PT95103B - Processo para a obtencao de receptor do virus da leucemia do macaco gibao - Google Patents

Description

FUNDAMENTO......DO......INVENTO

O presente? inventa está relacionado com a proteina do receptor do virus da leucemia do macaco gibão, urn retroviru© e ccrn genes animais e suas proteínas que interactuam com o vírus da leucemia do macaco gibão (GALV),. Esta© proteínas do receptor de GALV sao necessárias para a entrada do virus nas células e são portanto definidas como receptores celulares para GALV..

Os retroviru© podem ser inseridos em grupos bem defini.....

dos dependendo da via usada pelos virus para entrarem na célula..

Pensa.....se que os membros de um determinado grupo utilize recepto.....

res celulares específicos para entrar nas células e que existe pouca ou mesmo nenhuma utilizaç:ão cruzada de receptores por membros de grupo© diferentes,. Em geral, estes receptores per mane.....

cerarn virtualmente inexplorados.. De entre aproximadamente oito receptores humanos específicos para os retroviru© que se sabe infectarem células humanas, apenas um foi cionado (CD4 para HIV; Maddon et al„ , 1986; McDougalet al„ , 1986).. Este invento está pois relacionado com um dos receptores normalmente conhecidos necessários à infecção de animais, especificamente células humanas, por um retroviru©.. Se bem que tenha sido especulada a presença de uma proteina receptor especifico para GALV (e para outros retroviru© utilizando outras vias de receptores), nenhum receptor especifico de GALV foi até agora cionado ou caracteriza.....

do..

Se bem que tenha sido feita referência a GALV, compre.....

ende-se que o virus associado ao sarcoma sírnio e outros virus conforme estabelecido atrás, utilizem o rnesmo receptor (Weiss et al.. , 1984)..

-- ' > :· : λ ,.Os novos genes e proteínas do presente úteis na manipulação experimental do hospedeiro GALV, na analise de interacções vírus/receptores e na elucidação e exploração do papel normal do receptor, o qual inclui funções na actividade irnune..

invento sao

BREVE......DESCBJjGãO^DS......DESENHOS

FIGURA 1.. Análise Southern de DNAs humano (HU), trans— fectante (GRT) e de murganho (MO) digeridos com Bamlll.. 0 painel da esquerda mostra uma transferência hibridada com a inserção EcoRI de 3,5 Kb (contenda repetições) do pR7h na sua totalidade..

A faixa da direita foi hibridada com o subfragrnento EcoRI-HindIII de 2, 2 kb..

FIGURA 2... Analista Northern de RNAs humano, transfectante e de murganho.. As sondas usadas foram o subfragrnento EcoRI—HindiII. de 2, 2 kb do pR7h (painel superior)e uma sonda actina (painel inferior; 0’ Hara et al.. , 1937).. As faixas 1-4, RNA celular total purificado em oligo-dT da linha celular humana TU1„ 1.. 1 (0’Hara et al.. , 1987).. A faixa 1, células confluentes. 2, fase logarítmica.. 3, confluentes infectadas com GALV. 4, confluentes infectadas oorn Mo-MuSV (GALV). Faixas 5-8, RNA celular total purificado em oligo dT da linha celular hurnana NT2. 1. 1 (íT Hara et al.. , 1987).. A faixa 5, confluentes. S, fase logarítmi.....

ca. 7, confluentes infectadas com GALV. 8, confluentes infectadas oorn Mo~MuSV(GALV).. 9-11, RNAs citoplasmáticos purificados em oligo.....dT do tr an sfectan te primário GRT5, transfectante secun dário

GRT9 e células NIH3T3, respeetivamente.

FIGURA 3„ Análise Southern e Northern usando sondas de cDNA. (A) análise Southern dos DNAs humano (H), transfectante (GRT) e de murganho NIII3T3 (M) usando o fragmento da inserção ys '7 / 7

EcoRI 5’ de lambda FIGR6 (subclonado em pLICllS) como sonda. (B) análise Southern de DNAs digeridos com EcoRI usando o fragmento médio EcoRI de lambda I-IGR6 (subclonado em plJCllS) como sonda. (C) análise Northern de RMAs purificado© ern oligo-dT. Faixa 1, RNA de NT2„1. 1 hibridado com uma sonda de RNA de cadeia simples derivada de um fragmento EcoRI 5’ de lambda HGR6 e transcrito n direcção 3’·~·5^υ corno indicado na Figura 6. Faixa 2 e 3 RNAs GRT--5 e NT2. 1. 1 hibridados com as três inserções EcoRI de lambda I4GR8 (subclonado ern pUC118) corno sonda.

FIGURA 4. Análise Southern de DNAs humano (ll), células VERO de macaco verde africano (V), cão (D), gato (G), rã (F) e levedura (Y) digeridos corn EcoRI usando o fragmento da inserção EcoRI 5’ do lambda I-IGR6 (subclonado ern pUCll.8) corno sonda.

FIGIJRA 5. cDNAs humanos isolados e a® cadeias sequenciadas. As meias setas representam sítios EcoRI. Estão presentes adaptadores EcoRI ern cada urn dos extremos de cada clone onde nao estão indicadas rneias setas . A grelha de leitura aberta longa está indicada para larnbda I-IGR6 pela seta (inicio da tradução) e asterisco (codao de terminação).

FIGURA 6. Sequência de DNA do cDNA humano para o receptor GALV. A grelha de leitura aberta longa estende-se desde as; posiçSes 371 a 2407, inclusive.

FIGURA 7. Sequência de aminoácidos da proteína receptor de GALV humana, conforme derivado da grelha de leitura aberta longa na Figura 6.

