PT97321A - Processo de purificacao de factor de crescimento epidermico - Google Patents

Description

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MEMÓRIA DESCRITIVA 0 presente Invento refere-se a processos de purificação,. Num aspecto particular, o presente invento refere-se ao processo de purificação de péptídos do factor de crescimento epidérmico,, a partir de meios fluídos contendo os referidos péptidos» Num seu aspecto, o presente invento refere~se a processos de purificação de péptidos do factor de crescimento epidérmico produzidos por técnicas recombinantes» Num outro aspecto, o presente invento refere-se a processos de purificação de péptidos do factor de crescimento epidérmico produzidos por células de levedura* transformadas com, pelo menos, uma cópia de uma sequência de AON codificando um péptido do factor de crescimento epidérmico» ANTECEDENTES .00 INVENTO. 0 factor de crescimento epidérmico (EOF; também anteríormen™ te conhecido como urogastrona) é um péptido regulador possuindo múltiplas actividades biológicas» Por exemplo, o EOF provoca a total inibição da secreção do ácido gástrico em cerca de 15 minutos, após a administração» Adicionalmentea a aplicação do EOF durante um período de tempo rnais prolongado estimula o crescimento do tecido epidérmico» Estes efeitos fisiológicos tornam o EfâF um candidato para várias aplicações clínicas» As aplicações para as quais o EGF está actualmerite a ser testado Incluem a cicatrização de transplantes da córnea, a aplicação em enxertos de pele de dador, úlceras diabéticas, úlceras gastrintestinais e similares» Obviamente que o uso generalizado do EGF nestas aplicações clínicas necessitará do desenvolvimento de sistemas eficazes de produção e de purificação» 0 EGF foi prlmeiramente Isolado e caracterizado a partir de tecido da glândula submaxilar murina» 0 EQF humano (β-urogastrona) isolado a partir de urina humana, é um péptido de 53 aminoá-eidos contendo três ligações de díssulfureto» A disponibilidade da sequência de aminoácidos da B-urogastrona permitiu a concepção e a construção de genes sintéticos codificando este péptido» A disponibilidade de genes sintéticos permitiu o desenvolvimento de

72 455 IPA-004 (DBE/SLC/ /SLH) sistemas de expressão recombinantes para a produção deste pépti-do» 0 primeiro sistema de expressão recomblnante referido para a produção de EGF humano utilizou E»Coli e permitiu obter 2,3 rng/1 de material biologicamente activo» A expressão citoplásmica do EGF humano em S, cerevisiae atingiu um nível de cerca de 30 microgramas por litro, mas o produto continha uma metlonina N--terminal» Hais tarde, o uso da sequência de comando do factor de empareihamento α de S» cerevisiae para a secreção directa do EGF humano a partir de S» cerevisiae, aumentou o nível de expressão de uma forma ¢1-52) de EGF humano para cerca de 5 miligramas por litro» Mais recentemente, têm sido referidos hospedeiros de expressão Bacillus, melhorados, que são capazes de segregar até 240 miligramas de EGF por litro sem qualquer degradação apreciável» Com excepção do sistema de expressão Bacillus, para o qual não está disponível qualquer informação publicada relativa à produtividade de EGF numa produção em grande escala, os níveis de expressão do EGF humano em sistemas de expressão recombinantes têm sido bastante baixos» Adicionalmente, nenhuma das publicações que descreve a produção de EGF recombinante refere o problema da recuperação do EGF a partir do meio no qual o péptido é preparado»

Recentemente, desenvolveu-se a levedura metilotrófica P.ic,h.l.a Pastoris como um hospedeiro melhorado para a produção de produtos recombinantes» Tem-se mostrado que as estirpes recombinantes de

PicJiia.......Pastoris são capazes de segregar proteínas recombinantes na gama das gramas por litro» Adlcíonalmente, tem-se mostrado que estas estirpes são capazes de se adaptarem a condições de fermentação por cultura descontínua ou contínua» Além disso, estas estirpes têm um fenótipo recombinante extremamente estável e são capazes de manter rendimentos elevados do produto de expressão recombinante desejado, durante várias ordens da escala de fermentação» De facto, Siegel, et al», no pedido de patente copendente nQ de Série 323964, depositado em 15 de Março, 1989, mostraram recentemente que a P.-Pastoris. é um hospedeiro excelente para a produção recombinante do EGF» Deste modo, a descrição des-

72 455 IPA-004 (DBE/SLC/ /SLH) te pedido de patente copendente é aqui incorporada como referenciada sua totalidade- Em face da disponibilidade de meio contendo níveis elevados de EGF produzido de. modo recombinante, existe uma necessidade de meios eficazes para a recuperação e purificação do EQF destes meios -

SUMÁRIO.....DO.....INVENTO

De acordo com o presente invento, desenvolveu-se um processo eficaz para a recuperação e purificação de péptidos de EQF a pai— tir dum meio fluído contendo estes péptidos,. ΰ processo do invento envolve adsorções-desadsorções sucessivas em materiais resínicos apropriados, seguidos por cromatografia liquida de elevado rendimento, de fase inversa, seguida de passos opcionais de filtração e liofilizaçâo- Deste modo, podem-se obter, por 1,0 litros de caldo de fermentação, mais do que uma grama de EQF purificado- Tipicamente, pelo processo do presente invento, pode-se conseguir uma recuperação superior a cerca de 55% do EQF inicial mente presente no meio contendo EGF em bruto-

BREVE.....DESCRICÁQ.....DA FIGURA A Figura 1 é um rnapa de restrição do plasmídeo pEGF819, que contém cinco cassetes de expressão do EGF humano_

DISCRIÇÃO.....DETALHADA.....DO.....INVENTO

De acordo com o presente invento, apresenta-se um processo para a purificação de péptidos do factor de crescimento epidérmico (EQF) a partir do meio contendo EQF, o referido processo compreendendo:; a) o contacto do referido meio com uma quantidade suficiente de uma resina de fase inversa sob condições adequadas para a adsorção de, pelo menos, 90% do referido EQF do referido meio, b) a eluição do EGF adsorvido da referida resina contendo EQF do passo a) por contacto da referida resina com uma quantidade suficiente de um sistema solvente, que é suficientemente não polar para deslocar substancialmente todo o referido EGF da referida resina, c) o contacto do eluído do passo b) com uma quantidade suficiente de uma resina de permuta catióníca, sob condições adequa- 5 72 455 IPA-004 (DBE/SLC/ /SLH) das para a adsorção da, pelo menos, 95% do referido EQF do referido eluído, d) a eluiçao do EOF adsorvido da referida resina de permuta catiónica por contacto da referida resina com, pelo menos, 1,5 volumes, em relação ao volume de resina, de um sistema tampão possuindo uma força iónica suficiente para deslocar, substancialmente, todo o referido EOF da referida resina e, depois, e) a sujeição do EOF eluído, obtido no passo d) a cromato-grafia liquida de elevado rendimento (HPLC) a uma escala preparativa,

