HU215163B

HU215163B - Eljárás javított Zea mays genotípus előállítására

Info

Publication number: HU215163B
Application number: HU912082A
Authority: HU
Inventors: Günter Donn; Dénes Dudits; Sándor Morocz; János Németh
Original assignee: Hoechst Ag.
Priority date: 1990-06-23
Filing date: 1991-06-21
Publication date: 1998-10-28
Also published as: ES2184167T3; JPH04299928A; ATE223148T1; DE69130521T2; EP0873682A2; PT98070A; EP0873682B1; DE69133102D1; ZA914786B; PT98070B; DK0873682T3; ES2124693T3; EP0465875B1; IE912165A1; HU912082D0; TR28031A; JP3865264B2; EP0873682A3; ATE173581T1; DK0465875T3

Abstract

A találmány tárgya eljárás aűxin aűtőtróf Zea mays (L.) genőtípűselőállítására, amelyből reprődűkálhatóan és stabilan nőrmál termőképesnövénnyé vagy növényrészekké regenerálható prőtőpla zt nyerhető, őlymódőn, hőgy a) regenerálható pőrtőkból és/vagy szőmatikűs szövetbőlaűxin aűtőtróf sejttenyészetet állítanak elő aűxin adagőlása nélkülfejlődőképes, viszőnylag nyálkamentes, szemcsés és őmlós sejtekvizűális sz lektálásával és más sejtektől történő elválasztásával és aszelektált sejtek fenntartó közegen történő tenyésztésével, és b) atenyészetből nőrmál termőképes növényt vagy növényrészeketregenerálnak. A találmány kiterjed a fenti genőtípűs kallűsz sejttenyészetének,embriőgén sejttenyészetének, valamint prőtőplasztjának előállítására. ŕ

Description

A találmány tárgya eljárás javított Zea mays (L.) genotípus előállítására, amely hosszan tartó és nagyon hatékony növényregenerálódó képességgel rendelkezik.

Kultúrnövények géntranszformálásához a kísérleti adatok szerint ideálisan alkalmazható a protoplaszt, amit széles körben alkalmaznak a paraszexuális génmanipulációhoz, beleértve a DNS-transzformálást és a szomatikus hibridizációt. A protoplaszt alkalmazása a legelterjedtebb, annak ellenére, hogy alternatív módszerek is ismertek, például a sejtbe történő mikroinjektálás, valamint DNS-sel bevont részecskék ép vagy tenyésztett szövetekbe történő makroinjektálása vagy bombázása. A génmanipulációs felhasználáshoz a protoplasztot izolálni és tenyészteni kell. A gyakorlati felhasználás alapkövetelménye, hogy a manipulált protoplasztból termőképes növényt kell regenerálni. Az egyszikű kultúrnövények közül a kukorica a leggyakrabban tanulmányozott szövettenyészet. Több publikáció igazolja, hogy a különböző tenyésztett szervekből, így portokból vagy éretlen embrióból végzett növényregenerálás erősen genotípusfüggő (Green és Phillips: Crop. Sci., 15, 417 (1975); Morocz: Tag-Ber., Acad. Landwirtsch. Wiss. DDR, Berlin (1983); Duncan és munkatársai: Planta, 165, 322 (1985)). A tenyésztési körülmények javítása csak részlegesen tudja kiküszöbölni ezt a korlátozást (Duncan és munkatársai: Planta, 165, 322 (1985)).

Az utóbbi években a genotípus fejlődésével és folyamataival kapcsolatos kutatások sokat foglalkoztak a szabályozott növényregenerálás problematikájával. A 292 435 számú európai közrebocsátási irat olyan eljárást ismertet, amely szerint termőképes növény nyerhető a viszonylag kevésbé nyálkás, omlós és szemcsés kukoricakalluszból. Shillito és munkatársai (Bio/Technology, 7, 581 (1989)), valamint Priori és munkatársai (Bio/Technology, 7, 589 (1989)) a teljes növény regenerálását ismertetik kukoricaprotoplasztból. Ezekben az esetekben azonban regenerálható protoplaszt csak hosszú, in vitro tenyésztési periódus (7-8 hónap, illetve 20-40 hónap) után nyerhető. Emellett a regenerált növény morfológiai rendellenességeket és sérült termőképességet mutat.

Azt találtuk, hogy egy új Zea mays (L.) genotípus olyan szövet- és sejtszuszpenziós tenyészeteket eredményez, amelyek nagy biztonsággal és termelékenységgel ép és termőképes növénnyé regenerálhatok.

A találmány tárgya tehát eljárás auxin autotróf Zea mays (L.) genotípus előállítására, amelyből reprodukálhatóan és stabilan normál termőképes növénnyé vagy növényrészekké regenerálható protoplaszt nyerhető, oly módon, hogy

a) regenerálható portokból és/vagy szomatikus szövetből auxin autotróf sejttenyészetet állítunk elő auxin adagolása nélkül fejlődőképes, viszonylag nyálkamentes, szemcsés és omlós sejtek vizuális szelektálásával és más sejtektől történő elválasztásával és a szelektált sejtek fenntartó közegen történő tenyésztésével, és

b) a tenyészetből normál termőképes növényt vagy növényrészeket regenerálunk.

A találmány szerint előállított sejttenyészet lehet kallusz sejttenyészet vagy, előnyösen többszörös keresztezés után, embriogén sejttenyészet.

A találmány tárgya továbbá eljárás a fenti Zea mays (L.) genotípus protoplasztjának, valamint a protoplasztból regenerált sejtek előállítására, amely sejtek termőképes növénnyé regenerálhatok, oly módon, hogy az (a) lépés szerint előállított sejttenyészetet protoplaszttá alakítjuk, és kívánt esetben a protoplasztból sejteket regenerálunk.

A fent meghatározott genotípus előnyös képviselője a DSM 6009 számon deponált sejtvonal, amelyet 1990. június 1-jén a Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH gyűjteményben a Budapesti Szerződés előírásai szerint deponáltunk.

