PT97069A - Processo para a producao de monoxigenase alfa-hidroxilante de peptidilglicina - Google Patents

Processo para a producao de monoxigenase alfa-hidroxilante de peptidilglicina Download PDF

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Kenji Suzuki
Hiroko Shimoi
Yasuno Ywasaki
Yoshiki Nishikawa
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Description

Campo do Invento 0 presente invsnta está relacionada com um processa para a produção de manoKigenase a-hitímxilante cia psptidilqlicina (PAH).; com a sua utilização na preparação de um a-hidroxiglicil-peptídeo a partir de um correspondente peptídeo prolongado com glicina -e □ referida a~hidroK ig1 ici 1 peptídeo per se„ S®scrij^L2^J>^
As chamadas enzimas de α-amidaçgo C-terminal de pepti-deos que catalisa a conversão de um peptídeo prolongado com glicina representada pela fórmula R~NH~CH.->__COQH, em que R repre™ senta um peptideo e -NH-CR,-COOH representa um resíduo de qlicina presente no εκtremo C do peptídeo, num peptídeo a-smidado representado pela fórmula R--NH„ em que o grupo amina amida o grupa a-carboxilo do aminoácido C-terminal do peptídeo» é do conhecimento geral que muitas peptídeos biologicamente activas possuem uma estrutura C—terminal α-amitíada e em muitos casas esta estrutura é essencial para a sua actividade biológica, mas eKistem dificauldatíes na preparação dirscta de um peptídeo α-amidado no extremo C por síntese química e técnicas de recombinaçSo de genes» Para ultrapassar esta difiuIdade, foram feitas muitas tentativas para usar uma enzima de α-amidação de peptidilglicina para preparar um peptídeo α-amidado C-terminal» Por exemplo, EP ©3Θ8 ©67 descreve uma composição de enzimas de a-amidação originada em tumores M7C s sua utilização»
Mizuno K» 5 et al „ Biochem» Byophys» Res» Comm. Vol „ 143, N2 2, pp 546-552, 1937 descreve uma enzima de a-amidaçlo AE-I derivada da pele de Xsnopas_lasvisn e Ohsuye K,, et al* *
Biochsm, Biophys, Rss, Comm, Vol, 15®, N23, pp. 1275-1281 s 1988 descreve um outro tipo de enzima de «--amidação ΑΕ-ΙΪ derivada da pele da Xenopus lasviã= EP ©29879® descrsvs uma elonagem de cDMAs codificadores das enzimas derivadas Xsnopus laevis nos plasmideos pXA457 e pKA799? respectivamente. Mo entanto» a expressão da cDMft em células de E„ coli proporciona um produto apenas com aetivida-ds marginais provávelmenis devido aenrolamento incorrecto da enzima expressa ou por outros motivos, um dos quais poderá ser o produto naa ter activxdade de α-amidaçlo real <.
ObJec li vo... do.....inven to
Surprssndantements encontrou-se agora que X„ laevis AE--I não é realmente uma encima ds s-amidaçSo mas antes de «-hiriroxilaçSo e que a cinversão atrás referida de R-NH-CH^-COOH em R--NH,, ocorre em dois passos, 0 primeiro passo é catalisado por uma monoxigenase a-hidroxilants de peptidilglicina s conduz a um produto intermédio R-NH-CHOH-COOH. é de supor que também algumas outras enzimas de a-amidaçSo atrás referidas não sejam enzimas reais ds s-amidaçlo mas antes catalisem apenas o primeiro passa da reacção e portanto sejam monoxigenses α-hidroxilantes de peptidilglicina»
Existe a necessidade de um processo para a produção de uma monoxinenase a—hidroxilante de peptidiIg1icina tendo uma potência elevada, Como um meio para a produção de um peptídeo cu enzima biologicafísente aciiva, USP MS 4=,745,051 descreve a utilização de um sistema de expressão baculovírus/cáluias ds insectos»
Constitui um objeciivo do presente invento proporcionar um método para a produção de uma monoxigenase α-hidrox i1ante de peptidiIg1icina tendo uma elevada patineia e um método para a
produção de a—hidroxiglícilpeptideos usando a referida ínoncsxigs-" nass? a-hidroxilants*
Dsg£ÕcIa..dg„,Mves;vto
0 presente invento proporciona um processo para a produçSo de uma monoxigensss «--hidroxiXante de peptidilglicina tendo uma elevada potência por um método de recombinação de genes usando um sistema de expressão baculovi.rus-células de insectos*
Mais especificament e, o presente invento proporciona um processo para a produção de uma manoxigenase a-hidro>d,lante ds psptidilglic:ina = o referido método compreendendo os passos des cultura das células de insecto transfectadas com um baculovírus rscoffibí rtante no qual foi incorporado um BNA codificador de monoxigsnass a-hidrcníilante ds psptidiIgIicina para produzir a enzimas & facu 1 tativamente recuperação da enzima a partir da cultura.