Oe acordo com uma concretização especifica do presente invento, é proporcionado um processo para a purificação de péptidos do factor de crescimento epidérmico humano (hEOF) a partir do meio contendo hEQF, onde o referido meio contendo hEQF é um caldo de fermentação de uma operação de fermentação de levedura com uma elevada densidade de células e onde a referida levedura está transformada com, pelo menos, um fragmento de ADN capaz de exprimir o hEQF, o referido processo compreendendo;; a.) o contacto do referido meio com uma quantidade suficiente de uma resina de fase inversa, sob condições adequadas para a adsorção de, pelo menos, 90% do referido hEGF do referido meio; onde a referida resina de fase inversa é uma resina do tipo C·^; onde se utilizam pelo menos 30 gramas, da referida resina de fase inversa, por grama de hEGF no referido meio; e onde o referido contacto é realizado durante um período compreendido entre cerca de 0,1 e 8 horas, a uma temperatura compreendida entre cerca de 4 e 40°C, b) a separação da resina contendo hEGF do meio desprovido de hEGF, c) o contacto da resina contendo hEGF com pelo menos um volume, por volume de resina, de um ácido fraco, diluído; onde o ácido fraco, diluído, é uma solução de ácido acético 0,05 M e, depois, a remoção do ácido fraco, diluído, da resina contendo hEQF, d) a eluição do hEQF adsorvido da referida resina contendo hEQF do passo c), por contacto da referida resina com uma quantidade suficiente de um sistema solvente que· é sufi cientemente não 72 455 IPA-004 (DBE/SLC/ /SLH) ~6~ polar para deslocar, substancíalmente, todo o referido hEFG da referida resina, e) o contacto do eluído do passo d) com uma quantidade suficiente de uma resina de permuta catiónica sob condições adequadas para a adsorçao de pelo menos 95% do referido hEGF do referido eluído, f) o contacto da resina contendo hEGF produzida no passo e) com uma quantidade suficiente de uma solução, de um ácido fraco diluído para reduzir a absorvância a 400 manómetros, do efluente do referido contacto, a 0,1 U»A» ou menos, em relação a um branco da solução de ácido fraco, diluído, g) a eluição do hEGF adsorvido da referida resina de permuta catiónica, por contacto da referida resina com cerca de 1,5 a 3 volumes, em relação ao volume de resina, de um sistema tampão possuindo uma força ióriíca de cerca de 0,3 ião-g/1, e compreendendo 0,3 M de acetato de amónio» h) o ajustamento do pH do hEGF eluído, obtido no passo g) pela adição de uma quantidade suficiente de ácido trifluoroacéti-co de modo a tornar a referida solução cerca de 0,1% em TFA, i) o carregamento do hEGF eluído, como pH ajustado, obtido no passo h) numa coluna de cromatografia líquida de elevado rendimento (HPLC) à escala preparativa, j) inicialmente, o tratamento da coluna carregada com um sistema solvente, numa quantidade compreendida entre 1-2 volumes de coluna, que é suficientemente não polar para eluir as impurezas menos hidrofóbicas do que o hEGF, mas que não é tao não polar de modo a provocar a eluição de quantidades significativas de HEGF e, depois, k) a eluição do hEGF purificado da referida HPLC utilizando um sistema solvente misto, compreendendo um componente aquoso e um componente orgânico, onde o referido sistema solvente misto é suficientemente não polar para eluir o hEGF, mas não é tão não polar de modo a provocar a eluição de quantidades significativas de materiais que estão mais fortemente ligados ao suporte de HPLC do que o hEGF» 0 termo "factor de crescimento epidérmico" ou "péptido de EGF", tal como é utilizado na descrição e nas reivindicações, re-

72 455 IPA-004 (DBE/SLC/ /SLH) -7- fere-se a um produto polipeptídico que exibe actividades biológicas similares* do mesmo tipo* que o factor de crescimento epidérmico humano natural (hEGF), tal como é medido em bioensaios reconhecidos, e tem, substancialmente, a mesma sequência de aminoácidos que o hEGF, incluindo as formas de aminoiácidos 53, 52 e 48> Será de notar que os polipéptidos deficientes em um ou mais aminoácidos na sequência de aminoácidos referida na literatura para o hEQF de ocorrência natural, ou os polipéptidos contendo aminoácidos adicionais ou os polipéptidos onde um ou mais aminoácidos da sequência dos aminoácidos do hEGF natural, estão substituídos por outros aminoácidos* são abrangidos pelo campo do invento* desde que exibam a activida.de funcional do hEGF, p.e», inibição da secreção do ácido gástrico e promoção do crescimento celular.. Pretende-se que o invento abranda todas as variações alélicas do hEGF.. Além disso, no âmbito do presente invento, incluem-se os derivados obtidos por simples modificação da sequência de aminoácidos do produto de ocorrência natural, p»e», obtidos por mutagénese dirigida ao local ou por outros procedimentos convencionais» As formas de EGF produzidas por proteólise de células hospedeiras que exibem actividades biológicas similares às do hEGF maduro, de ocorrência natural, são também abrangidas pelo presente invento» 0 primeiro passo no processo de purificação do invento consiste em pôr em contacto o meio contendo factor de crescimento epidérmico com uma quantidade suficiente de uma resina de fase inversa sob condições adequadas para a adsorção de, pelo menos* 90% do factor de crescimento epidérmico do meio» 0 contacto do meio contendo factor de crescimento epidérmico com a resina de fase inversa pode ser realizado de várias formas., Por exemplo, a resina de fase inversa pode estar contida numa coluna através da qual se faz percolar o meio contendo factor de crescimento epidérmico» Alternativamente* a resina de fase invei— sa pode estar contida num recipiente fechado* rio qual se introduz o meio contendo factor de crescimento epidérmico, seguindo-se a agitação durante um período de tempo suficiente para permitir que ocorra um contacto grosseiro entre a resina e o meio fluído, 72 455 IPA-004 (DBE/SLC/ /SLH) ~8~ seguindo-se a decantação do meio,, desprovido de EGF, da resina de fase inversa, contendo EGF» Como outra alternativa, pode-se adicionar a resina de fase inversa (que foi primeiramente molhada com um solvente, solúvel em água, adequado, tal como metanol ou acetonitrilo) ao recipiente contendo o meio contendo EGF, seguindo-se a remoção do meio desprovido de EGF, da resina de fase inversa contendo EGF»

As resinas de fase inversa contempladas para uso na prática do presente invento são bem conhecidas na arte e incluem resinas Cq-Cjlq, resinas CN (ciano), resinas NHg (amino), resinas fenilo e similares- Ver, por exemplo Melande e Horvath nas páginas 114-319 (espeeialmente nas páginas 123-165) de "High Perfomance Liquid Chromatography, Advances and Perspectíves, Vol»2, C» Horvath, ed» Academic Press (New York, 1980)» As resinas de fase inversa, presentemente preferidas para uso na prática do presente invento, são resinas do tipo C18» A quantidade de resina de fase inversa utilizada pode variar grandemente» Tipicamente, usar-se-ão, pelo menos, cerca de 30 gramas de resina de fase inversa por grama de EGF contido no meio „ 0 contacto do meio contendo EGF com a resina de fase invei— sa, pode ser realizado sob várias condições» Tipicamente, este contacto é realizado durante um período compreendido entre cerca de 0,1 e 8 horas, e a uma temperatura compreendida entre cerca de 4 e 40°C»

Após o caldo contendo EGF ter sido mantido em contacto com a resina de fase inversa, durante um período de tempo suficiente para que o EGF seja adsorvído na resina, é desejável remover o meio, desprovido de EGF, do contacto com a resina de fase inversa, rica em EGF» Isto pode ser realizado de várias formas, tais como, por exemplo, filtração, decantação, centrifugação e similares» Este contacto e separação podem ser realizados, facilmente, num único passo operacional, fazendo passar o meio contendo EGF através de uma coluna da resina de fase inversa, coluna esta que 72 455 IPA-004 (DBE/SLC/ /SLH) está equipada com um meio de retenção (p.e., um peneiro, uma placa de suporte com orifícios ou similar), de modo a reter a resina de fase inversa na coluna permitindo, no entanto, que o meio fluído atravesse a coluna» Desta forma deixa-se o caldo, desprovido de £GF, percolar simplesmente através da resina de fase inversa»

Depois de substancialmente todo o EQF ter sido adsorvído na resina de fase inversa e antes da eluição do EQF da resina, é desejável pôr em contacto a resina contendo EQF com um volume de um ácido fraco, diluído, compreendido entre cerca de 1 e 10 volumes, em relação ao volume da resina de fase inversas e depois o ácido fraco, diluído, é então removida da resina contendo EQF» Esta lavagem opcional serve para remover impurezas que não estão tão for— temente ligadas à resina de fase inversa como o EQF» Exemplos de ácidos fracos, diluídos, incluem soluções, aproximadamente, 0,05 molar de ácido acético, ácido fórmico ou ácido fosfórico»

