PT95072A

PT95072A - Processo para a preparacao de polipeptideos cd4 de primatas nao humanos, moleculas cd4 humanas capazes de glicosilacao, seus fragmentos, suas proteinas de fusao, sequencias geneticas e sua utilizacao

Info

Publication number: PT95072A
Application number: PT95072A
Authority: PT
Inventors: Brian Seed; David Camerini
Original assignee: Gen Hospital Corp
Priority date: 1989-08-23
Filing date: 1990-08-22
Publication date: 1991-05-22
Also published as: DK0414178T3; DE69029294D1; JPH05500611A; US5420264A; AU648041B2; FI920658A0; EP0414178A3; GR3022039T3; EP0414178B1; KR927003613A; DE69029294T2; EP0414178A2; AU6429590A; CA2065010A1; ES2097121T3; WO1991002743A1; ZA906246B; ATE145938T1; IE903043A1

Description

CAMPO DO INVENTO

Este invento situa-se no campo da genética recombinante e composições farmacêuticas.

FUNDAMENTO DO INVENTO

Os vírus da imunodeficiência humana e símia HIV e SIV são os agentes causadores do Síndroma da Imunodeficiência Adquirida (AIDS) e Síndroma da Imunodeficiência Símia, (SIDS) respec-tivamente. Ver Curren, J. et al.. Science 329:1359-1357 (1985);

Weiss, R. et al.. Nature 324:572-575 (1986). O vírus HIV contem uma glicoproteína do invólucro, gpl20 que se liga à proteína CD4 presente na superfície de linfócitos T auxiliares, macrófagos e outras células. Dalgleish et al.. Nature. 312;763 (1984). Após a ligação de gpl20 a CD4, a entrada do vírus é facilitada por uma fusão mediada pelo invólucro das membranas virai e da célula alvo.

No decurso da infecção, o organismo hospedeiro desenvolve anticorpos contra as proteínas virais, incluindo as principais proteínas do invólucro gpl20 e gp41. Apesar desta imunidade humoral, a doença progride, resultando numa imunosupressão letal caracterizada por múltiplas infecçÕes oportunistas, parasitémia, demência e morte. A incapacidade dos anticorpos do hospedeiro anti-virais para parar a progressão da doença representa um dos aspectos mais vexantes e alarmantes da infecção, e não faz prever êxito para as vacinações baseadas em abordagens convencionais.

Dois factores podem desempenhar um papel importante na ineficácia da resposta humoral aos vírus da imunodeficiência. Primeiro tal como outros vírus de RNA (e retrovírus semelhantes 4 - \ \

em particular), os vírus da imunodeficiência apresentam uma eivada taxa de mutaçSes que a variação antigénica progrida a uma velocidade elevada em resposta à defesa imune do hospedeiro. Segundo, as próprias glicoproteínas do invólucro são moléculas altamente glicosiladas apresentando poucoa epítopos adequados à ligação de anticorpos de elevada afinidade. 0 alvo «móvel» fracamente antigénico que o invólucro virai apresenta, deixa ao hospedeiro pouca oportunidade de restrição da infecção virai pela produção de anticorpos específicos.

As células infectadas pelo HIV expressam a glicoproteí-na gpl20 na sua superfície. Gpl20 medeia as fusões entre células CD4+ através de uma reacção semelhante àquela usada pelo vírus íi&T ti cii ti ttT xxaTOti οητατβ τϊίχ oo et t ot «to ssmti smntBs mmnwiBsasE as nas ama: & lomuao as síncicios está dependente de uma interacção directa da glicopro-teína do invólucro gpl20 com a proteína CD4 . Dalgleish et al.. supra. Klatzmann, D. et al.. Nature 312:763 (1984); McDougal, J.S. et al. Science. 231:382 (1986); Sodroski, J. et al.. Nature. 323:725 (1986); Sodroski, J. et al. Nature 321:412 (1986). A proteína CD4 humana consiste numa região extracelular de 372 aminoãcidos contendo quatro domínios do tipo imunoglobuli-na, um domínio que atravessa a membrana e uma região intracelular carregada de 40 resíduos de aminoácidos. Maddon, P. et al.. Proo.Natl. Acad. Sei. (USA) 84:1649 (1987). A evidência de que a ligação CD4-gpl20 ’é responsável pela infecção virai de células portadoras do antigénio CD4 inclui o facto de se formar um complexo específico entre gpl20 e CD4. McDougal et al.. supra. Outros investigadores que linhas celulares, que não eram infectadas pelo HIV, eram convertidas em linhas celulares infectáveis após transfecção e expressão do gene de i

cDNA de CD4 humano. Maddon et al. . Cell 47.; 333-348 (1986).

Publicações de Pedidos de Patente N2 WO 88/01304 (1988) e Ψ089/01940 (1989) descreve que formas solúveis de CD4 humano compreendendo domínios de ligação do tipo imunoglobulina são úteis para o tratamento ou profilãxia de infecções pelo HIV.

Ao contrário da maioria das interacções anticorpo-invólucro, a interacção receptor-invólucro é caracterizada por uma 8 associação imutável de elevada afinidade (k ~ 10 1/mole) a

Ainda, a afinidade do vírus para CD4 humano é pelo menos três ordens de grandeza superior à afinidade de CD4 humano para o seu ligando endógeno putativo, os antigénios MHC classe II, Vários investigadores descreveram métodos para a preparação de proteínas híbridas. Por exemplo, Murphy, Patente dos Estados Unidos 4,675,382 (1987), descreve a utilização de técnicas de DNA recombinante para fazer moléculas de proteína híbridas através da formação do gene fundido pretendido codificador de uma proteína híbrida da toxina da difteria e um ligando polipeptídico como seja uma hormona, seguido da expressão do gene fundido.

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Muitos investigadores prepararam anticorpos monoclonais (Mabs) por técnicas de DNA recombinante. Os anticorpos monoclonais são moléculas altamente específicas muito bem caracterizadas na estrutura primária e terciária. Eles têm sido largamente usados na caracterização imunoquímica e quantificação de antigénios. Os genes das cadeias pesadas e leves foram introduzidos em hospedeiros adequados e expressos, seguido de reagregação das cadeias individuais em moléculas de anticorpos funcionais (ver, por exemplo, Munro, Nature 312:597 (1984); Morrison, S.L., Science 229:1202 (1985); Oi et al. . Biotechniaues 4.:214 (1986); Wood et al. Nature 314:446-449 (1985)). As regiões variáveis das 6 - V \ «

cadeias leve e pesada foram clonadas e expressas em hospedeiros estranhos em que elas mantiveram a sua capacidade de ligação (Moore et al.. Pedido de Patente Europeia 0088994 (publicado em 21 de Setembro, 1983)),

Também foram preparados anticorpos quiméricos ou híbridos por técnicas de DNA recombinante. Oi e Morrison, Biotechniques 4.:214 (1986) descrevem uma estratégia para a produção de tais anticorpos quiméricos que incluem um anticorpo quimérico humano IgG anti-leu3

Gascoigne, N.R.J., et al., Proc. Natl. Acad. Sei. (USA) 84.:2936-2940 (19879 descrevem a preparação de uma construção genética quimérica contendo um domínio variável (V) da cadeia α do receptor de células T e a sequência codificadora da região constante (C) de uma molécula de imunoglobulina gama 2a. As células transfectadas com o gene quimérico sintetizam um produto proteico que expressa imunoglobulina e determinantes antigénicos do receptor das células Tassim como sítios de ligação à proteína A. Esta proteína associa-se a uma cadeia lambda normal para formar uma molécula de imunoglobulina tetramérica aparentemente normal (HgLg, em que H=pesado e L=leve) que é secretada.

Sharon, J., et al. Nature 309:54 (1984), descreve a construção de um gene quimérico codificador da região variável (V) de uma cadeia pesada de ratinho específica do hapteno azofe-nilarsonato e da região constante (C) de uma cadeia leve Kapa (ν^κ)· Este gene foi introduzido numa linha celular de mieloma de ratinho. 0 gene quimérico foi expresso para dar uma proteína que associada com cadeias leves foi secretada pela linha celular de mieloma para dar uma molécula de anticorpo específica de azofenilarsonato. 7 - \ i \

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Morrison, Science 229:1202 (1985), descreve que as regiões variáveis das cadeias leves e pesadas podem ser ligadas a uma sequência que não seja Ig para criar proteínas de fusão. Este artigo descreve que as potenciais utilizações para as proteínas de fusão são três: (1) ligar o anticorpo específicamente a enzimas para usar em ensaios; (2) para isolar proteínas não-Ig em colunas de antigénio; e (3) libertar específicamente agentes tóxicos. Técnicas recentes para a introdução estável de genes de imunoglobulinas em células de mieloma (Banerji, et al., Cell 33.5729-740 (1983); Potter, H., Proc. Natl. Acad. Sei. (USA) 81:7161-7165 (1984)), acopladas ã informação estrutural detalhada, permitiram a utilização de métodos de DNA in vitro tais como mutagénese, para gerar anticorpos recombinantes possuindo novas propriedades. 0 Pedido de Patente W087/02671 descreve métodos para a produção de anticorpos por engenharia genética com a região variável de especificidade pretendida e propriedades de regiões constantes através de clonagem de genes e expressão de cadeias leves e pesadas. 0 mRNA das linhas de hibridoma de células B clonadas que produziram anticorpos monoclonais da especificidade pretendida foi isolado por clonagem de cDNA. A geração de sequências codificadoras de cadeias leve e pesada é conseguida por remoção das regiões variáveis clonadas e sua ligação a vectores módulo das cadeias leve e pesada. Isto dá sequências de cDNA que codificam cadeias de imunoglobulina. A ausência de intrões permite que estas sequências de cDNA sejam expressas em hospedeiros procarióticos, tais como bactériasou em hospedeiros eucarió-ticos inferiores, tais como leveduras.

A geração de anticorpos quiméricos em que a fracção de ligação ao antigénio da imunoglobulina é fundida com outras fracçÕes foi demonstrada. Exemplos de genes de que não sejam de imunoglobulina fundidos a anticorpos incluem nuclease de Staphylococcus aureus. o oncogene de ratinho c-myc e o fragmento Klenow da DNA-polimerase I de E. coli (Neuberger, M.S., et al. Nature 312:604-612 (1984); neuberger, M.S., Trends in Biochemical Science. 347-349 (1985)). Pedido de Patente Europeia 120,694 descreve a manipulação de engenharia genética das regiões constante e variável de uma molécula de imunoglobulina que é expressa em células hospedeiras de E. coli. É ainda descrito que a molécula de imunoglobulina pode ser sintetizada por uma célula hospedeira com uma outra fracção peptídica ligada a um dos domínios constantes. Tais fracções peptídicassão descritas como citotóxi-cas ou enzimáticas. 0 pedido e os exemplos descrevem a utilização de uma cadeia tipo lambda derivada de um anticorpo monoclonal que se liga a haptenos de 4-hidroxi-3-nitrofenilo (NP). 0 Pedido de Patente Europeia 125,023 está relacionado com a utilização de técnicas de DNA recombinante para produzir moléculas de imunoglobulina que são quiméricas ou modificadas de outro modo. Uma das utilizações descritas para estas moléculas de imunoglobulina é no diagnóstico e tratamento do corpo em geral pela injecção dos anticorpos dirigidos a tecidos alvo específicos. A presença da doença pode ser determinada pela ligação de uma marca adquada aos anticorpos ou o tecido doente pode ser atacado por anticorpos ligados a uma droga adequada. 0 pedido de patente descreve anticorpos modificados de modo a ajudar a libertação específica de um agente como 4(anticorpos alterados^. 0 Pedido de Parente PCT W083/101533 descreve anticorpos quiméricos em que a região variável de uma molécula de imunoglobulina está ligada a uma fracção de uma segundfa proteína que pode compreender a fracção activa de uma enzima.

Boulianne et al.. Nature 312:643 (1984) construiu um gene de imunoglobulina em que os segmentos de DNA que codificam a regiões variáveis de ratinho específicas para o hapteno trinitro-fenol (TNP) são ligados a segmentos que codificam regiões mu e kapahumanas. Estes genes quiméricos foram expressos para dar IgM quimérica funcinais de ligação a TNP.

Morrison et al.. P.N.A.S. (USA) 81:6851 (1984), descreve uma molécula quimérica que utiliza exões da região variável da cadeia pesada de uma proteína G de mieloma anti-fosforilcolina, que foram ligados aos exões de um dos genes da cadeia leve kapa humana. Os genes foram usados para transfectar linhas celulares de mieloma de ratinho, gerando células transformadas que produziram IgG quimérica ratinho-humano com função de ligação a antigé-nio. 0 Pedido de Patente PCT N2 W089/02922 (1989), descreve moléculas de anticorpos quiméricas compreendendo CD4 humano. Tais moléculas de anticorpo quiméricas podem ser administradas a um indivíduo infectado com HIV para tratar a infecção por HIV.

Apesar do progresso conseguido na determinação do mecanismo da infecção por HIV, continua a existir a necessidade de métodos de tratamento de infecções virais por HIV.

SUMARIO DO INVENTO O invento está relacionado com uma molécula de ácido nucleico especificando CD4 de primata não humano ou um seu fragmento de ligação a gpl20 de HIV ou de SIV.

Em particular, o invento está relacionado com uma molécula de ácido nucleico que especifica CD4 de macaco rhesus compreendendo a seguinte sequência de DNA: J ATGAACCGGGGAATCCCTTTTAGGCACTTGCTTCTGGTGCTGCAACTGGCGCTACTCCCA -25 MetAsnArgGlylleProPheArgHi sLeuLeuLeuValLeuGlnLeuAlaLeuLeuPro GCAGTCACCCAGGGAAAGAAAGTGGTGCTGGGCAAGAAAGGGGATACAGTGGAACTGACC 120 AI aVal ThrGl nGlyLysLysVal Vai LeuGly LysLysGlyAspThrVal G1 uLeuThr 15 121 TGTÀCAGCTTCGCÁGAAGAAGAACACACAATTCCACTGGAAAAÁCTCCAACCAGATAAAG 16 CysThrAlaSerGlnLysLysAsnThrGlnPheHisTrpLysAsnSerAsnGlnlleLys ATTCTGGGAATTCAGGGTCTCTTCTTAACTAAAGGTCCATCCAAGCTGAGCGATCGTGCT 240 IleLeuGlylleGlnGlyLeuPheLeuThrLysGlyProSerLysLeuSerAspArgAla 55 241 GACTC AAG AÁAAAGCCTTTGGGACCAAGGÂTGCTTTTCCAT GAT CAT CAAGAAT CTTAAG 56 AspSerArgLysSerLeuTrpAspGlnGlyCysPheSerMetllelleLysAsnLeuLys ÂTAGAAGACTCAGATACTTACATCTGTGAÀGTGGAGAACÀAGAAGGAGGÀgGTGGAATTG 360 II eGl uAspSerAspThrTyrll eCysGl uVal G1 uAsnLysLysGl uGl uVal G1 uleu 95 361 CTGGTGTTCGGATTGACTGCCAACTCTGACACCCACCTGCTTGAGGGGCAAAGCCTGACC 96 LeuVal PheGlyLeuThrAl aAsnSerAspThrHi sLeuLeuGl uGlyGl nSerLeuThr CTGACCTTGGÁGAGCCCCCCTGGTAGTAGCCCCTCAGTGÁAATGTAGGAGTCCAGGGGGT 480 LeuThrLeuGluSerProProGlySerSerProSerValLysCysArgSerProGlyGly 135 481 AAAAACATACAGGGGGGGAGGACCATCTCTGTGCCTCAGCTGGAGCGCCAGGATAGTGGC 136 LysAsnlleGlnGlyGlyArgThrlleSerValProGlnLeuGluArgGlnAspSerGly ACCT GGACAT GCACCGTCT CGCAGGACCAGAAGACGGTGGAGTT C AAAATAGAC ATCGT G 600

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O invento também está relacionado com uma molécula de ácido nucleico especificando CD4 de chimpanzé, compreendendo a seguinte sequência de DNA: 1 AT G AACCGGGGAGT CCCTTTT A6GC ACTT GCTT CT GGTGCT GC AACT 6GC ACTCCTCCC A -25 MetAsnArgGlyValProPheArgHisLeuLeuLeuValLeuGlnLeuAlaLeuLeuPro GCAGCCACTCAGGGAAAGAÀAGTGGTGCTGGGCAAGAAAGGGGACACAGTGGAACTGACC 120 AI aAl aThrGl nGlyLysLysVal Vai LeuGlyLysLysGl yAspThrVal G1 uLeuThr 15 121 T GTACAGCTTCCCAGAAGAAGAGCATACAATTCC ACT GGAAAAACTCCAACCAGACAAAG 16 CysThrAl aSerGl nLysLysSerll eGl nPheHi sTrpLysAsnSerAsnGl nThrLys ATTCTGGGAÁATCAGGGCTCCTTCTTAACTAAAGGTCCATCCAAGCTGAÁTGATCGCGTT 240 II eLeuGlyAsnGl nGlySerPheLeuThrLysGlyProSerLysLeuAsnAspArgVal 55 241 gactcaagaàgaagcctttgggaccaaggÀaactttaccctgatcatcaÁgaatcttaag 56 AspSerArgArgSerLeuTrpAspGlnGlyAsnPheThrLeuIlelleLysAsnLeuLys ATAGAAGACTCAGATACTTÂCATCTGTGAÂgTGGGGGACCAGAAGGAGGÀGGTGCAATTG 360 IIeGluAspSerAspThrTyrlleCysGluValGlyAspGlnLysGluGluValG1nLeu 95 361 CTAGTGTTCGGATTGACTGCCAACTCTGACACCCACCTGCTTCAGGGGCAGAGCCTGACC 96 LeuValPheGlyLeuThrAlaAsnSerAspThrHisLeuLeuGlnGlyGlnSerLeuThr CTGACCTTGGAGAGCCCCCCTGGTAGTAGCCCCTCAGTGCAATGTAGGAGTCCAAGGGGT 360 LeuThrLeuGluSerProProGlySerSerProSerValGlnCysArgSerProArgGly 135 481 AAAAACATACAGGGGGGGAAGACCCTCTCCGTGTCTCAGCTGGAGCTCCAGGATAGTGGC 136 LysAsnlleGlnGlyGlyLysThrLeuSerValSerGlnLeuGluLeuGlnAspSerGly ACCTGGACATGCACTGTCTTGCAGAACCAGAAGAAAGTGGAGTTCAAAATAGACATCGTG 600 ThrTrpThrCysThrValLeuGlnAsnGlnLy sLysValG1uPheLys11eAsp11eVal 175 601 GTGCTAGCTTTCCAGAAGGCCTCCAGCATAGTCTATAAGAAAGAGGGGGAACAGGTGGÀG 176 VaiLeuAlaPheGlnLysAlaSerSerlleValTyrLysLysGluGlyGluGlnValG1u ttctccttcccactcgcctttacagttgaÂaagctgacgggcagtggcgàgctgtggtgg 720

PheSerPheProLeuAlaPheThrValGluLysLeuThrGlySerGlyGluLeuTrpTrp 215 721 CAGGCGGAGÁGGGCTTCCTCCTCCAAGTCTTGGATCACCTTTGACCTGAÂGAACAAGGAÀ 216 G1nAlaGluArgAlaSerSerSerLysSerTrpIleThrPheAspLeuLysAsnLysGlu GTGTCTGTAÂAACGGGTTACCCAGGACCCTAAGCTCCAGÂtGGGCAAGAÁgCTCCCGCTC 840 ValSerValLysArgValThrGlnAspProLysLeuGlnMetGlyLysLysLeuProLeu 255 841 CACCTCACCCTGCCCCAGGCCTTGCCTCAGTATGCTGGCTCTGGAAACCTCACCCTGGCC 256 HisLeuThrLeuProGlnAlaLeuProGlnTyrAlaGlySerGlyAsnLeuThrLeuAla CTT GAAGCGÀAAACAGGAAÂgTT GCAT CAGGAAGT GAACCTCGT GGT GAT GAGAGCCACT 840

LeuGluAlaLysThrGlyLysLeuHisGl nGluValAsnLeuValValMetArgAlaThr 295 961 CAGCTCCAGÀAAAATTTGACCTGTGAGGTGTGGGGACCCÀcCTCCCCTAÁgCTGATGCTG 296 G1 nLeuGl nLysAsnLeuThrCysGl uValTrpGlyProThrSerProLysLeuHetLeu AGCTTGAAACTGGAGAACAÁGGAGGCAAAGGTCTCGAAGCGGGAGAAGGCGGTGTGGGTG 1080 SerLeuLysLeuGluAsnLysGluAlaLysValSerLysArgGluLysAlaValTrpVal 335 1081 CTGAACCCTGAGGCGGGGATGTGGCAGTGTCTGCTGAGTGACTCGGGACÁGGTCCTGCTG 336 LeuAsnProGluAlaGlyMetTrpGlnCysLeuLeuSerAspSerGlyGlnValLeuLeu GAATCCAACÁTCAAGGTTCTGCCCACATGGTCCACCCCGGTGCAGCCAATGGCCCTGATT 1200 G1uSerAsnI1eLysValLeuProThrTrpSerThrProValG1nProHetAlaLeuI1e 375 1201 GTGCTGGGGGGCGTCGCCGGCCTCCTGCTTTTCATTGGGCTAGGCATCTTCTTCTGTGTC 376 ValLeuGlyGlyValAlaGlyLeuLeuLeuPhelleGlyLeuGlyllePhePheCysVal AGGTGCCGGCACCGAAGGCGCCAAGCACAGCGGATGTCTCÁGATCAAGAGÀCTCCTCAGT* 1320 ArgCysArgHi sArgArgArgGlnAlaGlnArgMetSerGlnlleLysArgLeuLeuSer 415 1321 GAGAAGAAGÀCCTGCCAGTGCCCTCACCGGTTTCAGAAGÀCATGTAGCCCCATTTGA 1377 416 G1uLysLysThrCysGlnCysProHisArgPheGlnLysThrCysSerProIIeEnd 433 ou uma sua sequência degenerada. 15

0 invento também está relacionado com uma molécula de ácido nucleico especificando um fragmento solúvel de CD4 de chimpanzé (domínio I) que se liga a gpl20 de HIV ou de SIV, compreendendo a seguinte sequência de DNA: 1 ATGAACCGGGGAGTCCCTTTTAGGCACTTGCTTCTGGTGCTGCAACTGGCACTCCTCCCA -25 MetAsnArgGlyValProPheArgHisLeuLeuLeuValLeuGlnLeuAlaLeuLeuPro GCAGCCACTCAGGGAAAGAAAGTGGTGCTGGGCAAGAAAGGGGACACAGTGGAACTGACC 120 AlaAlaThrGlnGlyLysLysValValLeuGlyLysLysGlyAspThrValGluLeuThr 15 121 tgtacagcttcccagaagaàgagcatacaáttccactggÁaaaactccaaccagacaaag 16 CysThrAlaSerGlnLysLysSerlleGlnPheHisTrpLysAsnSerAsnGlnThrLys ATTCTGGGAAATCAGGGCTCCTTCTTAACTAAAGGTCCATCCAAGCTGAATGATCGCGTT 240 IleLeuGlyAsnGlnGlySerPheLeuThrLysGlyProSerLysLeuAsnAspArgVal 55 241 GACTC AAGAÂGAAGCCTTTGGGACCAAGGÂAACTTT AC CCTGAT CAT CAAGAATCTTAAG 56 AspSerArgArgSerLeuTrpAspGlnGlyAsnPheThrLeuIlelleLysAsnLeuLys ATAGAAGACTCAGATACTTÂCATCTGTGAÂGTGGGGGACCAGAAGGAGGÁGGTGCAATTG 360 IleGl uAspSerAspThrTyrll eCysGl uVal GlyAspGl nLysGl uGl uVal G1 nLeu 95 361 CTAGTGTTCGGATTGACTGCCAACTCTGACACCCACCTGCTT 96 LeuValPheGlyLeuThrAlaAsnSerAspThrHi sLeuLeu ou uma sua variante degenerada. 16 16

