PT97849A - Metodo para a preparacao de cristais do interferao alfa-2 - Google Patents

Description

FUNDAMENTO DO INVENTO

Os intsrferSes alta humanos slo uma família de proteínas compreendendo pelo senos 24 subespécies, Zoon K.C», Interferon 9, 1-:12 (1987), Gresser L ed« Academic Press, New

York, Eles foram originalmente descritos como agentes capazes de induzir um estado antiviral em células mas são conhecidos como linfoquinas pleiotrópicas que afectam muitas funções do sistema imune, Opdenakksr, et al,, Experisntia 45, 513-520 Π989). Para além das suas aetivitiades biológicas in vitro os interferões alfa humanos são normalmente usados para várias indicações importantes, e.g» leucémia das células cabelosas, Sarcoma de Kaposi, verrugas venéreas s estio a ser investigados por outros investigadores Intron A (interferon alpha-2b) Clinicai status____( 1989)

Proceedirtgs fro/n a satellite symposium at the 5"“ Europsan Conference on Clinicai Oncology, London, U«K» September 1989= A necessidade de formas altamente purificadas s cristalinas de intsrferão alfa, sspecialmente o recombinante tipo alfa-2b é muito importante para a elucidação da estrutura assim como para formulação de várias fornias de dosagem»

Foram publicadas duas formas cristalinas de interferia alfa-2 humano» Hiller et al», Science 215, Ó89-&90 (1982)5 Kung et al»5 Patente U = S = N2 4,672,1ΘΘ;; Weissmann, The Cloning of interferon and other Slistakes, Ems Interferon 1981, Ion Bresser, ed», Academic Press, New York, 1 €41-134 n Weissmann, Phil»___Trans-

Rs. Soo··... Lpnd, , 8298, 7-28 <19S2)§ e Nsqabhusban, st al., Ems

IntiríSESOi_...Research 1______Clinicai Application ...... and___Requlatory

Consideration„ Zoon et al», Elsevier, New York 79-88 (1982),

Estas publicações descrevem métodos para a cristalização de interferão alfa—2 a partir ds polietilsnoglicol a temperatura baixa ou a partir de uo?a solução de tampão de fosfatas ajustando o pH ou a temperatura» Estes métodos normalmente proporcionam

cristais tipo agulha que não podem ssr bsín caracterisadas par técnicas de difracção de raios X * 0 artigo de Miller et al„ também menciona interferio alfa-2 cristalino na “forma prismática” .

Em geralos métodos para a cristalização da proteínas tais como interferSo são imprevisíveis» For exemplos Kung et al., Patente U.S. NS 4,072,108 (1987) estabelece especificaments na coluna 1, linhas 52-64; "Foram desenvolvidas numerosas técnicas para a cristalização de proteínas, no entanto nSo foi descaberto um processo generalizado e muitas proteínas permanecem por cristalizar Assim, a cristalização de proteínas é uma arte imprevisível que utiliza processos de tentativa e erro entre muitas metodologias alternativas possíveis„

Uma das abordagens ma is usadas envolve abordagens qus envolvem a adição à solução de proteína de uma agente de cristalização, o qual é normaImante um sal, por exemplo sulfato de amónio ou citrato de amónio ou um solvente orgânico, como seja etanol ou 2-etil-2,4-pentanediol» No entanto, tais processos Qgfl_BCBescsisnam. ,um_jme iq......acisquado, Bã£^-^.Jin^íáSS^-5^ÍlitgrtgrSes humanos cristalinos da leucócitos. (Adicionado α sublinhado)