Depois de substancialmente todo o EQF ter sido adsorvído na resina de fase inversa e opcionalmente lavada como anteriormente se descreveu, o EQF é, então, eluído da resina contendo EQF, por contacto da resina com uma quantidade suficiente de um sistema solvente que é suficientemente não polar para deslocar substancialmente todo o EQF da resina- Um sistema solvente que é "suficientemente não polar" para realizar a eluição desejada é um sistema solvente que é menos polar do que o meio aquoso a partir do qual o EQF está a ser recuperado» A eluição é realizada reduzindo a polaridade do sistema solvente, tipicamente, pela adição de solventes orgânicos ao sistema solvente» Um sistema solvente que é "sufícientemente não polar" para realizar a eluição desejada é um sistema solvente no qual a polaridade foi suficientemente reduzida de modo a aumentar substancialmerite a partição dos pépti-dos de EGF na fase móvel a partir da fase estacionária»

Os solventes contemplados para uso neste passo de eluição incluem misturas aquosas de álcool contendo, pelo menos, um álcool possuindo até 4 átomos de carbono, soluções aquosas de acetonitrilo, cetonas possuindo até seis átomos de carbono. 72 455 IPA-004 (DBE/SLC/ /SLH) -10- éteres cíclicos ou poliéteres cíclicos, possuindo até seis átomos de carbono, e similares. Os sistemas solvente» presentemente preferidos para o uso neste passo de eluição, incluem (1) etanol aquoso a cerca de 38% ou (2) acetonítrilo aquoso a 30%. A quantidade do sistema solvente de eluição utilizada pode variar grandemente- Tipicamente» usar-se-ão volumes compreendidos entre cerca de 2-4 volumes do sistema solvente por volume de resina de fase inversa» A eluição do EfâF da resina de fase inversa contendo EfâF» pode ser realizada sob várias condições,. Tipicamente» usai—se~ã uma temperatura comprendida entre cerca de 10 e 40°C. Tipicamente» o tempo de eluição será relativamente curto» estando compreendido entre cerca de 0»1 e 1,0 hora» ainda que se possam usar tempos mais prolongados ou mais curtos. 0 meio contendo EOF» parcialmente purificado» que foi eluído da resina de fase inversa» é depois posto em contacto com uma quantidade suficiente de uma resina de permuta catiónica sob condições adequadas para a adsorção de» pelo menos» 95% do EfâF do meio contendo EfâF.

As resinas de permuta catiónica» contempladas para uso na prática do presente invento» incluem carboximetilcelulose, carbo-ximeti1-sephadex, sulfopropilcelulose, sulfopropil-sephadex» e similares- As resinas de permuta catiónica presentemente preferidas incluem carboximetilcelulose e carboxímeti1-sephadex, sendo a carboximetilcelulose a resina de permuta catiónica presentemente mais preferida» para uso na prática do presente invento» em virtude da sua fácil disponibilidade e excelente eficiência-

As quantidades de resina de permuta catiónica utilizadas na prática do presente invento podem variar grandemente- Tipicamente» usar-se-ão quantidades compreendidas entre cerca de 0,25 e 1 litro de resina de permuta catiónica por grama de EfâF no meio que está a ser tratado.

72 455 IPA-004 (DBE/SLC/ /SLH) ΊΙ™ 0 contacto do caldo contendo EGF» parcialmente purificado» com a resina de permuta catiónica pode ser realizado sob várias condições» Tipicamente» este contacto é realizado durante um periodo de» pelo menos» 1 minuto e a uma temperatura compreendida entre cerca de 4 e 40*0,.

Depois de substancialmente todo o EOF ter sido adsorvido pela resina de permuta catiónica» procede-se ao contacto opcional da resina contendo EGF com uma quantidade suficiente de uma solução de ácido fraco diluído» de modo a reduzir a absorvância a 400 nanometros» do efluente de contacto» até um valor de 0»1 U.A» ou inferior» em relação a um branco da solução de ácido fraco» diluído» As soluções de ácido fraco» presentemente preferidas para uso neste passo de lavagem» incluem soluções» aproximadamente» 0»05 molar de ácido acético» ácido fórmico ou ácido fosfórico»

Depois da substancialmente todo o EGF ter sido adsorvido na resina de permuta catiónica» opcionalmente lavada com ácido fraco» diluído» eluí-se o EGF da resina de permuta catiónica por contacto da resina com, pelo menos, 1,5 volumes, em relação ao volume da resina, de um sistema tampão possuindo uma força iónica suficiente para deslocar substancialmente todo o EGF da resina» Os sistemas tampão, contemplados na prática do presente invento, são os sistemas possuindo uma força iónica de pelo menos cerca de 0,1 ião-g por litro e são tipicamente seleccionados de entre acetato de amónio, formato de amónio» acetato de sódio, acetato de potássio, cloreto de sódio, e similares»

Os sistemas tampão, presentemente preferidos na prática do presente invento, incluem os sistemas que possuem uma força iónica de» pelo menos» cerca de 0,3 ião-g por litro» Um sistema tampão especialmente preferido é uma solução de acetato de amónio 0,3 molar. A quantidade de sistema tampão de elevada força iónica utilizada na prática do presente invento pode variar grandemente» Tipicamente, usai—se-ão quantidades de tampão compreendidas entre cerca de 1,5 e 3 volumes, por volume de resina de permuta

72 455 XPA-004 (DBE/SLC/ /SLH) catiónica» A eluição do EOF da coluna de resina de permuta catiónica pode ser realizada a várias temperaturas» Tipicamente, usam-se temperaturas até cerca de 40^0. A resina de permuta catiónica pode ser opcíonalmente actí-vada antes do uso e/ou regenerada após a eluição do EGF, por tratamento de acordo com técnicas de regeneração conhecidas na arte, tais como as que são tipicamente descritas pelos fabricantes de resinas» Por exemplo, pode-se pôr a resina em contacto, em primeiro lugar, com uma solução de sal concentrada para provocar a eluição da maior parte dos materiais adsorvidos na resina, lava--se depois com uma solução diluída de uma base forte e depois equilibra-se com um ácido fraco diluído» A coluna assim tratada está então pronta para o contacto com o caldo contendo EGF, pai— cialmente purificado, como anteriormente se descreveu»

Antes do carregamento da solução eluída contendo EGF numa coluna de cromatografia de alta eficiência (HPLC), a solução contendo EGF pode ser opcionalmente tratada com uma quantidade suficiente de ácido trifluoroacético de modo a tornar a solução contendo EGF cerca de 0,1% em ácido trifluoroacético»

Depois de a solução contendo EGF ter sido eluída da resina de permuta catiónica e opcionalmente ajustada a uma concentração de cerca de 0,1% de ácido trifluoroacético, pelo menos, uma porção desta solução é, depois, submetida a cromatografia líquida de elevado rendimento»

As colunas contempladas para uso neste passo de HPLC são bem conhecidas na arte e incluem resinas Cq-C-lq, resinas CN (ciano), resinas NH2 (amino), resinas fenilo e similares» Ver, por exemplo, Melander e Horvarth, supra» As colunas de HPLC, presentemente preferidas para uso neste passo do processo do invento, incluem resinas do tipo C^g- Uma configuração de coluna presentemente preferida é uifia coluna de compressão radial com 50,8 milímetros (2 polegadas) de diâmetro»

72 455 IPA—004 (DBE/SLC/ /SLH) "13“ A capacidade de carga dos vários empacotamentos das colunas de HPLC pode variar grandemente. Qualquer valor da carga até cei— ca de 50% do valor máximo, para um dado empacotamento da coluna e para uma dada configuração da coluna, é adequado. 0 valor máximo para uma dada coluna ocorre quando a resina está saturada com ad-sorvente, de modo que a introdução de qualquer adsorvente adicío-nal no sistema resultará, no fracasso da adsorçáo do material recentemente introduzido na resina, ou no deslocamento imediato do material adsorvido anteriormente (proporcionando o local para a adsorção de material recentemente introduzido)« Com as resinas do tipo C189 presentemente preferidas, podem-se conseguir níveis de carga, até cerca de 14 mg de EOF por centímetro cúbico de empacotamento de coluna.

