HUT63185A - Process for producing crystalline alpha-2-interferon - Google Patents

Description

A hűmán alfa-interferonok legalább 24 alfajból álló fehérjecsaládot alkotnak ^Zoon K.C., Interferon, 9_, 1-12 (1987), Gresser I., ed. Academic Press, New YorkJ. Ezeket eredetileg sejtek vírusellenes állapotát előidézni képes ágensként írták le, de az immunrendszer számos funkcióját .

befolyásoló pleiotrópiás limfokinekként ismertek enakker et al., Experimentia, 45 , 513-520 (1989)J. In vitro biológiai aktivitásuktól eltekintve, a humán alfa-interferonokat használják néhány fontos indikációnál, így a hairy cell leukémia, a Kaposi szarkóma, a verruca acuminata (veneral warts) esetében, és vizsgálják használatukat néhány más esetben is Qlntron A (interferon alfa-2b) Clinical status (1989), Proceedings írom a Satellite Symposium at the 5^ European Conference on Clinical Oncology, London, U.K. September 1989^.

Rendkívül nagy az igény az alfa-interferon nagyon tiszta, kristályos formái, különösen a rekonbináns típusú alfa-2b iránt szerkezetfelderítési és különböző adagolási formákban előállított készítmények céljaira.

A kristályos humán alfa-2b-interferon két formáját írták le [Miller et al., Science, 215, 689-690 (1982); Kung et al., U.S.P. 4,672,108 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás; Weissmann, T.: Cloning of Interferons and Other . ,,Mistakes , Interferon 1981, Ion Gresser, ed. Academic Press, New York. 101-134; Weissmann, Phil.Trans.R.Soc.Lond., B 299 , 7-2-8 (1982); Nagabhus’oan et al.,: Characterization of Gene' tically Engineered Alpha-2 Interferon, Interferon: Research Clinical Application and Regulatory Consideration:, Zoon et al., Elsevier, New York 79-88 . Ezekben a közleményekben

módszereket írnak le alfa-2-interferonnak poli(etilén-glikol)ból alacsony hőmérsékleten vagy foszfátpufférből a pH és a hőmérséklet beállításával történő kristályosítására. Ezek a módszerek általában tűszerű kristályokat eredményeznek, amelyeket nem lehet jól jellemezni röntgendiffrakciós technikákkal. Miller éa munkatársainak közleménye prizmás formájú kristályos alfa-2-interferont is említ.

Fehérjék, így az interferon kristályosításának módszereit általában kiszámíthatatlanoknak találták. így például Kung és munkatársai az U.S.P. 4,672,108 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásukban (j.987) speciálisan a következőket állítják az 1. oszlop 52-64. soraiban:

Fehérjék kristályosítására számos technikát dolgoztak ki, de nem találtak általánosítható eljárást, és sok fehérjét egyáltalán nem sikerül kristályosítani. így a fehérjék kristályosítása számos lehetséges alternatív módszer közül próbálgató eljárásokat alkalmazó kiszámíthatatlan tudomány.

Az egyik legelterjedtebben használt megközelítés abból áll, hogy a fehérjeoldathoz egy' kristályosító ágenst adnak, ami általában valamilyen só, így ammónium-szulfát vagy ammónium-citrát vagy egy szerves oldószer, mint például etanol vagy 2-etil-2,4-pentán-diol. Az ilyen módszerek azonban nem g-szolgáltatnak megfelelő eszközt kristályos humán leukocita interferon előállításához.

Kísérleteink eredményeként most meglepő módon azt találtuk, hogy kitűnő minőségű kristályos alfa-2-interferőn még szobahőmérsékleten is hatásosan előállítható egy olyan módszer rel, amely abból áll, hogy alfa-2-interferőn oldatát valamilyen szulfátsó oldatával szemben egyensúlyba hozzuk, ami az alfa-2-interferőn oldatának betöményedését és alfa-2-interferon kristályok keletkezését okozza. Az egyensúlyba hozást előnyösen ultraszűréssel vagy dialízissel végezzük vagy cseppek alkalmazásával, például függő vagy szendvicseit cseppecskék (hanging or sandwiched droplets) segítségével.

