PT96440A

PT96440A - Metodos para modelar estruturas terciarias de ligantes biologicamente activos incluindo agonistas e antagonistas das mesmas e novos antagonistas sinteticos com base na angiotensina

Info

Publication number: PT96440A
Application number: PT96440A
Authority: PT
Inventors: Graham J Moore; John M Matsoukas
Original assignee: Univ Technologies Int
Priority date: 1989-12-29
Filing date: 1991-01-08
Publication date: 1991-10-15
Also published as: CA2072363A1; HU9202147D0; US6060603A; WO1991010140A3; EP0557276A1; AU7034791A; IE904705A1; WO1991010140A2; HUT65361A

Description

MÉTODOS PARA MODELAR ESTRUTURAS TERCIÁRIAS DE LIGANDOS BIOLOGICAMENTE ACTIVOS INCLUINDO AGONISTAS E ANTAGONISTAS DOS MESMOS E NOVOS ANTAGONISTAS SINTÉTICOS DERIVADOS DA ANGIOTENSINA

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO 1. Campo da invenção. A presente invenção diz respeito a métodos para modelação (reprodução exacta) de estruturas terciárias (tridimensionais) de iigandos biologicamente activos, a métodos para concepção e sintese de agonistas e de antagonistas desses iigandos com base em modeios tridimensionais produzidos para tais Iigandos, e ao próprio modelo produzido para a Angiotensina II a partir dos métodos da presente invenção. 2. Estado actual de conhecimentos.

Em química os compostos podem definir-se de diferentes modos. Por exempio, pode definir-se um composto pela sua fórmula empírica que no caso do n-hexano seria simplesmente CgH^. Para moléculas simples tais como a água, o metano, o dióxl· do de carbono, etc., a fórmula empírica pode fornecer informações úteis.

Contudo, quando a complexidade da molécula aumenta, a fórmula empírica deve ser completada com informação estrutural respeitante à ligação covaiente dos átomos individuais opostos de modo a originar informação significativa no que diz respeito à molécula. Esta informação representa-se, na generalidade, sob a forma de ligações covalentes entre os átomos respectivos. Estas estruturas primárias constituem representações ilustradas bem conhecidas de compostos importantes. Na generaiida- i de, estas representações definem-se como a fórmula de estrutura do composto que, por exemplo, no caso do n-hexano, citado antes, seria representada do seguinte modo:

Η Η Η Η Η H

Contudo, mesmo conhecendo a fórmula estrutural das moléculas, é ainda omissa informação importante relativa à posição no espaço tridimensional dos átomos individuais relativamente uns aos outros. Estas estruturas ou conformações tridimensionais de uma molécula determinam-se, em parte, por interacções não covaientes, por exemplo, interacções eventualmente electrostáticas tais como interacções iónicas, ligações de hidrogénio, forças de Van der Waal, etc., entre átomos diferentes da molécula. A informação tridimensional, isto é, a conformação dos ligandos é extremamente valiosa nos ligandos naturais biologicamente activos. Em particular, estes ligandos biologicamente activos comportam, na generalidade, um ou mais sítio(s) activo(s) sobre ou no interior da sua estrutura molecular. Tais sitios activos podem envolver uma interacção devida a transferência de cargas (como se define mais adiante). Quando um destes ligandos se liga à molécula complementar do receptor, o sítio activo actl· va essa molécula afectando desse modo a sua actividade biológica. Esta activação do sítio activo, quer mediante um mecanismo de interacção devida a transferência de cargas quer mediante qualquer outro mecanismo, constitui, na generalidade, um passo necessário na alteração da actividade biológica do receptor. Ainda a este respeito, se fosse possível criar um modelo tridimensional exacto de um ligando natural biologicamente activo [incluindo o(s) seu(s) sítio(s) activo(s)] como observado in vivo, então um tal modelo poderia utilizar-se para criar compostos miméticos como,

O jtL. por exemplo, agonistas e antagonistas, desse ligando. Por exemplo, se se pretendesse eliminar a actividade biológica de um receptor, in vivo, então um modelo tridimensional exacto do ligando natural complementar desse receptor, incluindo o(s) seu(s) sftio(s) activo(s), facilitaria imenso a preparação de antagonistas desse receptor. De igual modo, um modelo tridimensional exacto do ligando pretendido facilitaria também a concepção e a síntese de agonistas em situações em que fosse vantajoso aumentar ou estimular a actividade biológica do receptor in vivo.

Embora já tivessem sido propostos modelos tridimensionais de moléculas, incluindo ligandos, estas representações em três dimensões apresentavam uma ou mais desvantagens graves, especialmente quando respeitantes a ligandos biologicamente activos com sítio(s) activo(s) que utilizam uma interacção devida a transferência de cargas. Os métodos anteriores à presente invenção falharam, em particular, na capacidade para proporcionar um meio simples para identificar o(s) sítio(s) activo(s) de tais ligandos. Deste modo, em tais casos, a criação de um modelo tridimensional de um tal ligando, incluindo o seu sítio activo, foi na generalidade conduzido por técnicas extremamente laboriosas tais como afinidades com a actividade estruturai, considerações teóricas, etc. Contudo, uma vez que estas técnicas não são capazes de identificar uma interacção devida a transferência de cargas no sítio activo desses ligandos, não tem sido possível modelar, isto é, reproduzir com exactidão, compostos miméticos de tais ligandos com uma conformação significativa.

Adicionalmente, outros métodos reconhecidos, que permitem modelar a estrutura terciária de um composto no espaço tridimensional como, por exemplo, a cristalografia por Raios X, apresentam o inconveniente de que com ligandos biologicamente activos as fases necessárias para preparar o ligando para análise podem alterar a estrutura terciária desse ligando e, deste modo, a estrutura determinada pela análise pode não estar de acordo com a estrutura observada in vivo. Além do mais, nem todos os ligandos biologicamente activos são sensíveis a este tipo de análise.

Tendo em atenção o que se afirmou antes, constitui um objectivo da presente invenção desenvolver um processo capaz de reproduzir exactamente a estrutura espacial em três dimensões (terciária) de um ligando biologicamente activo com um ou mais sítio(s) activo(s), utilizando uma interacção devida a transferência de cargas. Constitui ainda um outro objectivo da presente invenção que esta reprodução exacta identifique os grupos químicos no(s) sítio(s) das interacções devidas a transferência de cargas. Constitui ainda um outro objectivo da presente invenção a criação de modelos desses ligandos muito semelhantes à estrutura do ligando observado in vivo. Constitui ainda um outro objectivo da presente invenção a criação de compostos miméticos desses ligandos em relação ao modelo produzido para o ligando. Estes e outros objectivos são atingidos pela presente invenção como evidenciado pelo sumário, memória descritiva detalhada, exemplos e reivindicações da mesma invenção, em anexo.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

Os objectivos citados antes são alcançados pelos métodos de acordo com a presente invenção. Em particular, utilizando estes métodos é possível reproduzir, exactamente, ligandos biologicamente activos com um ou mais sítio(s) activo(s) que utilizam interacções devidas a transferência de cargas. Os métodos de acordo com a presente invenção envolvem a identificação da interacção devida a transferência de cargas utilizando métodos de fluorescência, a identificação dos grupos envolvidos na interacção devida a transferência de cargas mediante estudos da actividade da estrutura e a aplicação de métodos de RMN para solucionar os aspectos restantes da conformação envolvendo a interacção devida a transferência de cargas. Além do mais, o modelo ou a conformação assim obtida é utilizada em um método que permite a concepção de miméticos, isto é, de agonistas e de antagonistas desses ligan-dos. Deste modo, considerando um dos aspectos deste método, a presente invenção diz respeito a um processo que permite a realização de um modelo espacial tridimensional de um ligando biologicamente activo com um ou mais sítio(s) activo(s) baseado em uma interseção devida a transferência de cargas e comportando ainda uma fórmula estrutural conhecida na qual as atribuições espaciais tridimensionais de cada um dos átomos do ligando são determinadas no modelo pelas fases seguintes: a) determinação da presença de interacção(ões) devida(s) a transferência de cargas no ligando citado por análise de fluorescência desse ligando em um meio compatível com a fluorescência; b) determinação dos grupos quimicos envolvidos na(s) citada(s) inte-racção(ões) devidas a transferência de cargas; e c) resolução dos restantes aspectos da conformação tridimensional dos ligandos mediante obtenção de informação conformacionai relativa ao(s) sítio(s) activo(s), proveniente do espectro de ressonância magnética nuclear utilizando o efeito de Overhauser nuclear [NOE (Nuclear Overhauser effect)] com a condição do peso molecular desse ligando ser quer inferior a aproximadamente 500 quer superior a aproximadamente 2000 quando a técnica do efeito de Overhauser nuclear utilizada nesta fase é a técnica NOESY.

Um outro aspecto do método de acordo com a presente invenção está relacionado com um processo para reprodução exacta de antagonistas de um receptor biologicamente activo com base em um modelo produzido para um ligando biologicamente activo complementar desse receptor em que o citado ligando comporta um ou mais sítios activos com base em uma interaeção devida a transferência 3 de cargas e apresenta ainda uma forma estrutural conhecida, processo esse carac-terizado peias fases seguintes: a) realização de um modelo espacial tridimensional para esse ligando mediante i) determinação da presença de interacção(ões) devl· da(s) a transferência de cargas no citado ligando por análise de fluorescência do mesmo ligando em um meio compatível com a fluorescência; ii) determinação dos grupos químicos envolvidos na(s) in-teracção(ões) devida(s) a transferência de cargas citada(s) antes; e iii) resolução dos aspectos restantes da conformação tridimensional dos ligandos mediante obtenção de informação conformacional relativa aos sítios activos por espectroscopia de ressonância magnética nuclear utilizando o efeito de Overhauser nuclear com a condição do peso molecular do referido ligando ser quer inferior a aproximadamente 500 quer superior a aproximadamente 2000 quando a técnica do efeito de Overhauser nuclear utilizada nesta fase é a técnica NOESY; b) identificação de um composto com uma estrutura tridimensional suficientemente similar à desse ligando de tal modo que é complementar do mesmo ligando e em que peio menos uma das interacções devidas a transferência de cargas no citado composto ficou comprometida.

Ainda um outro aspecto do método de acordo com a presente invenção diz respeito a um processo de reprodução exacta de agonistas de um receptor biologicamente activo com base em um modelo realizado para um ligando biologicamente activo complementar do citado receptor, comportando esse ligando um ou mais sftio(s) ac-tivo(s) com base em uma interacção devida a transferência de cargas e apresentando ainda uma fórmula estrutural conhecida, que consiste nas fases: a) realização de um modelo espacial tridimensional do citado ligando mediante i) determinação da presença de interacção(ões) devidas a transferência de cargas nesse ligando por análise de fluorescência do mesmo ligando em um meio compatível com a fluorescência; ii) determinação dos grupos químicos envolvidos nes-sa(s) interacção(ões) devida(s) a transferência de cargas; e iii) resolução dos aspectos restantes da conformação tridimensional do ligando mediante obtenção de informação conformacional relativa ao(s) sítio(s) activo(s) por espectroscopia de ressonância magnética nuclear utilizando o efeito de Overhauser nuclear com a condição do peso molecular do citado ligando ser quer inferior a aproximadamente 500 quer superior a aproximadamente 2000 quando a técnica do efeito de Overhauser nuclear utilizada nesta fase é a técnica de NOESY; e b) identificação de um composto com uma estrutura tridimensional suficientemente similar à do citado ligando de tal modo que é complementar do citado receptor e em que a(s) interacção(ões) devidas a transferência de cargas nesse composto não foi(foram) comprometida(s).

Ainda um outro aspecto do método de acordo com a presente invenção diz respeito a um processo para determinar a presença de interacção(ões) devidas a transferência de cargas na estrutura terciária de um ligando biologicamente activo complementar de um receptor biologicamente activo, que consiste em realizar uma análise de fluorescência do citado ligando em um meio compatível com a fluorescência.

Em um aspecto preferido, os processos descritos antes são particularmente apropriados para reproduzirem exactamente uma estrutura espacial tridimensional da

Angiotensina II. A figura 6 desta memória descritiva ilustra uma fotografia estereo de um modelo molecular (modelo tridimensional) da Angiotensina II. A figura 7A desta memória descritiva ilustra uma fotografia estereo de um modelo molecular (tridimensional) da Angiotensina II ligada ao receptor. Consequentemente, um outro aspecto da presente invenção diz respeito a um modelo de Angiotensina II ilustrado na figura 6 bem como a um modelo de Angiotensina II ligada ao receptor ilustrado na figura 7A.

Um aspecto do produto de acordo com a presente invenção diz respeito a um composto de fórmula geral: r2 £

na qual s α, β, y, δ e s representam átomos de carbono, azoto, oxigénio ou enxofre com a condição de (a) o núcleo conter, pelo menos, um átomo de carbono e um átomo de azoto, e (b) a ligação dos grupos representados pelo símbolo R fazer--se no átomo de carbono ou de azoto; e ainda preferivelmente com a condição de

(c) pelo menos um átomo de azoto no núcleo permanecer in-substitufdo, e (d) o pKa do núcleo ser igual ou inferior a 7 quando todos os grupos presentes forem considerados;

RlA que imita na angiotensina a estrutura

CH - CO - N - CH - CO

inclui um grupo -alq; -O-alq; -alq-O-alq; -CH2-CO-NH2; -CH2-CO-NH-alq; -CH2-CO-N(alq)2;~ ch2 - co - n

alq -CH2-CO-AA-NH2 ou CH2-CO-AA-fenilo em que alq representa um grupo alquilo com 1 a 10 átomos de carbono, ciclo-alquilo com 3 a 6 átomos de carbono, alcenilo com 2 a 10 átomos de carbono ou alcinilo com 2 a 10 átomos de carbono; e AA representa um aminoácido, de preferência a prolina, 0 ácido azetidina-carboxílico, 0 ácido pipecólico, 0 ácido nipe-cótico, a glicina, a alanina, a sarcosina ou a N-metil-alanina; R-IB que eventualmente fornece um grupo espaçador que termina em um imitador do grupo carboxilato C-terminal da angiotensina II representa um átomo de hidrogénio ou um grupo de fórmu-

9

em que alq tem o significado definido antes e A representa um grupo ácido ou um seu sal aceitável sob o ponto de vista farmacêutico incluindo, embora sem carácter limitativo, um grupo -CO2H, -C02álq, -SO3H, -SO4H2, -P03H, -PO4H2, F3CCONH-, F3CS02NH-, -alq-SH ou y

N — N

N-N

H ou um grupo de fórmula geral -CO2R+ na qual R+ representa um profármaco de um éster lipofílico tal como um grupo de fórmula geral -CH2C02C(CH3)3 ou outro similar; de preferência com a condição de (a) 0 símbolo a e/ou y não representarem) um átomo de azoto quando 0 núcleo representa um grupo imidazólico, (b) ou 0 símbolo α representar um átomo de carbono ou 0 símbolo β representar um átomo de azoto quando 0 núcleo não representar um grupo imidazólico, (c) 0 símbolo R-ja comportar um grupo contendo um radical amida, (d) R2 comportar um grupo que inclui um radical representado pelo símbolo A, ou (e) R3 comportar um grupo designado por B escolhido entre um grupo alcalino ou um seu sal aceitável sob 0 ponto de vista farmacêutico englobando, embora sem carácter limitativo, .10

alq ; ou um grupo -NH2, -NHalq, -N(alq)2 ou n um grupo -Asp-Arg-NH2i quando R<| b representa um átomo de hidrogénio; R2 que fornece propriedades estereoquimicas e/ou electrónicas e/ou um grupo espaçador que termina em um grupo ácido, representa um átomo de hidrogénio ou de haiogéneo, isto é, um átomo de flúor, cloro, bromo ou iodo, um grupo -alq; -O-alq; -NO2;

R3 que fornece propriedades estereoquimicas e/ou electrónicas e/ou um grupo mimético do radical hidroxi da tirosina da angio-tensina II na sua conformação de "interruptor de carga" ("charge relay") ou um grupo espaçador que termina em um imitador do N-terminal do dipeptido N-terminal da angio-tensina II, representa um átomo de hidrogénio; um grupo -alq; -arilo; -alq-OH; -alq-halogeneto; -CH2-0-alq; -CH2-CN; -CH2-CO2H; -CH2C02-a!q; -NH-CO-alq; -CO-NH-alq; -alq-B; -CH(OH)-alq-B; -alq-Asp-Arg-NH2', / \ -CH(OH)-alq-Asp-Arg-NH2; -alq-C || ;

H 11

ou -ai> •8

Β F*4a que fornece um grupo espaçador, cuja rigidez relativa constitui um aspecto do modelo de acordo com a presente invenção, que termina em um grupo ácido que imita os grupos hidroxi da tirosina da angiotensina II na sua conformação de "ligação ao receptor", representa grupos de fórmula geral

x

em que Z representa uma ligação, um átomo de oxigénio ou um grupo -NHCO-, OCH2- ou -CH2S X representa um grupo -C02H, -alq-C02H, -PO3H, -alq-P03H, -PO4H2, -alq-P04H2, -SH, -alq-SH, -SO3H, -alq-S03H, -SO4H2, 12 -alq-S04H2, F3C-CO-NH-, F3C-SO2-NH-, Ν—Ν \ ου ainda um outro grupo ácido ou um seu sai aceitável sob o ponto de vista farmacêutico; e Y representa um átomo de hidrogénio ou de halogéneo ou um grupo -NO2, -O-alq, -alq, -CF3 ou -CN; e F?4B que fornece eventuaimente um grupo espaçador que termina em um imitador do N-terminai do dipeptido N-terminal da angiotensina, representa um átomo de hidrogénio, um grupo -alq-B, -alq-Asp-Arg-NH2, alq-O-alq-B, alq-0-alq-Asp-Arg-NH2, ou -alq— de preferência com a condição de (a) 0 símbolo <x e/ou y não representar(em) um átomo de azoto quando 0 núcleo representa um grupo imidazólico, (b) ou 0 símbolo α representar um átomo de carbono ou 0 símbolo β representar um átomo de azoto quando 0 núcleo não representa um grupo imidazólico, (c) 0 símbolo R*ja comportar um grupo que inclui um radical amida, (d) R2 comportar um grupo contendo um radical representado pelo símbolo A, ou (e) R3 comportar um radical contendo um grupo representado pelo símbolo B ou um grupo -Asp-Arg-Nh^, quando R4B representa um átomo de hidrogénio. 13

Em um aspecto do produto particularmente preferido de acordo com a presente invenção, o núcleo pentagonal citado antes representa um grupo imidazólico.

Outro aspecto do produto de acordo com a presente invenção diz respeito a um composto de fórmula geral:

na qual α, β, y, δ, ε e ei representam, cada um, um átomo de carbono, azoto, oxigénio ou enxofre, com a condição de (a) o núcleo comportar, pelo menos, um átomo de carbono ou um átomo de azoto, e (b) a ligação dos grupos representados pelo símbolo R fazer--se ao átomo de carbono ou de azoto e ainda, de preferência, com a condição de (c) pelo menos um átomo de azoto do núcleo permanecer in-substituído, e (d) o pKa do núcleo ser igual ou inferior a 7 quando se consideram todos os grupos presentes; e r1A> r1B. r2* r3> r4A> z> X» Y. r4B. halogeneto, A e B têm os significados definidos antes. 14

Um outro aspecto do produto de acordo com a presente invenção diz respeito a compostos de fórmula geral:

configuração 111 em que α, β e y representam um átomo de carbono ou de azoto, com a condição de apenas um átomo de azoto comportar substituintes; R-j representa um grupo de fórmula geral -CH(Ria)(Rib) na dual R-ja e Rí b têm os significados definidos antes, R4 representa um grupo de fórmula geral -CH(R4a)(R4B) na qual R4A e R4B têm os significados definidos antes, R2 e R3 têm os significados definidos antes, e R5 tem os significados definidos antes para 0 símbolo Ri, com a condição de (a) Ri a comportar um grupo contendo um radical amida, ou (b) Ri localizar-se em um átomo de azoto ou ±5 (c) R4 localizar-se em um átomo de carbono, quando Rjb representa um átomo de hidrogénio.

DESCRIÇÃO RESUMIDA DAS FIGURAS A Figura 1 representa um modelo molecular (modelo espacial tridimensional) da [Sar1 JAngiotensina II desenvolvido utilizando os métodos de acordo com a presente invenção. A Figura 2A diz respeito a uma representação bidimensional de um antagonista da Angiotensina II, a sarmesina, isto é, [Sar1Tyr(Me4)lAngiotensina II. A Figura 2B diz respeito a uma representação bidimensional da Angiotensina II. A Figura 2C diz respeito a uma representação bidimensional de um antagonista da Angiotensina II, a sarilesina, isto é, [Sar1 lle8]Angiotensina II. A Figura 3A diz respeito a uma representação bidimensional de um exemplo de um composto N-benziMmidazóIico e a Figura 3B diz respeito a uma representação bidimensional de um exemplo de um N-benzamidobenziMmidazol, compostos que se incluem ambos em uma classe de compostos que são antagonistas da Angiotensina II. A Figura 4A diz respeito a um modelo molecular (por exemplo, um modelo espacial em três dimensões) da Angiotensina II desenvolvido por métodos de acordo com a presente invenção, enquanto a Figura 4B diz respeito a um mapa de distribuição de cargas da Angiotensina II obtido colocando as cargas relativas encontradas na Angiotensina II sobre 0 modelo representado na Figura 4A. 16 A Figura 5A diz respeito a uma fórmula estrutural bidimensional da porção imida-zóiica da Angiotensina II, enquanto a Figura 5B diz respeito a uma sobreposição das partes comuns dos compostos representados nas Figuras 3A e 3B e representadas por linhas sólidas sobre a porção imidazólica da Angiotensina II descrita na Figura 5A e representada a tracejado. A Figura 6 representa uma fotografia estereofotogramétrica de um modelo de Angiotensina II preparado pelos métodos de acordo com a presente invenção. A Figura 7A representa uma fotografia estereofotogramétrica da forma de ligação ao receptor da Angiotensina li. A Figura 7B representa uma fotografia estereofotogramétrica da sobreposição do composto representado na Figura 7C sobre a forma de ligação ao receptor da Angiotensina II representada na Figura 7A.

Nos modelos moleculares 2 cm = 1 Â. Os entendidos na matéria reconhecem que quando os modelos das Figuras 6 e 7 são construídos por Minit Molecular Models, Chocranes, Oxford, U.K., os modelos coloridos permitem uma percepção mais fácil das configurações do que as fotografias estereofotogramétricas a preto e branco fornecidas com a presente memória descritiva. (Adicionalmente os entendidos na matéria reconhecem que nas Figuras 1,4, 6 e 7 é visível um erro aparente que consiste na representação inadvertida dos aminoãcidos valina e ácido aspártico na configuração D em vez de se apresentarem na configuração correcta L.)

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

Embora tenham sido realizadas investigações respeitantes à conformação de ligan-dos naturais biologicamente activos tais como a Angiotensina II, estas investigações, na generalidade, não consideraram a presença de uma interacção devida a transfe- rência de cargas no ligando, necessária para a activação do receptor e, consequentemente, não foi possível, nessa época, reproduzir com exactidão, facilmente, ligan-dos bem como compostos miméticos desses ligandos de conformação significativa. Contudo, utilizando os métodos de acordo com a presente invenção que tem em consideração as interacçOes devidas a transferência de cargas, é presentemente possível modelar ligandos biologicamente activos com sítio(s) activo(s) que utilizam interacções devidas a transferência de cargas com uma conformação significativa. Além do mais, é também possível utilizar os métodos de acordo com a presente invenção para reproduzir exactamente compostos imitadores destes ligandos. Contudo, antes de se iniciar a observação detalhada da presente invenção, devem definir--se em primeiro lugar os termos seguintes. "Interseção devida a transferência de cargas" - é uma interaeção electrostática que envolve um resto fenólico no qual uma carga aniónica é transferida de um grupo com carga para um grupo sem carga. De acordo com um dos aspectos da presente invenção, o resto fenólico não se apresenta inicíalmente com carga, isto é, é o fenol, e como resultado da interaeção de transferência de cargas este resto capta uma carga aniónica de um outro grupo com carga; assim neste aspecto da presente invenção o grupo fenólico transforma-se em um resto de um fenoiato. Em um outro aspecto da presente invenção, o resto fenólico apresenta-se inicialmente com carga, isto é, é um fenoiato, e como resultado da interaeção devida a transferência de cargas, este resto transfere a sua carga aniónica para um grupo que originalmente não comporta qualquer carga; assim neste processo o resto de um fenoiato transforma--se em um resto fenólico.

Qualquer resto fenólico encontrado em um ligando biologicamente activo se pode utilizar na interaeção devida a transferência de cargas. Restos fenólicos apropriados

ÍS

incluem os observados no aminoácido tirosina e seus derivados, em esteróides com um grupo fenóiico tais como o estradiol [estra-1,3,5(1Q)-trieno-3,17,diol] e seus derivados, em catecoiaminas tais como a norepinefrina e seus derivados, em iigandos contendo naftol ou outros similares. A lista descrita antes não é exaustiva relativamente a componentes naturais que utilizam restos fenólicos, apresentando-se apenas com o objectivo de exemplificar restos fenólicos como os que se podem observar em diferentes Iigandos biologicamente activos. "Sítios activos com base em interacções devidas a transferência de cargas” — dizem respeito a um ou mais sftio(s) de activação em um ligando biologicamente activo (para activar um receptor biologicamente activo) que se baseia(m) em uma interacção electrostática envolvendo um resto fenóiico no qual uma carga aniónica é transferida de um resto com carga para um resto sem carga. Consequentemente, nestas interacções, pelo menos, um dos resíduos representa quer um resto fenóiico quer um resto de um fenolato. Nestes Iigandos, a activação do receptor pelo ligando não pode ocorrer sem a interacção devida a transferência de cargas. Inicialmente, as interacções devidas a transferência de cargas foram sugeridas para Iigandos tais como a Angiotensina II. Consultar, por exemplo, Moore et al., Bioscience Reports, 5, pág. 407-416 (1985), que propôs que a transferência de uma carga negativa para o carboxilato C-terminal através do resto imidazólico do aminoácido histidina para a cadeia lateral da tirosina dã origem à formação de fenolatos que após a interacção com o receptor activam o receptor da angiotensina II. Estas interacções devidas a transferência de cargas permitem ao ligando modificar o seu carácter electrostâtico em uma forma que permite a activação do receptor. A interacção devida a transferência de cargas necessita não ser apenas uma interacção electrostática restringida unicamente ao ligando mas também poder envolver 19 uma transferência de cargas quer de um resto posicionado no iigando para um resto posicionado no receptor quer de um resto posicionado no receptor para um resto posicionado no iigando, sendo essa transferência uma pré-condição necessária para activar o receptor pelo ligando. Por exemplo, a formação de tirosinatos no ligando pode resultar da transferência de uma carga aniónica de um resto aniónico posicionado no receptor. Mediante formação de tirosinatos o iigando é depois capaz activar o receptor.