Depois da carga da coluna de HPLC, com solução contendo EQF, estar completa, tipicamente, a coluna é lavada, antes da eluição do EQF, fazendo passar através da coluna de HPLC urn volume do sistema solvente inicial compreendido entre cerca de 1 e 2 volumes de coluna, sistema de solventes este que é suficientemente não polar para provocar a eluição de impurezas que são menos hi-drofóbicas do que o EQF mas que rião é tão não polar que provoque a eluição de quantidades significativas do EQF. Um exemplo de um sistema de solventes utilizado neste passo inicial de tratamento de HPLC compreende (i) uma solução aquosa contendo 0,1% de ácido trifluoroacético e, opcionalmente, (ii) até 15% de uma mistura de 95% de acetoni t r ilo-5% de água, que contem 0,1% de ácido trifluoroacético.

Por forma a eluir o EQF purificado da coluna de HPLC, faz™ -se, depois, passar através da coluna de HPLC um sistema solvente misto. Os sistemas solventes mistos utilizados para este propósito compreendem um componente aquoso e um componente orgânico, onde o sistema de solventes misto é suficientemente não polar para provocar a eluição do EQF da coluna, mas não suficientemente não polar para provocar a eluição de quantidades significativas de materiais que estão mais fortemente ligados ao suporte de HPLC do que o EQF. Prefere-se que o EQF seja deslocado suavemente da coluna de HPLC e isto é realizado, tipicamente, aumen-

72 455 IPA-004 (DBE/SLC/ /SLH) ~14 tando· gradualmente a proporção do componente orgânico do sistema solvente misto* em relação à proporção do componente aquoso do sistema solvente misto* durante o decorrer da eluição»

Sistemas solventes típicos utilizados para a eluição do EGF da coluna de HPLC compreendem uma concentração inicial até 100%* até uma concentração final tão baixa quanto cerca de 50%* de uma solução aquosa contendo 0*1% de ácido trifluoroacético e uma concentração inicial tão baixa quanto 0%, até uma concentração final de cerca de 50%* de uma mistura aquosa de acetonitrilo contendo 0*1% de ácido trifluoroacético* onde o acetonitrilo aquoso contém até 20% de água»

Uma vez que o acetonitrilo é um solvente vulgarmente usado para a eluição de EGF purificado de HPLC* e que muitas aplicações do EGF requerem que o material satisfaça todas as regulamentações da Federal Orug Administration* para produtos considerados na generalidade como seguros ("generally regarded as safe") (GRAS)* pode-se utilizar um passo adicional de adsorção-desadsorção utilizando uma resina de permuta catiónica* para remover substancialmente todo o acetonitrilo introduzido nos passos anteriores» Assim* opcionalmente* os produtos do passo de HPLC podem ser submetidos ainda a: f) contacto do eluído do passo ©) com uma quantidade suficiente de uma resina de permuta catiónica sob condições adequadas para a adsorção de* pelo menos* 95% do referido EGF do referido eluído» g) o contacto da resina contendo EGF* produzida no passo f)* com uma quantidade suficiente de uma solução de um ácido fraco diluído* para reduzir a concentração de acetonitrilo no efluente até um valor não superior a cerca de 10 mg/1* e h) eluição do EGF adsorvido da referida resina de permuta catiónica* por contacto da referida resina com pelo menos 1*5 volumes* em relação ao volume de resina, de um sistema tampão possuindo urna força íónica suficiente para deslocar substancialmente todo o referido EGF da referida resina»

As resinas de permuta catiónica contempladas para uso neste 72 455 IPA-004 (DBE/SLC/ /SLH) -15- passo de remoção de acetonitrilo incluem carboximetilcelulose, carboximetil-sephadex, sulfopropilcelulose, sulfopropil-sephadex e similares- As resinas de permuta catiónica presentemente preferidas incluem carboximetilcelulose»

Qpcionalmente, as resinas de permuta catiónica, utilizadas nesta concretização do presente invento, podem ser opcíonalmente activadas antes da utilização, e/ou regeneradas após a eluição do EQF, como anteriormente se descreveu»

As soluções de ácido fraco, diluído, contempladas para uso nesta aspecto do presente invento, incluem soluções, apro-ximadamente, de 0,05 molar de ácido acético, ácido fórmico ou ácido fosfórico e similares»

Os sistemas tampão contemplados para uso na eluição de EOF altamente purificado da resina de permuta catiónica contendo EOF, incluem sistemas tampão possuindo uma força iónica de pelo menos 0,1 ião-g por litro, e tipicamente, são seleccionados de entre acetato de amónio, formato de amónio, acetato de sódio, acetato de potássio, cloreto de sódio e similares- Os sistemas tampão presentemente preferidos, úteis na prática do presente invento, são aqueles que possuem uma força iónica de pelo menos cerca de 0,3 ião~g por litro- Um sistema tampão especialmente preferido é uma solução 0,3 molar de acetato de amónio -

Uma forma conveniente para armazenar ou transportar o EQF purificado é a forma liofilizada» 0 material eluído da HPLC, utilizando sistemas tampão constituídos por sais orgânicos, pode ser liofilizado, directamente ou após a remoção do acetonitrilo, como anteriormente se descreveu, ou após esterílízação, que pode ser realizada de um modo convencional- 0 material eluído da HPLC utilizando sistemas tampão constituídos por sais orgânicos é tratado, tipicamente, por filtração estéril e, depois, armazenado na forma de um concentrado a granel» 0 método presentemente preferido para esterilizar as soluções contendo EGF, consiste em fazer passar o material -16- 72 455 IPA-004 (DBE/SLC/ /SLH) através de um filtro poroso, possuindo um diâmetro de poro não superior a cerca de 0,45 micron. Os peritos na arte podem facilmente identificar numerosas outras formas pelas quais eo podem esterilizar soluções contendo EGF» 0 meio a partir do qual se recupera o EOF, de acordo com o processo do invento para a purificação do EGF, pode variar gran-demerite» Presentemente, é contemplada a recuperação de materiais tanto naturais como sintéticos« Devido à sua semelhança substancial, são contemplados para uso na prática do presente invento todos os materiais do tipo EOF, tais como, o factor de crescimento epidérmico humano nativo (1-53 hEGF), o análogo (1-48) de hEGF, o análogo (1-51) de hEGF, o análogo (1-52) de hEGF, bem como todos os péptidos que são substancialmente homólogos do hEGF»

As fontes sintéticas de EGF, a partir das quais se pode recuperar e purificar o EOF, de acordo com o presente invento, incluem leveduras e/ou bactérias,, modificadas recombinantes, contendo uma ou mais sequências de ADN codificando operativamente péptidos de EGF» As espécies de levedura seleccionadas do género Pichia são presentemente preferidas» As estirpes especificas de Pichia pastoris G+EGF817S1, G+EGF819S4 ou G+EGF206S10, são presentemente preferidas pois provaram produzir níveis elevados de EGF numa operação de fermentação em grande escala» Preparam-se estas estirpes específicas, presentemente mais preferidas, e faz-se com que exprimam EGF como se descreveu no pedido de patente copendente nS 323964, pedido de patente cuja leitura se recomenda para detalhes adicionais, tais como a preparação das estirpes e expressão do EGF a partir das estirpes»

Quando o EGF a ser purificado está contido no caldo de fermentação de uma operação de fermentação, prefere-se separar o material celular e na forma de partículas, do caldo de fermentação, antes do contacto inicial do meio contendo EGF com a resina de fase inversa» 0 presente invento será agora descrito com maior pormenor com referência aos exemplos, não limitativos, seguintes»

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EXEMPLOS

Exemplo 1: Estirpe de produção de EOF A estirpe de £„»„ pastoris usada na produção de hEGF que continha quatro cópias de uma cassete de expressão de hEGF regulada por metanol (uma única cassete de expressão era constituída pelo promotor do gene $0X1 de p„........pastoris„ regulado por metanol, pelas sequências de secreção do factor de emparelhando da S». ce-reyis.la.et, por um gene sintético codificando o gene de hEGF (1-53) ou o (1-48) , pelo terminador de transcrição de A0X1 e pelo gene b!I.M de P... pasto,ris, para selecção integrada no genoma do hospedeiro) foi preparada como se segue.