0 presente invento proporciona ainda um processo para a produção ds um peptídeo com u---hidroxigiicilo C-terminal caracte-rizado pela conversão ds um psptidso prolongado com glicina no smtremo C da fórmula (l) r-MH-CH^-COOH CI) em que R representa um peptideo e -íMH-CH^-COOH representa um resíduo glicina presente no extremo C do peptideo R, num peptideo com a--"bidroKÍglicilo no extremo C da fórmula < II)
R-NH-CHOH-CDQH usando a enzima preparada par um processo de acordo com o presente invento»
As monoxigenasss a-hidroxi!antes de peptidilglina do presente invento incluem quaisquer enzimas tendo a actividade de s-hidroxilacSo C-terminal atrás referida & derivadas de várias origens» De preferência as presentes enzimas de α-hidroxilação de peptidilglicina slo as descritas na literatura atrás mencionada.; como sejam ΑΕ-Ϊ e AE-IX derivadas da pele de Xenopus___laevis,,· assim como seus fragmentos tendo a actividade enzimáiica pretendida» Mais preferencialmente a presente enzima é AE-I» 0 DMA codificador da presente enzima pode ser preparado de acordo com um processa convencional» For exemplo» RNA total foi extraído de um material em que um psptideo com r-hidroxi g liei lo ou a-amidado é expresso nativamente como seja a pele de Xenopus laevis,. glândula pituitária intermédia bovina =. átrio tíe rato ou similares de acordo com um processo convencional« Em seguida,. RNA poli<A>+ foi isolado numa coluna de cromatatografia em oligo riT-celulose de acordo com um processo convencional tal como o de Chirgvíin^ J„tL et 3LS Biochemistry ijB5 5294-5299 (1977)» Em seguida5 construiu-se uma biblioteca de cDHfi de acorda com um processo convencionalpor exemplo em fago lambda ou de acordo com o método d® Okayaina e Bergs Nol» Cell Biol. 2,, 161-17®,, 1982? a a biblioteca de cDImA foi despistada por um método de hibridaçSo usando usm sonda de oligonucleétidos projsc-tada de acordo com uma sequência publicada de cDMfi codificador de monoxigease a—hidroxilante de peptitíilglicína? derivada por exemplo de boi;, rS ou rato (ver Mizuno? K,, et al„ (1987),, Biochem. Biophys. Res» Comm. 148» 546-552? Eipper* B»A» et al,, (1987)» rlolec» Endocrinology j.,, N9 lis 777-790? Ohsuye» K* et al,= í 1.988) s Biochem» Biophs» Res» Comm» 15®» 12/5-1281? Stoffers, D»A. et ai» (1989),, Proc. Natl. Acad. Sei» USA 86» 735-739)» Numa
realização preferida da presente invento, clonou-ss um cDMA usando uma sonda de oligonucleétidos sintetizada de acordo com a sequência de DMA de AE-í descrita síis EP @299790* )
De acordo com o presente invento, um DNA codificador da presente enzima, como seja cDNA, foi inserido nucn vector de transferência para baculovírus para construir um vector de transferência recombinants para baculovírus s o vector de transferência recorabinante para baculovírus è então cotransfectatio com um DMA da baculovírus em células de insecto para que se dê uma recombinaçlo homóloga* 0 vector cie transferência para baculovírus é geralmsnte um plasmídeo contende um segmenta de DNA de báculo-vírus, segmento esse que compreende um gene nlo essencial para a replicaçlo de bsculavirus. 0 gene nãa essencial para a replicarão de baculovírus é, por exemplo, um gene da poiisdrina compreendendo um gene estrutural da poiisdrina e um seu promotor* Tais vectores de transferência de baculovírus slo por exemplo pftcYMi <síatsuura, Y. , et al. „ 6en. Vi rol. (1987) 68, 1233-125#) \ pftc31i, pAc3&#, pAc373 e pfic38@ (USP 4,745,051) e similares» )
Cs baculovírus usados no presente invento são5 por exemplo, vírus da poliedrose nuclear tíe Autographa californica (hcpíMPv), MNPV de Trichoplusia nl. MMPV de Rachiplusia ou, 1ÍNPV de 6a1leria mellonell e similares.
Um kit contendo uma combinação ds um vírus de poliedro— se nuclear de Autographa californica ® os vectores de trasnfertn-cia pAc700, pÃc701? pAc702, pVLÍ393 podem ser adquiridos à Invitropen*
As células de insactos usadas no presente invento são linhas estabelecidas de células de insactos, por exemplei de
Spadoptsra fruglperda, tais com a Sf9 í A i'CC CELÍ71Í), Sf21, Hamestra brsssicas e similares.. 0 sistema ris células de Bômbix mori usando o vírus da poliedrosa nuclear de Bômbix mori íBmriPv) também pode ser usado no presente invento.. A recambinaçMo homóloga foi realizada de acordo com um processo convencional? como descrita na Exempla 3= De acorde com o presente invento, a recomoinação homóloga ocorre numa taxa tio elevada como vários por centos e um vírus recombinante pode ser sslsccionado com êxito como uma placa transparente poliedrina-ns-gativa de entre as placas brancas selvagens.. Assim, um vírus recombinante pretendido pode ser fácil e reprodutive1men te ssleccionado..