Os métodos de acordo com a presente invenção utilizam técnicas que permitem a detecção de interacções devidas a transferência de cargas em iigandos biologicamente activos ou em complexos de um ligando biologicamente activo / um receptor biologicamente activo. Estas técnicas utilizam uma análise de fluorescência como seguidamente se apresenta, em um meio compatível com a fluorescência. "Ligando" - qualquer composto orgânico relativamente ao qual existe um receptor ou natural ou que se pode preparar. "Ligando biologicamente activo" -- uma molécula que se liga a uma outra molécula de um receptor biologicamente activa e que afecta directa ou indirectamente a activida-de da molécula do receptor. A ligação destes Iigandos à molécula do receptor (aceitador) é, consequentemente, uma pré-condição necessária para iniciar, terminar, alterar ou impedir a actividade biológica na molécula do receptor. Qualquer ligando que afecta a actividade biológica da molécula do receptor diz-se um ligando biologicamente activo. Um ligando biologicamente activo pode ser um substrato, um ago-nista, um antagonista, um activador, um inibidor, etc.. Quando um ligando é capaz de se unir a um receptor especifico, o par formado pelo ligando e pelo receptor diz-se complementar. Exemplos de Iigandos biologicamente activos estão bem documenta- dos na química da especialidade. Exemplos de ligandos biologicamente activos importantes incluem, por exemplo, a oxitocina (na qual os receptores complementares presentemente conhecidos são o receptor da oxitocina e a neurofisina associada à oxitocina), a vasopressina (em que os receptores complementares presentemente conhecidos são o receptor \A|, o receptor V2 e a neurofisina associada à vasopressina), a Angiotensina II (em que 0 receptor complementar presentemente conhecido é designado por receptor da angiotensina II), ou outros similares.

Um ligando biologicamente activo pode, eventualmente, ser de natureza peptldica. Tais ligandos podem ser inseparáveis do organismo onde se encontrou 0 receptor biologicamente activo. Quando 0 ligando ocorre naturalmente nesse organismo, designa-se por ligando natural biologicamente activo. Por outro lado, os ligandos biologicamente activos podem ser moléculas de síntese que são complementares de um receptor biologicamente activo e que alteram a actividade biológica do receptor. Assim qualquer molécula complementar de um receptor biologicamente activo e que altera a actividade biológica desse receptor é um ligando biologicamente activo.

Quando a ligação do ligando biologicamente activo ao receptor biologicamente activo e a activação do sítio activo dá origem a uma alteração da actividade biológica do receptor, por exemplo, inicia, aumenta, diminui ou interrompe a actividade biológica do receptor, diz-se que 0 ligando é afectado directamente pela actividade do receptor. Por outro lado, um ligando biologicamente activo afecta indirectamente a actividade do receptor biologicamente activo quando a ligação do ligando ao receptor dá origem a uma incapacidade para activar 0 receptor (porque 0 ligando possui uma interacção devida a transferência de cargas comprometida - como no caso de um antagonista). 21

A activação do sítio activo de um complexo natural biologicamente activo constituído por um ligando/receptor é na generalidade efectuada por uma determinada espécie de interacção química no interior do ligando ou entre o ligando e o receptor. Como se observou antes, quando a interacção química envolve uma transferência de car-gas de um resto para outro, sendo um dos restos ou um fenol ou um fenolato, a interacção designa-se por interacção devida a transferência de cargas. Pensa-se que estas interacções dão origem a uma alteração da estrutura do ligando ou do complexo ligando/receptor que activa depois o receptor. Porque, presentemente, estas interacções devidas a transferência de cargas podem detectar-se utilizando técnicas de acordo com a presente invenção, é agora possível considerar essas mesmas interacções em um modelo criado para um ligando natural biologicamente activo e para produzir agonistas e antagonistas relativamente ao receptor complementar.

De preferência, quando analisado por espectroscopia de ressonância magnética nuclear utilizando o efeito de Overhauser nuclear (como definido mais adiante) o ligando deve apresentar um peso molecular inferior a, aproximadamente, 15.000 daltons e de preferência inferior a, aproximadamente, 10.000 daltons, preferivelmente inferior a, aproximadamente, 5.000 daltons e ainda de maior preferência inferior a, aproximadamente, 3.000 daltons. Contudo, na análise de fluorescência de acordo com a presente invenção pode utilizar-se um ligando biologicamente activo com um qualquer peso molecular. "Angiotensina II" -- diz respeito a um ligando biologicamente activo que consiste em um octopeptido representado peia seguinte sequência de aminoâcidos Asp-Arg-Val-Tyr-1 le-H is- Pro- Phe na qual cada uma das abreviaturas citadas é uma abreviatura convencional utilizada para aminoâcidos na literatura da especialidade.

Ocitocina" -- diz respeito a um ligando biologicamente activo que consiste em um nonapeptido representado pela sequência de aminoàcidos seguinte Cys-Tyr-lle-Gln-Asn-Cys-Pro-Leu-GlyNH2 na qual as abreviaturas citadas são abreviaturas convencionais utilizadas para os aminoàcidos na literatura da especialidade. "Vasopressina" (vasopressina com arginina) -- diz respeito ao ligando biologicamente activo que consiste em um nonapeptido representado peia sequência de aminoâci-dos seguinte

Cys-Tyr-Phe-Gin-Asn-Cys-Pro-Arg-GlyNH2 na qual as abreviaturas citadas são abreviaturas convencionais utilizadas para os aminoàcidos na literatura da especialidade. "Receptor" - uma molécula que se liga ao ligando. "Receptor biologicamente activo" - uma molécula comportando um sítio de ligação específico relativamente ao ligando complementar, e que pode incluir receptores clássicos de hormonas, proteínas de ligação e/ou de transporte, enzimas, anticorpos ou outros compostos similares. Um exemplo de um receptor biologicamente activo inclui proteínas que se ligam à membrana e que controlam determinados processos celulares, sendo elas próprias reguladas pela ligação (ou ausência de ligação) do seu ligando complementar natural biologicamente activo. Devido a estes receptores biologicamente activos com capacidade de se ligarem à membrana estarem unidos à mesma, acredita-se que a conformação do ligando biologicamente activo necessária 7' para activar esses receptores é induzida por iípidos. Consultar, por exemplo, Sargent et al., Proc. Natl. Acad. Sei. (USA), 83(16¾. pág. 5774-5778 (1986) e Surewicz et al., J. Amer. Chem. Soe., 110, pág. 4412-4414 (1988). Por outro lado, existem outros receptores biologicamente activos que não se encontram ligados à membrana. Nestes casos, esses receptores podem não exigir que o ligando biologicamente activo apresente uma conformação induzida por Iípidos, podendo, de facto, exigirem que o ligando biologicamente activo complementar apresente uma conformação induzida por uma solução aquosa de modo a activar aqueles receptores.

Na literatura da especialidade encontram-se bem documentados exemplos de receptores biologicamente activos. Exemplos específicos incluem o receptor da insulina (em que o ligando complementar é a insulina), o receptor V1 (em que o ligando complementar é a vasopressina), o receptor V2 (em que o ligando complementar é a va-sopressina), a ocitocina-neurofisina (em que o receptor complementar é a ocitocina), o receptor da Angiotensina li (em que o ligando complementar é a Angiotensina II) ou outros similares. "Agonista" - é um ligando biologicamente activo que se liga ao seu receptor complementar biologicamente activo e activa este último quer de modo a provocar uma resposta biológica no receptor quer de modo a reforçar a actividade biológica pré-existente do receptor. Este agonista pode ser um ligando biologicamente activo natural ou pode ser uma molécula sintética que active também o receptor. Por exemplo, os entendidos na matéria sabem que a Angiotensina II actua como um agonista relativamente ao seu receptor complementar, o receptor da Angiotensina II. Outros exemplos de agonistas relativamente ao receptor da angiotensina II incluem a [Sar1]An-giotensina II ou outros similares. Exemplos de agonistas relativamente a outros receptores incluem a norepinefrina (relativamente aos seus receptores complemen- 24 tares, os receptores alfa ou beta adrenérgicos). Na presente invenção todos os ago-nistas apresentam uma caracteristica comum que consiste no facto da interacçâo devida a transferência de cargas no agonista, que é necessária para activar o re-ceptor biologicamente activo, não está comprometida. Quer isto dizer que a interac-ção devida a transferência de cargas é realizável no agonista. "Antagonista" - um ligando biologicamente activo que se liga ao seu receptor complementar biologicamente activo e impede quer a activação deste último quer a desactivação do mesmo, de modo que impede ou diminui a actividade biológica do receptor. Por exemplo, os entendidos na matéria sabem que os compostos não pep-tidicos, o ácido 2-n-butiM-[4-cart)OXibenzil]-4-cloroimidazol-5-acético e o sal sódico do 2-n-butil-1-[4-(2-carboxibenz-amido)benziI]-4-cloroimidazoi-5-acetato de metilo, actuam como antagonistas do receptor da Angiotensina ii. Consultar Hypertension, 13, N° 5, Maio de 1989. Outros exemplos de antagonistas do receptor da Angiotensina il reconhecidos peia literatura da especialidade incluem o peptido sarmesina ou outros similares. Exemplos de antagonistas de outros receptores biologicamente ac-tivos reconhecidos pela literatura da especialidade incluem o propanolol relativamente ao receptor adrenérgico beta, a cimetidina relativamente ao receptor H2 da hista-mina ou outros similares. Uma caracteristica comum de todos os antagonistas incluídos na presente invenção é que a interacçâo devida a transferência de cargas no antagonista, necessária para activar 0 receptor biologicamente activo, está comprometida. Isto quer dizer que a interacçâo devida a transferência de cargas no antagonista está danificada e consequentemente 0 mesmo não pode activar 0 receptor complementar. Por exemplo, um método de destruir a interacçâo devida a transferência de cargas consiste em modificar 0 grupo hidroxi do radical fenol mediante por exemplo metilação (por exemplo, formando 0 grupo -0-O-CH3). Um outro método Ί para destruir a interacção devida a transferência cargas consiste em remover o grupo hidroxi do radicai fenoi alterando, por exemplo, fenoi para fenilo.

Por exemplo e como se mencionou antes, Moore et al., Bioseience Reports, 5, pâg. 407-416 (1986), propôs a presença de uma interacção devida a transferência de cargas na Angiotensina II entre o resto carboxilato C-terminal, o aminoácido histidina e o aminoácido tirosina. Devido à existência desta interacção devida a transferência de cargas, conhecem-se duas classes de antagonistas da Angiotensina li, as quais apresentam uma interacção devida a transferência de cargas danificada. A primeira ciasse envolve antagonistas em que o grupo hidroxi da tirosina se encontra modificado ou eliminado e em que o aminoácido N-terminal foi modificado (por exemplo, [Sar1Tyr(Me)4]Angiotensina II, sarmesina). A outra classe de antagonistas da Angiotensina II envolve antagonistas em que o C-terminal se encontra modificado, com ou sem modificação concomitante de outras partes da molécula (por exemplo, [Sar1 lle8]Angiotensina II, sarilesina).

Assim, embora se considere que um antagonista é um ligando biologicamente activo, não é um ligando biologicamente activo com um sitio activo baseado em uma interacção devida a transferência de cargas porque, por definição, esta interacção devida a transferência de cargas foi danificada. "Miméticos" -- diz respeito a agonistas e a antagonistas de um receptor biologicamente activo mas que apresenta uma fórmula estrutural diferente (estrutura primária) do ligando biologicamente activo natural desse receptor. Quer isto dizer que os miméticos são ligandos não naturais biologicamente activos. “Estrutura terciária de um ligando bioiogicamente activo" - é uma expressão reconhecida peia química da especialidade que descreve a organização tridimensional jn vivo dos átomos individuais desses ligandos incluindo o mapa de distribuição de car-gas resultantes. A estrutura terciária de um ligando biologicamente activo (frequentemente designada a sua “conformação") reflecte interacções não covaientes entre/no meio de átomos bem como ligações covaientes entre átomos. Interacções não cova-lentes incluem quer interacções electrostáticas quer interacções não electrostáticas tais como ligações iónicas, ligações de hidrogénio, forças de Van der Waal, etc.. Porque o alcance e a natureza dessas interacções não covaientes dependem da polaridade do dissolvente no seio do qual são avaliadas, a estrutura terciária (conformação) desses ligandos modrficar-se-à quando subtraídos in vivo ao seu micro-am-biente e colocados em um meio de polaridade diferente. “Meio compatível com a fluorescência" — é um meio que permite detectar fluorescência de longa duração [LLF (Long Irfetime fluorescence) - definida mais adiante). A este respeito, deve ter-se em atenção que determinados dissolventes tais como o dimetilsulfóxido (DMSO) e a água não permitem a detecção de fluorescência de ionga duração, presumivelmente devido a factores como extinção da fluorescência induzida por dissolventes ou interferência de dissolventes com formação de ligações de hidrogénio intramolecuiares. Por outro lado, a utilização de soluções aquosas de micelas e de sistemas bifásicos de lípidos bem como a utilização de dissolventes com uma constante dieléctrica de, aproximadamente, 40 ou inferior, permite a detecção de fluorescência de ionga duração. Como meio compatível com a fluorescência, utilizam-se, de preferência, dissolventes com uma constante dieléctrica inferior a 40. Mais preferivelmente, a constante dieléctrica do meio compatível com a fluorescência está compreendida entre, aproximadamente, 2 e, aproximadamente, 40. Dissolventes apropriados com uma constante dieléctrica de, aproximadamente, 40 ou infe- rior incluem, por exemplo, propilenoglicol, isopropanol, trifluoroetanol ou outros similares. Por último, o dissolvente escolhido não deve possuir fluorescência na região em que se pretende detectar a LLF. "Meio simulador do meio que rodeia um receptor" - diz respeito a um meio criado para simular a polaridade do micro-ambiente in vivo na vizinhança imediata de um receptor biologicamente activo. Como se observou antes, quando um ligando biologicamente activo é colocado em um meio de polaridade diferente do seu micro-ambiente in vivo, a sua estrutura terciária alterar-se-á, mas não a sua fórmula estrutural, isto é, as ligações covalentes não se alterarão. A adição de um ligando biologicamente activo a um meio simulador do meio de um receptor permite ao ligando tomar, fundamentalmente, a configuração da estrutura terciária que possuiria se colocado no micro-ambiente do seu receptor biologicamente activo complementar. Por exemplo, e como se observou antes, para os receptores biologicamente activos ligados a uma membrana, pensa-se que a conformação de um ligando biologicamente activo responsável pela activação do receptor é induzida por Ifpidos. Consequentemente, para estes receptores, o meio simulador do meio que os rodeia será menos polar do que meios aquosos, tendo-se observado que dissolventes com uma constante dieléctrica de, aproximadamente, 50 ou inferior, proporcionam para receptores ligados a uma membrana um meio simulador do meio que os rodeia. Dissolventes apropriados com uma constante dieléctrica de, aproximadamente, 50 ou inferior incluem o dimetilsulfóxido (DMSO), o trifluoroetanol, o isopropanol, o propilenoglicol ou outros similares. Para receptores não ligados a uma membrana, um dissolvente com uma constante dieléctrica, aproximadamente, igual à da água ou inferior fornecerá um meio simulador do meio que rodeia esses receptores. "Modelo espacial tridimensional de um ligando biologicamente activo" -- diz respeito à estrutura terciária de um ligando biologicamente activo criado a partir de técnicas analíticas descritas na presente memória descritiva. A criação destes modelos espaciais tridimensionais é, às vezes, referida na presente memória descritiva como "modelação" ou "reprodução exacta".

Porque as técnicas de RMN utilizadas para criar um modelo espacial tridimensional utilizam um meio simulador do meio que rodeia o receptor, o modelo criado ajustar--se-á, substancialmente, à estrutura terciária do ligando biologicamente activo. Contudo, porque a polaridade do dissolvente que simula o ambiente não será exacta-mente o mesmo do micro-ambiente in vivo, o modelo tridimensional possuirá variações secundárias em comparação com a estrutura terciária. Desde que se utilize um meio simulador do meio que rodeia o receptor, as variações resultantes serão, na realidade, pouco importantes e o modelo espacial tridimensional fornecerá informação importante no que respeita à estrutura terciária, in vivo, de um ligando biologicamente activo. "Espectroscopia de RMN utilizando o efeito de Overhauser nuclear" - diz respeito a métodos de ressonância magnética nuclear que permitem compreender a organização espacial tridimensional dos átomos do ligando. Métodos de RMN apropriados incluem RMN 1H protónica, RMN 19F, RMN 13C ou outras similares. De preferência utiliza-se a RMN protónica. A primeira fase desta metodologia utiliza o método COSY ("Correlated Spectroscopy") que consiste em um espectro de RMN bidimensional que informa sobre modelos de acoplamento através de uma ligação no interior de uma molécula. O método COSY permite a determinação, no ligando, de ressonâncias protónicas indl- 29 viduais no seio do espectro de protões especiais. Esta informação é depois utilizada para identificar correlações NOE. Os entendidos na matéria conhecem bem o método COSY que Cheatham descreve em Journal of Chemical Education, 66, pág. 111--117 (1989). Em alguns casos, a metodologia COSY pode ser completada com as metodologias ROESY e NOE 1-D na indicação de ressonâncias protõnicas individuais no interior do espectro de protões especiais do ligando.

Uma vez concluidas as atribuições bidimensionais via metodoiogia COSY, a fase seguinte consiste em conduzir no ligando um espectro de ressonância magnética nuclear (RMN) utilizando métodos de efeito de Overhauser nuclear [tal como, intensificação de NOE unidimensional, NOESY bidimensional e ROESY bidimensional (es-pectroscopia de efeito de Overhauser nuclear de estrutura rotativa)]. O espectro de RMN utilizando o método do efeito de Overhauser nuclear emprega-se para descrever uma alteração na intensidade de uma linha de RMN quando uma outra iinha é irradiada na frequência desta última. A alteração na intensidade resulta da transferência de energia "através do espaço" de um núcleo atómico para outro. Assim, um efeito de Overhauser nuclear fornece informação sobre os núcleos atómicos vizinhos mais próximos da linha que está saturada. Consequentemente, a acumulação de um número suficiente de efeitos de Overhauser nucleares entre átomos vizinhos, pode utilizar-se para determinar as caracterfsticas espaciais de toda a molécula.

Um efeito de Overhauser nuclear é um efeito de RMN bem conhecido e identificado na literatura da especialidade, tendo sido descrito por Cheatham em Journal of Chemical Education, 66, pags. 111-117 (1989). Esta referência descreve a utilização de intensificação de NOE unidimensional bem como a utilização de NOE em RMN bidimensional (NOESY) como uma ferramenta para criar modelos tridimensionais. O método ROESY é também um método bem conhecido e identificado na literatura da especialidade tendo sido descrito por Bax e Davis em J. of Magn. Reson., 63, pags. 207-213 (1985). A utilização do método ROESY aplica-se especialmente a moléculas de dimensão intermédia como, por exemplo, as hormonas peptidicas. "Análise de fluorescência" — diz respeito à identificação de um sistema de transferência de cargas em um ligando biologicamente activo, utilizando um instrumento de fluorescência capaz de medir o decaimento da fluorescência a intervalos de tempo da ordem de um nanosegundo ou mais curtos. Um tal equipamento, encontra-se descrito na literatura da especialidade e pode adquirir-se no mercado, por exemplo, fabricado por Photochemical Research Associates sob a designação System 3000. O decaimento da fluorescência devida à forma fenol (ou fenolato) no estado excitado envolvida na interacção devida a transferência de cargas, determina-se em um meio compatível com a fluorescência, após excitação com luz de um comprimento de onda apropriado. Por exemplo, se a tirosina está envolvida na interacção devida a transferência de cargas, de modo a obter-se uma forma de tirosinato, o decaimento da fluorescência devida à emissão do tirosinato no estado excitado a, ou próximo de, 350 nm, determina-se após excitação com luz de um comprimento de onda apropriado como, por exemplo, 275 nm. Medindo o decaimento da fluorescência correspondente a um comprimento de onda apropriado, após excitação a um comprimento de onda também apropriado, podem determina-se também outras formas no estado excitado (por exemplo, ligandos com grupos contendo um radical fenol sem ser a tirosina) envolvidos na interacção devida a transferência de cargas. Os entendidos na matéria, podem determinar facilmente os comprimentos de onda de absorção e de emissão apropriados de um qualquer ligando comportando um radicai fenol. O decaimento da fluorescência obtido experimentalmente, que ê descrito como uma soma de exponenciais, sofre desconvolução, e determina-se o tempo de duração do componente mais durável devido à forma fenolato pretendida. Os métodos para somar os exponenciais de modo a obter o decaimento da fluorescência, realizar a desconvolução do decaimento da fluorescência e determinar o tempo de duração do componente mais durável devido à forma fenolato, encontram-se descritos na literatura da especialidade e concretizados nos exemplos descritos adiante.

Fluorescência de ionga duração ("LLF") - é a semivida do componente de fluorescência mais durável emitindo no ou próximo do máximo de fluorescência da forma e utiliza-se para determinar a existência de uma interacção devida a transferência de cargas estável que ocorre no ligando.

Fluorescências de longa duração, em análises de fluorescência do estado excitado de um tirosinato em propilenoglicoi, superiores a, aproximadamente 11 nanossegun-dos e, de preferência, superiores a aproximadamente 12 nanossegundos indicam, especialmente, que o radicai tirosinato eventualmente modificado participa em uma interacção devida a transferência de cargas estável. Este diagnóstico é feito com base no facto de que uma fluorescência de ionga duração superior a aproximadamente 11 nanossegundos, de iigandos contendo tirosina eventualmente modificada em propilenoglicoi, está em correlação com a presença de, pelo menos, alguma (isto é, è 1% relativamente à Angiotensina li) aetividade agonista relativamente a esses iigandos. Por outro lado, uma LLF de 11 nanossegundos ou inferior em propilenogli-coi, indica que a forma de tirosinato eventualmente modificada responsável por essa LLF não é suficientemente estável e não activa o receptor. Mais uma vez, este diagnóstico é feito com base no facto de uma LLF de aproximadamente 11 nanossegundos ou inferior, de Iigandos contendo tirosina eventuaimente modificada, está em correlação com a acção inactiva ou antagonista desses ligandos (acção agonista inferior a 1% relativamente à Angiotensina II). Para determinar em um ligando quando uma forma diferente da tirosina participa na interacção devida a transferência de cargas, fazem-se correlacções similares baseadas nas LLF dessa forma eventualmente modificada, em um grande número de ligandos correlacionados, quer o ligando especifico seja um agonista, um antagonista ou seja inactivo.

Sem estarmos subordinados a qualquer teoria, acreditamos que a interacção devida a transferência de cargas concede um nível de estabilidade ao estado excitado destas formas (por exemplo, tirosina) que permite, para as mesmas uma LLF mais durável. Consequentemente, LLFs mais duráveis estão em correlação com a presença de uma interacção devida a transferência de cargas que por sua vez está em correlação com a actividade agonista.

Uma vez descritos os termos e as expressões utilizadas na presente invenção, iremos agora descrevê-la detalhadamente.

Como mencionado antes, a primeira fase da preparação de um modelo espacial tridimensional de um ligando biologicamente activo com uma ou mais interacções devidas a transferência de cargas, consiste na análise de fluorescência desse ligando. Quer isto dizer, que o ligando é analisado utilizando técnicas de fluorescência para se determinar a existência de uma interacção devida a transferência de cargas. Na descrição seguinte desta técnica de fluorescência, utilizar-se-á a Angiotensina li como um ligando representativo. Contudo, deve ter-se em atenção que se podem analisar outros ligandos biologicamente activos do mesmo modo que a Angiotensina II, utilizando os métodos que seguidamente se descrevem para esse composto. O decaimento da fluorescência, determinado em nanossegundos, da Angiotensina ii e dos seus análogos, mediu-se aproveitando as propriedades de fluorescência ca-racteristicas das formas tirosinato no estado excitado (outras formas de fenoiato poderão exibir também propriedades características similares quando no estado excitado). Quanto a isto, de modo a obter-se emissão de fluorescência a partir do tirosinato (e de outras formas de fenoiato), deve existir transferência de protões para/de um grupo hidroxi fenólico de/para um grupo aceitador apropriado. Com base no pKa da tirosina no estado fundamentai (10,4) e no estado excitado (inferior ou igual a, aproximadamente, 5,4) a protólise no estado excitado é mais eficiente. O decaimento da fluorescência, determinado em nanossegundos, da Angiotensina ii e dos seus análogos, determinou-se a partir da emissão a 350 nm do seu estado excitado. A fluorescência de longa duração (LLF) determinou-se para cada um destes análogos em diversos dissolventes de polaridade diferente utilizando a N-acetikiro-sina-amida como padrão de referência. Os resultados desta análise demonstram que dissolventes como a água e o dimetilsulfóxido não permitem a detecção, nesses análogos, de fluorescência de longa duração; presumivelmente devido a factores tais como a cessação da fluorescência induzida pelo dissolvente, interferência do dissolvente com formação de ligações de hidrogénio intramoleculares, etc.. Por outro lado, a utilização de um meio compativel com a fluorescência como, por exemplo, soluções aquosas bifásicas de lipidos, micelas em meios aquosos e dissolventes com uma constante dieléctrica de, aproximadamente, 40 ou inferior, permite a detecção de fluorescência de longa duração.