Transformou-se a estirpe hospedeira GS115 de Pichia pastoris His auxotrófica (ATCC 20864), com um vector contendo cinco cassetes de expressão de hEGF- 0 vector compreendendo cinco cassetes de expresão de hEGF (1-53) é designado por pEGF819 e a sua preparação foi descrita no pedido de patente copendente nQ de série 323964. Na Figura 1 apresenta-se um mapa de restrição do plasmídeo pEGF819. A estirpe GS115 de Pichia pastoris, foi o hospedeiro usado para transformação com este vector- 0 vector foi linearizado antes da transformação da G8115, pelo processo do esferoplasto CCregg, 'et al„, Mol. Cell. Biol. 5, 3376-3385 (1985)]. Após selecção e análise por hibridação de Southern, verificou-se que a estirpe G+EGF819S4 continha quatro cópias da cassete codificando o hEGF (1-53) (aparentemerite, perdeu-se uma cópia, do vector plasmídico de cinco cópias, por recombinação durante a traris-formação)-

Exemplo 2r, Protocolo de Fermentação Iniciou-se uma fermentação de 250 1 (realizada num fermenta-dor New Brunswick) num volume de 100 litros contendo 67 litros de sais de base 10X (52 ml/1 de ácido fosfórico a 85%, 1,8 g/'l de sulfato de cálcio.2^0, 28,6 g/1 de sulfato de potássio, 23,4 g/1 de sulfato de magnésio»7H20, 6,5 g/1 de hidróxido de potássio) e 3,6 kg de glicerol- Após esterilização, adicionaram-se 420 ml de

72 455 IPA-004 (DBE/SLC/ /SLH ) -18-

solução de sais vestigiários ΡΤΜ^ [6,0 g/1 de sulfato cúprico. 5H2q, 0,08 g/1 de iodeto de sódio, 3,0 g/1 de sulfato de manganês.H20, 0,2 g/1 de molibdato de sódio.2H2QS 0,02 g/1 de ácido bórico, 0,05 g/1 de cloreto de cobalto, 56,0 g/1 de sulfato ferroso.7H20, 0,2 g/1 de biotina e 5,0 ml/1 de ácido sulfúrico (conc.)] e ajustou-se o pH e controlou-se, subsequentemente, a 5,0, pela adição de hidróxido de amónio ao longo da fermentação. Controlou-se a formação excessiva de espuma pela adição de agente anti-espuma a 5% Struktol J673. Inoculou-se o fermentador com 1,5 litros de uma cultura de um dia para o outro (DQ^qq = 1:1 da estirpe de expressão de EGF de P... pastoris, G+EGF81954 em YNB

[6,7 g/1 de base de azoto de levedura sem aminoãcidos (Difco, De-troit, MI, H.U.A.)], 2% de glícerol, fosfato 0,1 M, pH 6. Mante-ve-se o oxigénio dissolvido acima de 20%, aumentado, conforme apropriado, o caudal de ar até um valor máximo de cerca de 200 litros/minuto, a agitação até um valor máximo de cerca de 300 rpm, a pressão do fermentador até um valor máximo de cerca de 68,9 kPa (10 psig) e/ou por enriquecimento da injecção de ar no fermentador com oxigénio durante a fermentação.

Após exaustão da carga de glicerol inicial, iniciou-se uma alimentação de 50% de glicerol, contendo 12 ml/1 de sais vestigiários PTM, com um caudal de 2 1/h; continuou-se a alimentação de glicerol durante 7 horas, instante no qual se iniciou a alimentação de metanol, contendo 12 ml/1 de sais vestigiários PTMjl» com um caudal de 0,24 kg/h. Aumentou-se a alimentação de metanol em cerca de 10% por hora, com intervalos de meia hora, até se atingir um caudal de alimentação de metanol de cerca de 1 kg/h„ Recolheu-se o conteúdo do fermentador após cerca de 44 horas de crescimento, em alimentação contendo metanol -

Exemplo 3: HPLC Analítica A. A HPLC de fase inversa foi realizada com uma coluna de HPLC analítica; usaram-se uma coluna Waters Boridapak C18 (0,25 X X 30cm) com uma coluna de guarda C18, usando um "Solvente Delive-ry System" Waters Modelo 600 e um "Intelligent Sample Processor" Waters Modelo 712, com refrigeração. A Fase Móvel A consistia de ácido trifluoroacético (TFA) a 0,1%, i.e., 0,6 ml de TFA a 100% 72 455 IPA-004 (DBE/SLC/ /SLH) -19- por litro e a Fase Móvel B consistia em 95% de acetonitrilo/5% de H20 com TF A a Q,l%„ 0 caudal foi de 1,0 ml/minuto» A coluna foi equilibrada em 80% de A e 20% de B durante 20 minutos antes de cada ensaio -

Cada ensaio analítico teve uma duração de 50 minutos- Os primeiros cinco minutos foram isocráticos com 80% de A e 20% de B; depois, um gradiente linear durante os 25 minutos seguintes trouxe a composição para 70% de A e 30% de B; e, finalmente, aumentou-se a concentração de B para 55% por um gradiente linear durante os 20 minutos finais» Mediu-se continuamente a absorvân-cia no UV a 210 nm com um detector Waters modelo 481 e registou-se num integrador Shimadzu C-R3A» B» Oesenvolveu-se um procedimento de HPLC analítica menos prolongado, para controlo do processo à escala piloto. 0 procedimento menos prolongado consistiu de um ensaio de 10 minutos sob condições isocráticas com 72% de A e 28% de B.

Removeram-se as células, a partir de amostras de caldo, por centrifugação durante 3 minutos numa microcentrifugadora, antes de se carregarem na HPLC»

Exemplo 4: Protocolos de Purificação à Escala de 250 litros

Separou-se o caldo contendo EGF humano das células, por centrifugação com um caudal de 3 litros por minuto e um tempo de impulso de 40 segundos (i.e», intervalos de 40 segundos entre des-cargas), numa centrifugadora contínua Alfa-Laval BTPX205, a apro-ximadamente 13000 xg» Diluiu-se o creme de células com água desi-onizada até ao seu volume original e centrifugou-se como anteri-ormente» Combinaram-se os caldos clarificados das duas separações e clarificaram-se adicionalmente, de novo por centrifugação, com um caudal de 6 litros por minuto e com um tempo de impulso de 20 minutos» 0 EfâF humano foi removido do caldo resultante pela adição, por passos, de uma resina de fase inversa» Ao caldo adicionaram-se duas alíquotas de 200 g cada e alíquotas subsequentes de 300 g 20- 72 455 IPA-004 (DBE/SLC/ /SLH) cada, de Vydac 281TPB 15-20,, rnalhada em metanol, e agitou-se a mistura durante 15 minutos após cada adição- Mediu-se a quantidade de EOF que permaneceu no caldo pelo procedimento analítico de HPLC menos prolongado (como se descreveu no Exemplo 3B) subsequentemente a cada adição de resina- Adicionaram-se alíquotas adicionais de resina até estarem presentes no caldo menos do que 10% do valor de EGF de partida- No total, adicionaram-se 1600 g de resina-