SUMARIO DO IMVEMTQ

Surpreendentemente encontrámos que interferão alfa-2 cristalino de alta. qualidade pode ser produzido eficazmente, mesmo à temperatura ambiente, por um método que se caractsriza pelo equilíbrio de uma solução de interferão alfa-2 contra uma solução de sal sulfato que fará com que a solução de interferão de interferão alfa-2 fique mais concentrada e forme cristais de interferão alfa-2* De prsfertneiâg o equilíbrio è efectuada por meio de ultrafiItração ou diálise ou usando gotas, e*g.* por goticulas pendentes ou em sanduíche* A solução da interferão alfa-2 contem de preferencia um sal sulfato e esta solução é preferancialmente equilibrada contra uma solução concentrada de sal sulfato* 0 sal sulfato é de preferencia seleccionado a partir de um sal de amónio, cálcio, cádmio, potássio, iítio, magnésio ou sódio* mais preferencialmen--· te é sulfato de amónio* 0 sal sulfato está prsferencialmente presente na solução de interferão alfa-2 cristalino na altura em que os critais começam a formar-se numa concentração entre cerca de 12% s cerca de 3Θ% de saturação, mais preferencialmente numa concentração entre cerca de 15% s cerca de 25% de sulfato de amónio saturado* Como se refere abaixo* a concentração de sal sulfato no inicio do processo de equilíbrio será inferior. i„e„ entre cerca de 2% e cerca de 18% saturado*

Preferencialrnante, o intsrferlo-slía-2 é interferão alfa 2b e mais prsferencialmente é interferão alfa~2b humano reeomhxnante e cristalino* Numa realização, o material cristalino é interferão alfa~2h tendo a sequfncia de aminoácidos apresentada abaixoκ 1 Cys Asp Leu Pro Gin Thr His Ser Leu Gly Ser Arg 13 Arg Thr Leu Met Leu Leu Ala Gin Met Arg Arg lie 25 Ser Leu Phe Ser Cys Leu Lys Asp Arg His Asp Phe 37 Gly Phe Pro Gin Glu Glu Phe Gly Asn Gin Phe Gin 49 Lys Ala Glu Thr lie Pro Vai Leu His Glu Met lie 61 Gin. Gin lie Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser 73 Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr Leu Leu Asp Lys Phe 85 Tyr Thr Glu Leu Tyr Gin Gin Leu Asn Asp Leu Glu 97 Ala Cys Vai lie Gin Gly Vai Gly Vai Thr Glu Thr 109 Pro Leu Met Lys Glu Asp Ser lie Leu Ala Vai Arg 121 Lys Tyr Phe Gin Arg He Thr Leu Tyr Leu Lys Glu 133 Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Vai Vai Arg 145 Ala Glu lie Met Arg Ser Phe Ser Leu Ser Thr Asn 157 Leu Gin Glu Ser Leu Arg Ser Lys Glu Pode também ser empregue inte rferão al f a—2 a= h sequtn- cia d> s e.minoâc - ^ Hqc pricnár ia do intsr f erS o alfa--2 a difere da sequência anterior do inte r farão a1ta -2b pela su bs ti tu. i ç ãc* d e ί,πίΓι^ QOI*" *1 puSlÇãU dfcí Í* fc?V»'ldUC{ *— - Unja solução dS Sâl sul f ât.O ds .1Π t«Γf í--'f aSifs *· prfciu··· renciaImante inclui uma tampão tendo um pH de ò5o a 8,5, mais preferencialments entre 7,3 e 8,0, coma seja uma solução tampão fosfato de sc-clic?» n int.arterâo u u. * cristalino preparado pelos métodos acima podem ser usados mais interferSo aría-2 como cristãs, cristal ino,= semente para preparação de

DESCRICgO DETALHADA DO INVENTO

Come se notou atrás, o método do invento envolve q equilíbrio de uma solução de sal sulfato da interferão alfa-2 contra uma solução de sal sulfato que fará com que a solução de interferão alfa-2 cristalina fique mais concentrada e forme cristais de interferão alfa-2,, Pode ser empregue qualquer interferia alfa-2 adequado, e»g«? interferão alfa~2ae interferão alfa—2b, mais preferencialmente interferão recombinante humano alfa~2a <r-h-interferlo alfa-2a) ou interferão alfa~2b ír-h-in-tsrferSo alfa—2b). As preparações de interferão alfa-2 que podem ser adquiridas comercialmente podem ser compradas à Hoffmann-La

R P

Rocha <Roferon“) e à Schering-Plough (Intron A), Misturas de interferSes puros incluindo interferSes alfa-2 podem ser adquiri-

— P cias è. tíurroughs—Wellcame Corporation (Wel Iferon") „ Face ao elevado grau ds homologia da ssquãncia nos interferSes alfa humanos., o método do presente invento deverá ser aplicável a cada uma das subespécies»

As subspécies de interferão alfa-2 humano podem ser obtidas através da tecnologia de DMA recombinante ou podem ssr purificadas a partir de fontes naturais (e.g. linfécitos do sangue periférico humano, linhas celulares linfoblastóides humanas),: por exemplo» como descrito em Pestka, et al,= , Ann.__Rev.