Sem estarmos subordinados a qualquer teoria, acreditamos que a detecção da fluorescência de longa duração em um meio compatível com a fluorescência se deve ao facto desses meios não provocarem a cessação da fluorescência gerada pelo estado excitado do tirosinato e/ou não interferirem com a ligação de hidrogénio intramolecular na Angiotensina li. Adicionalmente, tai como se mencionou antes, a conformação da Angiotensina li (estrutura terciária) que permite a formação de uma interacção devida a transferência de cargas, estabilizará o estado excitado do tirosinato que por sua vez dará origem a uma fluorescência de duração extremamente longa. Na medida em que a conformação da Angiontensina il não é inerte mas sim dinâmica (isto é, em um dado meio a uma determinada temperatura, a Angiotensina II altera constantemente a sua conformação quer in vitro quer in vivo), apenas a conformação que permite a formação da interacção devida a transferência de cargas responsável peia activação do receptor, dará origem à formação de uma fluorescência de duração extremamente longa. Consequentemente, o meio utilizado para determinar a presença de uma interacção devida a transferência de cargas, através de análise de fluorescência, deve ser escolhido de tai modo que seja compativei com essa análise e possibilite a presença da conformação que permite tal interacção. Estes resultados são alcançados com um meio compatível com a análise de fluorescência utilizada na presente invenção. De preferência, o meio compatível com a análise de fluorescência, aumentará ao máximo a presença da conformação do ligando biologicamente activo que activa o receptor; embora tal não seja necessário desde que o meio compatível com a análise de fluorescência permita a presença de uma quantidade suficiente da conformação do ligando biologicamente activo que activa o receptor de tai modo que se possa detectar a sua LLF.

Nos receptores ligados a uma membrana, uma prova recente proveniente de estudos de mutação de um receptor específico de um sítio, sugere que ligandos pequenos, isto é, ligandos com um peso molecular inferior a, aproximadamente, 300 dal-tons, se ligam a um sítio em um dos domínios da transmembrana da proteína do receptor e, consequentemente, podem exibir uma conformação biologicamente activa que é induzida por iípidos. Nestes casos, embora sem estarmos subordinados a qualquer teoria, pensa-se que a utilização de dissolventes de polaridade intermédia ou baixa (isto é, com uma constante dieléctrica constante de, aproximadamente, 50 ou inferior) sistemas bifàsicos de Iípidos e micelas fornecem um meio receptor que simula o micro-ambiente com que o ligando depara na proximidade dos receptores ligados a uma membrana. Assim, a utilização de um meio compatível com a análise de fluorescência de ligandos biologicamente activos complementares de tais receptores, fornece como vantagem adicional a facilitação por estes meios do aumento máximo do adaptador do ligando responsável pela activação do receptor. O Quadro I apresentado seguidamente mostra os valores médios da fluorescência de longa duração, obtidos a partir da Angiotensina II e de análogos relacionados, em isopropanol e também em propano-1,2-diol(propilenoglicol). O Quadro I mostra também a actividade agonista da Angiotensina II bem como dos análogos especificados. [Os dados apresentados seguidamente no Quadro I obtiveram-se utilizando uma técnica similar à descrita nos próximos Exemplos 1 a 3}. %

Quadro I

Dissolvente

Ligando Propano-1,2-dioi LLFa LLF(%) Isopropanoi LLFa LLF(%) Actividade·3 Agonista A 20,8 19 15,5 79 100 B 13,1 46 13,1 10 27 C 18,8 11 9,3 11 7 D 14,9 13 0 ~ 4c E 16,2 10 0 -- 5C F 9,2 6 11,6 3 0,2 G 6,6 35 0 -- inferior a 0,1 H 10,6 17 9,4 16 inferior a 0,1 I 10,2 8 8,5 12 inferior a 0,1 J 0 — 6,5 20 inferior a 0,1d K 7,4 10 10,2 14 10 a = em nanossegundos b = A actividade agonista avaiiou-se através de um doseamento biológico utilizando o útero isolado de ratos e descrito por Matsoukas et ai., J. Med. Chem., 31, pág. 1418-1421 (1988). Os resultados apresentados estão referidos à Angio-tensina il que se considera 100. c = Potente antagonista do receptor com actividade agonista residual, d = Potente antagonista do receptor.

Quadro I (cont.)

Ligando A = Angiotensina il

Ligando B = [Sar1 His(3-Me)6JAngiotensina i!

Ligando C = [Sar1 Phe6]Angiotensina li Ligando D = [Sar1 Cha8]Angiotensina il Ligando E = [Des1 Cha8]Angiotensina II Ligando F = [Sar1 Phe-NH28]Angiotensina II Ligando G = [Sar1 Ala6]Angiotensina II Ligando H = [Sar1His(1-Me)6]Angiotensina II Ligando I = [Sar1 D-Pro^jAngiotensina II Ligando J = [Sar1 Ile^jAngiotensina II (Sarilesin)

Ligando K = Angiotensina III A literatura da especialidade descreve convenientemente a preparação de Ligandos B-K. Consultar, por exemplo, Matsoukas et al., Journal of Med. Chem., 31, pág. 1418-1421 (1988).

Sar = sarcosina

Cha = ciclo-hexilalanina

Des = resto de um aminoácido omitido

No Quadro I citado antes, a LLF (%) mede a percentagem de confórmero(s) presen-te(s) que produz elevação de LLF.

Os dados citados antes, demonstram que agonistas fortes, Ligandos A e B, possuem uma fluorescência de longa duração em isopropanol superior a 13 nanosse-gundos quando comparados com ligandos que possuem quer actividade agonista baixa quer actividade antagonista ou são inactivos, Ligandos C-K. Do mesmo modo, em propilenoglicol, ligandos com aiguma actividade agonista (excepto Angiotensina lil), Ligandos A-E, possuem fluorescência de longa duração superior a 11 nanosse-gundos, ao passo que ligandos inactivos ou que possuem actividade antagonista sem qualquer actividade agonista residual, Ligandos F-J, possuem fluorescência de longa duração de 11 nanossegundos ou inferior. Consequentemente, a duração prolongada da LLF está em correlacção com a actividade agonista que por sua vez indica que o resto fenólico da tirosina está envolvido na interacção devida a transferência de cargas responsável pela activação do receptor.

Em contraste com o método de acordo com a presente invenção, facilmente realizável, que demonstra, via análise de fluorescência, que a tirosina está envolvida no estado activo da Angiotensina II, os métodos anteriores determinaram previamente que o grupo hidroxi da tirosina da Angiotensina II tinha um importante papel na activação dos receptores, quer mediante preparação de análogos de Angiotensina li sem tirosina quer mediante metilação do grupo hidroxi da tirosina. É evidente, que o processo de acordo com a presente invenção é mais fácil e não exige a síntese de análogos numerosos de Angiotensina li. Além disso, a modificação da Angiotensina II por eliminação de aminoácidos, etc., pode alterar, de facto, a estrutura terciária do análogo referente à Angiotensina II de tal modo que pode ser difícil obter conclusões significativas.

Uma vez identificada a interacçâo devida a transferência de cargas no ligando, via uma análise de fluorescência de acordo com a presente invenção, a fase seguinte, no processo de preparação de um modelo espacial tridimensional de um ligando biologicamente activo com uma ou mais interacção(ões) devida(s) a transferência de cargas, consiste na determinação dos grupos químicos envolvidos nessa(s) interac-ção(ões). Esta determinação, pode realizar-se utilizando afinidades de actividade devidas a estruturas reconhecidas na literatura da especialidade. A este respeito, estas determinações estão muito simplificadas pelo conhecimento de que a forma fenol/fenolato está envolvida na interacçâo devida a transferência de cargas. Consequentemente, nos ligandos com apenas uma dessas formas (por exemplo, tirosina) facilmente se verifica que essa forma está envolvida na interacçâo devida a transferência de cargas.

Na generalidade, as afinidades de actividade estrutural são conduzidas mediante a criação de análogos do ligando pretendido, mediante substituição selectiva ou modificação de um dos componentes do ligando (por exemplo, no caso de um peptido, um aminoácido) e determinação posterior das LLFs dos análogos. Uma redução na LLF de um análogo, em comparação com o ligando, representa uma evidência significativa que o componente encontrado originalmente no ligando e subsequentemente substituído ou modificado no análogo actua na interacçâo devida a transferência de cargas. Observe os ligandos F e G no Quadro I que identificam a histidina e o car-boxilato C-terminal na interacçâo devida a transferência de cargas na Angiotensina II. Adicionalmente, a perda de actividade agonista no análogo fornece uma evidência corroborante de que esse componente actua na interacçâo de transferência de cargas. A este respeito, quando o ligando comporta duas ou mais formas fenol/fenolato, consegue-se a determinação de qual dessas espécies está envolvida na interacçâo devida a transferência de cargas, criando análogos em que um dos dois ou mais 40 grupos fenólicos ficou(aram) comprometido(s), por exemplo, mediante metilação do grupo hidroxi. A análise das LLFs e actividades biológicas destes análogos fornecerão a informação necessária para determinar qual dos dois ou mais grupos fenólicos estâ(ão) envotvido(s) na interacção devida a transferência de cargas.

Uma vez identificados os grupos envolvidos na interacção devida a transferência de cargas, a fase seguinte, no processo de preparação de um modelo espacial tridimensional de um ligando biologicamente activo com uma ou mais interacção(ões) devida(s) a transferência de cargas, consiste em resolver os aspectos restantes da conformação espacial tridimensional do ligando, mediante a obtenção de informação da conformação relativa ao sítio activo de acordo com a espectroscopia de ressonância magnética nuclear utilizando o efeito de Overhanser nuclear.

Como descrito antes, esta fase envolve, inicialmente, a utilização de metodologia COSY que fornece informação sobre modelos de acoplamento através de ligações no interior de uma molécula e permite a averiguação bidimensional de protões individuais no ligando. A metodologia COSY encontra-se descrita na literatura da especialidade. Após a averiguação bidimensional dos protões individuais via metodologia COSY, o ligando é depois examinado mediante ressonância magnética nuclear utilizando o método do efeito de Overhanser nuclear. Metodologias do efeito de Overhanser nuclear apropriadas incluem intensificação de NOE unidimensional, NOESY bidimensional e ROESY bidimensional. Todas estas metodologias que utilizam o efeito de Overhanser nuclear encontram-se descritas na literatura da especialidade.

Contudo, relativamente a ligandos com peso molecular compreendido entre, aproxi-madamente, 500 e 2000 daltons, a utilização de uma metodologia NOESY falha fre- quentemente, independentemente das distâncias inter-nucleares envolvidas, porque a velocidade de "tumbling" para estes solutos é próxima daquela a que o NOE máximo possível passa por zero. Consultar Bax e Davis, J. Magn. Reson, 63, pág. 207--213 (1985). Consequentemente, utilizando métodos NOESY para estes ligandos, não são possíveis determinações sequenciais nem a observação de estruturas reveladoras das distâncias inter-protónicas. Contudo, estes ligandos podem ser analisados estruturalmente utilizando ou intensificação de NOE unidimensional ou metodologias ROESY. ν'

Ainda em relação â espectroscopia de ressonância magnética nuclear, utilizando o efeito de Overhanser nuclear, existe um limite prático quanto ao peso molecular do ligando a analisar. Em particular, ligandos com um peso molecular aproximado de 15.000 daltons ou superior tornam demasiado complexas metodologias NOESY/ /ROESY convencionais para permitir a sua utilização. Contudo, em determinadas circunstâncias, podem utilizar-se metodologias NOE unidimensionais. Consequentemente, na presente invenção, os ligandos que se pretende investigar por espectroscopia de ressonância magnética nuclear utilizando o efeito de Overhanser nuclear têm, de ^ preferência, um peso molecular inferior a, aproximadamente, 15.000 daltons, e pre ferivelmente, um peso molecular inferior a, aproximadamente, 10.000 daltons.

Quando se realiza uma espectroscopia de ressonância magnética nuclear utilizando o efeito de Overhanser nuclear, seleccionam-se os dissolventes de modo a obter-se um meio capaz de simular o meio do receptor. Assim, quando o receptor biologicamente activo é um receptor ligado a uma membrana, hipóteses generalizadas sugerem o papei da dobragem dos peptidos induzida por lípidos nas interacções re-ceptor-hormona peptídica. Consultar Sargent et al., Proc. Natl. Acad. Sei. (EUA), 83 (16). pág. 5774-5778 (1986); e Surewicz et al., J. Amer. Chem. Soc., 110, 4412- 42

-4414 (1988). Na generalidade, pensa-se que estes peptidos induzidos por lípidos têm um peso molecular inferior a, aproximadamente, 3.000 daltons. Assim, nestas circunstâncias, justifica-se a utilização de dissolventes com uma constante dieléctríca de, aproximadamente, 80 ou inferior. Além do mais, tais constantes dieléctricas permitem uma estrutura peptfdica mais ordenada.

Um dissolvente particularmente preferido, para aplicar em espectroscopia de ressonância magnética nuclear, utilizando o efeito de Overhanser nuclear para igandos cujo receptor complementar é um receptor ligado a uma membrana, é o dimetilsulfóxi-do (DMSO). O dimetiisulfóxido é especialmente preferido porque pelas razões seguintes oferece inúmeras vantagens sobre outros possíveis dissolventes com uma constante dieléctríca de, aproximadamente, 50 ou inferior: 1) este dissolvente permite a melhoria de NOEs até um nível de detectabilidade que não é possível em dissolventes tais como água deuterada; 2) pelas razões citadas antes, o meio dieléctri-co da massa fornecido pelo dimetiisulfóxido é tal que representa um meio similar ao encontrado por esses peptidos nos seus receptores, e que fornece informação útil e prática; 3) os espectros são caracterizados por sinais protónicos estreitos e aguçados e bem separados que se podem determinar individuaimente utilizando metodologia COSY e são ffequentemente superiores aos espectros obtidos em dissolventes tais como o trifluoroetanol, o propilenoglocol e o isopropanol que dão sinais mais largos e frequentemente de justaposição; 4) para moléculas com carga, o dimetilsulfó-xido é superior a meios aquosos, porque na generalidade ensaiam-se menos conformações e a média conformacional altera-se no dimetiisulfóxido quando se compara com a água; e 5) a constante dieléctríca do dimetiisulfóxido (~45) está suficientemente próxima da constante dieléctríca máxima utilizada na análise de fluorescência, de tal modo que as alterações conformacionais mínimas são aguardadas nos dois meios. 43 η,

Quando ο meio que simula o meio do receptor é de natureza aquosa, justifica-se a utilização de âgua ou de uma mistura de dissolventes contendo água.

Em qualquer caso, quando os métodos de RMN descritos antes na presente memória descritiva são métodos de RMN [1H] protónica, são necessários dissolventes deuterados, isto é, dg-DMSO, D2O ou outros similares.

Os exemplos 4-6 descritos seguidamente, mostram ligandos biologicamente activos analisados por espectroscopia de ressonância magnética nuclear utilizando o efeito de Overhanser nuclear. A este respeito, os Exemplos 1-3 já demonstram que as estruturas terciárias de ligandos naturais biologicamente activos (isto é, [Sar^j Angio-tensina II e oxitocina) utilizam uma interacção devida a transferência de cargas para activar 0 receptor biologicamente activo e que grupos foram envolvidos nessa interacção.

Ainda a este respeito e utilizando métodos de acordo com a presente invenção, desenvolveram-se modelos moleculares de ligandos biologicamente activos. Em particular, a Figura 1 ilustra um modelo molecular de [Sar1] Angiotensina II. Na Figura 1, 0 esqueleto de [Sar^j Angiotensina II é mantido por duas espirais gama mantidas em parte por ligações de hidrogénio entre Arg CO e Tyr NH e entre His CO e Phe NH (não visível). [Todos os modelos moleculares descritos na presente invenção foram desenvolvidos utilizando Minit Molecular Models, Cochranes, Oxford, U.K.. Um entendido na matéria pode facilmente reproduzir estes modelos].

Com 0 objectivo de comparação, as Figuras 2A, 2B e 2C ilustram estruturas bidi-mensionais simplificadas que mostram alguns aspectos conformacionais de Sarmesi- 44 na, Angiostensina II e Sarilesina, respectivamente. Na realidade, os núcleos aromáticos situam-se por cima do esqueleto peptidico. Observar Figuras 1 e 4A. A Figura 4A ilustra um modelo molecular de Angiostensina II determinado em DMSO/ /D2O por RMN protónica 2D-ROESY de um modo similar ao descrito no Exemplo 4. O esqueleto da Angiotensina II caracteriza-se por duas espirais gama mantidas, em parte, por pontes de hidrogénio entre Arg CO e Tyr NH e entre His CO e Phe NH (não visível). A Figura 6 ilustra fotografias tridimensionais estereo do modelo de Angiotensina II. Relativamente às figuras contendo fotografias estereo, observa-se que tais fotografias devem ser examinadas por visores/óculos estereo de modo a obter-se o efeito tridimensional. Estes visores/óculos estereo podem adquirir-se no comércio; um dos fornecedores é Marivac, 1872 Gardem St. Halifax, Nova Scotia, B3M 3RL, Canadá.

Uma vez desenvolvido um modelo espacial tridimensional para um ligando biologicamente activo, utilizando técnicas de acordo com a presente invenção, pode poste-riormente aperfeiçoar-se esse modelo ou mesmo desenvolverem-se novos modelos, utilizando considerações teóricas. Por exemplo, conhecendo 0 modelo tridimensional da Angiotensina II representado na Figura 4A e ilustrado nas fotografias estereo da Figura 6 é possível, mediante utilização de considerações teóricas, criar um modelo tridimensional da Angiotensina II ligada ao seu receptor, 0 receptor da Angiotensina II. Em particular, tais considerações teóricas dizem respeito, na generalidade, a ciclos químicos facilmente realizáveis. Por exemplo, por causa da interacção devida a transferência de cargas, 0 grupo hidroxi da tirosina foi, na Angiotensina II, convertido na sua forma tirosinato. Esta forma tirosinato, que é um nucleófilo forte, pode originar seguidamente através do receptor uma ligação transitória entre 0 ligando e 0 receptor. Por meio desta ligação, a tirosina abandona a cadeia lateral da histidina por- que este aminoácido já não é capaz de formar uma ligação de hidrogénio com o grupo hidroxi da tirosina. Além disso, espera-se também a lenta reposição da histidina. Estas considerações teóricas já tinham sido apresentadas. Consultar, por exemplo, Moore et al., Int. J.Pept. Prot. Res., 26, pág. 469-481 (1985). Tendo em vista o que acabámos de afirmar, desenvolveu-se um modelo espacial tridimensional da Angio-tensina II ligada ao receptor, que concorre para as alterações conformacionais que eventualmente ocorrem quando a Angiotensina II se comporta do modo sugerido. Na Figura 7A está representada uma fotografia estereo deste modelo. A validade do modelo resultante pode ser facilmente verificada colocando antagonistas conhecidos sobre o modelo unido ao receptor e averiguando se esses antagonistas se adaptam ao modelo. Quer isto dizer que se o modelo estiver correcto então os antagonistas deverão ser capazes de adoptarem uma conformação similar à do modelo do ligando, de modo a ligarem-se ao receptor e, consequentemente, concorrerem para o seu comportamento de antagonista. A este respeito, as Figuras 3A e 3B ilustram exemplos de compostos provenientes de uma classe (isto é, compostos estruturalmente relacionados) de antagonistas da Angiotensina II. Esta classe é genericamente conhecida ou como compostos N-benzil-imidazóJicos ("BI") ou como compostos N-benzamidobenzil-imidazólicos ("BABI"). Observou-se que na figura 3B, o protão acídico nos compostos BABI encontra-se presente sob uma forma ligada ao hidrogénio (representada pelo espaço separado pelas linhas que rodeiam este protão em associação com os pontos dirigidos até ao grupo carbonilo do amido) de algum modo análoga à forma do tirosinato ligada ao hidrogénio da Angiotensina II. Nos compostos BABI podem existir muitos grupos acídicos em formas similares estabilizadas e ligadas ao hidrogénio como, por exemplo, grupos carboxilato (visível), sulfato, trifluoro-metilsulfonamido ou outros similares. Observou-se também que para a classe de compostos BI, o protão acfdico pode ocupar uma posição similar no 46 espaço relativamente ao protão acfdico indicado em BABI, embora de tal modo que o primeiro não está estabilizado por uma ligação de hidrogénio.

Na Figura 5B, a porção comum destes antagonistas foi colocada sobre a porção imidazóiica da Angiotensiva II representada na Figura 5A que adicionalmente mostra a posição relativa dos compomentes responsáveis pela interacção devida a transferência de cargas na Angiotensina II (nota - as ligações duplas do radical imidazol foram removidas da Figura 5B por motivos de clareza). Na Figura 5B, o facto do grupo hidroxi do radical hidroximetil estar, em ambos os antagonistas, localizado de um modo similar ao grupo hidroxi da tirosina na Angiotensina II; o facto de a cadeia lateral n-butilo de ambos os antagonistas imitar com precisão a cadeia His C$-His Ca-His CQ-Pro N da Angiotensina II; e o facto do átomo de cloro nestes antagonistas puder servir para diminuir a alcalinidade do núcleo imidazólico destes compostos, indicam que o antagonista pode apresentar uma conformação com caracterfsticas electrónicas e tridimensionais similares equivalentes à conformação da Angiotensina II necessária para o aparecimento da interacção devida a transferência de cargas responsável pela activação do receptor. Contudo, porque estes antagonistas carecem da funcionalidade necessária para gerar uma interacção devida a transferência de cargas, não podem activar o receptor, o que consequentemente explica as suas propriedades antagonistas.

Após a criação de um modelo para a estrutura terciária de um ligando biologicamente activo, é agora possível conceber e sintetizar miméticos deste ligando. Por exemplo, é agora possível conceber e sintetizar compostos que são suficientemente similares ao modelo gerado para a estrutura terciária do ligando biologicamente activo, de modo a apresentarem-se complementares relativamente ao receptor do ligando. A este respeito, criaram-se antagonistas quando o composto concebido e sintetizado 47

apresenta uma interacção devida a transferência de cargas comprometida, enquanto que se criaram agonistas quando o composto concebido e sintetizado apresenta uma interacção devida a transferência de cargas operâvel, isto é, a interacção devida a transferência de cargas não estã prejudicada. Conhecendo o modeio criado para a estrutura terciária de um ligando biologicamente activo, a concepção e a síntese de agonistas e/ou de antagonistas do receptor complementar do ligando está ao alcance dos entendidos na matéria. A presente invenção oferece também uma vantagem especial na concepção e síntese de novos miméticos eventuaimente formados a partir da estrutura de miméticos conhecidos acoplados, utilizando o conhecimento do modeio produzido peia estrutura terciária de um ligando biologicamente activo. Esta vantagem particular aplica-se especialmente para conceber novos miméticos da Angiotensina II, os quais podem, eventualmente, basear-se na estrutura de miméticos conhecidos.