As células de insseto transfectadas sao cultivadas de acordo com um processo convencional= Nomeadamente. as células de insseto transfsetadas podem ser cultivadas em qualquer meio de cultura de tecidos em que as células tíe insecto possam crescer, como seja meio de Srace ou TC10© suplementado com soro de mamífero, meio sem soro EX-CELL4©© ou similares a uma temperatura de 2©!-C a 3©CCP de preferincla entre 27*0 s 28°C,= por exemplo 27°C durante 2 a Í0 dias, de preferiríeis 3 a 5 dias» De acordo com o presente invento, mais de 9©% de uma encima expressa é secretada para o sobrsnadants de cultura s portanto a encima pretendida pode ser recuperada a partir do sobrsnadants as cultura segundo um processo convencional, como seja centrifugação, remoção de sais ou vários processo cromatogréíicos ou uma combinação deles»
Quando a enzima purificada assim preparada reage com um psptídeo prolongado com glicina da fórmula (I),. e„g„ no peptídeo modelo Ala-I le-81 i-Val-81 i-Ala-Pro-81 i sendo id@nt.ico aos 7
resíduos ds aminoâcidos C--termins.is da ca lei terrina humana prolongada com um resíduo glicina C-terminal ou nos precursores da calcitnina prolongadas com um resídua glicina C-terminal como seja calcitonina humana, calcitonina cie ssitón, calcitonina ds galinha, calcitonina ds enguia, calcitonina tis rato, calcitonina porcina, calcitonina ovina, calcitonina bovina ou factor ds libertação da hormona ds crescimento humana (GHRF), peptídeo relacionado com a gene da calcitonina humana <CBRP>, hormona libertadora da hormona luteínizante \LHRH> e similares, são produzidos os correspondentes a-hidroxilglicilpeptídeos da fórmula (II)S A produção de tal «-hidroKig1icx 1peptídso á realizada usando uma preparação contendo monoxigenase de «—hidroxilaçlo de peptidilglicina, partindo de um correspondente peptídso prolongado com glicina num meio aquoso tal como tampão, por exemplo um tampão ds fosfates, tampão acetato, tampão HES-Na, tampão TES-Wa, tampão Tris-HCl ou similares, a uma temperatura tis 16*0 a 37°C, de preferiríeis cerca de 30*0* Uma quantidade da enzima usada é
*7 A por exemplo í xlô*“ a lxi®w unídadss/tng ds proteína substrato e -3· !~
preferencia 1 mente ΙχΙΦ'" a 5κ1Θ~ unidades/mg de proteína substrato» A preparação contendo monoxigenase da α-hidroxilação de peptidilylicina pode ser qualquer preparação contendo a referida enzima, como seja um sobrenadante ds cultura, um sobrenadante concentrado, uma preparação de enzima enriquecida ou parcialmerite purificada, uma enzima purificada ou similares» Tais preparações de enzima, uma enzima purificada ou similares» Tais preparações de enzima podem ser liofilizadas para armazenamento»
Os Λή-hidroKÍglicilpeptidaos R--NH—CH0H-C00H produzidos pelo processo acima sao quaisquer s-hidroxilglicilpeptídeos incluindo os precursores das calcitoninas, tais como calcitonina humana, calcitonina de salmão calcitonina de galinha, calcitonina
de enguia, calcitonina de rato, calcitonina porcina, caleitonina ovina, calcitonina bovina ou facior de libertação da hormona de cresciinento humana C8HRF3, pspiidso relacionado com o gene da calcitonina humana CCSRF*) , hormona libertadora da hormona lutei-nicante ÍLHRH) s similares» Assim α presente invento também diz respeito a «-hidroKiglicilpeptideQS C-terminais da fórmula R--NH-CHOH-COOH referidos atrás, à sua produção por meio de uma íiianoKigsnase ds a-hidroxilação cíe peptidxlglicina e á sua utilização para a produção dos correspondentes peptitíeos α-amidados da fórmula R-NH0 em que o grupo amins amida o grupo a-carboxilo do affiinoácido C-terminal do peptideo» R-NH-uHOH-COUH é surpreendentemente estável em condições fisiológicas e pode ser convertido em R~MFL, pela adiçao ds s~. uma hasa, e»g» um hidróxido alcalino, em particular NaQH, a um valor de pH básico, particularmente entre cerca ds pH 9 e pH 12, de preferência sntrs cerca de qi-l 1® e cerca de pHii, e»g* por incubação durante alguns minutos a pH 1í ou durante 3@ minutos a pH lô.
Descrição dos desenhos
Fiq» 1-1 representa um processo para a construção do plasmídeo intermediário pSVL/fiE-1-31©?