Biochem» 56, 727-777 (1987)» Um interferão alfa-2 preferido έ r-h-inierferão alfs-2b tendo a sequência de aminoácidos descrita atrás»

InterferSes alfa humanos naturais foram purificados a partir de várias fontes celulares incluindo leucócitos isolados a partir de sangue total, fihrohlastos neonatais, linhas celulares linfoblastóides e várias linhas de células leucémicas.

A primeira preparação disponível em clinica de intsr-ferio de leucócitos humanos foi desenvolvida por K» Cantei1 e colaboradores na Finlândia,, sangue csntrifugado de dadores normais foi estimulado com interferão, induzido pels adição de vírus Sendaí e centrifugado. 0 sobrenadante rsultante foi precipitado com tioacianato da potássio,, extraído com etanol, precipitado por pH e dialisado contra tampão de fosfatas salino (!<«E„ Morgsnssn5 L„ Cantei1 (1977) Pharmaeol„ Ther. 1= 369-3B1).

Os intsrferSss alfas recombinantes foram clonadas e expressos em E„ coll por vários grupos, por sKSíiplo, C» Weissmann, et al« Science 2Θ9 (198Θ) 1343-1349« A purificação de interferBes alfa-2 recombinantes foi descrita por vários grupos usando uma combinação de passos cromatográficas tais coma precipitação com sulfate de amónio, cromatografia de afinidade com corantes, permuta iónica e filtração em gels por exemplo, como descrito em Weissmann, C., Phil. R. Soc. (Lond), CÍ982) b299, 7-28)« Uma abordagem alternativa para a purificação de inter-ferSes alfa recombinantes emprega cromatografia de imunoafini— dadecom um anticorpo imobilizado ÍP.P. Trotta et al.,

Developments in_____Industrial___Microbiolv 72, Elsevier, Amsterdão (1987) 53-64). Para uma revisão de esquemas de purificação disponíveis usados para interferBes alfa recombinantes, ver T.L.

Nagabhushan e PP« Trotta, Ullmann51_Encvclopedia of__Industrial

Chemistry AÍ4, VCH, Weinhsm, Federal Republic of Sermany (1989) 372-374,= Preferencialmsnte, o interferão alfa—2b usado é purificado por um processo de purificação convencional descrito em Ullmann. ss, Encyc1 apeei ia____οχ___Industrial Chemistry A14, VCH,

Weinhsim, Federal Republic of Sermany (Í9S9) 372-374 seguido de cromatografia de alta resolução em fase reversa. Métodos u.l trafiltração, adequados de equilíbrio incluem diálise, diafiltraçao ou usando gotas, e„g„. s „ g „