Removeu-se a resina do caldo por bombagem da mistura resina--caldo através de uma coluna (com 30 cm de diâmetro, Amicon) com, um peneiro de 10 mesh no suporte de fundo e com o peneiro de topo removido- Após a passagem do caldo através da coluna, recolocou--se o peneiro de topo e lavou-se a resina com cerca de 5 litros de ácido acético 0,05 M- Depois eluiu-se o EGF com duas alíquotas de 4 litros de etanol a 38%, e acidificou-se até pH 3,5 com ácido acético 0,05 M- Descoloriu-se o eluído carregando o referido eluído numa coluna de resina de permuta catiónica com uma proporção de não mais do que 25 g de EGF por seis litros de resina de permuta catiónica (Resina Macrosorb KAX-CM, Sterling Organics)- A coluna tinha sido previamente activada/regenerada por lavagem com acetato de sódio 1,0 N, depois, contacto com hidróxido de sódio 0,1 N durante cerca de 1 hora à temperatura ambiente, seguindo-se uma lavagem com ácido acético 0,2 M- Depois, equilibrou-se a coluna em ácido acético 50 mH- Eluiu-se depois o EGF da coluna com 12 litros de acetato de amónio 0,3 M (com uma condutividade de cerca de 19000 microohm)-

Carregaram-se alíquotas do eluído da coluna de permuta catiónica numa HPLC preparativa (Waters Delta prep. Modelo 3000) possuindo uma coluna C18, Waters, de compressão radial, com 50,8 mm (2 polegadas) de diâmetro, até um nível de carga de cerca de 14 mg de EGF por cm® de resina de fase inversa- A coluna usada era um cartucho Waters Prep Pak, empacotado com resina de fase inversa Vydac C18 (possuindo uma dimensão de partícula de 15-20 e um diâmetro de poro de, aproximadamente, 300 A). Prímeiramente lavou-se a coluna com cerca de 500 ml de uma mistura compreendendo 90% de A e 10% de B, com um caudal de cerca de 50 ml/minuto; 72 455 IPA-004 (DBE/SLC/ /SLH) “21” depois eluiu-se o EQF num gradiente linear de 40 minutos até 25% de B. Os solventes A e B foram os que se descreveram anteriormen-te para a HPLC analítica (ver, Exemplo 3). Recolheram-se amostras em alíquotas de 40 ml* com início cerca de 15 minutos após o início do gradiente linear e continuando-se durante um período de cerca de 15 minutos« A pureza de cada amostra de HPLC foi determinada por HPLC analítica (ver Exemplo 3). Reuniram-se as amostras obtendo-se uma pureza final superior a 95%«

Para remover o acetonítrilo e o TFA da fracção contendo EQF, carregaram-se as fracções reunidas numa coluna de permuta catiónica de 6 litros (resina Macrosorh KAX-CM), e lavou-se com ácido acético 0,05 M até a concentração de acetonitrilo ser inferior a 10 ppm« Depois eluiu-se o EQF com acetato de amónio 0,3 M-Filtrou-se o aluído através de um filtro de 0,2 μ e liofilizou-se até à secura« Na Tabela I resume-se a recuperação do EQF obtido em cada passo do processo da invenção -(Segue Tabela I)

72 455 IPA-004 (DBE/SLC/ /SLH )

TABELA I

RECUPERAÇÃO E PURIFICAÇÃO DO EOF A PARTIR DE CALDO CONTENDO ESP

Amostra Volume m. Concentração de EGF .(.9./1.1. EGF Total Lsi Recuperação por passo íll Recuperação Global Í.I1 Caldo Clarificado e Lavagem 210 0,225 47 — 100 Eluído da resina a granel 8 4,90 38,9 83 83 Descoloração 15 2,60 39,4 101 84 HPLC Preparativa 1 19,00 37,5 95 80 Remoção do aceto- nitrilo 15 20,00 30 80 64 Filtração estéril 15 1,83 27,5 92 58 Liofilização — 27,5 98 57

23 72 455 IPA-004 (DBE/SLC/ /SLH)

Os resultados resumidos na Tabela I demonstram que o processo do invento proporciona meios muito eficientes para a purificação de grandes volumes de meio contendo EOF. Consegue-se uma recuperação superior a 50% de EOF possuindo uma pureza de pelo menos 95%. 0 presente invento foi descrito em detalhe em relação a certas concretizações particulares, mas as variações e modificações razoáveis, dentro do espírito e âmbito da presente descrição, estão contempladas na presente descrição e nas reivindicações.

J

Claims (6)

1. 24 72 455 IPA—004 (DBE/SLC/ /SLH) REIVINDICAÇÕES lã Processo para a purificação de péptidos do factor de crescimento epidérmico (EGF), a partir de um meio contenda EGF, caracterizado por compreenders (a) fazer contactar o referido meio com uma quantidade suficiente de resina de fase inversa,, sob condiçSes adequadas para adsorver pelo menos 90% do referido EGF,, do referido meio. (b) eluir o EGF adsorvido, da referida resina contendo EGF do passo (a), fazendo contactar a referida resina com uma quantidade suficiente de um sistema solvente que seja suficientemente não polar para poder deslocar substancialmente todo o referido EGF da referida resina, (c) fazer contactar o eluído do passo (b) com uma quantidade suficiente de resina de permuta catiónica, sob condiçSes adequadas para adsorver pelo menos 95% do referido EGF do referido eluído, (d) . eluir o EGF adsorvido da referida resina de permuta catiónica, fazendo contactar a referida resina com pelo menos 1,5 volumes, em relação ao volume de resina de um sistema tampão possuindo uma força iónica suficiente para poder deslocar substancial-mente todo o referido EGF da referida resina e, em seguida, (e) submeter pela menos uma parte do EGF eluído, obtido no passo (d), a cromatografia líquida de elevado rendimento, de tipo preparativo (NPLC)„ 21„ Processo de acordo com a reivindicação i, caracterizado por o referido meio conter pelo manos 0,1 grama de EGF por litro do referido meio» 3ã„ Processo de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por o referido meio a partir do qual o EGF ê purificado ser o caldo de fermentação proveniente de uma operação de fermentação. 4ã» Processo de acordo com a reivindicação 3, caracterizado por o referido meio a partir do qual o EGF é purificado, ser o caldo de fermentação proveniente de uma operação de fermentação com elevada densidade de células.

   -25- 72 455 IPA-004 (DBE/SLC/ /SLH ) 5ã. Processo de acordo com a reivindicação 4* caracterizado por o referido meio* a partir do qual o EOF é purificado* ser o caldo de fermentação proveniente de uma operação de fermentação de leveduras com elevada densidade de células* tendo a referida levedura sido transformada com pelo menos um fragmento de AON capaz de exprimir EOF» 6ã» Processo de acordo com a reivindicação 5* caracterizado por as referidas leveduras serem seleccionadas de entre o género Pichia- 7ã. Processo de acordo com a reivindicação 5* caracterizado por a referida levedura ser a estirpe G+EGF819S4 de P. pastoris. Sã* Processo de acordo com a reivindicação 5* caracterizado por os materiais em partículas e celular serem separados do caldo de fermentação antes do contacto contemplado pelo passo (a)« 9ã» Processo de acordo com a reivindicação 1* caracterizado por a referida resina de fase inversa ser seleccionada de entre resinas resinas CN (ciano)* resinas NH2 (arnino) ou resinas fenilo. lOã» Processo de acordo com a reivindicação 9* caracterizado por a referida resina de fase inversa ser uma resina do tipo 0^9 » lli. Processo de acordo com a reivindicação 10* caracterizado por se empregar* pelo menos* 30 gramas por grama de EOF no referido meio* da referida resina de fase inversa» 12ã» Processo de acordo com a reivindicação 1* caracterizado por 0 referido contacto contemplado pelo passo (a) se realizar durante um período de tempo na gama de cerca de 0*1 até 8 horas* a uma temperatura na gama'de cerca de 4 a 40°C» 13ã» Processo de acordo com a reivindicação 1* caracterizado por a referida resina contendo EOF ser separada do caldo desprovido de EQF* do passo (a)* antes de se realizar a eluição contem- 72 455 IPA—004 (DBE/SLC/ /SLH) plada pelo passo (b}« 141» Processo de acordo com a reivindicação 13, caracteriza-do por ai referida separação se realizar por filtração, decantação ou centrifugação»
2. 151. Processo de acordo com a reivindicação 14, caraeteriza-do por a referida separação se realizar por filtração»