0 invento também está relacionado com uma molécula de ácido nucleico especificando CD4 de chimpanzé com o domínio citoplasmático, compreendendo a seguinte sequência de DNA: 1 ATGAACCGGGGAGTCCCTTTTAGGCACTTGCTTCTGGTGCTGCAACTGGCACTCCTCCCA -25 MetAsnArgGlyValProPheArgHisLeuLeuLeuValLeuGlnLeuAlaLeuLeuPro GCAGCCACTCAGGGAAAGAAAGTGGTGCTGGGCAAGAAAGGGGACACAGTGGAACTGACC 120 AlaAlaThrGlnGlyLysLysValValLeuGlyLysLysGlyAspThrValGluLeuThr 15 121 TGTACAGCTTCCCAGAAGAAGAGCATACAATTCCACTGGAAAAACTCCAACCAGAYAAAG 16 CysThrAlaSerGlnLysLysSerlleGlnPheHi sTrpLysAsnSerAsnGInThrLys

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Ala 241 gactcaagaágaagcctttgggaccaaggàaactttmccctgatcatcaÂgaatcttaag 56 AspSerArgArgSerLeuTrpAspGlnGlyAsnPheThrLeuIlelleLysAsnLeuLys

Pro ATAGAAGACTCAGATACTTÁCATCTGTGAÀGTGGGGGACCAGAAGGAGGÀGGTGCAATTG 360 II eGl uAspSerAspThrTyr II eCysGl uVal GlyAspGl nLysGl uGl uVal G1 nLeu 95 361 CT AGT GTT CGGATT 6ACT GCC AACT CT 6AC ACCC ACCT GCTT C AGGGGC AG AGCCT GACC 96 LeuVal PheGlyLeuThrAl aAsnSerAspThrHi sLeuLeuGl nGlyGI nSerleuThr CT GACCTTGGAGAGCCCCCCT GGTAGT AGCCCCT CAGTGC AAT GTAGGAGTCCAAGGGGT 360

LeuThrLeuGl uSerProProGlySerSerProSerVal G1 nCysArgSerProArgGly 135 481 AAAAACATACAGGGGGGGAAGACCCTCTCCGTGTCTCAGCTGGAGCTCCAGGATAGTGGC 136 LysAsnlleGlnGlyGlyLysThrLeuSerValSerGlnUuGluLeuGlnAspSerGly ACCTGGACATGCACTGTCTTGCAGAACCAGAAGAAAGTGGAGTTCAAAATAGACATCGTG 600 ThrTrpThrCysThrValLeuGlnAsnGlnLysLysValG1uPheLysI1eAspIleVal 175 601 GTGCTAGCTTTCCAGAAGGCCTCCAGCATAGTCTATAAGAAAGAGGGGGAACAGGTGGAG 176 VaiLeuAlaPheGlnlysAlaSerSerlleValTyrLysLysGluGlyGluGlnValG1u TTCTCCTTCCCACTCGCCTTTACAGTTGAÁAAGCTGACGGGCAGTGGCGÀGCTGTGGTGG PheSerPheProLeuAlaPheThrValGluLysLeuThrGlySerGlyGluLeuTrpTrp 720 215 721 CAGGCGGAGAGGGCTTCCTCCTCCAAGTCTTGGATCACCTTTGACCTGAAGAACAAGGAA 216 G1nAlaGluArgAlaSerSerSerLysSerTrpIleThrPheAspLeuLysAsnLysGlu GTGTCTGTAÂAACGGGTTACCCAGGACCCTAAGCTCCAGÂTGGGCAAGAÂGCTCCCGCTC VaiSerValLysArgValThrGlnAspProLysLeuGlnMetGlyLysLysLeuProLeu 840 255 841 CACCTCACCCTGCCCCAGGCCTTGCCTCAGTATGCTGGCTCTGGAAACCTCACCCTGGCC 256 HisLeuThrLeuProGlnAlaLeuProGlnTyrAlaGlySerGlyAsnLeuThrLeuAla CTTGAAGCGAAAACAGGAAAGTTGCATCAGGAAGTGAACCTCGTGGTGATGAGAGCCACT LeuGluAlalysThrGlyLysLeuHi sGlnGluValAsnLeuValVaiMetArgAlaThr 840 295 96i cagctccagáaaaatttgacctgtgaggtgtggggacccÂcctcccctaágctgatgctg 296 G1nleuGlnLysAsnLeuThrCysGluValTrpGlyProThrSerProLysLeuMetLeu AGCTTGAAACTGGAGAACAAGGAGGCAAAGGTCTCGAAGCGGGAGAAGGCGGTGTGGGTG SerLeuLysLeuGluAsnLysGluAlaLysValSerLysArgGluLysAlaValTrpVal 1080 335 1081 CT GAACCCT GAGGCGGGGAT GT GGCAGT GTCT GCTGAGT GACTCGGGACAGGTCCTGCTG 336 LeuAsnProGluAlaGlyMetTrpGlnCysLeuLeuSerAspSerGlyGlnValLeuLeu GAATCCAACÁTCAAGGTTCTGCCCACATGGTCCACCCCGGTGCAGCCAATGGCCCTGATT G1uSerAsnlleLysValLeuProThrTrpSerThrProValGlnProMetAlaLeuIle 1200 375 1201 GTGCTGGGGGGCGTCGCCGGCCTCCTGCTTTTCATTGGGCTAGGCATCTTCTTCTGTGTC 376 ValLeuGlyGlyValAlaGlyLeuLeuLeuPhelleGlyLeuGlyllePhePheCysVal 18

AGGTGCCGGCACCGAAGGCGCCAAGCASAGCGGATGTCTCAGATCAAGAGACTCCTCAGT 1320 ArgCy sArgHi sArgArgArgGI nAl aGl nArgMetSerGl nll eLysArgLeuLeuSer 415

Glu 1321 GAGAAGAAGACCTGCC AGT GCCCT CACCGGTTTCAGAAGACAT GT AGCCCCATTT GA 1377 416 G1uLysLysThrCysGlnCysProHi sArgPheGlnLysThrCysSerProIleEnd 433 em que Y é C ou T, M é A ou C e S é C ou G; ou uma sua variante degenerada. 0 invento também está relacionado com uma molécula de ácido nucleico especificando um fragmento CD4 de chimpanzé, compreendendo a seguinte sequência de DNA: 1 AT GAACCGGGGAGTCCCTTTT AGGCACTTGCTTCTGGTGCTGCAACTGGCACTCCTCCCA -25 MetAsnArgGlyValProPheArgHi sLeuLeuLeuValLeuGlnLeuAlaLeuLeuPro GCAGCCACTCAGGGAAAGAAAGTGGTGCTGGGCAAGAAAGGGGACACAGTGGAACTGACC 120 ΑΊ aAlaThrGlnGlyLysLysValVaiLeuGlyLysLysGl yAspThrValG1uLeuThr 15 121 TGTACAGCTTCCCAGAAGAAGAGCATACAATTCCACTGGAAAAACTCCAACCAGAYAAAG 16 CysThrAlaSerGlnLysLysSerlleGlnPheHi sTrpLysAsnSerAsnGlnThrLys

Ala 241 GACTCAAGAÀGAAGCCTTTGGGACCAAGGÂAACTTTMCCCTGATCATCAÂGAATCTTAAG 56 AspSerArgArgSerLeuTrpAspGlnGlyAsnPheThrLeuIlelleLysAsnLeuLys

Pro AT AGAAGACTCAGAT ACTTACATCT GT GAAGTGGGGGACCAG AAGGAGGAGGT GCAATT G 360 IIeGluAspSerAspThrTyrlleCysGluValG1yAspGlnLysGluGluValG1nLeu 95 361 CTAGTGTTCGGATTGACTGCCAACTCTGACACCCACCTGCTT 96 LeuValPheGlyLeuThrAlaAsnSerAspThrHisLeuLeu em que Y é C ou T e M é A ou C; ou uma sua variante degenerada. 20 20

O invento também está relacionado com uma molécula de ácido nucleico especificando uma molécula de ligação a gpl20 capaz de glicosilação que está relacionada com CD4 humana com o domínio citoplasmático, compreendendo a seguinte sequência de DNA: 1 ATGAACCG666A6TCCCTTTTAGGCACTTGCTTCTGGTGCTGCAACTGGCGCTCCTCCCA -25 NetAsnArgGlyVal ProPheArgHisLeuLeuLeuVal LeuGlnLeuAl aLeuLeuPro GCAGCCACTCAGGGAAAGAAAGTGGTGCTGGGCAAAAAAGGGGATACAGTGGAACTGACC 120 AI aAl aThrGl nGl yLysLysVal Vai LeuGlyLysLysGl yAspThrVal G1 uleuThr 15 121 tgtacagcttcccagaagaÂgagcatacaÂttccactggÂaaaactccÀaccagayaaag 16 CysThrAlaSerGlnLysLysSerlleGlnPheHisTrpLysAsnSerAsnGlnThrLys

Ile ATTCTGGGAÀATCAGGGCTCCnCTTAAcfAAAGGTCCATCCAAGCTGAÂTGATCGCGCT 240 11 eLeuGl yAsnGl nGl ySerPheLeuThrLysGl y ProSerLy sLeuAsnAspArgAl a 55 241 GACTCAAGAÂGAAGCCTTTGGGACCAAGGÂAACTTCMCCCTGATCATCAÂGAATCTTAAG 56 AspSerArgArgSerLeuTrpAspGlnGlyAsnPheThrLeuIlelleLysAsnLeuLys

Pro ATAGAAGACTCAGATACTTÁCATCTGTGAÁGTGGAGGACCAGAAGGAGGÀgGTGCAATTG 360 II eGl uAspSerAspThrTyr II eCysGl uVal G1 uAspGl nLysGl uGl uVal G1 nLeu 95 361 CTAGTGTTCGGATTGACTGCCAACTCTGACACCCACCTGCTTCAGGGGCAGAGCCTGACC 96 LeuVal PheGlyLeuThrAl aAsnSerAspThrHi sLeuLeuGl nGlyGI nSerLeuThr CTGACCTTGGAGAGCCCCCCTGGTAGTAGCCCCTCAGTGCAATGTAGGAGTCCAAGGGGT 360 LeuThrLeuGl uSerProProGlySerSerProSerVal G1 nCysArgSerProArgGly 135 481 AAAAACATACAGGGGGGGAÀGACCCTCTCCGTGTCTCAGCTGGAGCTCCÀGGATAGTGGC 136 LysAsnlleGlnGlyGlyLysThrLeuSerValSerGlnLeuGluLeuGlnAspSerGly 600 175 ACCT GG AC AT 6C ACTGT CTT GC AG AACC AGAAG AAGGTGG AGTT C AAAAT AG AC AT CGTG ThrTrpThrCysThrVal LeuGlnAsnGlnLysLysValGluPheLysIleAspIleVal 601 GTGCTAGCTTTCCAGAAGGCCTCCAGCATAGTCTATAAGAAAGAGGGGGAACAGGTGGÁG 176 Vai LeuAl aPheGl nLysAl aSerSerlleValTyrLysLysGl uGlyGl uGlnValG1 u 720 215 ttctccttcccactcgcctttacagttgaÂaagctgacgggcagtggcgÂgctgtggtgg

PheSerPheProLeuAl aPheThrVal G1 uLysLeuThrGl ySerGIyGl uLeuTrpTrp 721 CAGGCGGAGÁGGGCTTCCTCCTCCAAGTCTTGGATCACCTTTGACCTGAÁGAACAAGGAÂ 216 GlnAl aGl uArgAl aSerSerSerLysSerTrpIleThrPheAspLeuLysAsnLysGl u 840 255 GTGTCTGTAÂAACGGGTTACCCAGGACCCTAAGCTCCAGÁTGGGCAAGAÂGCTCCCGCTC Vai SerVal LysArgVal ThrGl nAspProLysLeuGl nMetGlyLysLysLeuProLeu 841 CACCTCACCCTGCCCCAGGCCTTGCCTCAGTATGCTGGCTCTGGAAACCTCACCCTGGCC 256 Hi sLeuThrLeuProGlnAlaLeuProGlnTyrAlaGlySerGlyAsnLeuThrLeuAla 840 295 cttgaagcgâaaacaggaaâgttgcatcaggaagtgaacctggtggtgatgagagccact LeuGl uAl aLysThrGlyLysleuHi sGl nGl uVal AsnLeuVal Vai MetArgAl aThr 961 CAGCTCCAGÂAAAATTTGACCTGTGAGGTGTGGGGACCCÁCCTCCCCTAÂGCTGATGCTG 296 GlnLeuGlnLysAsnLeuThrCysGluValTrpGlyProThrSerProLysLeuMetLeu 1080 335 AGCTTGAAACT GGAGAACAAGGAGGCAAAGGT CTCGAAGCGGGAGAAGGCGGT GT GGGT G SerLeuLysLeuGl uAsnLysGl uAl aLysVal SerLysArgGl uLysAl aVal TrpVal 1081 CTGAACCCTGAGGCGGGGATGTGGCAGTGTCTGCTGAGTGACTCGGGACÁGGTCCTGCTG 336 LeuAsnProGl uAl aGlyMetTrpGl nCysLeuLeuSerAspSerGlyGl nVal LeuLeu 1200 375 GAATCCAACÀTCAAGGTTCTGCCCACATGGTCCACCCCGGTGCAGCCAATGGCCCTGATT G1uSerAsnlleLysValLeuProThrTrpSerThrProValG1nProMetAl aLeuIle 1201 GT GCTGGG6GGCGTCGCCGGCCT CCT GCTTTTCATTGG6CTAGGCAT CTTCTTCTGT GT C 376 Vai LeuGlyGlyValAI aGlyLeuLeuLeuPhelleGlyLeuGlyIIePhePheCysVal AGGTGCCGGCACCGAAGGCGCCAAGCAGAGCGGATGTCTCAGATCAAGAGACTCCTCAGT 1320 ArgCysArgHi sArgArgArgGl nAl aGl uArgMetSerGl nll eLysArgLeuLeuSer 415 1321 GAGAAGAAGACCTGCCAGTGCCCTCACCGGTTTCAGAAGACATGTAGCCCCATTTGA 1377 416 G1 uLysLysThrCysGlnCysProHisArgPheGlnlysThrCysSerProIleEnd 433 em que Y é C ou T e M é A ou C; ou uma sua variante degenerada; com a condição de Y não ser T e M não ser C ao mesmo tempo. 23

0 invento também está relacionado com uma molécula de ácido nucleico especificando uma molécula de ligação a gpl20 capaz de glicosilação que está relacionada com um fragmento de CD4b humano, compreendendo a seguinte sequência de DNA: 1 ATGAACCGGGGAGTCCCTTTTAGGCACTTGCTTCTGGTGCTGCAACTGGCGCTCCTCCCA -25 HetAsnArgGlyVal ProPheArgHi sLeuLeuLeuVal LeuGl nLeuAl aLeuLeuPro GCAGCCACTCAGGGAAAGAAAGTGGTGCTGGGCAAAAAAGGGGATACAGTGGAACTGACC 120 AlaAlaThrGlnGlyLysLysValValLeuGlyLysLysGlyAspThrValGluLeuThr 15 121 tgtacagcttcccagaagaâgagcatacaâttccactggâaaaactccáaccagayaaag 16 CysThrAlaSerGlnLysLysSerIIeGlnPheHisTrpLysAsnSerAsnGInThrLys II e ATTCTGGGAÂATCAGGGCTCCTTCTTAACTAAAGGTCCATCCAAGCTGAÂTGATCGCGCT 240

IleLeuGlyAsnGlnGlySerPheLeuThrLysGlyProSerLysLeuAsnAspArgAla 55 241 gactcaagaÂgaagcctttgggaccaaggÂaacttcmccctgatcatcaÂgaatcttaag 56 AspSerArgArgSerLeuTrpAspGlnGlyAsnPheThrLeuIlelleLysAsnLeuLys

Pro ATAGAAGACTCAGATACTTÂCATCTGTGAÂGTGGAGGACCAGAAGGAGGÂgGTGCAATTG 360 IIeGluAspSerAspThrTyrIIeCysGluValG1uAspGlnLysGluGluValG1nLeu 95 361 CTAGTGTTCGGATTGACTGCCAACTCTGACACCCACCTGCTT 96 LeuValPheGlyLeuThrAlaAsnSerAspThrHisLeuLeu em que Y é C ou T e M é A ou C; ou uma sua variante degenerada; com a condição de YU não ser T e M não ser C simul tânemente. 24

0 invento também está relacionado com uma molécula de ácido nucleico especificando uma proteína de fusão, compreendendo 1) uma molécula de ácido nucleico especificando CD4 de primata não humano ou seu fragmento que se liga a gpl20 de HIV ou SIV e 2) uma molécula de ácido nucleico especificando uma cadeia leve ou pesada de imunoglobulina, em que a molécula de ácido nucleico que especifica a região variável da referida cadeia de imunoglobulina foi substituída com a molécula de ácido nucleico especificando o referido CD4 primata não humano ou seu fragmento. 0 invento também está relacionado com uma molécula de ácido nucleico especificando uma proteína de fusão, compreendendo 1) uma molécula de ácido nucleico especificando CD4 de primata não humano ou umseu fragmento que se liga a gpl20 de HIV ou SIV, ligada a 2) uma molécula de ácido nucleico especificando um polipeptídeo citotóxico. 0 invento também está relacionado com vectores compreendendo as moléculas de ácido nucleico do invento. 0 invento também está relacionado com hospedeiros transformados com os vectores do invento. Em particular, o invento está relacionado com hospedeiros que expressam cadeias leves e pesadas complementares de imunoglobulina juntamente com o produto de expressão da referida molécula de ácido nucleico da proteína de fusão para dar uma molécula tipo imunoglobulina que se liga a gpl20 de HIV ou de SIV. 0 invento também está relacionado com métodos para a produção de CD4 de primata não humano ou seu fragmento que se liga a gpl20 de HIV ou SIV, que se caracteriza por cultura, num meio nutritivo adequado em condições de produção de proteína, de uma estirpe hospedeira transformada com um vector compreendendo uma molécula de ácido nucleico especificando um CD4 de primata não humano ou seu fragmento solúvel que se liga a gpl20 de HIV ou SIV, o referido vector compreendendo ainda sinais de expressão que são reconhecidos pela referida estirpe hospedeira e dirigem a expressão do referido CD4 de primata não humano ou seu fragmento e recuperação do CD4 de primata não humano ou seu fragmento solúvel assim produzido. 0 invento também está relacionado com um método para a produção de uma proteína de fusão compreendendo CD4 de primata não humano ou seu fragmento que se liga a gpl20 e uma cadeia leve ou pesada de imunoglobulina, em que a região variável da cadeia de imunoglobulina foi substituída por CD4 de primata não humano ou seu fragmento que se liga a gpl20 de HIV ou SIV, que se cartacteriza por cultura, num meio nutritivo adequado em condições de produção de proteína, de uma estirpe hospedeira transformada com um vector especificando a a referida proteína de fusão, o referido vector compreendendo ainda sinais de expressão que são reconhecidos pela referida estirpe hospedeira e dirigem a expressão do referido CD4 de primata não humano e recuperação da proteína de fusão assim produzida. 26

Em particular, o invento está relacionado com um método para a preparação de uma molécula do tipo imunoglobulina, em que a referida estirpe hospedeira é uma linha celular de mieloma que produz cadeias leves de imunoglobulina e a referida proteína de fusão compreende uma cadeia pesada de imunoglobulina da classe IgM, IgGl ou IgG3, em que é produzida uma molécula do tipo imunoglobulina compreendendo a referida proteína de fusão. 0 invento também está relacionado com um método para a preparação de uma molécula do tipo imunglobulina, em que o referido hospedeiro produz cadeias pesadas de imunoglobulina da classe IgM, IgGl e IgG3 juntamente com a referida proteína de fusão compreendendo uma cadeia leve de imunoglobulina para dar uma molécula do tipo imunoglobulina que se liga a gpl20 de HIV ou SIV. 0 invento também está relacionado com CD4 de primata não humano substancialmente puro. Em particular, o invento relaciona-se com CD4 de rhesus substancialmente puro compreendendo a seguinte sequência de aminoácidos: 27 27

MetAsnArgGlylleProPheArgHi sLeuLeuLeuValLeuGlnLeuAlaLeuLeuPro AIaValThrGlnGlyLysLysValValLeuGlyLysLysGlyAspThrValGluLeuThr CysThrAlaSerGlnLysLysAsnThrGlnPheHi sTrpLysAsnSerAsnGInlleLys IleLeuGlylleGlnGlyLeuPheLeuThrLysGlyProSerLysLeuSerAspArgAla AspSerArgLysSerLeuTrpAspGlnGlyCysPheSerMetllelleLysAsnLeuLys IleGluAspSerAspThrTyrlleCysGluValG1uAsnLysLysGluGluValG1uLeu LeuValPheGlyLeuThrAlaAsnSerAspThrHi sLeuLeuGl uGlyGlnSerLeuThr LeuThrLeuGluSerProProGlySerSerProSerVal LysCysArgSerProGlyGly LysAsnlleGlnGlyGlyArgThrlleSerValProGlnLeuGluArgGlnAspSerGIy ThrTrpThrCysThrValSerGlnAspGlnLysThrValG1uPheLysI1eAspIleVal VaiLeuAlaPheGlnLysAlaSerSerThrValTyrLysLysGluGlyGluGlnValG1u PheSerPheProLeuAl aPheThrLeuGluLysLeuThrGlySerGlyGluLeuTrpTrp G1nAlaGluArgAlaSerSerSerLysSerTrpIleThrPheAspLeuLysAsnLysGlu VaiSerValLysArgValThrGlnAspProLysLeuGlnMetGly LysLysLeuProLeu HisLeuThrLeuProGlnAlaLeuProGlnTyrAlaGlySerGlyAsnLeuThrLeuAla LeuGluAlaLysThrGlyLysLeuHi sGlnGluValAsnLeuValVaiMetArgAlaThr G1nPheGlnGluAsnLeuThrCysGluValTrpGlyProThrSerProLysLeuThrLeu SerLeuLysLeuGluAsnLysGlyAlaThrValSerLysGlnAlaLysAlaValTrpVal LeuAsnProGluAlaGlyMetTrpGlnCysLeuLeuSerAspSerGlyGlnValLeuLeu GluSerAsnlleLysValValProThrTrpProThrProValGlnProMetAlaLeuIle VaiLeuGlyGlyValAIaGlyLeuLeuLeuPheThrGlyLeuGlyllePhePheCysVal ArgCysArgHi sArgArgArgGlnAlaGluArgMetSerGlnlleLysArgLeuLeuSer G1uLysLysThrCysGlnCysProHi sArgPheGlnLysThrCysSerProIle. 0 invento também está relacionado com CD4 de chimpanzé substancialmente puro compreendendo a seguinte sequência de aminoácidos:

MetAsnArgGlyValProPheArgHi sLeuLeuLeuValLeuGlnLeuAlaLeuLeuPro AI aAl aThrGl nGlyLysLysVal Vai LeuGlyLysLysGlyAspThrVal G1 uLeuThr CysThrAlaSerGlnLysLysSerlleGlnPheHi sTrpLysAsnSerAsnGlnThrLys IleLeuGlyAsnGlnGlySerPheLeuThrLysGlyProSerLysLeuAsnAspArgVal AspSerArgArgSerLeuTrpAspGlnGlyAsnPheThrLeuIlelleLysAsnLeuLys IIeGluAspSerAspThrTyrlleCysGluValGlyAspGlnLysGluGluValG1nLeu LeuValPheGlyleuThrAlaAsnSerAspThrHi sLeuLeuGlnGlyGlnSerLeuThr Le uThrLeuGluSerProProGlySerSerProSerValG1nCy sArgSerProArgGly LysAsnlleGlnGlyGlyLysThrLeuSerValSerGlnLeuGluLeuGlnAspSerGly ThrTrpThrCysThrValLeuGlnAsnGlnLysLysValGluPheLysIleAspIleVal VaiLeuAlaPheGlnLysAlaSerSerIIeValTyrLysLysGluGlyGluGlnValG1u PheSerPheProLeuAlaPheThrValG1uLysLeuThrGlySerGlyGluLeuTrpTrp G1nAlaGluArgAl aSerSerSerLysSerTrpIleThrPheAspLeuLysAsnLysGlu ValSerValLysArgValThrGlnAspProLysLeuGlnMetGlyLysLysLeuProLeu Hi sLeuThrLeuProGlnAlaLeuProGlnTyrAlaGlySerGlyAsnLeuThrLeuAla LeuGluAlaLysThrGlyLysLeuHi sGlnGluValAsnLeuValVai MetArgAlaThr GlnLeuGlnLysAsnLeuThrCysGluValTrpGlyProThrSerProLysLeuMetLeu SerLeuLysLeuGluAsnLysGluAlaLysValSerLysArgGluLysAlaValTrpVal LeuAsnProGluAlaGlyMetTrpGlnCysLeuLeuSerAspSerGlyGlnValLeuLeu G1uSerAsnlleLysValLeuProThrTrpSerThrProValG1nProMetAlaLeuIle VaiLeuGlyGlyValAIaGlyLeuLeuLeuPhelleGlyLeuGlyllePhePheCysVal ArgCysArgHisArgArgArgGlnAlaGlnArgMetSerGlnlleLysArgLeuLeuSer G1uLysLysThrCysGlnCysProHi sArgPheGlnLysThrCysSerProIle; ou o seu derivado glicosado 29

0 invento também está relacionado com uma molécula de CD4 não humano substancialmente puro compreendendo a seguinte sequência de aminoácidos .