gatículas pendentes ou em sanduíche» 0 equilíbrio pode ser efsctuado contra uma segunda solução de sal sulfato que é mais concentrada do que a solução de sal sulfato do interferão alfa-2» Um método particularmente preferido consiste em equilibrar uma solução de r-h-interferSo alfa~2 contra uma solução de sal sulfato usando uma solução de tampão fosfato» Preferencialmente, o equilíbrio ocorre i en tamen te 3 e = g» durante 2 a dias» A cristalização em larga escala pode ser conseguida por métodos equivalentes à difusão em vapor; nomeadamente diáiiss e ultrafiltração» No produção clínica, â cristalização em larga escala pode ser usada como passo de purificação ou de concentração» Ainda? em tal operação sulfato de amónio poderá ser substituído por outros sais de sulfata vulgares» A concentração final do interferão alfa-2 na solução de sal sulfato no ponto de cristalização, i„e» no ponto da formação dos primeiros cristais, pode variar entre cerca de í€> e cerca de 80 mq/ffll = liais preferencialmenta a concentração de interferão alfa-2 vai de cerca de 3© até cerca, ds 5© mg/ml „ Prefsrsncia 1 men-te>. α interferão alfa-2 na concentração de partida é cerca de 2ô mg/ml» A concentração do sal sulfato na solução de interferão alfa-2 na fase inicial antes de começarem os processos de cristalização pode variar entre cerca de 2% e cerca de 18% de saturação.: i.»e „, o sal sulfato presente entre 2 e 18% da concentração que estaria presente se a solução estivesse 1©0% saturada» Maia pretersncia!mente, a concentração do sal sulfato vai de cerca de 7% a cerca de 15% saturado na soluçscs de interferão alfa-2» Na contra—solução no inicia do processo de cristalizaç:So5 a concentração de sal sulfato vai de 12% ate cerca de 3©% de saturação..

mais preferencialmente, entrs cerca de Í5% e cerca ds 25% da saturação. 0 pH da solução ds interferão alfa-2 a a contra-solução ds sal sulfato é preferencialmerite controlado na gama entre cerca ds 6=5 s csrca ds 8?5? mais preferencialments sntrs cerca ds 7,3 s csrca ds S,®. Para este fim pode ser usado qualquer tampão adequado. Por sxssnplo podem ssr empregues fosfato ds sódio, hidrocloreto ds Trisílhidroximetil 3-aminometano ou tampões ds N-L2-hiriroxietilIpiperazina-N5-Cácido 2-etanossulfónico].

Prefsrsnciaimsnts a cristalização é realizada em condições controladas ds temperatura, A temperatura é ds preferencia nuiiia gama sntrs csrca ds :15*C e cerca ds 37 *C, mais preferencialmente entre cerca ds 18*C e csrca ds 25*0=

Uma vsz que o presente invento surpreendentemente produz interferão alfa-2 á temperatura ambiente, ele oferece uma vantagem distinta relativamente aos cristais obtidos a partir ds polietilenog1icol a 4°C, 0 armazenamento s formulação ds cristais ds interferão alfa-2 humano à temperatura ambiente, A dissoluçãos dos cristais pode ser conseguida por diálise contra tampão fosfato de sódio 2Θ mM, pH 7,5 a qus se adicionou cloreto ds sódio Θ,ΙδΜ, Ainda, uma vez que a solução ds sal sulfato é mais fácil ds remover, s„g„ por diálise, do qus o polietilenoglicol, podem ser obtidos cristais de interferão alfa-2 mais puros quando da dissolução com o método do invento, 0 interferão alfa-2 cristalino preparado pslo método do invento formará as bases ds várias formulações farmacêuticas, Por exemplo, o interferão cristalino pode ssr empregue numa formulação ds libertação controlada, e,o, uma preparação tipo depósito capaz ds libertar o equivalente a uma dose diária ds &V1 - Ι,Θ

μρ/Κα de peso de? carpo, Uma preparação tipo depósito empregando cristais preparadas pelo método dos inventos deverá apresentar uma velocidade da dissolução consideravelmente mais baixa do que uma formulação contendo cristais produzidos a 4*C» Em particular,, os cristais formados à temperatura ambiente (22*0 deverão ser menos sensíveis á temperatura do qus cristais que requerem uma temperatura mais baixa de formação.