Em particular, a dependência actividade-estrutura mostra que a afinidade de ligação entre a Angiotensina II e o seu receptor complementar deriva largamente de forças Couiombicas [iónicas] procedentes de cargas complementares entre a Angiotensina li e o seu receptor. As cargas iónicas na Angiotensina II estão apresentadas na Figura 4B que se baseia no modeio da Angiotensina II representado na Figura 4A. Na Figura 4B, N simboliza o grupo tirosinato que reassume a posição por meio de uma interacção com o receptor (o que acabámos de afirmar está apresentado na Figura 7A que constitui uma fotografia estereo da Angiotensina II ligada ao receptor). Por outro lado, um composto N-benzilimidazólico (BI) ou N-benzamidobenziMmidazólico (BABI), classe de antagonistas conhecidos da Angiotensina II [Wong et al., Hypertension, 13, pág. 489 e seg., (1989)] estão privados de muitas das cargas que provocam uma firme ligação da Angiotensina II ao seu receptor. A sobreposição do

grupo imidazol dos compostos Ν-benzilimidazólicos (BI) e N-benzamidobenzil-imida-zólico (BABI) representados nas Figuras 3A e 3B sobre o grupo Imidazol do modelo da Angiotensina II representado na Figura 5A está representada na Figura 5B. A organização tri-dimensional dos grupos químicos dos compostos N-benzilimidazólicos (BI) e N-benzamidobenzil-imidazólicos (BABI) é tal que estes compostos podem imitar 1) a Angiotensina II, 2) a Sarmesina ou 3) a Sarilesina. (Por exemplo, quando o grupo hidroxi do radical imidazol dos compostos N-benzamidobenzil-imidazólicos (BABI) é metilado, o grupo oximetilo resultante ocupa, relativamente ao grupo oxi-metilo da Sarmesina, uma posição similar no espaço). A sobreposição de um composto N-benzamidobenzil-imidazólico (BABI) específico (representado na Figura 7C) sobre o modelo de Angiotensina li ligado ao receptor (representado na Figura 7A) está representada na fotografia estereo da Figura 7B. Como se pode observar na Figura 7B, porque o composto N-benzamidobenzil-imidazólico (BABI) apresenta um arranjo espacial similar ao de sequência Tyr-Val-His da Angiotensina II (bem como ao da Sarilesina), os compostos N-benzamidobenzil-imidazólicos (BABI) podem imitar esta parte do modelo da Angiotensina II (e da Sarilesina) de modo a apresentarem-se como complementares do receptor da Angiotensina II. Ainda a este respeito e sem limitações impostas por uma qualquer teoria, acredita-se que o receptor possa ser transitoriamente acilado ou sofrer uma outra reacção similar, o grupo hidroxi da tirosina se ligue à Angiotensina li e altere a situação da cadeia lateral da tirosina relativamente à sua posição na forma da Angiotensina II com "interacção devida a transferência de cargas". Pensa-se também que a porção acídica dos compostos N-benzamidobenzil-imidazólicos (BABI), que é estável sob uma forma predisposta ou "pré-activadaM mediante interacção entre uma ligação a um átomo de hidrogénio e o átomo de oxigénio do grupo carbonilo do radical amido (observar Figura 3B), ocupa uma posição no espaço que é similar à do grupo hidroxi da tirosina no modelo de ligação ao receptor da Angiotensina II apresentado na Figura 7A. Pensa-se também 49 η r que, entre o grupo ácido pré-activado dos compostos N-benzamidobenziMmidazóIi-cos (BABI) e o receptor, formar-se-à uma ligação similar à existente entre o grupo tirosinato "pré-activado" da Angiotensina II e um grupo aceitador pertencente ao receptor. Em contraste com a Angiotensina II, pensa-se também que no caso dos compostos N-benzamidobenzil-imidazólicos (BABI), isto não terá como consequência a activação do receptor devido a diferentes impedimentos conformacionais e à natureza da ligação do receptor ao ligando. Assim, por exemplo, quando o receptor acila o grupo hidroxi da tirosina da Angiotensina II, o aduto formado entre a Angiotensina II e o seu receptor envolverá uma ligação éster, enquanto que para o composto N-benzamidobenzil-imidazólico (BABI) apresentado na Figura 3B envolverá uma ligação anidrido ou para o composto N-benzamidobenzil-imidazólico (BABI) apresentado na Figura 7C envolverá uma ligação amida. Isto mostra que os compostos N-benza-midobenzil-imidazólicos (BABI) são antagonistas dos receptores da Angiotensina II, porque podem actuar como inibidores do estado de transição ou substratos suicidas relativamente ao receptor da Angiotensina II. Em constrate com os compostos N-benzamidobenzil-imidazólicos (BABI), os compostos N-benzilimidazólicos (BI) não actuam, provavelmente, através deste mecanismo porque o protão acfdico não é estabilizado pela ligação hidrogénio e, consequentemente, não é pré-activado.

Em qualquer caso, observa-se que a classe dos compostos N-benzilimidazólicos/ /N-benzamidobenzil-imidazólicos (BI/BABI) possui, na generalidade, um núcleo imida-zólico que pode ser modificado para reforçar a potência destes compostos.

Esta informação, em associação com o mapa de distribuição de cargas, apresentado na figura 4B, permite a concepção e a síntese de novos antagonistas do receptor da Angiotensina II com base na incorporação de cargas adicionais, no local apropriado, nos compostos N-benzilimidazólicos (BI) e N-benzamidobenzil-imidazólicos 50 (BABI), de modo a aumentar a afinidade de ligação destes antagonistas ao receptor da Angiotensina II e, consequentemente, aumentar a sua potência. Em consequência do que acabámos de afirmar, derivados de compostos N-benziiimidazólicos (BI) e N-benzamidobenzil-imidazóIicos (BABI) com uma ou mais destas cargas, podem preparar-se do seguinte modo [na Figura 4B pode observar-se que todas as cargas (excepto a carga do tirosinato) incluindo o núcleo imidazólico se situam no mesmo plano próximo: 1. Todas as distâncias são apresentadas em relação ao centro do núcleo imidazólico plano [ou do aminoácido His na Angiotensina II ou do núcleo imidazólico dos compostos N-benzilimidazólicos (BI)/N-benzamidobenzil-imidazólicos (BABI)]. 2. A colocação das cargas é definida por uma linha que passa pelo centro do núcleo imidazólico bissectando a ligação N3-C4 do núcleo imidazólico da histidina como se pode ver na Fórmula I apresentada seguidamente:

na qual os números 1-5 correspodem à numeração adoptada para 0 núcleo imidazólico da histidina. [Nos análogos em que 0 núcleo His sofre uma rotação de 180°, por exemplo, análogos His(3-metilo), a ligação bissectada é a ligação N-J-C2]. 3. Uma ou mais das cargas seguintes pode ser colocada sobre 0 núcleo imidazólico: i) Direcção: Esquerda Carga: Catiónica

Distância do centro do núcleo imidazólico: 7 ± 1,5 Angstrom (Corresponde à carga catiónica do N-terminal); ii) Direcção; Direita

Carga: Aniónica

Distância do centro do núcleo imidazólico: 2,5 ± 0,5 Angstrom (Corresponde à carga do carboxilato aniónico do C-terminal); iii) Direcção: Esquerda

Carga: Aniónica

Distância do centro do núcleo imidazólico: 10 ± 2 Angstrom (Corresponde à carga aniónica do ácido aspártico); e iv) Direcção: Esquerda

Carga: Catiónica

Distância do centro do núcleo imidazólico: 12 ± 2,5 Angstrom (Corresponde ao catião da arginina). 4. Face ao exposto, a orientação dos núcleos imidazólicos da Angiotensina II e dos compostos Ν-benzilimidazólicos (BI)/N-benzamidobenziMmidazólicos (BABI) é a descrita na Fórmula II apresentada seguidamente:

Assim C4 na Angiotensina II é equivalente a N-j na classe de compostos N-benzilimF dazólicos (BI)/N-benzamidobenzil-imidazólicos (BABI).

Exemplos de cadeias laterais que se podem adicionar a compostos N-benzilimidazó-licos (BI)/N-benzamidobenzil-imidazólicos (BABI) incluem, por exemplo, compostos de Fórmula geral III apresentada seguidamente:

R

(III)

/ I

Rx CH-R2 (ch2)2 ch3 - na qual R representa a) um grupo fenilo comportando em posição para um substi-tuinte escolhido entre um grupo carboxilo ou um seu sal aceitável sob o ponto de vista farmacêutico, sulfato ou trifluorometilsulfonamido ou b) um grupo de fórmula geral -NHC(0)R5 na qual R5 representa um grupo fenilo comportando em posição orto um substituinte escolhido entre um grupo carboxilo ou um seu sal aceitável sob 0 ponto de vista farmacêutico, sulfato ou trifluorometilsulfonamido; Rj e R2 representam, cada um, um átomo de hidrogénio ou têm 0 significado definido oportunamente; R3 representa ou um grupo hidroximetilo, -CH2OCH3, -CH2C(0)0CH3 ou -C(0)0CH3 ou tem 0 significado definido oportunamente; e R4 representa ou um átomo de flúor ou de cloro ou tem 0 significado definido oportunamente.

Face ao exposto, pode preparar-se um composto imitador da carga catiónica do N-terminal mediante ligação de um grupo amino próprio no local apropriado de um composto de Fórmula gerai III. Um tal grupo poderia ser colocado à distância apropriada do centro do núcleo imidazólico utilizando um substituinte amino alquflico (ou outro grupo catiónico apropriado tal como um grupo guanidino ou outro similar) em que 0 número de grupos metilénicos utilizados na cadeia que une 0 grupo amino ao composto N-benzilimidazólico (BI)/N-benzamidobenzii-imidazólico (BABI) é escolhido de modo a proporcionar uma carga positiva a 7 ± 1,5 Angstrom à esquerda do centro do núcleo imidazólico. Por exemplo, a colocação em RR3 de um grupo -(CH2)4-NH2 fornecerá uma tal carga (0 grupo amino dará origem a um protão in vivo de modo a obter-se um grupo -NH3+). De igual modo, se se mantiver a função 53

hidroxi em R3, então este símbolo representará um grupo -CHOH-(CH2)3-NH2. Alternativamente, a carga positiva a 7 ± 1,5 Angstrom pode obter-se mediante colocação em Ri de um grupo -(CH2)3-NH2- Em uma outra alternativa, R-j ou R3 podem representar, cada um, um grupo de fórmula geral -(CH2)n-Asp-Arg-NH2 na qual n representa 0 número inteiro 3 no caso de R-| e 0 número inteiro 4 no caso de R3( 0 que permite a obtenção dos 3 grupos com carga encontrados no dipeptido N-termi-nal da Angiotensina li. Reiativamente ao que acabámos de afirmar, apenas um dos símbolos R-j e R3 poderia ser substituído em qualquer momento com um grupo catiónico.

Pode preparar-se também um imitador aniónico do C-terminal colocando uma carga negativa à direita a 2,5 ± 0,5 Angstrom do centro do núcleo imidazólico. Por exemplo, a colocação em R4 de um grupo -(CH2)3C(0)0H fornecerá a carga negativa necessária à direita a 2,5 ± 0,5 Angstrom (0 grupo carboxilo será desprotonado in vivo, obtendo-se um grupo carboxilato, isto é, um grupo -C(0)0~. Altemaíivamente, a colocação em R2 de um grupo -(CH2)3C(0)0H fornecerá a carga negativa necessária à direita a 2,5 ± 0,5 Angstrom. Relativamente ao que acabámos de afirmar, apenas um dos símbolos R2 e R4 deve ser substituído, de cada vez, com um grupo aniónico.

Considerações similares, relativamente às ligações das cargas podem ser aplicadas ao grupo imidazol do aminoácido His de modo a obterem-se miméticos do receptor da Angiotensina II. Isto é particularmente verdade porque, como indicado antes, todas as cargas iónicas na Angiotensina II ligada ao receptor (excepto 0 anião tirosinato) estão, aproximadamente, no mesmo piano e, além do mais, em uma linha aproximadamente recta. Além disso, 0 núcleo imidazol é plano e situa-se, aproximadamente, no mesmo plano que as cargas iónicas. 54

Consequentemente, os substituintes descritos antes para o grupo imidazol dos compostos N-benzílimidazóIicos/N-benzamidobenzil-imidazélicos (BI/BABI) poderiam ser colocados nos seus pontos equivalentes sobre o radical imidazol do aminoácido His.

Para a carga aniónica do ácido aspártico e para a carga catiónica da arginina podem projectar-se grupos similares.

Utilizando técnicas reconhecidas, os entendidos na matéria podem preparar facilmente os compostos descritos antes. Estes compostos e os seus sais aceitáveis sob o ponto de vista farmacêutico são úteis como antagonistas da Angiotensina II. Consequentemente, estes compostos podem ser utilizados no controlo da hipertensão e/ou da insuficiência cardíaca congestiva em mamíferos doentes. Adicionalmente, pensa-se que os compostos de acordo com a presente invenção são úteis no tratamento de outras doenças cardiovasculares ou relacionadas como, por exemplo, trombose, enfarte de miocárdio ou outra similar. Quando utilizados para controlar a hipertensão e/ou a insuficiência cardíaca congestiva, estes compostos administram--se aos mamíferos, na generalidade, quer por via oral quer por via parentérica. Para tal administração, incorporam-se os compostos, na generalidade, em um diluente aceitável sob o ponto de vista farmacêutico em uma concentração suficiente para controlar a hipertensão e/ou a insuficiência cardíaca congestiva no mamífero a tratar. Os entendidos na matéria podem determinar facilmente as concentrações específicas das doses a administrar em tais situações. Consequentemente, a presente invenção contempla um método para controlar a hipertensão em mamíferos que inclui a administração, quer por via oral quer por via parentérica, de uma composição farmacêutica contendo um dos compostos descritos antes em uma quantidade suficiente para controlar a hipertensão. Adicionalmente, a presente invenção contempla também um método para o tratamento da insuficiência cardíaca congestiva em mamífe- ros e doentes que consiste na administração, quer por via orai quer por via parentética, de uma composição farmacêutica contendo um dos compostos descritos antes em uma quantidade suficiente para controlar a insuficiência cardiaca. Os métodos para controlar a hipertensão implementaram-se utilizando composições farmacêuticas contendo um veículo aceitável em farmácia e uma quantidade de um dos compostos descritos antes, eficaz para controlar a hipertensão em um mamifero necessitado desse tratamento. Os métodos para controlar um coração congestivo implementaram-se utilizando composições farmacêuticas que incluem um veículo aceitável em farmácia e uma quantidade de um dos compostos descritos antes eficaz no controlo de tal insuficiência cardiaca. A presente invenção será descrita mais detalhadamente nos exemplos seguintes. Contudo, deve ter-se em atenção que a presente invenção não é de modo algum restringida por estes exemplos específicos.

EXEMPLOS A. Os exemplos 1 e 3 que se seguem, apontam para a identificação, mediante análise por fluorescência, da eventual presença de uma interacção de transferência de cargas no tirosinato de ligandos biologicamente activos. A análise por fluorescência foi avaliada em nanossegundos ou intervalos de tempo mais curtos. O decaimento da fluorescência devido ao tirosinato no estado excitado que emite a ou próximo de 350 nm, determinou-se após excitação com luz de um comprimento de onda apropriado, por exemplo, 275 nm. O decaimento da fluorescência obtido experimen-taimente, que é descrito como uma soma de exponênciais, foi desconvoluído, tendo--se determinado a actividade do componente mais durável devida ao tirosinato. Em dissolventes de polaridade intermédia, como, por exemplo, propilenoglicol, isopropa- 56 nol ou outros similares ou nos meios que envolvem as membranas, uma actividade em excesso de, aproximadamente, 11 nanossegundos para a fluorescência de ionga duração do tirosinato no estado excitado, significa a existência de uma interacção de transferência de cargas particularmente estável no material submetido a análise.

Exemolo 1 - Propriedades fluorescentes da Anoiotensina II A Angiotensina II foi fornecida por Sigma (sob a forma de acetato) e pelos Laboratórios Península (sob a forma de trifluoroacetato), tendo-se observado por HPLC de fase inversa que continha um peptido simples.

Utilizando o método descrito por Matsoukas et al., J. Med. Chem., 31, pág. 1418--1421 (1988), sintetizou-se, purificou-se e doseou-se por métodos biológicos a Angiotensina II. À temperatura de refluxo e sobre óxido de cálcio, secou-se durante 8 horas o 1,2-propanodiol [Pr(OH)2], separou-se por destilação e conservou-se sobre um peneiro molecular. O teor em água avaliou-se por RMN1H ou pelo método de Karl Fisher. Utilizou-se isopropanol (PrOH) apropriado para HPLC (Caledon Laboratories Ltd) que se pretendia com um teor inferior a 1% em água. O dimetil--sulfóxido (DMSO) e o trifluoroetanol (TFE) utilizaram-se sem qualquer tratamento adicional. A partir de água destilada que se fez passar através de cartuchos de Fisher permutadores de iões, prepararam-se dissolventes aquosos. A N-acetil-tirosi-na-amida (NAYA) foi adquirida a Sigma. O dodecil-sulfato de sódio (SDS) foi adquirido a BDH biochemicals (especialmente puro) e utilizou-se sem qualquer outro tratamento. À temperatura de 21 °C, realizaram-se experiências de fluorescência, utilizando amostras de Angiotensina II com uma concentracção compreendida, na generalida-

X X ι de, entre 0,25 e 1,0 mg/ml. Para facilitar a degradação do peptido, as amostras podem aquecer-se até uma temperatura próxima de 50°C. Eventuaimente, as amostras podem ser, seguidamente, filtradas. Limparam-se as tinas com ácido sulfo-crómico e saturaram-se com o dissolvente do ensaio muito puro. Utilizando o System 3000 da Photochemical Research Associates (PRA) equipado com instrumentos para determinar o período de fluorescência, mediram-se decaimentos de fluorescência separados por nanossegundos. Este meio utiliza a técnica de contagem simples de fotões relacionada com o tempo. Como fonte luminosa utilizou-se uma lâmpada de flash PRA 510 que funcionou a 18,6 KHz, com 5,8 Kv aplicados através de uma abertura de 4 mm no eléctrodo sob -44 KPa de hidrogénio. Os comprimentos de onda de excitação e de emissão, foram seleccionados utilizando monocromadores de Jobin Yvon com fendas produzindo uma passagem de banda de 8 nm. O perfil do decaimento da lâmpada obteve-se medindo a dispersão da luz através de uma suspensão de esferas de látex e de polivinil-tolueno de 2,02 pm em glicerina/água (1:1), com os monocromadores de excitação e de emissão ajustados para o comprimento de onda de emissão da amostra. Em todas as experiências se reuniram dados até à obtenção de contagens de 2,5 x 1Q5 fotões. Para cada dissolvente obtiveram-se contagens "de fundo" ("Background Counts") que se subtraíram aos dados da amostra; as contagens "de fundo" obtidas durante o período de recolha da amostra foram 7% inferiores às contagens no fim da cauda ("tail end") do decaimento da amostra. Os dados de decaimento observados foram desenvolvidos começando por 5 canais antes do canal máximo até ao canal que continha 0,05% das contagens de fotões presentes no canal de contagens máximas. O método de desconvolução utilizado foi o método de iteração dos quadrados mínimos não lineares. Consultar Grinvald et a!., Anal. Biochem., 59, pág. 583-598 (1974). A aceitação de quadrados mínimos ajustados para um grau de confiança de 95% foi avaliada pelo teste de qui-quadrado reduzido, tendo a qualidade de adequação sido avaliada a partir dos residuais, da função 58 de autocorrelação dos residuais e do parâmetro de Durbin-Watson. Consultar Lampert et ai., Anal. Chem., 55, pág. 68-73 (1983). O decaimento da fluorescência obtido experimentalmente, f(à,t), está descrito como uma soma de exponenciais: f(X,t) = Σ α|(λ) exp μ/τ;(λ)] (1) em que α|(λ) e τ^λ) representam um importante factor pré-exponêncial e o tempo de duração da fluorescência do componente ith para um dado comprimento de onda de emissão, respectivamente. A fracção da intensidade de fluorescência proveniente de cada um dos componentes determina-se pela expressão:

Int %(λ) = α,(λ) τ;(λ) x 100 (2) Σ <2,|(λ)Έ|(λ)

As curvas normalizadas do decaimento da fluorescência da Angiotensina li, obtiveram-se em propiienoglicol, isopropanol e uma solução aquosa 0,1 M de SDS. Equações tri-exponênciais ajustadas aos dados (equações 1 e 2) fornecem dois parâmetros: a duração do componente de fluorescência máxima (LLF) e a percentagem da intensidade proveniente do componente de decaimento mais longo [LLF(%)j. A LLF observada para a Angiotensina II em propiienoglicol foi 20,8 nanossegundos e a LLF em percentagem foi 19. Para a Angiotensina II em isopropanol a LLF foi 15,5 nanossegundos e a LLF em percentagem foi 79. No trifluoroetanol, a Angiotensina II forneceu uma LLF igual a 13,0 nanossegundos e uma LLF em percentagem igual a 19. Em uma solução aquosa de SDS (SDS em uma concentracção superior à concen- tracção micelar crítica), a Angiotensina II forneceu uma LLF igual a 13,7 nanosse-gundos e uma LLF em percentagem igual a 14. A observação de que a adição de SDS, em uma quantidade superior à sua con-centracção micelar crítica em água, induz a fluorescência do tirosinato sugere que a formação da ligação intramolecular ao hidrogénio do grupo hidroxi da tirosina na Angiotensina II, pode ocorrer na presença de uma membrana celular mas não na sua ausência. Quer a estabilidade da forma tirosinato (LLF) quer os confórmeros em percentagem fornecidos pela forma tirosinato [confórmeros com LLF (%)] aumentaram significativamente quando se formaram micelas de SDS na presença da Angiotensina II (LLF = 13,7) comparativamente a uma situação em que se adicionaram ml· celas de SDS a uma solução contendo Angiotensina II (LLF = 7,2). A primeira representa uma situação em que a Angiotensina II fica presa no interior hidrofóbico das micelas, enquanto a segunda representa a ligação da Angiotensina II com carga positiva à superfície exterior da micela com carga negativa. Nestes exemplos, as diferenças na fluorescência do tirosinato indicam que a forma tirosinato é estável mesmo em um meio extremamente não polar (hidrofóbico), isto é, meios com uma constante dieléctrica, aproximadamente, 2. Consequentemente, estes meios não polares são meios simuladores dos meios que rodeiam os receptores.

Análogos de Angiotensina II com acção agonista 1% mais baixa do que a acção agonista da Angiotensina II no ensaio com útero de rato fêmea, exibem uma LLF inferior a 11 nanossegundos em propilenoglicol, e análogos com acção agonista de, aproximadamente, 10% ou inferior, exibem LLFs inferiores a 12 nanossegundos em isopropanol. Por exemplo, a [Sar^ lle®]Angiotensina II fornece LLF igual a zero em propilenoglicol e LLF igual a 6,5 nanossegundos em isopropanol. η A alteração da concentracção da amostra não afectou os parâmetros obtidos, pelo que a dimerização ou agregados múltiplos podem ser excluídos como conformações possíveis responsáveis pelo componente de LLF.

Os dados anteriores demonstram que a existência de uma interacção devida a transferência de cargas envolvendo o resto tirosinato, em um ligando especifico, pode determinar-se facilmente, avaliando a LLF do radical tirosina nesse ligando.

Exemplo 2 -- Relação entre a actividade e a estrutura da Angiotensina II

Na Angiotensina II verificou-se a relação entre a actividade e a estrutura preparando os análogos [Sar1 Ala5]Angiotensina II e [Sar* Phe-NH2]Angiotensina II. No Quadro I apresentado antes, podem observar-se as LLF, a LLF (%) e a actividade Agonista destes análogos. A ausência de LLF superiores a, aproximadamente, 12 nanosse-gundos nestes análogos compromete quer o grupo imidazol quer o carboxilato do C-terminal da Angiotensina II na interacção devida a transferência de cargas. Adicionalmente, a ausência de acção agonista significativa nestes análogos corrobora esta observação.

Exemplo 3 - Propriedades de Fluorescência e Propriedades de Accão Estrutural da Oxitocina

Utilizando a técnica de fluorescência descrita antes, a oxitocina exibiu uma LLF igual a 18,5 nanossegundos em propiienoglicol. Por outro lado, um análogo de oxitocina, [Ala5], exibiu um LLF de 7,6 nanossegundos em propiienoglicol. Consequentemente, isto estabelece que a asparagina que ocupa a posição 5 na oxitocina está envolvida na interacção devida a transferência de cargas. Adicionalmente, este análogo não possui acção agonista, o que confirma esta observação.

ESPECTROSCOP1A DE RMN A análise conformacional de ligandos, realiza-se por métodos de COYS 2D acoplados a RMN 1 D, intensificação de NOE 1D ou NOE 2D (ROESY), utilizando um dissolvente simulador do meio que rodeia o receptor. Quando o dissolvente simulador do meio que rodeia o receptor não contem grupos deutério permutáveis, então podem adicionar-se, eventualmente, pequenas quantidades de D2O ao DMSO com a finalidade de proceder a trocas. Registaram-se efeitos NOE ou ROE observados como consequência de fenómenos de relaxação através do espaço; efeitos de Overhauser nucleares inter-restos ilustram a proximidade de grupos vizinhos e consequentemente fornecem valiosa informação conformacional. Esta informação é utilizada para construir um modelo molecular do ligando. A técnica fica facilitada quando a presença de uma interacção capaz de formar grupos tirosinato foi previamente determinada por espectrocopia de fluorescência.

Exemplo 4 — Estudo por RMN protónica e ROESY 2D da fSarllAngiotensina II

Utilizando a técnica de fase sólida, sintetizou-se a [Sar1]Angiotensina II e purificou--se até à homogeneização por HPLC de fase inversa, utilizando métodos descritos por Matsoukas et al., J. Med. Chem. 31(7), pág. 1418-1421 (1988). O peptido sintético permitiu a análise necessária do aminoácido e revelou-se como um produto único em dois sistemas de cromatografia em camada fina (CCF). A [Sar1]Angiotensina II exibiu 180% da bioactividade da Angiotensina II no ensaio com 0 útero de rato fêmea também descrito por Matsoukas et al., citados antes. Uma vez que a HPLC for-

neceu o trifluoroacetato do peptido, a [Sar1]Angiotensina II neutralizou-se mediante passagem através de uma coluna (1,5 x 3 cm) de resina carboximetilcelulósica permutadora de iões (Whatman CM23). Em primeiro lugar, aplicaram-se 10 mg do peptido na coluna, em 5 ml de acetato de amónio 0,01 M a pH 5, e seguidamente procedeu-se à eluição com 10 ml de acetato de amónio 0,5 M a pH 8. Liofilizou-se o produto efluente obtido a pH 8, três vezes, e dissolveram-se 5 mg do produto em 0,5 ml de DMSO-d@ ao qual se adicionaram duas gotas de D2O. Durante 5 minutos, fez-se borbulhar árgon através da amostra, antes de se fechar 0 tubo de RMN.

As experiências de RMN realizaram-se utilizando um espectrómetro de RMN a 400 MHz Modelo AM 400 da Bruker, que se modificou para realizar a técnica designada por trancagem de spin (em língua inglesa "spin-locking") com um campo de radiolfe-quências eficaz de 5 Hz à temperatura ambiente (24°C <> 297+1 °K). A aquisição de dados e 0 processamento dos mesmos controlaram-se com um computador Aspect 3000 equipado com um processador de sensibilidade reforçada utilizando programas operacionais ("software") DISNMR Bruker 1987. Apresentaram-se desvios químicos referentes à fracção não deuterada do grupo CH3 de DMSO-d$ a 2,5 ppm relativa-mente ao TMS. Registou-se um espectro unidimensional com uma amplitude de varredura de 6100 Hz e 32 K (zero realizado até 64 K) pontos de dados. Para obter uma boa razão sinal/ruído acumuiou-se um total de 64 sequências. Utilizaram-se os métodos descritos por Otter et ai., Biochemistry, 27 Π0) pág. 3560-3567, (1988) e Marion et al., Biochem Biophys. Res. Commun., 113 (3). pág. 967-974 (1983). No Quadro II apresentado seguidamente, pode observar-se 0 resumo dos parâmetros utilizados nas técnicas de RMN bidimensional.