A fent meghatározott genotípus kifejlesztését, valamint a tenyészet beindításának és fenntartásának technikáját, a szuszpenziós tenyésztést, a protoplasztizolálást és -tenyésztést az alábbi lépések szerint végezzük:

(a) lépés: Szövettenyésztésre alkalmas különböző genotípusok kifejlesztése

Különböző kukorica beltenyésztett vonalakon, törzseken és tájjellegű változatokon vizsgáltuk azt a képességet, hogy kallusz tenyészetet alakít ki portokból és szomatikus szervekből, így éretlen embrióból vagy apikális és laterális merisztémából. A portoktenyészethez az egymagvú mikrospórás portokot portoktenyészetindító közegre visszük, és sötétben, előnyösen 21-28 °C hőmérsékleten 40-90 napon keresztül inkubáljuk.

A szomatikus tenyészethez az inokulumot (például 1-3 mm méretű éretlen embriót vagy 0,5-0,7 cm méretű merisztémadarabot) épen vagy bemetszett állapotban szomatikus tenyészetindító és -fenntartó közegre visszük, és megvilágítás mellett 21-28 °C hőmérsékleten tenyésztjük 30-60 napon keresztül. A kapott tenyészeten növényregeneráló közegen ellenőrizzük a regenerációs képességet. A regenerálható szövettenyészetet eredményező genotípusokat alkalmazzuk a kereszthibridizáláshoz, és a hibridembriókat azonos módon vizsgáljuk. A vizsgálatot kiegészítjük azzal, hogy legalább egyéves szövettenyésztéses fenntartás után ellenőrizzük a regenerációs képességet. A portoktenyészetből származó anyagot haploid fenntartóközegen tartjuk fenn. A regenerálható beltenyésztett vonalak, törzsek vagy tájjellegű változatok hibridjei általában gyakrabban eredményeznek embriogén tenyészetet. Az első néhány fokozatban nem veszítik el a regenerációs képességet, és szövettenyészetből könnyebben regenerálhatok növénnyé, mint a szülő egyedek.

(b) lépés: A kiindulási anyag előállítása az (a) lépésben kiválasztott genotípusokból

Az (a) lépés szerint regenerálhatónak bizonyult tenyésztett portokból és szomatikus inokulumból származó különböző genotípusokat az egymást követő generációkban keresztezve szintetikus változatokat állítunk elő, amelyek mindegyike 6-8 genotípust tartalmaz.

(c) lépés: Különleges szövettenyésztési tulajdonságokkal rendelkező javított rekombinánsok kiválogatása

HU 215 163 Β

A (b) lépés szerinti szintetikus változat portokját és éretlen embrióját vagy merisztémáját inokulumként alkalmazva javított regenerálható embriogén tenyészetet állítunk elő. A több száz regenerálható tenyészetből egy speciális típusú tenyészetet állítunk elő, amely bőségesen burjánzó korai embriogén kalluszként fenntartható. Egy év elteltével H 229 és OK 281 genotípusokat (a DSM 6009 genotípus szülőváltozatai) állítunk elő, amelyhez csak olyan tenyészeteket válogatunk ki és tartunk fenn, amelyek felületi és szuszpenziós tenyészetben is normálisan fejlődő regenerátumot eredményeznek a kalluszból. A kiválogatott termőképes, regenerálható, korai embriogén tenyészetekből izolált protoplasztok szintén különböző változatokat mutatnak az életképesség és a tenyészthetőség vonatkozásában. Előnyösen a protoplaszt kísérletben pozitív választ adó genotípusokat tartjuk fenn. A kiválogatás után az első ciklusú genotípus regenerátumait keresztbe hibridizálva második ciklusú genotípusokat, így DSM 6009 (HE 89) genotípust állítunk elő, amelyek azonos módon alkalmasak regenerálható haploid vagy szomatikus sejt és szövettenyészetek iniciálására, és a megfelelő tenyészetekből totipotens protoplaszt előállítására.

(d) lépés: A genotípus fejlődési szakaszainak szabályozásához szükséges körülmények optimalizálása a kiválasztott tenyészetben

A H 229, OK 281 és DSM 6009 fenntartóközegben lévő szövettenyészetét gyakori és szabályos fokozatokra (2-3 fokozat 1-2 hetes intervallumokkal) osztva elnyomjuk a korai embrió további differenciálódását, és a késői fejlődési fokozatokat a korai fokozatokhoz igazítjuk. A homogén korai embriogén tenyészet különböző tenyészközegeken kevésbé gyakori fokozatokkal (például egy hónap) könnyen fenntartható. A kevésbé gyakori fokozatokkal vagy előnyösen növényregeneráló közegre átvive késői embriogén tenyészet fejlődik a korai embriogén tenyészetből. A késői embriogén tenyészet különböző időpontokban csírázó embriókat tartalmaz, amelyek egy második növényregeneráló közegre vive nagyszámú regenerált növényt eredményeznek. Az ilyen genotípusok korai embriogén tenyészetét a tenyészközeg vonatkozásában mutatott nagyfokú rugalmasság jellemzi. Valamennyi közismert tenyészközeg, így az MS közeg (Murashige/Skoog: Physiol. Plánt 15, 473 (1962)), a B5, SH vagy N6 közeg (Chu C. C. és munkatársai: Sci. Sin. 16, 659 (1975)) felhasználható a H 229, OK 281 és DSM 6009 szövettenyészetek beindítására vagy fenntartására. Előnyösen alkalmazható az N6M közeg, mivel a fenti tenyészetek ezen a közegen több éven keresztül (például a H 229 esetében 4 éven keresztül) fenntarthatok anélkül, hogy elveszítenék a termőképes növénnyé történő regenerálódás képességét. A fenti genotípusok embriogén jellegzetességeinek magas szintű kifejezése és a regenerálható embriogén tenyészet kialakításához szükséges N6M közeg optimális összetétele közötti szoros összefüggést igazolja az a tény, hogy az N6M közeg hormonok nélkül nemcsak növényregeneráláshoz, hanem a fenti genotípusokból származó embriogén tenyészetek beindításához és fenntartásához is alkalmazható. Ebből következik, hogy a fenti genotípusok fontos jellemzője az, hogy auxin autotróf közegben is fejlődőképesek.