Az alfa-2-interferőn oldata egy szulfátsót tartalmaz, és ezt az oldatot előnyösen egy töményebb szulfátsó oldattal szemben hozzuk egyensúlyba. A szulfátsó előnyösen az ammóniumkalcium-, kadmium-, kálium-, lítium-, magnézium- vagy nátriumsó valamelyike, legelőnyösebben az ammóniumsó. A szulfátsó a kristályos alfa-2-interferőn oldatban a kristályok keletkezésének kezdetén előnyösen körülbelül 12 % és körülbelül 30 % közötti telítettségű koncentrációban, még előnyösebben körülbelül 15 % és körülbelül 25 % közötti telítettségű koncentrációban van jelen. Miként alább látható, a szulfátsó koncentrációja az egyensúlyba hozási folyamat kezdetén alacsonyabb, éspedig körülbelül 2 % és körülbelül 18 % közötti telítettségű

Az alfa-2-interferon előnyösen alfa-2b-interferon, még előnyösebben humán rekombináns kristályos a 1fa-2b-interferőn . A találmány egyik megvalósításánál a kristályos anyag az alábbi aminosavszekvenciát tartalmazó alfa-2b-interferőn:

1

Cys

Asp

Leu

Pro

Gin

Thr

His

Ser

Leu

Gly

Ser

Arg

13

Arg

Thr

Leu

Met

Leu

Leu

Alá

Gin

Met

Arg

Arg

lle

25

Ser

Leu

Phe

Ser

Cys

Leu

Lys

Asp

Arg

His

Asp

Phe

37

Gly

Phe

Pro

Gin

Glu

Glu

Phe

Gly

Asn

G’ln ’

Phe

Gin

49

Lys

Alá

Glu

Thr

lle

Pro

Val

Leu

His

Glu

Met

lle

61

Gin

Gin

lle'

Phe

Asn

Leu

Phe

Ser

Thr

Lys

Asp

Ser

73

Ser

Alá

Alá

Trp

Asp

Glu

Thr

Leu

Leu

Asp

Lys

Phe

85

Tyr

Thr

Glu

Leu

Tyr

Gin

Gin

Leu

Asn

Asp

Leu

Glu

97

Alá

Cys

Val

lle

Gin

Gly

Val

Gly

Val

Thr

Glu

Thr

109

Pro

Leu

-Met

Lys

Glu

Asp

Ser

lle '

Leu

Alá

Val

Arg

121

Lys

Tyr

Phe

Gin

Arg

lle

Thr

Leu

Tyr

Leu

Lys

Glu

133

Lys

Lys

Tyr

Ser

Pro

Cys

Alá

Trp

Glu

Val

Val

Arg

145

Alá

Glu

lle

Met

Arg

Ser

Phe

Ser

Leu

Ser

Thr

Asn

157

Leu

Gin

Glu

Ser

Leu

Arg

Ser

Lys

Glu

Alfa-2a-interferont is használhatunk. Az alfa -2a-Lnterf erőn primer aminosavszekvenciája az alfa-2b-interferőn fenti szekvenciájától abban különbözik, hogy a 23-as számú aminosavként arginin helyett lizint tartalmaz.

Az alfa-2-interferőn szulfátsójának oldata előnyösen tartalmaz egy 6,5 és 8,5 közötti, előnyösebben 7,3 és 8,0 közötti pH-jú puffért, így nátrium-foszfát pufferoldatot.

A fenti módszerekkel készült kristályos alfa-2-interferon további kristályos alfa-2-interferőn mennyiségek előállífásánál oltókristályként használható.

Miként fent láthattuk, a találmány szerinti módszer abból áll, hogy egy alfa-2-interferon szulfátsó oldatot valamilyen szulfátsó oldattal szemben egyensúlyba hozunk, ami a kristályos alfa-2-interferőn oldatának betöményedését és alfa-2-interferőn kristályok keletkezését ókozza. Bármely megfelelő alfa-2-interferon_; így alfa-2a-interferőn (r-h alfa-2a-interferőn) vagy alfa—2b—interferőn (r-h alfa-2b-interferon) használható. A kereskedelemben elérhető alfa-2-interferon készítmények beszerezhetők a Hoffmann-La Roche cégtől (Roferon^O és a Schering-Plough cégtől (IntrorPÁ). Tiszta interferonok elegyei, amelyek tartalmaznak alfa-2-interferonokat is, beszerezhetők a Burroughs-Wellcome Corporation cégtől

A humán alfa-interferonok egymás közötti nagyfokú szekvenciaazonossága folytán a találmány szerinti módszer minden egyes alfajra alkalmazható kell,hogy legyen.