MetAsnArgGlyValProPheArgHi sLeuLeuLeuValLeuGlnleuAlaLeuLeuPro AIaAlaThrGlnGlyLysLysValVaiLeuGlyLysLysGlyAspThrValG1uLeuThr CysThrAlaSerGlnLysLysSerlleGlnPheHi sTrpLysAsnSerAsnGln-@-Lys IleLeuGlyAsnGlnGlySerPheLeuThrLysGlyProSerLysLeuAsnAspArg-#-AspSerArgArgSerLeuTrpAspGlnGlyAsnPhe-$-LeuIlelleLysAsnLeuLys IIeGluAspSerAspThrTyrlleCysGluValGlyAspGlnLysGluGluValG1nLeu LeuValPheGlyLeuThrAlaAsnSerAspThrHi sLeuLeuGl nGlyGlnSerLeuThr LeuThrLeuGluSerProProGlySerSerProSerValGlnCysArgSerProArgGly LysAsnlleGlnGlyGlyLysThrLeuSerValSerGlnLeuGluLeuGlnAspSerGly ThrTrpThrCysThrValLeuGlnAsnGlnlysLysValG1uPheLysIleAspIleVal ValLeuAlaPheGlnLysAlaSerSerlleValTyrLysLysGluGlyGluGlnValGlu PheSerPheProLeuAlaPheThrValG1uLysLeuThrGlySerGlyGluLeuTrpTrp G1nAlaGluArgAlaSerSerSerLysSerTrpIleThrPheAspLeuLysAsnLysGlu VaiSerValLysArgValThrGlnAspProLysleuGlnMetGlyLysLysLeuProLeu Hi sLeuThrLeuProGlnAlaLeuProGlnTyrAlaGlySerGlyAsnLeuThrLeuAla LeuGluAlaLysThrGlyLysLeuHi sGlnGluValAsnLeuValVaiMetArgAlaThr GlnLeuGlnLysAsnLeuThrCysGluValTrpGlyProThrSerProLysLeuMetLeu SerLeuLysLeuGluAsnLysGluAlaLysValSerLysArgGluLysAlaValTrpVal LeuAsnProGluAlaGlyMetTrpGlnCysLeuLeuSerAspSerGlyGlnValLeuLeu GluSerAsnlleLysValLeuProThrTrpSerThrProValGlnProMetAlaLeuIle VaiLeuGlyGlyValAIaGlyLeuLeuLeuPhelleGlyLeuGly IIePhePheCysVal ArgCysArgHi sArgArgArgGlnAla-%-ArgMetSerGlnlleLysArgLeuLeuSer G1uLysLysThrCysGlnCysProHi sArgPheGlnLysThrCysSerProIle, em que é Tre ou Ile, -#- é Vai ou Ala, -$- é Tre ou Pro e -%- é Gin ou Glu; ou o seu derivado glicosilado. O invento também está relacionado com uma molécula de ligação a gpl20 relacionada com CD4 não humano, compreendendo a seguinte sequência de aminoácidos:

MetAsnArgGlyValProPheArgHi sLeuLeuLeuValLeuGlnLeuAlaLeuLeuPro AIaAlaThrGlnGlyLysLysValVaiLeuGlyLysLysGlyAspThrValG1uLeuThr CysThrAIaSerGlnLysLysSerIleGlnPheHisTrpLysAsnSerAsnGln-0-Lys IleLeuGlyAsnGlnGlySerPheLeuThrLysGlyProSerLysLeuAsnAspArgAla AspSerArgArgSerLeuTrpAspGlnGlyAsnPhe-$-LeuIleIleLysAsnLeuLys IIeGluAspSerAspThrTyrIIeCysGluValG1uAspGlnLysGluGluValG1nLeu LeuValPheGlyLeuThrAlaAsnSerAspThrHi sLeuLeuGlnGlyGlnSerLeuThr LeuThrLeuGluSerProProGlySerSerProSerValGlnCysArgSerProArgGly LysAsnlleGlnGlyGlyLysThrLeuSerValSerGlnLeuGl uLeuGlnAspSerGly ThrTrpThrCysThrVal LeuGlnAsnGlnLysLysVal G1uPheLysIIeAspIleVal VaiLeuAlaPheGlnLysAlaSerSerlleValTyrLysLysGluGlyGluGlnValGlu PheSerPheProLeuAlaPheThrValG1uLysLeuThrGlySerGlyGluLeuTrpTrp G1nAlaGluArgAlaSerSerSerLysSerTrpIleThrPheAspLeuLysAsnLysGlu VaiSerValLysArgValThrGlnAspProLysLeuGlnMetGlyLysLysLeuProLeu Hi sLeuThrLeuProGlnAlaLeuProGlnTyrAlaGlySerGlyAsnLeuThrLeuAla LeuGluAlaLysThrGlyLysLeuHi sGlnGluValAsnLeuValValMetArgAlaThr G1nLeuGlnLysAsnLeuThrCysGluValTrpGlyProThrSerProLysLeuMetLeu SerLeuLysLeuGluAsnLysGluAlaLysValSerLysArgGluLysAlaValTrpVal LeuAsnProGluAlaGlyMetTrpGlnCysLeuLeuSerAspSerGlyGlnValLeuLeu G1uSerAsnlleLysValLeuProThrTrpSerThrProValG1nProMetAlaLeuIle VaiLeuGlyGlyValAIaGlyLeuLeuLeuPhel1eGlyLeuGlyIIePhePheCysVal ArgCysArgHi sArgArgArgGlnAlaGluArgMetSerGlnlleLysArgLeuLeuSer GluLysLysThrCysGlnCysProHisArgPheGlnLysThrCysSerProIle, em que é Tre ou Ile e é Tre ou Pro; ou o seu derivado glicosilado; com a condição de pelo menos um de —e ser Tre. 31

0 invento também está relacionado com fragmentos de CD4 de primata não humano que se ligam a gpl20 de HIV ou SIV. De preferência tais fragmentos de CD4 de primata não humano são solúveis em solução aquosa.

Em particular, o invento está relacionado com um fragmento solúvel de CD4 que é derivado do macaco rhesus e compreende a seguinte sequeiicia de aroinoácidos:

MetAsnArgGlylleProPheArgHisLeuLeuLeuVal LeuGlnLeuAlaLeuLeuPro AI aValThrGlnGlyLysLysValValLeuGlyLysLysGlyAspThrValGluLeuThr CysThrAlaSerGlnLysLysAsnThrGlnPheHisTrpLysAsnSerAsnGlnlleLys IleLeuGlyneGlnGlyLeuPheLeuThrLysGlyProSerLysLeuSerAspArgAla AspSerArgLysSerLeuTrpAspGlnGlyCysPheSerMetllelleLysAsnLeuLys Π eGluAspSerAspThrTyrlleCysGluValGluAsnLysLysGluGluValG1uLeu LeuValPheGlyLeuThrAlaAsnSerAspThrHi sLeuLeu. 0 invento está também relacionado com um fragmento solúvel de CD4 de chimpanzé compreendendo a seguinte sequência de aminoácidos:

MetAsnArgGlyValProPheArgHi sLeuLeuLeuValLeuGlnLeuAlaLeuLeuPro AIaAlaThrGlnGlyLysLysValVaiLeuGlyLysLysGlyAspThrValG1uLeuThr CysThrAlaSerGlnlysLysSerIIeGlnPheHi sTrpLysAsnSerAsnGlnThrLys IleLeuGlyAsnGlnGlySerPheLeuThrLysGlyProSerLysLeuAsnAspArgVal AspSerArgArgSerLeuTrpAspGlnGlyAsnPheThrLeuIlelleLysAsnLeuLys IIeGluAspSerAspThrTyrlleCysGluValG1yAspGlnLysGluGluValG1nLeu LeuValPheGlyLeuThrAl aAsnSerAspThrHisLeuLeu. 0 invento está também relacionado com uma molécula de ligação a gpl20 capaz de ser glicosilada compreendendo a seguinte sequência de aminoácidos:

MetAsnArgGlyValProPheArgHi sLeuLeuLeuValLeuGlnLeuAlaLeuLeuPro AIaAlaThrGlnGlyLysLysValVaiLeuGlyLysLysGlyAspThrValG1uLeuThr CysThrAl aSerGl nLysLysSerll eGl nPheHi sTrpLysAsnSerAsnGl n-@-L.ys IleLeuGlyAsnGlnGlySerPheLeuThrLysGlyProSerLysLeuAsnAspArg-#-AspSerArgArgSerLeuTrpAspGlnGlyAsnPhe-$-LeuIleIleLysAsnLeuLys IIeGluAspSerAspThrTyrlleCysGluValGlyAspGlnLysGluGluValG1nLeu LeuValPheGlyLeuThrAlaAsnSerAspThrHi sLeuLeu em que é Tre ou Ile, -#- é Vai ou Ala e -$- é Tre ou Pro; ou o seu derivado glicosilado. 33 0 invento também está relacionado com uma molécula de ligação a gpl20 capaz de ser glicosilada relacionada com fragmentos de CD4 humanos. Em particular, o invento está relacionado com um fragmento de CD4 humano glicosilado compreendendo a seguinte sequência de aminoácidos:

MetAsnArgGlyValProPheArgHi sLeuLeuLeuValLeuGlnLeuAlaLeuLeuPro AIaAlaThrGlnGlyLysLysValVaiLeuGlyLysLysGlyAspThrValG1uLeuThr CysThrAlaSerGlnLysLysSerlleGlnPheHi sTrpLysAsnSerAsnGln-@-Lys IleLeuGlyAsnGlnGlySerPheLeuThrLysGlyProSerLysLeuAsnAspArgAla AspSerArgArgSerLeuTrpAspGlnGlyAsnPhe-$-LeuIIeI1eLysAsnLeuLys Π eGluAspSerAspThrTyrIIeCysGluValG1uAspGlnLysGluGluValG1nLeu LeuValPheGlyLeuThrAlaAsnSerAspThrHi sLeuLeu em que é Tre ou Ile e -$- é Tre ou Pro; ou o seu derivado glicosilado; com a condição de pelo menos um de e -$- ser Tre 34 0 invento também está relacionado com proteínas de fusão, compreendendo CD4 de primata não humano ou moléculas de ligação a gpl20 do invento, ou seus fragmentos de ligação a HIV ou a SIV, ligados a um polipeptídeo citotóxico. 0 invento também está relacionado com uma proteína de fusão compreendendo CD4 de primata não humano ou moléculas de ligação a gpl20 do invento ou seus fragmentos que sejam capazes de se ligar a gpl20 de HIV ou de SIV, ligados ao extremo C de uma segunda proteína que compreende uma cadeia pesada de imunoglobu-lina da classe IgM, IgGl ou IgG3, em que a região variável da referida cadeia pesada de imunoglobulina foi substituída por CD4 ou um seu fragmento de ligação a gpl20 de HIV. 0 invento também está relacionado com uma molécula do tipo imunoglobulina, compreendendo: (1) uma proteína de fusão de CD4 de primata não humano ou um seu fragmento que se liga a gpl20 de HIV ou de SIV e uma cadeia pesada de imunoglobulina, ligado a (2) uma cadeia leve de imunoglobulina. 0 invento também está relacionado com uma proteína de fusão compreendendo CD4 de primata não humano ou moléculas de ligação a gpl20 do invento, ou seus fragmentos que se liguem a gpl20 de HIV ou de SIV, fundidos no extremo C a uma segunda proteína compreendendo uma cadeia leve de imunoglobulina em que a região variável foi eliminada. 0 invento também está relacionado com uma molécula do tipo imunoglobulina compreendendo: 1) uma proteína de fusão de CD4 de primata não humano 35 35

ou molécula de ligação a gpl20 do invento ou seu fragmento que se liga a gpl20 de HIV ou SIV e uma cadeia leve de imunoglobulina, ligada a 2) uma cadeia pesada de imunoglobulina. 0 invento também está relacionado com composições farmacêuticas, compreeendendo 1) uma quantidade terapêuticamente eficaz de CD4 de primata não humano e 2) um veículo farmacêuticamente aceitável. 0 invento também está relacionado com composições farmacêuticas, compreendendo 1) uma quantidade terapêuticamente eficaz de um fragmento solúvel de CD4 não humano e 2) um veículo farmacêuticamente aceitpavel. 0 invento também está relacionado com composições farmacêuticas compreendendo as proteínas, glicoproteínas, proteínas de fusão e moléculas do tipo imunoglobulina do invento. 0 invento também está relacionado com complexos entre CD4 de primata não humano substancialmente puro e gpl20 de HIV ou SIV. 0 invento também está relacionado com complexos compreendendo fragmentos de CD4 não humano do invento e gpl20 de HIV ou SIV. 0 invento também está relacionado com complexos compreendendo as proteínas de fusão e moléculas do tipo imunoglobulina do invento e gpl20 de HIV ou SIV. 0 invento também está relacionado com complexos entre as moléculas de ligação a gpl20 capazes de sofrerem glicosilação e gpl20 de HIV ou de SIV. 0 invento também está relacionado com um método para o tratamento de infecções por HIV ou SIV, caracterizado pela administração a um animal necessitado de tal tratamento de uma quantidade terapêuticamente eficaz de CD4 de primata não humano substancialmente puro ou um seu fragmento solúvel. 0 invento também está relacionado com um método para o tratamento de infecções por HIV ou SIV, caracterizado pela administração a um animal necessitado de tal tratamento de uma quantidade terapêuticamente eficaz de uma das proteínas de fusão do invento. 0 invento também está relacionado com um método para o tratamento de infecções por HIV ou SIV, caracterizado pela administração a um animal necessitado de tal tratamento de uma quantidade terapêuticamente eficaz de moléculas do tipo imunoglo-bulina do invento. 0 invento também está relacionado com um método para o tratamento de infecções por HIV ou SIV, caracterizado pela administração a um animal necessitado de tal tratamento de uma quantidade terapêuticamente eficaz das moléculas de ligação a gpl20 do invento. - 37 - - 37 -

0 invento também está relacionado com um método para a detecção de gpl20 de HIV ou de SIV numa amostra, caracterizado por (a) contacto de uma amostra suspeita de conter gpl20 de HIV ou de SIV com a proteína de fusão ou molécula do tipo imunoglobulina do invento e (b) detecção da formação do complexo 0 invento também está relacionado com um método para a detecção de gpl20 de HIV ou de SIV numa amostra, caracterizado por (a) contacto de uma amostra suspeita de conter gpl20 de HIV ou de SIV com CD4 de primata não humano ou um seu fragmento que seja capaz de se ligar a gpl20 de HIV ou de SIV e (b) detecção da formação do complexo. 0 invento está relacionado com a descoberta de que os primatas não humanos têm CD4 com uma sequência de aminoácidos diferente do CD4 humano. 0 invento também está relacionado com a descoberta de que quando CD4 de primata não humano é expresso na superfície de células humanas, substancialmente menos células gigantes multinucleadas ou sincícios são formados do que quando CD4 humano é expresso na superfície da célula. 0 invento também está relacionado com a descoberta de que a presença de um resíduo glicina na posição 87 em CD4 de primata não humano derivado de chimpanzé, em vez de resíduo de ácido glutâmico tal como se encontra em CD4 humano é responsável pela ausência da formação de síncicios. Como resultadoa a molécula de CD4 derivada de chimpanzé pode agora ser usada em aplicações terapêuticas sem o potencial de causar a formação de síncicios. 0 invento está também relacionado com a descoberta inesperada que CD4 de chimpanzé contem dois sítios de 38

glicosilação (posições 36 e 66 (ASN)). A descoberta permite a preparação de moléculas glicosiladas de ligação a gpl20 e seus fragmentos que se ligam a gpl20 e provavelmente são mais estáveis in vivo. Vantajosamente, as moléculas glicosiladas de ligação a gpl20 e seus fragmentos podem ser administradas menos frequentemente a um animal do que outras moléculas CD4 humanas ou de outros primatas que não sejam glicosiladas. Assim, o invento também está relacionado com moléculas CD4 de primatas (incluindo humanos) tendo um ou mais sítios de glicosilação, por exemplo, a sequência de chimpanzé nos resíduos de aminoácidos 34 e 68, só em 34 e só em 68. 0 invento também está relacionado com outras moléculas de CD4 com sítios de glicosilação noutras posições, desde que a molécula retenha a ligação a gpl20.

DESCRICÂO DE REALIZAÇÕES PREFERIDAS 0 invento é dirigido a moléculas de ácido nucleico especificando CD4 de primata não humano, seua fragmentos de ligação a gpl20 de HIV, seus fragmentos solúveis de ligação a gpl20 de HIV, suas proteínas de fusão e moléculas do tipo imuno-globulina. 0 invento também estás relacionado com moléculas de ligação a gpl20 capazes de serem glicosiladas, seus fragmentos de ligação a gpl20, suas proteínas de fusão e moléculas do tipo imunoglobulina. As moléculas de ácido nucleico do invento pode ser uma molécula de DNA ou de RNA. 0 termo «solúvel^ pretende significar que o fragmento de CD4 é solúvel em soluções aquosas que incluem, mas não estão limitadas a tampões aquosos sem detergentes e fluidos do corpo tais como sangue, plasma e soro. 39

0 invento também é dirigido ã expressão destas novas moléculas de ácido nucleico em hospedeiros transformados para dar proteínas e glicoproteínas. 0 invento também está relacionado com a utilização destas proteínas e glicoproteínas para tratar e diagnosticar infecçÔes pelo HIV.

Em particular, o invento está relacionado com a expressão das referidas moléculas de ácido nucleico, as quais especificam uma proteína de fusão compreendendo uma cadeia leve ou pesada de imunoglobulina, em hospedeiros mamíferos que expressem imuno-"" globulinas de cadeias leves ou pesadas complementares para dar uma molécula do tipo imunoglobulina que se liga a gpl20 de HIV ou de SIV.

As proteínas CD4, glicoproteínas, fragmentos de CD4, proteínas de fusão ou moléculas do tipo imunoglobulina do invento podem ser administradas a um animal para tratamento de infecçães por HIV ou SIV. 0 termo ^infecçôes por HIV» significa a condição de ter AIDS, complexo relacionado com AIDS (ARC) ou sempre que um animal seja portador do vírus AIDS, mas não apresente os sintomas clínicos de AIDS ou ARC. O termo <infecção por SIV» significa a condição de estar infectado com o vírus da imunodeficiência s ímia. 0 termo ^animal» engloba todos os animais que possam beneficiar da administração das proteínas CD4, glicoproteínas, y fragmentos de CD4, moléculas de ligação a gpl20, proteínas de fusãoe moléculas do tipo imunoglobulinado invento. Entre tais animais estão os humanos, no entanto o invento não pretende estar-lhes limitado. 40

O termo «proteína de fusão» significa uma proteína fundida compreendendo uma molécula CD4 do invento ou seu fragmento que seja capaz de se ligar a gpl20, ligada no seu extremo C a uma cadeia de imunoglobulina em que a fracção do extremo N da imunoglobulina foi substituída por CD4 de primata não humano. Como alternativa, a molécula de CD4 ou seu fragmento pode ser ligado a um polipeptídeo citotóxico como seja rícino ou toxina da difteria. 0 termo «primata não humano» significa qualquer membro da subordem Anthropoidea exceptuando a família Hominidae. Tais primatas não humanos incluem a superfamília Ceboidea, a família Cebidae (os macacos do Novo Mundo incluindo os capuchinhos, macacos urradores, macacos-aranha, e macacos-esquilo) e a família Callithricidae (incluindo saguins); a superfamília Cercopitheci-dae (incluindo os macacos, mandris, babuínos, macacos narigudos, macacos monos e os macacos hanumanos sagrados da índia); a superfamília Hominoidae, a família Pongidae (incluindo gibSes, orangotangos, gorilas e chimpanzés). 0 macaco rhesus é um membro dos macacos.

As moléculas de ácido nucleico e proteínas do invento podem ser preparados de acordo com métodos aqui divulgados e de acordo com métodos bem conhecidos de síntese em fase sólida usando as sequências de aminoácidos e de DNA aqui divulgadas.