(e) lépés: Hosszú idejű tenyésztés után is termőképes növénnyé regenerálható szuszpenziós tenyészetekjavítása

Annak következtében, hogy a gyorsan növekvő sejtpopuláció hajlamos sejtmutánsok felhalmozására, szükség volt a folyékony tápközeg javítására, és így annak az időtartamnak a meghosszabbítására, amelyen belül a szuszpenziós tenyészet fenotipikusan normális és teljes egészében termőképes növényekké regenerálható. Meglepő módon azt találtuk, hogy ez elérhető, ha az N6 közeg mikrotápanyagait az MS közeg mikrotápanyagaival helyettesítjük, és a felületi tenyészethez viszonyítva csökkentjük a 2,4-diklór-fenoxi-ecetsav (2,4-D) menynyiségét, és megnöveljük a szacharóz (mintegy 3 tömeg%) mennyiségét. Ez az úgynevezett N6M közeg felhasználható a DSM 6009 omlós korai embriogén kallusz tenyészetéhez is. Mintegy két fokozat után ebben a közegben a szuszpenzió felhasználható jó kitermeléssel regenerálható protoplasztnak a genotípusból történő izolálására.

(f) lépés: Protoplasztizolálás és -tenyésztés

A protoplaszt előállításához az ismertetett genotípust roncsolóenzimekkel, így cellulázzal és pektinázzal inkubáljuk. Az enzimek alkalmazhatók keverék formájában is, ahol az egyes enzimek koncentrációja 0,05-4 vegyes% (tömeg/térfogat). A vizes inkubációs oldat optimális összetétele, valamint az enzimkoncentráció minden szövettípusnál egyszerű tesztek segítségével megállapítható. A protoplaszt ozmotikus stabilizálása érdekében az inkubációs oldat ozmotikus anyagokat, így mannitolt, szorbitolt, glükózt, szacharózt, fruktózt, káliumnitrátot vagy más, jellemző növényi tápsót tartalmaz. Az enzimoldat ozmolaritása előnyösen 500-750 mOsm, különösen előnyösen 600-700 mOsm. A pH-érték 4,5-6,0 között, előnyösen 5,5-6,0 között változik, és 1-75 mmol/1 foszfát puffer és 1-10 mmol/1 morfolinetán-szulfonsav (MES) segítségével állítjuk be.

Az enzimkoncentrációtól függően a protoplaszt 3-20 óra alatt előállítható. Az inkubálás során a szuszpenziót óvatosan, előnyösen 10-50 fordulat/perc értéken rázzuk.

Az inkubálás után a protoplasztot sókat, vitaminokat, aminosavakat, szintetikus auxint, így 2,4—D-t vagy dikambát, valamint cukrot, előnyösen fruktóz, glükóz és szacharóz keverékét tartalmazó növesztőközegre visszük.

A protoplasztot előnyösen vékony réteg (0,1-1 mm) ppN6M protoplaszt-tenyészközegen tenyésztjük steril üveg vagy műanyag tenyészedényben, amelyet a protoplaszttenyészet elpárolgásának megakadályozására megfelelően lezárunk. A tenyésztést tompa megvilágítás mellett 21-26 °C hőmérsékleten végezzük. A sejtés telepképzéshez szükséges protoplasztsűrűség 5-7 x 10⁵ és 3-5 χ 10⁶ protoplaszt/ml tenyészközeg között található. 20-40 napos tenyésztési periódus után szabad szemmel látható telepek fejlődnek ki a protoplaszttenyészközegben. A látható telepek képzéséhez szükséges idő lerövidíthető, ha a protoplaszttenyésztés megin3

HU 215 163 Β dítását követő 3 hét elteltével részletekben kis mennyiségű szuszpenziós vagy protoplaszt-tenyészközeget adagolunk (például 0,2-0,5 ml 3-4 napos intervallumokban). A látható telepeket fenntartó- vagy regenerációs közegre visszük, vagy új szuszpenziós tenyészet megindításához alkalmazzuk.

(g) lépés: Növényregenerálás a protoplasztból származó tenyészetből és a regenerált növény termesztése

A protoplasztból származó telepeket növényregeneráló közegre visszük, ahol érett, szomatikus embrióvá fejlődnek, amely kicsírázva növénnyé növeszthető. Hormonmentes közegen a viszonylag homogén korai embriogén tenyészet a felületen jól fejlődő embriogén szövethalmazokat képez. Az érett és csírázó embriókat friss hormonmentes növényregeneráló közegre vive nagyszámú egészséges növénykét kapunk. Amikor a növénykék elérik az 5-7 cm magasságot, és az első csomónál több gyökérrel rendelkeznek, ezeket eltávolítjuk a tenyészedényből, elválasztjuk őket egymástól, és a hozzátapadó agardaraboktól. A gyökérrendszert megszabadítjuk a gyenge, nem csomóhoz kötődő gyökerektől és a tenyészközeg-maradékoktól. A növény kéket ezután talajba kiültetjük. Talajként előnyösen alkalmazható tőzeg, homok és perlit egyenlő arányú keveréke, valamint bármely szokásos mezőgazdasági talaj. A növényeket nejlonzsákok alatt vagy nedves légkörben tartjuk 10 napon keresztül, 2 napon keresztül folyamatosan, majd a szokásos zöld színhez és intenzív fejlődéshez szükséges periódusokban megvilágítjuk. A növényeket rendszeresen öntözzük és trágyázzuk. Magok előállításához csak azokat az óvatosan tenyésztett növényeket alkalmazzuk, amelyek a zöld színt az első leveleknél visszanyerik. A magokat önbeporzással és keresztbe beporzással állítjuk elő. A legtöbb olyan növény, amelyet az érés megkezdése előtt a tenyészközegből kiültettünk a talajba, és amelyet megfelelően tenyésztettünk, a szaporodószervekben rendellenességektől mentes, jól fejlett növénnyé fejlődik.

(h) lépés: Törzs azonosítása és a genotípus védelme

RFLP (restriction fragment length polymorphism, hasítási fragmensek hosszúságának polimorfizmusa) segítségével

A szokásos morfológiai és fiziológiai jellemzők mellett, amelyek a szövettenyészet megindítása és fenntartása során láthatóvá válnak, a kiválogatott genotípusok növényregeneráló és növénystabilitási jellemzői, valamint meghatározott molekuláris minták segítségével kapott restrikciós fragmensek hibridizálási eloszlása is segítik a leírt genotípus azonosítását. A szülővonalból (H 229 és OK 281), valamint a kapott, erősen embriogén DSM 6009 hibridből DNS-t izolálunk. Példaként a növényi DNS HindUI és BamHI restrikciós enzimmel végzett hasítása után a kukoricából klónozott feltételezett auxin receptor génre vonatkozó cDNS kiónnal (U. Tillman és munkatársai: The EMBO J., 1988, 2463-2467) kapott hibridizációs mintát alkalmazzuk. Mint a 2. ábráról látható, valamennyi vizsgált genotípus különleges és jellemző mintát ad a hibridizációs sávokból.

