした。植物再生培地上で早期不定胚形
成性培養を形成する胚の１つ、ＤＳＭ　６００９（ＨＥ
　８９）を選択し、維持し、懸濁培養を開始するために
使用した。ドナーの雑種胚（ＨＬ２９×ＯＫ２８１）の
接種後わずか２ヶ月で最初のプロトプラスト培養を成功
裡に開始し、これは稔性のプロトプラストから誘導され
る植物の形成につながった。ＤＳＭ　６００９はその親
の望ましい特性のすべてを持ち、当初挙げた多くの組織
培養特性においてそれらよりすぐれている。

【００２４】実施例　　４ 選択したトウモロコシ組織培養における再生性保持に関
する懸濁培養培地Ｎ６Ｍの評価 懸濁培養培地Ｎ６Ｍが開発された後、３つの独立に選択
した再生性遺伝子型（早期及び後期不定胚形成性、体細
胞及び半数体培養）につきその再生及び稔性特性を懸濁
培養で２年以上にわたって試験した。体細胞性で主とし
て後期不定胚形成性培養４Ｃ１、体細胞性で後期不定胚
形成性培養Ｃ２−Ａ、及び半数体で主として早期不定胚
形成性培養Ｈ　２２９をＮ６Ｍ懸濁培養培地で維持した
。懸濁培養はより速い増殖速度を示すが、これらの選択
した遺伝子型の植物再生能力は胚様体をまれに継代する
（約２ヶ月間隔）寒天表面培養より懸濁培養から平板に
移した場合の方が良好であった。すべての３つの場合に
おいて、Ｎ６Ｍ懸濁培養に２年間維持した後稔性植物を
得ることができた。他の培養をこの懸濁培養で１年間維
持した場合も同様のことが観察された。従ってＮ６Ｍ懸
濁培地はプロトプラスト分離前の培養の維持に好ましい
。

【００２５】授粉後１２日間温室で生長させた植物から
得られる１ｍｍより小さい胚（Ｈ　２２９×ＯＫ　２８
１）を２，４−ＤのないＮ６Ｍで３週間インキュベート
し、次いでＮ６ＭとＭＳＧ培地で１０〜１４日間隔で２
つの継代培養を行った後Ｎ６Ｍ培地で懸濁培養を開始し
た。 規則的な維持には４ｇの細胞を使用して１００ｍｌのエ
ルレンマイヤーフラスコ中５０ｍｌのＮ６Ｍ培地で５〜
７日の新しい培養周期を開始する。すべての培養は２２
〜２５℃で蛍光灯で連続して又は定期的に照明しながら
生長させる。

【００２６】プロトプラストの分離と培養最終移植後２
日目の懸濁培養から新鮮物重量として２ｇの細胞物質を
１％のｎＰＧ保存溶液を添加した１ｍｌの洗浄溶液（Ｗ
Ｓ）中でピンセットで砕いた。この処理により大きさを
２〜３ｍｍのコロニーとした。砕いた細胞懸濁液をｎＰ
Ｇ−ＷＳで２回洗浄した。洗浄した細胞を１０ｍｌのプ
ロトプラスト分離培地中でおだやかに振盪するか又はし
ないで、暗所で４時間インキュベートする。酵素処理後
溶液を２１０ミクロンと６０ミクロンのスクリーンを通
過させ、次に１０００ｒｐｍで遠心分離する。ペレット
を１０ｍｌの０．６Ｍシュクロース＋ｎＰＧに再懸濁し
、１ｍｌのＷＳ＋ｎＰＧを重層して二回目の遠心分離を
行う。浮遊するプロトプラストを集め、１５ｍｌのＷＳ
＋ｎＰＧ中で三回目の遠心分離により再度沈降させる。 プロトプラストの数は三回目遠心分離の前バーカー（Ｂ
ｕｅｒｋｅｒ）又はトーマチャンバー（Ｔｈｏｍａ　ｃ
ｈａｍｂｅｒ）で計数する。プロトプラストは２ｍｌの
液体培地で培養するか、又は２倍濃度のｐｐＮ６Ｍ／８
９と１．２％溶融アガロース溶液との１：１混合物の２
ｍｌとプロトプラストをおだやかに混合することにより
０．５〜０．７％の低ゲル化点アガロース（Ｓｉｇｍａ
）に埋め込み、この場合両溶液共予め４５℃に温度調節
する。プロトプラストは暗い光りの下２５℃で培養する
。液体培地のプロトプラストに栄養源を与えるため３週
間後に０．５ｍｌのＮ６Ｍ培地、次いで更に２〜３日後
１ｍｌを添加する。次に３〜４日後全培養を１０ｍｌの
新鮮なＮ６Ｍ培地に入れ、振盪した。アガロースに埋め
込んだ培養は２〜４週間後、大部分の場合３週間後に２
，４−Ｄ添加又は無添加の固化させたＮ６Ｍ、又は１０
〜５０ｍｌの液体Ｎ６Ｍ培地に置く。