Fig.: 1-2 representa um processo para a construção do vector de transferência recombinante pAcYHl/AE-1 para baculc?-vcírusg
Fig» 2 representa um processo para a construção ds um baculovlrus rscombinantej
Fig= 3 representa a produção da íiiGnoviganase «~hidrcs;-íi·--lante de peptidilglicina por células de insecto transiestadas com o baculcvírus recomfainants em meio sem saras s
Fig. 4 representa a conversão dependente do tempo de calei tcinina humana prolongada com qlieina <hCT-Sl.i.) para calcito-nina humana <hCT) usando meio de cultura de células de insscto enriquecido»
J
Os exemplos que ss seguem servem para ilustrar o presente invento mas nso devem ser considerados como limitaçSes dele»
Clonaqeffi de cSNft codificador de monoxigsnasa q-hidroxiXante de pentiriilqlic.ina.....A£~£.....a j^rtir.. da
EliJLJsL JLiD22ys_jL asvis
0 RUA total foi extraído das peies de Xenopus laevis e isolado RNA poli(A>+ por crranatografia em coluna de oligoCdT)-celulose de acordo com um processo de Chirgwin, J» M. et al, Biochemistry 18? 5294-5299 C1977K Construiu-se uma biblioteca de cDNA pelo método de Okayama e Bera? Mal. Cell. Biol. 2,, 161-170=, Í982„ usando 10 pg de RWApoliCA>+ e 5 pg de DMA vector-iniciador. Um oligonucleótido sintético de 29 pb 1 ft— 1 i o íCATCACAT8CTTCTATTT6SATSCAATAT> que corresponde a ‘"''His- Ile em AE-I Enizuno K.= 5 et al.Biochem» Biophys„ Res. Coram» 148,
546-552 (1987)3 foi usado como sonda de hibridaçãc* de acordo com a sequência publicada tía enzima de hidroxilaçSo de Xenopus laevis» AE-I, Um dos clenes positivos= pAE-I-31© observou-se ter cDWA da enzima hidroxilante de Xenosus laevis„ fiE-1s através de mapsamsnto de restrição e análise da sequência de nucleótidos» A sequência de nucleótidos do cDMA flanqueando os extremos Smal e Oral está apresentada na Sequência de Listagsm/SEQ ID MSI» EXEQELOl_2s uonstruclp dP vector de transferência reegrabinante
Pfíçvm/AE-I ^riq» 1) 0 vector de transferência de partida pAcYMl é um plasmideo contendo um gene da poliedrina de baculovírus» descrito
detaihadaments em Matsura V, 5 et aL, J= Baru Virol, (19S/> 68, ;i 233-125® ==
Para construir um vector de transfsrincia para um sistema de expressão em células da insseta=; α clons de cDNfi pftE-I-31® foi duplamente digerido com as enzimas de restrição Smal e Dral.
0 fragmento Smal/uraI foi entlo integrado no sítio Smal no vector pSVL (Pharmacia)« 0 plasmidao com a orientação pretendida foi designado pSV/AE-l~-31® , Em seguida o plssmídeo foi duplamente digerido com as encimas tíe restrição PstI e BsmHI= Um fragmento resultante de i:i3 Kpb do clone continha uma região codificadora da encima hidrasilants AE-I» Esta fragmento foi dotado de entremos cerses com DNA-polímerase de T4S seguido de ligação com um adaptador BamSíí e digestão com a encima de restrição BamHX= ρΑοΥΜί/ΑΕ-Ι foi preparado por inserção do fragmento modificado num vector de transferência pAcYMl que foi previaments tratado com a encima de restrição BamHI e desfosíorilado. EXeMPLu 3; Construção da baculovírus recombinante (Fiq.2) ) 0 plasmideo de transferência contendo um cDNA de Ab-1 foi recombinado com o genonsa do vírus selvagem da poliedros® nuclear de Autoqrapha___californica CAonNPv) por recombinação homóloga. 0 AcMMPV tipo selvagem pode ser adquirido coraercia 1 mente a Inviírogen, Em seguida 1 μα do DMA virai foi misturado com 25-10Φ pg de DNfi do plasmidso pAcYHi/AE-I em 95Θ μΐ de tampão HEPES 'i20 mM HEPEB (pH 7,Ôi/lmM Na^HPC^/omM KC1/14® mn NaCI/1® mH glucose) e apés precipitação com 5® ui de 2?5n CaCl^? as psrtícu~ A . .Λ
Ias de DMA foram colocadas sobre 2>;i®w células Sf9 a a cultura foi incubada durante i hora è temperatura ambiente. Em seguida o sotarsnadants da cultura foi substituído por 2 ml de meio ds Srace