Como descrito mais detalhadamente nos exemplos abaixo, o resíduo gli na posição 87 de CD4 derivado de chimpanzé difere do resíduo glu presente em CD4 humano que é responsável pela formação de síncicios. Esta descoberta permite a preparação de novas moléculas CD4 que não medeiem a formação de síncicios. Um exemplo de tal proteína relacionada com a molécula CD4 de chimpanzé compreende a seguinte sequência de aminoácidos:

MetAsnArgGlyValProPheArgHi sLeuLeuLeuValLeuGlnLeuAlaLeuLeuPro AIaAlaThrGInGlyLysLysValVaiLeuGlyLysLysGlyAspThrValG1uLeuThr CysThrAlaSerGlnLysLysSerIIeGlnPheHi sTrpLysAsnSerAsnGln-@-Lys IleLeuGlyAsnGlnGlySerPheLeuThrLysGlyProSerLysLeuAsnAspArg-#-AspSerArgArgSerLeuTrpAspGlnGlyAsnPhe-$-LeuIlelleLysAsnLeuLys IIeGluAspSerAspThrTyrlleCysGluValGlyAspGl nLysGluGluValG1nLeu LeuValPheGlyLeuThrAlaAsnSerAspThrHi sLeuLeuGl nGlyGlnSerLeuThr LeuThrLeuGluSerProProGlySerSerProSerVal G1 nCysArgSerProArgGly LysAsnlleGlnGlyGlyLysThrLeuSerValSerGInLeuGl uLeuGlnAspSerGly ThrTrpThrCysThrValLeuGlnAsnGlnLysLysValG1uPheLysIIeAspIIeVal VaiLeuAlaPheGlnLysAlaSerSerI1eValTyrLysLysGluGlyGluGlnValG1u PheSerPheProLeuAlaPheThrValGluLysLeuThrGlySerGlyGluLeuTrpTrp G1nAlaGluArgAlaSerSerSerlysSerTrpIleThrPheAspLeuLysAsnLysGlu VaiSerValLysArgValThrGlnAspProLysLeuGlnMetGl y Lys LysLeuProLeu Hi sLeuThrLeuProGlnAl aLeuProGlnTyrAl aGlySerGlyAsnLeuThrLeuAl a LeuGluAlaLysThrGlyLysLeuHi sGlnGluValAsnLeuValValMetArgAlaThr G1nLeuGlnLysAsnLeuThrCysGluValTrpGlyProThrSerProLysLeuMetLeu SerLeuLysLeuGluAsnLysGluAlaLysValSerLysArgGluLysAlaValTrpVal LeuAsnProGluAlaGlyMetTrpGlnCysLeuLeuSerAspSerGlyGlnValLeuLeu G1uSerAsnIIeLysValLeuProThrTrpSerThrProVal G1nProMetAlaLeu11e ValLeuGlyGlyValAlaGlyLeuLeuLeuPhelleGlyLeuGlyllePhePheCysVal ArgCysArgHisArgArgArgGlnAla-%-ArgMetSerGlnIleLysArgLeuLeuSer G1uLysLysThrCysGlnCysProHi sArgPheGlnLysThrCysSerProIle, em que -e- é Tre ou Ile, é Vai ou Ala, é Tre ou Pro e é Gin ou Glu; ou o seu derivado glicosilado. 42

As moléculas de DNA recombinante que codificam esta família de proteínas e glicoroteínas tem a seguinte sequência:

1 ATGAACCGGGGAGTCCCTTTTAGGCACTTGCTTCTGGTGCTGCAACTGGCACTCCTCCCA GCAGCCACTCAGGGAAAGAAAGTGGTGCTGGGCAAGAAAGGGGACACAGTGGAACTGACC 121 TGTACAGCTTCCCAGAAGAAGAGCATACAATTCCACTGGAAAAACTCCAACCAGAYAAAG ATTCTGGGAAATCAGGGCTCCTTCTTAACTAAAGGTCCATCCAAGCTGAATGATCGCGYT 241 GACT CAAGAAGAAGCCTTTGGGACCAAGGAAACTTTWCCCTGAT CAT CAAGAAT CTTAAG ATAGAAGACTCAGATACTTACATCTGTGAAGTGGGGGACCAGAAGGAGGAGGTGCAATTG 361 CTAGT GTT CGGATT GACTGCCAACT CT GACACCCACCT GCTTCAGGGGCAGAGCCT GACC CTGACCTTGGAGAGCCCCCCTGGTAGTAGCCCCTCAGTGCAATGTAGGAGTCCAAGGGGT 481 AAAAACATACAGGGGGGGAAGACCCTCTCCGTGTCTCAGCTGGAGCTCCAGGATAGTGGC ACCT GGACAT GCACT GT CTT GCAGAACCAGAAGAAAGT GGAGTT CAAAATAGACAT CGTG 601 GT GCTAGCTTT CCAGAAGGCCT CCAGCATAGT CTATAAGAAAGAGGGG GAACAGGT GGAG TTCTCCTTCCCACTCGCCTTTACAGTTGAAAAGCTGACGGGCAGTGGCGAGCTGTGGTGG 721 CAGGCGGAGAGGGCTTCCTCCTCCAAGTCTTGGATCACCTTTGACCTGAAGAACAAGGAA GTGTCTGTAAAACGGGTTACCCAGGACCCTAAGCTCCAGATGGGCAAGAAGCTCCCGCTC 841 CACCTCACCCTGCCCCAGGCCTTGCCTCAGTATGCTGGCTCTGGAAACCTCACCCTGGCC CTTGAAGCGAAAACAGGAAAGTTGCATCAGGAAGTGAACCTCGTGGTGATGAGAGCCACT 961 CAGCTCCAGAAAAATTTGACCTGTGAGGTGTGGGGACCCACCTCCCCTAAGCTGATGCTG AGCTTGAAACTGGAGAACAAGGAGGCAAAGGTCTCGAAGCGGGAGAAGGCGGTGTGGGTG 1081 CTGAACCCTGAGGCGGGGATGTGGCAGTGTCTGCTGAGTGACTCGGGACAGGTCCTGCTG GAATCCAACATCAAGGTTCTGCCCACATGGTCCACCCCGGTGCAGCCAATGGCCCTGATT 1201 GTGCTGGGGGGCGTCGCCGGCCTCCTGCTTTTCATTGGGCTAGGCATCTTCTTCTGTGTC AGGTGCCGGCACCGAAGGCGCCAAGCASAGCGGATGTCTCAGATCAAGAGACTCCTCAGT 1321 GAGAAGAAGACCTGCCAGTGCCCTCACCGGTTTCAGAAGACATGTAGCCCCATTTGA em que Y é C ou T, W é A ou C e S é C ou G; ou uma sua variante degenerada. » 43

Em geral, para a preparação de proteínas de fusão compreendendo uma imunoglobulina, a fracção da imunoglobulina que é eliminada é a região variával, As proteínas de fusão do invento podem compreender também imunoglobulinas em foi eliminado mais do que a região variável e substituido por pela molécula de CD4 ou seu fragmento de ligação a gpl20 de HIV. Por exemplo, as regiões Vjj e CHI de uma cadeia de imunoglobulina podem ser eliminadas. Na prática, qualquer quantidade do extremo N da cadeia pesada de imunoglobulina pode ser eliminada desde que o restante fragmento medeie a morte celular pela função efectora de anticorpos ou outro mecanismo. A sequência mínima necessária para a ligação do complemento inclui os domínios CH2 e CH3. A ligação de fracções Fc pela região de de charneira é vantajoso para o aumento da eficácia da ligação do complemento.

As moléculas de CD4 do invento e as suas proteínas de fusão podem compreender a sequência completa de CD4, a região extracelular de 32? aminoãcidos e o domínio que atravessa a membrana ou só a região extracelular. Ainda, as proteínas de fusão podem compreender fragmentos da região extracelular que retenham a ligação a gpl20 de HIV. 0 domínio extracelular de CD4 consiste em quayro regiões contíguas cada uma sendo semelhante na sequência de aminoácidos e estruturalmente com os domínios variável e de ligação (V-J) das cadeias leves de imunoglobulina assim como com regiões relacionadas noutros membros da superfa-mília de genes das imunoglobulinas. Estas regiões estruturalmente semelhantes de CD4 são designadas domínios , Vg, e V^. Ver Pedido de Patente PCT N2 WO 89/02922 (publicado em 3 de Outubro, 1988). Assim, a CD4 de primata não humano e as suas proteínas de fusão podem compreender qualquer combinação de tais regiães de ligação. Em geral, qualquer fragmento das proteínas e glicopro-teínas CD4 do invento podem ser usadas desde que retenham a capacidade de ligação a gpll20. 44 44

Os fragmentos CD4 de ligação a gpl20 podem ser obtidos cortando a sequência de DNA que codifica CD4 de chimpanzé no sítio Nhe na posição 603 (para dar uma molécula que codifica dois domínios de ligação) ou o sítio BspMl na posição 405 (para dar uma molécula que codifica um domínio). Como alternativa, a molécula de DNA codificadora de CD4 de rhesus pode ser cortada no sítio Nhe na posição 603 (para dar uma molécula que codifica dois domínios) ou no sítio BspMl na posição 405 (para dar uma molécula que codifica um domínio). Podem ser obtidos outros fragmentos usando por exemplo uma exonuclease. 0 fragmento de DNA pode então ser incorporado num vector de clonagem e introduzido num hospedeiro, seguindo-se o despiste do hospedeiro transformado quanto ã presença de uma proteína que se ligue a gpl20. Os métodos para o despiste de clones relativamente a actividade específica de ligação são bem conhecidos dos familiarizados com a matéria. De preferência, tais fragmentos CD4 são solúveis em solução aquosa.

Sempre que a proteína de fusão compreende uma cadeia leve de imunoglobulina, é necessário que se retire à cadeia de Ig apenas o necessário para a formação de um complexo estável com uma cadeia pesada de Ig. Em particular, devem ser preservados os resíduos císteina para a formação de uma ponte dissulfureto tanto na fracção de cadeia pesada como na de leve.

Quando expressa num hospedeiro, e.g., uma célula de mamífero, a proteína de fusão pode associar-se a outras cadeias de Ig leves ou pesadas secretadas pela célula para dar uma molécula do tipo imunoglobulina funcional que é capaz de se ligar a gpl20. a gpl20 pode estar em solução, estar expressa na superfície de células infectadas ou pode estar presente na superfície do próprio vírus HIV. Como alternativa, a proteína de fusão pode ser expressa numa célula de mamífero que não secreta outras 45

cadeias de Ig leves ou pesadas. Quando expressa nestas condições, a proteína de fusão pode formar um homodímero.

Na realização do invento podem ser usadas sequências genómicas ou de cDNA. As sequências genómicas são expressas eficazmente em células de mieloma, uma vez que elas contêm estruturas de promotores nativas.

As regiões constantes do anticorpo clonado e usado na molécula quimérica tipo imunoglobulina podem ser derivadas de qualquer fonte de mamífero.Elas podem ser activas na ligação do complemento ou em ADCC. As regiões constantes podem ser derivadas de qualquer isotipo adequado, incluindo IgGl, IgG3 ou IgM. A ligação dos vários fragmentos de DNA, é efectuada de acordo com técnicas convencionais, empregando extremos cerses ou coesivos na ligação, digestão com enzimas de restrição para proporcionar extremos adequados, preenchimento dos extremos coesivos conforme adequado, tratamento com fosfatase alcalina para evitar ligações indesejáveis e ligação com ligases adequadas. A construção genética pode facultativamente codificar uma sequência líder para permitir expressão eficaz da proteína de fusão. Por exemplo pode ser usada a sequência líder utilizada por Maddon et al . Cel 1 4j2:93-104 (1985) para a expressão de CD4 humano.

Para o isolamento de cDNA, as bibliotecas de cDNA podem ser despistadas, por exemplo, usando uma sonda complementar ou por ensaio da molécula CD4 expressa do invento usando um anticorpo específico de CD4. Os métodos para a preparação de anticorpos por imunização de animais com um antigénio estão descritas, por exemplo, por Kohler e Milstein, Nature (London) 256:495 (1975); Kohler et al. . Eur. J. Immunol 6.:511 (1976); Kohler et al. . Eur. 46

J. Immunol. 6.:292 (1976); ou Hammerl ing et al., em Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas. Elsevier, NY., pp.563-681 (1981). 0 invento está ainda relacionado com anticorpos monoclo-nais e policlonais que sao específicos para as proteínas CD4 não humanas, glicoproteínas do invento e seus fragmentos solúveis e não solúveis. CD4 de primata não humano pode ser derivado de qualquer membro da subordem Anthropoidea exceptuando a família Hominidae. De preferência, CD4 de primata não humano deriva de macaco rhesus ou chimpanzé, se bem que o invento não pretenda estar-lhe limitado. Os familiarizados com a matéria podem obter CD4 de qualquer outra fonte de primatas através do isolamento de RNA poli-A a partir de células mononucleadas do sangue periférico obtidas do animal particular. Após preparação do cDNA por exemplo com transcriptase reversa, o cDNA pode ser ligado num vector de clonagem adequado e usado para transformar um hospedeiro adequado. Os clones podem então ser despistados com um anticorpo monoclonal dirigido contra CD4 de macaco rhesus ou de chimpanzé do invento seguido de selecção dos clones positivos ou por hibridação com os cDNAs de CD4 de chimpanzés ou de rhesus.

Para expressar as moléculas CD4 e as proteínas híbridas de fusão do invento, são necessários sinais de transcrição e tradução reconhecidos por um elemento hospedeiro adequado.Os hospedeiros eucarióticos que podem ser usados incluem células de mamífero susceptíveis de serem cultivadas in vitro. particular-mente leucócitos, mais particularmente células de mieloma ou outros linfócitos transformados ou oncogénicos, e.g., células transformadas com EBV. Com vantagem são usadas células de mamífero para expressar as proteínas CD4 glicosiladas. Como alternativa, podem ser empregues células que não sejam de mamífero, tais como bactérias similares. fungos, e.g., leveduras, fungos filamentosos ou

Os hospedeirospreferidos para a produção de proteínas de fusão são células de mamífero, cultivadas in vitro em cultura de tecidos ou in vivo em animais. As células de mamífero proporcionam modificação pós-tradução às moléculas de proteína imuno-globulina o que confere o enrolamento correcto e glicosilação dos sítios adequados. As células de mamífero que podem úteis como hospedeiros incluem células de origem fibroblástica tais como VERO ou CH0-K1 ou células de origem linfóide, tais como o hibri-doma SP2/0-AG14 ou o mieloma P3x63Sgh e seus derivados. Com a finalidade de preparar uma molécula do tipo imunoglobulina, um plasmídeo contendo um gene que codifica uma cadeia pesada de imunoglobulina, em que a região variável foi substituída por uma das moléculas CD4 do invento, pode ser introduzido, por exemplo, em células de mieloma J558L, um plasmacitoma de ratinho que expressa a cadeia leve lambda-1 mas que não expressa a cadeia pesada (ver Oi et al. . P.N.A.S. (USA) 8():825-829 (1983)). Outros hospedeiros preferidos incluem células COS, células BHK e células de hepatoma. Outros hospedeiros preferidos incluem células COS, células BHK e células de hepatoma.

As construções podem ser ligadas umas ãs outras para formar um único segmento de DNA ou podem ser mantidas como segmentos separados, por eles próprios ou conjuntamente com vectores.

Sempre que a proteína não seja glicosilada, pode ser usado qualquer hospedeiro para expressar a proteína que é compa-t+ível com a replicação e transcrição de sequências no plasmídeo de expressão. Em geral, os vectores contendo sequências de controle da replicação e transcrição derivam de espécies 48

η

compatíveis com a célula hospedeira a ser usada. Normalmente o vector é portador de uma origem de replicação, assim como de genes específicos que são capazes de proporcionar selecção fenotípica em células transformadas. A expressão de moléculas CD4 de primata não humano e de proteínas de fusão pose também ser colocada sob o controle de outras sequências reguladoras que possam ser homólogas para o organismo no seu estado não transformado. Por exemplo, DNA cromossómico de E. coli dependente de lactose ou operão lac que medeia a utilização de lactose ao elaborar a enzima beta-galactosidase. Os elementos de controle lac podem ser obtidos a partir do fago bacteriano lambda plac5 que é infeccioso para E. coli. 0 sistema promotor-operador lac pode ser induzido por IPTG.

Podem igualmente ser empregues outros sistemas promoto-res/operadores ou fracções dele. Por exemplo, podem ser usados colicina EI, galactose, fosfatase alcalina, triptofano, xilose, tax e similares.

Para os hospedeiros mamíferos existem disponíveis para expressão vários sistemas vectores possíveis. Uma classe de vectores utiliza elementos de DNA que derivam de vírus animais tais como vírus de papiloma bovino, vírus polioma, adenovírus, vírus da vacina, baculovírus, retrovírus (RSV, MMTV ou MOMLV) ou vírus SV40. As células que têm estávelmente integrado o DNA nos seus cromossomas podem ser seleccionadas por introdução de uma ou mais marcas que permitam a selecção de células hospedeiras transfectadas. A marca pode proporcionar prototrofia a um hospedeiro auxotrófico, resistência a biocidas, e.g., antibióticos ou metais pesados tais como cobre ou similares. 0 gene da marca seleccionável pode ser ligado directamente às sequências de DNA a serem expressas ou introduzido na mesma célula por cotransforma-ção. Podem ser também necessários elementos adicionais para a 49

síntese óptima de mRNA. Estes elementos podem incluir sinais de «splicing^, assim como promotores, potenciadores e sinais de terminação da transcrição. Os vectores de expressão de cDNA que Possuem tais elementos incluem os descritos por Okayama, H., Mol. Cel. Biol. . .3:280 (1983) e outros.

Uma vez preparado para expressão o vector ou sequência de DNA contendo as construções, as construções de DNA podem ser introduzidas num hospedeiro adequado. Podem ser empregues várias técnicas, tais como fusão de protoplastos, precipitação com fosfato de cálcio, electroporação ou outras técnicas convencionais. Após a fusão as células são cultivadas em meio e despistadas quanto á actividade adequada. A expressão do(s) gene(s) resulta na produção da proteína pretendida. Se o produto expresso fôr uma proteína de fusão, ela pode então ser submetida a posterior montagem com uma cadeia leve ou pesada de imunoglobulina para formar uma moléula tipo imunoglobulina.

As células hospedeiras para a proteína e glicoproteína CD4, fragmento de CD4 e produção de imunoglobulina podem ser células imortalizadas, principalmente células de mieloma ou de linfoma. Estas células podem ser cultivadas em meio nutritivo adequado em frascos de cultura ou injectadas num hospedeiro sinergístico, e.g., murganho ou rato, ou hospedeiro imunodefici-ente ou parte imunodeficiente do hospedeiro, e.g., murganho labro ou bolsa de cobaio. Em particular, as células podem ser introduzidas na cavidade abdominal de um animal para permitir a produção de fluido ascítico que contenha a molécula tipo imunoglobulina. Como alternativa, as células podem ser injectadas subcutâneamente e o anticorpo quimérico ser colhido do sangue do hospedeiro. As células podem ser usadas como as células de hibridoma. Ver Diamond et al.. N. Eng. J. Med. 304:1344 (1981) e Kennatt, - 50 - - -Λ.

McKearn e Bechtol (Eds.), Monoclonal Antibodies: Hvbridomas: — A New Dimension, in Biologic Analvsis. Plenum, 1980.

As proteínas CD4, glicoproteínas, fragmentos de CD4, proteínas de fusão e moléculas do tipo imunoglobulina do invento podem ser isolados e purificados de acordo com condições convencionais, tais como extracção, precipitação, cromatografia, cromatografia de afinidade, electroforese ou similares. Por exemplo, as proteínas, glicoproteínas e fragmentos de CD4 podem ser purificados por passagem de uma solução contendo-os através de uma coluna com gpl20 nela imobilizado (ver Patente U.S. N2 4,725,669). A molécula de CD4 ligada pode então ser eluida por tratamento com um sal caotrópico ou por eluição com ácido acético aquoso (1 M).

As proteínas de fusão de Ig podem ser purificadas por passagem de uma solução contendo a proteína de fusão através de uma coluna que contem proteína A ou proteína G imobilizada que selectivamente se liga à fracção Fc da proteína de fusão. Ver por exemplo, Reis, K.J., et al.. J. Immunol. 132:3098-3102 (1984);

Pedido de Patente PCT, Publicação N° W087/00329. 0 anticorpo quimérico pode ser eluido por tratamento com um sal caotrópico ou por eluição com ácido acético aquoso (1 M).

Como alternativa as proteínas CD4 de primata não humano e glico+roteínas, fragmentos, proteínas de fusão e moléculas do tipo imunoglobulina podem ser purificadas em colunas de anticorpo anti-CD4 ou em colunas de anticorpo anti-imunoglobulina para dar uma proteína substancialmente pura. 0 termo «substancialmente puro» pretende significar que a proteína está livre de impurezas que norroalmente lhe estão 51

associadas. Este grau de pureza pode ser evidenciado por uma única banda em electroforese.

Numa realização do invento, as sequências de cDNA que codificam moléculas de CD4 do invento ou um seu fragmento que se ligue a gpl20, podem ser ligadas num plasmídeo de expressão que codifique um anticorpo em que a região variável do gene foi eliminada. Métodos para a preparação de genes que codificam as regiões constantes da cadeia pesada ou leve estão descritos por exemplo por Robinson, et al.. Pedido de Patente PCT, Publicação N2WO87-02671. A sequência de cDNA codificadora da molécula CD4 ou seu fragmento pode ser directamente ligada ao cDNA codificador das regiões constantes de Ig leves ou pesadas ou pode sere através de uma sequênci de ligação. De preferência a sequência de ligação não codifica um produto proteico que dê origem a uma reacção antigénica no índividuo.

As moléculas tipo imunoglobulina preferidas contendo CD4 do invento, ou seus fragmentos, contêm a região constante de um anticorpo IgM, IgGl ou IgG3.

As proteínas CD4, glicoproteínas, fragmentos, proteínas de fusão e moléculas do tipo imunoglobulina e suas composições farmcêuticas podem ser usadas no tratamento ou profilaxia de infecções virais por HIV. Este método caracteriza-se pela administração a um animal de uma quantidade eficaz de proteínas CD4, glicoproteínas, fragmentos, proteínas de fusãoe moléculas do tipo imunoglobulina e suas composições farmacêuticas, as quais são capazes de formar especificamente um complexo com gpl20 de modo a tornar HIV ou SIV, com os quais estão infectadas as células do indivíduo, incapazes de infectar células T4+. 52

A proteína de fusão e a molécula do tipo imunoglobulina podem-se complexar com gpl20 que é expresso nas células infectadas. Se bem que o inventor não esteja ligado a qualquer teoria particular, parece que a fracção Fc de proteína de fusão ou da molécula tipo imunoglobulina pode ligar-se ao complemento para mediar a destruição da célula. Deste modo, as células infectadas são destruídas de modo a parar a produção adicional de partículas virais.

Com a finalidade de tratar as infecções por HIV, as moléculas de CD4 de primata não humano ou seus fragmentos, proteínas de fusão ou moléculas tipo imunoglobulinado invento podem conter adicionalmente uma marca radioactiva, agente terapêutico ou polipeptídeo citotóxico que aumente a destruição da partícula HIV ou da célula infectada com HIV. São exemplos de radiosisótopos que se podem ligar a proteínas, glicoproteínas, proteínas de fusão e moléculas do tipo 1 ΛΓ 1 O i imunoglobulina do invento para usar na terapia do HIV I, χοχΙ, 90 67n 217,,. Cu, Bi, 211.. 212™ 470 At, Pb, Sc 109, e Pd. Facultativamente, uma marca tal como bóron pode ser usada a qual emite partículas β quando do bombardeamento com radiação de neutrões.