FIGURA 8. Estrutura de pSV2GR6. A linha preta fina representa sequências derivadas do pSV2gpt a caixa pequena representa sequências derivadas do sítio de clonagem múltipla do

pUC118 e a caixa com sota representa sequências derivadas da inserção de lambda HGR-8. Para esta construção, larnbda HGR8 foi digerido parcialmente com EcoRI e as três inserções contíguas EcoRI foram isoladas como um fragmento único. Este foi então clonado no sitio EcoRI em plJC'118 (para dar pHGíRG-l), de tal forma que o presumível 5’ da inserção esta proxirnal relativamente ao sítio HindIII em pUCUS. A fracção deste plasmídeo entre os sítios HindIII e Hpal foi clonado entre os sitias HindIII e Hpal do pSV2gpt para dar pSV2GR8..

SUMÁBIQ.....DO.....INVENTO presente inventa está relacionado com a proteína receptor de GALV e com os; seus homólogos expressos numa grande variedade de tecidos animais., A sequência de aminoácidos; primária do receptor está ilustrada na Figura 7, na qual está mostrada o receptor humano. Mo entanto, como seria de esperar da larga gama de hospedeiros do GALV (Weiss et al...... 1984) e da análise Southern de outras espécies além da humana (Figura 4), existem homólogos estreitamente relacionados em espécies tais como cão, gato, murganho e macaco e outros. Estas observações suportam a existência universal de genes discretos verdadeiramente homólogos do receptor de GALV humano. Assim, o presente invento está relacionado não só com a proteína específica identificada na Figura 7, rnas também com as proteínas tendo substancialmente a rnesrna sequência de aminoácidos e substancialmente a rnesrna capacidade de todas para permitir a infecção virai corno a proteína ilustrada na Figura 7. Ainda, o invento está relacionado com a sequência de DMA purifiçada (Figura 6) codificadora do receptor de GALV (humano) e oorn DNAs tendo substancialmente a rnesrna sequência de DMA e corn substancialmente a mesma sequência de DNA codificadora de aminoácidos da Figura 6. Corno será apreciado pelos familiarizados com a matéria outras proteínas corno estas mas de outras

espécies, assirn corno outras alternativas a proteína ilustrada na Figura 7, são isoladas pelo processo do presente invento.. Podem ser usados vários sistemas de expressão para produzir variedades destas proteínas mas tais variedades ainda resultam numa proteína com actividades biológicas semelhantes â proteína do presente invento.. È também reconhecido pelos familiarizados com a área que as modificações da sequência de DMA apresentadas na Figura 6 resultam em proteínas do receptor de GAL.V» As sequências de DMA resultantes e as proteínas resultantes tendo substancialmente o mesmo papel na entrada do vírus estão incluídos dentro do âmbito do presente invento.A função biológica do receptor foi medida por estudos de infecção de células normalmente nao susceptiveis de serem infectadas e transfectadas com construções destinadas a expressar a proteína (como demonstrado na Tabela 1), Ainda, os estudos de ligação e estrutura caracterizam e identificam a sequência de aminoácidos e estrutura.. Os estudos de infecção com vírus identificam funcionalmente um papel da proteína na entrada do vírus,.

As proteínas do receptor de GALV do presente invento sao produzidas através de vectores de expressão compreendendo uma sequência de DMA codificadora de uma proteína humana do receptor de GALV (ou sequências de DMA dos homólogos de outras espécies) ou mutantes (com ou sem a capacidade para conferir susceptibilidade â infecção em células normalmente não infectáveis) em que um ou mais aminoácidos foram inseridos, eliminados ou substituídos na sequência de aminoácidos da proteína humana do receptor de GALV ou no seu homólogo de outras espécies»

Em adição, o presente invento inclui um método para a identificação de homólogos do receptor de GAI....V de todas as espécies animais em que uma sonda de DMA seleccionada do DMA da Figura 6 ou com substancialmente a mesma sequência de DMA da

identificada na Figura D ê usada para isolar o DMA adequado de outras espécies..

Ainda, conforme pode ser determinado pelos familiarizados com a matéria, a manipulação do receptor GIALV permite a regulação da entrada do virus nas células.. Isto permite a prevenção de certas infecçoes virais mecanismo para retrovirus; que GiALV para a entrada na célula..

e a capacidade de controlar este utilizam a proteína receptor de U s o u - s e u rn a q u a n t i d a d e r e g u 1 a d ora da proteína receptor de GiALV de um agente infeocioso que usa a proteína receptor de GALV parai manipular a infecção de células por retrovirus.

Para fins do presente invento, os plastnídeos, sequências de DNA e microorganismos depositados em ligação corn o presente invento, excepto sempre que especificado o contrário, foram depositados na colecçao de culturas da American Cyanamid Company mantida em Princeton, New Jersey, e foram depositados na American Type Culture Collectíon em Rockford, Maryland 20952 USA.

Se bem que as técnicas de engenharia genética possam por si sós conduzir a métodos eficazes para produzir as proteínas receptor de GALV do presente invento, deve-se notar igualrnente que as presentes proteínas incluem outros métodos de produção, corno seja síntese química ou purificação a partir de tecidos animais,,

É pois um objectivo do presente invento proporcionar a nova proteína receptor do receptor de GALV.. Também, a proteína receptor de GALV de outras espécies, para além da proteína receptor de GALV humana, é englobada pelo presente invento.. Um outro objectivo do presente invento é proporcionar uma sequência de DNA isolada codificadora do receptor GALV., Estes e outros objectivos cio invento tornar-se-ão aparentes por urna descrição rnais detalhada cio invento a seguir apresentada.