   161» Processo de acordo com a reivindicação 12, caraeteriza-do por o referido contacto se realizar por passagem do meio contendo EGF por uma colunai contendo a referida resina de fase inversa» 171» Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por, antes do passo (b), a referida resina ser feita contactar com entre cerca de .1 e 10 volumes, em relação ao volume de resina, de um ácido fraco, diluído, ácido fraco diluído esse que é em seguida removido da referida resina contendo EGF» 131» Processo de acordo com a reivindicação 17, caracterizado por o referido ácido fraco, diluído, ser seleccionado de entre uma solução de ácido acético, fórmico ou fosfórico 0,05 M.

   26- 191« Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por os solventes adequados para a eluição do passo <b) serem se-leccionados de entres misturas de álcoois, aquosas, contendo pelo menos um álcool pos--suindo até 4 átomos de carbono, acetonitrilo aquoso, cetonas possuindo até 6 átomos de carbono, éteres cíclicos, ou poliéteres cíclicos, possuindo até 6 átomos de carbono»
3. 201. Processo de acordo com a reivindicação 10, caracterizado por o solvente empregue na eluição do passo (b) ser etanol aquosa a 38%»

   72 455 IPA—004 {DBE/SLC/ /SLH) 21ã» Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a resina de permuta catiónica ser seleccionada de entre earboximeti1celulose, earboximeti1-sephadex, sulfopropilcelulose ou sulfopropi1-sephadex» 22i. Processo de acordo com a reivindicação 21, caracteriza-do por o contacto do caldo parcialmente purificado com a resina de permuta catiónica se realizar durante um período de contacto de pelo menos i minuto e a uma temperatura entre cerca de 4 e 40° C. 23ã. Processo de acordo com a reivindicação 22, caracteriza-do por a resina de permuta catiónica ser carboximetilcelulose ou carboximetil-sephadex. 24ã» Processo de acordo com a reivindicação 22, caracteriza-do por a referida resina de permuta catiónica ser carboximetilcelulose » 25â» Processa de acordo com a reivindicação 24, caracteriza-do por a referida resina de permuta catiónica ser activada/rege— nerada por contacto sequencial com acetato de sódio .1,0 N, hidróxido de sódio 0,1 N e, em seguida, com áicido acético 0,2 M. 2éã„ Processo de acordo com a reivindicação 24, caracteriza— do por a quantidade de resina de permuta catiónica empregue estar dentro da gama de cerca de 0,25 até i litro, por grama de EGF no referido eluído» 27§. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a resina contendo EGF, produzida no passo (c), ser feita contactar com uma quantidade suficiente de uma solução de ácido fraco, diluído, para reduzir a absorvSncia, a. 400 manómetros, do efluente proveniente do referido contacto, a 0,1 U»A„, ou menos, em relação a um branca da referida solução de ácido fraco, diluído» 28=1» Processo de acordo com a reivindicação 27, caracteriza- 72 455 IPA-004 (DBE/SLC/ /SLH) -28~ do por o ácido fraco diluído ser seleccionado de entre uma solução de ácido acético, ácido fórmico ou de ácido fosfórico 0,05 M» 29ã» Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o referido sistema tampão possuindo uma força iónica suficiente para deslocar substancialmente todo o referido EOF da referida resina, ter uma força iónica de pelo menos 0,1 iões-g/1 e ser seleccionado de entre acetato de amónio, formato de amónio, acetato de sódio, acetato de potássio ou cloreto de sódio» 30ã» Processo de acordo com a reivindicação 29, caracterizado por o referido sistema tampão possuindo uma força iónica de pelo menos 0,1 iões-g/1 ser o acetato de amónio 0,3 M» 311» Processo de acordo com a reivindicação 30, caracterizado por se empregar na eluição do EGF da referida resina de permu ta catiónica, o referido sistema tampão n.a gama de cerca de 1,5 até 3 volumes, por volume da referida resina» 32ã. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o pH do EOF eluxdo, obtida no passo (d), ser ajustado antes do passo (e), adicionando-lhe uma quantidade suficiente de ácido trífluoroacético (TFA), de modo que a referida solução contenha cerca de 0,1% de TFA» 33ã» Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a coluna de HPLC, na qual a solução contendo EGF é carregada, ser seleccionada de entre resinas C3-0^3? resinas CN (ciano), resinas NHj> (amino) ou resinas fenilo» 34â» Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a referida resina de fase inversa ser uma resina do tipo C^q» 3Sã» Processo de acordo com a reivindicação 34, caracterizado por 0 sistema solvente inicial, empregue no passo de HPLC ser suficientemente não polar para provocar a eluição de impurezas menos hidrofóbicas do que o EGF, mas não tão não polar que provo- 29- IPA—004 (DBE/SLC/ /SLH) que a eluição cie quantidades significativas de EGF« 3é§. Processa de acordo com a reivindicação 35, caracteriza-do por o referido sistema solvente inicial compreenders uma solução aquosa contendo (3,1% de ácida trifluoroacético, e até 157. de uma mistura de 957« de acetonitrilo~57„ de água contendo 0,17. de TF A. 37ã. Processo de acordo com a reivindicação 33, caracteriza-do por o sistema solvente empregue na eluição do EGF da HPLC ser um sistema solvente misto compreendendo um componente aquoso e um componente orgânico, sendo o referido sistema solvente misto suficientemente não polar para provocar a eluição do ESF, mas não tão não polar que provoque a eluição de quantidades significativas de materiais que estejam mais fortemente ligados ao suporte de HPLC do que o EGF. 38ã» Processo de acordo com a reivindicação 37, caracteriza-do por a eluição do EGF da HPLC se realizar por aumento gradual da proporção do componente orgânico, no referido sistema solvente misto, em relação à proporção do componente aquoso do sistema solvente misto, durante o decurso da eluição, 39ã» Processo de acordo com a reivindicação 38, caracteriza-do por o sistema solvente compreenders uma concentração inicial de até 1007 de uma solução aquosa contendo 0,17. de ácido trif luoroacético que diminui até uma concentração final tão baixa como 50%, uma concentração inicial tão baixa como 0% de uma mistura aquosa de acetonitrilo contendo 0,1% de TFA, até uma concentração final de 50%, contendo o referida acetonitrilo aquoso até 20% de água. 40â. Processo de acordo com a reivindicação 39, caracteriza-do por compreender os passos adicionaiss (f) fazer contactar o eluido do passo (e) com uma quantidade suficiente de uma resina de permuta catiónica, sob condiçSfes adequadas para adsorver pelo menos 95% do referido EGF do referido eluido,

   IPA—004 (DBE/SLC/ /SLH) -30- (g) fazer contactar a resina contendo EGF, produzida no passo (f), com uma quantidade suficiente de uma solução de ácido fraco, diluído, para reduzir a concentração de acetonitrilo a não mais do que 10 mg/1, e (h) eluição do EOF adsorvido da referida resina de permuta catiónica, fazendo contactar a referida resina com pelo menos 1,5 volumes, em relação ao volume de resina, de um sistema tampão tendo uma força iónica suficiente para deslocar substancialmente todo o EGF da referida resina»