Para o diagnóstico in vivoos radionuclidos podem ser ligados a proteínas CD4, glicoproteínas ou seus fragmentos, proteínas de fusão ou moléculas do tipo imunoglobulina directa— mente ou usando um grupo funcional intermediário. Um grupo intermediário que é muitas vezes usado para ligar radioisótopos, os quais existem como catiões metálicos, a anticorpos é o ácido dietilenotriaminapentacético (DTPA). São exemplos típicos de catiões metálicos que se ligam desta forma ^mTc, ^^1, ^^In, 131T 97_ 67n 68_ I, Ru, Ga e Ga. 53

.-ο ’ X '

Ainda, as proteínas CD4 e glicoproteínas ou seus fragmentos, proteínas de fusão e moléculas do tipo iraunoglobulina podem ser ligadas a um agente para formação de imagens por NMR que inclui átomos paramagnéticos. A utilização de um agente de formação de imagens por NMR permite o diagnóstico in vivo da presença e do grau de infecção pelo HIV num paciente usando técnicas de NMR. Elementos particularmente úteis com esta finali- , , * 157-,, 55„ 162- 52„ 56„ dade são Gd, Mn, Dy, Cr e Fe. A introdução de moléculas de ácido nucleico do invento por terapia genética pode também ser considerada, por exemplo, usando retrovírus ou outros meios para introduzir o material genético especificando as proteínas de fusão em tecidos alvo adequados. Nesta realização, os tecidos alvo tendo as moléculas de ácido nucleico do invento podem então produzir as moléculas CD4 ou proteína de fusão in vivo.

As moléculas de ácido nucleico especificando as moléculas de CD4 ou seus fragmentos podem ser usadas para reconstituir o sistema imune de um indivíduo que sofra de HIV. Por exemplo, as células de medula óssea de um tíndividuo infectado por HIV podem ser removidas e as células hematopoiéticas, quer como parte de uma população mista quer como uma fracção purificada, podem ser infectadas ou transfectadas com um vírus ou construção de DNA que especifique CD4 de primata não humano ou seu fragmento. A produ-_/ ção de CD4 humano pode ser parada ao incluir-se na mesma constru ção genética ou noutra diferente, um gene que interfira com a expressão de CD4 humano. Tal gene pode tomar muitas formas, por exemplo ele pode codificar RNA que se liga a uma proteína reguladora (uma vez que CD4 de primata não humano pode estar sob outro controle, a sua expressão não será afectada); um RNA anticodão que se ligue selectivamente ao gene CD4 humano; ou uma proteína de ligação a DNA a que tenha sido removida a sua região 54 reguladora. As células modificadas serão então injectadas novamente parao paciente onde migrarão para a medula óssea. De preferência, a medula terá sido préviamente limpa de células hematopoiéticas normais por irradiação ou com uma droga citotóxi-ca. Ver Baltimore, D. Nature 335:395-396 (1988). São bem conhecidos os métodos para a transfecção de células hematopoiéticas e estão descritos por exemplo por Wetherall, D.J., Nature 331:13-14 (1988); Dick, J.E., Ann. N. Acad. Sei. 507:242-251 (1987); Eglitis, D.B. et al.. Science 230=1395-1398 (1985); Gillio, A. et al.. Ann. N. Acad. Sei. 511;406-417 (1987). Métodos para a transfecção de células com RNA anti-codão estão descritos, por exemplo, por Hambor, J.E. et al.. PrOc. Natl. Acad. Sei. (USA) 85:4010-4014 (1988); Sanford, J.C., J. Theor. Biol. 130:469-480 (1988); Izant, J.G. et al.. Science 229.345-352 (1985); e Hambor, J.E. et al. J. Exp. Med. 168:1237--1245 (1988). CD4 de primata não humano e seus fragmentos solúveis e não solúveis que se ligam a gpl20 de HIV ou de SIV, podem também ser usados in vivo para tratar infecçães por HlVatravés do bloqueio da infecção de linfócitos humanos portadores de CD4 e a formação de síncicios. Ver Lui, M. et al.. J. Clin. Invest. 82.:2176-2180 (1988) ou Fischer, R.A. et al. . Nature 331:76-78 (1988) para uma discussão sobre a utilização de CD4 humano e seus fragmentos solúveis para bloquear a infecção por HIV de linfõci-tos portadores de CD4e a formação de síncicios.

As proteínas de fusão compreendendo as proteínas CD4, glicoproteínas e seus fragmentos e um agente terapêutico podem também ser usados para tratar indivíduos infectados com HIV matando as células infectadas in vivo. Os agentes terpêuticos podem incluir, por exemplo, polipeptideos citotóxicos tais como toxinas bacterianas, toxina da difteria ou rícino. Métodos para a produção de proteínas de fusão compreendendo o fragmento A da toxina da difteria estão descritos na Patente U.S. 4,675,382 (1987) que aqui é incluído como referência. A toxina da difteria contem duas cadeias polipeptídicas. A cadeia B liga a toxina a um receptor na superfície celular. A cadeia A entra no citoplasma e inibe a síntese proteica ao inactivar o factor de elongação 2, o factor que faz a translocação dos ribossomas ao longo do mRNA simultâneamente com a hidrólise de ATP. Ver Darnell, J., et al.. em Molecular Gell Biology. Scientific American Books, Inc., página 662 (1986). Como alternativa, pode ser preparada uma proteína de fusão compreendendo ricino, uma lectina tóxica. Métodos para a preparação de uma proteína de fusão compreendendo CD4 humano ligado a regiões activas da endotoxina A de Pseudomo-nas e a sua utilização para matar selectivamente células infectadas por HIV estão descritos por Chaudhary, V.K. et al,. Nature 335:369-372 (1988), que é aqui incluído como referência.

As gamas das doses para a administração das proteínas CD4, glicoproteínas e seus fragmentos, proteínas de fusão e moléculas do tipo imunoglobulina serão as suficientes para produzir o efeito pretendido ou seja, omelhoramento dos sintomas da infecção por HIV ou SIV. A dosagem não deve demasiadamente grande para poder causar efeitos secundários adversos, tais como reacçÕes cruzadas indeserjáveis, reacções anfiláticas e similares. De um modo geral, a dosagem variará com a idade, estado, sexoe grau de doença do paciente, contra-indicações, caso existam, tolerância imune e outras variáveis deste tipo a serem consideradas pelo médico assistente. A dosagem pode variar de 0,001 mg/Kg a 50 mg/Kg, de preferência 0,1 mg/Kg a 1,0 mg/Kgda molécula CD4 do invento, molécula de ligação a gpl20 ou seu fragmento, proteína de fusão ou molécula tipo imunoglobulina, numa ou mais administrações diárias, durante um ou vários dias. A 56

molécula tipo imunoglobulina pode ser administrada parenteralmen-te por injecção ou por perfusão gradual ao longo do tempo. Elas podem ser administradas intravenosamente, intraperitonealmente , intramuscularmente ou subcutâneamente.

As preparaç8es para administração parenteral incluem soluções aquosas ou não aquosas, suspensões e emulsões. São exemplos de solventes não aquosos propilenoglicol, polietileno-glicol, óleos vegetais tais como azeite, e ésteres orgânicos injectáveis tais oomo oleato de etilo. Os veículos aquosos incluem água, soluções alcoólicas/aquosas, emulsões ou suspensões, incluindo soro fisiológico e meios tamponados. Os veículos parenterais incluem solução de cloreto de sódio, dextrose de Ringer, dextrose e cloreto de sódio, soução de Ringer lactada ou óleos fixos. Os veículos intravenosos incluem agentes de enchimento fluidos e nutrientes, electrólitos, tais como os baseados na dextrose de Ringer e similares. Os preservativos e outros aditivos podem também estar presentes, tais como, por exemplo, agentes anti-microbianos, anti-oxidantes, agentes de quelação, gases inertes, e similares. Ver, para informação geral, Remington’s Pharmaceutical Science, 16§ Ed., Mack Ads., 1980. 0 invento também está relacionado com um método para a preparação de um medicamento ou composição farmacêutica compreendendo os componentes do invento, o medicamento a ser usado para terapia da infecção por HIV ou SIV em animais.

As proteínas e glicoproteínas do presente invento podem também ser usadas em combinação com outras terapêuticas usadas notratamento de AIDS, ARC e infecção por HIV. Por exemplo, as proteínas e glicoproteínas podem ser coadministradas com agentes anti-retrovirais que bloqueiam a transcriptase reversa tais como AZT, DDI, HPA-23, fosfonoformato, —- ‘ .... suramina, ribavirina e desoxicitidina. Como alternativa, as proteínas e glicoproteínas do invento podem ser coadministradas com tais agentes anti-virais tais como interferões, incluindo interferão alfa, interferão gama, interferão ómega ou inibidores de glucosidasestais como castanospermina. Tais terapias de combinação podem ser com vantagem utilizar doses mais baixas daqueles agentes de modo a minimizar a toxicidade eaumentar a eficácia do tratamento. A detecção e quantificação de substâncias antigénicas e amostras biológicas frequentemente utilizam écnicas de imunoen-saio. Estas técnicas são baseadas na formação do complexo entre a substância antigénica, e.g., gpl20, a ser testada e um anticorpo ou anticorpos em que um dos membros do complexo pode ser marcado de forma detectável. No presente invento, as proteínas Cd4, glicoproteínas ou seus fragmentos, moléculas do tipo imunoglobu-lina ou proteínas de fusão podem ser marcadas com qualquer marca convencional.

Assim, a proteína CD4, glicoproteína ou seu fragmento, proteína de fusão ou molécula do tipo imunoglobulina podem também ser usadas no ensaio da infecção virai por HIV ou SIV numa amostra biológica através do contacto de uma amostra, derivada de um animal suspeito de ter uma infecção por HIV ou SIV, com a proteína CD4, glicoproteína ou seu fragmento, proteína de fusão, ou molécula tipo imunoglobulina e detecção da formação de um complexo com gpl20, sozinho ou na suprfície de uma célula infectada com HIV.

Por exemplo, uma amostra biológica pode ser tratada com nitrocelulose ou outro suporte sólido que seja capaz de imobilizar células, partículas celulares ou proteina slúvel. 0 suporte pode então ser lavado com tampões adequados seguido de tratamento com a proteína CD4, glicoproteína ou seu fragmento, proteína de

fusão ou molécula tipo imunoglobulina, qualquer uma das quais pode ser marcada de forma detectável. 0 suporte da fase sólida pode então ser lavado com um tampão uma segunda vez para remover a proteína não ligada e a marca detectada.

Na realização do ensaio do presente invento com uma amostra contendo gpl20, o processo caracteriza-se por: a) contacto de uma amostra suspeita de conter gpl20 com um suporte sólido para efectuar a imobilização de gpl20 ou célula que expresse gpl20 na sua superfície; b) contacto do referido suporte sólido com a proteína CD4 marcada de forma detectável, glicoproteína ou seu fragmento que se liga a gpl20 de HIV, molécula tipo imunoglobulina ou molécula proteína de fusão do invento; c) incubação da referida molécula marcada de modo detectável com o referido suporte durante um período de tempo suficiente para permitir que a molécula marcda de forma detectável se ligue à gpl20 ou célula imobilizada que expressa gpl20 na sua superfície; d) separação do suporte de fase sólida da mistura de incubaçãoobtida no passo c); e e) detecção da molécula marcada de forma detectável ligada e deste modo detecção e quantificação de gpl20.

Como alternativa, o complexo da proteína CD4, glicopro-teína ou seu fragmento, molécula tipo imunoglobulina ou proteína de fusão marcada de forma detectável - gpl20 numa amostra podem ser separados de uma mistura de reacção pondo em contacto o complexo com o anticorpo imobilizado ou proteína que seja específico para uma imunoglobulina ou, e.g., proteína A, proteína G, anticorpos anti-IgM ou anti-IgG. Tais anticorpos anti-imunoglobu-lina podem ser monoclonais ou policlonais. 0 suporte sólido pode então ser lavado com tampães adquados para dar um complexo 59

. iraobiliza<*° · A· marca pode então ser detectada para dar uma medição da quantidade de gpl20 e portanto da presença de HIV.

Este aspecto do invento está relacionado com um método para a detecção de infecção virai por HIV ou SIV numa amostra caracterizando-se por: a) contacto de uma amostra suspeita de ter gpl20 com uma proteína de fusão compreendendo CD4 de primata não humano ou seu fragmento que se liga a gpl20 de HIV e a fracção Fc de uma cadeia de imunoglobulina e b) detecção da formação do complexo. 0 invento também está relacionado com um método para a detecção de SPl20 numa amostra, caracterizando-se ainda por: c) contacto da mistura obtida no passo (a) com uma molécula de ligação a Fc, como seja um anticorpo, proteína A ou proteína G, a qual é é imobilizada num suporte de fase sólida e é específica para a proteína de fusão, para dar um complexo anticorpo imobilizado - proteína de fusão-gpl20 d) lavagem do suporte de fase sólida obtido no passo c) para remover a proteína de fusão não ligada e e) detecção da marca na proteína de fusão.

Certamente as concentrações específicas da molécula tipo imunoglobulina (ou proteína de fusão) marcada de forma detectável e gpl20, a temperatura e otempo de incubação, assim como outras condições do ensaio podem ser variadas, dependendo de vários factores incluindo a concentração de gpl20 na amostra, da natureza da amostra e similares. Os familiarizados com a matéria serão capazes de determinaras condições operacionais e óptimas do ensaio para cada determinação empregando experimentação de rotina.

Outros destes passos tais como lavagem, agitação magnética, agitação, filtração e similares podem ser adicionados aos ensaios conforme necessário para a situação particular.

Uma das maneiras em que a proteína CD4, glicoproteína ou seu fragmento, molécula tipo imunoglobulina ou proteína de fusão pode ser marcada de modo detectável por ligação da mesma a uma enzima. Esta enzima, por sua vez, quando mais tarde exposta ao seu substrato, catalizará a formação de um produto que pode ser detectado como, por exemplo, por meios espectrofotométricos, fluorimétricos ou visuais. Enzimas que podem ser usadas para marcar de modo detectável a proteína CD4, glicoproteína ou seu fragmento, molécula tipo imunoglobulina ou proteína de fusão do presente invento incluem, mas não estão limitados a malato-desi-drogenase, nuclease estafilocóccica, isomerase delta-V-esteróide, álcool-desidrogenase de levedura, alfa-glicerofosfato-desidroge-nase, triose-fosfato-isomerase, peroxidase de rábano silvestre, fosfatase alcalina, asparaginase, glucose-oxidase, beta-galacto-sidase, ribonuclease, urease, catalase, glucose-VI-fosfato-desi-drogenase, glucoamilase e acetilcolina-estearase. A proteína CD4, glicoproteína ou seu fragmento, molécula tipo imunoglobulina ou proteína de fusão do presente invento-pode também ser marcada com um isótopo radioactivoque pode ser determinado por meios tais como utilização de um contador de cintilação ou por autorradiografia. Isótopos que são particular- 3 125 131 mente úteis para fins do presente invento são: Η, I, I,

32 35ς 14~ 51„ 36pi 57n 58n 59v 75Q r, S, C, Cr, Cl, Co, Co, Fe e Se. É também possível marcar a Proteína CD4, glicoproteína ou seu fragmento, molécula tipo imunoglobulina ou proteína de fusão com um composto fluorescente. Quando a molécula tipo imunoglobulina marcada fluorescentemente é exposta a luz do

X comprimento de onda adequado, a sua presença pode então ser detectada devido à fluorescência emitida pelo corante. Entre os compostos de marcação por fluorescência mais usados encontram-se o isotiocianato de fluoresceína, rodamina, ficoeritrina, ficocia-nina, aloficocianina, o-ftaldeído e flourescamina. A proteína CD4, glicoproteína ou seu fragmento ou proteína de fusão do invento pode também ser marcada de modo 152 detectãvel usando metais que emitem fluorescência tais como Eu ou outros da série dos lantanídeos. Estes metais podem ser ligados à proteína CD4 , glicoproteína ou seu fragmento, molécula do tipo imunoglobulina ou proteína de fusão, usando grupos de quelatação de metais como seja o ácido dietilenotriaminapentacé-tico (DTPA)ou o ácido etilenodiaminatetracético (EDTA). A proteína CD4, glicoproteína ou seu fragmento, molécula tipo imunoglobulina ou proteína de fusão do presente invento pode também ser marcada de forma detectável através do seu acoplamento a um composto quimioluminescente. A presnça da proteína CD4, glicoproteína ou seu fragmento, molécula do tipo imunoglobulina ou proteína de fusão quimioluminescente é então determinado pela detecção da presença de luminescência que surge no decurso de uma reacção química. São exemplos de compostos para marcação quimioluminescente particularmente úteis o luminol, isoluminol, éster de acridinio teromático, imidazole, sal de acridinio e éster oxalato.

Do mesmo modo, pode ser usado um composto biolumines-cente para marcar a proteína CD4, glicoproteína ou seu fragmento, molécula do tipo imunoglobulina ou proteína de fusão do presente invento. A bioluminescência é um tipo de quimioluminescência encontrada em sistemas biológicos em que uma proteína catalítica aumenta a eficácia da reacção quimioluminescente. A presença de 62 \

Uma proteína bioluminescente é degzrminada por detecção da Presença de luminescência. A luciferina, luciferase e aequorina são compostos importantes para usar em marcação. A detecção de proteína CD4, glicoproteína ou seu fragmento, molécula tipo imunoglobulina ou proteína de fusaão pode ser conseguida usando um contador de cintilação, por exmplo, se a marca detectável fôr um emissor radioactivo gama ou um fluorómetro,por exemplo, se a marca fôr material fluorescente. No caso de uma marca enzimática a detecção pode ser conseguida por métodos colorimétricos que emprgam um substrato da enzima. A detecção pode também ser conseguida por comparação visual do grau de reacção enzimática de um substrato comparativamente com padrões preparados de modo semelhante. 0 ensaio do presente invento é idealmente adequado para a preparação de um kit. Tal kit pode compreender um sistema de transporte compartimentado para acomodar um ou mais contentores tais como ampolas tubos e similares, cada um dos referidos contentores compreendendo os elementos separados do imunoensaio. Por exemplo, pode existir um contentor contendo um suporte de fase sólida e ainda outro contentor contendo a proteína CD4, glicoproteína ou seu fragmento, molécula do tipo imunoglobulina ou proteína de fusão marcada de forma detectável. 0 contentor pode ainda conter soluções padrão compreendendo diluições seriadas do material a detectar como seja gpl20 ou seus fragmentos. As soluções padrão destes materiais a serem detectados podem ser usados para preparar uma curva padrão com a concentração de gpl20 em função do sinal de detecção na ordenada. Os resultados obtidos a partir de uma amostra contendo gpl20 podem ser interpolados a partir de tal curva padrão para dar a concentração de gpl20. A proteína CD4, glicoproteína ou seu fragmento, molécula tipo imunoglobulina ou proteína de fusão do presente invento podem também ser usadas como corante de secções de tecido. Por exemplo, uma molécula marcada compreendendo proteína CD4 ou glicoproteína ou seu fragmento de ligação a gpl20 de HIV pode ser colocada em contacto com uma secção de tecido, e.g., uma amostra de biópsia do cérebro. Esta secção pode então ser lavada e a marca detectada.

Os exemplos que se seguem são ilustrativos, mas não limitantes do método e composição do presente invento. Outras modificaçães adequadas e adptaçães que são óbvias para os familiarizados com a matéria estão dentro do espírito e âmbito deste invento.

EXEMPLOS

EXEMPLO 1 ISOLAMENTO DE cDNAs DE CD4 DE CHIMPANZÉ E DE MACACO RHESUS

Clones de cDNA codificador de antigénios CD4 do Chimpanzé (Pan troglodytes) e do Macaco Rhesus (Maccaca mulatta) foram isolados, sequenciados e expressos. cDNAs de CD4 de primata não humano foram sintetizados a partir de RNA poli-A de células mononucleadas do sangue periférico estimuladas com mitogénio obtidas a partir destes animais. Fizeram-se bibliotecas de expressão de cDNA no vector CDM8 e isolaram-se cDNAs de CD4 por quatro ciclos de imuno-selecção como préviamente descrito por Seed et al.. Proc. Natl. Acad. Sei. (USAl 84:3365-3369 (1987). Fez-se sequenciação usando o método de terminação de cadeias de didesoxinucleotídeos em moldes de cadeia simples ou dupla. As sequências de DNA e de aminoácidos de CD4 do Chimpanzé e do Macaco Rhesus estão apresentadas abaixo. Também está apresentada uma comparação das respectivas sequências com CD4 humano. 64

SEQUÊNCIA CODIFICADORA DE CD4 DE RHESUS E SEQUÊNCIA DE AMINOÁCIDOS PREVISTA MOSTRANDO DIFERENÇAS RELATIVAMENTE AS SEQUÊNCIAS HUMANAS 1 ATGAACCGGGGAATCCCTTTTAGGCACTTGCTTCTGGTGCTGCAACTGGCGCTACTCCCA -25 HetAsnArgGly11eProPheArgHisLeuleuLeuValLeuGlnLeuAlaLeuLeuPro Vai

G C 1 GCAGTCACCCAGGGAAAGAAÀGTGGTGCTGGGCAAGAAAGGGGATACAGTGGAACTGACC 120 AI aVal ThrGl nGlyLysLysVal Vai LeuGlyLysLysGlyAspThrVal G1 uLeuThr 15

Ala

C T A 121 TGTACAGCTTCGCAGAAGAAGAACACACAATTCCACTGGAAAAACTCCAACCAGATAAAG 16 CysThrAlaSerGlnLysLysAsnThrGlnPheHisTrpLysAsnSerAsnGlnlleLys

Serlle

C G T ATTCTGGGAATTCAGGGTCTCTTCTTAACTAAAGGTCCATCCAAGCTGAGCGATCGTGCT 240 IleLeuGlylleGlnGlyLeuPheLeuThrLysGlyProSerLysLeuSerAspArgAla 55 Asn Ser Asn

A CTC AT C

A 241 gactcaagaÁaaagcctttgggaccaaggatgcttttccatgatcatcaagaatcttaag 56 AspSerArgLysSerLeuTrpAspGlnGlyCysPheSerMetllelleLysAsnLeuLys Arg Asn ProLeu

G AA CC C ÀTAGAAGACTCAGATACTTACATCTGTGAÀGTGGAGAACÀAGAAGGAGGÀGGTGGAATTG 360 IleGluAspSerAspThrTyrlleCysGluValG1uAsnLysLysGluGluValG1uLeu 95

AspGIn Gin

G C C 361 CT GGT GTT CGGATTGACTGCCAACT CT GACACCCACCT GCTTGAGGGGCAÀAGCCTGACC 96 LeuValPheGlyLeuThrAlaAsnSerAspThrHi sLeuLeuGluGlyGlnSerLeuThr

Gin

A

C

G CTGACCTTGGAGAGCCCCCCTGGTAGTAGCCCCTCAGTGAAATGTAGGAGTCCAGGGGGT 480 LeuThrLeuGluSerProProGlySerSerProSerValLysCysArgSerProGlyGly 135 G1n Arg

C A 481 AAAAAC AT ACAGGGGGGGAGGACCAT CT CT GTGCCT CAGCTGGAGCGCC AGGATAGT GGC 136 LysAsnlleGlnGlyGlyArgThrlleSerValProGlnLeuGluArgGlnAspSerGly

Lys Leu Ser Leu

A C C T T * ACCTGGACATGCACCGTCTCGCAGGACCAGAAGACGGTGGAGTTCAAAATAGACATCGTG 600 ThrTrpThrCysThrValSerGInAspGlnLysThrValG1uPheLysIleAspIleVal 175

Leu Asn Lys

T T A A 601 GTGCTAGCTTTCCAGAAGGCCTCCAGCACAGTCTATAAGAAAGAGGGGGAACAGGTGGAG 176 VaiLeuAlaPheGlnLysAlaSerSerThrValTyrLysLysGIuGlyGluGlnValG1u

Ile

T TTCTCCTTCCCACTCGCCTTTACACTTGAÀAAGCTGACGGGCAGTGGCGÁGCTGTGGTGG 720 PheSerPheProLeuAIaPheThrLeuGluLysLeuThrGlySerGlyGluLeuTrpTrp 215

Vai

G 721 CAGGCGGAGAGGGCCTCCTCCTCCAAGTCTTGGATTACCTTCGACCTGAAGAACAAGGAA 216 G1nAI aGluArgAlaSerSerSerLysSerTrpIIeThrPheAspLeuLysAsnLysGlu

T C T GTGTCTGTAÂAACGGGTTACCCAGGACCCCAAGCTCCAGÀTGGGCAAGAÀgCTCCCGCTC 840 VaiSerValLysArgValThrGlnAspProLysLeuGlnMetGlyLysLysLeuProLeu 255

T 841 CACCTCACCCTGCCCCAGGCCTTGCCTCAGTATGCTGGCTCTGGAAACCTCACGCTGGCC 256 HisLeuThrLeuProGlnAIaLeuProGlnTyrAlaGlySerGlyAsnLeuThrLeuAla

C 66 cttgaagcgÃaaacaggaaagttgcatcaggaagtgaacctcgtggtgatgagagccact

LeuGl uAl aLysThrGlyLysLeuHi sGl nGl uVal AsnLeuVal ValMetArgAl aThr

G 961 CAGTTCCAGGAAAATTTGACCTGTGAAGTGTGGGGACCCÀCCTCCCCTAÂGCTGACGCTG 296 GlnPheGlnGluAsnLeuThrCysGluValTrpGlyProThrSerProLysLeuThrLeu Leu Lys Met

C A G T AGCTTGAAACTGGAGAACAAGGGGGCAACGGTCTCGAAGCAGGCGAAGGCGGTGTGGGTG SerLeuLysLeuGluAsnLysGlyAlaThrValSerLysGlnAlaLysAlaValTrpVal

Glu Lys ArgGlu

A A GA 1081 CTGAACCCTGAGGCGGGGATGTGGCAGTGTCTGCTGAGTGACTCGGGACÀGGTCCTGCTÁ 336 LeuAsnProGluAlaGlyMetTrpGlnCysLeuLeuSerAspSerGlyGlnValLeuLeu.