A 2a és 2b ábra a restrikciós fragmensek polimorfizmusát mutatja, amely a feltételezett auxin receptor génre vonatkozó és ³²P jelölésű cDNS inzerttel végzett hibridizálással tehető láthatóvá. A felvitt oszlopok a következők:

1. OK

2. H 229 HindUI

3. DSM 6009

4. OK

5. H 229 BamHI

6. DSM 6009.

Az exponálási idő a 2b ábra felvételénél mintegy háromszor hosszabb, mint a 2a ábra exponálási ideje.

Az 1A-K ábrák különböző sejttípusokat és fejlődési fokozatokat mutatnak (részleteket lásd a regenerálás és növesztés ismertetésénél).

í. példa

A szintetikus MR Syn So₂o₂/87 homályos szomatikus tenyészetének és az OK 281 elsődlegesen korai embriogén tenyészetének előállítása

Különböző kukorica-genotípus növényeket növesztünk szabadfoldön. 3—4 növényt önbeporzunk, és a megtermékenyített csöveket 12-14 nappal a beporzás után betakarítjuk. A héjat és a kukoricahajat eltávolítjuk a csövekről, majd a felületet 0,15 tömeg% nátriumhipoklorit oldattal, amely 0,5 tömeg% háztartási detergenst tartalmaz, 10 percen keresztül sterilizáljuk, majd steril ionmentesített vízzel háromszor leöblítjük. Minden csőről 10 embriót eltávolítunk aszeptikus körülmények között, és a lapos csírarügy és gyököcske oldallal lefelé a felülettel érintkezve 50 ml megszilárdított (0,8 tömeg% agar) szomatikus kezdeti és fenntartóközegre helyezzük 10^2 cm-es Petri-csészékben. Az embriótenyészetet 30-60 napon keresztül megvilágítás mellett 25 ± 2 °C hőmérsékleten inkubáljuk. Kifejlesztés után az embriogén tenyészetet hónaponként friss közegre visszük át, és növényregeneráló közegen ellenőrizzük a növényregenerációs képességet. A vizsgált genotípusok közül az A188, GK3/H és W64A beltenyésztett vonalak, a Mangelsdorf-féle teszter (MT) genetikai törzs, és egy fehér gyöngyszemű helyi változat (white fiint local variety, WFLV) eredményez regenerálható tenyészetet a fenti körülmények között. Ezek a genotípusok azonban főként késői embriogén tenyészetet adnak, amit a kukorica-szövettenyésztés irodalmában gyakran I. típusú tenyészetnek neveznek. A regenerációs képesség a friss közegre történő fokozatos átvitellel arányosan csökken, és 6 hónap fenntartás után csak szűk regenerálódó szektor marad fenn. Két regenerálódó genotípust hibridizálva és annak embrióját tenyésztve javulás érhető el a szaporodási arányban és a regenerációs képességben. Az A188 X W64A hibrid tenyészet például 3 éven keresztül fenntartható a regenerációs potenciál elvesztése nélkül. A lehetséges előnyös gének további kombinációjának elősegítése érdekében az eredeti genotípusokból egy többgenerációs keresztezési programot indítottunk. Két opálos forrásból (o₂o₂), amelyek a fenti körülmények között vagy nem

HU 215 163 Β regenerálhatok (Oh 43o₂o₂) vagy regenerációs képességét nem vizsgáltuk (H Temp Ao₂o₂) indulunk ki. A homályosságot biztosító gén és a regenerációs jellemzőért felelős gének egyesítéséhez először az opálos genotípust regenerálódó genotípussal keresztezzük. Ezért ezeket a genotípusokat elültetjük, tenyésztjük, és a csöveket a haj megjelenése előtt izoláljuk. A regenerálódó genotípus izolált csöveit keresztbeporozzuk az opálos gént hordozó genotípus virágporával. így egyszeri keresztezést! hibridet (SC1-SC10) állítunk elő az A188, GK3/H, W64A, MT és WFLV Oh 43o₂o₂-vel és H Temp Ao₂o₂-vel végzett keresztezésével. A tíz különböző egyszeri keresztezés magjait betakarítjuk, elültetjük, növesztjük, és a keresztbeporzás második sorozata előtt izoláljuk. így kettős keresztezésű (DC1-DC5) hibrid magokat kapunk az SC1*SC7, SC2*SC8, SC3*SC9, SC4*SC10 és SC5*SC6 keresztezésekből. Az első és második beporzási sorozatban csak egy csövet takarítunk be minden keresztbeporzásról. A betakarított DC magokból homozigóta o₂o₂ magokat szelektálunk a fenotípus alapján, és ezeket elültetjük. A virágzást periódusban a harmadik beporzási sorozatban minden DC hibridet (DC1-DC5) az összes többivel keresztezünk, és így minden húsz keresztkombinációból négy csövet takarítunk be. A kapott 80 csőből csövenként 10 magot felhalmozunk, elültetünk, és véletlenszerű leszármazásos beporzással lehetővé tesszük a kívánt gének rekombinálását. A száz legjobb csövet kiválogatjuk a betakarított növényi anyagból, minden csőről 10 magot felhalmozunk, és a szomatikus tenyészethez szintetikus kiindulóanyagként alkalmazzuk (jelölése: MR Syn So₂o₂/87). A kapott szintetikus anyagot elültetjük, és a virágzó növényeken önbeporzást végzünk. Minden száz önbeporzott csőből 10 éretlen embriót elültetünk a fent leírt módon. A tenyésztett embriók mintegy 30%-a (286 a 950-ből) regenerálódó tenyészetet eredményez, ezek többsége késői embriogén típusú. A spontán korai embriogén tenyészetből, amelyet a szakirodalomban gyakran II. típusú vagy omlós embriogén tenyészetnek neveznek, intenzív növekedése, az üszkösödés hiánya, a könnyű regenerálhatóság és a regenerált növény termőképessége alapján kiválogatjuk az OK 281 tenyészetet.