A humán alfa-2-interferőn alfajok rekombináns DNS technológiával nyerhetők, vagy tisztíthatok természetes forrásokból (így humán perifériás vér 1imfocitákból, humán limfoblasztoid sejtvonalakból), például a Pestka és munkatársai által leírtak szerint [ληη.Rev.Biochem., 56 , 727^777 (1937)]. Előnyös alfa-2-interferőn az r-h alfa-2b-interferőn, amelynek aminosavszekvenciáját láttuk a fentiekben, ·

Természetes humán alfa-interferonokat különböző sejtforrásokból tisztítottak, köztük a teljes vérből izolált leu'kocitákból, újszülöttek fibroblasztjaiből, limfoblasztoid és különböző leukémiás sejtvonalakból. Az első klinikailag rendelkezésre álló humán leukocita interferon készítményt Finnországban K. Cantell és munkatársai fejlesztették ki úgy,

hogy normál donoroktól származó centrifugált vért Sendai vírus beadásával indukált interferonnal primeroltak, és centrifugálták. Az így kapott szupernatánst kálium-tiocianáttal lecsapták, etanollal extraháltak, a pH megváltoztatásával kicsapták, és foszfátpufferes konyhasóoldattal szemben dializálták [κ .E . Morgensen , L. Cantell, Pharmacol.Ther., 1^, 369-381 (1977 )] .

Rekombináns alfa-interferonokat klónozott és E-Coliban hagyott kifejeződni néhány kutatócsoport, például C. Weissmann és munkatársai [Science, 209, 1343-1349 (1980)j .

A rekombináns alfa-2-interferonok tisztítását leírta néhány kutatócsoport, kromatográfiás lépések kombinációját használva, így ammónium-szulfátos kicsapás után színezék affinitás kromatográfiát (dye affinity chromatography), ioncserét és gélszűrést használva, például a Weissmann,C. által leírt módon [Phil.R.Soc. (Lond.), b299 , 7-28 (1982) J . Rekombináns alfa-interferonok tisztításához egy alternatív megközelítés immuno-affinitás kromatográfiát használ immobilizált antitesttel Qp. P. Trotta és munkatársai ': Developments in Industrial Microbiology 7 2 , 53-64 ( 1987), Elsevier, Amsterdam]. Rekombináns alfa-interferonok tisztítására szolgáló rendelkezésre álló rendszerek áttekintését lásd T.L. Nagabushan és P.P.Trotta összeállításában ^Ullmann’s Encyclopedia of Industrial Chemistry, A14, VCH, Weinheim, Federal Republic of Germany 372-374 (1989)J . A felhasznált alfa-2b-interferont előnyösen az Ullmann’s Encyclopedia of Industrial Chemistry A14, VCH, Weinheim, Federal Republic of Germany 372-374 (1989)4 * ··«» ·· · a « « · * ·· · ♦*· ·» ben leírt szokásos tisztítási eljárással tisztították, majd fordított fázisú nagynyomású folyadékkromatográfiás (RP-HPLC) tisztítást végeztek vele.

Az egyensúlyba hozás alkalmas módszerei közé tartozik a dialízis, ultraszűrés, például a diaszűrés vagy cseppek, így függő vagy -szendvicseit cseppecskék (hanging or sendwiched droplets) ekvilibrálása. Az egyensúlyba hozást el lehet végezni egy második szulfátsó oldattal szemben, amely töményebb, mint az alfa-2-interferőn szulfátsó oldat. Egy különösen előnyös módszer szerint egy r-h alfa-2-interferőn oldatot foszfátpuífer oldat használatával szulfátsóval szemben hozunk egyensúlyba. Előnyös, ha az ekvilibrálás lassan történik, például 2-30 napig tart.

A kristályosítás nagy méretekben a gőzdiffúzióval ekvivalens módszerekkel, azaz dialízissel és ultraszűréssel végezhető el. A klinikai célokat szolgáló gyártásnál a nagy méretekben végzett kristályosítás tisztító vagy koncentráló lépésként használható. Továbbá az ilyen műveleteknél az ammónium-szulfátot más közönséges szulfátsók helyettesíthetik.