DESORI£AO..%ETALHADA „DO„.INVENTO □ presente invento está relacionado corn a proteína receptor de Í3ALV., A espécie analisada rnais detalhadarnente é a humana, se bem que seja reconhecido que outras proteínas sernihan— tes existam noutras espécies animais. Portanto, o invento inclui proteínas homologas de outras espécies.. 0 presente invento descreve a estrutura do cDNA para o receptor GALV de células HL80 Inumanas.. Ainda, a funcionalidade do cDNA isolado ao permitir a entrada dos vírus é dada nos exemplos que se seguem mas não lhes está limitada..

EXEMPLO......1 ,Isçú.amentçL._do.,._receptor......deJSALV

FracçSes do gene do receptor humano para o vírus da leucemia do macaco gibão (GAEV) foram isoladas como se segue.. Ern primeiro lugar, o DNA das células humanas (que sejam facilmente infectadas com GALV e portanto expressam aquele receptor virai) foi Introduzido em células de ratinho NIH3T3 (as quais nao podem ser infectadas com o vírus) de várias maneiras, sendo descrito abaixo o processo da precipitação com CaPCl^» 0 DNA humano de mais alto peso molecular foi misturado oom pSVSgpt em solução aquosa contendo CaCl^ fô mistura foi adicionada a uma segunda solução contendo fosfato e tampão HEPES a pH 7, 1. Os DNAs precipitam em agregados com CaPO_z) e este agregado é aplicada nas células em cultura (células MIH3T3 de ratinho).. Uma fracção das células interioriza agregados dã mistura de DMA e incorpora e expressa o DNA transfectado.

Para estudar apenas a© célula© que foram transfectadas, é imposta selecção para a presença de pSV2gpt. Para isto, as células são cultivada© em rneio contendo ácido micofenólico e xantina» 0 ácido micofenólico impõe um bloqueio metabólico nas células o qual pode ser ultrapassado pela expressão de guanilina— ••f osforribosiltransferase (codificada por pSV2gpt) através da sua utilização de xantina (Mulligan e Berg, 1981).. Após cerca de duas semanas neste meio, apenas permanecem as células transfectadas.

Urna determinada célula nesta cultura expressa agora aproximada.....

mente 0,1% do DMA dador humano. Uma fracção deste (aproximadamente 1/1000) espera-se expressarem o receptor humano para GALV. Tai© célula© forarn isoladas por infecção com um virus resistente ao antibiótico que requere interacçao com o receptor GALV para entrar nas células. Este virus é feito por repescagern de pGV16, um resistente a G418, virus defectivo para a replicação (Nada et al» , 1986) das células, usando GALV, de tal forma que o vírus ptíVIG é pseudotipado por GALV. Os sobrenadantes destas células infectadas contêm agora GALV e pGV16 pseudotipados por GALV (i. e„ , o genoma EMA de pGV16 está contido numa partícula GALV). A mistura |„designada pGV16(GALV) J pode agora infectar células usando apenas a via normalmente usada por GALV» Esta mistura foi aplicada as células de ratinho transfectadas e estas foram tratada© dois dias mais tarde com o antibiótico G418» Apenas as células infectadas com pGV16 sobrevivem. Estas forarn designadas transfectantes primários e deverão conter aproximadamente 0, 1% do genorna humano ern cada isolado independente.

EXEMPLO......2

I.CansfeoElí2 material transfeotado encontrado nos transfectantes primários conterá uma grande quantidade de sequências repetitivas

humanas e deverá também incluir o gene do receptor humano de GALV. Mo entanto, devido à pressão para manter o gene ser perdida apos infecção com virus e selecçâo de pGVIS, espera-se gue muitos transfectantes segreguem o gene, como é normal para qualquer urna destas experiências. Por este rnotivo, pensa-se que um transfectante primário tenha sido infectado com pGV18 mas não com GALV competente para a replicaçâo,. A presença continuada do receptor e portanto do gene receptor pode ser demonstrada nesta célula pois ela deixou de estar imune á superinfecção tal corno estão as células que foram infectadas com GALV. Estas constituem a maioria dos isolados devido a GALV estar ern excesso relativarnente a pGVl.8 nos «stocks» de pGV16(GALV).. Foi escolhido um transfeotante infectado apenas com pGV16, neste caso a célula designada GRT5, o DMA preparado a partir dela e o DNA usado numa segunda volta de transfecção para obter transfectantes secundários.. 0 processo parei obter estes é semelhante ao usado para derivar os transfectantes primários.. Ou seja, o DNA de GRT5 foi misturado com pSV2gpt, precipitado com OaPO,., e usado para transfectar células 4

N1H3T3.. Estas foram então cultivadas em meio contendo ácido rnicofenõlico e xantina e as células sobreviventes foram infecta.....

das com pGV16(GALV).. Aplicou-se então G418 e as células sobreviventes foram cultivadas e examinadas para identificar presumíveis transfectantes secundários para o gene? do receptor.. Uma vez que pGV18 proviral está presente no DMA dador primária, alguns dos transfectantes secundários tornar-se-ão resistentes a G418 a partir da transfecção do DMA proviral... Os transfectantes bana fide do receptor podem, no entanto, distinguir-se destes pois a maioria dos transfectantes secundários deverão ser produtores de GALV.. Os transfectantes secundários foram portanto despistados quanto à produção de GALV e o DNA foi preparado de qualquer um encontrado. Este DMA foi analisado em análise Southern para determinar se qualquer um dos produtores contem sequência repeti.....

tivas humanas,, Devido aos processas de transfecção primaria e

secundária reduzirem corn êxito a quantidade de DMA repetitivo humana encontrada num transfectante espera-se que qualquer DMA humano repetitivo encontrado num transfectante secundário esteja espeoificamente associado ao gene do receptor..