2. példa

Szintetikus MR Syn A/85 portok tenyészetének és a H 229 korai embriogén haploid tenyészetének előállítása

Különböző kukorica-genotípusokat elültetünk, és a megfelelő fiziológiai állapot eléréséig tenyésztjük, majd a legfelső levelek által betakart címert begyűjtjük. A külső leveleket eltávolítjuk, és a maradék levelekkel fedett címert műanyag zsákba helyezzük, és 4-8 °C hőmérsékleten 10-30 napon keresztül hőkezeljük. A kezelés után a leveleket eltávolítjuk, és a késői egymagvú mikrospórákat hordozó portokokat tartalmazó címerszektorokat a portok mikroszkopikus vizsgálata alapján kiválogatjuk, és 2 tömeg%-os vizes orceinoldatban péppé töijük. A kívánt mikrospórákat hordozó virágocskák felületét 0,1 tömeg%-os nátrium-hipoklorit oldattal sterilizáljuk 10 percen keresztül, amely 0,5 tömeg% háztartási detergenst tartalmaz, majd ionmentesített steril vízzel háromszor 10 percen keresztül mossuk. A sterilizált virágocskákból mintegy 100 portokot eltávolítunk, és 50 ml portokindító tenyészközegre helyezzük 10*2 cmes üveg Petri-csészékben. A portokot sötétben 40-90 napon keresztül 25 °C hőmérsékleten inkubáljuk. Két helyi változat a Golden Glow (GG) egy fehér lófogú helyi változat (white dent local variety, WDLV) kis százalékban (1% alatt) haploid kalluszt eredményez a tenyésztett portokból. Regeneráló közegben egyik sem regenerálódik növénnyé. A két helyi változatot (GG és WDLV) keresztezzük, a hibrid magokat elültetjük, és a kapott FI növények portokját azonos módon vizsgáljuk. A kapott haploid embriókból egy tenyészet többszörös növényregeneráláshoz alkalmazható egy éven keresztül, mielőtt regenerációs potenciálját elveszítené. Az embrióképzési potenciál, a növényregenerációs kapacitás és a talajba kiültetett regenerált növény túléléséhez és fejlődéséhez szükséges növényi jellemzők kombinálásához a két lokális változat hibridjének 10 növényét egy olyan növényi populációval porozzuk keresztbe, amelyet két különböző hibrid [GK3/H * MT és (A188 * A619) * BMSC] kereszthibridizálásával állítunk elő, és amelyek mindegyike portoktenyészetben továbbvihető. A betakarított csövekről 10 magot felhalmozunk, szabad földön elültetjük, és a nemkívánatos agronómiái jellemzőktől, így elágazástól, üszkösödéstől és megdőléstől mentes növényeket egyenes ágon leszármaztatjuk. Betakarítás után a harminc legjobb csövet megtartjuk, és ezekről csövenként azonos számú magot felhalmozunk. Ezek a magok jelentik a szintetikus MR Syn A/85 portoktenyészetet. A magok egy részét elültetjük, a címert begyűjtjük, és a fent leírt módon feldolgozzuk. A tenyésztett portokból Petri-csészénként 0-20% embrió képződik. Az MS Syn A/85 különböző címereiből származó, összesen 300 haploid embrióból mintegy 20% regeneráló embriogén tenyészetben kifejlődik, miután az indítóközegből haploid fenntartóközegre vittük át. A regenerálódó tenyészetekből szelektáljuk a H 229 tenyészetet a főként korai embriogén kallusz fenotípus, gyors szaporodási készség, a hosszan tartó felületi és szuszpenziós tenyészetben (több mint 2 év a következő keresztezést ciklus előtt) megőrzött növényregenerációs kapacitás, valamint az osztódási és telepképzési, valamint a növényprotoplasztból történő regenerációs képessége alapján.

3. példa

Erősen embriogén DSM 6009 tenyészet előállítása Az embrióból vagy portokból főként korai embriogén tenyészetet eredményező két, korábban kiválogatott genotípust keresztbe beporozva kombináljuk a két genotípus kívánatos jellemzőit. A 30 hónappal az iniciálás után regenerált H 229 növény női virágjait beporozzuk a 10 hónappal az iniciálás után regenerált OK 281 növény virágporával. A kapott éretlen hibrid embriókat szomatikus indító- és fenntartóközegen, valamint növényregeneráló közegen inkubáljuk. A növényregeneráló közegen korai embriogén tenyészetet eredményező embriók közül auxin autotrófia alapján és vi5

HU 215 163 Β szonylag nyálkamentes, szemcsés és omlós sejtek vizuális szelektálásával kiválogatjuk a DSM 6009 (HE 89) embriót, fenntartjuk, és szuszpenziós tenyészet iniciálásához alkalmazzuk. A donor hibrid embrió (HL 29*OK 281) inokulálását követő két hónap elteltével indul az első eredményes protoplaszttenyésztés, amely protoplasztból származó termőképes növényeket eredményez. A DSM 6009 hordozza a szülők valamennyi előnyös tulajdonságát, és emellett kitűnik hozzájuk viszonyítva a legtöbb felsorolt szövettenyésztési jellemzőben.

4. példa

A regenerációs képesség visszatartására alkalmas

N6M szuszpenziós tenyészközeg kifejlesztése

Az N6M szuszpenziós tenyészközeg kifejlesztése óta három független szelektált regenerálható genotípust (köztük korai és késői embriogén, szomatikus és haploid tenyészeteket) vizsgáltunk több mint 2 éven keresztül szuszpenziós kultúrában, amelynek során megfigyeltük a regenerációs és termőképességi tulajdonságokat. A 4C1 szomatikus, főként késői embriogén tenyészet, a C2-A szomatikus, késői embriogén tenyészet és a H 229 haploid, főként korai embriogén tenyészet N6M szuszpenziós tenyészközegben fenntartható. Bár a szuszpenziós tenyészet gyorsabb szaporodási arányt mutat, a kiválogatott genotípusok növényregenerációs képessége jobb, ha az embriókat a szuszpenziós tenyészetből ritka fokozatokra (mintegy 2 hónapos intervallumokra) osztott agar felületi tenyészetre visszük. Mindhárom esetben 2 éves N6M szuszpenziós tenyészetben végzett fenntartás után termőképes növény nyerhető. Hasonló eredményeket kapunk más tenyészetekkel egy évig a fenti szuszpenziós tenyészetben végzett fenntartás után. Ebből következik, hogy az N6M szuszpenziós tenyészközeg előnyösen alkalmazható a tenyészetek fenntartásához a protoplaszt izolálása előtt.