【００２７】植物の再生と生長 寒天培地上の再生したカルスから０．２〜１ｇの不定胚
形成性カルスを通気用スポンジ栓を備えたふたを持つガ
ラスジャー、又はプラスチック容器中の１００ｍｌの２
，４−ＤのないＮ６Ｍ培地上に置く。この処置を胚様体
と小植物から十分に発育した植物が得られるまで繰り返
す。より大きい植物（７ｃｍ以上）を除いて腐植に富む
種々な種類の園芸用土壌を含む種々な大きさのポットに
移植する。毛と発散する花粉を持つ雄穂が出現した植物
を自家又は兄妹授粉させる。

【００２８】図１（Ａ）〜（Ｇ）および図２（Ｈ）〜（
Ｊ）はＤＳＭ　６００９、ＤＳＭ　６００９の不定胚形
成トウモロコシ培養及びそれからプロトプラスト培養工
程を経る正常な植物の再生に含まれる種々な細胞の形態
と発生段階を示す。（Ａ）は確立された早期不定胚形成
性培養、（Ｂ）はプロトプラスト分離の準備の整った半
純粋懸濁培養、（Ｃ）は分離後６時間のプロトプラスト
、（Ｄ）は分離後３２時間の第一回の分裂、（Ｅ）は分
離後８日目のコロニー、（Ｆ）、（Ｇ）はそれぞれプロ
トプラストから２ヶ月後の早期及び後期不定胚形成性培
養、土壌に移植前（Ｈ）及び移植後（Ｉ）のプロトプラ
ストから再生した植物、（Ｊ）は土壌移植後３ヶ月半の
実を付けた成熟したプロトプラスト由来植物である。

【００２９】定　　義 Ｈ　２２９ 再生可能な半数体ゼア・メイズ・エル組織培養と遺伝子
型であって、ＭＳ　Ｓｙｎ　Ａ／８５葯培養合成種から
葯培養を経て得られ、前記合成種は次の遺伝子型：Ａ１
８８、Ａ６２９、ＧＫ　３／Ｈ（同型交配種）、ブラッ
ク・メキシカン・スイート・コーン（Ｂｌａｃｋ　Ｍｅ
ｘｉｃａｎ　Ｓｗｅｅｔ　Ｃｏｒｎ）（ＢＭＳＣ）、マ
ンゲルスドルフス・テスター（ＭＴ）（遺伝的保存株）
、白色デント在来種（ＷＤＬＶ）及びゴールデン・グロ
ー（ＧＧ）（在来種）を含む連続的交差及び兄妹授粉に
より作られた。Ｈ　２２９培養は優勢に不定胚形成性で
あり、容易に懸濁培養を形成し、一方懸濁培養プロトプ
ラストから限定された条件下で植物が発生する。Ｈ２２
９組織培養から得られるＨ　２２９植物は雌性稔性であ
り、可視的花粉粒で授粉させると実を付ける。

