PT97277B

PT97277B - Processo para a preparacao de formulacoes farmaceuticas, contendo, por exemplo, ciclosporina a e factor de veneno de cobracapelo, uteis para a inibicao da rejeicao de aloenxerto e de xenoenxerto concordante

Info

Publication number: PT97277B
Application number: PT97277A
Authority: PT
Inventors: David James Graham White; Johan Beyers Van Den Bogaerde
Original assignee: Imutran Ltd
Priority date: 1990-04-09
Filing date: 1991-04-08
Publication date: 1998-08-31
Also published as: AU7555591A; DE69121401T2; CN1040178C; EP0527762A1; HK48597A; PT97277A; ZA912467B; IE911153A1; WO1991015221A1; JPH05507266A; JP3518547B2; SK279949B6; EP0527762B1; IL97788A0; NZ237739A; GR3021642T3; ES2090325T3; DE69121401D1; CN1056240A; IN173149B

Description

DESCRIÇÃO

DA

PATENTE DE INVENÇÃO

N.° 97.277

REQUERENTE: IMUTRAN LIMITED., britânica, industrial, em 21 Holborn Viaduct, London EC1A 2DY INGLATERRA

EPÍGRAFE: "processo para a preparação de formulações

FARMACÊUTICAS, CONTENDO, POR EXEMPL.0, CICLOS PORIN-A A Ε FACTOR DE VENENO DE COBRACAPELO, UTEIS PARA A INIBIÇÃO DA REJEIÇÃO DE ALOEN XERTO È DE XENOENXERTO CONCORDANTE"

INVENTORES: DAVID JAMES GRAHAM WHITE; JOHAN BEYERS VAN

DEN BOGAERDE

Reivindicação do direito de prioridade ao abrigo do artigo 4.° da Convenção de Paris de 20 de Março de 1883.

REINO UNIDO, em 9 DE ABRIL DE 1 990, SOB O No.GB9007971 - 6

INPI. Moa 113 RP 18732

Cf 2-

IMUTRAN LIMITED "PROCESSO PARA A PREPARAÇSD DE FORMULAÇÕES FARMACÊUTICAS, CONTENDO POR EXEMPLO, CICLOSPORINA A E FACTOR DE VENENO DE COBRA-CAPELO, ÚTEIS PARA A IMÍBÍÇKO DA REJEIçSO DE ALOENXERTO E DE XENOENXERTO CONCORDANTE"

MEMóRIA

1RITIVA

RESUMO

O presente invento diz respeito um processo para preparação de uma formulação farmacêutica que consiste em

incluir na referida formulação ciclosporina A, ou outro composto tendo uma actividade semelhante à da ciclosporina A, e factor veneno de cobra-capelo, ou outro inibidor do complemento, os quais podem ser usados em conjunto um com o outro para a promoção da sobrevivência do aloenxerto e do xenoenxerto concordante e para evitar que esses enxertos? sejam rejeitados,

Este invento relaciona-se com formulações farmacêuticas tratamento da rejeição crónica de aloenxertos e d-a

úteis ηε rejeição de xenoenxertos concordantes. 0 invento relaciona-se assim com a promoção da sobrevivência do enxerto, ou com a prevenção da perda do enxerto, num hospedeiro» aloenxerto é a transplantação de tecido entre dois membros da mesma espécie» 0 xenoenxerto, que consiste na transplantação de tecidos entre duas espécies diferentes, foi dividido por meio de critérios biológicos em dois subenxertos (Calne, Transplant. Proc. II 550-556 CÍ970))» Os dois subenxertos são xenoenxertos concordantes e xenoenxertos discordantes» A distinção entre estes dois subenxertos consiste no facto de um enxerto de orgão vasculsrízado transplantada entre espécies discordantes e rejeitado hiperagudamente, ou seja no espaço ds alguns minutos ou horas de revascularização. Entre espécies concordantes, a rejeição hiperaguda de xenoenxertos não se verifica. Os enxertos, contudo, serão rejeitados, e frequentemente de um modo acelerado, mas isto irá ocorrer no espaço de vários dias e não no espaço de horas ou minutos»

Pensa-se geralmente, embora não exista para este facto uma evidência formal, que entre espécies discordantes a rejeição hiperaguda é um resultado da acção de anticorpos que ocorrem naturalmente contra a espécie do dador» Os enxertos concordantes, por outro lado, sobrevivem pelo menos durante um curto periodo de tempo visto não estarem presentes esses anticorpos capazes de causar a sua destruição» Existem muitos exemplos na bibliografia para demonstrar esta diferença» Talvez os mais elegantes sejam os de Hammer Cem "Xenograft 25" CMark A. Hardy, Ed) Elsevier, Amsterdam (1989>>. Usando sempre o cão como espécie recipiente, Hammer indica os tempos de sobrevivência dos enxertos de rim como sendo os seguintes