*·.. £ £ Λ ( tí 1 HCO ! contendo t®% de soro fetal bovino (OIBCO). Após fl J J „ _ -J — *t Li 1 S/zs U fcí incubaç lo a 27°C, o sobrenad· ante foi colhido e diluido Í 0 c\ | ÇiÇ\Çi V€32©S»} seguido do ensaia em placas. As placas que se formam a υ partir de um baculovirus recombinante tendo uma inserção de DNA estranho no seu genoma podem distinguir-se das placas virais não recombinantes a olho nu, Duas placas negativas para a poliedrina foram repicadas e posterior purificação e amolificação dos vírus recombinantes foi realizado sequndo um processo convencional
J of Methods for Bac u1ov i rus vsctors and In: Pro-cedures, M, D, Summers, Te; s<as Agrxcu 1tural E Bulistin ΜΘ 15 d d ) c-e i i vatíirt-0 Vs rruduçao oe enzima ) , um HttílU Β.ύθ.Ξ no me melo de cu áS f O i cen
Primeiro 5ki0~J células Sf9 ÍATCC CkL. 1.'711) foram misturadas com os vírus recombinantes isolados a uma Mui (multiplicidade de infseção) de 1Θ -s suplementado com S ml de EX—CELL 400 (u R Scxentxfxc), um mexo sem soro. As células de insecto infectadas 3 EX—CELL 4Θ® a 27°C durante 7 dias, vj VSZterS US ando Ui» uunuentr ador Amicon e a. aniusti- a. concentrada f 0 aplicada. numa . coluna de f 1111 '"ação* em gel de BephadeK £3—25? PD í Pharmac ia > 3 para rwmover os materia XiS 0 e ba x x o peso mo 1 ec u 1 a r acuviaao ·? menoí dai enzima eluida. da coluna é estável durante ps 1 o 20 °C, meses- a C .J _ iUâ de a coroo Cuffl Jonesj B«N = et a 1 „ !’70 1988) ^ c om uma 1 igsira modi fIcacão = iad r __ /·-* _ CÍU TatíLU □ Η 6 : »4 em 20@ mM TES-Na/ácido A actividade enzimé.tica de mono.--iigene.se s—hidroxilante de peptidilglxcina foi mediu; (Anal, Biochem, 168, 272 _............ ? mM/
Umas condições de ensaio padrão são ascórfaico 2 mM/ 5® mH Ku/ 1μ CaSCL / N—etilmaleimida 2mM/
iniciada pela adição de unta enzima a 3€?°C e parada após 15—3Θ min pela adição de EDTA para uma concentração final de 5Θ mH, seguido
enzimática é definida cama amole do produto por minub 0 resultada uentioade cuiturs e* e.pr enzima para produzir
da adie3o de Na OH para. U.fTi-B concentração final N e neutra- lização c P1T1 HC1= A amo s foi analisada numa colune H i—ρο rs (4 ? 6 x 40 mm) C Bio—Rad) u sando uma condiçã' D X 30 crática de 62,5 mM UH-, CQUNa / 537, ac eLonit.nl o , pH 7 r. 0 Lhua un i.dadvs de auLividade
iQ
Uma linha a cli íeio indica a actividade medida segundo 0 método d esc r i to atra s= Uma linha a. ponteado n n cl 11 c 3. actividade medida. se m t. r a. t a. m en 10 a. 1 cali no e neutralização*
Note-se que o peptidsa prolongado com a-hidroniglicina pode ser convertido com no correspondente peptideo «—amidado por tratamento alcalino, por exemplo durante alguns minutos a pH lí ou durante 30 minutos a ρΗ 10= rara purificar a
O a enzima, o IfíS io de cultura (500 ml > tratado como se segue* Após remoção d as aos o meio f dí dial is ado contra 10 mH 1 7,5 (Tampio Λ \ e apli cado a uma co luna. ulose CBE52) equ i 1 r =5, da com Tampão A e Torant as fracçSes contendo a actividade de enzima hid-roxilante colhidas, dial Xsadãís contra 3'© m!i MES-Ma, pH 5,' 7 e apl içada coluna Mono S HR5/5 (Pharmacia) equilibrada com 50 mM MES-N 0 r: / 11 A en z i ma hidroxilants foi eluida com um grsdie n ce di linear de Θ—d©© mM NaCl no mesmo tampão» As fracçSes com elevada afinidade Torsm reunidas e dialisadas concra o Tampão Ag seguido de aplicação numa coluna DEÃE 8LASS (Nasalai) aquilibrada com o
Tabela U resultada da purificação está apresentada Ι Ο TABO_A i
Passo de Proteína Actividade Actividade Recuperação Purificação
purirxcaçáo C mg > < un i. d ades) V 1 0 >pec iTica . Li/íTíQ ) t VaZiíS )
Meio 5'3 4 DE-52 4Θ Mono S 1 DEAE SLA33 0 A e 1 ec troforese peso molécula por filtração 1 »5© 14,6 179 214 1 y 14 / ,, u B6 J Λ **t« l proteína purxTxcaca mostrou-se noaiogenea numa .turante de Sl?3—poiiscniamida, tendo um 0 peso molecular a-parente determinado e 43 KDa* de 41 KDa iTl Cf Sr 1 foi
J
Note-se, pa.ra a hidroxilação dos peptídeos é desnecessário purificar mono;·; iqsn ase a—hidraxilante de peptidilglicina até 1ΘΘ% de homogeneidade e as impurezas não perturbam a hidroxi— lação dos peptideos prolongados com glicina.