【００３０】ＯＫ　２８１ ＭＲ　Ｓｙｎ　Ｓｏ２ｏ２／８７からの未成熟胚培養を
経て得られた再生可能であり、優勢に早期不定胚形成性
の体細胞ゼア・メイズ・エル組織培養と遺伝子型であっ
て、前記ＭＲ　Ｓｙｎ　Ｓｏ２ｏ２／８７は次の遺伝子
型：Ａ　１８８、ＧＫ　３／Ｈ、Ｗ　６４　Ａ、Ｏｈ　
４３ｏ２ｏ２（同型交配種）、ＭＴ（遺伝的保存株）、
白色フリント在来種（ＷＦＬＶ）（在来種）及びＨＴｅ
ｍｐ　Ａｏ２ｏ２（ｏ２ｏ２合成種）を含む連続的交差
、兄妹及び自家授粉により作られた。

【００３１】ＯＫ　２８１培養から得られるＯＫ　２８
１植物は適当な条件下で自家、兄妹又は交差授粉により
実を作る。ＯＫ　２８１遺伝子型は劣性オペーク遺伝子
（ｏ２ｏ２）について同型接合である。

【００３２】ＤＳＭ　６００９（ＨＥ／８９）２つの予
め選択された遺伝子型：Ｈ　２２９とＯＫ　２８１との
間の未成熟胚培養と引き続く交差授粉により得られた再
生可能で高度に胚形成性であり、優勢に早期不定胚形成
性の体細胞ゼア・メイズ・エル培養と遺伝子型である。 Ｈ　２２９とＯＫ　２８１遺伝子型は交差授粉のため再
生させる前、それぞれ３０と１０ヶ月培養で維持した。 ＤＳＭ　６００９遺伝子型はそれらの組織培養特性から
選択された祖先からの遺伝の結果としてインビトロ培養
の要求に特に適合している。従って、ＤＳＭ　６００９
は特異な次の性質の組合せを持っている。

【００３３】１．　標準の植物組織培養培地で良く生長
するホルモン自立栄養性胚形成カルスの形成。 ２．　オーキシン含有培地の成熟体細胞不定胚からカル
ス様早期不定胚形成性（ＩＩ型カルス）培養の再現性の
ある形成。 ３．　信頼性のある長期間の植物再生能力。 ４．　カルス様早期不定胚形成性（ＩＩ型カルス）培養
の懸濁培養への再現性ある変換。 ５．　カルスから液体培養へ移植の１ヶ月後豊富なプロ
トプラストの放出。 ６．　カルス、懸濁液及びプロトプラストから十分稔性
の植物の高頻度の再生。

【００３４】早期及び後期不定胚形成性培養体細胞不定
胚の初期段階の速い増殖速度が観察される特定の種類の
トウモロコシ（ゼア・メイズ・エル）の組織培養。これ
らの胚様体はその大きさ、平滑で葉と根の原基を持つ胚
盤様構造により特徴付けられる明らかに見える胚様体に
成熟しない。対照的に、早期不定胚形成性培養は均質な
カルス培養の外観を呈する。この培養形態は関連文献で
はＩＩ型又はもろい不定胚形成性カルス培養と呼ばれて
いる。早期不定胚形成性培養は植物再生前後期不定胚形
成性培養に発育する。後期不定胚形成性培養においては
胚様体は拡大してよく発達した胚盤様体、グリーン・ス
ポット（ｇｒｅｅｎ　ｓｐｏｔ）又は葉と茎の原基、並
びに根の原基又は小根を持つ。ＤＳＭ　６００９培養に
おいては両方のカルス形態を培養条件により容易に利用
し、互いに置き換えることができる。

【００３５】体細胞培養開始と維持培地Ｇｒｅｅｎ，　
Ｃ．Ｅ．及びＰｈｉｌｌｉｐｓ，　Ｒ．Ｌ．、Ｃｒｏｐ
　Ｓｃｉ．（１９７５年）１５巻、４１７〜４２１ペー
ジに発表された改変ＭＳ培地（Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ，　
Ｔ．及びＳｋｏｏｇ，　Ｆ．、Ｐｈｙｓｉｏｌ．　Ｐｌ
ａｎｔ．（１９６２年）１５巻、４７３〜４９７ページ
）に次の変更と添加（最終濃度、ｍｇ／ｍｌ）：バクト
・トリプトン（Ｂａｃｔｏ　Ｔｒｙｐｔｏｎｅ）５００
ｍｇ、Ｌ−アスパラギン　１５０ｍｇがなされている。