	Cão-cão	í 1 β ‘τ· O „'L 3. S
	Cão Selvagem da Austrália-cão	11,5 dias
	Lobo—cão	19,4 dias
	Raposa-cão	6,5 dias
	Leão—cão	10—24 horas
	Tigre-cão	10-24 horas
	Vi t â O	10-24 horas
	Po r c o—cão	10—30 minutos

xert tos □= dis seriai»

As quatro últimas int cordantss, enquanto q concordantes„ Hsmeier ri ·ι «i ausência, respectivamente, de espécies critzsdas.

eracçSes seriam nesta base xencenue os quatro primeiros xsnoenxerequacionou estas diferenças entre concordantes, com a presença au anticorpos bemoaglutinantes de

Num nível académico, existem algumas dificuladades isoladas no que se refere ao que é essencialmente um definição de trabalho sobre as relações entre espécies concordantes e discordantes. Sob um ponto de vista prático, contudo, tendo como finalidade o presente invento, duas espécies diferentes são consideradas como relacionadas de um modo concordante se não houver uma rejeição hiperaguda de um xenoenxerto de uma espécie para a outra» Assim, tendo como finalidade o presente invento, as espécies relacionam-se concordantemente se, embora, mesmo normalmente não viessem a dar origem a uma rejeição hiperaguda, tenham contudo sido submetidas a um processo, pior exemplo manipulação genética, de modo a evitar a. rejeição hiperaguda» O Requerimento da Patente Internacional F'CT/GB*?0/0Í575 por exemplo relaciona-se em apresentações específicas com animais dadores de xenoenxertos que foram modificados transgénicamente para expressar reguladores do complemento do recipiente (tais como factor acelerador do enfraquecimento <DAF) ou proteina cofactor da membrana ÍMCP)>

Os orgãos dos animais dadores não são rejeitados -hiperagudamerite quando enxertados num animal que seria normalmente encarado como de uma espécie relacionada discordantemente. Assim, tendo como finalidade este invento, esses animais dadores transgénicos podem se/'· encarados como relacionados concordantemente com as suas espécies alvo pretendidas.

Exemplos de espécies tendo uma relação concordante, tal como foi definido -rato s primata anteriormente, incluem lebre-coelho, cricetonão humano-humano, incluindo, por exemplo, babuíno-humano, chimpanzé-humano e macaco-humano.

de al

A promoção da sobrevivência do enxerto foi alvo de atenção tanto no campo dos xenoenxertos ídiscordantes e concordantes) e aloenxertos» Aproveitando as primeiras sugestões que foram feitas para a promoção da sobrevivência do xenoenxerto discordante, Adachi et al (Transplant. Proc„ XIX (1) í149-1152)} estudaram a sobrevivência de xenoenxertos cardíacos discordantes em ratos. Entre os potenciais promotores de sobrevivência encontraram-se a ciclosporina A, a aspirina e o factor veneno de cobra-capelo» Adicionalmente, foi estudada a combinação ciclosporina A e de factor veneno de cobra—capelo. Adachi et referem que "no nosso estudo, não se verificou uma diferença estatisticamente significativa no tempo de sobrevivência médio entre o grupo tratado com ciclosporina A e factor veneno de cobra-capelo ε o grupo tratado apenas com factor veneno de cobra capelo”. Ds tempos de sobrevivência médios variaram entre 40 e 50 horas» Kemp etg al (Transplant. Proc. XIX (6) 4471-4474 (1987)) também estudaram vários potenciais promotores da sobrevivência de xenoenxertos discordantes num estudo de xenoenxertos de rim de coelho em gatos. Os promotores de sobrevivência candidatos incluíram captopril, enalapril, nifedipina, prostaciclina, cromoglicato de sódio, uma combinação azatioprina/corticosteroide, ciclos-

pariria A e factor veneno de cobra-capelo» A rejeição hiperaguda não foi evitada por qualquer uma destas droqas candidatas exceptuando o factor veneno de cobra-capelo o qual, afirmaram os autores, "apresentou um efeito notável, com prolongamentos da sobre— viVÈínciâ do enxerto atê sete dias”.