Em adição, podem ser formados complexos de metais e interferão alía-2 humano qus são suhsequentemente cristalizados pelo método do invento. Os cristais de tal complexo poderão igualmente ssr usados numa formulação de libertação lenta. Exemplos de complexos iSo metéiico-proteína usados na formulação de libertação controlada foram descritos em trabalhos anteriores, Um complexo de zinca e insulina preparado pela adição de cloreto de zinco a uma solução estéril tíe insulina foi descrito na Patente U«S. 2,882,,203 atribuída a Novo Terapeutisk Laboratorium A/8» A suspensão cristalina de tal complexo foi 4 a 6 vazes mais activo do que a preparação não cristalina (Rsolnqton Pharmaesu-tical Sciences 17, Bennaro, A,R=, eri„, Hack Publishing Co,? Easton» Penn= (1985) 975-976), 0 complexo de zinco-insulina pode ser adquirido comercialmente em diferentes formas em vários fabricantes, como por exemplo» Lente Insulin SSquibb), Ultra--Lente LIetin (Lilly) e UI traiente Insulin/UItratard (Squibb™ -Novo), Rfôj|Linfltgii_P harjna.CBU tical Sr iences 17, Sennaro, A.R. ed., Mack Publishing Co., Eastor», Penn, (1983) 975™97é, Isophane Insulin é um produto cristalino da insulina ízinco-insulina) e uma proteína alcalina (salmiridina), 0 produto é fabricado sob o nome de várias marcas registadas? WPH-Iletin (Lilly), Insulated (Lso) e Νονοίin N (Scjuibb—Novo) (PLarmaceutical Manufacturinq Encyclopedia 1, Sittig» ii„ ed,, (1988) 820-822). Um complexo de zinco-interferão aIfa-2 pode ser formado pelos métodos descritos na Patente U.S. 2,882,2®3. 0 complexo interfsrão—alfa-2-zinco

pode ser cristalizado usando os métodos desta invento π A suspensão cristalina resultante (compreendendo cristais de tamanho uniforme) formulados com aditivos adequados íe.g» metiIparabeno, cloreto de sódio e acetato de sódio) podem ser usados para injseção subcutlnsa, 0 intsrferlo slfa-2 cristalino preparado pelo método do invento pode ser usado basicamente da mesma forma que os materiais anteriores de interfsrão slfa-2 foram usados nas preparações farmse§uticas5 e«g« preparações tipo depósito do interfsrão alfa-Ξ, que podem ser projectados para administrar uma dose diária de cerca de Θ,ΐμς/Κο a cerca de i3@ pg/Kg de interferio slfa-2 cristalino» Tais preparações contlm uma quantidade fisio-logicamente eficaz do interfsrão alfa-2 cristalino em associação com um veículo convencional farsaceuticamsnts aceitável» 0 invento aqui descrito é esemplificado pelo exemplo que se segue? o qual não deverá ser pensado como limitante do seu âmbito» Métodos ai terna ti. vos dentro do inventa da inventa serão óbvios para os familiarizados com o campo» 0 intsrferlo alfa-2 empregue foi interferão alfa-2 rscomhinante humano eKpresso em E» coli como descrito em Weissmann» st al. , Science» 2®9? 1343 (198®). As células foram cultivadas, colhidas e s;-;traídas como anteriormente descrito emn Lezbowitzr, P» et al.? (1982) Patente US 4r,315,852» Os e>;tractos resultantes foram purificados através de uma combinação de passo tís purificação convencionais; SKtr-acção com etanol 5 cromatografia de afinidadenuma matriz de gel com ligando azul ? cromatografia de permuta iónic:-a e de filtração e-m gel» A preparação de interfsrão aífa—2b purificado resultante foi ainda purificada por HPLC em fase reversa usando o sistema Rainin Auto Prep ChrGmatoqraphy» 0

numa inisrfsrão alfa-2b purificado (5Θ rog) foi cromatografado coluna Rainin <4,1 κ 25® cm) Ca 30® Angstrom que tinha sido pré-squilibrada com '27% acetonitrilo, Θ,;!% ácido trif lucroacêtico <7FA>= Um gradiente linear de 27%~72% acetonitrilo, θ,ί% TFA durante 3Θ minutos a 4Θ ml/««In foi usado para eluir o interfsrSo alfa--2b da coluna, As fracçSes aluídas foram colhidas com base no perfil de absorvSncia de um detector Knauer em linha marcado para 28Θ nanómetros, A cristalização foi conseguida por difusão de vapor usando a técnica de gota pendente, assente qu em sanduíche* As experiências de difusão de vapor de gota pendente foram efectua-das em placas de cultura de tecidos de 24 cavidades (Becton Dick inson and Company, Lincoln park, Nd), As experiências de gota em sanduíche foram sfectuadas em placas de cristalização de Tívf proteínas Crystai Plate"‘ (Floi*? Laboratories, McLean, VA) e as experiências de difusaotíe vapor em gota assente foram realizadas em placas de difusão da vapor muiti-c;ãmaras MvD/24 <Cryschem, Inc-, CA).