EXEMPLO......3

......ÊDMA...e......de....sonda©......de......cDMA

Construiu--se uma biblioteca genórnica a partir de tais transfectantes secundários encontrados no Exempla 2 (neste caso GRT3,, o transf ectante secundário e lambda gtlO e EcoRI corno vector e enzima de elonagern, respectivamente) e despistou-se quanto á presença de clones contendo DMA repetitivo humano usando DMA humano marcado radioactivarnente por «nick-translation» corno sonda. Um em 500 000 clones híbrida com a sonda.. Este clone (lambda R'7h) foi purificado por placas até â homogeneidade e a sua inserção EcoRI de 3, 5 Kb foi clonada ern pGEM2 e pUC118. Este fragmento EcoRI de 3,, 5 Kb consiste ern fragmentos EcoRI-HindIII de 2, 2 e 1, 3 kb.. A utilização de todo o fragmento de 3, 5 kb corno sonda em análise Southern demonstra que o DMA clonado contem sequências repetitivas humanas, conforme esperado, e que híbrida corn um fragmento EcoRI de 6, 8 kb na maior parte dos transf ectante© mas não apreciavelmente corn DMA de ratinho (Figura 1), tempos de exposição mais longos revela a presença de urna banda hibridante ern DMA de ratinho representando a hornologia rnurina, conforme esperado.. A presença desta última sequência transfectada ern transfectantes independentes demonstra que as sequências em lambda R'7h sao parte ou estão na proximidade do gene receptor.. A utilização do fragmento de 2, 2kb como sonda dá o mesmo resultada exceptuanda no DMA humano apenas um único fragmento de 8, 8 kb ser detectado (Figura 1), Isto indica que apenas sequências de copias simples estão contidas neste fragmento..

Quando este fragmento foi usado como sonda em análise

Northern, detectou-se apenas um único rnRNA de aproximadamente 4 kb em células humanas e ern GRT5, o transfectante com o número de cópias mais elevado do DMA transf ectadonão se encontrou RNA fortemente hibridante em células de ratinho (Figura 2).. Isto indica que as sequências olonadias são expressa© em RNA e ©ão portanto adquados para o despiste de bibliotecas de cDNA, Assim, uma biblioteca de cDNA das células I-IL60 (adquiridas á Clontech, #l-IL1020b) foi despistada corn o fragmento e encontrou-se 1/10 000 placas hibridantes, Três destes (isolados de lambda HGR6, HGR7 e HGR16, Fig ura 5) foram purificado© e o© fragmento© EooRI contido© foram subolonados em pUC'118 e sequeneiados usando o método de t er min ação didesoxi..

A análise das sequência© revela várias características,

1) As ©equêncas dos clones sao virtualmente idênticas,

2) Lambda HGR6 e lambda HGR16 comtêin uma única grelha de leitura aberta de 679 aminoácidos cada, as presumíveis sequências de aminoácidos dos quais sendo idênticas,

3) Lambda I-IGR7 parece ser um cDNA truncado por conter uma grande grelha de leitura aberta com urna pressuposta sequência de aminoácidos para os dois terços 3 da presumível proteína codificada pelos isolados acima começando no aminoãcido 180 na Figura 7,

4) A proteína presumida codificada por estes isolados (Figura 7) tem as características de uma proteína de membrana integral. Ou seja, a análise pelo program de de Kyte e Doolittle (1982) indica que várias regiões são possíveis domínios que atravessam a membrana (estes são aproximadamente οs resíduos 15—33, 159-182, 228—251 e 851-874). Outras regicies sao também hidrofõtaicas, no entanto se bem que num grau inferior poderão também representar domínios que atravessam membranas ( por exemplo, regiões

58.....79, 118.....141 e 555-578). A semelhança da presumível proteína oom as proteina© de membrana integrai© reside no manter a sua função esperada como receptor de retrovirus.

Para caracterizar melhor os isolados, os fragmentos EcoRI subclonados a partir de lambda HGR8 foram usados na analise Southern de DNAs humano, transfectante e de murganho. Encontrou-se que todos os fragmentos detectados no DNA humano são tarnbêrn encontrados em DNAs transfectantes mas nao ern DNA de murganho (Figura 3A, 13). Isto confirma ainda que os isolados derivam do gene receptor pois uma sequência com tal comprimentonao seria encontrada ern transf ectantes independentes a menos que tenha sido seleccionada a sua presença. A Figura 3C mostra que o RNA esperado foi detectado usando sondas de cDNA.

EXEMPL0...4

ExEiressão

A prova final de que lambda HGR8 codifica o receptor GALV deriva da demonstração do seu potencial para conferir susceptibilidade à infecção por GALVem células de retinho. pHGR8-l, contendo os três fragmentos de inserção EcoRI do lambda HGR8 na orientação correeta, foi digerido corn HindlII, a qual corta no sítio de clonagern múltipla do vector plJCll.8 no extrema 5’ da inserção e com Itpal que corta na região não traduzida 3’ da inserção. Este fragmento foi usado para substituir a região de pSV2gpt entre o© sítios HindlII e Hpal. 0 plasmideo resultante, pSV2GR8 (Figura 8), contem toda a grelha de leitura aberta

codificadora do receptor corn o promotor precoce do SV40 a montante e um sinal de poliadenilaçao do SV40 a jusante.. As células de ratinho transfectadas corn este plasrnídeo foram tornadas suscepti····· veis â infecção por GALV, desde que a confirmação final do clone de que o clone de facto codifica o receptor GALV.. Usando o ensaia de centros infecciosos, encontrou-se que até 1% de células transfectadas com pSV2.gpt e pSV2GR6 e seleccíonadas quanto à presença de pSV2gpt são infectadas..

plasmideo pSV2GR6 foi depositado na American Type Culture Collection com o número de deposito ATCC 680070 (2 de Agosto, 1989)»

TABELA I

A expressão de pSV2GR8 torna as células de murganho NIH3T3 susceptíveis à infecção por GALV

DMA Tran sfectado

IC® pSV2gpt pSV2gpt + pSV2GR6

0/10®

739/10®

-I- (-/1-1 colomas G4..I..8

Sem virus pGVlS(GALV)

ND 0/10®

0/10⁷ 252/8 X 10® ^U Numero de células produtoras de virus/numero bestado.. Células N1H3T3 (transfectadas e depois cultivadas em meio contendo ácido arninof enólico) foram expostas a pGV16(GALV) e semeadas com células PG4 num ensaio de centros infecciosos.