【００３６】葯培養開始培地 Ｃｈｕ等、Ｓｃｉｅｎｔｉａ　Ｓｉｎｉｃａ（１９７５
年）１８巻、６５９ページに記述のＮ６大量要素、グリ
シン及びビタミン、Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ，　Ｔ．及びＳ
ｋｏｏｇ，　Ｆ．、Ｐｈｙｓｉｏｌ．　Ｐｌａｎｔ（１
９６２年）１５巻、４７３ページに記述のＭＳ微量要素
、ＥＤＴＡ及びＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、及び次の成分（
ｌ当たり）：Ｌ−プロリン１００ｍｇ、バクト・トリプ
トン（ＢＴ）６００ｍｇ、シュクロース１２０ｇ、ベン
ジルアデニン１ｍｇ、ナフチル酢酸１ｍｇ、２，４−ジ
クロロフェノキシ酢酸（２，４−Ｄ）２ｍｇ、活性炭５
ｇからなる。ｐＨはオートクレーブ殺菌及び活性炭添加
前ＫＯＨで５．８±０．０５に調節する。培地は５ｇ／
ｌのアガロースで固化させる。

【００３７】半数体培養維持培地 葯培養開始培地の大量要素、微量要素、ＥＤＴＡ、Ｆｅ
ＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、アミノ酸及びビタミン。変更された
成分（ｌ当たり）は２，４−Ｄ　０．５ｍｇ、シュクロ
ース３０ｇ、寒天８ｇである。ｐＨはオートクレーブ殺
菌前５．８±０．０５に調節する。

【００３８】懸濁培養培地（Ｎ６Ｍ） 寒天を除いた半数体培養維持培地と同じである。

【００３９】プロトプラスト培養培地（ｐｐＮ６Ｍ）次
の添加成分又は変更された成分を含む改変Ｎ６Ｍ培地（
ｌ当たり最終濃度）。ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ　３７０ｍ
ｇ、ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ　３００ｍｇ、シュクロース
１ｇ、グルコース５０ｇ、フラクトース３０ｇ、マルト
ース２．５ｇ、ガラクトース２．５ｇ、ガラクチュロン
酸５００ｍｇ、グルクロン酸５００ｍｇ、Ｌ−アスパラ
ギン５００ｍｇ、Ｌ−グルタミン１００ｍｇ、Ｌ−セリ
ン１００ｍｇ、２，４−ジクロロフェノキシ酢酸０．４
ｇ、ナフチル酢酸０．７ｍｇ及びゼアチン（異性体混合
物）０．７ｍｇ。ｐＨは無調節で４．５〜５．０の範囲
である。

【００４０】プロトプラスト分離培地（細胞溶解性溶液
） １０ｍｌのプロトプラスト分離溶液を次の濾過滅菌（ｆ
ｓ）又はオートクレーブ殺菌（ａ）した保存溶液から調
節する。

【００４１】０．３〜０．５ｍｌ　　　　脱塩セルラー
ゼ／ペクチナーゼ保存溶液（ｆｓ） ２．０ｍｌ　　　　　　　　　　　洗浄溶液（ｆｓ）４
．２〜４．４ｍｌ　　　　２回蒸溜水（ａ）０．５ｍｌ
　　　　　　　　　　　ＢＳＡ保存溶液（ｆｓ）０．１
ｍｌ　　　　　　　　　　　ｎ−ＰＧ溶液（ｆｓ）０．
１ｍｌ　　　　　　　　　　　１Ｍ　ＣａＣｌ２溶液（
ａ）０．１ｍｌ　　　　　　　　　　　１Ｍ　ＭｇＳＯ
４溶液（ａ）２．５ｍｌ　　　　　　　　　　　浸透性
溶液（ｆｓ）