Para as gotas pendentes, gesticulas de i® μΐ contendo 20 mg/ml de proteína em sulfato de amónio aquoso 10% saturado, fosfato da sódio 4® mil, pH 8,® forma penduradas a partir de lamelas siliconatías invertidas em placas de cultura de tecidos LinbrOn Estas gotieulas foram equilibradas contra 1 ml de sulfato de amónio 20% saturado, fosfato de sódio 4® mii, pH 8,Θ, Cristais prismáticos monocíclicos grandes (0,5 κ 0,5 κ 0,5 mm) surgiram algures entre 4—1.5 dias de incubação a 22 °C, Soluções e condições-experimentais comparáveis foram usadas para as experiências de gotieulas assentes e pendentes. Os cristais foram estáveis è. análise ds diíracção de raios X s difractados para uma resolução de ò Angstrons, Diferentes lotes ds; cristais foram sujeitos a analxse tí-s raios X e deram resultados consistentes rslativamente

à morfologia* Esta é a primeira descrição da um padrão de difrac™ çSo de raios X do interferSo alfa-~2<=

Para estudos ds raios X* os cristais foram montados sm capilares de vidro e fotografados com uma câmara a 22° usando radiação CuKa derivada de um gerador de ânodo rotativo Rigaku RU-~3M funcionando a 4Θ KV e 1ΘΘ oh» 0 conjunto de dados nativos foi colhido num dstector de área Micolst Χ-1ΘΘΑ usando a mesma fonte de radiação, ÇARAÇTgRIZftggQ 1, BI0EN3AI0

Cristais individuais foram extraídos a partir de gotas pendentes usando uma seringa, depois ressuspensos em 1#θ μΐ de solução de lavagem consistindo sm solução de sulfato de amónio 35% saturado, fosfato de sódio 4Θ mli, pH S?© a 22*C, A suspensão foi centrifugada s a soluçlo de lavagem foi removida com uma pipeta de Pasteur. Os cristais lavados foram rsdissolvidos em 1.ΘΘ μΐ de fosfato de sódio 2® mf!, pH 7P5, cloreto de sódio S,15 11 a 22°C =

A proteína foi determinada por um ensaio de Bradford modificado usando interferão alfa-2fa humano puro como padrão de referfncia* A actividade anti-viral foi determinada por um ensaio de inibição de efeito citopàtico usando fibroblastos dipióidss de prepúcio humano e. vírus da encefalomiacardite (AICC-VR--Í29 j „ Uma descrição detalhada do ensaia é proporcionada em 8» Rubinstein, P = C. Familletti e S. Pestka, 3, Virol. 37 ¢1981) 755-758» A solução redissolvids deu uma actividade especifica de 2,õ κ UI/mg. Este valor é o mesmo previsto para a preparação de interferia alfa-2b original antes da cristalicaçlo5 dentro dos limites da ensaio UI/mg)„

(tipicamente dentro da gama de í

10S a 3 u

Ci U

2. HPL.C

Uma amostra de cristais de intsrferSo rsdissolvidos foi submetida a cromatografia liquida de alta resolução analítica íBPLC) (Waters Ass„ Milfordy nft), A amostra foi aplicada numa coluna Rainin Dynamax 3ΘΘ Angstrom (456 κ 25# mm) que foi subsequentemente sluida com um gradiente linear de acetonitrila 27-72% em ácido trifluoroacético a durante um período ds 3Ô minutos,, Para controlar o aluato usou-se um detector de comprimento de onda variável Silson marcado para 28# nm com uma sensibilidade ds #5#2 unidades de absorvãncia, Os tempos de retenção e perfis cromatográficos da solução de cristais redissolvidos s da preparação original de interferSo alfa-2b antes da cristalização eram idfnticos.