® Colónias formadas ern meio contendo G418/núrnero testado.. Células NIH3T3 (transf ectadas e depois cultivadas ern meio contendo ácido rnicofenólico) foram semeadas na presença de G418 após exposição, onde indicado, a pGV18( GALV n à o r e al i z a d o..

BIBLIOGRAFIA

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lã.. - Método para a produção da proteína reoeptor de GALV, caracterizado por compreender a transformação de uma célula hospedeira apropriada com uma sequência de ãcido nucleico que codifica a proteína, e o crescimento da célula sob condições que permitam a expressão da proteína pela célula hospedeira..

2S.. ..... Método de acordo com a Reivindicação 1, caracterizado por a proteína reoeptor de GALV ter a sequência de aminoáeidos definida na Figura 7 ou ter substancialmente a mesma sequência de aminoácidos e substancialrnente a mesma capacidade para permitir a infecção virai que a proteína na Figura 7;;

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FIG. 7 (cont.) i

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3ã.. - Método de acordo corn a Reivindicação 1, caracte.....

rizado por a proteína ser a proteína receptor de GALV humana..

4â.. ..... Método de acordo com a Reivindicação 1, caracte.....

rizado por a proteína ser derivada de uma espécie diferente da humana..

5â„ ~ Método de acordo com a Reivindicação 1, caracterizado por a proteína receptor ter a sequência de aminoácidos definida na Figura 7, anteriormente referida,.

63. - Método para a obtenção de uma sequência de DMA isolada e purificada., codificadora de uma proteína receptor de GALV, caracterizado por compreender a identificação do DMA que contém a sequência por hibridação com uma sonda de ácido nucleico apropriada, a digestão do DMA com enzimas de restrição apropria.....

dos, e o isolamento do fragmento de restrição que contém a s e q u ê n c i a h i b r i d a n t e..

7íL - Método de acorda corn a Reivindicação 6, caracte.....

rizado por- a sequência de DMA codificar uma proteína receptor de GALV corno definida na Figura 6 ou tendo substancialmente a mesma sequência de DNA e substancialmente a mesma sequência codificado.....

ra de aminoácidos do DNA na Figura 6::

FIG. 6

----_f----4----_t----+----₁----+----'----4-----,----4

GAGCTGTCCCCGGTGCCGCCGACCCGGGCCGTGCCGTGTGCCCGTGGCTC 50

CAGCCGCTGCCGCCTCGATCTCCTCGTCTCCCGCTCCGCCCTCCCTTTTC 100 101 CCTGGATGAACTTGCGTCCTTTCTCTTCTCCGCCATGGAATTCTGCTCCG 150 151 TGCTTTTAGCCCTCCTGAGCCAAAGAAACCCCAGACAACAGATGCCCATA 200 201 CG CAG CGTATAGCAGTAACTCCCCAGCTCGGTTTCTGTGCCGTAGTTTAC 250

----_f----4----₁----+----₁----+----,----4----_f----+

251 AGTATTTAATTTTATATAATATATATTATTTATTATAGCATTTTTGATAC 300 301 CTCATATTCTGTTTACACATCTTGAAAGGCGCTCAGTAGTTCTCTTACTA 350 351 AACAACCACTACTCCAGAGAATGGCAACGCTGATTACCAGTACTACAGCT 400 4 01 GCTACCGCCGCTTCTGGTCCTTTGGTGGACTACCTATGGATGCTCATCCT 450 4 51 GGGCTTCATTATTGCATTTGTCTTGGCATTCTCCGTGGGAGCCAATGATG 500

----_f----4----_f----4----_f ----4----_f----4----_f----4

501 TAGCAAATTCTTTTGGTACAGCTGTGGGCTCAGGTGTAGTGACCCTGAAG 550 551 CAAGCCTGCATCCTAGCTAGCATCTTTGAAACAGTGGGCTCTGTCTTACT 600 601 GGGGGCCAAAGTGAGCGAAACCATCCGGAAGGGCTTGATTGACGTGGAGA 650 651 TGTACAACTCGACTCAAGGGCTACTGATGGCCGGCTCAGTCAGTGCTATG 700 701 TTTGGTTCTGCTGTGTGGCAACTCGTGGCTTCGTTTTTGAAGCTCCCTAT 750

----_f----4----_f----4----'----4----,----4----_f----4

51 TTCTGGAACCCATTGTATTGTTGGTGCAACTATTGGTTTCTCCCTCGTGG 800 801 CAAAGGGGCAGGAGGGTGTCAAGTGGTCTGAACTGATAAAAATTGTGATG 850 851 TCTTGGTTCGTGTCCCCACTGCTTTCTGGAATTATGTCTGGAATTTTATT 900 901 CTTCCTGGTTCGTGCATTCATCCTCCATAAGGCAGATCCAGTTCCTAATG 950 951 GTTTGCGAGCTTTGCCAGTTTTCTATGCCTGCACAGTTGGAATAAACCTC 1000

FIG. 6 Icont.)