Ov QUADRO I!

Resumo dos Parâmetros Experimentais utilizados nos Ensaios de RMN BI DIMENSIONAL e,f

Parâmetros Unidade COSY ROESY

Amplitude da varredura em F2(H2> Hz 4000 3300 Amplitude da varredura em F<j(H2) Dimensão da Matriz (F-j x F2) Hz 2000 1650 antes da realização do zero Dimensão da Matriz (F<j x F2) 512x1K 256x1K após a realização do zero Tempo de evolução • - 1Kx8K 1Kx2K Valor inicial (ps) ps 3 1 Incremento (ms) ms 78 N° de sequências (sequências simuladas) 32 64 Tempo de aquisição s 0,32 0,20 Atraso na relaxação (pré-saturação HDO) s 1,8 1,8 Outros atrasos 9 ms 200 Funções de janela para 2D FT (F1/F2) 5/5 5/5 Desvios das funções de janela em fracções de 7t(F-|/F2) 4/8 3/4 e = Todos os espectros se registaram à temperatura de 24°C (297° K) na concentração de 10 mM em DMSO-d0 (+2 gotas de D2O). f Após a transformação de Fourier, favoreceu-se a fase em ambas as dimensões mediante uma correcção adicional da fase, aplicada a toda a matriz. O espectro ROESY foi corrigido na sua linha de base em F-j e F2 utilizando uma correcção de linha de base ABS Bruker. g = Tempo de trancagem de spin a um campo rf médio de 5 Hz.

Ambas as sequências de impulsos incorporaram um intervalo de pré-saturação do desacoplador para suprimir o sinal da água. Revelaram-se as matrizes 2D resultantes tendo sido, na generalidade, necessário um ligeiro ajustamento de fase em ambas as dimensões, para obter a melhor representação possfvel de dados. Mediante observação de linhas horizontais e verticais individuais de espectros eventualmente simetrizados verificaram-se correlações. A experiência de ROESY necessitou de uma correcçâo de fase básica de 90° em t-j antes de se realizar a fase de afinação cuidadosa. Para a sequência de trancagem de spin de impulsos duros, seieccionaram-se uma frequência do veículo de 3,7 ppm, um período de trancagem de spin de 0,2 segundos e um ângulo "flip" de 30°. Deve ter-se em atenção que esta experiência sofre muitas vezes de ressonâncias espúri-cas devidas a tranferência de magnetização entre spins acoplados escalares. Nas condições experimentais seieccionadas, o espectro bidimensional resultante apresentou-se praticamente livre de tais picos, os quais são por outro lado facilmente identificados peio facto das suas fases serem iguais às dos sinais em diagonal (os picos cruzados ROE reais têm sinais opostos relativamente aos picos em diagonal). Observaram-se algumas distorções na linha de base, especiaimente em torno de picos intensos tais como os sinais do dissolvente residual e grupos metíiicos. Para diminuir este problema, submeteram-se os espectros em ambas as dimensões a cor-recções convencionais da linha de base ABS Bruker utilizando uma adaptação polinomial do quinto grau à linha de base. Uma vez que todos os espectros bidimensio-nais registados sofrem de considerável ruído e arestas em t-j, tomaram-se precauções para obter informação precisa a partir desses espectros. Uma vez que apenas interessavam conexidades de acoplamento, observou-se que é útil registar a extensão do espectro no caso de uma experiência COSY; as arestas ao longo de ti po- 65 dem reduzir-se depois, consideravelmente, mediante métodos descritos por Otter et ai., citados antes.

Todas as ressonâncias do peptido foram atribuídas a aminoácidos individuais mediante informação reunida proveniente de espectros COSY e ROESY como se mostra no Exemplo 5 descrito seguidamente. As determinações obtidas pelos inventores da presente invenção para a [Sar1 ]Angiotensina II diferem das relatadas ante-riormente para a Angiotensina II [por Smeby et ai., Chemistry and Biochemistry of Amino Acids, Peptides and Proteins, Ed. Weinstein, Dekker, New York, pág. 117--162 (1976)] apenas no que se refere à posição relativa do protão Ca da Phe no interior do grupo Ca. Observaram-se espectros ROESY eventualmente simetrizados para identificar os picos cruzados quer intra- quer inter-restos. O Quadro III apresentado seguidamente mostra todas as interacções ROESY, quer as intra- quer as inter-restos:

Quadro ili

Interacções ROESY protão:protão identificadas para a [Sar1JAngiotensina li em

DMSO-de + D20h>UXI

Sar Arg(R) Val(V) Tyr(Y) Πο(Ι) His(H) Pro(P) Phe(F) a:M α:β α:β α:β α:β β:β' α:β α:β Interacções intra- restos α·.β' /3:7 7:6 β-Ί <*:β' α\η β:β' a :m β · 7 β·Ί' τ.ε a: C, 4 α:β β-Ί' η:6 β:β' α:ΓΦ a: y /S:m α.·7 7' :5' 'Λ a:S β :m α:γ' 6:6' β-.s m: 0 ί·ί' α:Η . β:Κ interacções inter-restos M:Y 0 VM:Y Υ :V„ Μ m Çm.pM νο'„Φ Y :Sar„ 0 Μ Η :Ρ. Η°:Ρ* α 6 Ρ.:Η pÍ-:8 Ρ{:Ρ,α γ Φ F.:Y Φ 7 h = M significa protões do grupo metilo. i = Meta (m) e orto (o) referem-se ao grupo hidroxi da tirosina. j = Os sinais dos protões Φ do núcleo da feniialanina sobreposeram-se e não foram determinados individualmente. k = β\ y', e 5' dizem respeito a ressonância protónica geminada para “campo alto" (upfield). I = As abreviaturas de aminoácidos utilizadas seguidamente são as abreviaturas convencionais utilizadas na Química da especialidade.

As interacções inter-restos são extremamente importantes para o estudo da conformação da [Sar^Angiotensina II em DMSO. Assim, os picos cruzados dos protões dos núcleos Tyr orto: Phe, em associação com os picos cruzados dos protões dos núcleos Pro Cy: Phe e dos protões Cg da Pro: Ca da His, ilustram a proximidade da Tyr relativamente quer à His quer à Phe e sugerem que os três núcleos aromáticos na Angiotensina II estão imediatamente próximos.

Observando as conexidades ROE entre protões Ca e Cg dos intra-restos, obteve--se informação útil respeitante à liberdade rotacional das três cadeias laterais aromáticas. Para a Tyr, a interacção do protão Ca com o protão Cg (δ = 2,80 ppm) foi muito mais forte do que a interacção do protão Ca com o protão Cg (δ = 2,62 ppm), o que indica rotação impedida da cadeia lateral da Tyr. Para a Phe apenas o protão Cg1 (isto é, o protão a δ =2,85 ppm) inter-reage com o protão Ca (δ = 4,10) o que indica, mais uma vez, a presença de um rotâmetro preferido e possivelmente menor movimento para a cadeia lateral da Phe do que para a cadeia lateral da Tyr. Para a His nenhum dos protões Cg (δ-j = 2,86 ppm e δ2 = 2,75 ppm) parece inter-reagir com o protão Ca (δ = 4,60 ppm). Examinando as colunas verticais e as colunas horizontais, observa-se apenas uma interacção muito fraca entre os protões Ca e Cg da O/

His; isto sugere que a ligação Ca-Cg da His pode estabelecer-se, essencialmente, sob a forma trans em DMSO. A interacção do protão Ca da His com ambos os protões Cg da Pro ilustra não apenas que a ligação His6-Pro7 existe principalmente sob a forma trans, mas define também a orientação da ligação His-Pro. Uma outra conexidade presente no espectro ROESY envolve uma interacção forte entre um grupo metilo da Vai ou da lie com o protão Ca da lie, Vai ou Phe. A determinação definitiva destes picos cruzados não foi possível devido à sobreposição do sinal, mas representa provavelmente uma interacção intra-resíduo da lie e/ou da Vai. Do mesmo modo, não se pôde verificar, definitivamente, uma interacção inter-restos entre a Tyr meta e um grupo metilo da lie ou Vai. Entre o protão do grupo NCH3 da Sar (δ = 2,23 ppm) e 0 protão da Tyr orto (δ = 6,58 ppm) observou-se também uma conexidade fraca. Nas colunas horizontais, observou-se uma conexidade entre os protões do núcleo da Tyr orto e os protões C4 do núcleo da His, mas não nas colunas verticais.

Para a Arg, 0 protão Ca (δ = 4,32 ppm) parecia inter-reagir com todos os protões metilénicos da cadeia lateral. Assim, as conexidades foram observadas entre 0 protão Ca e 1) os dois protões Cg (1,65 e 1,35 ppm), 2) os dois protões Cy (1,48 e 1,42 ppm), e 3) um protão Cg a 3,02 ppm (uma outra conexidade entre 0 protão Ca da Arg e um protão a 3,45 ppm foi determinada por tentativas relativamente ao protão Cg da Arg). A ausência de equivalência dos três pares de protões geminados, indica rotação restringida para a cadeia lateral da Arg. Métodos ROE entre protões Ca e Cg podem ilustrar enrolamento da cadeia lateral da Arg.

Interacções entre protões dos núcleos Tyr orto: Phe, em associação com conexidades entre protões dos núcleos Phe: Cy da Pro e protões Ca da His: Cg da Pro, su- gerem que os três núcleos aromáticos da Angiotensina II estão imediatamente próximos e formam um grupo (com aspecto de cacho) em DMSO. Entre os restos de His e de Phe não se observaram picos cruzados no método ROE. Um relatório prévio descrevendo a protecção do núcleo da His pelo núcleo da Phe em DMSO [consultar Matsoukas et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 122(1); pág. 434-438 (1984)] pode reflectir efeitos indirectos resultantes do agrupamento em cacho dos três núcleos. Alternativamente, os núcleos da His e da Phe podem estar separados por uma distância que permite uma interacção electrostâtica mas que é inferior ao limite máximo (< 5 Angstrom) para um ROE observável. Considerações similares podem explicar a ausência de um ROE, duas vias, observável, entre os núcleos da Tyr e da His. A orientação relativa dos núcleos, um reiativamente ao outro, no grupo em forma de cacho, não se pode deduzir sem informação adicional. Contudo, é fornecida alguma informação útil sob a forma de conexidades entre protões não aromáticos, como se pode observar no Quadro III. Em particular, a observação de interacções através do espaço entre os protões Ca da His e os protões C§ da Pro define a orientação da estrutura His-Pro e demonstra a predominância do isómero trans em DMSO. Pode deduzir-se que o resto Phe do C-terminal deve oscilar entre um ângulo de, aproxima-damente, 90° de modo que o núcleo Phe pode inter-reagir com o núcleo central Tyr (Quadro III). Experiências de modelação ilustram que o resto Phe está muito provavelmente a aproximar-se da sequência Tyr-lle-His a partir de uma volta y que tem origem na ligação His-Pro.

Um espectro de ROESY mostra fortes intra-restos Cg/Cg, interacções nos três restos aromáticos (Tyr, His e Phe), ilustrando ausência de equivalência e rotação restringida nestes protões geminados. Além do mais, observaram-se interacções inter- -restos não equivalentes entre o protão Ca e os dois protões Cg na Tyr; na Phe observou-se apenas uma interacção intra-restos Ca/Cg; e na His observaram-se in-teracções Ca/Cg muito fracas. Estas observações sugerem que as ligações Ca-Cg das três cadeias laterais aromáticas são incapaz de rodar iivremente. Na His os protões da ligação Ca-Cg parecem encerrados ("trancados") na posição trans, enquanto na Tyr e na Phe os protões da ligação Ca-Cg podem fixar-se (na escala de tempo de RMN) entre as orientações gaúche e trans. Uma rotação restringida no núcleo da Phe pode originar a partir da interacção com a cadeia lateral da His, o carboxiia-to do C-terminai e/ou uma interacção com o núcelo Pro. Esta última interacção é evidenciada no espectro de ROESY por conexidades de picos cruzados entre o núcleo da Phe e os protões Cy e Cy' da Pro. Estas interacções inter-resíduos não eram equivalentes; a interacção do(s) protão(ões) do núcleo Phe com o protão Cy da Pro em campo mais baixo a δ = 1,70 ppm, pareceu ser consideravelmente mais forte do que a interacção com o protão Cy da Pro em campo alto a δ = 1,50 ppm. isto indica que os núcleos da Phe e da Pro estão próximos mas que o núcleo da Phe, provavelmente, se aproxima do núcleo da Pro de um modo não paralelo. Estas observações estão de acordo com propostas prévias que sugerem posições funcionais para as três cadeias laterais aromáticas, e posições estereo/espaciais para a lie e a Vai. Consultar Moore, Pharmacol. Ther., 33(2-3), pág 349-381 (1987). Mais especifica-mente, foi sugerido que o movimento das cadeias laterais da His e da Phe seria inibido pela interacção com o carboxilato do C-terminal e reciprocamente, enquanto a cadeia lateral da Tyr seria constrangida pela ligação do átomo de hidrogénio à His. Estas considerações poderiam explicar que a ligação Ca-Cg da His exista predominantemente na conformação eclipsada energeticamente menos favorável, uma vez que a energia obtida a partir da interacção devida a transferência de cargas poderia superar a perda de energia devida a um rotomero Ca-Cg da His eclipsado.

De acordo com aspectos especialmente estruturais sugeridos peia experiência de ROESY de acordo com a presente invenção, determinadas interacções previamente propostas [consultar Moore et al., Biosci. Rep., 5(5), pág. 407-416, (1985)] são admissíveis. Assim, experiências de modelação ilustram que o radical hidroxi da Tyr poderia ligar-se através do átomo de hidrogénio ao átomo de azoto do núcleo imida-zólico do resto His e que o carboxiiato do C-terminal poderia também inter-reagir com o núcleo His. Estas interacções parecem ser possíveis em DMSO sem introduzir constrições indevidas na mólecula. A proximidade do carboxiiato C-terminal de um dos átomos de azoto do núcleo His, serve para aumentar a polarização do dipolo do núcleo His, aumentando, consequentemente, a alcalinidade do outro átomo de azoto do núcleo His e a força da sua interacção com o radical hidroxi da Tyr. Esta interacção pode originar a produção da forma tirosinato que activa o receptor.

As investigações correntes têm mostrado uma interacção inter-restos do resto Sar1 com o núcleo Tyr*. Em parte, escolheu-se a [Sar1]Angiotensina para este estudo para que a informação respeitante às interacções do N-terminal se pudessem observar facilmente. A este respeito, espectros de RMN 1D conduzidos para a Angioten-sina II e a [Sar1]Angiotensina II em DMSO, mostraram que a região aromática dos mesmos é idêntica. A importância do resto Sar1 como contribuinte para a acção antagonista da Sarmesina, encontra-se bem documentada, tendo estudos prévios demonstrado que o radical N-CH3 da Sar1 está submetido a uma influência protectora em um grande número de análogos da Angiotensina em DMSO. Consultar Moore et al., Biosci. Rep., 5(5), pág. 407-416, (1985). Os resultados deste exemplo ROESY apoiam sugestões anteriores [Matsoukas et al., Peptides 1986, Ed. Theodoropoulos et al., Berlin, New York, pág. 335-339 (1987)] de que 0 radical N-CH3 da Sar inter--reage com 0 núcleo da Tyr. Em especial, a observação das colunas horizontais e das colunas verticais que comportam 0 radical N-CH3 da Sar do espectro de 71 ROESY eventualmente simetrizado, indicou uma conexidade fraca com o protão da Tyr orto. Assim, a fonte do efeito protector, reiativamente ao radical N-CH3 poderia ser 0 núcleo Tyr, podendo 0 grupo N-CH3, da Sar existir justamente nos valores limites que permitem uma observação ROE.

Resumindo os resultados ROESY descritos antes, picos cruzados entre núcleos aromáticos evidenciaram que os três núcleos aromáticos da [Sar^jAngiotensina li formam, conjuntamente, grupos em forma de cacho. Picos cruzados entre 0 protão Ca da His com ambos os protões C§ da Pro, ilustraram que a ligação His6-Pro7 existe especialmente sob a forma trans. Picos cruzados entre 0 protão do radical N-CH3 da Sar e 0 protão do radical N-CH3 da Sar e 0 protão em posição orto da Pro, ilustraram proximidade do N-terminal do peptido ao núcleo Tyr. Um pico cruzado observado entre os protões do núcleo Phe e os protões Cy da Pro ilustraram que 0 núcleo Phe se encontra próximo do núcleo Pro [bem como do núcleo His, anteriormente mencionado]. A informação obtida a partir da experiência de ROESY 2D juntamente com os dados de fluorescência que mostram a presença de um sistema de transferência de cargas na forma tirosinato, permite a construção de um modelo molecular para a [Sar1]-Angiotensina II. Este modelo pode observar-se na Figura 1.

Do mesmo modo, seguindo as técnicas apresentadas antes e porque se observaram picos cruzados similares para a Angiotensina II, construiu-se um seu modelo molecular que se pode observar na Figura 4A. A figura 6 representa uma fotografia estereo deste modelo. A Figura 4A mostra um modelo da Angiotensina II que difere das conformações pre-viamente referidas. Em particular, o N-terminal e o núcleo Phe foram reposicionados na Fig. 4 de modo a acomodar a proximidade já observada do núcleo Tyr quer ao N--terminal quer ao núcleo Phe. A reposição do núcleo Phe é também compatível com, ab initio, cálculos de interacções devidas a emparelhamento de núcleos que sugeriram uma interacção na placa perpendicular para os núcleos His e Phe. Fowler et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 153(3), pág. 1296-1300 (1988).

Exemplo 5 - Aumento de intensidade NOE 1D para a Sarmesina

Utilizando uma técnica de fase sólida similar à descrita no Exemplo 4 apresentado antes, sintetizaram-se a Sarmesina e a [Des1]Sarmesina. A purificação por HPLC de fase inversa, forneceu o trifluoroacetato de peptidos que se neutralizaram mediante passagem através de uma coluna carboximetilcelufósica como a referida também no Exemplo 4 descrito antes.

As experiências de RMN realizaram-se a 400 MHz utilizando um espectrofotómetro da Bruker. Em 0,5 ml de DMSO-dg dissolveram-se 5 mg do peptido e adicionaram--se duas gotas de D2O. Através da amostra, fez-se borbulhar árgon durante 5 ml· nutos antes de fechar 0 tubo de RMN. A aquisição de dados e 0 processamento dos mesmos, controlaram-se com um computador Aspect 300 equipado com um processador de sensibilidade reforçada utilizando programas operacionais DISNMR 1987. Apresentaram-se desvios químicos referentes à fracção não deuterada do grupo CH3 de DMSO-dg a 2,5 ppm relativamente ao TMS. Registou-se um espectro unidl· mensional com uma amplitude de varredura de 4500 Hz e 32 K (zero realizado até 64 K) pontos de dados. Para obter uma boa razão sinal/ruído acumulou-se um total de 64 sequências. Utilizaram-se métodos similares aos de Otter et al., J. Am. Chem.

Soc., 109, pág. 6995-7001 (1987). As experiências de COSY (two-dimensionai correlated spectroscopy) forneceram gráficos de contorno que se simetrizaram relativamente à diagonal. Os tempos de relaxação 1H longitudinal não selectiva, determinaram-se em DMSO-dg + D2O (2 gotas) utilizando uma sequência adicional de 180-τ-90°, podendo observar-se no Quadro IV apresentado seguidamente.

Quadro IV

Tempos de Relaxação T-j Protónica (em segundos) para a Sarmesina. A. Cadeias laterais Aromáticas

His C2H 0,332 C4H 0,481

Tvr (Me) meta 1,180 orto 1,505 CH3 0,994 B. Protões da Estrutura

His Tvr (Me) lie Vai PheíAra.Pro)

Ha 0,436 Ha 0,962 Ha 0,726 Ha 0,853 Ha 0,896 C. Outros

Sar

Ha 0,559 CH3 0,805

Utilizaram-se inúmeros valores de x compreendidos entre 0,01 e 10 s. Para determinações T1 utilizaram-se retardamentos de relaxação até 10 s. η<

Realizaram-se cálculos de aumento de intensidade NOE unidimensional de um modo distinto utilizando irradiação múltipla. Durante 100 ms irradiou-se 50 vezes cada uma das linhas seleccionadas (tempo total de irradiação 5,0 s). Em algumas experiências utilizaram-se também outros tempos de irradiação (0,2, 0,5,1 e 3 s) para controlar a reconstrução do NOE. A técnica de irradiação múltipla permite uma regulação multo pequena da potência do desacoplador (na generalidade 10 dB mais baixa do que a de uma experiência de NOE padrão) de modo que é possível evitar saturação parcial de ressonâncias na proximidade imediata. Para cada linha foi necessário um total de 1000 sequências e o tempo de relaxação total foi 2 s. Nas condições experimentais utilizadas para a experiência de NOE (potência baixa, tempos de pré-irrra-diação τ diferentes, saturação de áreas de controlo), minimizaram-se, visivelmente, a difusão de spin e a saturação parcial relativamente às interacções em debate. Aumentos de intensidade por NOE determinaram-se sob a forma de aumento de pontos na dimensão do sinal por protão após saturação de um protão distinto sob o ponto de vista funcional. No Quadro V apresentado seguidamente apresentam-se os aumentos de intensidade por NOE resultantes:

/ O

Quadro V

Aumentos de intensidade por NOE para a Sarmesina e a [Des1]Sarmesina m Sat. de protSofões) de peptido Taxa de aumento de intensidade protão {%)

A Tyr(Me) Ca Tyr(Me) CBB· 8,7 C A Phe Ca f+vai.ilel Phe ϋββ- 2,4 C A His Ca His CBB- 8,2 C A His Ca Pro Cg 11,3 D A His Ca Pro Cg· 8,6 D A Arg Ca Arg CDB· 2,5 C A Arg Ca Arg C„· 1,5 C A Arg Ca Arg Cgg- 1,1 C A Sar Ca [+Pro Cg] Sar CH3 1,2 C A Sar CH3 Sar Ca 0,9 C A Sar CH3 His Cg 1,1 D A Pro Cg [+Sar Ca] His Ca 5,0 D A Pro Cg [+Sar CqJ Pro Cg 9,0 C B Tyr(Me) CH3 His C2 0,4 D B Tyr(Me) CH3 His C4 0,5 D B Tyr(Me) CH3 Tyr(Me) orto 6,7 C B Tyr(Me) CH3 Tyr(Me) meta 3,2 E B Tyr(Me) meta [+Phe] Tyr(Me) orto 18 C B His C2 Tyr(Me) meta 2,1 D B His C2 Tyr(Me) orto 1,6 D m = em DMSO-de A = Sarmesina B = [Des1] Sarmesina C = Noe intra-restos D = Noe intra-restos E = difusão de spin 76 A Sarmesina e a [Des1]Sarmesina submeteram-se a experiências bidimensionais COSY e de aumento de intensidade por NOE, apropriadas para atribuição da ressonância e informação da distância. Foi possível atribuir ressonâncias de peptidos aos aminoácidos individuais, reunindo informação proveniente de espectros COSY e NOE respeitantes às diferenças. O espectro de RMN unidimensional da Sarmesina e da [Des1]Sarmesina em DMSO-dg exibiu uma complexa região em "campo alto" com ressonâncias NH de sobreposição larga indicando permuta rãpida. Para simplificar as regiões aromáticas e do protão Caeo estudo das interacções protão-protão intramoleculares entre núcleos aromáticos e protões de estruturas inter-restos, realizaram-se experiências de RMN depois de se permutarem grupos NH com D2O.

As experiências de NOE em associação com 0 espectro COSY permitem completa atribuição de todas as ressonâncias de protões da cadeia lateral e da estrutura. A saturação dos protões Ca da His, Tyr(Me) e Phe (sobrepostos aos protões Ca da Vai e da lie) deu origem a um aumento de intensidade dos protões β vicinais revelando 0 seu modelo e posição exacta na região alifática densa do espectro de referência. Assim, 0 espectro de NOE respeitante âs diferenças obtidas após saturação J do protão Ca da His a δ = 4,64 ppm, mostrou um quarteto AB a δ = 2,86 ppm atri buível aos dois protões vicinais Cg da His. Para esta interacção encontrou-se 0 valor de 8,2 %. Do mesmo modo 0 espectro de NOE respeitante às diferenças depois da saturação do protão Ca da Tyr(Me) a 4,48 ppm e do protão Ca da Phe a δ = 4,11 ppm, mostra um quarteto AB para os protões vicinais Cg da Tyr (Me) e da Phe a δ = 2,77 ppm (8,7 %) e 2,95 ppm (2,4 %). O espectro de NOE respeitante às diferenças, obtido após saturação do protão Ca da His mostra também duas ressonâncias fortes a δ = 3,20 ppm (11,3 %) e 3,49 ppm (8,6 %) devidas a aumento de intensidade dos dois protões C5 da Pro. Ambos 7- os protões Cg da Pro são igualmente afectados, o que revela proximidade imediata e equidistância destes dois protões relativamente ao protão Ca da His. Esta interac-ção que também se observou para a [Sar1]Angiotensina II em DMSO (Exemplo 4 descrito antes), confirma a presença da forma trans da ligação His6-Pro7 e permite a compreensão da orientação relativa da sequência His-Pro-Phe. A estereoqufmica respeitante à ligação His-Pro na Angiotensina II tem constituído o objectivo de muitas investigações utilizando, principalmente, espectrocopia de RMN 1H e de RMN 13C. Os resuitados deste exemplo que utiliza aumento de intensidade por NOE protão: protão, confirmam estas observações e, consequentemente, definem a orientação precisa da ligação His-Pro. A saturação do protão Ca da Arg e da Pro a δ = 4,34 ppm e a δ = 4,21 ppm, res-pectivamente, revelaram modelos de multipletos para os respectivos protões β vicinais a δ = 1,58 ppm e a δ = 1,75 ppm no espectro de NOE respeitante a diferenças. O aumento da ressonância observado a δ - 3,02 ppm (1,6 %) respeitante à saturação do protão Ca da Arg foi atribuído, por tentativas, a uma interacção com protões Cg da Arg. Esta interacção, observada também na [Sar1]Angiotensina ii durante os > estudos de espectroscopia por NOE de estrutura rotativa (Exemplo 4), ilustra a pro ximidade entre os protões Ca da Arg e os protões Cg da Arg. A saturação da ressonância dos protões Ca da Sar a δ - 3,2 ppm deu origem, como se esperava, ao aumento de intensidade da ressonância protónica do grupo CH3 da Sar a δ = 2,26 ppm (1,2%). Reciprocamente, a irradiação do grupo CH3 da Sar reforçou a ressonância dos protões Ca da Sar (0,9%). Adicionalmente, observou-se aumento de intensidade de um dos protões Cg da His após saturação do grupo N-CH3 da Sar, 0 que implica a proximidade dos protões do grupo CH3 da Sar relativamente aos protões Cg da His. O aumento de intensidade observado da ressonância de protões Ca da His a δ = 4,64 ppm (5%) e a ressonância de protões Cg da Pro em "campo baixo" a δ = 78 = 3,48 ppm ¢9%) podem atribuir-se a saturação da ressonância de protões C§ da Pro em "campo alto" que se sobrepõe à ressonância de protões Ca da Sar a δ = = 3,20 ppm.