Az alfa-2-interferőn végkoncentrációja a szulfátsó oldatban kristályosodáskor, vagyis az első kristályok képződésekor körülbelül 10 és 80 mg/ml közötti tartományban lehet. Az alfa-2-interferőn koncentrációja előnyösebben körülbelül '30 és körülbelül 50 mg/ml között van. Az alfa-2-interferőn kiindulási koncentrációja körülbelül 20 mg/ml.

A szulfátsd koncentrációja az alfa-2-interferőn oldatban induláskor, a kristályosodás megkezdése előtt körülbelül % és körülbelül 18 % közötti telítettségi tartományban lehet, azaz a jelen lévő szulfátsó 2-18 %-át alkotja annak a koncentrációnak, amely akkor volna jelen, ha az oldat 100 %ig telített volna. Előnyösebben, a szulfátsó körülbelül 7 % és 15 % közötti telítettségi tartományban van jelen az alf a-2-interferőn oldatban. A kristályosítási eljárás megkezdésekor az ellenoldatban a szulfátsó körülbelül 12 % és körülbelül 30 % közötti telítettségű, előnyösebben körülbelül 15 % és körülbelül 25 % közötti telítettségű.

Az alfa-2-interferőn oldat és a szulfát ellenoldat pH-ját előnyösen körülbelül 6,5 és 8,5 közötti, előnyösebben körülbelül 7,3 és 8,0 közötti tartományban tartjuk. Erre a célra bármely megfelelő put'fer felhasználható, így a nátrium-foszfát, trisz(hidroxi-metil)-amino-metán-hidroklorid, vagy

4-(2-hidroxi-etil)-l-piperazin-etán-szulfonsav (HEPES) puffer használható.

A kristályosítást előnyösen szabályozott hőmérsékleti viszonyok között végezzük. A hőmérséklet előnyösen a körülbelül 15 °C és 37 °C közötti, előnyösebben a körülbelül 18 °C és körülbelül 25 °C közötti tartományban van.

Minthogy jelen találmány meglepetésszerűen szobahőmérsékleten szolgáltat kristályos alfa-2-interferont, ez határo'zött előnyöket jelent a poli(etilén-glikol)-ból 4 °C-on kapott kristályokkal szemben. A humán alfa-2-interferőn kristályok szobahőmérsékleten való tárolása és azokból készítmények előállítása így most már lehetséges:. A kristályok oldását elvégezhetjük 7,5 pH-jú 20 mM nátrium-foszfát pufferrel szem« ♦ ··· ·· « · * * · *· · »·« · · • · · · · · «

-10ben dializálva, 0,15 M nátrium-klorid hozzáadásával. Sőt, minthogy a szulfátsó oldatot könyebb eltávolítani, például dialízissel, mint a poli(etilén-glikolt), a találmány szerinti módszerrel újraoldva tisztább alfa-2-interferőn, kristályok nyerhetők.

A találmány szerinti módszerrel kapott kristályos alfa-2-interferőn különböző gyógyászati készítmények alapját képezi. így a kristályos interferon felhasználható lassan felszívódó készítményekben, például 0,1 - 1,0 /jg/kg testtömeg napi adaggal ekvivalens mennyiség felszabadítására képes depó-készítményekben. A találmány szerinti módszerrel előállított kristályokat tartalmazó depó-készítmény sokkal lassúbb oldódási sebességet mutat, mint a 4 °-C-on nyert kristályokat tartalmazó készítmény. A szobahőmérsékleten (22 °C) előállított kristályok kevésbé hőérzékenyek, mint azok a kristályok, amelyek képződéséhez alacsonyabb hőmérséklet szükséges.

Előállíthatok ezenfelül a humán alfa-2-interferőn fémkomplexei, majd azt követően a találmány szerinti módszerrel kristályosíthatok. Az ilyen komplex kristályai hasonlóképpen felhasználhatók lassan felszívódó készítményekben. Az ilyen lassan felszívódó készítményekben alkalmazott fémion-fehérje-komplexekre példákat már leírtak korábbi tanulmányokban. Λ-cink-kloridnak steril inzulinoldathoz való adásával előállított cink-inzulin-komplexet ismertetik az U.S.P. 2,802,203 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban '(Novo Terapeutisk Laboratórium A/S). Az ilyen komplex kristá»*·» ·♦