----'----4.----'----4-----'----4-----'----4-----'----41003 TTTTCCATCATGTATACTGGAGCACCGTTGCTGGGCTTTGACAAACTTCC 1051 TCTGTGGGGTACCATCCTCATCTCGGTGGGATGTGCAGTTTTCTGTGCCC 1101 TTATCGTCTGGTTCTTTGTATGTCCCAGGATGAAGAG AAAAATTG AACG A 1151 GAAATAAAGTGTAGTCCTTCTGAAAGCCCCTTAATGGAAAAAAAGAATAG 1201 CTTGAAAGAAGACCATGAAGAAACAAAGTTGTCTGTTGGTGATATTGAAA

----_f-----(.----_f--_—|---—— _f —---1-----,----4-----_t-----11251 ACAACCATCCTGTTTCTGAGGTAGGGCCTGCCACTGTGCCCCTCCAGGCT 1301 GTGGTGGAGGAGAGAACAGTCTCATTCAAACTTGGAGATTTGGAGGAAGC

51 TCCAG AGAGAGAGAGGCTTCCCAGCGTGGACTTGAAAGAGGAAACCAGCA

01 TAGATAGCACCGTGAATGGTGCAGTGCAGTTGCCTAATGGGAACCTTGTC 14 51 CAGTTCAGTCAAGCCGTCAGCAACCAAATAAACTCCAGTGGCCACTCCCA _f 4-—— , , ————4.———— ————+— , +

1501 GTATCACACCGTGCATAAGGATTCCGGCCTGTACAAAGAGCTACTCCATA 1551 A ATTACATCTTGCCAAGGTGGGAGATTGCATGGGAGACTCCGGTGACAAA 1601 CCCTTAAGGCGCAATAATAGCTATACTTCCTATACCATGGCAATATGTGG 1651 CATGCCTCTGGATTCATTCCGTGCCAAAGAAGGTGAACAGAAGGGCGAAG 1701 AAATGG AGAAGCTGACATGGCCTAATGCAGACTCCAAGAAGCGAATTCGA _t----4.----_f----+----_f----4.----_f----4__---_f----4.

1751 ATGGACAGTTACACCAGTTACTGCAATGCTGTGTCTGACCTTCACTCAGC 1801 ATCTGAG ATAGACATG AGTGTCAAGGCAGCG ATGGGTCTAGGTGACAGAA 1851 AAGGAAGTAATGGCTCTCTAGAAGAATGGTATGACCAGGATAAGCCTG ΑΛ 1901 GTCTCTCTCCTCTTCCAGTTCCTGCAGATCCTTACAGCCTGCTTTGGGTC 1951 ATTCGCCCATGGTGGCAATGACGTAAGCAATGCCATTGGGCCTCTGGTTG _t----4.----_f----4.----_f----4.----_f----4.----₁----42001 CTTTATATTTGGTTTATG ACACAGGAGATGTTTCTTCAAAAGTGGCAACA 2051 CCAATATGGCTTCTACTCTATGGTGGTGTTGGTATCTGTGTTGGTCTGTG 2101 GGTTTGGGG AAGAAG AGTTATCCAG ACCATGGGG AAGG ATCTG ACACCG A 2151 TCACACCCTCTAGTGGCTTCAGTATTGAACTGGCATCTGCCCTCACTGTG 2201 GTGATTGCATCAAATATTGGCCTTCCCATCAGTACAACACATTGTAAAGT _t----4.----,----+----_f----4.----,----4.----,----+

2251 GGGCTCTGTTGTGTCTGTTGGCTGGCTCCGGTCCAAGAAGGCTGTTGACT 2301 GGCGTCTCTTTCGTAACATTTTTATGGCCTGGTTTGTCACAGTCCCCATT

1050

1100

1150

1200

1250

1300

1350

1400

1450

1500

1550

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1650

1700

1750

1800

1850

1900

1950

2000

2050

2100

2150

2200

2250

2300

2350

FIG. 6 (cont.)

TCTGGAGTTATCAGTGCTGCCATCATGGCAATCTTCAGATATGTCATCCT 2400 CAGAATGTGAAGCTGTTTGAGATTAAAATTTGTGTCAATGTTTGGGACCA 24 50 TCTTAGGTATTCCTGCTCCCCTGAAGAATGATTACAGTGTTAACAGAAGA 2500 _____f_____I-----₍-----1----— _t ———-----?----,---—μ

CTGACAAGAGTCTTTTTATTTGGGAGCAGAGGAGGGAAGTGTTACTTGTG 2550 CTATAACTGCTTTTGTGCTAAATATGAATTGTCTCAAAATTAGCTGTGTA 2600 AAATAGCCCGGGTTCCACTGGCTCCTGCTGAGGTCCCCTTTCCTTCTGGG 2650 CTGTG AATTCCTGTACATATTTCTCTACTTTTTGTATCAGGCTTCAATTC 2700 CATTATGTTTTAATGTTGTCTCTG AAG ATGACTTGTGATTTTTTTTTCTT 2750

----₁----+----_f----+----_f----+----,----₊----_f----+

T_TTTTTAAACCATGAAGAGCCGTTTGACAGAGCATGCTCTGCGTTGTTGG 2800 TTTCACCAGCTTCTGCCCTCACATGCACAGGGATTTAACAACAAAAATAT 2850 AACTACAACTTCCCTTGTAGTCTCTTATATAAGTAG AGTCCTTGGTACTC 2900 TGCCCTCCTGTCAGTAGTGGCAGGATCTATTGGCATATTCGGGAGCTTCT 2950 TAGAGGGATGAGGTTCTTTGAACACAGTGAAAATTTAAATTAGTAACTTT 3000

----₁----+----_f----+----₁----+----₁ ~---+----_f----+

TTTGCAAGCAGTTTATTG ACTGTTATTGCTAAGAAGAAGTAAGAAAGAAA 3050 AAGCCTGTTGGCAATCTTGGTTATTTCTTTAAGATTTCTGGCAGTGTGGG 3100 ATGGATGAATGAAGTGGAATGTGAACTTTGGGCAAGTTAAATGGGACAGC 3150 CTTCCATGTTCATTTGTCTACCTCTTAACTGAATAAAAAAGCCTACAGTT 3200

aã= ~ Método ds acordo com a Reivindicação 6=, rizado por a sequência de DNA ser derivada de humano.