Foi feita tuna comparação snt.ro o interferão alfa~2fc antes a após a cristalização por electroforese unidimensional em gel de 157, poliacrilsmida — dodecilsulfato de sódio (SDS-PABE) como descrito em Laemmli, LLK. (197Θ) hlature 227,, &&Φ* Não houve variação na. mobilidade relativa quando as amostras eram comparadas em faixas paralelas no mesmo gel.

De 1,, 2 e 3 atrás é claro que não há razão para supor que quaisquer alterações químicas ou qualquer desnaturação da proteína tem lugar durante a cristalização ou. reconstituição.

Se bem que o presente invento tenha sido descrito conjunt assente com realizações específicas descritas atrás? muitas alternativas5 modificações e variações serão aparentes para os Tamz.1i-ariçados com a matéria. Todas essas alternativas.

Claims (1)

1. RE Σ viMDICftCSES s lã. - Método para a preparação de interferlo alfa-2 cristalino, caracterizado por compreender o equilíbrio de uma solução de sal sulfato contendo interferlo alfa~2 contra uma solução de sal sulfato que fará com que a solução de interferlo alfa-2 se torne mais concentrada e forme cristais de interferlo alfa-2. 2ã. - Método de acordo com a reivindicação 1, caracte-rizado por o equilíbrio ser sfectuado por maios de ultrafiltração ou diálise ou por difusão de vapor. 3 HL - Método de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado por o equilíbrio ser efeciuado por difusão de vapor usando gesticulas pendentes ou sanduíche. 4ã. - Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1—3, caracterizado por uma solução de um sal sulfato de interferlo alfa-2 ser equilibrada contra uma solução de sal sulfato mais concentrada. 5HL - Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-4, caracterizado por α interferlo alfa-2 ser interferlo alfa-2b recombinante humano. óã. - Método de acordo com a reivindicação 5, caracterizado por o sal de sulfato ser seleccionado a partir de um sal de amónio3 cálcio, cádmio., potássio, litio, magnésio ou sódio. 7â. - Método de acordo com a reivindicação 5, caracterizado por o sal de sulfato ser sulfato de amónio.

   8â» - Método de acordo coai a reivindicação 5, caracte··· riçado por a solução de sal sulfato do interferão a1fa-2 incluir um tampão <?«. ” Método de acordo com a reivindicação 8» ca.ra.cte- rizado por a. solução de interferão aifa-2 ser tamponada para. um pH de 7,3 a 8,0. 10â. ~ Método de acordo com a reivindicação 9, caracte-riçado por o tampão ser fosfato, ilã» - Método ae acordo com a reivindicação 19, carac-tericado por o sal sulfato estar presente na solução ds inisrterão alfa-·2 numa concentração entre cerca de 12% e cerca de 39% saturado no ponto de formação de cristais do interferão alfa-2„ 12§» - Método de acordo com a reivindicação 19, carácter içado por o sal sulfato estar presente na solução de ir?ter-ferão alfa-·2 numa concentração entre cerca de 15% ε cerca ds 25% saturado no ponto de formação de cristais do interferão aIf-ã-2, 13S* - Método para cristalização do interferão alfa-2 humano$ caracterisado por se utilizarem cristais obtidos por um processo de acordo com a reivindicação 1 como cristais semente,, 14â,· - Processo para a preparação de uma formulação de depósito, caractericado por se incluir na referida formulação cristais de interferão alfa-2, em combinação com um veiculo de depósito farmaceuticamente aceitável„ Í5ã« - Processo de acordo com a reivindicação 14, caractericado por os cristais ds interferão alfa—2 estarem presentes na forma de um complexo com metais ou protamina»

   lóâ = - Processo de-? acordo com < caracterizado por o complexo com sor um complexc rei v ma ícacé.a com zinco, IF, Lisboa de ,J a π l*i o de 1 v V i

   J. PEREIRA DA CRUZ Agente Oficial da Propriedade Industrial RUA VICTOR CORDON, 10-A 3.® 1200 USBOA