G GAATCCAACÀTCAAGGTTGTGCCCACATGGCCCACCCCGGTGCAGCCAATGGCCCTGATT G1uSerAsnlleLysValVaiProThrTrpProThrProValG1nProMetAl aLeulIe

Leu Ser .........

C T 1201 GTGCTGGGGGGCGTTGCGGGCCTCCTGCTTTTCACTGGGCTAGGCATCTTCTTCTGTGTC 376 ValLeuGlyGlyValAlaGlyLeuLeuLeuPheThrGlyLeuGlyllePhePheCysVal .................................Ile..................

C C T AGGTGCCGGCATCGAAGGCGTCAAGCAGAGCGGATGTCTCAGATCAAGAGACTCCTCAGT ArgCysArgHi sArgArgArgGlnAlaGluArgMetSerGlηIIeLysArgLeuLeuSer

C C 1321 GAAAAGAAGÁCCTGCCAGTGCCCTCACCGGTTTCAGAAGÁCATGTAGCCCCATTTGA 416 G1uLysLysThrCysGlnCysProHisArgPheGlnLysThrCysSerProIleEnd

G 960 295 1080 335 1200 375 1320 415 1377 433 67 67

Ι'Ρ"

SEQUÊNCIA CODIFICADORA DE CD4 DE CHIMPANZÉ E SEQUÊNCIA DE AMINOÁCIDOS PREVISTA MOSTRANDO DIFERENÇAS RELATIVAMENTE

ÃS SEQUÊNCIAS HUMANAS i 1 AT GAACCGGGGAGT CCCTTTT AG6C ACTT GCTT CT 6GT6CT GCAACTGGC ACTCCT CCC A -25 MetAsnArgGlyValProPheArgHisLeuLeuLeuValLeuGlnLeuAlaLeuLeuPro • I · · · · · GCAGCCACTCAGGGAAAGAAAGTGGTGCTGGGCAAGAAAGGGGACACAGTGGAACTGACC 120 AlaAlaThrGlnGlyLysLysValValLeuGlyLysLysGlyAspThrValGluLeuThr 15

A T * ΛΑΛΛΛΛΛΛΛ 121 τgtacagcttcccagaagaÁgagcatacaÁttccactggaaaaactccAACCAGACAAAG 16 CysThrAlaSerGlnLysLysSerlleGlnPheHisTrpLysAsnSerAsnGlnThrLys

II e T ATTCTGGGAÂATCAGGGCTCCTTCTTAACTAAAGGTCCATCCAAGCTGAÀTGATCGCGTT 240 neLeuGlyAsnGInGlySerPheLeuThrLysGlyProSerLysLeuAsnAspArgVal 55

Ala

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# # AAAAAAAAA 241 GACTCAAGAÂGAAGCCTTTGGGACCAAGGÀAACTTTACCCTGATCATCAAGAATCTTAAG 56 AspSerArgArgSerLeuTrpAspGlnGlyAsnPheThrLeuIleneLysAsnLeuLys

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CC ' * /·

* AT AGAAGACTCAGATACTTACATCTGTGAAGTGGGGGACCAGAAGGAGGAGGTGCAATTG IleGIuAspSerAspThrTyrlleCysGluValGlyAspGlnLysGluGluValG1nLeu

Glu

A 361 CTAGTGTTCGGATTGACTGCCAACTCTGACACCCACCTGCTTCAGGGGCAGAGCCTGACC 96 LeuValPheGlyLeuThrAlaAsnSerAspThrHi sLeuLeuGlnGlyGlnSerLeuThr

CTGACCTTGGAGAGCCCCCCTGGTAGTAGCCCCTCAGTGCAATGTAGGAGTCCAAGGGGT

LeuThrLeuGluSerProProGlySerSerProSerValGInCysArgSerProArgGly 481 AAAAACATACAGGGGGGGAÂGACCCTCTCCGTGTCTCAGCTGGAGCTCCÁGGATAGTGGC 136 LysAsnll eGlnGlyGlyLysThrLeuSerValSerGlnLeuGluLeuGlnAspSerGly ACCTGGACATGCACTGTCTTGCAGAACCAGAAGAAAGTGGAGTTCAAAATAGACATCGTG ThrTrpThrCysThrValLeuGlnAsnGlnLysLysValG1uPheLysIleAspIleVal

G 601 GTGCTAGCTTTCCAGAAGGCCTCCAGCATÃGTCTATAAGÁAAGAGGGGGÁACAGGTGGAG 176 VaiLeuAlaPheGlnLysAlaSerSerI1eValTyrLysLysGluGlyGluGlnValG1u ttctccttcccactcgcctttacagttgaâaagctgacgggcagtggcgágctgtggtgg

PheSerPheProLeuAlaPheThrValG1 uLysLeuThrGlySerGlyGluLeuTrpTrp 721 CAGGCGGAGAGGGCTTCCTCCTCCAAGTCTTGGATCACCTTTGACCTGAAGAACAAGGAA 216 G1nAlaGluArgAlaSerSerSerLysSerTrpIleThrPheAspLeuLysAsnLysGlu GT GT CT GTAAAACGGGTTACCCAGGACCCTAAGCT CCAGAT GGGCAAGAAGCTCCCGCT C ValSerValLysArgValThrGlnAspProLysLeuGlnMetGlyLysLysLeuProLeu 841 CACCTCACCCTGCCCCAGGCCTTGCCTCAGTATGCTGGCTCTGGAAACCTCACCCTGGCC 256 HisLeuThrLeuProGlnAlaLeuProGlnTyrAlaGlySerGlyAsnLeuThrLeuAla CTTGAAGCGAAAACAGGAAAGTTGCATCAGGAAGTGAACCTCGTGGTGATGAGAGCCACT LeuGluAlaLysThrGlyLysLeuHi sGlnGluValAsnLeuValVaiMetArgAlaThr

G

X 961 cagctccagãaaaatttgacctgtgaggtgtggggacccacctcccctaagctgatgctg 296 61 nLeuGl nLysAsnLeuThrCysGl uVal TrpGlyProThrSerProLysLeuMetLeu AGCTTGAAACTGGAGAACAAGGAGGCAAAGGTCTCGAAGCGGGAGAAGGCGGTGTGGGTG 1080 SerLeuLysLeuGluAsnLysGluAlaLysValSerLysArgGluLysAlaValTrpVal 335 1081 CTGAACCCTGAGGCGGGGATGTGGCAGTGTCTGCTGAGTGACTCGGGACÂGGTCCTGCTG 336 LeuAsnProGluAlaGlyMetTrpGlnCysLeuLeuSerAspSerGlyGlnValLeuLeu GAATCCAACÂTCAAGGTTCTGCCCACATGGTCCACCCCGGTGCAGCCMTGGCCCTGATT 1200 G1uSerAsnlleLysValLeuProThrTrpSerThrProValG1nProMetAlaLeuIle 375 1201 GTGCTGGGGGGCGTCGCCGGCCTCCTGCTTTTCATTGGGCTAGGCATCTTCTTCTGTGTC 376 ValLeuGlyGlyValAlaGlyLeuLeuLeuPhelleGlyLeuGlyllePhePheCysVal AGGTGCCGGCACCGAAGGCGCCAAGCACAGCGGATGTCTCAGATCAAGAGACTCCTCAGT 1320 ArgCysArgHi sArgArgArgGlnAlaGlnArgMetSerGlnlleLysArgLeuLeuSer 415

Glu

G 1321 GAGAAGAAGÂCCTGCCAGTGCCCTCACCGGTTTCAGAAGÁCATGTAGCCCCATTTGA 1377 416 GluLysLysThrCysGlnCysProHisArgPheGlnLysThrCysSerProIleEnd 433 O antigénio CD4 de chimpanzé é 99% homólogo da sua contraparte, possuindo 5substituiçÔes de aminoácidos no polipep— tídeo maduro previsto de 433 aminoácidos, enquanto que CD4 de macaco rhesus é 92% homólogo tendo 34 divergências da sequência de aminoácidos de CD4 humano. A expressão de antigénios foi efectuada transitoriamente em CDM( assim como estávelmente usando o vector retroviral pMNCS.

V

EXEMPLO 2 CARACTERIZAÇÃO DO DOMÍNIO CD4 HUMANO QUE E NECESSÁRIO PARA A FORMAÇÃO DE SÍNCICIOS MEDIADA POR HIV

Estes antigénios CD4 de primata não humano foram expressos em células humanas que se tornaram assim susceptíveis à infecção por HIV, mas formaram muito menos células gigantes multinucleads, ou síncicios, do que as suas contrapartes expressando o antigénio CD4 humano. Usando mutagénese in vitro este fenótipo foi atribuído a uma diferença num único aminoácido entre as glicoproteínas de chimpanzé e humanas. Esta substituição de aminoácido afecta quantitativamente a capacidade das células HeLa para formar síncicios quando estes antigénios são expressos juntamente com as proteínas externa e transmembranar (EMP e TMP) do vírus da imunodeficiência humana tipo I (HIV). Isto foi conseguido através da expressão transitória de seis antigénios CD4 híbridos trans-espécies, que contêm uma das três alteraçêes não conservadora na sequência de aminoácidos extracelularentre as duas espécies sozinhas e em pares, seguido da infecção com Vacina:(env de HIV) vírus recombinante VSC25 de Vacina:(env de HIV). A presença de um resíduo glicina na posição 87, conforme encontrado em CD4 de chimpanzé, em vez do resíduo de ácido glutâraico encontrado em CD4 humano, elimina essencialmente a formação de síncicios multinucleados. Pelo contrário a transferência do resíduo de ácido glutâmico humano na posição 87 para CD4 de chimpanzé confere a capacidade de formação de síncicios na presença de EMP e TMP de HIV. Pelo contrário, a ausência ou presença de uma das duas substituiçSes de aminoácidos que dão origem a sítios únicos de glicosilação no antigénio CD4 de chimpanzé, nos aminoácidos 34 e 68 no primeiro domínio homólogo da região variável de imunoglobulina, tem pouco ou nenhum efeito no grau de formação de síncicios neste ensaio.Esperamos que todos estas glicoproteínas CD4 híbridas apresentem igual afinidade para 71

EMP de HIV, uma vez que nenhuma destas diferenças de aminoãcidos estão no sítio de ligação ao HIV definido anterioraiente.

Se a formação de síncicios for um mecanismo importante da doença induzida por HIV este bloqueio da formação de síncicios mediada por HIV pode justificar a resistência do chimpanzé à patologia do síndroma da imunodeficiência adquirida (AIDS) apesar da infecção prolongada pelo HIV.

V EXEMPLO 3 PREPARAÇÃO DE CONSTRUÇÕES DE cDNA DE CD4-IG A fracção extracelular da sequência codificadora de chimpanzé ou de macaco rhesus (codificadora de peptídeos sinal e dos aminoãcidos 1-372 das glicoproteínas maduras) foi fundido em três sítios diferentes com um gene da região constante da cadeia pesada de IgGl humana por meio de uma molécula sintética de adaptador dadora de um sítio de ^splicing>. Para utilizar o adaptador dador de <splicing>, um adaptador BamHI tendo a sequência CGCGGATCCGCG é primeiro inserido η o resíduo de aminoácido 395 da sequência precursora de CD4 (resíduo de nucleotídeo 1295). Criou-se uma sequência sintética dadora de ^splicing>

^ GATCCCGAGGGTGAGTACTA

GGCTCCCACTCATGATTCGA delimitada por extremos complementares HindIII e BamHI e fundiu--se com o sítio HindIIIno intrão que precede o domínio CHI, ao sítio EspI no intrão que precede o domínio CH2 da sequência genómica da IgGl. A montagem dos genes quiméricos por ligação no sítio BamHI dá moléculas em que a região variável (V), as regiSes V+CH1 ou as regiões V, CHI e de charneira foram substituídas por CD4. No último caso, espera-se que a molécula forme uma estrutura 72

monomérica. enquanto que no primeiro espera-se que seja formado um dímero. A imunoprecipitação das proteínas de fusão com um painel de anticorpos monoclonais dirigidos contra epítopos CD4 mostra que todos os epítopos estão preservados. Demonstrou-se uma associação de afinidade específica elevada entre as moléculas quiméricas e as proteínas do invólucro de HXV expressas na superfície de células transfectadas com uma construção proviral atenuada (transcriptase reversa eliminada) ou infectada com um vírus recombinante vacina:env de HIV.

EXEMPLO 4 PREPARAÇÃO DAS PROTEÍNAS DE FUSÃO A PARTIR DE SOBRENADANTES DE CÉLULAS COS Células COS foram cultivadas em meio DME suplementado com 10% de Soro de Vitela e sulfato de gentamicinaa 15 pg/ml foram passadas para meio DMEM contendo 10% de NuSerum (Collabora-tive Research) e gentamicina para dar 50% de confluência no dia antes da transfecçêo. No dia seguinte, adicionou-se DNA de plasmídeo purificado em CsCl para uma concentração final de 0,1 a 2,0 jjg/ml seguido de DEAE Dextran para 400pg/ml e cloroquina para 100 μΜ. Após 4 horas a 37°C, o meio foi aspirado e adicionada uma solução de dimetilsulfóxido a 10% em tampão de fosfatos salino durante 2 minutos, aspirado e substituído por DME/10%de Soro de Vitela. 8 a 24 horas mais tarde, as células foram tripsinizadas e passadas a 1:2. e

Para a marcação radioactiva, o meio foi aspirado 40 a 48 horas após transfecção, as células foram lavadas uma vez com tampão de fosfatos salino e adicionado meio DME sem císteina ou metionina. 30 minutos mais tarde, adicionou-se cisteína 73

Ν' ‘ metionina marcadas com com S para concentrações finais de 30-60 μΟί e 100-200 μΟχ respectivamente e as células foram deixadas a incorporar a marca durante 8 a 24 horas mais. Os sobrenadantes foram recuperados e examinados por electroforese em géis de 7,5% de poliacrilamida após desnaturação e redução ou num gel de 5% de poliacrilamida após desnaturação sem redução. As proteínas de fusão IgG-CD4 formam estruturas diméricas. As proteínas de fusão CD4~IgM formam multímeros grandes para lá da resolução do gel sem redução e monómeros do tamanho esperado com redução.

Prepararam-se proteínas não marcadas deixando as células crescer durante 5 a 10 dias após transfecção em meio DME contendo 5% de NuSerum e gentamicina como atrás. Os sobrenadantes foram colhidos, centrifugados e purificados por adsorção em bloco a proteína A trisacrilo, proteína A agarose, anticorpo de acbra anti-IgG humana agarose, anticorpo de coelho anti-IgM humana agarose ou anticorpo monoclonal anti-CD4 agarose. Os conjugados de anticorpo agarose foram preparados acoplando anticorpos purificados a agarose activada com brometo de cianogénio de acordo com as recomendações do fabricante e usando uma concentração de anticorpo de 1 mg/ml. Após adsorção em bloco por agitação durante a noite num plataforma rotatória, as esferas foram colhidas por decantação para um funil de vidro com filtro e lavadas algumas vezes no fulnil com tampão de fosfatos salino contendo 1 % do detergente Nonidet P40. As esferas foram removidas do funil e vertidas para uma pequena coluna de plástico não reutilizável (coluna Quick-Sep QS-Q, Isolab), lavadas com pelo menos vinte volumes de coluna de tampão de fosfatos salino contendo 1% de Nonidet P40, com 5 volumes de 0,15 M NaCl, 1 mM EDTA (pH 8,0) e eluidas pela adição de ácido acético 0,1 M contendo 0,1 M NaCl ou tampão glicina-HCl 0,25 M, pH 2,5. 74

EXEMPLO 5 BLOQUEIO DA FORMAÇÃO DE SÍNCICIOS PELAS PROTEÍNAS DE FUSÃO

Proteínas de fusão purificadas ou parcialmente purificadas foram adicionadas a células HPB-ALL infectadas 12 horas antes com um vírus da vacina recombinante codificador da proteína do invólucro de HIV. Após incubação durante mais 6-8 horas, as células foram lavadas com tampão de fosfatos salino, fixadas com formaldeído e fotografadas. Todas as proteínas de fusão CD4 de tamanho completo - imunoglobulina apresentarão inibição da formação de síncicios.

Tendo agora descrito detalhadamente este invento, será apreciado pelos familiarizados com a matéria que o mesmo pode ser realizado com uma larga gama de parâmetros equivalentes no que respeita a composição, condições e métodos de preparação de tais moléculas recombinantes, vectores, hospedeiros transformados e proteínas sem se afastar do espírito ou âmbito do invento ou de qualquer sua realização.

Claims

REIVINDICAÇÕES: 1È. - Processo para a produção de CD4 de primata não humano ou seu fragmento que se liga a gpl20 de HIV ou de SIV, caracterizado por compreender: a cultura, num meio nutritivo adequado em condições de produção de proteína, de uma estirpe hospedeira transformada com um vector compreendendo a molécula de ácido nucleico de acordo com a reivindicação 1, compreendendo ainda o referido vector sinais de expressão que são reconhecidos pela referida estirpe hospedeira e dirigem a expressão do referido CD4 de primata não humano e a recuperação do CD4 de primata não humano assim produzido. 2ã. - Processo de acordo com a reivindicação 1, ca-racterizado por o referido primata não humano ser o macaco rhesus, e por o referido CD4 ou seu fragmento compreender a seguinte sequência de aminoãcidos: MetAsnArgGlylleProRieAr^íi sT euT <euT <euValLsuGInLsuMaLeuLeiJPro MaValThrGlnGlyLysLysValValLeiK31yLysLysGlyAspG[hrValGlviLeufIhr cysIhrMaSerGlnLysLysAsrtllu^lnHieHisTrpLysAsnSerAsriGlnlleLys IleLeuGlylleGInGlyLeuHiel^uIhrLysGlyProSerLysIeuSerAspArgAla AspSerArgLysSerLeuTtíAspGlriGlyCVs^eSerifetllelleLysAsriljeuLys IlθGlυAΞpSerAsp/IhrTyrIleCysGluValGluAsnLysLyεGl^lGlu.ValGluL·eu I£uValI¾eGlyL·euΊhrMaΆsιΐSerAΞpOl·lrΉisIGuLeuGluGlyGlnSerL·eulIhr iBiíIhrLeuGluSerErdPrcjGlySerSerProSerValLysCysArgSerProGlyGly LysAsnlleGlnGlyGlyADglhrlleSerValProGlnLeuGluArgGlnAspSerGly IhcTrpGlirCysnirValSérGlnAspGlriLysIhrValGluHieLysIleAspIleVal ValJjeuAlaHieGlriLysAlaSerSerlíirValTyrLysLysGluGlyGluGlnValGlu RieSerPheProLsuAlal^ea^IauGluLysI^uThrGlySerGlyGlijLeLiTrpírrp GlnMaGluArg?^.aSerSerSerLysSerTrpIleIhrPheA£pLeiíLysAsnLysGlu ValSerValLysArxgValftirGlnAsp^oLysLeuGliiMetGlyLysLysLeuProLeu ΗίΞ]^υΏιτΐ£υΡΓ(Λΐη^3ΐ£υΡΓοσΐηΤγτΑ1άαΐγ3θτ6ΐγΑΞΐΐ!1βυΏιτΙ/ΒυΑΐΕ LeuGluMaLysThrGlyLysLei^sGlrySluVal^nLeuValValMetAcgAlaTlir GlriE^eGlriGluAsríLeu3hr<^sGluValTEpGlyPrdIlhrSerProLysLeuIhrLeu Serl^uLysLeuGluAsriLysGlyAIallirValSerLysGlnAlaLysAlaValTrpVal l^uAsriProGl\AlaGly^tTrpGInC^^sLeul^uSg>rA!=p.qprGl ym nVa 1 τ «iT «n GluSerAsnIléLysValValPro01aTrpFtoi31irEroValGlriPrxtet^al£UIle ValLeuGlyGlyValAlaGlyLaiTia.iLeuPheahrGlyLeuGlylléPhePheCysVal ArgCysArçpisArgArgAr^lnAlaGluArc^1^erGlnIleLysArgl£uLeuSer GluLysLyslhrCysGlrK^sProHisArgEíieGlnLysIhrCysSerProIle. 77 77