9â„ - Método de acordo com a Reivindicação 6_? caracterizado por a sequência de DNA ser derivada de uma espécie diferente da humana.

caracteLisboa₅ 24 de Agosto de ívv@

Claims (4)

1. J. PEREIRA DA CRUZ

   Agente Oficial da Propriedade Industrial RUA VtCTOR CORDON, 10-A 3.® 12Õ0 LISBOA

   FOLHA 1 (11 FOLHAS)

   FIG.1

   A GRT

   HU
2. 2 5 9 6 7 8 MO HU

   FIG. 2

   12345678 9 10 11

   FOLHA 2 (11 FOLHAS)

   FIG. 3A

   GRT

   H 5 9 6 7 8 M P f -23.7

   -2.1

   FOLHA 3 (11 FOLHAS)

   FIG. 3B

   GRT

   12 3

   FIG. 3C

   FOLHA 4 (11 FOLHAS) ,¥/z .·1ιΈή

   FIG. 4 o

   Η V D C F ¥

   4.3

   FOLHA 5 (11 FOLHAS)

   FIG. 5

   -1_I XHGR7

   --r

   -

   - XHGR6

   XHGR16

   1 KB

   FOLHA 6

   11 FOLHAS

   FIG. 6

   ----_f----₊----,----+----_f----4.----,----4-----_f----4.

   1 GAGCTGTCCCCGGTGCCGCCGACCCGGGCCGTGCCGTGTGCCCGTGGCTC 51 CAGCCGCTGCCGCCTCGATCTCCTCGTCTCCCGCTCCGCCCTCCCTTTTC 101 CCTGGATGAACTTGCGTCCTTTCTCTTCTCCGCCATGGAATTCTGCTCCG 151 TGCTTTTAGCCCTCCTGAGCCAAAGAAACCCCAGACAACAGATGCCCATA 201 CGCAGCGTATAGCAGTAACTCCCCAGCTCGGTTTCTGTGCCGTAGTTTAC

   ----_f----4_----_f----4-----_f----4.----_f----4.----_f----4251 AGTATTTAATTTTATATAATATATATTATTTATTATAGCATTTTTGATAC 301 CTCATATTCTGTTTACACATCTTGAAAGGCGCTCAGTAGTTCTCTTACTA
3. 3 51 AACAACCACTACTCCAGAGAATGGCAACGCTGATTACCAGTACTACAGCT
4. 4 01 GCTACCGCCGCTTCTGGTCCTTTGGTGGACTACCTATGGATGCTCATCCT 4 51 GGGCTTCATTATTGCATTTGTCTTGGCATTCTCCGTGGGAGCCAATGATG

   ----_r----4.----_f----4-----_f----4-----₁----4-----_f----4.

   501 TAGCAAATTCTTTTGGTACAGCTGTGGGCTCAGGTGTAGTGACCCTGAAG 551 CAAGCCTGCATCCTAGCTAGCATCTTTGAAACAGTGGÇCTCTGTCTTACT 601 GGGGGCCAAAGTGAGCGAAACCATCCGGAAGGGCTTGATTGACGTGGAGA 651 TGTACAACTCGACTCAAGGGCTACTGATGGCCGGCTCAGTCAGTGCTATG 701 TTTGGTTCTGCTGTGTGGCAACTCGTGGCTTCGTTTTTGAAGCTCCCTAT

   ----_f----4-----_f----4-----_t----4-----₁----4.----_f----47 51 TTCTGGAACCCATTGTATTGTTGGTGCAACTATTGGTTTCTCCCTCGTGG 801 CAAAGGGGCAGGAGGGTGTCAAGTGGTCTGAACTGATAAAAATTGTGATG 851 TCTTGGTTCGTGTCCCCACTGCTTTCTGGAATTATGTCTGGAATTTTATT 901 CTTCCTGGTTCGTGCATTCATCCTCCATAAGGCAGATCCAGTTCCTAATG 951 GTTTGCGAGCTTTGCCAGTTTTCTATGCCTGCACAGTTGGAATAAACCTC

   100

   150

   200

   250

   300

   350

   400

   450

   500

   550

   600

   650

   700

   750

   800

   850

   900

   950

   1000

   -FOLHA 7 (11 FOLHAS)

   FIG. 6 (cont.)

   ----_t -----i-----'-----(-----_f-----p____ _f-----1-----_t----41001 TTTTCCATCATGTATACTGGAGCACCGTTGCTGGGCTTTG ACAAACTTCC 1050 1051 TCTGTGGGGTACCATCCTCATCTCGGTGGGATGTGCAGTTTTCTGTGCCC 1100 1101 TTATCGTCTGGTTCTTTGTATGTCCCAGGATGAAGAGAAAAATTGAACGA 1150 1151 GAAATAAAGTGTAGTCCTTCTGAAAGCCCCTTAATGGAAAAAAAGAATAG 12 00 12 01 CTTGAAAGAAGACCATGAAGAAACAAAGTTGTCTGTTGGTGATATTGAAA 1250

   ----_t----4_--------4-----_f----4.----_t-----(-----_f----412 51 ACAAG CATCCTGTTTCTGAGGTAGGGCCTGCCACTGTGCCCCTCCAGGCT 13 00 1301 GTGGTGGAGGAGAGAACAGTCTCATTCAAACTTGGAGATTTGGAGGAAGC 13 50

   13 51 TCCAG AG AG AGAG AGGCTTCCCAGCGTGGACTTGAAAGAGG AAACCAGC A 14 00 1401 TAGATAGCACCGTGAATGGTGCAGTGCAGTTGCCTAATGGGAACCTTGTC 1450

   14 51 CAGTTCAGTCAAGCCGTCAGCAACCAAATAÀACTCCAGTGGCCACTCCCA 1500

   ----_t----4.----_f----4.-----_f----4.----_f----4.----_t----4.