Para investigar a proximidade proposta dos núcleos Tyr e His, metilaram-se a [Sar1]Angiotensina li e a [Des1]Angiotensina II (Angiotensina III) no grupo hidroxi da Tyr, de modo a fornecer uma sonda apropriada (δ = 3,61 ppm) para investigar a interacção entre os dois núcleos aromáticos. Por estas razões, as experiências de NOE realizaram-se mediante saturação da ressonância do grupo O-CH3 da Tyr e das ressonâncias dos protões C2 e C4 em ambos os análogos. Mediante saturação de ressonância do grupo O-CH3 da Tyr da [Des1]Sarmesina ([Tyr (Me)4]Angiotensi-na III), observaram-se aumentos fracos de intensidade de ressonâncias dos protões C2 e C4 da His a δ = 7,47 ppm (0,42%) e δ = 6,85 ppm (0,52%), respectivamente. A fragilidade destas interacções coloca 0 grupo O-CH3 da Tyr no limite da distância permissfvel (< 5 Angstrom) relativamente ao núcleo imidazólico da His, para se observar 0 efeito. O cancelamento da ressonância do núcleo Phe na proximidade da ressonância da Tyr (meta) sugere que 0 efeito observado pode ser real e não devido a difusão de spin. Contudo, observou-se aumento de intensidade das ressonâncias dos protões em posição orto e meta da Tyr a δ = 7,82 ppm (3,21%) e a δ = = 6,71 ppm (8,86%) mediante saturação dos protões do grupo O-CH3 da Tyr na [Des1]Sarmesina. Enquanto 0 primeiro representa um efeito de Overhauser esperado, 0 último pode resultar de uma transferência de magnetização de segunda ordem via protões em posição orto. Não se pode excluir a possibilidade de que aumentos de intensidade de protões C2 e C4 da His em [Des1]Sarmesina resultem de NOE secundários substituídos por protões em posição orto e/ou meta da Tyr, embora estas considerações possam ainda colocar os núcleos Tyr e His na proximidade imediata. Uma vez que, para a Sarmesina, não se observaram aumentos similares de intensidade por NOE, para os protões C2 e C4 da His, a presença do N-terminal Sar pode, de um modo subtil, alterar a conformação do octapeptido e colocar 0 grupo O-CH3 da Tyr justamente no limite máximo que permite interacções devidas a NOE com 0 núcleo His. A saturação da ressonância do protão C2 da His a δ = 7,47 ppm na [Des1]Sarmesi-na, deu origem a aumento de intensidade das ressonâncias de protões em posição meta e orto da Tyr a δ = 7,08 ppm (2,15%) e a δ = 6,71 ppm (1,58%). Contudo, mediante saturação da ressonância do protão em posição meta da Tyr a δ * 7,09 ppm (sobreposto a ressonâncias do protão do núcleo Phe), não se observou aumento de intensidade dos protões C2 e C4 da His a δ = 7,47 ppm e a δ = 6,85 ppm. Apenas 0 protão em posição orto da Tyr δ = 6,71 ppm (18 %) na região aromática sob observação, sofreu aumento de intensidade. Esta última saturação serve como experiência de controlo para mostrar a contribuição mínima da saturação parcial relativamente aos sinais dos protões em posição meta e orto da Tyr. O espectro de NOE relativamente às diferenças para a Sarmesina mediante saturação dos protões Ca da His, Ca da Tyr (Me) e Ca da Phe (Vai, Pro), revela interacções de protões Ca/C& intra-restos na His, Tyr (Me) e Phe. A presença de um NOE protão:protão dos protões Ca da His/Cg da Pro, define a conformação predominantemente trans de ligação peptídica His-Pro da Sarmesina em DMSO. O isómero trans também predomina na [Sar1]Angiotensina II (Exemplo 4), ilustrando que quer 0 agonista quer 0 antagonista matêm esta propriedade conformacional em DMSO. Além do mais, efeitos similares de saturação do protão Ca da His, reiativamente a ambos os protões Cg da Pro, colocam 0 protão Ca da His a meio caminho entre os dois protões Cg da Pro.

Entre os protões Ca da Arg e Cg da Arg, observou-se um NOE protão:prot5o inter--restos, após saturação do primeiro na Sarmesina. isto pode demonstrar que a cadeia lateral da Arg não exibe liberdade completa de movimento em DMSO, ou que exibe liberdade conformacional suficiente para fornecer muitas conformações. A função desta cadeia lateral com carga positiva pode ser a de contactar um sítio anió-nico complementar relativamente ao receptor e participar na realização da ligação produtiva da Angiotensina II ao seu receptor. Na [Sar1]Angiotensina II (Exemplo 4) observou-se a mesma interacção. O que acabámos de afirmar, juntamente com considerações respeitantes à ligação His-Pro na [Sar^jAngiotensina II e na Sarmesina, ilustra as similaridades, em certos aspectos, das conformações do agonista e do antagonista em DMSO. A proximidade dos protões do grupo CH3 da Sar com um dos protões Cg da His na Sarmesina é evidenciada pelo aumento de intensidade do sinal dos últimos com saturação dos primeiros, isto sugere a presença de uma inflexão na região N-terminal, Sar-Arg-Val, da molécula que permite a proximidade da Sar e da His. Experiências de modelação sugerem que, por razões estereo, os N- e C-terminais das moléculas, provavelmente, aproximam 0 dominio central de diferentes lados, criando, consequentemente, uma estrutura peptídica aproximadamente em forma de S. O espectro de NOE relativo a diferenças para a [Des1]Sarmesina, mediante saturação de protões do grupo metilo da Tyr (Me), ilustra aumento de intensidade de protões C2 e C4 da His. A proximidade do grupo metilo da Tyr (Me) e do núcleo His está de acordo com a interacção da ligação ao hidrogénio anteriormente postulada entre 0 núcleo Tyr OH e 0 núcleo His na Angiotensina II. Difusão de spin não contrariada, aumentos de intensidade NOE similares de ambos os protões, C2 e C4 da His, sugerem que 0 núcleo Tyr (Me) pode apresentar uma orientação perpendicular re- lativamente ao núcleo imidazoi; esta dedução baseia-se no facto de que, tal como se esperava o grupo metoxi e o núcleo Tyr são complanares. O que acabámos de afirmar constitui uma observação potencialmente interessante, uma vez que as orientações relativas dos núcleos Tyr e His podem manter-se, similarmente, no grupo em forma de cacho dos núcleos aromáticos da Angiotensina II. Mesmo quando o aumento de intensidade das ressonâncias dos protões C2 e C4 da His se deve a NOE secundários substituídos pelos protões na(s) posição(ões) orto e/ou meta da Tyr, os dados ainda demonstram 0 importante facto de que os núcleos Tyr e His se encontram na proximidade imediata.

Mediante saturação do protão C2 da His na [Des1]Sarmesina, observa-se 0 aumento de intensidade por NOE dos protões nas posições meta e orto da Tyr (Me). Devido a sobreposição dos sinais dos protões nas posições meta e orto da Tyr (Me) e do protão C4 da His no espectro de RMN, não foi possível saturar 0 protão C4 da His e obter resultados significativos. Na verdade, a validade da experiência de saturação do protão C2 da His é questionável, tendo-se realizado uma experiência de controlo para avaliar 0 grau de saturação parcial. A saturação de ressonância dos protões em posição meta da Tyr (Me) a δ = 7,09 ppm (sobreposta à ressonância dos protões do núcleo Phe) originou um aumento de intensidade dos protões em posição orto da Tyr (Me) a δ = 6,72 ppm (30%) mas não das ressonâncias dos protões C2 e C4 da His. Esta experiência favorece a ausência de efeitos de saturação parcial que contribuem para 0 aumento de intensidade de ressonâncias dos protões nas posições meta e orto da Tyr (Me) após saturação do protão C2 da His, validando os dados experimentais ao mostrar proximidade entre os núcleos Tyr (Me) e His da [DesljSarmesina em DMSO. Além do mais, a interacção entre os núcleos Tyr (Me) e His da [Des1]Sarmesina não constitui um fenómeno de relaxação inverso. Assim, enquanto os protões C2 e C4 da His podem relaxar através dos protões do 82 η, núcleo nas posições meta e orto da Tyr (Me) rigorosamente separados com espaços, o efeito inverso não se observa mediante saturação dos protões nas posições meta e orto da Tyr (Me). A razão provável para tal facto é que os protões nas posições orto e meta da Tyr (Me) exibem ciclos de relaxação que não são acessíveis aos protões C2 e C4 da His. Os protões em posição orto da Tyr (Me) podem relaxar através dos protões do grupo metilo e dos protões na posição meta da Tyr (Me), enquanto os protões na posição meta da Tyr (Me) podem relaxar através dos protões Οβ e na posição orto da Tyr (Me).

Concluindo, as observações deste exemplo sugerem que a Sarmesina e a [Des1]-Sarmesina comportam a mesma inflexão na ligação His-Pro a qual tem sido observada para a [Sar1]Angiotensina II e que este facto produz uma transformação similar em grupos em cacho dos núcleos aromáticos. A Sarmesina e a Angiotensina II parecem assumir na DMSO uma conformação, aproximadamente, em forma de S. Trabalhos anteriores sugerem que 0 N-terminal da [Sar1]Angiotensina li inter-reage com 0 núcleo Tyr, enquanto os achados de acordo com a presente invenção indicam que 0 N-terminal da Sarmesina está próximo da cadeia lateral da His. A partir de expe-- riências de modelação moleculares, pode demonstrar-se que 0 grupo NCH3 da Sar pode ocupar uma posição próxima quer dos protões Οβ da His quer dos protões do núcleo Tyr, simultâneamente.

Exemplo 6 - Estudos de RMN relativamente à ocitocina e à ÍArail vasopressina.

Utilizando um Bruker a 400 Mz, realizaram-se estudos de RMN, essencialmente de acordo com os exemplos anteriores. Dissolveram-se peptidos em uma concentrac-ção de 5 mg/0,5 ml de DMSO-de e adicionaram-se 2 gotas de D2O. 83

No espectro de RMN protónica da vasopressina, observou-se uma ressonância característica a S - 9,2 ppm, mas não no espectro de RMN da ocitina. A ausência deste sinal na ocitocina é o indício da formação do tirosinato e está de acordo com a espectroscopia de fluorescência (Exemplo 3); este sinal estava também ausente no caso da Angiotensina li.

Uma interacção devida a emparelhamento nuclear na vasopressina é também evidente quando se investigam os dados de RMN respeitantes à vasopressina. Cálculos téoricos [Fowler et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 153(3), pág. 1296--1300 (1988)] esclareceram que as interacções electrostáticas devidas a emparelhamento nuclear, ocorrerão, de preferência, na orientação em placa perpendicular e que a configuração em placa paralela deslocada apenas será adoptada quando outros factores preponderantes dominarem as interacções em placa prependicular. Nas experiências de RMN, a interacção em piaca perpendicular está associada â protecção dos protões de um núcleo e à ausência de efeito protector no outro núcleo, com os dois núcleos demonstrando não equivalência dos seus protões. Isto observa-se para a vasopressina quando os protões da Tyr livre (7,07 e 6,70 ppm) ou com os protões do núcleo Tyr do peptido estão protegidos (6,91 e 6,62 ppm) em comparação com os protões do núcleo Tyr da ocitocina (7,12 e 6,68 ppm). Os protões do núcleo Phe da vasopressina não são protegidos e não são equivalentes (7,34 e 7,24 ppm) em comparação com a Phe livre (7,30 ppm). Isto revela o facto de que o eixo hexagonal do núcleo Tyr inter-reage com a face hexagonal do núcleo Phe na vasopressina. Este método pode utilizar-se para qualquer molécula em que seja possível uma interacção devida a emparelhamento nuclear.

Utilizando o mapa de distribuição de cargas representado na Figura 4B, juntamente com as considerações implícitas nas Figuras 5 e 7, preparam-se os novos anta- 84 gonistas do receptor da Angiotensina II apresentados seguidamente, com base em modificações no núcleo imidazólico. Deve ter-se em atenção que a nomenclatura dos substituintes dos compostos que comportam núcleos é diferente da apresentada antes. Assim, os novos antagonistas do receptor da Angiotensina II são compostos de fórmula geral

α, β, y, δ e s representam átomos de carbono, azoto, oxigénio ou enxofre com a condição de (a) o núcleo conter, pelo menos, um átomo de carbono e um átomo de azoto, e (b) a ligação dos grupos representados pelo símbolo R fazer--se no átomo de carbono ou de azoto; e ainda preferivelmente com a condição de (c) pelo menos um átomo de azoto no núcleo permanecer in-substituído, e (d) o pKa do núcleo ser igual ou inferior a 7 quando todos os grupos presentes forem considerados;

Ri a que imita na angiotensina a estrutura

inclui um grupo -alq; -O-alq; -alq-O-alq; -CH2-CO-NH2; Ί

alq -CH2-CO-NH-alq;-CH2-CO-N(alq)2;- ch2 - Co - ι -CH2-CO-AA-NH2 ou CH2-CO-AA-fenilo em que alq representa um grupo alquilo com 1 a 10 átomos de carbono, ciclo-aiquilo com 3 a 6 átomos de carbono, alcenilo com 2 a 10 átomos de carbono ou alcinilo com 2 a 10 átomos de carbono; e AA representa um aminoácido, de preferência a prolina, o ácido azetidina-carboxílico, o ácido pipecólico, o ácido nipe-cótico, a glicina, a alanina, a sarcosina ou a N-metil-alanina;

RiB que eventualmente fornece um grupo espaçador que termina em um imitador do grupo carboxilato C-terminal da angiotensina II representa um átomo de hidrogénio ou um grupo de fórmu-

em que alq tem o significado definido antes e A representa um grupo ácido ou um seu sal aceitável sob o ponto de vista farmacêutico incluindo, embora sem carácter limitativo, um grupo -C02H, -C02alq, -SO3H, -SC>4H2, -PO3H, -PO4H2, F3CCONH-, F3CS02NH-, -alq-SH 86 ου

C

Ν-Ν

Ν-Ν Η ou um grupo de fórmula geral -CC>2R+ na qual R+ representa um profármaco de um éster lipofílico tal como um grupo de fórmula geral -CH2CC>2C(CH3)3 ou outro similar; de preferência com a condição de (a) o símbolo <x e/ou y não representar(em) um átomo de azoto quando o núcleo representa um grupo imidazólico, (b) ou o símbolo α representar um átomo de carbono ou o símbolo β representar um átomo de azoto quando o núcleo não representar um grupo imidazólico, (c) o símbolo R«ia comportar um grupo contendo um radical amida, (d) R2 comportar um grupo que inclui um radical representado pelo símbolo A, ou (e) R3 comportar um grupo designado por B escolhido entre um grupo alcalino ou um seu sal aceitável sob 0 ponto de vista farmacêutico englobando, embora sem carácter limitativo,

um grupo -NH2, -NHalq, -N(alq)2 ou · um grupo -Asp-Arg-NH2; quando R-j g representa um átomo de hidrogénio; R2 que fornece propriedades estereoquímicas e/ou electrónicas e/ou um grupo espaçador que termina em um grupo ácido, representa um átomo de hidrogénio ou de halogéneo, isto é, um átomo de flúor, cloro, bromo ou iodo, um grupo -alq; -O-alq; -NO2;

R3 que fornece propriedades estereoquímicas e/ou electrónicas e/ou um grupo mimético do radical hidroxi da tirosina da angio-tensina II na sua conformação de "interruptor de carga" ("charge relay") ou um grupo espaçador que termina em um imitador do N-terminal do dipeptido N-terminal da angio-tensina II, representa um átomo de hidrogénio; um grupo -alq; -arilo; -alq-OH; -alq-halogeneto; -CH2-0-alq; -CH2-CN; -CH2-C02H; -CH2C02-alq; -NH-CO-alq; -CO-NH-alq; -alq-B; -CH(OH)-alq-B; -alq-Asp-Arg-NH2;

N ·- N

H -CH(OH)-alq-Asp-Arg-NH2; -alq-C ^ || ;

R4A que fornece um grupo espaçador, cuja rigidez relativa constitui um aspecto do modelo de acordo com a presente invenção, que termina em um grupo ácido que imita os grupos hidroxi da tirosina da angiotensina II na sua conformação de "ligação ao receptor", representa grupos de fórmula geral 7 /

em que Z representa uma ligação, um átomo de oxigénio ou um grupo -NHCO-, OCH2- ou -CH2-; X representa um grupo -C02H, -alq-CC^H, -PO3H, -alq-POjH, -PO4H2, -alq-P04H2, -SH, -alq-SH, -SO3H, -alq-S03H, -SO4H2,

N·—N

-alq-SQ4H2, F3C-CO-NH-, F3C-SO2-NH-, -G ^ J

-N ou ainda um outro grupo ácido ou um seu sal aceitável sob 0 ponto de vista farmacêutico; e Y representa um átomo de hidrogénio ou de halogéneo ou um grupo -NO2, -O-alq, -alq, -CF3 ou -CN; e F?4B que fornece eventualmente um grupo espaçador que termina em um imitador do N-terminal do dipeptido N-terminal da angiotensína, representa um átomo de hidrogénio, um grupo -aiq-B, -alq-Asp-Arg-NH2, alq-O-alq-B, alq-0-alq-Asp-Arg-NH2i

ou -aii ngí' de preferência com a condição de (a) o símbolo α e/ou y não representar(em) um átomo de azoto quando o núcleo representa um grupo imidazólico, (b) ou o símbolo α representar um átomo de carbono ou o símbolo β representar um átomo de azoto quando o núcleo não representa um grupo imidazólico, (c) o símbolo Ria comportar um grupo que inclui um radical amida, (d) F?2 comportar um grupo contendo um radical representado pelo símbolo A, ou (e) R3 comportar um radical contendo um grupo representado pelo símbolo B ou um grupo -Asp-Arg-NH2, quando R413 representa um átomo de hidrogénio.

Em um aspecto preferido da presente invenção, (a) α e/ou y não representa(m) um átomo de azoto, quando 0 núcleo é um núcleo imidazólico; (b) ou <x representa um átomo de carbono ou β representa um átomo de azoto, quando 0 núcleo não é um núcleo imidazólico; (c) 0 símbolo R-ja representa um grupo que inclui uma amida; (d) 0 símbolo R2 representa um grupo que comporta um outro grupo representado pelo símbolo A; ou (e) 0 símbolo R3 representa um grupo que comporta um radical representado pelo símbolo B ou um grupo -Asp-Arg-NH2i quando R-j b representa um átomo de hidrogénio. 90 η

Em um outro aspecto da presente invenção de maior preferência, (a) α e/ou y não representa(m) um átomo de azoto, quando o núcleo é um núcleo imidazólico; (b) ou α representa um átomo de carbono ou β representa um átomo de azoto, quando o núcleo não é um núcleo imidazólico; (c) R-ja representa um grupo que inclui uma amida; (d) R2 representa um grupo que comporta um outro grupo representado pelo símbolo A; ou (e) 0 símbolo R3 representa um grupo que comporta um radical representado pelo símbolo B ou um grupo -Asp-Arg-NH2i quando R4B representa um átomo de hidrogénio;

Em um aspecto particularmente preferido do produto de acordo com a presente invenção, 0 núcleo pentagonal citado antes é um núcleo imidazólico.

De preferência, não se observa duplicação do símbolo R2 ou R3 quando os mesmos símbolos não representam um átomo de hidrogénio.

Na fórmula citada antes, o grupo de fórmula geral -CH(R-|a)(Rib) Poc,e ser designado por R-j e 0 grupo -CH(R4a)(R4b) P°de ser desigando por R4. O posicionamento relativo dos grupos representados pelo símbolo R descritos antes, e particularmente as afinidades entre os grupos representados pelo símbolo R-j e os grupos representados pelo símbolo R4 dão origem a configurações diferentes no caso de núcleos pentagonais como, por exemplo, um grupo imidazol, pirrol, pirazol, triazol, tetrazol, tiazol, etc.

Por exemplo, no caso de grupos imidazólicos adaptam-se as configurações seguintes: 91

Configuração ΝΥ»ε

Configuração ΝΥ>δ

Configuração Configuração R2 OU R3

ou R-*

Configuração nM

Uma vez que o símbolo R^ representa um grupo benzi lo substi-

OL Ô Ct "V tuído ou equivalente, as configurações Ν' e N são, genericamente falando, compostos N-benzí1icos, enquanto as configurações Ν^'ε e Νβ,ε e Νβ,δ são compostos C-benzilimidazóli-cos. Configurações similares, numeradas de zero a cinco de acordo com o número de átomos de azoto presentes no núcleo, adaptam-se a outros núcleos heterocíclicos pentagonais.

Os novos antagonistas de acordo com a presente invenção não estão limitados a núcleos pentagonais, englobando na realidade, núcleos hexagonais incluindo a piridina e diazinas (como, por exemplo, a pirimidina, a piridazina e a pirazina) bem como triazinas. Por exemplo, os compostos seguintes podem servir como substitutos do núcleo imidazólico na histidina:

R2 OU r3 na qual a, S,y , δ, ε e Φ representam átomos de carbono, azoto, oxigénio ou enxofre, com a condição de (a) o núcleo comportar, pelo menos, um átomo de carbono e um átomo de azoto, (b) o átomo de carbono ou o átomo de azoto representar a ligação dos grupos representados pelo símbolo R, (c) o número de átomos de azoto substituídos ser igual ou superior a um, e (d) 93

o pka do núcleo ser igual ou inferior a sete quando considerados todos os grupos presentes; e R^g, R2» Rg, R4A, Z, X e Y, R^g, alq, halogeneto, A e B têm os significados definidos antes.

De preferência, α não representa um átomo de azoto.

De preferência, β representa um átomo de azoto.

De preferência, não se observa duplicação do símbolo Rg ou Rg quando os mesmos não representarem um átomo de hidrogénio.

Ainda um outro grupo de núcleos que podem substituir o núcleo imidazólico da histidina são grupos indólicos, benzoazólicos ou outros similares, ainda com a condição das considerações estereoquímicas permitirem que tais sistemas de núcleos se incluam nos constrangimentos espaciais permitidos pelos modelos conformacionais da Angiotensina apresentados antes. A consideração destes modelos conformacionais permite as três configurações gerais, como se seguem: 94 R2 OU R3

configuração III em que α, β e Ϋ representam um átomo de carbono ou de azoto, com a condição de apenas um átomo de azoto comportar substituintes; R^ representa um grupo de fórmula geral -CH (R^ (R^g) na qual e R^g têm os significados definidos antes, R^ representa um grupo de fórmula geral -CH (R^) (R^g) na qual R^ e R^g têm os significados definidos antes, R£, Rg e Rg têm os significados definidos antes com a condição de (a) R1A comportar um grupo contendo um radical amida, ou 95

(b) localizar-se em um átomo de azoto, ou (c) localizar-se em um átomo de carbono, quando R^g representa um átomo de hidrogénio.

Observa-se que as configurações I e II referem-se a compostos indólicos, mas não a compostos benzotriazólicos ou benzopira-zólicos. A configuração I refere-se a compostos benzimidazó-licos com a condição de nenhum grupo representado pelo símbolo R2 se encontrar presente em e a configuração II refere-se a compostos benzimidazólicos com a condição de nenhum grupo representado pelos símbolos R2 ou R^ se encontrar presente em Νε. A configuração III diz respeito a compostos indólicos, benzimidazólicos, benzopirazólicos ou benzotriazólicos; a substituição de R2 ou de Rg em sé eventual de acordo com as condições descritas antes desde que se substitua apenas um átomo de azoto. 0 símbolo R^ tem o significado definido antes para o símbolo R^.