3â. - Processo de acordo com a reivindicação 1, ca-racterizado por o referido primata não humano ser o chimpanzé, e por o o referido CD4 ou seu fragmento compreender a seguinte sequência de aminoácidos: MetÃsnArgGlyValProiFheArgHisI βιιΙ/?ιίΡρυν3ΐΐ£υ01ηΕΒυΑΐΗΐ;Βαί£υΡΓθ AlaAlaUirGlnGlyLysLysValValXeuGlyLysLysGlyAspatirValGluLeuflhr CysIlirAlaSerGlnLysLysSerl leGlnHieHisTrpLysAsnSerAsnGIraiirLys I leLeuGlyAsnGlnGlySerPheLeuItirLysGlyProSerLysIeuAsnAspArgVal AspSerArgArgSerleuTrpAspGlnGlyAsnPhelhrLeuIlelleLysAsnljeuLys I loGluAspSerAs^hriyrlleCysGluValGlyAspGlhLysGluGluValGlriLeu X^ValPheGlyLeuflhrAlaAsnSerAspahrHisT /euT euGlnGlyGInSerLeuIhr ΐ£υΏιτΐ£υ01υ3ατΡτοΡτο01γ8θτ3θτΡΓθ3βΕναΐαΐηανΞΑΓ93βτΡΓθΑΓ9αΐγ LysAsnI leGlnGlyGlyLyslhrLeuSerValSerGlriLa^luLeuGlnAspSerGly IhrltpGlirCysIhrValLenGlnAsnGIhLysLysValGliiRieLysIleAspIleVal ValIjeuAlaHieGlriLysAlaSerSerlleValiyrLysLysGluGlyGluGInValGlu ^ÊSerHieProlÊuMaPhelhrValGluLysLeuBirGlySerGlyGluLeuTrpírrp GlnMaGluArgMaSerSerSerLysSerTi^IlelhrHieAspIieuLysAsnLysGlu ValSerValLysArgVallhrGlnAspProLysIieuGln^tGlyLysLysLeuProLeu HisIfiuIhr]^uProGInAIaL·euProGlIt[yrMaGlySerGlyAsnL·eu,IhrL·euAla LeuGluMaLysIhrGlyLysIjeuHisGlriGluValAsnLeuValValtfetArgAlaliir GIJ^uGInLyΞ¾ΞrιLeu!IhcCyΞGluValTrpGlyProfIhrSerProLyΞL·suMetIJeu SerlÊuLysLeuGluAsrLLysGluMaLysValSerLysArgGluLysMaValTcpVal LeuAsnProGluAlaGlyMetTrpGInCysLeuLeuSerAspSerGlyGlriVa 1T euLeu GluSerAsrO:ieLysVall£uPrc®irTrpSerihrProValGlnPraífetjy.aLeuIle ValLeuGlyGlyValAlaGlyLeuI^aiTaÍiHielleGlyLeuGlylleRiePheCysVal Αη9^&Ατ^3Ατ9Ατ9ΑΤ96ΙηΑΐΗθΙηΑκ^ί^θτ6ΙηΙ1^γ5Αιχ^]0ΐιΙβη5θτ GluLysLysIhrCysGlrK^ysProHisArgHieGlriLyslhrCysSerProIle; ou o seu fragmento glicosilado. 78 78

4â. - Processo de acordo com a reivindicação 1, ca-racterizado por o referido CD4 ou seu fragmento compreender a seguinte sequência de aminoãcidos: Ι^ΐΑ3ηΑτ^1^α1Ρζχ>Ε4ιεΑτ^ΙΪΞΐ^υΙ^υΙ>εην3ΐΐ£υαΐηΐ£υΑΐ3ΐβυ1βηΡΓθ AlaAlaΊhr<3lnGlyLysL·ysValVaIL·euGXyLysLysGlyAsp¢IhrValGl^aL·eUIhr CyslhrAlaSerGlnLysLysSerlleGInRieHisTrpLysAsnSerAsnGln-ê-Lys 11β]1<£υΰ1γΑ2ΐ£ΐΓ»2ΐγ3θτΗΐθΐ£ΐ}ΏΐΓίγΞθ1γΡτο56ΤΕγΞΐ£υΑ5ηΑ5ρΛτ^-#-AspSerArgArgS6rl£UÍItpi^^lnGlyAsn£^e>$-lâuXleIléLysAsrújeuLys IleGluAspSerAspGlirTyrlleCysGluValGlyAspGlnLysGluGluValGlnLeu LeuValPheGlyl^uflhrAlaAsnSerAsp/Ihrii i sJjeuLeuGlr^lyGlnSerLeuflhr LeiflhrLeuGlijSerEraProGlySerSerProSerValGliKystó^gSerPrQArgGly LysAsnlleGlnGlyGlyLy^IhrleuSerValSerGlriLeijGluLeaiGlnAspSerGly 15irTr]3IhrCysIhrValLeuGlriAsr£lriLysLysValGluPheLysIleAspIleVal ValIeuAlaPheGlnLysAlaSerSerI leValiyrLysLysGluGlyGluGlriValGlu PheSerPheRroLeuAlaPheÍhrValGluLysI euTtirGlySerGlyGluI^uTrp/Trp GlnAlaGluArgAlaSerSerSerLysSej^rrpIleThrHieAspLeuLysAsríLysGlu ValSerVcdLysArgValThrGlnAspProLysLeuGlnMetGlyLysLysIjeuProLeu Hisl ggfllnrLeuEcoGliTMaLeuProGlrflyrMaGlySerGlyAsnl^iJIhrLexAla LeuGl\aAlaLysThrGlyLysLetiHisGlnGluValAsnLeuValValMetArg?y.aThr GljiLeuGlT^ysftsriLeuIhrCysGluValTtpGlyPrcinirSerProLysLeuMetLeu SerLeuLysLeuGluAsnLysGluAlaLysValSerLysArgêluLysAlaValTEpVal LeuAsnPrcGluMaGl^fetfcpGlnCysljsulexjSerAspSerGlyGlnValTjeuLeu GluSerAsnlleLysValLeuPrcaiu^ItpSerlhrProValGlnPrQlfetAlaLeuIle Va 11 euGlyGlyValAlaGlyLeuLeuLeuRielleGlyLeuGlylleHiePheCysVal ArgCysArgHisftEgArgAr^31nAla-%-Ar^4etSerGlnI leLysArgLeuLeuSer GluLysLy^IhrCysGlnC^sProHisAirgRieGInLyslhrCysSerProIle, V 79 V 79 era que ou o seu é Thr ou Ile, é Vai ou Ala, é Thr ou Pro, e é Gin ou Glu; derivado glicosilado. 5ã. - Processo de acordo com a reivindicação 1, ca-racterizado por o referido CD4 ou seu fragmento compreender a seguinte sequência de aminoácidos: MetÃsn¾r¾GlyVa]J>roPhe¾Γ^sI£UI£uLeuValLeuGlnLeu¾laLe^lL·e^iPro MaMaOirGlnSlyLysLysValValIfiiXSlyLysLysGlyAspThrValGluLeuIhr Cy^IhrMaSerGlnLysLysSerIleGlnRiéHi^ErpLysAsnSerAsnGln-@-Lys IleLeuGlyAsnGIriGlySerPhelieuahrLysGlyPtxaSerLysLajAsnAspArg-#- AspSerArgArgSerLeuTrpAspGlnGlyAsriFhe-$-IeuIleIleLysAsnLeLiLys IleGluAspSerAspα]hrTyrIleCyΞGluValGlyAspGlnLyΞGl\JGluValGInL·su I^uValPheGlylaiíIhrMaAsnSerAspíDirHisIjeuLeu em que é Thr ou Ile, -#- é Vai ou Ala, e -$- é Thr ou Pro; ou ou o seu derivado glicosilado. 6ã. Processo para a produção de uma proteína de fusão que compreende CD4 de primata não humano, ou um seu fragmento que se ligue a gpl20 de HIV ou SIV, e uma cadeia pesada de imunoglo-bulina, em que a região variável da cadeia de imunoglobulina foi substituída com CD4 de primata não humano, ou um seu fragmento que se ligue a gpl20 de HIV ou de SIV, caracteriza por compreender : a cultura, num meio nutritivo adequado em condições de produção de proteína, de uma estirpe hospedeira transformada com um vector compreendendo a sequência que especifica CD4 de primata não humano, ou um seu fragmento que se ligue a gpl20 de HIV, ligada a uma molécula de ácido nucleico que especifica uma cadeia pesada de imunoglobulina, em que a referida sequência de ácido nucleico que especifica a região variável da referida cadeia pesada de imunoglobulina foi substituída pela referida molécula de ácido nucleico que especifica o referido CD4 de primata não humano ou seu fragmento, compreendendo ainda o referido vector sinais de expressão que são reconhecidos pela referida estirpe hospedeira e dirigem a expressão da referida proteína de fusão, e a recuperação da proteína de fusão assim produzida . 7ã. - Processo de acordo com a reivindicação 6, ca-racterizado por o referido hospedeiro transformado ser uma linha celular de mieloma que produz cadeias leves de imunoglobulina e por a referida proteína de fusão compreender uma molécula de imunoglobulina de cadeia pesada da classe IgM, IgGl ou IgG3, em que é produzida a referida molécula do tipo imunoglobulina que compreendeque a referida proteína de fusão. 81

8ã. - Processo de acordo cora a reivindicação 6, ca-racterizado por o referido primata não humano ser o macaco rhesus, e por o referido CD4 ou seu fragmento compreender a Seguinte sequência de aminoácidos: MetAsnj^rgGlylleProiPheftr^isLeuIfiuI^uVall^uGlnlieuAlaLeuIieiiPro MaVallhrGln5lyLysLysValValIf>uGlyLysLysGlyAspr[hrValGluLeulhr CysBirAlaSerGlnLysLysAsnlhi^lriEiieHisTrpLysAsnSerAsnGlnlleLys IléLeuSlyIleGlnGlyLeuHieLeulThrLysGlyProSerLysT.fiÍi.SerAspargAla ΑΞρεθτΑτψΕγβεθτίΒυΤτρΑΞρΟΐι^ΙγαγΞΗΐθΞετΜβϋΕΙεΙΙείΡγεΑΕηΙ^ιιΡγΞ IleGliiAspSerAspflhi^ryrlleCysGluValGluAsnLysLysGluGluValGluLeu LeuValHieGlyleuItirMaAsnSerAspGlifflisIguLeuGluGlyGInSerl^iflhr LeultirLeuGluSerProProGlySerSerProSerValLysCysArgSerProGlyGly LysAsnI leGlnGlyGlyArglhrI leSerValPrcGlnleuGlxoArgGlnAspSerGly Ώΐΐ^ΙϊρίΙ^07ΞΤΐιτνα15βτΰ1ηΑΞρ01ηίγΞΏϊΓναΐαΐυΗι^γ3ΐ1βΑ3ρΙ1θν3ΐ ValIjeuMaPheGlriLysAlaSerSerllirValiyrLysLysGluGlyGluGlnValGlu PheSerPheProl£uMaPh£fàirl£i&luLysl£UlhrGlySerGlyGlul£uTr]in^ GlnMaGluArgAlaSerSei^erLysSei^EiTlleíhrRieAspLeuLysAsriLysGlu ValSerValLysArgValIhrGlnAspProLysLei£lr^t£lyLysLysl£uProLeu ΗΐΞΐ^υίΠίΓίευΕΓςβΙηΑίβΙβίΙΡΓςβίΓαγτΜβΟίγεβτΟΙγΑεηΙβίϊΙ^^ΙβϋΑΐβ I^uGluMaLysThrGlyLySLeuHisGlnGluValAsr^uValValMetArgAlalhr GlnPheGlnGluAsnIJeuI!hrCysGluValTrpGlyPrcdhrSerProLysL·euΏΊrL·eu SerLeuLysLeuGluAsnLysGlyAlalhrValSerLysGlnAlaLysAlaValTrpVal LeuAsnRrcGluMaGlyItet®^li£ysLeuLeuSerAspSerGlyGlnVall£uLeu GluSerAsnlleLysValValProcnn^rpPrcíIhrProValGlnPrcMetAlaleuI le ValT.i^iGlyGlyValAlaGlyLeuLsuLeuPhelhrGlyLeuGlylleRieltieCysVal ArgCysAr^iisArgArgArgGlnAlaGluAr^yietSerGlnl leLysArgleuLeuSer GluLysLysftii^ysGlrtysPrcilisArgPheGlnL^^ . 82 9ã. - Processo de acordo com a reivindicação 6, carácter izado por o referido primata não humano ser o chimpanzé, e por o o referido CD4 ou seu fragmento compreender a seguinte sequência de amínoácidos: J MatAsa^Arç^iyValEròPheArffli sLsnT auT ftuValLeuGlnLeuAlaLeiiLeviPro MaMalhrGlnGlyLy^ysValVaILeix;iyLysLysGlyAspa3irValGluLei/lhr C^sIhrMaSerGlnLysLysSerlleGlrPheHisIi^iLysAsnSerAsnGlrtlhrLys IleLeuGlyAsnGlnGlySerHiel fii/TtoLysGlyProSeírLysLeuAsnAspto^Val i ^ AspSerΑτ9Ατ93ετΐ£υΤτρΑ3ρΘΙιτΟ^Α3ηΕίΐ0ΏΐΓΐβΐιΙ lei leLysAsnLeuLys IleGluAspSerAφIhrΊyrIleCysGluValGlyAΞpGlnLyΞGlv^GluValGlnL·eu IauValPheGlylauIhrAlaÃsnSaraspahcHi ^ΡΒυΙ^ϋΰΙηΰΙγΟΙηΒβτΙίΒϋαίΐΓ LeulhrLeuGluSerProProGlySerSerProSerValGlriCysArgSerPrcArgGly LysAsnIleGlrιGlyGlyLy^IhrL·euSerValSerGlriL·eιX31uIeuGlnAspSerGly Ihrltp/IhrCystfhrValLeuGlnAsnGlriLysLysValGluPheLysIleAspIleVal ValLeuAlaPheGlnLysAlaSerSerlléValTyrLysLysGluGlyGluGlnValGlu PheSerPheProLeuMaPhelhrValGluLysLeifllirGlySerGlyGluIjeuIrpa^ Glr^aGluArgAlaSerSerSerLysSerT^IleãhrEheA^LaiLysAsnLysGlu ValSerValLysArgValItuXílJiAspPrQLysLeuGlriMetGlyLysLysI^uProLsu Hi sT PAflhrXguPcoGlnAlaLaiEroGlnflyrAlaGlySerGlyAsnLexíIhrLeuAla lBOGluAlaLyâl]irGlyLysl£i)iHisGIriGluValAsnl^ValVal^tArç^al^ GlhLe\X;lhLyΞAsnIau!IhrCyΞGluValTrpGlyProΊllrSerProLyΞL·eu^íetL·eu Serl^uLysLeTjGlTjAsnLysGlviAlaLysValSerLysArgGlxiLysAlaValTrpVal LeuAsnProGluAlaGly^fetTι^lnCysL·euL·euSerAspSerGlyGlnValL·euL·eu GluSerAsnlleLysValI^uPrxíIhrTrpSerTlirPrdValGlnPrciMetAlaljeuIle Υ3ΐΙ>εααΐγ6ΐγν3ΐ?ϋ.361γΙ^ευΙβΐί[βϋΗΐθΙ1θ61γυΒΐι61γΙ1βΕ1ιβΕ4ΐΘΰγεν3ΐ ArgCysArgHisArgArgArgãlnAlaGInAr^íetSerGlnl leLyEArrgLeuLeuSer GlxiLysLy^IhrCysGlnCysPrcflisftrgPheGIrújyâlhrCysSerProIle; ou o seu fragmento glicosilado. 83

10Ê. - Processo de acordo com a reivindicação 6, caracterizado por o referido CD4 ou seu fragmento compreender a seguinte sequência de aminoácidos: tfetÃsnftrgGlyValPrt^eArçftí i sLeuIeuIfiuValLeι¾3lnLeuAlaL·aJLeuPΓ0 ίϋχΰϋΑΊΛτ0ΐη0^γ^γ8ν3ΐν3ΐΙ^^^γ^γ80ΐγΑΞρα3ιτνηΐαΐυΙβΐϊΙ1η: C^rsThrMaSerGlnLysLysSerIleGlnHieHisTrpLysAsnSerAsriGln-@-Lys IleLeuGlyAsnGlnGlySerPhaLeuTVirLysGlyPrOSerLysLeuAsnAspArg-#-ΑΞρ5βτΑΓ9ΆΤ956Τΐ£ΐϊΙ1^3ΑΞρΟ1η3ΐγΑΞηΣ4ΐθ-$-ΙβαΙ1βΙ1^γΞΑΒηΙβν01.γΞ Ι1άΞΐ\^Άερ86ΤΑΞρΊ!1ιταγΓΐΐ6θγΞ61υν^6ΐγΑερ6ΐηίγ36ΐυ6ΐην3ΐ61ηΐ£ω ΐ£\ίΠη^υ&1η5θτΕτοΡτΌθ1γ8βτ8βτΕπ>5βτνη16ΐη(^ΞΑτ986ΓΕΓθΑΓ9θ1γ LysAsrtfleGlnGlyGlyLyslhrLeuSerValSerGlrfljeuGluLeuGlriAspSerGly Itn^ItpOlxrC^^IlirValIieuGlnAsnGInLysLysValGliaftieLysIleAspIléVal ValLeuAlaHieGlnLysAlaSerSerlleValiyrLysLysGluGlyGluGlnValGlu PheSerHieProLeuAlaPhegiirValGluLy si jaiIhrGIySerGlyGIuLeuIi^frrp GlnAlaGluAcgAlaSerSerSerLysSerTrpIleãhrRieAspLeuLysAsnLysGlu ValSerValLysArgValftirGlnAspProLysIaiX;iri]^fetGlyLysLysLeuProl£u HisLeuIhrLfiuProGlnAlal£uPraGlnTyrAlaGlySerGlyAsnLeuThrLeuAla LeuGluMaLy^BirGlyLysT.euHisGlnGluValAsnLeuValValMetArgÃlalhr 6ΐΠΙίΒΰ01ΐ1ίγ5Α3ηίΡΕ»ΰΐη^561ηνηΐΤι^1γΕιχΊ^5βτΡιχ^γ5ΐ^60ΜΒίΐ£η SerLaiLysLeuGluAsriLysGluAlaLysValSerLysftrgGliiLysMaValTrpVal Ι^υΑ3ΤΐΡΤ06ΐυΜ30ΐγΜΒΐίη^ΐΓ^3Ώ8υΐ£\ι3βτΑ5ρ5βτΟ1γΟ1ηνη1ΙβυΙβη GluSerAsnIléLysValLeuProãhrTrpSerT3n:ProValGlhProMetAlaLeuIle ArgCysArgHisArgArgArgGlnAla-%-AD^letSerGlnI leLysArgLeuLeuSer GluLysLy^nirCysGInCysErcHisÃrgHieGlnLysilirCysSerProIle, 84

em que é Thr ou Ile, -#- é Vai ou Ala, -$- é Thr ou Pro, e é Gin ou Glu; ou o seu derivado glicosilado. 11». _ Processo de acordo com a reivindicação 6, caracterizado por o referido CD4 ou seu fragmento compreender a seguinte sequência de aminoácidos: MetAsnArqGlyValIfroPheArçftíi sT faiLauT euValIjeiXSliiliguAlaTiRuLeuPro MaAlallirGlnGlyLysLysValVallÊuGlyLysLysGlyAspalii^alGluLeuBir Ο^ΞΏιτΜαΕβτΟΙτ^γΞΐΙϊγΞΒοΓίΙθΰΙηΙϊίθΗχΞΤτ^γΒΑΞηΒθτΑΞηΰΙη-β-Τγε IleLaXSlyAsnGlnGlySerPheLeuBirLysGlyProSerLyslBuAsnAspArg-#-AspSerArgArgSerLe;fl!cpftspGlnGlyAsnIfte-$-LeuXleIleLysAsriIjeuLys IleGl^JAspSerAsp/IhrΊyrIleCy9GluValGlyAspGlriLyΞGluGluValGlnL·eu LsuValRlθGlyL·afDlΓMaAsnSerAspΏlrΉisLeuLgu em que é Thr ou Ile, -#- é Vai ou Ala, e -$- é Thr ou Pro; ou ou o seu derivado glicosilado. 85

-X com a reivindicação 6, ser marcada de modo de- 12â. - Processo de acordo caracterizado por a proteína de fusão tectável. 13ã. - Proce caracterizado por a ref polipeptídeo citotóxico de imagens por NMR. sso de acordo com a reivindicação 6, erida proteína de fusão estar ligada a um , marca radioactiva ou agente de formação 14§:. - Processo de acordo com a reivindicação 13, caracterizado por o referido polipeptídeo citotóxico ser ricina ou toxina da difteria.