   1501 GTATCACACCGTGCATAAGGATTCCGGCCTGTACAAAGAGCTACTCCATA 1550 1551 AATTACATCTTGCCAAGGTGGGAGATTGCATGGGAGACTCCGGTGACAAA 1600 1601 CCCTTAAGGCGCAATAATAGCTATACTTCCTATACCATGGCAATATGTGG 1650 1651 CATGCCTCTGGATTCATTCCGTGCCAAAGAAGGTGAACAGAAGGGCGAAG 1700 17 01 AAATGGAGAAGCTGACATGGCCTAATGCAGACTCCAAGAAGCGAATTCGA 17 50

   ----_t-----1-----_f-----1-----'-----1-----'-----1-----_t-----(1751 ATGGACAGTTACACCAGTTACTGCAATGCTGTGTCTGACCTTCACTCAGC 1800 1801 ATCTGAGATAGACATGAGTGTCAAGGCAGCGATGGGTCTAGGTGACAGAA 1850 1851 AAGGAAGTAATGGCTCTCTAGAAGAATGGTATGACCAGGATAAGCCTGAA 1900 1901 GTCTCTCTCCTCTTCCAGTTCCTGCAGATCCTTACAGCCTGCTTTGGGTC 1950 1951 ATTCGCCCATGGTGGCAATGACGTAAGCAATGCCATTGGGCCTCTGGTTG 2000 — ·— — Μ — Η H ·— — Μ H «“· ·— ~ ·“ ·— «“ — — «— “

   2001 CTTTATATTTGGTTTATGACACAGGAGATGTTTCTTCAAAAGTGGCAACA 2050 2051 CCAATATGGCTTCTACTCTATGGTGGTGTTGGTATCTGTGTTGGTCTGTG 2100 2101 GGTTTGGGGAAGAAGAGTTATCCAGACCATGGGGAAGGATCTGACACCGA 2150 2151 TCACACCCTCTAGTGGCTTCAGTATTGAACTGGCATCTGCCCTCACTGTG 2200 2 201 GTGATTGCATCAAATATTGGCCTTCCCATCAGTACAACACATTGTAAAGT 2250

   ----_f----4.----₁----+----₁----4.----_f----4-----,----+

   2251 GGGCTCTGTTGTGTCTGTTGGCTGGCTCCGGTCCAAGAAGGCTGTTGACT 2300 2301 GGCGTCTCTTTCGTAACATTTTTATGGCCTGGTTTGTCACAGTCCCCATT 2350

   FOLHA 8 (11 FOLHAS)

   FIG. 6 (contJ

   TCTGGAGTTATCAGTGCTGCCATCATGGCAATCTTCAGATATGTCATCCT 2400 CAGAATGTGAAGCTGTTTGAGATTAAAATTTGTGTCAATGTTTGGGACCA 2450 TCTTAGGTATTCCTGCTCCCCTGAAGAATGATTACAGTGTTAACAGAAGA 2500

   ----,-----1-----_t-----1-----,-----1-----,-----1-----'-----μ

   CTGACAAGAGTCTTTTTATTTGGGAGCAGAGGAGGGAAGTGTTACTTGTG 2550 CTATAACTGCTTTTGTGCTAAATATGAATTGTCTCAAAATTAGCTGTGTA 2600 AAATAG CCCGGGTTCCACTGGCTCCTGCTGAGGTCCCCTTTCCTTCTGGG 2650 CTGTGAATTCCTGTACATATTTCTCTACTTTTTGTATCAGGCTTCAATTC 2700 CATTATGTTTTAATGTTGTCTCTGAAGATGACTTGTGATTTTTTTTTCTT 2750

   ----'----+----_;----₊----,----₊----_f----+----,----₊

   TTTTTTAAACCATGAAGAGCCGTTTGACAGAGCATGCTCTGCGTTGTTGG 2800 TTTCACCAGCTTCTGCCCTCACATGCACAGGGATTTAACAACAAAAATAT 2850 AACTACAACTTCCCTTGTAGTCTCTTATATAAGTAGAGTCCTTGGTACTC 2900 TGCCCTCCTGTCAGTAGTGGCAGGATCTATTGGCATATTCGGGAGCTTCT 2950 TAGAGGGATGAGGTTCTTTGAACACAGTGAAAATTTAAATTAGTAACTTT 3000

   ----_f----J-----_f----q-----_f---------,-----|-----_t-----l·

   TTTGCAAGCAGTTTATTGACTGTTATTGCTAAGAAGAAGTAAGAAAGAAA 3050 AAGCCTGTTGGCAATCTTGGTTATTTCTTTAAGATTTCTGGCAGTGTGGG 3100 ATGGATGAATGAAGTGGAATGTGAACTTTGGGCAAGTÍAAATGGGACAGC 3150 CTTCCATGTTCATTTGTCTACCTCTTAACTGAATAAAAAAGCCTACAGTT 3200 TTTAGAAAAAA 3220

   FOLHA 9

   FOLHAS)

   IX

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   FOLHA 10

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   FIG. 7 (cont.)

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