A rejeição do xenoenxerto concordante foi estudada por Hardv et al (Transp1an ta tion 33 (3) 237-242 (1982)), que examinaram o efeito da irradiação linfoide selectiva (SLI) com paládio-109-hematoporfirina combinada com globulina. antilinfocito, uma terapêutica que é principalmente dirigida contra a rejeição mediada pelas células T« Os tempos de sobrevivência, médios foram da ordem dos 12,5 dias, em comparação com controlos não tratados que sobreviveram durante 2,9 dias- em média» Homan et al (Transplantation 31 (3) 164-166 (1981)) estudaram o efeito da ciclosporina A na promoção da. sobrevivência do xenoenxerto concordante» A melhor sobrevivência foi para uma média de 21 dias, em comparação com 2 dias para os controlos não tratados» Monden et al (Transplantation 43 (5) 745-746 (1987)) estudaram xenoenxsrtos do fígado criceto-para-rato e verificaram que a ciclosporina A não apresentava um efeito promotor da sobrevivência significativo em comparação com controlos não tratados» Valdevere et al (Transρ1ant» Proc» XIX Cl) 1158-1159 (1987)) também estudaram xenoenxertos do fígado criceto-para—rato e verificaram uma melhoria significativa no tempo de sobrevivência do enxerto, em comparação com os controlos, quando a ciclosporina A foi administrada em conjunção com ssplenectomia; a sobrevivência melhorou uma média de 3,6 dias até uma média de 17,6 dias» Knechtle et al (Transqlant» Proc» XÍX (í) 1137-1139 (1987?)=, tal como o grupo Hardy et al referido anteriormente, estudaram o efeito da irradiação linfoide total (TLI), mas desta vez em conjunção com a terapêutica com a ciclosporina A, sobre a promoção da sobrevivência do xenoenxerto concordante,

Referiram que.

nos xenoen xertos ό

cardíacos c ricsto-pa pro1ongava si gnifica recipiente ocasional ra-rato, a ciclosporina A em doses elevadas tivamente a sobrevivência, mas apenas um apresentou função do enxerto a longo prazo.

TL.I em combinação com a ciclosporina A promoveu, ainda mais significativamente a sobrevivência do enxerto.

A terapêutica convencional contra a rejeição do aloenxerto consiste em usar ciclosporina A ou por sí só ou em combinação com esteroides ou azatioprin ou ambos. Na opinião de alguns, a combinação de terapêuticas triplas não representa uma melhoria em relação á terapêutica usando ciclosporina A isoladamente. Estas terapêuticas são eficazes na prevenção e reversão da rejeição aguda do enxerto, e provávelmente retardam o início da rejeição crónica do enxerto, mas parece apresentarem um efeito pequeno ou nulo sobre a reversão da rejeição crónica após o seu início.

presente invento procura promover a melhor sobrevivência, ou evitar a rejeição, de xenoenxertos e/ou aloenxertos, 0

invento baseia-se na j	per	ceção de que a sobr
xertos concordantes,	e	também a sobrevivên*
pode ser acentuadamen	te	aumentada por tratam*
ção de ciclosporina A		de factor veneno de *
combinação de composti	os	apresentando modos s-

xenoenih^-í naDe acordo com um primeiro proporciona-se uma formulação inibidor do complemento e um semelhante à da ciclosporina A» aspecto do presente invento, farmacêutica compreendendo um iíBunossuprsssor com actividade

As formulações farmacêuticas de acordo com o invento têm assim dois componentes, pelo menos, Um primeiro composto ê um inibidor do complemento, 0 inibidor do complemento pode ou evitar activação do complemento ou fazer a sua remoção ou ds um ou mais dos seus componentes» De preferência., o complemento irá inibir as vias tanto clássica como do complemento» ή assim preferido que o actue a fim de bloquear a via em C3, seja por o ou deplecção» 3erà. assim tomado sm consideração

pos deplecção, inibidor alfcernativa inibidor do inibi, que podem invento» activaco? setor ds membrana do complemento mais preferidos é

Cpor exemplo anticorpos monoclonais) contra como o inibidor do complemento no presente

C3 a

ou do da activação complemento ção, remoçã anticor ser usados Outros inibidores do complemente?

en f r a q uecimen to C DAF) e CMCP>« Um dos inibidores veneno de cobra-capelo.

çao uo solúvel o facor úteis incluem factor de proteína anima

Os venenos de cobra mais complexas, contendo constituem uma das secreções um vasto número de substâncias com diferentes actividades farmacológicas e bioquímicas» ft presença effi venenos de princípios que afectam o complemento já é conhecida há quase um século» A acção do veneno da cobra-capelo íNaja naja kaouthia) sobre o complemento do soro foi estudada com

um certo detalhe» 0 factor activo é uma glicoproteina com um peso molecular de 144kDa, que se combina com o factor B do soro na presença de iSes de magnésio. Q factor B é então dividido em dois componentes pela acção proteoiítica do factor D do soro, criando 8b e Ba» 0 complexo CoF-E«b, onde CoF representa o factor veneno de cobra-capelo, é um enzima ou convertas© altamente activo fazendo a divisão em C3 e C5» Contudo, diferentemente das convertases normais em C3 e C5_S o CoF—Bb é resistente aos sistemas reguladores do complemento normal» Assim, a sua acção irá continuar, até todo o C3 ter sido convertido, fazendo assim a deplecção eficaz da actividade do complemento individual» A divisão de Co liberta C5a, que apresenta acção anafilactóide? nem todos os factores de veneno de cobra—capelo Na ja possuem esta actividade converta.se de C5. mas não se pensa que este facto seja importante ~