- 11 lyos szuszpenziója 4-6-szor hosszabb ideig hatott, mint a nem kristályos készítmény [Remington Pharmaceutical Sciences, • 17 , 975-976 (1985), Gennaro, A.R., ed., Mack Pulishing Co., Easton, PennQ. A cink-inzulin komplex különböző formákban kereskedelmileg kapható néhány gyártó cégtől, például: Lente — r

Insulin (Squibb), Ultra-Lente Hetin (Lilly) és Ultralente Insulin/Ultratard (Squibb-Novo) , Remington Pharmaceutical Science, 17 , 975-976 (1985), Gennaro, A.R. ed., Mack Publishing Co., Easton, Penn. Az izofán-inzulin inzulint (cink-inzulint) és egy lúgos fehérjét (szálmiridint) tartalmazó kristályos termék. A terméket különböző márkanevek alatt gyártják: NPH-Iletin (Lilly), Insulated (Leó) és Novolin N (Squibb-Novo) [Pharmaceutical Manuf acturing Ency clopedia, 1_, 820-822 (1988), Sitting, M. edj. A cink-alfa-2-interferőn komplex előállítható az U.S.P. 2,882,203 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban ismertetett módszerekkel. Az alfa-2-interferon-cink komplex kristályosítható a jelen találmány szerinti módszerekkel. Az így kapott, azonos méretű kristályokból álló kristályos szuszpenzió megfelelő adalékanyagokkal (így metil-parabennel, nátrium-kloriddal és nátrium-ácetáttal) formázva felhasználható szubkután injekciók céljára.

A találmány szerinti módszerrel előállított kristályos iálfa-2-interferőn lényegileg ugyanúgy használható, mint ahogy a korábbi alfa-2-interferonokat használták gyógyászati készítményekben, például alfa-2-interferőn depó-készítményekben, amelyeket meg lehet úgy tervezni, hogy körülbelül 0,1 yjg/kg és körülbelül 1,0 yug/kg közötti kristályos alfa-2-interferőn • «·« ·4 · • * · « · ·· · ··· « · napi adag felszívódását biztosítsák. Az ilyen készítmények a kristályos alfa-2-interferőn fiziológiailag hatásos menynyiségét egy gyógyászatilag elfogadható hagyományos vivőanyaggal együtt tartalmazzák.

Az itt vázolt találmányt a következő példa szemlélteti, amelyet nem szabad úgy értelmezni, hogy az bármiben is korlátozza a találmány oltalmi körét. A találmány témakörén belüli alternatív módszerek a szakterületen járatosak előtt nyilvánvalóak lesznek.

A felhasznált alfa-2-interferőn a Weissmann és munkatársai által leírt [Science, 209, 1343 (1980)J rekombináns humán alfa-2b-interferon , amelyet E.coli-ban hagytak kifejeződni. A sejteket tenyésztés után leszűreteljük és extraháljuk, miként azt Leibowitz, P. és munkatársai korábban (1982) már közölték az U.S.P. 4,315,852 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban. A kapott extraktumot szokásos tisztítási lépések kombinálásával tisztítjuk: etanolos extrakció, mátrix gél blue ligandumos affinitáskromatográfia, ioncsere és gélszűrésen alapuló kromatográfia. A kapott tisztított alfa-2b-interferont fordított fázisú nagynyomású folyadékkromatográfiával (RP-HPLC) tovább tisztítjuk egy Rainin Autó Prep Chromatography rendszert használva. 50 mg tisztított alfa-2b-interferont egy Rainin 4,1 cm x 250 cm mér'etű, 30 nm (300 &) részecskeméretű C töltettel töltött oszlopon kromatografálunk , amelyet 0,1 % trifluor-ecetsavat (TFA-t) tartalmazó 27 %-os acetonitril oldattal előzetesen egyensúlyba hoztunk. Az alfa-2b-interferonnak az oszlopról való eluálásához 40 ml/perc áramlási sebességgel 0,1 % TFA-t tartalmazó 27 % - 72 % acetonitril 30 percig tartó lineáris grádiensét használjuk. Az eiluálódó frakciókat egy 280 nm-re állított in-line Knauer UV detektor abszorbancia profilja alapján szedjük.