EXEMPLO 5¾ Preparação de uma calcitonina humana prolongada com a—hxdromxCj 1 .i.cxí no estremo C gl ΊΠ ’C O 5S1S mg 0 y\ tremo C Tí*3 i de calcitonina adicionado em Φ
hum ίΤίΓΙ &. prol ϋΠ Q cl G d com M MES“Na coivtendo 2 mM
iD L-ascorbatos Θ»1 mg/ml de cata1 nou~ss à solução €>56 mg de monoxicienas dilglicina purificada* Após incubação a ZQ°C durante 5 horas solução de reacção foi tratada com uma cassete Sep-pak (Wai iiofilizada, A amostra l.iof il izada foi dissolvida em coluna Bio—Rad Hl Pore si realizada com um gradiente linear de 3=>β 1 ® mH Kl * Em seguida. adielo igenase a-hidroxilante de pepti· acético a ύΘ'Ζ g* a ρ 1 í c ada Π- * (Í0>;25© mm) „ A eluição 70 X re· a Cf é.C 1 do DDT p. J i7i£l
J acetonitri1o Cl9—2 ’ι. «... JS _ — ** J. _ rjt/y J feflll 1 Di ÍTtCÍ ·-. o de arnéniu 10 mH C ρΗ 4 s@) * Ar !—2 r- f r ac ç S-es con ten d o o peptídeo produto τ oram 1 xof .ι 1 izadas = A !JD! p Π* 3—0 analítica feita us ando uma coluna Bio- ~Rad Hx !-‘oret.04 4,, L· x.250 mm) 1 --··-- -·- ae acetonitrilo (8-οΘ%) em formato as com um gradiente linear de acetonitril amónio CpH 4,0) indicou que o produto obtido estava puro*
O
Análise do produtos Trinta μο do produto obtido foi degradação de Edman com um sequencisdor de proteínas em fase gasosa equipada com um analisador de PTH. A estrutura dos aminoâ— cidos obtidos corresponde aos da cadeia de 32 aminoácidos da c a 1 c i ton i n a hu ma n a * Cinco mq do produto dissolvido em água (9Θ% H^O e 1 " ^ ím H-NHK» Os sínaxs dos protões ?ouble yuantum tx-itered Chemical Schift Corerelated Spectroscopy) . Uma ressonância de 54 p-pm foi esindicíOcí par d um proi_ao u. ι ιο ~~ ç e u t.ro de impíR» m ress-onãncxa deste protão a. mostrai um grande desvio abaixa do campo relativa- mente a outros protoes <?.* Este resultado sugere que o peptídeo contem um resíduo de <3—hidroxiglicina na sua estrutura»
10% H.-,Ορ pH ó p 2) foi ana Usado foram assina1ados po r DQF—COSY w 1 t to foram analisadas por espec tr ornei ri* r\ por átomos rápidos com ioss positivo D distinto a volta do número de ma ss, 34905 o que é compatível com a calcitonina humana prolonqads
J
Para determinar a conversão dependente do tempo de calcitonina humana prolongada com glicina, 25 mg de calcitonina a couí ç 1 i c i n -a (hCI-Gli) foi incubado com 5=25 iTíI ado obtido no Exemplo 4 a 3®°C -em 15 ml de tam ipSo ! 0 s 2i'1 \ pH h 5 2 ) contendo L—ascorbsto 5 l mM, 0,5 P* * de catalase (Boenrínger), 10 mM K Ί, 0,25 ubrol tipo vários M-e til ma 1 e i m i d a a, í acetonitr ilo e 031’ a incubação. 4 μΐ d-as HCOOHH. (pH 4) /λ. ^ / 10% rectemente aol içado ηυ,ίΤν 10 mH HCOUí-iH „ (pH 45 0)/ 1Θ mH HCOOMH„ <pH 4,0)/ 50% acetonitrilo. Coluna Bio—Rad £J. * ‘ ffnTi D, s amostra^ * coram oiiUxdss 5v.-;
D e depois 25 μΐ da cx d& HPLC (T e.fflpao A tc 3ΠΧ triloi Tampão p !J 4 _o, Π i. i I RP 304 - , ·*“; ÍCT _ __ % Λ .i,%J <·» íTiUi j A Figura 4 mostra s c on vs r sêto d boetí den t.0 do tempo d< πτ ~G1 i pela encima expressa. em que re-spec tivamente 05 c i rcu1o ,DS rtos i n d i c am o su bs t r a to h-CT-Bli, e os circul nc a che.ii nina humana (hCT) usando i=r i _ *-j ΠΙλ ufc? um cobres s-adan te t_ oncentrado derivado de ' 200 m 1 do sob roned-ísn to da cultura, após 4 horas de incubação a reacça o foi p -âredci pS 1 a adição de 150 μΐ de 0 3 5 M EDTA í pH 7 3 0 ) 0 0 solução TOÍ. ÍLf~Θ. l.Sj da com uma base como referido atráso
O