para a finalidade do presente invento» A inibição do complemento não se restringe a venenos do género Na ja» Eggertsen et al (Toxxcon 18 87-96 (1980)} estudaram venenos de cobras das famílias Elapidae Viperidae e Crotalidae. Dos 26 venenos estudados, 22 apresentam a capacidade de inibir a actividade do complemento humane? normal» A análise da estrutura do factor veneno da cobra-capelo sugere que seja o equivalente do C3 da cobra-capelo ou um seu. produto de degradação parcial» factor veneno de cobra-capelo, e factores veneno ds outras cobras, não serão geraimente administrados no presente invento na sua forma nativa, devido a óbvios problemas de toxicidade. Na ausência de outras medidas para combater o problema da toxicidade, será, assim, geraimente necessário, pelo menos parcialmente, purificar o factor activo a partir do veneno crú» Não é necessário que o veneno da cobra-capelo ou de outra cobra seja purificado até è homogeneidade para utilização no presente invento, mas é evidente que pelo menos problemas reguladores se não outros, levam a prescrever utilização do factor substancialmente purificado» 0 factor veneno de cobra-capelo, sob a forma de uma preparação semí-purifiçada, pode ser obtida a partir de fornecedores químicos tais como Sigma (Sigma Chemicals Limited, Poole, Dorset), que também fornecem veneno de cobra—capela crú para purificação pelo utilizador» Um exemplo de um processo preparativo para o factor veneno de cobra-capelo é indicado nos exemplos»

Será tomado em consideração que, para além da utilização do factor outras cobras, acti vos.? poef em veneno de cobra-capelo natural e de factores de análogos desses factores (incluindo fragmentos ser usados neste mvento, tal como acontece com factores sintéticos incluindo os produzidos por tecnologia de ADN recombinante» A catacterística de CoF que? o torna apropriado para utilização no presente invento é a sua capacidade para formar um complexo estável com o factor Bb que é resistente ao mecanismo normal de decomposição» Outras moléculas apresentando esta característica são assim também preferidas para utilização no invento»

Um segundo componente das formulações farmacêuticas de acordo com sste invento é constituído por um imunes-supressor com actividade semelhante à da ciclosporina A» Esses compostos são do conhecimento dos especialistas nesta técnica & incluem ciclospo-rinas diferentes da ciclosporina A, tais como ciclosporina C e ciclosporina Θ» Os eicosanoides também apresentam actividade semelhante à da ciclosporina A e incluem (prostacic 1 ina), F'QE.-j, F‘GD„, rapamicina e FK 5©6 íFujisawa). 0 composto FK 506 é um dos que é preferido para utilização no presente invento, mas o mais preferido é a própria ciclosporina A» A ciclosporina A é fornecida por Sandoz sob o nome comercial de SANDIMUN»

Uma apresentação particularmente preferida do presente invento é uma formulação farmacêutica que compreende factor veneno de cobra—capelo a ciclosporina A, dois dos compostos individuais mais preferidos discutidos anteriormente»

Será tomado em consideração que podem estar presentes outros ingredientes nas formulações farmacêuticas de acordo com o invento» Estarão usualmente presentes excipientes, e a presença de outros ingredientes activos não é excluída» Podem estar presentes mais de um ingrediente activo de cada categoria»

Será tomado em consideração gue os ingredientes acti não têm necessáriamente oue ser co-administrados numa unica formulação» Assim, de acordo com um segundo aspecto do presente invento, é proporcionado um produto contendo um inibidor do @

complemento a um imunossupressor com uma actividade semelhante à da ciclorporina A para utilisação como uma preparação combinada para utilisação simultânea, separada ou sequencial na promoção da sobrevivência ou para evitar a rejeição do aloenxerto ou do xenoenxerto concordante»

De acordo com um terceiro aspecto do invento, proporciona-se um estojo compreendendo uma preparação farmacêutica de ura inibidor do complemento e uma. preparação farmacêutica de um imunossupressor com actividade semelhante à da ciclosporina A»

A) ciclosporina A e outros imunossupressores comi uma -actividade semelhante è. da ciclosporina A serão usualmente administrados parentéricamente na prática do presente invento. Nesses casos, a preparação contendo imunossupressor será estéril» Contudo, a própria ciclosporina A, e alguns outros imunossupressores, podem ser administrados oralmente, caso esse em que a esterilidade não constitui um factor essencial» A própria ciclosporina A é apenas ligeiramente solúvel em água e para fins de ordem prática é preferido dissolve-la num óleo, tal como um óleo vegetal» Verificou-se ser aceitável na prática o aseite» A dissolução em óleo só é necessária quando se trata de um imunos— supressor que não é solúvel na água, e em termos gerais, o imunossupressor pode ser dissolvido em qualquer veículo fisiológicamente aceitável apropriado» Nalguns casos, a dissolução pode mesmo não ser necessária» A concentração â qual o imunossupressor é preparado dependerá, evidentemente, da natureza do próprio imunossupressor e da dose pretendida, que dependerá geralmente da orientação do médico assistente» Regra geral, contudo, foi considerado apropriado preparar formulações da ciclosporina com uma concentração variando entre 1 ε 10Θ mg/ml, por exemplo entre IO mg/ml, tipicamente entre cerca, de 5 mg/ml paira utilisação n »— .t fc?

ii

parentérica ou 25 a 10© mg/ml, por exemplo entre 5© e 10© mg/ml. tipicamente cerca de 100 mg/ml para administração oral..