De acordo com a Figura 4 do pedido de patente de invenção original e considerações relacionadas com a mesma, um exemplo da síntese de novos antagonistas baseia-se na incorporação de cargas adicionais em sítios apropriados de compostos BI e BABI de modo a aumentar a afinidade destes antagonistas relativamente ao receptor da Angiotensina II e consequentemente a potência dos mesmos. Tais considerações aplicam-se não só a 96 compostos N-benzil- e N-benzamidobenzi1-imidazólicos mas também a compostos C-benzil- e C-benzamidobenzi1-imidazólicos, como descrito no pedido de patente de invenção original e como descrito antes, ainda mais detalhadamente, relativamente às 5 configurações do núcleo imidazóiico:

e S

na qual representa um grupo benzi lo ou benzamidobenzilo eventualmente substituído e a representa um átomo de azoto ou de carbono. De acordo com uma outra consideração inerente à Figura 5 do pedido de patente de invenção original, a síntese de novos antagonistas invoca também a inclusão de um substi-tuinte melhorado para substituir o grupo n-alquílico designado pelo símbolo R^, particularmente um imitador mais perfeito da sequência -CH^-CH-CO-Pro- na Angiotensina; estes imitadores

z I melhorados foram descritos antes sendo os seguintes particularmente relevantes:

-CH2-CH2-CO-NMe2; -CH2-CH2-CO-Pro-NH2 97

Em uma outra consideração baseada na Figura 7 e especialmente no debate apresentado nas páginas 43-46 do pedido de patente de invenção original, a orientação do núcleo heterocíclico representa um aspecto importante da concepção dos antagonistas da Angiotensina. Como descrito antes, à síntese de antagonistas da Angiotensina aplicam-se cinco orientações ou configurações possíveis, determinadas pelo posicionamento dos átomos de azoto no núcleo relativamente aos substituintes representados pelo símbolo R do núcleo imidazólico. Além do mais, como se descreveu antes, nestes antagonistas também podem estar presentes sistemas de núcleos isofuncionais com núcleos imidazólicos, incluindo outros compostos azólicos e incluindo núcleos hexagonais tais como a piridina, diazinas ou outros similares bem como sistemas polinucleares com, pelo menos, um núcleo heterocíclico penta- ou hexagonal, como se descreveu antes.

Em um aspecto preferido do presente pedido de invenção, o núcleo heterocíclico é um núcleo imidazólico em uma qualquer das cinco configurações possíveis descritas antes. Um aspecto £ particularmente preferido é a configuração N ' que dá origem aos compostos C-benzílicos e que imita exactamente o grupo imidazólico do resto histidina da Angiotensina II (observar Figura 5). Constitui também um aspecto preferido o facto do substituinte designado pelo símbolo nao representar um hi-drocarboneto de cadeia linear mas comportar uma função amida que imita o grupo His-Pro na Angiotensina II. 98

Em um outro aspecto preferido, incorpora-se em ou ou R^g ou R,d, como se descreveu antes, um grupo espaçador que ter-mina em um grupo com carga e que imita o N- ou o C-terminal da Angiotensina II. 0 critério para estes aspectos preferidos baseia-se em um modelo molecular da Angiotensina II como descrito nas Figuras 4, 5 e 7 e no debate relevante relacionado com o mesmo modelo, incluídos nas páginas 43-46 do pedido de patente de invenção original.

Utilizando técnicas convencionais, os entendidos na matéria podem preparar facilmente os compostos descritos antes. Estes compostos e os seus sais aceitáveis sob o ponto de vista farmacêutico são úteis como antagonistas da Angiotensina II. Consequentemente, estes compostos podem utilizar-se para controlar a hipertensão e/ou a insuficiência cardíaca congestiva em um mamífero doente. Adicionalmente, os compostos de acordo com a presente invenção destinam-se a utilizar em doenças y cardiovasculares e relacionadas como, por exemplo, trombose, enfarte do miocárdio ou outras similares. Quando utilizados para controlar a hipertensão e/ou a insuficiência cardíaca congestiva, estes compostos administram-se aos mamíferos quer por via oral quer por via parentérica, misturados com um diluente aceitável em farmácia e em uma quantidade suficiente para controlar, no mamífero doente, a hipertensão e/ou a insuficiência cardíaca congestiva. Os entendidos na matéria podem determinar facilmente as concentrações específicas utilizadas em tais situações. Consequentemente, a presente 99 mamíferos invenção inclui um método para controlar, em doentes, a hipertensão, que consiste em administrar por via oral ou parentérica uma composição farmacêutica contendo um dos compostos citados antes em uma quantidade suficiente para controlar a hipertensão. Adicionalmente, a presente invenção inclui também um método para tratar a insuficiência cardíaca congestiva em um mamífero doente, que consiste em administrar, por via oral ou parentérica, uma composição farmacêutica contendo um dos compostos citados antes em uma quantidade suficiente para controlar a citada insuficiência cardíaca. Os métodos para controlar a hipertensão são implementados utilizando composições farmacêuticas que incluem um veículo aceitável sob o ponto de vista farmacêutico e uma quantidade de um dos compostos descritos antes, eficaz para controlar a hipertensão em um mamífero doente. Os métodos para controlar um coração congestivo são implementados utilizando composições farmacêuticas que incluem um veículo aceitável em farmácia e uma quantidade de um dos compostos descritos antes, eficaz no controlo da citada insuficiência cardíaca.

Apresentam-se seguidamente métodos para preparar os compostos descritos antes. A síntese dos compostos heterocíclicos segue métodos que os entendidos na matéria bem conhecem como, por exemplo, os métodos descritos em Comprehensive Heterocyclic Chemistry, Fergamon Press, New York, em que os volumes 4 e 5 (1984) são particularmente relevantes para a presente invenção. Nas patentes de invenção europeias 0263310 e 0323844 100 fez-se também a revisão detalhada de métodos de síntese da presente invenção. Tendo em vista os conhecimentos respeitantes às vias de síntese utilizadas, apresentam-se seguidamente esquemas de síntese gerais para a preparação de compostos de acordo com a presente invenção. Na generalidade, estes esquemas utilizam associações de transformações químicas e de estratégias e de grupos protectores que os entendidos na matéria bem conhecem.

Caso não sejam fornecidas outras informações, todas as reac-çÕes foram conduzidas a temperaturas compreendidas entre 20°C e a temperatura de refluxo do dissolvente durante 2 horas a dois dias no seio de um dissolvente inerte apropriado como, por exemplo, a dimetilformamida, o dimetilsulfóxido, o clorofórmio, o cloreto de metileno, o benzeno, o tolueno, o dioxa-no, o tetra-hidrofurano ou o éter. Síntese de compostos imidazólicos substituídos

As referências seguintes dizem respeito à síntese de compostos imidazólicos substituídos. Advances in Heterocyclic Chemistry, volumes 4, 12, 27, 35 (Cambridge University Press) e Heterocyclic Nitrogen Compounds: The Azolesz, K. Schofield et al. (1976) Cambridge University Press. Um esquema geral para a síntese de compostos imidazólicos substituídos envolve a condensação de uma amidina ou de um composto relacionado com uma a-halogeno/hidroxi-cetona: 101

R ^nh2 -c:l + R' ' I o-X 1 0 II —C-R1 ' i na qual X = Cl, Bre OH © ^ THF Et3N -©

Os isómeros separam-se por métodos convencionais como, por exemplo, cristalização ou cromatografia. A amidina de fórmula geral 1 prepara-se a partir do nitri lo, directamente ou por via do iminoéter: NH3sob pressão

NH NH2

R'-C N

R1

A halogeno/hidroxi-cetona de fórmula geral 2 prepara-se mediante diversos métodos convencionais como, por exemplo: R'

102 Ί j Ί j 0 1 rh,-c-chn2 diciclo-hexiÍcarbodi imida (λ) R CO2H diazometano/éter 0 2 equiv. -4 N-clorosuccinimida-dioxano 1 , RH I-C-CHC12 i (RH)2CuLi Cl 0

I I R"-CH-C-R"'

(B) R',-CH2CHO 1,3 propano-diti-ol r ' ' ch2

1) BaLi/THF 2) R'"I 1) Buli/THF 2) R"'CH0 3) Hg2+ R''-CH2 R" '

H"1 0 1 rk-ch2-c-rm' H+ i 1 equiv. N-,clorosuccinimida Cl 0

I X RM-CH-C-RM‘

. HO O I 8 RM'-CH“C-CH2

Alternativamente, um iminoéter pode condensar-se com uma α-hidroxi/halogeno-cetona na presença de uma solução de amo- maco: // c \

KH OH 0 + R''— (R* ") c-C-R' (R") nh3 -> R'- /\.

O ^R' " [κΊ [*“3 nR" 103 η

Os isómeros separam-se por cristalização ou cromatografia.

Em um outro método aplicável, especialmente, a compostos N-benzílicos substituídos, faz-se reagir um iminoéter com uma benzi lamina substituída para se obter a amidina que se condensa depois còm uma/um α-halogeno- ou a-hidroxi-cetona/al-deído.

f2

CH2

Em um outro método aplicável à síntese de compostos N-benzílicos substituídos, faz-se reagir uma acilaminocetona com um derivado de benzi lamina para se obter uma imina que se converte depois em um N-benzilimidazol: 104 f Γ R'—C—NH—CH—C—R'1 * + 0 NH, i Ç«2

O benzeno- base de Schiff catalisador ' (TosOH)

PCle/C^N DCE NH^/catalisador y/

ÇH2

Compostos imidazólicos podem obter-se também utilizando uma solução de amoníaco em vez de uma amina como descrito por Davidson et al. em J. Org. Chem., 2, 319, 1937 e Heinze et al. em Chem. Ber. 101, 3504, 1968. A partir de aminoácidos obtem-se facilmente uma acilaminoce-tona, utilizando a reacção de Dakin-West e modificações à mesma reacção bem como a partir da α-halogenocetona correspondente mediante métodos convencionais. 105

Preparação de acilaminocetonas R' 1

Aminoacil-cetonas de fórmula geral R'-CO-NH-CH-CO-R111 podem preparar-se a partir de um aminoácido N-acílico mediante reacção com um alquil-lítio ou um alquil-cobre-lítio:

LiOH

R"I R'OONH—CH—OO2H

HCl/MeOH PC15 • R''‘ I ROONHCHOOOLi R"I -> R'C0NHCHC0CMe R"I > ROONHCHODCl R,MLi H20 R'' R'"U I -^ ROONHCHOOR''' Tolueno/ à temp. de refluxo -> R' ·'CuLi

Por exemplo, a N-acil-DL-4-nitrofenilalanina pode converter-se em um seu derivado de butil-cetona utilizando, por exemplo, butil-lítio.

Um outro método geral para preparar acilaminocetonas é a J reacção de Dakin-West em que se converte o aminoácido acílico na acilaminocetona pretendida mediante reacção com um anidrido na presença de uma base (consultar Hofle et al., Angew. Chem. Int. Ed. Vol. 17, pag. 569, 1978): R" (R'"C0)20 R« R' -CO-NH-CH-CO-OH _ R' -CO-NH-CH-CO-R» «

Piridma

Esta reacção que prossegue por intermédio da oxazalinona, fornece uma alternativa para a preparação de acilaminocetonas quando o aminoácido não é facilmente obtenível. Por exemplo, a 106 7' acil-glicina pode converter-se em outros aminoácidos acílicos mediante alquilação da oxazalinona intermédia de acordo com a técnica seguinte: 7' (R'00)20 + NH2CH2tXCH -) /\ R'-CH CH\ /0—c qxazalona(oxazalinona) [R* = trifluorometil, fenil, alquil, etc.) 1 equiv. R''X (X « BT, I)

(R* "00) 20 piridina (DMAP)

RM

I R'—00—NH—Oí—CO—R'' *

Nos compostos N-benzílicos, a alquilação do átomo de azoto do núcleo imidazólico pode realizar-se do seguinte modo:

Os dois produtos podem separar-se por métodos clássicos tais como a cristalização e a cromatografia. 107

Nos compostos C-benzí1icos, o átomo de azoto do núcleo imida-zólico pode proteger-se com um grupo protector apropriado tal como um grupo tosilo, benziloximetilo, tritilo ou benzilo que se elimina depois mediante um método aceitável sob o ponto de vista estratégico tal como uma acidólise ou uma hidrogenação. Quando o grupo protector se separa no final da síntese não é necessário separar os dois produtos formados:

Tal como se indicou antes, a preparação de compostos como os descritos considera-se ao alcance dos entendidos na matéria. Um entendido na matéria sabe, por exemplo, que muitas vezes não é possível introduzir um grupo lateral, durante a síntese, sob a forma pretendida no produto final. Assim, por exemplo, muitas vezes não é possível introduzir um grupo amino no decurso do esquema de síntese porque a reactividade desse grupo relativamente a grupos electrófilos é elevada, podendo assim esse grupo modificar-se de um modo irreversível durante a síntese até à obtenção do produto final. Assim, um grupo amino é introduzido sob a forma de um grupo nitro ou de um grupo acilamino ou ainda sob uma outra forma de modo a solucionar este problema. No final da síntese ou próximo do mesmo, altura em que a conversão de um grupo amino não comprometerá a 108

integridade do produto final, produz-se o grupo amino utilizando técnicas clássicas de química. De um modo similar, quando se pretende que o produto final contenha uma função carboxilato, esta é introduzida sob a forma de um nitri lo, álcool, éter, éster, alceno ou um outro qualquer precursor que os entendidos na matéria admitam.

Conversões deste tipo geral, são realizadas mediante reacções clássicas descritas seguidamente, dando origem aos grupos laterais indicados. Para mais detalhes, consultar J. March em Advanced Organic Chemistry, 1985, J. Wiley & Sons, New York e as referências aí contidas.

piridina dicromato ~¥ TosCl OU NOS DMSO rch2oh

M -0^2°^ S0C12 A. ou ---> -0121 -oi2oh piridina

NaCN CMSO, 20-100* -) -ch-.cn HCl/AcCH 50-160* 2-48 h

-> -CH2OO2H HBr NaCN B. -CH2CH -(-CH2~) -CH2 Br - CMSO, 20-100

> -CH2CN HCl

AcCH

“CH2OO2H C.

irVEtoH refluxo

H em NaOH/EtOH/à temp. de refluxo 109 1

Carboxilato KMn04 RCHO -► RCO-,Η

transferência de fase A

Cr03/Hs0; 1'A. 2. Amino «>>

H2/RÍ

ou Fe/AcCH OU Zn/AcCH nh2-

0-5* HCl -> N2-Ar Sândmeyer50° CuOÍ -> Qf—Ar HCl

KCN

AcCH

CO2H-AR

CuX2 15-6Ó* Sandmeyer x - Ar em que X = halogeneto Ar = arilo

J 3. Tetrazol B. -NHfOO-O-^Bijtyl)Boc(grupo protector)

TFA -NH- 1.

SrR3N3

N—N í —N H 4. Eter -ch2ch -ch2ch

HCl/WeOHà temp. de ^ refluxo·1. NaOEt ou NaH -> 2, RX -^20°¾ -ch2qr

HaOR -CH 7C1 —--> CMF -ch2or 110

5. Éster

HCl/MeCH à temp. de ~> refluxo- ac2o

~CH2CH ---> -QÍ20AC

Et3N ou piridína 6. Amida Diciclo-hexilcarbodiimida

7. Halogenação R' ' R’

N-halogenosuccinimida —----? í“2 eqiiiv., dioxona

I I R,—< O ' N-

Desalogenação halogeneto

HyPd 111 8. Sulfonação/Fosfonação

F3B.SCH3

^2°2

H

F3B.SCH3 <0>^ S03-Í amma ¢(0)^4¾ J,h2o

4,pci5

9. Trifluorometil-sulfonamido e trifluorometilacetamido

(F3CS02)20 2 --> Et3N (F3C-CD)20

CF-,

Et3N * —(Oy—nhoocf-. 10. Grupos protectores de -conh2,·

NH -NH, -NH2, -OH, -C02H, -nh-ch nh2

Os entendidos na matéria conhecem bem grupos protectores voláteis de ácidos e de bases e grupos protectores removíveis por hidrogenação. Os entendidos na matéria conhecem bem métodos para introduzir estes grupos protectores bem como para remover os mesmos tal como afirmam J. Stewart e J. Young em Solid Phase Peptide Synthesis, 1984, Pierce Chem. Co.. 112 11. Nitro e trifluorometilo

12. - (CH2) n-Asp~Arg-NH2 X Y DCC X γ

Boc Asp H- Arg-NH2 -*· Boc-Asp-Arg~NH2

x Y Et3N X Y 4 TFA

Cl - (CH2) n-Asp - Arg-NH2 +- Asp -Ar g-NH2

Cl-(I?H2)n-ci

Em que X representa um grupo benzi lo ou t-butilo e Y representa um grupo tosilo ou nitro.

Na reacção descrita antes o peptido deve adicionar-se a um excesso abundante do agente da ligação cruzada, para evitar a dimerização.

Compostos não imidazólicos

Tal como se indicou antes, é possível utilizar compostos não imidazólicos como novos antagonistas. Estes compostos preparam-se por técnicas análogas às descritas antes que fornecem substituintes ao núcleo, os quais se podem converter em outros núcleos. Na patente de invenção europeia 0323841 faz-se uma revisão exaustiva de métodos e estratégias para estas sínteses destinadas a compostos similares aos da presente invenção. Consequentemente, o que afirmamos seguidamente é um resumo das estratégias mais importantes que permitem a obtenção dos 113 *7 1/ compostos pretendidos não tendo por isso a intenção de cobrir todo o assunto. Tal como com os compostos imidazólicos substituídos, a elaboração de núcleos heterocíclicos com funções derivadas no núcleo, produz muitas vezes uma mistura de produtos que se podem separar por métodos cromatográficos convencionais, podendo os isómeros identificar-se, individualmente, por espectroscopia de NOE e em alguns casos por doseamento biológico ou por determinação da ligação, isto é, da capacidade para deslocar a Angiotensina II do seu sítio no seu re-ceptor.

Compostos pirrólicos substituídos 1. Reacção de Paal-Knorr: condensação de compostos 1,4-dicar-bonílicos com uma solução de amoníaco ou uma amina primária, de acordo com a reacção:

2. Síntese de Hantzsch: condensação de α-halogenocetonas (ou α-hidroxialdeídos ou nitroalcenos) com β-cetoésteres na presença de uma solução de amoníaco: 114

Η OO-OEt

t 11 X

Compostos pirazólicos substituídos ou

Condensação de compostos 1,3-dicarboní1icos com hidrazina derivados deste composto:

n2h4 R' · 'X

Compostos 1.2.3-triazólicos substituídos

Adição cíclica térmica de azidas a alcinos: 115 Ί'

Compostos 1.2.4-triaz6licos substituídos

Reacção de um ortoéster e de uma aci1-hidrazina para se obter um 1,2,4-oxadiazol seguindo-se uma reacção com uma solução de amoníaco ou uma amina primária:

R'c(cr)3 + R' 'ο>νη·νη2 mistura de R* "x substituição f- em 1 e 2 4-substituído

Compostos tetrazólicos substituídos Métodos gerais elaborados previamente podem aplicar-se na protecção respeitante ao núcleo tetrazólico: 116

R'—CN

NaN3 -> R'nh4ci,a \ Ar3SnN3 / (tri-ari1-estanho-azida) ^ s A protecção do núcleo ^ tetrazol pode conseguir-se H utilizando, eventualmente, • um grupo tritilo ou de outro modo em conformidade R' 'x base

-N-N R' ' il

-N-N R*1

Utilizando métodos análogos obtiveram-se piridinas, diazinas e triazinas substituídas.

Compostos heterocíclicos polinucleares

Compostos__indólicos.__benzimidazólicos. benzopirazólicos___e l?enzotriazólicos substituídos Síntese de compostos indólicos de Fischer: aril-hidrazonas de aldeídos ou cetonas quando tratadas com um catalisador tal

Benzimidazól6lNH2 \^nh2

R1COX base

R·

R» 'X ψ base

BenzopIrazoT ·νηνη2 R' R' 'COXácido de Lewis

R' R' · R' ' 'X RI 1 . I —N\ ^f=^N I R' 1; R· '

BenzotriaTT.i -nh2 nh2 HONO --·)»

R1 'Xbase η,

118

Utilizando métodos análogos prepararam-se benzopiridinas, benzodiazinas e benzotriazinas substituídas. Síntese dos compostos A escolha de compostos iniciais e a estratégia da síntese de um dado composto são impostas por diversos factores incluindo a praticabilidade e custos. A escolha de métodos, de grupos protectores e de grupos precursores para uma dada síntese é determinada, em grande parte, por outras estruturas intervenientes e factores químicos que os entendidos na matéria facilmente determinarão. 119

120 7

121

V* ΒΑΒΙ

FIG..3B 122

*aaUWUMMlMUMÍMaaMLMatt*4hllíJMM)M >

123

124

Ν FIG.-5A 7 χ

FIG—5B 125 7-

126

127 1

128 $

HO Cl

FIG—7C 129

Claims

REIVINDICAÇÕES 1. Método para criar modelos espaciais tridimensionais de ligandos biologicamente activos com um ou mais sítio (s) acti-vo (s) com base em uma interacção devida a transferência de cargas e tendo ainda uma fórmula estrutural conhecida na qual as atribuições espaciais tridimensionais de cada um dos átomos do ligando no modelo são determinadas pelas fases seguintes: a) determinação da presença de interacção(ões) devida(s) a transferência de carga (s) no ligando citado por análise de fluorescência desse ligando em um meio compatível com a fluorescência; b) determinação dos grupos químicos envolvidos na (s) citada (s) interacção(Ões) devida (s) a transferência de cargas; e c) resolução dos restantes aspectos da conformação tridimensional dos ligandos mediante obtenção de informação conforma-cional relativa ao (s) sítio (s) activo(s), proveniente do espectro de ressonância magnética nuclear utilizando o efeito de Overhauser nuclear [NOE (Nuclear Overhauser Effect), com a condição do peso molecular desse ligando ser quer inferior a, aproximadamente, 500 quer superior a aproximadamente 2000 quando a técnica do efeito de Overhauser nuclear utilizada nesta fase é a técnica NOESY. 130 %
2. Método de acordo com a reivindicação 1F caracterizado pelo facto de se aperfeiçoar ainda o modelo realizado utilizando considerações teóricas.
3. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de se realizarem ainda novos modelos tridimensionais do citado ligando utilizando considerações teóricas.
4. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de se escolher o ligando biologicamente activo entre Angiotensina II, ocitocina e vasopressina.
5. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto da interacção devida a transferência de cargas ser uma interacção devida a transferência de cargas em uma forma tirosinato.
6. Método de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo facto do ligando citado possuir um sítio activo baseado em uma interacção devida a transferência de cargas em uma forma tirosinato.
7. Método de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo facto do citado ligando ser a Angiotensina II. 131
8. Método de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo facto de se utilizar como técnica do efeito de Overhauser nuclear a técnica ROESY.
9. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de se escolher o meio compatível com a fluorescência entre micelas, sistemas bifásicos de lípidos e dissolventes com uma constante dieléctrica próxima de 40 ou inferior.
10. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de se utilizar como técnica do efeito de Overhauser nuclear a técnica NOESY.
11. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de se realizar a citada espectroscopia de ressonância magnética nuclear utilizando o efeito de Overhauser nuclear, em um meio simulador do meio que rodeia o receptor.
12. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto do citado ligando ser complementar de um receptor biologicamente activo ligado a uma membrana.
13. Método de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo facto de se realizar a citada espectroscopia de ressonância magnética nuclear utilizando o efeito de Overhauser nuclear, em um dissolvente com uma constante dieléctrica próxima de 50 ou inferior. 132
14. Método de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo facto de se utilizar como dissolvente o dimetilsulfóxido.
15. Método para modelar, isto é, para reproduzir exactamente antagonistas de um receptor biologicamente activo com base em um modelo produzido para um ligando biologicamente activo complementar desse receptor em que o citado ligando comporta um ou mais sítio (s) activo (s) com base em uma interacção devida a transferência de cargas e apresenta ainda uma forma estrutural conhecida, caracterizado pelas fases seguintes: a) realização de um modelo espacial tridimensional para esse ligando mediante i) determinação da presença de interacção (ões) devida(s) a transferência de cargas no citado ligando por análise de fluorescência do mesmo ligando em um meio compatível com a fluorescência; ii) determinação dos grupos químicos envolvidos na(s) interacção (ões) devida(s) a transferência de cargas citada (s) antes; e iii) resolução dos aspectos restantes da conformação tridimensional dos ligandos mediante obtenção de informação con-formacional relativa aos sítios activos por espectroscopia de ressonância magnética nuclear utilizando o efeito de Overhauser nuclear com a condição do peso molecular do referido ligando ser quer inferior a, aproximadamente, 500 quer 133 superior a, aproximadamente, 2000 quando a técnica do efeito Overhauser nuclear utilizada nesta fase é a técnica NOESY. b) identificação de um composto com uma estrutura tridimensional suficientemente similar à desse ligando de tal modo que é complementar do mesmo ligando e em que pelo menos uma das interacções devidas a transferência de cargas no citado composto ficou comprometida.
16. Método de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo facto de se utilizar como ligando biologicamente activo um ligando natural biologicamente activo complementar do citado receptor.
17. Método de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo facto de se utilizar um ligando biologicamente activo com apenas uma interacção devida a transferência de cargas.
18. Método de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo facto de se escolher o citado ligando natural biologicamente activo entre Angiotensina II, ocitocina e vasopressina.
19. Método de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo facto de se utilizar como técnica do efeito de Overhauser nuclear a técnica ROESY. 134
20. Método de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo facto do citado receptor biologicamente activo ser um receptor ligado a uma membrana.
21. Método para a modelação, isto é, para a reprodução exacta de agonistas de um receptor biologicamente activo com base em um modelo realizado para um ligando biologicamente activo complementar do citado receptor, comportando esse ligando um ou mais sítio (s) activo ís) com base em uma interacção devida a transferência de cargas e apresentando ainda uma fórmula estrutural conhecida, que consiste nas fases: a) realização de um modelo espacial tridimensional do citado ligando mediante i) determinação da presença de interacção (ões) devida(s) a transferência de cargas nesse ligando por análise de fluorescência do mesmo ligando em um meio compatível com a fluorescência; e ii) determinação dos grupos químicos envolvidos nessa (s) interacção(ões) devida(s) a transferência de cargas; e iii) resolução dos aspectos restantes da conformação tridimensional do ligando mediante obtenção de informação confor-macional relativa ao (s) sítio (s) activo (s) por espectroscopia de ressonância magnética nuclear utilizando o efeito de Ove-rhauser nuclear com a condição do peso molecular do citado ligando ser quer inferior a aproximadamente 500 quer superior 135 a aproximadamente 2000 quando a técnica do efeito Overhauser nuclear utilizada nesta fase é a técnica NOESY; e b) identificação de um composto com uma estrutura tridimensional suficientemente similar à do citado ligando de tal modo que é complementar do citado receptor e em que a(s) interac-ção (ões) devida(s) a transferência de cargas nesse composto não foi (foram) comprometida(s).
22. Método de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo facto do citado ligando biologicamente activo ser um ligando natural biologicamente activo complementar do citado receptor.
23. Método de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo facto do citado ligando natural biologicamente activo possuir apenas uma interacção de transferência de cargas.
24. Método de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pelo facto de se escolher o citado ligando natural biologicamente activo entre Angiotensina II, ocitocina e vasopres-sina.
25. Método de acordo com a reivindicação 24, caracterizado pelo facto de se utilizar como técnica do efeito de Overhauser nuclear a técnica ROESY. 136
26. Método de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo facto do citado receptor biologicamente activo ser um receptor ligado a uma membrana.
27. Modelo tridimensional da Angiotensina II apresentado na Figura 6, caracterizado pelo facto de resultar da utilização dos métodos de acordo com a presente invenção.
28. Método para modelar, isto é, para reproduzir exactamente antagonistas da Angiotensina II, caracterizado pelo facto de se criarem compostos com estrutura tridimensional suficientemente similar à atribuída à Angiotensina II definida na reivindicação 27 de modo a apresentarem-se complementares do receptor biologicamente activo da Angiotensina II, e em que a interacção de transferência de cargas ficou comprometida.
29. Método para modelar, isto é, para reproduzir exactamente, agonistas da Angiotensina II, caracterizado pelo facto de se criarem compostos com estrutura tridimensional suficientemente similar à atribuída à Angiotensina II definida na reivindicação 27 de modo a apresentarem-se complementares do receptor biologicamente activo da Angiotensina II, e em que a interacção de transferência de cargas não ficou comprometida.
30. Modelo tridimensional da Angiotensina II ligada ao receptor apresentado na Figura 7B, caracterizado pelo facto de 137 7- resultar da utilização dos métodos de acordo com a presente invenção.
31. Método para determinar a presença de interacção(ões) de transferência de cargas na estrutura terciária de um ligando biologicamente activo complementar de um receptor biologicamente activo, caracterizado pelo facto de se submeter o citado ligando a análise de fluorescência em um meio compatível com a mesma.
32. Método de acordo com a reivindicação 31, caracterizado pelo facto de se utilizar como meio compatível com a fluorescência micelas, sistemas bifásicos de lípidos e dissolventes com uma constante dieléctrica inferior a, aproximadamente, 40.
33. Método de acordo com a reivindicação 31, caracterizado pelo facto do citado ligando biologicamente activo possuir y apenas uma interacção de transferência de cargas.
34. Método de acordo com a reivindicação 33, caracterizado pelo facto do citado ligando biologicamente activo ser um ligando natural biologicamente activo.
35. Método de acordo com a reivindicção 34, caracterizado pelo facto de se escolher o citado ligando natural biologicamente activo entre Angiotensina II, ocitocina e vasopressina. 138
36. Método de acordo com a reivindicação 31, caracterizado pelo facto do citado receptor biologicamente activo ser um receptor ligado a uma membrana.
37. Método para a preparação de compostos imitadores da carga catiónica do N-terminal/aniónica do C-terminal da Angiotensina II, caracterizado pelo facto de se adicionar, como cadeias laterais, a compostos N-benzilimidazólicos/N-benzamidobenzili-midazólicos (BI/BABI), compostos de fórmula geral