Em seguida a mistura de reacção foi passada através de <«Jaters/ e hCT tox purificado numa coluna uma coiuna bieupsk t_* lu luroa 18 de Hi-LU em fase reversa I=D= 23% acstoni t r i 1 o 5
20 mm acetonitrilo) durante 6Θ min a um fluKO de 1® ml/min. As fracções contendo iiCT foram colhidas e liofilizadas e a hCT mostrou—se estar pura por cromatoqrafia.„ 0 produto foi taínbéiTi confirmado como hCT por análise com um analisador de aminoácidos, um sequenciador de aminoácidos em fase gasosa e um espectrómetro FAB-MASS„
J .ug-ijoir-ico us microorganismos ,
o plasmídeo pftc YM1 í foi d eposit tu te Ag en cy of Indus cria λ Scien gashi-1 -c hem se, Tsuk uba-s Hi, I
Fermentation Research In·: sarski-Tratado dt
Technology s (FRI.), i—3, -ken5 da-pan, como FERrI BP--2796, de acordo com Budapeste, em 7 de Marco, 1990«
0 plasmideo pSVL/AE foi deposita^
U w i-S i KJ FERH BR—2797. Março* 199® = de acorde :d?ti
Tratado de Budapeste, em CUIflU de
I ϋ Nu 3 1
J
Kl· TOPOLOGIAS Linear TIPO DE MOLÉCULAs IMucIsótidas com correspcnd itNCIAs 1391 par ria es ps bases :DNft para mRNA OHIOEMs XenoPUs i. ζ~· V" X d a mono;* i qen a se a1fa hxd ro eptidilglicina ds Xenopus laevis
GGGAAGAATG TGTATTTCTG GTTACCTGCG GGGCTAGCAC TGATGGAGTA 50 GGGGGGATTG ATCCAGCTTC CTAATTACCA GGATTACAAC TTGCCTTTAA 100 TTTACTCCTG CAGTAAGGCA CAGACCACAG GGTGGAC ATG GCC AGC CTC 149
Met Ala Ser Leu -37 -35 AGT AGC AGC rpipip CTT GTG CTC TTT CTC TTA TTT CAG AAC AGC 191 Ser Ser Ser Phe Leu Vai Leu Phe Leu Leu Phe Gin Asn Ser -30 -25 -20 TGC TAC TGT TTC AGG AGT CCC CTC TCT GTC TTT AAG AGG TAT 233 Cys Tyr Cys Phe Arg Ser Pro Leu Ser Vai Phe Lys Arg Tyr -15 -10 GAG GAA TCT ACC AGA TCA CTT TCC AAT GAC TGC TTG GGA ACC 275 Glu Glu Ser Thr Arg Ser Leu Ser Asn Asp Cys Leu Gly Thr -5 1 5 ACG CGG CCC GTT ATG TCT CCA GGC TCA TCA GAT TAT ACT CTA 317 Thr Arg Pro Vai Met Ser Pro Gly Ser Ser Asp Tyr Thr Leu 10 15 20 GAT ATC CGC ATG CCA GGA GTA ACT CCG ACA GAG TCG GAC ACA 359 Asp Ile Arg Met Pro Gly Vai Thr Pro Thr Glu Ser Asp Thr 25 30 35 TAT TTG TGC AAG TCT TAC CGG CTG CCA GTG GAT GAT GAA GCC 401 Tyr Leu Cys Lys Ser Tyr Arg Leu Pro Vai Asp Asp Glu Ala 40 45 50
TAC CCT GTA GAG CAT CCA GTA GAG ATT AGC CCT GGG GAT ATT 989 Tyr Pro Vai Glu His Pro Vai Glu Ile Ser Pro Gly Asp Ile 235 240 245 ATA GCA ACC AGG TGT CTG TTC ACT GGT AAA GGC AGG ACG TCA 1031 Ile Ala Thr Arg .Cys Leu Phe Thr Gly Lys Gly Arg Thr Ser 250 255 260 GCA ACA TAT ATT GGG GGC ACA TCT AAC GAT GAA ATG TGT AAT' 1073 Ala Thr Tyr Ile Gly Gly Thr Ser Asn Asp Glu Met Cys Asn 265 270 275 TTA TAC ATC ATG TAT TAC ATG GAT GCG GCC CAT GCT ACG TCA 1115 Leu Tyr Ile Met Tyr Tyr Met Asp Ala Ala His Ala Thr Ser 280 285 TAC ATG ACC TGT GTA CAG ACA GGT GAA CCA AAG CTA TTT CAA 1157 Tyr Met Thr Cys Vai Gin Thr Gly Glu Pro Lys Leu Phe Gin 290 295 300 AAC ATC CCT GAG ATT GCA AAT GTT ccc ATT CCT GTA AGC CCT 1199 Asn Ile Pro Glu Ile Ala Asn Vai Pro Ile Pro Vai Ser Pro 305 310 315 GAC ATG ATG ATG ATG ATG GGA CAT GGT CAC CAC CAT ACA GAA 1241 Asp Met Met Met Met Met Gly His Gly His His His Thr Glu 320 325 330 GCT GAG CCT GAG AAG AAT ACA GGA CTT CAG CAG CCT AAA CGA 1283 Ala Glu Pro Glu Lys Asn Thr Gly Leu Gin Gin Pro Lys Arg 335 340 345 GAG GAG GAA GAA GTA TTA GAT CAG GGT CTC ATT ACC TTA GGG 1325 Glu Glu Glu Glu Vai Leu Asp Gin Gly Leu Ile Thr Leu Gly 350 355 GAT AGC GCA GTG TGA TGGAGGAGGA CATGATCCCT ATACCGTTGA 1370
Asp Ser Ala Vai 360 1391
AGGGGATGAC CCAATCATTT T

Claims (1)

  1. V REIVINDICAi íUcici; Pm* w