A kristályosítást gőzdiffúzió segítségével végezzük a függő, ülő vagy szendvicseit csepp (hanging, sitting or sandwiched drop) technikát használva. A függő csepp (hanging drop) gőzdiffúziós kísérleteket 24 lyukú szövettenyésztó lemezeken (Becton Dickinson and Company, Lincoln park, NO) végezzük. A szendvicseit csepp (sandwiched drop) kísérleteket Crystal

TM

Plate fehérjekristályosító lemezeken (Flow Laboratories, McLean, VA) , az ülőcsepp (sitting drop) gőzdiffúziós kísérleteket pedig MVO/24 többkamrás gőzdiffúziós lemezeken (Cryschem, Inc., Riverside, CA) végezzük.

A függő cseppecskék (hanging droplets) esetében 40 mM nátrium-foszfát (8,0 pH-jú) puffért tartalmazó 10 % telítettségű ammónium-szulfát oldatban 20 mg/ml fehérjét tartalmazó 10 jul—es cseppecskék függnek Linbro szövettenyésztő lemezekre lefelé fordítva helyezett szilikonozott fedőlemezekről. Ezeket a cseppecskéket hozzuk egyensúlyba 40 mM 8,0 pH-jú nátrium-foszfátot tartalmazó 20 % telítettségű ammónium-szulfát ol_d.3.t 1 ml-ével szemben. Nagy monoklin prizmás kristályok (0,5 x 0,5 x 0,5 mm) jelennek meg mindenütt 22 °C-on 4-15 napig.végzett inkubálás után. Hasonló oldatokat és kísérleti körülményeket alkalmazunk az ülő és szendvicseit cseppecske (sitting and sandwiched droplets) kísérletekben is. A kristályok stabilisak a röntgendiffrakciós vizsgálatok elvégzéséhez, és 0,6 nm-es (6 S) felbontású szórást adnak. Különböző sarzsokból származó kristályokat röntgendiffrakciós analízisnek alávetve a morfológiával egyező eredményeket kapunk. Ez az első beszámoló az alfa-2-interferőn röntgendiffrakciós vizsgálatáról.

A röntgensugár-vizsgálatok céljaira a kristályokat üvegkapillárisokba helyezzükjés egy precessziós kamerával 22 °Con lefényképezzük, egy 40 kV-οπ és 100 mA-el működő Rigaku RU-300 típusú forgóanódos generátor CuKtz. sugárzását használva. A natív adatokat egy Nicolet X-100A típusú terület detektoron gyűjtjük, ugyanazt a sugárforrást használva.

Jellemzés

1. Biológiai vizsgálat

Az individuális kristályokat egy függő cseppből fecskendővel nyerjük ki, majd azokat 22 °C-on 40 mM 8,0 pH-jú nátrium-foszfát oldatot tartalmazó 35 % telítettségű ammónium-szulfát mosóoldat 100 yal-ében újra szuszpendáljuk. A' szuszpenziót centrifugáljuk, és a mosóoldatot Pasteur-pipetta segítségével eltávolítjuk. Az így mosott kristályokat újra oldjuk 22 °C-on 0,15 M nátrium-kloridot tartalmazó 20 mM (7,5 pH-jú nátrium-foszfát oldat 100 yjl-ében.

A fehérjetartalmat módosított Bradford vizsgálattal határozzuk meg, referencia standardként tiszta humán alfa-2b-interferont használva. A vírusellenes aktivitást egy humán fityma diploid fibroblasztokat és encefalomiokarditisz vírust (ATCC-VR-129) alkalmazó citopatiás gátlási vizsgálattal határozzuk meg. E vizsgálat részletes leírását S.Rubinstein, P . C.Familetti és S.Pestka közleményében ^J.Virol., 37, 755-758 (1981)3 találjuk. Az újrafeldolgozással kapott oldat 2,0 x 10 nemzetközi egység/mg (IU/mg) fajlagos aktivitást mutat. Ez az érték megegyezik a kristályosítás előtti eredeti alfa-2b-interferőn készítményre előre megadottal a

8 vizsgálat határain belül (tipikusan 1 x 10 és 3 x 10 nemzetközi egység/mg tartományon belül).