A HE/89 szuszpenziós tenyészet létrehozása és fenntartása

A HE 229 ^x OK 281 keresztezésből üvegházban a beporzást követő 12 nap alatt kapott, kisebb mint 1 mm-es embriókat N6M közegen inkubáljuk 2,4—D adagolása nélkül 3 héten keresztül, majd N6M és MSG közegen két altenyészetet képzünk 10-14 napos intervallumokkal a szuszpenziós tenyésztés N6M közegen történő megindítása előtt. A szabályos fenntartáshoz 4 g sejtet alkalmazunk egy új 5-7 napos, 100 ml-es Erlenmeyer-lombikban 50 ml N6M közegben végzett tenyésztési ciklus megindításához. A tenyészeteket fluoreszcens csövekkel végzett folyamatos vagy periodikus megvilágítás mellett 22-25 °C hőmérsékleten növesztjük.

Protoplasztizolálás és -tenyésztés

A szuszpenziós tenyészetből 2 nappal az utolsó átvitel után 2 g frissen lemért sejtanyagot csipesszel 1 ml mosóoldatban, amely 1 tömeg% nPG törzsoldatot tartalmaz, összetörünk. Ez a kezelés csökkenti a 2-3 mmes telepek méretét. Az összezúzott sejtszuszpenziót kétszer nPG tartalmú mosóoldattal mossuk. A kimosott sejteket 10 ml protoplaszt izolációs közegben 4 órán keresztül sötétben inkubáljuk, amelynek során kívánt esetben óvatosan rázzuk. Az enzimes kezelés után az oldatot egy 210 pm-es és egy 60 pm-es szitán hajtjuk át, majd 1000 fordulat/perc értéken centrifugáljuk. A pelletet 10 ml 0,6 mol/1 szacharóz + nPG és 1 ml mosóoldat + nPG elegyben szuszpendáljuk, majd ismét centrifúgáljuk. Az úszó protoplasztot összegyűjtjük, és 10 ml mosóoldat + nPG elegyben harmadszor is centrifugáljuk. A protoplasztok számát Buerker- vagy Thoma-kamrában megszámoljuk a harmadik centrifúgálás előtt. A protoplasztot 2 ml folyékony közegben tenyésztjük, vagy 2 ml kettős sűrűségű ppN6M/89 és 1,2 tömeg%-os megolvasztott agaróz 1:1 arányú és 45 °C hőmérsékletre melegített oldattal keverve 0,5-0,7 tömeg%-os, alacsony gélpontú agarózba (Sigma) beágyazzuk. A protoplasztot tompa megvilágítás mellett 25 °C hőmérsékleten tenyésztjük. A protoplaszt táplálásához a folyékony közeghez 3 hét elteltével 0,5 ml N6M közeget, majd további 2-3 nap elteltével 1 ml közeget adunk. Ezután 3—4- nap elteltével az egész tenyészetet 10 ml friss N6M közegre öntjük, és összerázzuk. Az agarózba beágyazott tenyészetet vagy adott esetben 2,4-D-t tartalmazó megszilárdított N6M közegre, vagy 10-50 ml folyékony N6M közegre viszszük 2-4 hét, előnyösen 3 hét elteltével.

Növényregenerálás és -növesztés

Az agar közegen lévő regenerált kalluszból 0,2-1 g embriogén kalluszt helyezünk 100 ml N6M közegre, amely 2,4-D-t nem tartalmaz. A közeget levegőztető szivacsdugóval ellátott fedéllel lezárt üvegedénybe vagy műanyag edénybe helyezzük. Ezt a lépést addig ismételjük, amíg kifejlett növényt kapunk az embrióból és a növénykéből. A nagyobb növényeket (7 cm felett) eltávolítjuk, és humuszban gazdag, különböző mezőgazdasági talajokat tartalmazó különböző méretű cserepekbe ültetjük. A növényeken a haj és a címer megjelenése után önbeporzást és egyenes ágú leszármazási beporzást végzünk.

Az 1A-K ábrák különböző sejttípusokat és fejlődési fokozatokat mutatnak, köztük a DSM 6009 tenyészetet, DSM 6009 embriogén kukoricatenyészetet és az ebből protoplaszttenyésztési eljárással kapott regenerált növényt. Ezen belül az 1A ábra korai embriogén tenyészet, az IB ábra protoplasztizolálásra alkalmas középfinom szuszpenziós tenyészet, az 1C ábra protoplaszt az izolálás utáni hatodik órában, az 1D ábra az első osztódás az izolálás utáni 32. órában, az 1E ábra telepek az izolálást követő 8. napon, az 1F és 1G ábra korai és késői embriogén tenyészet a protoplasztból 2 hónap elteltével, az IH és II ábra a protoplasztból regenerált növény talajba történő kiültetés előtt és után, az 1K ábra a protoplasztból származó érett növény magokkal, három és fél hónappal a talajba történő kiültetés után.

Definíciók:

H229:

Regenerálható haploid Zea mays (L.) szövettenyészet és genotípus, amely a portok tenyészetből előállított mesterséges MS Syn A/85 portok tenyészetéből egymást követő keresztbe beporzással és egyenes ági

HU 215 163 Β leszármazási beporzással nyerhető a következő genotípusok felhasználásával: A 188, A 629, GK 3/H (beltenyésztett vonalak), fekete mexikói édeskukorica (Black Mexican Sweet Com, BMSC), Mangelsdorf-féle teszt (MT) (genetikai törzsanyag), fehér lófogú lokális változat (WDLV) és Golden Glow (GG) (helyi változatok). A H 229 tenyészet főként korai embriogén, és könnyen képez szuszpenziós tenyészetet. A szuszpenziós tenyészetben lévő protoplaszt megfelelő körülmények között növénnyé fejlődik. A H 229 szövettenyészetből nyert H 229 növények termőképes női növények, amelyek életképes virágporral megporozva magokat eredményeznek.