Inibidores do complemento tais como factor veneno ds cobra-capelo serão gsralmente administrados parentericamente e para esta via serão geralmente estéreis» 0 próprio factor veneno de cobra-capelo poda ser formulado em solução salina tamponada com fosfato ísem azeto) ou em qualquer outro solvente ou veículo apropriado» Pode acontecer que venham a ser preparadas formulações por via oral. A concentração do inibidor do complemento numa formulação farmacêutica irá depender de novo da dose final pretendida, que será orientada pelo médico assistente» Regra geral, contudo, uma preparação de factor veneno de cobra-capelo em PBS pode ser feita com uma concentração variando entre ©,©5 mg/ml e acima até ao limite da solubilidade, o que irá depender da sua pureza» Composições tendo uma concentração até 5 mg/ml podem ser úteis na prática, por exemplo as que têm uma concentração variando entre ©,1 e 2 mq/ml, por exemplo cerca de ®,5 mq/ml»

Porque a cefalosporina é essencialmente não solúvel em meio aquoso, enquanto que o factor veneno de cobra-capelo o é, estes dois ingredientes activos preferidos serão geralmente formulados separadamente e administrados separadamente na. prática» Contudo, isto não é em princípio essencial, visto ser possível formular uma emulsão apropriada dos dois ingredientes activos, e diferentes combinações dos ingredientes activos podem ser solúveis num solvente comum ou pelo menos podem ser suspensos .num veícu1o comum.

Poi feita referência anteriormente à injecção parentérica» 0 sitio preferido para a injecção é α músculo, devido ao efeito depot resultante de uma injecção intramuscular» Contudo, a injecção intravenosa, pode ser apropriada nalgumas circunstancias

s a injecção subcutânea pode apresentar algumas senão todas as vantagens da injecção intramuscular. A injecção intraperitoneal pode ser usada se as circunstancias α ditarem,

De acordo com um quarto aspecto do presente invento, proporciona-se a utilização de um inibidor do complemento e de um imunossuprsssor com uma actividade semelhante ã da ciclosporina ft na preparação ds um agente para a promoção da sobrevivência ou para evitar a rejeição de um aloenxerto ou de um xenoenxerto concordante. Será assim tomado em consideração que o invento tem aplicação num método para a promoção da sobrevivência ou para evitar a rejeição de um aloenxerto ou de um xenoenxerto concordante, num hospedeiro, compreendendo o método a administração a um recipiente de enxerto ou a um recipiente de enxerto projectado de um inibidor do complemento ou. de um imunossupressor com uma actividade semelhante ã da ciclosporina A,

Pode ser preferível em muitos casos pré-administrar alguns ou todos os ingredientes activos úteis neste inventa antes de se realizar a cirurgia para enxerto, Deve ser tomado em consideração que uma vantagem principal do presente invento quando se relaciona com aloenxertos consiste no facto da combinação de ingredientes activos útil no presente invento ser útil para a prevenção da rejeição crónica ou para regular a rejeição crónica (isto é evitar a rejeição) após o seu início? isto acontece usualmente muitos anos após a transplantação.

Os recipientes de aloenxertos que sofrem de rejeição crónica do enxerto, podem estar a receber insunossupressão com ciclosporina ft ou com outro imunossupressor tendo uma actividade semelhante à da ciclosporina ft, Para a finalidade deste invento, a fim de tratar ou evitar a rejeição do enxerto crónica nesses doentes é necessário adicionar apenas uma terapêutica inibidora do complemento» p ropo r c i on a-se a

De acordo com um quinto aspecto do invento.