   41ã„ Processo de acordo com a reivindicação 40, caracteriza-do por a referida resina de permuta catiónica ser earboximeti3.ee-1u1ose„ 42â. Processo de acordo com a reivindicação 40, caracteriza-do por o referido ácido fraco diluído ser seleecionado de entre uma solução de ácido acético, ácido fosfórico ou ácido fórmico 0,05 M. 43ã» Processo de acordo com a reivindicação 40, caracteriza-do por o referido sistema tampão tendo uma força iónica suficiente para deslocar substancialmente todo o referido EGF da referida resina, ser o acetato de amónio 0,3 M» 44ã» Processa de acordo com a reivindicação 40 caractarizado por o eluido do passo (h) ser liofilizado até à secura» 45ã» Processo de acordo com a reivindicação 44, caracteriza-do por, antes de ser liofilizado, o eluido do passo (g) ser filtrado através de um filtro porosa, tendo um tamanho de poro não superior a 0,45 micron. 4óã. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o factor de crescimento epidérmico ser seleecionado de entre factor de crescimento epidérmica humano nativo (1-53 EGF), análogo (1-48) de hEGF, análogo (1-51) de hEGF, análogo (1-52) de hEGF, bem como de péptidos substancialmente homólogos a estes» 31- 72 455 IPA-004 (DBE/SLC/ /SLH ) 47ã„ Processo de purificação de péptidos de factor de crescimento epidérmico humano (hEGF) a partir de um meio contendo hEGF, sendo o referido meio contendo hEGF o caldo de fermentação proveniente de uma operação de fermentação de leveduras com elevada densidade de células e em que as referidas leveduras estão transformadas com pelo menos um fragmento de AON capaz de exprimir hEGF, caracterizado por compreender; (a) fazer contactar o referido meio com uma quantidade suficiente de uma resina de fase inversa e sob condições adequadas para ad~ sorver pelo menos 90% do referido hEGF do referido meio, sendo a referida resina de fase inversa uma resina do tipo C^g., empregando-se pelo menos 30 gramas da referida resina de fase inversa por grama de hEGF, no referido meio, e realizando o referido contacto por um período de tempo variando entre cerca de 0,1 até 8 horas, a uma temperatura na gama de cerca de 4 a 40 0C, (b) a separação da resina contendo hEGF do referido meio desprovido de hEGF, (c) fazer contactar a resina contendo hEGF com pelo menos 1 volume, por volume de resina, de um ácido fraco diluído, sendo o ácido fraco diluído uma solução de ácido acético 0,05 M, em seguida remover o ácido fraco diluído da resina contendo hEGF, (d) eluir o hEGF adsorvido da referida resina contendo hEGF do passo (c), fazendo contactar a referida resina com uma quantidade suficiente de um sistema solvente que é suficientemente não polar para deslocar substancialmente todo o referido hEGF da referida resina, (e) fazer contactar o eluido do passo (d) com uma quantidade suficiente de uma resina de permuta catiónica, sob condições adequadas para adsorver pelo menos 95% do referido hEGF do referido eluido, (f) fazer contactar a resina contendo hEGF, produzida no passo (e), com uma quantidade suficiente de uma solução de ácido fraco diluído, para reduzir a absorvância, a 400 nanómetros, do efluente proveniente do referido contacto, a 0,1 U„A«, ou menos, em relação a um branco da solução de ácido fraco, diluído, (g) eluir o hEGF adsorvido da referida resina de permuta catiónica, fazendo contactar a referida resina com, cerca de 1,5 a 3 volumes de um sistema tampão, contendo acetato de amónio 0,3 M, 72 455 IPA-004 (DBE/SLC/ /SLH) -32- ern relação ao volume de resina, (h) ajustar o pH do hEGF eluído, obtido no passo (g), adicionando-lhe uma quantidade suficiente de ácido trifluoroacético, de modo que a referida solução contenha 0,1% de TFA, (i) carregar pelo menos uma parte do hEGF com pH ajustado, eluído, obtido no passo (h), numa coluna de cromatografia líquida de alto rendimento do tipo preparativo (HPLC), (j) tratar, inicialmente, a coluna carregada com cerca de 1 a 2 volumes, da coluna, de um sistema solvente que é suficíentemente não polar para eluir as impurezas menos hidrofóbicas do que o hEGF, mas não tão não polar que provoque a eluição de quantidades significativas de hEGF e, em seguida, (k) eluir o hEGF purificado da referida HPLC, empregando um sistema solvente misto, compreendendo um componente aquoso e um componente orgânico, sendo o referido sistema solvente suficientemente não polar para eluir o hEGF, mas não tão não polar que provoque a eluição de quantidades significativas de materiais que estejam mais fortemente ligados ao suporte de HPLC do que o hEGF.
4. 481. Processo de acordo com a reivindicação 47, caracteriza-do por o sistema solvente empregue no passo (j) compreendera 90% de uma solução aquosa contendo 0,1% de ácido trifluoroacé-tico, e 10% de uma mistura de 95% de acetonitrilo-5% de água, contendo 0,1% de TFA.
5. 491. Processo de acordo com a reivindicação 47, caracteriza-do por o sistema solvente misto, empregue na eluição do hEGF da referida HPLC, compreenders uma concentração inicial de 90% de uma solução aquosa contendo 0,1% de ácido trifluoroacético, diminuindo até uma concentração final de 75%, e uma concentração inicial de 10% de uma mistura de 95% de acetonitrilo-5% de água, contendo 0,1% de TFA, aumentando até uma concentração final de 25%.
6. 501. Processo de acordo com a reivindicação 47, caracteriza-do por compreender os passos adicionais:: 72 455 IPA-004 (DBE/SLC/ /SLH) -33- (l) fazer contactar o eluído do passo (k) com uma quantidade suficiente de uma resina de permuta catiónica, sob condições adequadas para adsorver pelo menos 95% do referido hEQF do referido eluído, (m) fazer contactar a resina contendo hEGF, produzida no passo (1), com uma quantidade suficiente de uma solução de um ácido fraco, diluído, para reduzir a concentração de acetonitrilo, no efluente, a não maís do que 10 mg/1 e, em seguida, (n) eluir o hEGF adsorvido da referida resina de permuta catiónica, fazendo contactar a referida resina com pelo menos 1,5 volumes, em relação ao volume de resina, de um sistema solvente possuindo uma força iónica de cerca de 0,3 iões-grama/l- Slã» Processo de acordo com a reivindicação 50, caracteriza-do por a referida resina de permuta catiónica ser carboximetilce-lulose» S2â» Processo de acordo com a reivindicação 50, caracteriza-do por o ácido fraco diluído ser uma solução de ácido acético 0,05 M» 53ã» Processo de acordo com a reivindicação 52, caracteriza-do por a referida resina de permuta catiónica ser activada/rege-nerada por contacto sequencial com acetato de sódio 1,0 N, hidróxido de sódio 0,1 N e, em seguida, com ácido acético 0,2 N» 54ã» Processo de acordo com a reivindicação 50, caracteriza-do por o referido sistema tampão ser acetato de amónio 0,3 M» 55â» Processo de acordo com a reivindicação 50, caracteríza- do por o eluído do passo (h) ser líofílizado até à secura» 56â. Processo de acordo com a reivindicação 55, caracteriza- do por o eluído do passo (g), antes de ser líofílizado, ser fil trado através de um filtro poroso possuindo um tamanho de poro não maior do que cerca de 0,45 micron» 72 455 IPA—004 (DBE/SLC/ /SLH) —>34“ Lisboa [ Por INDU PARIKH 0 AGENTE OFICIAL