【００４２】脱塩セルラーゼ／ペクチナー
ゼ保存溶液１０ｇのセルラーゼ・オノヅカ（Ｃｅｌｌｕ
ｌａｓｅ　Ｏｎｏｚｕｋａ）ＲＳと１ｇのペクトリアー
ゼ（Ｐｅｃｔｏｌｙａｓｅ）Ｙ２３を４℃で２回蒸溜水
に溶解する。不溶性残査を遠心分離（６０００ｒｐｍ、
１０分）により除く。上澄液をセファデックスＧ２５カ
ラム（カラム容量２００〜２５０ｍｌ）を通過させて脱
塩する。無塩酵素含有画分を合併し、最終容量を５０ｍ
ｌに調整する。それらを０．２２μｍメンブランフィル
ターで濾過滅菌し、次いで０．５ｍｌずつに等分して急
速冷凍する。

【００４３】洗浄溶液（ＷＳ） Ｆｅ、ＥＤＴＡ、２，４−Ｄ及び（ＮＨ４）２ＳＯ４を
除いたＮ６Ｍ培地。次の糖：シュクロース１０ｇ／ｌ、
グルコース５５ｇ／ｌ及びフラクトース５５ｇ／ｌを含
む。

【００４４】ＢＳＡ保存溶液 凍結乾燥したウシ血清アルブミン、画分Ｖ（Ｍｅｒｃｋ
）から１ｍｌの２回蒸溜水中４０ｍｇのＢＳＡを含む保
存溶液を調製する。等分試料を使用前急速冷凍保存する
。

【００４５】ｎＰＧ溶液 ５０ｍｇの没食子酸ｎ−プロピルを２ｍｌのエタノール
に溶解する。８ｍｌの２回蒸溜水を添加し、溶液を濾過
滅菌する。１％の新しく調製したｎＰＧ溶液を洗浄溶液
（ＷＳ−ｎＰＧ）と０．６Ｍシュクロース溶液（０．６
Ｓｕ＋ｎＰＧ）に添加する。

【００４６】浸透性溶液 １００ｍｌ中ＫＮＯ３　４．０４ｇ、ＫＨ２ＰＯ４　２
．７２ｇ、Ｋ２ＨＰＯ４　０．９４ｇ、フラクトース７
．２ｇ、グルコース８．０ｇ、Ｌ−プロリン０．６８ｇ
を含む。溶液を濾過滅菌する。

【図面の簡単な説明】

【図１】（Ａ）〜（Ｇ）はＤＳＭ　６００９、ＤＳＭ　
６００９不定胚形成トウモロコシ培養の培養及びそれか
らプロトプラスト培養過程を経る正常な植物の再生に含
まれる種々な細胞の形態を示す写真である。

【図２】（Ｈ）〜（Ｊ）は図１の培養過程を経て再生さ
れた植物の発育段階を示す写真である。

【図３】推定のオーキシンリセプター遺伝子を３２Ｐで
ラベルしたｃＤＮＡ挿入断片でハイブリッド形成させた
後の可視的な制限断片多型現象を示す電気泳動パターン
の写真であり、（Ｂ）の露出時間は（Ａ）の約３倍の長
さである。

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】　　オーキシン独立栄養性であり、再現性
   よく安定に正常な稔性植物に再生することができるプロ
   トプラストを作ることができるゼア・メイズ・エルの遺
   伝子型、並びに再生した植物と部分及びこれら植物の子
   孫。
2. 【請求項２】　　遺伝子型ＤＳＭ　６００９。
3. 【請求項３】　　請求項１記載の遺伝子型から作られる
   不定胚形成性細胞培養物。
4. 【請求項４】　　不定胚形成細胞培養物ＤＳＭ　６００
   ９。
5. 【請求項５】　　請求項１と２に記載の遺伝子型から作
   られるプロトプラスト、並びにこれらのプロトプラスト
   から作られ、稔性植物を再生する能力を持つ細胞。
6. 【請求項６】　　ａ）オーキシン独立栄養性で比較的非
   粘液性、粒状でもろいカルスをカルス維持培地上で得、
   及びｂ）段階ａ）のカルスをカルス維持培地上で生長さ
   せることからなるゼア・メイズ・エルのカルス培養物の
   製造方法であって、前記カルス培養物からプロトプラス
   トを分離することができ、前記プロトプラストは稔性植
   物に再生する能力があるカルス培養物の製造方法。