utilização de um inibidor do complemento na preparação de um agente para a promoção da sobrevivência ou para evitar a rejeição de um aloenxerto ou de um xenoenxerto concordante, num recipiente de enxerto a ser tratado com um imunossu.-pressor com uma actividade semelhante à da ciclosporina A = Q invento tem assim aplicação num método para a promoção da sobrevivência e/ou para evitar a rejeição de um aloenxerto ou de um xenoenxerto concordante, num hospedeiro, compreendendo o método a administração a um recipiente de enxerto ou a um recipiente de enxerto pretendido, a ser tratado com um imunossupressor com uma actividade semelhante à da ciclosporina A, de um inibidor do complemento» imunossupressor com uma actividade semelhante á da ciclosporina A será administrado a um nível apropriado eficaz mas não tóxico, tomando em consideração a espécie a ser tratada e o orgão a ser transplantado» 0 limite superior da tolerância á ciclosporina A nos seres humanos é determinado pela sua acção nefrotóxica e pela idade do recipiente» 20 mg/kg por dia pode constituir um limite superior inócuo para o tratamento de seres humanos em muitos casos, embora outras espécies possam apresentar tolerâncias mais elevadas.. A ciclosporina A ê eficaz em baixas doses, e assim, a quantidade mais baixa que pode ser administrada será simplesmente a quantidade mais baixa que dá origem a uma resposta eficaz» Quantidades de í ou 2 mg/kg por dia revelaram ser nalguns casos, aficazes» Como regra geral, pode-se administrar entre 5 e í© mg/kg por dia» Se administrada parentéricamente, a ciclosporina A pode ser injectada em dias alternados, caso esse em que a dose deverá ser duplicada» Contudo, para & via preferida, a oral, a dosagem diária será o regime de administração de escolha; roais particularrnente a ciclosporina A pode ser administrada duas vezes por dia ou com maior frequência para dar origem a uma dase diária total na ordem dos b a 1® mg/kg, de preferencia., Outros imunossupressores com uma actividade semelhante à da ciclosporina A serão administrados em doses eficazes mas não tóxicas, tal como será determinado pelo médico assistente.

inibidor do complemento, tal como factor veneno de cobra-capelo, será, em regra, administrado numa quantidade que irá inibir com eficácia a actividade do complemento tal como é determinado pelo ensaio da hemólise do complemento CCl-L 0 limite superior inócuo para a administração de factor veneno de cobra-capelo não foi determinado, mas doses de 2 mg/kg não parecem ser tóxicas, A dosagem mínima do factor veneno de cobra—capelo depende da espécie e pode ser determinada rápidamente pelo ensaio Verificou-se que doses entre ®,@1 e ®,í ou 0,2 mg/kg são eficazes para o factor veneno de cobra-capelo. Doses eficazes e não tóxicas de outros inibidores do complemento podem também ser determinadas rápidamente pelos especialistas na técnica, por exemplo, usando o ensaio CH^,

U factor veneno de cobra-capelo leva cerca de 6 horas

para que a sua actividade inicial se realiza intramuscular. Uma vez observada a actividade durar mais de um dia, por exemplo 2 dias, e as diária do factor veneno ds cobra-capelo pode n Com efeito, ê preferível administrar o factor após administração inicial, ala pode sim a administração ão ser necessária, veneno de cobra—ca pelo em dias alternados, preferidas indicadas anter administração. Na prática, part icu1armsn te apropriado intramuscularmente em dias caso esse em que as doses iormente serão duplicadas no verificou-se que um regime de consiste em administrar 8 aIternados= diárias dia da dosagem mg/kg

A administração pressor será usualmente veneno de cobra-capelo ou geraimente não continua, pode, na prática, não ser apenas uma terapêutica de para evitar a rejeição de de ciclosporina ou de outro imunossu— contínua» A administração do factor de outro inibidor do complemento será mas pode ser prolongada? mesmo isto essencial, visto poder ser necessária curta duração para o tratamento, ou xenoen xer tos c oncord ant es«

Aspectos ρη to são como para feridos dos segundo a quinto aspectos o pr3.mej.ro aspecto, mu ta tis mu tar;d ís-» do

invento será agora ilustrado tendo como referênci preparações e exemplos que se seguem» Os exemplos referem—se desenhos acompanhantes, em que:

as aos

FIGURA í é um gráfico da sobrevivência de um xenoenxerto de coração de criceto em ratos, sendo a percentagem de sobrevivência registada em relação aos dias pós transplantação? e

FISURA 5 έ um gráfico da sobrevivência de um xenoenxerto coração de criceto em ratos tratados com ciclofosfamida? de modo diferente o gráfico corresponde á Figura 1» de um

Preparação

Esta preparação dá origem a um protocolo para a preparação do factor veneno de cobra-capelo a partir de veneno de cobra-capelo crú» ló g de veneno de Naja naja kaouthia (Sigma, Product No. V-9125, Lotes Nos» ílóF-0398 e 5SF-05Ó5) foi dissolvido em 60 ml de tampão fosfato de sódio desgaseificado C0,01ii> a um pH de 7,5 e bombeada para uma coluna com 90cm x 2ómm CdiSmat.ro interno) de celulose DEAE (DE52, Whatman) e equilibrado com o mesmo tampão» A coluna foi então eluida a 43,0 ml por hora com o tampão inicial até a absorvencia - do efluente voltar a O» Um gradiente linear 3 litros s 3 litros do tampão de partida e tampão limite (fosfato de sódio 0,01M, pH 7,5, contendo cloreto de sódio 0,5M) foi então para ela bombeado a 4&,0 ml por hora e foram recolhidas fracçSes de 7,0 ml» As fracçSes foram testadas quanto a anti-complementaridade, e as fracçSes positivas foram reunidas e concentradas em ultrafiltros CX-10»