(CH2)2 ch3 na qual R representa um grupo fenilo comportando em posição para um substituinte escolhido entre um grupo carboxilo ou um seu sal aceitável sob o ponto de vista farmacêutico, sulfato ou trifluorometilsulfonamido ou um grupo de fórmula geral -NHC (0) Rj. na qual R,. representa um grupo fenilo comportando em posição orto um substituinte escolhido entre um grupo carboxilo ou um seu sal aceitável sob o ponto de vista farmacêutico, sulfato ou trifluorometilsulfonamido; e R^, Rg* Rg e/ou R^ fornecem uma ou mais das seguintes cargas: i) uma carga catiónica à esquerda do centro do núcleo imidazólico a uma distância aproximada de 7±1,5 Angstrom; 139 ii) uma carga aniónica à direita do centro do núcleo imidazólico a uma distância aproximada de 2,5+0,5 Angstrom; iii) uma carga aniónica à esquerda do centro do núcleo imidazólico a uma distância aproximada de 10±2 Angstrom; e iv) uma carga catiónica à esquerda do centro do núcleo imidazólico a uma distância aproximada de 12+2,5 Angstrom; com a condição de R^ e de Rg representarem, cada um, um átomo de hidrogénio, Rg representar um grupo hidroximetilo, -CELj-O-CHg, -CH^C (0)OCHg ou -C (0)OCHg e R^ representar um átomo de flúor ou de cloro quando um qualquer dos símbolos R^, Rg, Rg e R^ não fornecer uma das cargas iónicas citadas antes; e ainda do citado composto não comportar mais do que uma carga de cada uma das alíneas i), ii), iii) ou iv); e também ainda da co-'S1 locação de tais cargas à esquerda e/ou à direita do núcleo imidazólico se processar como definido nas fórmulas gerais

e 140 ANG II His BI/BABI

descritas no presente pedido de invenção.
38. Processo para a preparação de composições farmacêuticas apropriadas para controlar a hipertensão ou a insuficiência cardíaca congestiva em um mamífero, caracterizado pelo facto de se misturar uma quantidade eficaz sob o ponto de vista terapêutico de um composto de fórmula geral III definida na reivindicação 37, com um veículo aceitável em farmácia.
39. Método para controlar a hipertensão ou a insuficiência cardíaca congestiva em um mamífero, caracterizado pelo facto de se administrar ao mamífero doente uma quantidade eficaz sob o ponto de vista terapêutico de uma composição farmacêutica preparada pelo processo de acordo com a reivindicação 38.
40. Método para a preparação de compostos imitadores da carga catiónica do N-terminal/aniónica do C-terminal da Angiotensina II, caracterizado pelo facto de se adicionar, como cadeias laterais, a compostos N-benzilimidazólicos/N-benzamidobenzili- 141

midazólicos (BI/BABI), compostos de fórmula geral / Oi C- r4 R- HC

Rx CH-R2 (CH2)2 ch3 ÍIII) na qual R representa a) um grupo fenilo comportando em posição para um substituinte escolhido entre um grupo carboxilo ou um seu sal aceitável sob o ponto de vista farmacêutico, sulfato ou trifluorometilsulfonamido ou b) um grupo de fórmula geral -NHC (0)Rg na qual R^ representa um grupo fenilo comportando em posição orto um substituinte escolhido entre um grupo carboxilo ou um seu sal aceitável sob o ponto de vista farmacêutico, sulfato ou trifluorometilsulfonamido; os grupos representados ou pelo símbolo R1 ou pelo símbolo Rg, mas não os dois simultaneamente, fornecem uma carga catiónica à esquerda do centro do núcleo imidazólico a uma distância aproximada de 7±1,5 Angstrom com a condição de representar um átomo de hidrogénio quando fornece uma tal carga e ainda de representar um grupo hidroximetilo, -CE^OCHg, -CH^COgCHg ou -COgCHg quando R^ fornece uma tal carga; e ainda os grupos representados ou pelo símbolo R9 ou pelo símbolo Rá, mas não os dois simultâneamente, fornecem uma carga aniónica è direita do centro do núcleo imidazólico a uma distância aproximada de 2,5±0,5 Angstrom com a condição de representar ou um átomo de flúor ou um átomo de cloro quando Rg fornece uma tal carga, 142 de R2 representar um átomo de hidrogénio, quando fornece uma tal carga e também ainda do posicionamento das cargas à esquerda e/ou à direita do núcleo imidazólico se processar como definido nas fórmulas gerais I e II apresentadas na reivindicação 37.
41. Método de acordo com a reivindicação 40, caracterizado pelo facto de se utilizar um composto de fórmula geral III na qual R^ representa um átomo de hidrogénio e Rg representa um grupo -(CH2)4-NH2, -CHOH- (CHg) 3~NH2 ou - (0¾} ^-Asp-Arg-NHg.
42. Método de acordo com a reivindicação 40, caracterizado pelo facto de se utilizar um composto de fórmula geral III na qual Rg representa um grupo hidroximetilo, -C^OCHg, -CHgCO^jCHg ou -COgCHg e R1 representa um grupo - (CHg) g-NH2 ou -(CH2)g-Asp-Arg-MHg.
43. Método de acordo com a reivindicação 40, caracterizado pelo facto de se utilizar um composto de fórmula geral III na qual R2 representa um átomo de hidrogénio e-R4 representa um grupo - (CH2)3-C(0)0H.
44. Método de acordo com a reivindicação 40, caracterizado pelo facto de se utilizar um composto de fórmula geral III na qual R4 representa ou um átomo de hidrogénio ou um átomo de cloro e R2 representa um grupo -(CH2)9-C(0)OH. 143
45. Processo para a preparação de composições farmacêuticas apropriadas para controlar a hipertensão ou a insuficiência cardíaca congestiva em um mamífero, caracterizado pelo facto de se misturar uma quantidade eficaz sob o ponto de vista terapêutico de um composto de fórmula geral III definida na reivindicação 40,com um veículo aceitável em farmácia.
46. Método para controlar a hipertensão ou a insuficiência cardíaca congestiva em um mamífero, caracterizado pelo facto de se administrar ao mamífero doente uma quantidade eficaz sob o ponto de vista terapêutico de uma composição farmacêutica preparada pelo processo de acordo com a reivindicação 45.
47. Método para modelar, isto é, para reproduzir exactamente, antagonistas pentagonais do receptor da Angiotensina II, caracterizado pelo facto de se criarem compostos de fórmula geral

na qual

<5 e e representam átomos de carbono, azoto, oxigénio ou enxofre com a condição de (a) o núcleo conter, pelo menos, um átomo de carbono e um átomo de azoto, e (b) a ligação dos grupos representados pelo símbolo R fazer-se no átomo de carbono ou de azoto; que imita na angiotensina a estrutura

CH - CO - N - CH - CO inclui um grupo -alq; -O-alq; -alq-O-alq;-CH2“CO-NH2;

-CH2“CQ-AA-NH2 ou CH2~C0-AA-fenilo em que alq representa um grupo alquilo com 1 a 10 átomos de carbono, cicloalquilo com 3 a 6 átomos de carbono, alcenilo com 2 a 10 átomos de carbono ou alcinilo com 2a 10 átomos de carbono; e AA representa um aminoácido; que eventualmente fornece um grupo espaçador que termina em um imitador do grupo carboxilato C-terminal da Angiotensina II representa um átomo de hidrogénio ou um grupo de fórmula geral -alq-A;

-<grA i ou -akng^ em que alq tem o significado definido antes e A representa um grupo ácido ou um seu sal aceitável sob o ponto de vista farmacêutico; R2 que fornece propriedades estereoquímicas e/ou electró-nicas e/ou um grupo espaçador que termina em um grupo ácido, representa um átomo de hidrogénio ou de halogéneo, isto é, um átomo de flúor, cloro, bromo ou iodo, um grupo -alq; -O-alq; -NQ2; -CF3; -CN; -alq-A; -A;

ou -alq· A Rg que fornece propriedades estereoquímicas e/ou electró-nicas e/ou um grupo mimético do radical hidroxi da tirosina da Anglotensina II na sua conformação de "interruptor de carga" ("charge i-elay") ou um grupo espaçador que termina em um imitador do N-terminal do dipeptido N-terminal da Angiotensina II, representa um átomo de hidrogénio; ou um grupo -alq; -arilo; -alq-OH; -alq-halogeneto; -CHg-O-alq; -CH^-CN; -CH2“C02Hí “CH2C02"alq; “NH-CO-alq; -CO-NH-alq; 146 -alq-B; -CH (OH) -alq-B; -alq-Asp-Arg-NH,, ; -CH(OH)-aiq-Asp-Arg-NH..

H em que B representa um grupo alcalino ou um seu sal aceitável em farmácia; R4A que f°rnece um grupo espaçador» cuja rigidez relativa constitui um aspecto do modelo de acordo com a presente invenção, que termina em um grupo ácido que imita os grupos hidroxi na tirosina da Angiotensina II na sua conformação de "ligação ao receptor" ou um grupo espaçador que termina em imitador do dipeptido N-terminal da Angiotensina II, representa um grupo de fórmula geral · _____

ou x alq—z—alq- 147 em que Z representa uma ligação» um átomo de oxigénio ou um grupo -NHCO-, OCH, ou CH2~; X representa um grupo -CO^H, -alq-C02H, -FO^H, -alq-PO^H, -PO^Hg» -alq-P04H2, -SH. -alq-SH, -SOgH, -alq-SOgH, -S04H2, Nh-h -alq-S04H2» FgC-CO-NH-, F3C-S02-NH-, H ou um seu sal aceitável sob o ponto de vista farmacêutico; e Y representa um átomo de hidrogénio ou de halogéneo ou um grupo -N02» -O-alq, -alq, -CF^ ou -CN; e Η.,, que fornece eventual mente um grupo espaçador que termina em um imitador do N-terminal do dipeptido N-terminal da Angiotensina, representa um átomo de hidrogénio ou um grupo -alq-B, ~alq-Asp-Arg-NH2, alq-O-alq-B, alq-Q-alq-Asp-Arg-NH2, ou-alq—
48. Método de acordo com a reivindicação 47, caracterizado pelo facto de se criarem compostos em que (a) a e/ou não representa (m) um átomo de azoto, quando o núcleo é um núcleo imidazólico; (b) ou a representa um átomo de carbono ou β representa um átomo de azoto, quando o núcleo não é um núcleo 148 imidazólico; (c) o símbolo representa um grupo que inclui uma amida; (d) o símbolo R2 representa um grupo que comporta um outro grupo representado pelo símbolo A; ou (e) o símbolo Rg representa um grupo que comporta um radical representado pelo símbolo B ou um grupo -Asp-Arg-NH2; quando R^g representa um átomo de hidrogénio.
49. Método de acordo com a reivindicação 47, caracterizado peio facto de se criarem compostos em que (a) « e/ou Jj'' não representa(m) um átomo de azoto, quando o núcleo é um núcleo imidazólico; (b) ou a representa um átomo de carbono ou β representa um átomo de azoto, quando o núcleo não é um núcleo imidazól ico; Ic) o símbolo representa um grupo que inclui uma amida; (d) o símbolo R^ representa um grupo que comporta um outro grupo representado pelo símbolo A; ou (e) o símbolo R3 representa um grupo que comporta um radical representado pelo símbolo B ou um grupo -Asp-Arg-NH»; quando R.-, representa um átomo de hidrogénio.
50. Método de acordo com a reivindicação 47, caracterizado pelo facto de se criarem compostos em que o núcleo é um radical imidazólico, pirrólico, pirazólico, 1,2,3- e 1,2,4--triazólico, tetrazólico ou tiazólico, oxazólico, tiadiazólico ou oxadiazólico. 149
51. Método de acordo com a reivindicação 50, caracterizado pelo facto de se criarem compostos em que o núcleo é um radical imidazóiico.
52. Método de acordo com a reivindicação 47, caracterizado pelo facto de se criarem compostos em que pelo menos um dos símbolos R2 ou R^, ligado aos átomos jf', Õ ou ε do núcleo, representa um átomo de hidrogénio.
53. Método de acordo com a reivindicação 47, caracterizado pelo facto de se criarem compostos em que R^g ou R^g representa um átomo de hidrogénio.
54. Método para modelar, isto é, para reproduzir exactamente, antagonistas hexagonais do receptor da Angiotensina II, caracterizado pelo facto de se criarem compostos de fórmula geral R3 R2

na qual a, β, I , δ, e e φ representam átomos de carbono, azoto, oxigénio ou enxofre com a condição de (a) o núcleo conter, pelo menos, um átomo de carbono 150 e um átomo de azoto, e (b) a ligação dos grupos representados pelo sím^0^0 ^ fazer-se no átomo de carbono ou de azoto;

—CU—00 h CK-— I inclui um grupo -alq; -0-alq; -alq-0-alq;-CH2-CO-NK2 í -CH2-C0-NH-alq; -CH2-C0-N(alq)2; 2 * —0^2—00—Ϊ

-CH2-C0-AA-NH2 ou CH2-CO-AA-fenilo em que alq representa um grupo alquilo com 1 a 10 átomos de carbono, cicloalquilo com 3 a 6 átomos de carbono, alcenilo com 2 a 10 átomos de carbono ou alcinilo com 2a 10 átomos de carbono; e AA representa um aminoácido; R^g que eventualmente fornece um grupo espaçador que termina em um imitador do grupo carboxilato C-termi-nal da angiotensina II representa um átomo de hidrogénio ou um grupo de fórmula geral -alq-A;

ou

151 em gue alq tem o significado definido antes e A representa um grupo ácido ou um seu sal aceitável sob o ponto de vista farmacêutico; R2 que fornece propriedades estereoquímicas e/ou electró-nicas e/ou um grupo espaçador que termina em um grupo ácido, representa um átomo de hidrogénio ou de halo-géneo, isto é, um átomo de flúor, cloro, bromo ou iodo, um grupo -alq; -O-alq; -N02; -CF3; -CN; -alq-A; -A; A -alq-fôY'1 R que fornece propriedades estereoquímicas e/ou electró- V nicas e/ou um grupo mimético do radical hidroxi da tirosina da Angiotensina II na sua conformação de "interruptor de carga" ("charge reiay") ou um grupo espaçador que termina em um imitador do N-terminal do dipeptido N-terminal da Angiotensina II, representa um átomo de hidrogénio; um grupo -alq; -arilo; -alq-OH; -alq-halogeneto; -CH2~0-alq; -CH2-CN; -CH2-C02H; -CH2C02-alq; -NH-CO-alq; -CO-NH-alq; -alq-B; -CH(OH)-alq-B; -alq-Asp-Arg-NH0;

152 em que B representa um grupo alcalino ou um seu sal aceitável em farmácia. ^4A que f°rnece um ^rupo espaçador, cuja rigidez relativa constitui um aspecto do modelo de acordo com a presente invenção, que termina em um grupo ácido que imita os grupos hidroxi na tirosina da Angiotensina II na sua conformação de "ligação ao receptor" ou um grupo espaçador que termina em um imitador do dipeptido N-terminal da Angiotensina II, representa um grupo de fórmula geral

X y . n Y·

v A*

Y oV , ou — alq—2—alq- em que Z representa uma ligação, um átomo de oxigénio ou um grupo -NHCO-, -OCI^- ou \ X representa um grupo -CC^H, -alq-CC^H, -PO^H, -alq-POgH, -PO^H^f -alq-P04H2, -SH. -alq-SH, -S03H, -alq-S03H, -SO^, 153

H -alq-S04H2, F3C-CO-NH-, -N F.C-SCU-M-, —<Γ I ou um seu sal aceitável sob o ponto de vista farmacêutico; e Y representa um átomo de hidrogénio ou de halogéneo ou um grupo -N02, -0-alq, -alq, -CF^ ou CN; e R^g que fornece eventualmente um grupo espaçador que termina em um imitador do N-terminal do dipeptido N-terminal da Agiotensina, representa um átomo de hidrogénio, um grupo -alq-B, -alq-Asp-Arg-NH^, alq-O-alq-B, alq-0-alq-Asp-Arg-NH2,
55, Método de acordo com a reivindicação 54, caracterizado

pelo facto de se criarem compostos em que (a) « e/ou representa(m) um átomo de azoto, quando o núcleo é um núcleo imidazólico; (b) ou α representa um átomo de carbono ou β representa um átomo de azoto, quando o núcleo não é um núcleo imidazólico; (c) o símbolo representa um grupo que inclui uma amida; (d) o símbolo R2 representa um grupo que comporta um outro grupo representado pelo símbolo A; ou (e) o símbolo 154 R representa um grupo que comporta um radical representado O pelo símbolo B ou um grupo -Asp-Arg-NE^; quando R^g representa um átomo de hidrogénio.
56. Método de acordo com a reivindicação 54, caracterizado pelo facto de se criarem compostos em que (a) a e/ou jf não representa(m) um átomo de azoto, quando o núcleo é um núcleo imidazólico; (ta) ou <x representa um átomo de carbono ou β representa um átomo de azoto, quando o núcleo não é um núcleo imidazólico; (c) o símbolo R^ representa um grupo que inclui uma amida; (d) o símbolo R2 representa um grupo que comporta um outro grupo representado pelo símbolo A; ou (e) o símbolo R3 representa um grupo que comporta um radical representado pelo símbolo B ou um grupo -Asp-Arg-N^; quando R^g representa um átomo de hidrogénio.
57. Método de acordo com a reivindicação 52, caracterizado pelo facto de se criarem compostos em que pelo menos um dos símbolos R2 ou R^, ligado aos átomos , δ ou s do núcleo, representa um átomo de hidrogénio.
58. Método para modelar, isto é, para reproduzir exactamente, antagonistas do receptor da Angiotensina II, caracterizado pelo facto de se criarem compostos de fórmula de geral 155

(II)

(III) na qual «, β, J , representam átomos de carbono ou de azoto, com a condição de apenas um átomo de azoto se apresentar substituído; R^ representa um grupo de fórmula geral -CH (R^) (R^g) R1A que *m*ta na Angiotensina a estrutura - CH - CÕ“- N - CH _- CO

inclui um grupo -alq; -O-alq; -alq-O-alq; C^-CO-NH^J

-CH2-C0-NH-alq; -CH2-C0-N(alq) ch2 156 -CH2”CO-AA-NH2 ou CHg-CO-AA-fenilo em que alq representa um grupo alquilo com 1 a 10 átomos de carbono, cicloalquilo com 3 a 6 átomos de carbono, alcenilo com 2 a 10 átomos de carbono ou alcinilo com 2a 10 átomos de carbono; e AA representa um aminoácido, o ácido azetidina-carboxílico, o ácido pipecólico, o ácido nipecólico, a glicina, a alanina, a sarcosina ou a N-metil-alanina; RlB que fornece um grupo espaçador que termina em um imitador do grupo carboxilato C-terminal da Angiotensina II representa um átomo de hidrogénio ou um grupo de fórmula geral -alq-A;

em que alq tem o significado definido antes e A representa um grupo ácido ou um seu sal aceitável sob o ponto de vista farmacêutico com a condição de (a) o símbolo R1A representar um grupo que comporta um radical amida; ou (b) se apresentar sobre um átomo de azoto; ou (c) R4 se apresentar sobre um átomo de carbono;

157 que fornece propriedades estereoquímicas e/ou electró-nicas e/ou um grupo espaçador que termina em um grupo ácido, representa um átomo de hidrogénio ou de halogéneo, isto é, um átomo de flúor, cloro, bromo ou iodo, um grupo -alq; -O-alq; -NO^; -CF^; -CN; A -alq-A; -A; ou -alq· h-/õyA que fornece propriedades estereoquímicas e/ou electró-nicas e/ou um grupo mimético do radical hidroxi da tirosina da Angiotensina II na sua conformação de "interruptor de carga" ("charge relay") ou um grupo espaçador que termina em um imitador do N-terminal do dipeptido N-terminal da angiotensina II, representa um átomo de hidrogénio; um grupo -alq; -arilo; -alq-OH; -alq-halogeneto; -CH2-0-alq; -CI^-CN; -CH2-C02H; -CH2C02-alq; -NH-CO-alq; -CG-NH-alq; -alq-B; -CH(OH)-alq-B; -alq-Asp-Arg-NH2; -CH(OH)-alq-Asp-Arg-NH2 ^ÇS ' h@Tb co R4 representa um grupo de fórmula geral -CH(R4A) (R4B) 158 ^4A ^ue ^ornece um grupo espaçador, cuja rigidez relativa constitui um aspecto do modelo de acordo com a presente invenção, que termina em um grupo ácido que imita os grupos hidroxi na tirosina da Angiotensina II na sua conformação de "ligação ao receptor", ou um grupo espaçador que termina em um imitador do dipeptido N-terminal da Angiotensina II, representa grupos

o Y /

em que Z representa uma ligação, um átomo de oxigénio ou um grupo -NHCO-, OCH^ ou CH^-; X representa um grupo -C02H, -alq-COgH, -POgH, -aiq-PC^H, -PO^, -alq-P04H2, -SH. -alq-SH, -SOgH, -alq-SO^, -SC>4H2, -alq-S04H2, FgC-CO-NH-, F3C-SC>2-NH-r j XN—N H 159 ou um seu sal aceitável sob o ponto de vista farmacêutico; e Y representa um átomo de hidrogénio ou de halogéneo ou um grupo -NC^, -Q-alq, -alq, -CF^ ou CN; e F-4B que fornece eventual mente um grupo espaçador que termina em um imitador do N-terminal do dipeptido N-terminal da Angiotensina, representa um átomo de hidrogénio, um grupo -alq-B, -alq-Asp-Arg-NE^, alq-O-alq-B, alq-0-alq-Asp-Arg-NHo,

em que B representa um grupo alcalino ou um seu sal aceitável em farmácia; e R5 tem o significado definido antes para o símbolo R1. 160 Lisboa, 8 de Janeiro de 1991 i ΜΗΤΕ «FiCiAL DA PJJOPftlEQABE «ST1II·

JOÃO MACHADO De SARROS ADVOGADO AGENTE OFICIAI. DA PBOPflSilAf?? 'NDUSTFilAL RUA BERNA.-. ..-4; 10-1« F,-.,; k· λ 1 TEL.EP. 34245 04 - 12OOL1SB0A