2. Nagynyomású folyadékkromatográfiás (HPLC) vizsgálat

Az újrafeloldott interferon kristályok alikvotját analitikai nagynyomású folyadékkromatográfiával (HPLC) vizsgáljuk Waters készüléken (Waters Áss. Milford, MA). A mintát egy Rainin Dynamax 4,6 x 250 mm méretű, 30 nm (300 A) részecskeméretű C^ töltettel töltött oszlopra visszük, amelyet azután 0,1 %-os trifluor-ecetsav oldatban 27 % - 72 % acetonitril lineáris grádienssel eluálunk 30 perc alatt. Az eluátumot egy 0,02 abszorbancia egység érzékenységre és 280 nm hullámhosszra állított Gilson változtatható hullámhosszú detektorral ellenőrizzük. A kristály újraoldásával kapott oldat és a kristályosítás előtti eredeti alfa-2b-interferőn készítmény íjt ietenciós ideje és kromatográfiás profilja azonos.

3. SDS-PAGE analízis

Összehasonlítjuk a kristályosítás előtti és utáni alfa-2b-interf eront a Laemmli, U.K. által leírt [^Natúré, 227 , 680 (1970)J egydimenziós 15 % nátrium-dodecil-szulfát poliakrilamid gélelektroforézist (SD5-PAGE) alkalmazó módszerrel. Nincs különbség a relatív mobilitásban, ha a mintákat ugyanazon a gélen egymás mellett párhuzamosan hasonlítjuk össze.

A fenti l.j2. és 3. vizsgálat alapján nyilvánvalóan nincs ok feltételezni azt, hogy a fehérje bármilyen kémiai változása vagy denaturálódása következett volna be a kristályosítás vagy az újraoldás alatt.

Bár a találmányt a fent vázolt speciális megoldásokkal kapcsolatban írtuk le, a szakterületen átlagos képzettséggel bíró személy számára nyilvánvaló lesz, hogy annak számos alternatívája, módosítása és változata létezik. Mindezeket az alternatívákat, módosításokat és változatokat a találmány tárgykörébe esőnek tartjuk.

Claims (7)

1. Eljárás kristályos alfa-2-interferőn előállítására, azzal jellemezve, hogy egy alfa-2-interferont tartalmazó szulfátsó oldatot egyensúlyba hozunk egy szulfátsó oldattal szemben, ami az alf a-2-interf er^ron oldatának betöményedését és alfa-2-interferőn kristályok keletkezését okozza.

2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az egyensúlyba hozást ultraszűrés vagy dialízis segítségével vagy gőzdiffúzióval valósítjuk meg.

3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az egyensúlyba hozást gőzdiffúzióval hajtjuk végre, függő vagy szendvicseit cseppecskék használatával.

4. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy egy alfa-2-interferon-szulfátsót egy töményebb szulfátsó oldattal szemben hozunk egyensúlyba.

5. Az 1-4. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az alkalmazott alfa-2-interferőn humán, rekombináns alfa-2b-interferőn.

6. Az 5. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve hogy az alkalmazott szulfátsó az ammónium-, kalcium-, kadmi-

R’yüm-, kálium-, lítium-, magnézium- vagy nátriumsó valamelyike.

7. Az 5. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, .hogy az alkalmazott szulfátsó ammónium-szulfát.

8. Az 5. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az alfa-2-interferon-szulfátsó tartalmaz egy puffért. 9. A 8. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az alfa-2-interferon oldatot 7,3 és 8,0 közötti pH-ra

pufferőijuk.

lo. A 9. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az alkalmazott puffer nátrium-foszfát. 11. A 10. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve,

hogy a szulfátsó az alfa-2-interferőn oldatban az alfa-2-interferon kristályok keletkezésekor körülbelül 12 % és körülbelül 30 % közötti telítettségű.

12. A 10. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve,

hogy a szulfátso az alfa-2-interferőn oldatban az alfa-2-interferon kristályok keletkezésekor körülbelül 15 % és körülbelül 25 % közötti telítettségű.

13. Eljárás alfa-2-interferőn kristályosítására, azzal

jellemezve, hogy az 1. igénypont szerinti eljárással kapott kristályokat használjuk oltókristályokként.

14. Depó-készítmény, azzal jellemezve, hogy alfa-2-inter-

férőn kristályokat gyógyászatilag elfogadható vivőanyaggal együtt tartalmaz.

15. A 14. igénypont szerinti készítmény* azzal jellemezve, hogy az alfa-2-interferőn kristályok fém- vagy protaminkomplex formájában vannak jelen.

16. A 15. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy a fémkomplex egy cinkkomplex.