Pi totalidade do veneno de cobra—capelo reunido foi bombeada para uma coluna com 9©cm x 2ómm (diâmetro interno) de Sephadex 6200 (fino) (Pharmacia BB Limited, London), equilibrada com PBS (não azsto) e eluida com PBS a 36 ml por hora» FracçSes de 6 ml foram recolhidas e ensaiadas- quanto -à. actividade anti— —complementaridade. As fracçSes do factor veneno de cobra-capelo (isto é as fracçSes activas) foram reunidas, especialmente no elemento descendente do .pico, concentradas em ultraf il tros CX-10, divididas em porções alíquotas e armazenadas com congelação a -20’“‘C prontas para utilização»

A anti-complementaridade do factor pelo referida anteriormente pode ser medida segue» FracçSes de 20 μΐ foram incubadas com : fresco durante 20 minutos a 37‘-'C. Quantidades adicionadas a recipientes numa placa de teste veneno de cobra-capelo método que se 10 pl de soro humano de 5 μΐ foram então ; constituídas por5

5,0 ml	de	agarose aquosa a 2%?
4,5 ml	de	PBS de energia dupla incluindc	3 EDTA 20mM
0,5 ml	de	eritrocitos de cobaia lavados	a 10X 5 e
©,5 ml	ds	soro humano normal fresco.

Α placa foi então incubada durante Resultados positivos são indicados por zonas lise após incubação.

a noite a -$-4*C« transparentes de

Exemplo í C Exempl o de Comparação)

Neste exemplo, os ratos são ratos DA de Banting -and Kingdom, e os cricetos são cricetos Sírios, também de Banting and Kingdom, Seguindo o método de Heron (Acta Pathol. Microbiol Scand . 79 366--372 (1971)), coraçSes de criceto foram enxertados nos pescoços de ratos. A aorta foi reunida ã artéria carótida usando a técnica de canhão descrita por Heron. De um modo semelhante, a artéria pulmonar foi reunida a veia jugular. Todos os outros vasos cardíacos foram laqueados. Os coraçSes começaram a bater no espação de alguns minutos após a remoção dos grampos. A pele foi então fechada sobre o coração implantado, o qual foi monitorizado diáriamente por palpação externa, us dadus de indicados na Figura 1 verificar-se que a tax JL tó is?» de sobrevivência do enxerto cardíaco são e são representados pela linha 1. Pode de sobrevivência média dos enxertos foi

Exemplo 2 (Exemplo de Comparação) processo do Exemplo 1 fo facto de se administrar ciclosporina A dias alternados» A ciclosporina A- foi i repetido, exceptuando numa dose de 2© mg/kg administrada sob a forma em ds uma preparação de 2© mg/ml em ite e injectada intramuscular

mente, sendo a primeira dose adminlstr tação. As injecções foram em seguida Os dados da sobrevivência do enxerto Figura 1ϊ linha 2 apresentando os re de a méoxa

Exemplo (Exemplo de Comparação) ada na altura da transplanfeitas em dias alternados.

são de novo indicados na sultados deste exemplo. A dias ι processo do Exemplo 1 foi repetido, exceptuanda o facto do factor veneno de cobra-capelo ser administrada numa dose ds ©,4 mg/kg em dias alternados» 0 factor veneno de cobra-capelo foi administrado sob a forma de uma solução 0,5 mg/ml em PBS sem

izada intramuscularmente na intramusculares subsequens alternados» Os dados de resentados na Figura 1» Os o que mostra que a taxa de é de 6 dias» azeto» A primeira injecção foi real altura da transplantação, e injecções tes foram feitas em seguida em dia rejeição do enxerto são de novo ap resultados são indicados na linha 3, sobrevivência média para os enxertos

Exemplo 4 processo do Exemplo í foi repe facto de tanto a ciclosporina A como o factor pelo serem administrados ao recipiente, ft administrada numa dose de 20 mg/kg em dias caf oi de tal tido, exceptuando veneno de cobracefalosporina A alternados.

modo que as condições para a administração da ciclosporina foram

iguais ãs do Exemplo 2, 0 factor veneno de cobra—capelo foi administrado nas mesmas condições que foram descritas no Exemplo 3. Tanto a ciclosporina A como o factor veneno de cobra-capelo foram administrados pela primeira vez na altura da transplantação. Ds dados de sobrevivência, do enxerto são de novo indicados na figura. Neste exemplo, não se observa qualquer rejeição, como se pode concluir da linha 4 da Figura 1. Presentemente, a sobrevivência média do enxerto ultrapassa os 50 dias.