OK 281:

Regenerálható, főként korai embriogén, szomatikus Zea mays (L.) szövettenyészet és genotípus, amely az MR Syn So₂o₂/87 változatból éretlen embriótenyészettel nyerhető. A kiindulási anyagot egymást követő keresztbe beporzással, egyenes ági leszármazási beporzással és önbeporzással állítjuk elő a következő genotípusok felhasználásával: A 188, GK 3/H, W 64 A, Oh 43o₂o₂(beltenyésztett vonalak), MT (genetikai törzsanyag), fehér gyöngyszemű lokális változat (WFLV) (helyi változat) és H Temp Ao₂o₂ (mesterséges o₂o₂ változat).

Az OK 281 tenyészetből nyert OK 281 növények megfelelő körülmények között önbeporzással, egyenes ági leszármazási beporzással vagy keresztbe beporzással magokat eredményeznek. Az OK 281 genotípus a recesszív opálos gén (o₂o₂) vonatkozásában homozigóta.

DSM 6009 (HE/89):

Regenerálható, erősen embriogén, főként korai embriogén szomatikus Zea mays (L.) tenyészet és genotípus, amely a H 229 és OK 281 keresztbe beporzását követő éretlen embriótenyészetből nyerhető. A H 229 és OK 281 genotípusokat 30 és 10 hónapon keresztül tartjuk fenn tenyészet formájában, majd a keresztbe beporzáshoz regeneráljuk a növényeket. A DSM 6009 genotípus előnyösen adaptálható az in vitro tenyésztés követelményeihez, mivel olyan ősöktől származik, amelyeket szövettenyésztési jellemzők alapján szelektáltunk. így a DSM 6009 a különböző jellemzők következő különleges kombinációját tartalmazza:

1. Autotróf embriogén kallusz hormonképzés, amely standard növényszövet-tenyésztó közegen jól fejlődik.

2. Érett szomatikus embrióból auxin tartalmú közegen reprodukálható módon kallusszerű korai embriogén (II. típusú) tenyészetet képez.

3. Hosszan tartó növényregeneráló képesség.

4. A kallusszerű korai embriogén (II. típusú) tenyészet reprodukálható módon szuszpenziós tenyészetté alakítható.

5. A kallusz folyékony tenyészetre történő átvitelét követő 1 hónapon belül nagy mennyiségű protoplaszt szabadul fel.

6. A kalluszból, szuszpenzióból és protoplasztból nagy gyakorisággal regenerálható termőképes növény.

Korai és késői embriogén tenyészet:

Speciális kukoricaszövet-tenyészet, amelyben a szomatikus embrió korai állapotában gyors szaporodás figyelhető meg. Ezek az embriók nem fejlődnek jól látható embriókká, amelyek méretükkel, simaságukkal, scutellumszerű szerkezetet hordozó levelükkel vagy gyökérkezdeményükkel jellemezhetők lennének. Ezzel ellentétben a korai embriogén tenyészet megjelenése homogén kallusztenyészetre utal. Ezt a tenyészettípust a szakirodalomban II. típusú vagy omlós embriogén kallusztenyészetnek nevezik. A korai embriogén tenyészet a növényregenerálás előtt késői embriogén tenyészetté fejlődik. A késői embriogén tenyészetben az embriók jól fejlett scutellumszerű felépítéssel, zöld foltokkal vagy levél- és szárkezdeménnyel, valamint gyökérkezdeménnyel vagy kis gyökerekkel rendelkeznek. A DSM 6009 tenyészetében mindkét kallusztípus könnyen hozzáférhető, és a tenyésztési körülményektől függően egymásba átalakítható.

Szomatikus indító és fenntartó tenyészközeg:

Green C. E. és Phillips R. L.: Crop Sci., 15, 417-421 (1975) által ismertetett módosítás szerinti MS közeg (Murashige T. és Skoog F.: Physiol. Plánt., 15 473- 497 (1962)), azzal a kiegészítéssel, hogy 500 mg/1 Bacto triptont és 150 mg L-aszparágint tartalmaz.

Portokindító tenyészközeg:

N6 makroelemek glicin és vitamin (Chu és munkatársai: Scientia Sinica, 18, 659 (1975)), MS mikroelemek, EDTA és FeSO₄ ^x 7H₂O (Murashige T. és Skoog F.: Physiol. Plánt, 15,473 (1962)), valamint kiegészítésként 100 mg/1 L-prolin, 600 mg/1 Bacto tripton, 120 g/1 szacharóz, 1 mg/1 benzil-adenin, 1 mg/1 naftil-ecetsav, 2 mg/1 2,4-diklór-fenoxi-ecetsav, 5 g/1 aktív csontszén. A pH-t autoklávozás előtt kálium-hidroxiddal 5,8 ± 0,05 értékre állítjuk, majd hozzáadjuk az aktív csontszenet. A közeget 5 g/1 agarózzal megszilárdítjuk.

Haploidfenntartó tenyészközeg:

Makroelemek, mikroelemek, EDTA, FeSO₄ χ 7H₂O, aminosavak és vitaminok, mint a portokindító tenyészközegnél. A megváltoztatott komponensek: 0,5 mg/1 2,4-diklór-fenoxi-ecetsav, 30 g/1 szacharóz és 8 g/1 agar. A pH-t autoklávozás előtt 5,8 ± 0,05 értékre állítjuk.

N₆M-szuszpenziós tenyészközeg:

Azonos a haploidfenntartó tenyészközeggel, de nem tartalmaz agart.

ppN₆M-protoplaszt tenyészközeg:

Módosított N₆M tenyészközeg a következő plusz komponensekkel vagy megváltoztatott mennyiségekkel: 370 mg/1 MgSO₄ x 7H₂O, 300 mg/1 CaCl₂ x 2H₂0,1 g/1 szacharóz, 50 g/1 glükóz, 30 g/1 fruktóz, 2,5 g/1 maltóz, 2,5 g/1 galaktóz, 500 mg/1 galakturonsav, 500 mg/1 glükuronsav, 500 mg/1 L-aszparagin, 100 mg/1 L-glutamin, 100 mg/1 L-szerin, 0,4 g/1 2,4-diklór-fenoxi-ecetsav, 0,7 mg naftil-ecetsav és 0,7 mg zeatin (izomer keverék). A pH értéke beállítás nélkül 4,5-5,0.