    produção de monoxiganasa a-hidro-κiIante de psptid i 1g1ic ina ? caractsrizado pela cultura, de célula; de inssetos transfectadas com um baculovirus recombinante no qua] foi inserido um DHA codificador de uma monoxigeriase s-hidroxi-Xante de peptidilglicina para produzir a enzima. tdcssí-u para vs — Processo de acordo com a reivindicação 1 =, caracte X Π Γ* C D por se preparar um baculovirus recombi nas s te atravKb da !o de um fragmento de cDNA codific ador de uma monoxíqena .se? xxXante de peptidi X g 1 icina. num pX asmideo de t r an s f e r § n c xa ndentío i Lsm gene de *»%#-> 1 iedrina par a constr uir um vector ds transferencia rcombinante e inserção do referido fragmento de cDNA num genoma de baculovirus por recombinaçSo homóloga. Processu ds acordo com a reivindicação *£ r. Lâracts* r i zado par o vector ds t.r ao s *í* erenc xa. ser pAcYMi e o bacu 1 qv í ru.s ‘»©Γ* o vírus da poliedro se nuclear de Autaaraoha californica (AcMNPv ! ) „ - Processo de acordo cdíts a r s i v x n d i c a ç So 1, caracte- rizado pDf a /lion D κ i qst! a.S0 a-hidroxila ,n te de ps ρ t i d i 1 í rç I i c i π a 50 r recuperada na forma purificada ou enriquecida. 5ã — Processo para peptídeo C-terminal caracteri um peptídeo prolongado com gl a produção de uni ca zado por compreender icina C-terminal dâ hid rox i 1 g 1 ic i 1 -a conversão de fórmula (I) R—MH· H-p-COOH sai que R representa um pspfcídec resíduo cilieina. presente? no exfcre xiglicilpeptideo da fórmula (II) R-NH-CHOH-COOH
    i) J usando a enzima μ? eparada uor uír yi ocessu de aeordo cuííi a reivindicação 1, z.a — P T Ω C B s s o de acordo ouísi a reivindicação O, U<{âvi cá C l<0 zado por o a-hidroxj Llgl i c i1peptí dso ser calcitonina humana 1citonina de sa1mão5 cal citonina de galinhas caleit □nina dí ca1c i ton ina enguia» calcitonina de rato, calcitonina bovina;, porcina, calcitonina ovina, c resc i men t.o human a í GHRF) s calcitonina humana \CSRP) luteinizante ÍLHRH)= factor de libertação da hormona de peptídeo r elacionatío com o gene da ou hormona dei ibertação de horme ?oa J ja ~ Processo de ac :ordo com a reivi: rizado por o s~hidroxilglicil .p-^otitíso ssr cal* g 1 i c i1 a .oa no extremo C. 8§ _ Processo para a produção da um no extremo ϋ da fórmula h-NR í-kji i Vfef rS-âo uS UiTi «-hidroxi ípcideo a-aíiiiQaoo (I) caracterisado por compreender a peptídeo com α-hidroxilalicil C—terminal da fórmula κsNH-CHOH-COOH (II) por tratamento com uma base. 9-â - Processa de acorda com a reivindicação 8, caracte- rizado por o material de partida da fórmula (II) ser obtido de acordo com o processo •da reivindic iacao 5« ^4-ίΤΛ*·- VCV ~ \ -¾ "" \\? \i. . n/ terxs nina 10â ~ Processo de acordo cosa a reivindicação S5 carac— a.do por o material de partida, da fórmula (II) ser calcito” humana cc-hidroMilalicilada no estremo C„ lia — Método para o ensaio da monoKigenase o— hidroxi-Xante de peptidilglicina5 caracterisado por compreender os passo·; oa a) rea .cçlo de uma a mostra a Ι.ΙΊ 01 i. ar CDiii um ri«3r\4* r* — y *- * „! ... „ x ϋ çsf u ss tendo um r EíS i d uo de glici na no 0X Γ remo « u- num meio de teri iuD um v alor de pH o p C. X íTí iO pa ra a a cçlo da enzim ia; b) auraento do va. I or de pH da m x s fcur a de rea CCâO para pe pH i0| c) neutral j. So do ffieiO 0 ara. Uffl pH neu tr os ubstracto reacçao lo menos
    o) determinaçSo tie uma quantidade de peptádeo amidado no extremo C formado* Lisboa., 1V rÍ0 Marro q·" 1PP1 J
    J. PEREIRA DA GRUI Agente Oficial da Propriedade Industriai RUA VtCTOR CORDON, 10-A 3.« 1200 USBQA
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