Exemplo 5 processo do Exemplo 4 foi repetido, exceptuando o •facto da administração do factor veneno de cobra-capelo ser interrompida 23 dias após o transplante. A sobrevivência média do a IO® dias, Foram sacrificados dois transplante foi animais aos 1®3 superior

H 4 <z: 4* ί-i Ί Λ rs ? r m s aos 100 dias e o exame nistolaq do enxerto indicou uma arquitetura cardíaca normal. Um rato restante sobreviveu com um coração de criceto pulsátil durante mais de 5 meses até aqora.

Exemplo 6 (Exemplo de Comparação)

Foram dados corações de criceto a 2® ratos pelo protocolo descrito no Exemplo 1« Os ratos foram tratados com ciclosporina A tal como foi descrito no Exempla 2, s além disso foi—lhes administrada ciclof osf amida ENDOXAíM i.p. <2® mg/kg) um dia antes da transplantação Cdia-i) e no dia 2 após a transplantação» CA ciclofosfamida, que é palavra ENDOXAíM é um nome comercial pari um inibidor da produção ds anticorpos), Os corações de criceto foram rejeitados tal como é indicado na linha 5 da Fiqura 2» A rejeição retardada observada, em que curta terapêutica com c ic iof osf -amida _? dada do xenoenxerto do tipo que resul supressores inadequados«

o atraso foi resultado da simula uma rejeição retartaria de protocolos imunosExemplo 7

Cinco ratos foram tr foram adicionalmente tratados tal como no Exemplo 4 a partir veneno de cabra-capelo durou 1todos os animais, como se pode atados tal como- no Exemplo 6, mas com facto veneno de cobra-capelo do dia 7» 0 tratamento com factor dias« h rejeição foi evitada em concluir da linha 6 da Fiqura 2=

Claims

REIVINDICAÇÕES lã.

Prouessu pa ra a preparação ds uma formulação farmacêutica, caracterizado por se incluir uns inibidor do complemento, de preferência numa concentração compreendida entre 0.05 até 5 mg/ml, e um imunossupressor com uma actividade semelhante à da ciclosporina A, de preferência numa concentração compreendida entre 1 até 100 mg/ml»
2ã. - Processo de acordo com a reivindicação í, terizatio por o inibidor do complemento inibir as vias clássica como alternativa da activação do complemento.

carsctan to
3ã. - Processo de acordo com a reivindicação í ou 2, caracterizado por o inibidor do complemento compreender MCP, DAF ou um anticorpo contra C3.

que forma é resistente
4ã„ - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o inibidor do complemento compreender uma molécula um complexo estável com o factor Bb, em que o complexo aos mecanismos normais de desintegração.
5ã» - Processo de acorda com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado por o inibidor do complemento compreender o factor de veneno de cobra-capelo»
6ã» -· Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações í a 5, caracterizado por o imunossupressor com uma actividade semelhante a da ciclosporina A ser unia ciclosporina ou um e x c o s a non.de»
7-â» - Hrocesso de acorde com a reivindicação 6, caracterizado por o iísunossuprsssor ser a ciclosporina A.

Sâ» - Processo de acordo com a reivindicação 6, caracterizado por o imunossupressor ser FK 506.
9â» - Processo para a preparação da um produto caracterizado por se incorporar no referido produto um inibidor do complemento e um imunossupressor com uma actividade semelhante à da ciclosporina A para utilização como uma preparação combinada para utilização simultânea, separada ou sequencial na promoção da sobrevivência ou para evitar a rejeição de um aloenxerto ou x en oen x e r t o c on c o rd an te.
10ã. - Estojo ("Kit"), caracterizado por compreender uma preparação farmacêutica de um inibidor do complemento e uma preparação farmacêutica de um imunossupressor com uma actividade semelhante ã da ciclosporina A„ llã. - Método para a promoção da sobrevivência de um aloenxerto ou xenoenxerto concordante num hospedeiro, ou para evitar a rejeição desse enxerto, caracterizado por compreender a administração a um receptor de um enxerto ou a um receptor que vai ser submetido a enxerto, de um inibidor do campiemento, de preferência numa gama de dosagem de ã,õí a 2 mg por quilograma de peso corporal por dia, e de um imunossupressor com uma actividade semelhante à da ciclosporina A, de preferência numa gama de dosagem de í a ΞΘ mg por quilograma de peso corporal por dia.
12â« - Método para a promoção da sobrevivência num hospedeiro de um aloenxerto ou de um xenoenxerto concordante, ou para evitar a rejeição desse enxerto, caracterizada por compreender a administração de um inibidor do complemento, de preferência

I a 2 mg por quilograma de peso corpo ceptor de um enxerto ou a um receptor que va rto, que tenha sido tratado com um imunossu vidade semeinante à da cxciosporina A» numa gama de dosagem de θ,ΟΙ ral por dia, a submetido <

sor oom um· um en re·