Protoplasztizolációs közeg (sejtes oldat):

ml protoplasztizolációs oldatot állítunk elő a következő szűréssel sterilizált (s) vagy autoklávozott (a) törzsoldatokból:

0,3-0,5 ml ionmentesített delluláz/pektináz törzsoldat (s)

2,0 ml mosóoldat (s)

4,2-4,4 ml kétszeresen desztillált víz (a)

HU 215 163 Β

0,5 ml BSA törzsoldat (s)

0,1 ml n-PG oldat (s)

0,1 ml 1 mol/1 CaCl₂ oldat (a)

0,1 ml 1 mol/1 MgSO₄ oldat (a)

2,5 ml ozmotikus oldat (s).

Ionmentesített celluláz/pektináz törzsoldat:

g celluláz Onozuka RS-t és 1 g pektoliáz Y23-t 4 °C hőmérsékleten kétszeresen desztillált vízben oldunk. Az oldhatatlan maradékokat centrifugálással (6000 fordulat/perc, 10 perc) eltávolítjuk. A felülúszót Sephadex G25 oszlopon (200-250 ml) áthajtva ionmentesítjük. Az ionmentes enzim tartalmú frakciókat összegyűjtjük, és 50 ml térfogatra hígítjuk. Szűréssel 0,22 pm-es membránszűrőn sterilizáljuk, és 0,5 ml részletekben fagyasztva szárítjuk.

Mosóoldat:

Fe, EDTA, 2,4-D és (NH₄)₂SO₄ nélküli N₆M közeg. Cukorként 10 g/1 szacharózt, 55 g/1 glükózt és 55 g/1 fruktózt tartalmaz.

BSA törzsoldat:

Liofílizált borjúszérum albumin V. frakciójából (Merck) törzsoldatot készítünk, amely 40 mg BSA-t tartalmaz 1 ml kétszer desztillált felhasználásig fagyasztva tároljuk.

nPG oldat:

mg n-propil-gallátot oldunk 2 ml etanolban. 8 ml kétszer desztillált vizet adunk hozzá, és az oldatot szűréssel sterilizáljuk. 1 tömeg% frissen előállított nPG oldatot adunk a mosóoldathoz (WS-nPG), és 0,6 mol/1 szacharóz oldathoz (0,6 Su + nPG).

Ozmotikus oldat:

100 ml oldat összetétele 4,04 g KNO₃, 2,72 g KH₂PO₄,0,94 g K₂HPO₄, 7,2 g fruktóz, 8,0 g glükóz és 0,68 g L-prolin. Az oldatot szűréssel sterilizáljuk.

Claims

SZABADALMI IGÉNYPONTOK

1. Eljárás auxin autotróf Zea mays (L.) genotípus előállítására, amelyből reprodukálhatóan és stabilan normál termőképes növénnyé vagy növényrészekké regenerálható protoplaszt nyerhető, azzal jellemezve, hogy

a) regenerálható portokból és/vagy szomatikus szövetből auxin autotróf sejttenyészetet állítunk elő auxin adagolása nélkül fejlődőképes, viszonylag nyálkamentes, szemcsés és omlós sejtek vizuális szelektálásával és más sejtektől történő elválasztásával és a szelektált sejtek fenntartóközegen történő tenyésztésével, és

b) a tenyészetből normál termőképes növényt vagy növényrészeket regenerálunk.
2. Az 1. igénypont szerinti eljárás DSM 6009 genotípus előállítására, azzal jellemezve, hogy DSM 6009 genotípusú sejteket szelektálunk.
3. Az 1. igénypont szerinti eljárás kallusz sejttenyészet előállítására, azzal jellemezve, hogy az (a) lépésben kallusz sejttenyészetet állítunk elő.
4. A 3. igénypont szerinti eljárás DSM 6009 genotípus előállítására, azzal jellemezve, hogy DSM 6009 genotípusú kallusz sejteket szelektálunk.
5. Az 1. igénypont szerinti eljárás embriogén sejttenyészet előállítására, azzal jellemezve, hogy az (a) lépésben, előnyösen többszörös keresztezés után, embriogén sejttenyészetet állítunk elő.
6. Az 5. igénypont szerinti eljárás DSM 6009 genotípus előállítására, azzal jellemezve, hogy DSM 6009 genotípusú embriogén sejteket szelektálunk.
7. Eljárás az 1. vagy 2. igénypont szerint előállított Zea mays (L.) genotípus protoplasztjának, valamint a protoplasztból regenerált sejtek előállítására, amely sejtek termőképes növénnyé regenerálhatok, azzal jellemezve, hogy az 1. igénypont (a) lépése szerint előállított sejttenyészetet protoplaszttá alakítjuk, és kívánt esetben a protoplasztból sejteket regenerálunk.
8. Eljárás auxin autotróf Zea mays (L.) genotípus előállítására, amelyből reprodukálhatóan és stabilan normál termőképes növénnyé vagy növényrészekké regenerálható protoplaszt nyerhető, azzal jellemezve, hogy

a) DSM 6009 sejtvonalból auxin autotróf sejttenyészetet állítunk elő auxin adagolása nélkül fejlődőképes, viszonylag nyálkamentes, szemcsés és omlós sejtek vizuális szelektálásával és más sejtekből történő elválasztásával és a szelektált sejtek fenntartóközegen történő tenyésztésével, és

b) a tenyészetből normál termőképes növényt vagy növényrészeket regenerálunk.
9. A 8. igénypont szerinti eljárás kallusz sejttenyészet előállítására, azzal jellemezve, hogy az (a) lépésben kallusz sejttenyészetet állítunk elő.
10. A 8. igénypont szerinti eljárás embriogén sejttenyészet előállítására, azzal jellemezve, hogy az (a) lépésben, előnyösen többszörös keresztezés után, embriogén sejttenyészetet állítunk elő.
11. Eljárás a 8. igénypont szerint előállított Zea mays (L.) genotípus protoplasztjának, valamint a protoplasztból regenerált sejtek előállítására, amely sejtek termőképes növénnyé regenerálhatok, azzal jellemezve, hogy a 8. igénypont (a) lépése szerint előállított sejttenyészetet protoplaszttá alakítjuk, és kívánt esetben a protoplasztból sejteket regenerálunk.