152. - Processo de acordo com a reivindicação 6, caracterizado por a referida proteina de fusão incluir uma cadeia leve de imunoglobulina. 16ã. - Processo para a produção de uma proteína de fusão que compreende CD4 de primata não humano, ou um seu fragmento que se ligue a gpl20 de HIV ou SIV, e uma cadeia leve de imunoglobulina, em que a região variável da cadeia de imunoglobulina foi substituida com CD4 de primata não humano, ou um seu fragmento que se ligue a gpl20 de HIV ou de SIV, caracterizado Por compreender: a cultura, num meio nutritivo adequado em condi-ç8es de produção de proteína, de uma estirpe hospedeira transformada com um vector compreendendo uma molécula de ácido nucleico que compreende a sequência de ácido nucleico que especifica CD4 de primata não humano, ou um seu fragmento que se ligue a gpl20 de HIV, ligada a uma sequência de ácido nucleico que especifica uma cadeia leve de imunoglobu-lina, em que a referida sequência de ácido nucleico que especifica a região variável da referida cadeia leve de imunoglobulina foi substituída pela referida molécula de ácido nucleico que especifica o referido fragmento, compreendendo ainda o referido vector sinais de expressão que são reconhecidos pela referida estirpe hospedeira e dirigem a expressão da referida proteína de fusão, e a recuperação da proteína de fusão assim produzida . 172. - caracterisado por de imunoglobulina referida proteína globulina que se Processo de acordo com a reivindicação 16, o referido hospedeiro produzir cadeias pesadas das classes IgM, IgGl e IgG3 juntamente com a de fusão para dar uma molécula do tipo imuno-ligue a gpl20 de HIV ou de SIV. 87 18ã. - Processo de acordo cora a reivindicação 16, caracterizado por o referido primata não humano ser o macaco rhesus, e por o referido CD4 ou seu fragmento compreender a Se®uinte sequência de aminoácidos: MatAsnArgGlyTleProPheftrgHi sT euT puT puVal T eufíl nT enAI aT euT euPro MaValBitólnGlyLysLysValVall£iX51yL^ysGlyAspBiifValGl\ajeu(Ilir CysThrMaSerGlhLysLysAsríIhrGlriHieHisTrpLysAsnSerAsnGlnlleLys IleLeiXSlylleGlriGlyLeuPheljeuIhrLysGlyProSerLysI^uSerAspArT^a AspSerArgLysSerljeuTrpAspGlnGlyCysPheSerMetllel leLysftshLeuLys IleGluAspSerAsp(IhriyrIleCysGluValGluAsriLysLysGluGluValGluLeu Ι^υνα]^θ01γΙ^υΏιτΑΐ3ΑΞη5θτΑ2ρΏΐΕΉί5ΐ£υΐ£υ01ιιαΐγ01η5ει:ΐ£υ1ΐιτ LeuIlirLeuGluSerProPrc£lySerSerProSerValLystysArgSerPrc)GlyGly LysAsnI leGlnGlyGlyArglhrl leSerValProGlhLeuGluArgãlnAspSerGly líirtirpOlirCysIhrValSerGlnAspGlriLysTlirValGluHieLysIleAspIleVal ValIjeuAlaTheGlnLysAlaSerSerlhrValTyrLysLysGluGlyGluGlriValGlu PheSerPheProL·euMa]E¾eΏlrL·eι£luLysL·euΏIΛlySerGlyGluL·euΏΓF/rrp GlriAlaGluArg^aSerSerSerLysSerTcpIleíIhrEheAspLeuLysAsnLysGlu ValSerValLysΆrgVcllThrGlnAspProLyΞIJeuGlri^fetGlyLysLysL·euProlJeu HisLeulhrLeuProGlnZÚaLeuProGlriiyrMaGlySerGlyAsnLeua3irLeuAla LeuGliiMaLy^IhrGlyLysI.auHisGlnGluValAsnLeuValValMetAggAlaOir GlrιHαeGlrlGluAsrJl£uIhrCyΞGluValTrpGlyProQϊlrSerProLysL·euΏlrL·eu Serl^uLysLei^luAsrúLysGlyAlalhrValSerLysGlnAlaLysAlaValTrpVal L·euAsnProGluAlaGliMetΊ¾pGlnCysLeuLeuSerAΞpSerGlyGlriVaIIJeuL·eu GluSerAsnlleJjysValValPraíIlirTrpPrctthrPrdValGlnPrcMetAlaLeuIle ValLeuGlyGlyValAlaGlyLeuLeuLeuHieThrGlyLeuGlylleHieHieCysVal ArgCysArgHisArgArgArgãlnAlaGluAr^letSerGlnl leLysArgLèuLeuSer GluLysLysThrCysGlnCysPraHisArgPheGlnLysIhrCysSerProIle. 88

19ã. - Processo de acordo com a reivindicação 6, caracterizado por o referido primata não humano ser o chimpanzé, e por o o referido CD4 ou seu fragmento compreender a seSuinte sequência de aminoácidos: MetAsnAr^lyValItoPheArgH i sT.fíi.iLeuXieuVaILeuGlnLeuAlaLeuLeuPro MaMalhrGInGlyLysLysValValLeuGlyLysLysGlyAspaiirValGluLeuIhr CyslhrMaSerGIiiLysLysSerlleGljTl^eHisTrpLysAsnSerAsnGlrtliirLys IleL·euGlyAsnGlnGlySerHleL·etíIhrLysGlyProSerLyΞL·euAsnAspArgVal AspSerArgArgSerl^uTcpAspGlnGlyAsnftielhrljeuI lei leLysAsnLeuLys IleGluAspSerAspflhrTVrIleCysGluValGlyAspGInLysGluGluValGInIjeu I^uValHieGlyLeuThrMaAsriSerAsp/IhrHisLeuLeuGlnGlyGlnSerLeuIhr LeuIhrLeuGluSerProProGlySerSerProSerValGlnCysArgSerPrQArgGly LysAsnlleGlnGlyGlyLysIhrLeuSerValSerGlnLeuGluLeuGlnAspSerGly ItirTrFflhr^sIhrValLeuGIiiAsnGlriLysLysValGluHieLysIleAspIléVal ValLeuAlaPheGlriLysAlaSerSerlleValiyrLysLysGluGlyGluGlríValGlu PheSerPheProLeuMaPhelhrValGluLysLeulhrGlySerGlyGlur euTrpTrp 01η^30ΐ\αΑτ9Αΐ356ίτ5θΤ8βτΕγ38θΐ^ΕφΙ1θΊΙη:Ε4ΐθΑ3ρΙ^ιΛγ3Α3ηΕ^301ϋ ValSerValLysArgValThrGinAspProLysteuGlrjMetGlyLysLysI^uProLeu HiΞI^uIllrL·euPrcGlnMaLeuPrcGlrflyrMaGlySerGlyAsnL·eu,IhrLeuAla L·euGl^^aLySIhι¾lyLysI£uHisGI^^GluValAsriL·euValVal^fetArgAlaΊhr 01τιΙβυ0ΐι^3ΑΞηί£\ϊΙ^(^3ΰ1υν3ΐΊϊρ0ΐγΡΓ€/Ι1ΐΓ3θτΡτοΕ7ΞΐβυΜθ1ΐ£α SerLeuLysIjeuGlxiAsnLysGluAlaLysValSerLysArgGluLysAlaValTrpVal L·euAsriPrcGluAlaGl^fetΊ¾^pGlnCysIÊuIJeuSerAspSerGlyGlnValIieuL·eu GlxiSerAsnlléLysValLeuPcoOlnmpSeiíIhrEFoValGlriProMetAlaLeuIle ValLeuGlyGiyValAXaGlyLaiLeiÚjeuE^iâlleGlyLeuGlylleFlieFheCysVal AΓgCysAr¢IisArgAΓgArgGlrlAlaGIIlAr^¢yfetSerGIr^IleLysAΓgL·euLeuSer GlxiLysLysThrCysGlnCysPr^HisftrgHaeGlnLyslhrCysSerProI le; ou o seu fragmento glicosilado. 89

\

20S. - Processo de acordo com a reivindicação 16, caracterizado por o referido CD4 ou seu fragmento compreender a seguinte sequência de arainoácidos: MaMalhrGlnGlyLysLysValValXeuGlyLysLysGlyAspãhrValGlúLeulhr cyslhrMaSerGlnLysLysSerlleGlnPhÊHisTrpLysAsnSerAsnGln-e-Lys I leL·euGlyAsnGlnGlySer¾eL·eu,IhrLyΞGlyProSerLysL·euAΞnAspArg-#-AspSerArgArgSerLeu!rrpAspGlri31yAsnHie-$-LeuIleIleLysAsnLeuLys IleGluAspSerAspahrTyrlleCysGluValGlyAspGlnLysGluGluValGlnLeu IeuIhrlfiuGluSerPraProGlySerSerEroSerValGlnCyaftrg^erPrxArgGly LysAsnlleGXnGlyGlyLygRnrl^uSerValSerGlriLeuGluLeuGlnAspSerGly TtoliTilhrCyslta^alLeuGlriAsnGlriLysLysValGluRieLysIleAspIleVal ValLeuAlaRieGlnLysAlaSerSerlléValTyrLysLysGluGlyGlxjGlriValGlu PheSerPheProL·euMaPheΏΌ^alGluLyεL·eulllt¾lySerGlyGluteufItpQ¾p GInAlaGluArgAlaSerSerSerLysSerTrrpIleíIhrRieAspIjeuLysAsnLysGlu ValSerVcQLysAi^allIlirGlJiA^ProLysIeuGlriMetGlyLysLysIieuPrcjIjeu Hi^iíIhrLeuProGlnAlaleuPixGlriíyrMaGlySerGlyAsnLeullirLeuAla I^uGliJMaLysiluGlyLysLeuHisGlnGluValAsriLeuValValMetArgftlalhr GlrnjeuGlnLysAsriLeuBtrC^sGluValTrpGlyPrcaiirSerProLysLeuífetLeu SerL·euLysL·euGluAsriL·y^GluAlaLysValSerLysArgGluLysAlaValTtpVal LeuAsnPrcGliiMaGiy^títpGlnCysLeuLeuSerAspSerGlyGlnValLeuLeu GluSerAsiiCleLysValLeuPrxilhrTirpSertlirProValGInPrcMetAlaLeuIle ValLeuGlyGlyVal¾laGlyL·eúLeuLeuPheIleGlyLsuGlyIlβE¾lePheCysVal Arg(^sArgHisArgArgArgGlnAla-%-Ar^fetSerGlriI leLysArgLeuLeuSer GluLysLyslhrCysGlnCysProHisArgliieGlnLysltirCysSerProIle, em que é Thr ou Ile, -#- é Vai ou Ala, é Thr ou Pro, e -%- é Gin ou Glu; ou o seu derivado glicosilado. 21®. Processo de acordo com a reivindicação 16, caracterizado por o referido CD4 ou seu fragmento compreender a seguinte sequência de aminoácidos: ^tAsnArgGlyValPrt^eAr^i sLeuLeuLeuValIeuGlnLeuAlaLeuLeuPro MaMalfrrGlnGlyLysLysValValIjeuGlyLysLysGlyAsÈ^nirValGluLeuaiir CyslhrMciSerGlnLysLysSerlleGlnEtieHisTrpLysAsnSerAsnGln-ê-Lys IleLeuGlyAsnGliiGlySerRiel^iíIlarLysGlyProSerLy^uAsnAspArg-#-ΑΞρ5θτΑτ9Ατ53βτΐ£υΤΓρΑ3ρ6ΐηθ1γΑΞηΕίι©-$-ΙβυΙ1θΙ1^γΞΑεηΊ^Λγ3 IleGluAspSerAspflhrTyrlleCysGluValGlyAspGlriLysGluGluValGlriLeu I^uValRieGlyLeulhrAlaAsriSerAspQlirHisIeuTieu em que é Thr ou Ile, -#~ é Vai ou Ala, e -$- é Thr ou Pro; ou ou o seu derivado glicosilado. 91 22§. - Processo de acordo com a reivindicação 16, caracterizado por a proteína de fusão ser marcada de modo de- tectável. 23§. - Processo de acordo com a reivindicação 16, caracterizado por a referida proteína de fusão estar ligada a um polipeptídeo citotóxico, marca radioactiva ou agente de formação de imagens por NMR. 24®. - Processo de acordo com a reivindicação 23, caracterizado por o referido polipeptídeo citotóxico ser ricina ou toxina da difteria. 25®. - Processo para purificar substancialmente CD4 de primata não humano, caracterizado por compreender o isolamento do referido CD4 por meio de extracção, precipitação, cromatografia, cromatografia de afinidade, ou electroforese. 26®. - Processo de acordo com a reivindicação 25, caracterizado por o referido primata não humano ser o macaco rhesus, e por o referido CD4 ou seu fragmento compreender a seguinte sequência de aminoácidos: MetAsnAr^lylleProPheAr^íi sT ΡΛίΤβυΤ piiValLsuGlriteoiAlaL^^ AlaValIhrGInGlyLysLysValValLeuGlyLysLysGlyAspalirValGliiLevílhr ÇysIhrMaSerGlrújysLysAsrtlhrGljTPhefíisTcpLysAsnSerAsnGlnlleLys IleLeuGlylleGlJTGlylÊuPheLeuIhrLysGlyPrOSerLysI^uSerAspArgZUa AspSerAr^yΞSerL·euTrpAspGlnGlyCysPheSer^IetIleIleLyΞAΞnL·euLys IleGl\jAspSerAsp(IhriyrIleCysGluValGluAsnLysLysGluGluValGluLeu LeuVal^eGlyLeuThrMaAsnSerA£p®irHisIeuljeuGluGlyGLnSerLeu!Ihr L·eu,IhrL·euGluSerProProGlySerSerPrc)SerValLysCysArgSerProGlyGly LysAsnlleGlnGlyGlyArgT^IleSetValProGlnlÊUGluArgSlnAspSerGly IhrltpflhrCyslhrValSerGlnAspGlriLy^Ilii^alGluFheLysIleAspIléVcil VaUjeuMaPheGliiLysAlaSerSerThrValTyrLysLysGlitólyGliXSlnValGlu PheSerPhéProLeuAlaI^eaiirl£uGliiLysIfiuIhrGlySerGlyGluLevtDrp(ltp GlnAlaGluArgAlaSerSerSerLysSerTrpI leKirl^eAspI^uLysAsnLysGlu ValSerValLysArgVallhrGliTAspProLysLeuGIiTMstGlyLysLysLeuProLeu Ηί3ΐ£ϋ!]^Ι>6υΡΓθ61ηΑΐ3ΐ^υΡτΰβΙιϊ]^Αΐ3σΐγ8θτ01γΑ3ΐΐ£ϋιΙ!ϊτΙβυΑΐ3 LeuGluAlaLyállrt^lyLysLeiíHisGlnGluValAsnLeuValValMetArgAlalhr GlriRieGlnGliiAsnlfixilhrCysGluVallipGlyPrcyilirSerProLysLeuflhrLeu Serl^uLysIeuGluAsnLysGlyMalhrValSerLysGlnAlaLysAlaValTEpVal ΐ£ΐαΑ3ηΡπ301υΑΐ3σΐ^Μ6ΪΏ^ΐΓΚ^5ΐίθΛθυ3βτΑ3ρ3θτΟ1γ0Ιην3ΐΐ£υΐ£α GluSerAsnlleLysValValPrdllu^ItpPrctthrProValGlnProMetAlaleuIle ν3ΐΐ£υαΐγαΐγν3ΐΑΐ3σΐγΐ£ΐίΐ£ΐΛευΗιβ,]ϊιτ01γΐ£ΐΧ;ΐγΙ1θΗΐθΡήθ0γ3ν3ΐ ArgCy sArgHisArgArgArgGlnAlaGluAr^letSerGlnl leLysArgLeuLeuSer GluLysLysTlu^sGlrt^sProHisZ^PheGlnLysIhrCysSerProIle. 93 93

27ã. - Processo de acordo com a reivindicação 25, caracterizado por o referido primata não humano ser o chimpanzé, e por o o referido CD4 ou seu fragmento compreender a seguinte sequência de aminoácidos: MetAsnArgGlyyalPrdFheftrçpisT faiT píhT pnValTgnfll nT^uRl aT *>nT auPto AlaAlalhrGinGlyLysLysValVcilT eiXSlyLysLysGlyAspGiirValGluLeiJlhr C^slhrAlaSerGlnLysLysSerlleGlriEíieHisTriiLysAsnSerAsnGlrtlhrLys Iler^uGlyAsnGlnGlySerHieLeuBirLysGlyProSerLysIjeuAsnAspArgVal AspSerAΓgArgSerL·euTφAspGlΓϊ31yAsnRleGllrL·aItleIleLyεAsnIJeuLyΞ IleGluAspSerAspfllH^iyrlleCysGluValGlyAspGlnLysGluGluValGlnLeu 1βυνο1Ηιβαΐγΐ£υΉΐΓΜ3ΑΞΓΐ5βτΑΞρα3ιιΉΪΞΐ>εχιΙ>Ευαΐηβ1γαΐη5θΓΐ£υΉιτ I^xnhrLeuGluSerPrQProGlySerSerProSerValGInCysArgSerErQAigSly LysAsrd:ieGlnGlyGlyLygIhrl£uSerValSerGlnLeuGluLeuGlnAspSerGly IhrTrpãhrCyglhrVal I euGlnAsnGlnLysLysValGlixPheLysIleAspIleVal ValLeu^aPheGliíLysftlaSerSerlleVaXiyrLysLysGluGlyGluGInValGlu PheSerPheProIeuAl al^eOirValGluLysLeuIhrGlySerGlyGluLeuIqirrp GlnMaGluArgAlaSerSerSerLysSerTrpIleThrPheAspLeuLysAsnLysGlu ValSerVa]IysArgValΊllrGlnAspProLysIJeuGln^ístGlyLysLysL·euProIJeu Hi sLeuIhrl£uPrcGlnAlaLeuPrc^IriryrAlaGlySerGlyAsnT fiuThrLeuAla LeuGluAlεdJyáIhrGlyLyΞIβ^αHisGlnGluValAsnL·BUValVal^fetAΓgΆlaΊhr GlrOLeuGlnLysAsnLeuIhrCysGluValTr^lyPrxilhrSerProLysLeuMetLeu Serl£uLysLeuGluAsnLysGluAlaLysValSerLysArgGluLysAlaValTrpVal ifiuftsriProGluMaGlytfetTqpGInCysLeuLeaSerAspSerGlyGlnVan fsuT eu GluSerAsriIleLysValLeuPrdlhrTEpSerthrRroValGlnPrcífetAlaLeuIle ValIauGlyGiyyalAlaGlyLsuTeuLeuHielleGlyLeuGlylleHieHieCysVal ArgcysAr^iisftrgArgArgGlnMaGlnAr^fetSerGlnlleLysArgLeuIieuSer GluLysLysihrCysGlnQ^PrOHisArgHieGlnLysBirCysSerProl le; ou um seu fragmento glicosilado. 94 94

28â. - Processo de acordo com a reivindicação 25, caracterizado por o referido CD4 ou seu fragmento compreender a seguinte sequência de aminoãcidos: MetAsnArgGlyValEroKxeAr^isIieuLeuLeuVctlIiaaSlriLeuAlaLeuLeuPro MaMaTlrrGlnGlyLysLysValValIeiiGlyLysLysGlyAspãhrValGluLevínir cysliirMaSerGlnLysLysSerlleGlnEíieHisTrpLysAsnSerAsnGIn-ê-Lys I leLeuGlyAsnGlnGlySeri¾eL·ÊU¾lrLysGlyProSerLyΞL·euAsnAspArg-#-Αερ3βτΑτ9Ατ95ετΙβυίΙϊρΑερ0ΐΓΛΐγΑ3ηΙ^β-$-1^ειιΙ1εΙ1^γΞΑ3ηΙβΐύ1(73 I leGluAspSerAspffhrTyrlleCysGluValGlyAspGlnLysGluGluValGlnLeu Ι^ανα1Ι^θΕ^ΐ£υΏΐΓΜ3Α3η5βτΑΞρ/ΙίΐΓΗ isl euJjeix;]jTGlyGlriSerl£u!Ihr Leu31irLeiX;iuSerProPrcX31ySerSerProSerValGlnCysArgSerPrQArgGly LysAsnlleGliGlyGlyLy^flirLeuSei^alSerGlnLeuGluLaiGlnAspSerGly IhrT^pGlgGysihrValI ejjGInAsriGInLysLysValGliiRieLysIleAspIleVal ValIjeuAlaHieGlnLysAlaSerSerlléValTyrLysLysGluGlyGluGlnValGlu PheSerI¾ePro]JeuMaPheThrValGluLysI£lϊIhrGlySerGlyGl^JL·eιlTrp(Prp GlnMaGluArT^aSerSerSerLysSerTrpIledhrPheAspLeuLysAsnLysGlu ValSerVaIIJysArqVal^hrGlrlAΞpProLyΞLeuGln^letGlyLysLysL·euPrQL·eu HisLeuIhrLeuProGlnMaLeuProGlríryrAlaGlySerGlyAsriIieujQirLeuAla LeuGluAlaLy^IhrGlyLysIfaifíi sGlnGluValftsnlguValVallfetÃrçftlalhr GlriLeuGlnLy£AsnI£uIhrCyΞGluValΏ^lyPrcGllrSerProLysL·euMetLeu SerLeuLysLeijGluAsríLysGluAlaLysValSerLysArgGluLysAlaValTrpVal ΐ£θ?^ΞηΡΓ001ηΑΐ301γΜβίΏ^!1ιΚ^Ξΐ^υΐ£υ5€τΑΞρ5θΓΰ1γ61ην3ΐΐ£ΐιΐ£η GluSerAsnlleLysValIeuProQlirTrpSerTlirProValGIriPrcífetAlaLeuIle ValleuGlyGlyValAlaGlyLeuLeul euPhel leGlyLeuGlyllePhePheCysVal ΑΤ9θγ3Ατ9ΗΪ5ΑΤ9Ατ9ΑΓ^1ηΑΐ3-%-ΑΓ9Μ6ί5θταΐηΙ1βΕγΒΑΓ9ΐ£ηΐ£υ3θα: GluLysLy^Ilir^sGlnCysPrcflisArgPheGlnLy^rhrCysSerPzOlle, em que é Thr ou Ile, -#- é Vai ou Ala, é Thr ou Pro, e -%- é Gin ou Glu; ou o seu derivado glicosilado. 29§. - Processo de acordo com a reivindicação 25, caracterizado por o referido CD4 ou seu fragmento compreender a seguinte sequência de aminoácidos: Mp-h&gnfrngfri yVa 1 ProPhg&rrfH i gT AiiT f>nT f»nVa1 T f»n<n nT PnM aT euT guPro MaMaΊhrGlIlGlyLysLysValValL·euGlyLysLysGlyAspíΠlrValGlu^βuIhr CysIhrMaSerGlriLysLysSerl leGlnPheHisTrpLysAsnSerAsnGln-@-Lys I leLeuGlyAsnGlnGlySerFheLeuIhrLysGlyProSerLysLeuAsnAspArg-#-AspSerArgArgSerLeuIfcpAspGlxiGlyAsnPhe-$-l^uIleIleLysAsrfl^uLys IleGluAspSerAspOliETyrlleCysGluValGlyAspGlnLysGluGluValGlnljeu Ι^εαν3ΐΗιβΰ^]^υ^τΜ3ΑΞη3βτΑ5Ε®ιτΗΪΞ]ϋΒαΐ£α em que é Thr ou Ile, -#- é Vai ou Ala, e -$- é Thr ou Pro; ou r ou o seu derivado glicosilado. 6 * ί) 7'

infecções por HIV ou 3€>â. - Método para o tratamento SIV, de preferencia em seres humanos , c: enaer a administração de uma composição ende ®mg /kg p raf erfnci a maca até 50 mg/kg de CD4 de o rhesus ou. chimpanzé , que- se ligue a gp!20 de HIV ou SIV, s um te aceitável* aracterisado por compre-farmaciutica que compre-primata não humano, de ou ds uíh seu fragmento veí cu1o farmaceutieamen- a reivindicação 3Θ, ca~ CD4 de primata não humano 3iâ- - Método ds acordo com racterizado por o referido fragmento de ser solúvel em solução aquosa» Método ds s acordo com a d por o réferi;: io primata nSo reivindicação 30, ca--· humano ser o macaco racter rhesus, e por o referido CD4 ou. seu fragmento compreender a seguinte sequfncia de aminoácidoss MetAsnArgGlylleProPheAr^HisLanl <aiLeuVall£uGlnLeuAlaLeuLeuRro AlaValIhrGlnGlyLysLysValValLeuGlyLysLysGlyAspyihrValGluLeulhr CyslVirMaSerG]jTLysLysAsrtIhrGlnPheHisTrpLysAsnSerAsnGlnIleLys IleLeuGlylleGliTGlyleuEheLeuíIhrLysGlyProSerLyslÊUSerAspArgAla AspSerArgLysSerLeuTrpAspGLnG lyCysRieSerMetl lei leLysAsnleuLys IleGluAspSerAspΏlrΊyrIleCysGluValGluAsriLysLysGluGluValGluL·eu LeuValItieGlylauIhrAlaAsnSerAspOtirHisLeuLeuGluGlyGlnSerljeuIhr LeuflhrLeuGluSerPrdProGlySerSerProSerValLysCyaArgSerRroGlyGly LysAsnI leGlnGlyGlyArglhrlleSerValProGlnLeuGluArgGlnAspSerGly BxrtíqpOlirCytílhrValSerGInAspGlxiLyálhrValGlvíPheLysIleAspIleVal ValIeuAlaPheGlriLysAlaSerSeríhrVaHyrLysLysGluGlyGluGlnValGlu PheSerPhePrQLeuMaPheÍhrLeuGluLysl£t/IYirGlySerGlyGlul£Urrprrp Gljytl^GluArgAlaSerSerSerLysSerltpIleOíirRieAspLeuLysAshLysGlu ValSerValLys¾rgValΊϊlΓGlJl¾ΞpPrdLysL·RuGlΓlMetGlyLysLysL·euPrdL·eu HisT £a3ThrLeuPrc^liAlaIfiuRn3GlnQ^AlaGlySerGlyAsnLeuIhrLeuAla LeuGluAlaLyslhrGlyLysLeiJHi sGlnGluValftsnLeuValValMetArgAlalhr ΟΙηΗίθΟΙηβΙυΑεηΙ^ειΟΙίΓΰνΒΟΐυνβίΤΕρΟΙγΡΓοαίίΓεθΓΡτ^γεΙάΐϊΙΙηΓί^υ Serl^uLysLeuGluAsnLysGlyAlalhrValSerLysGlnAlaLysAlaValTcpVal Ι^5ηΑκηΡτςβ1υΜ3θ1γ^ΰϊρ21ηθνΒΐ£υΐ£υ5βτΑ£ρ8βτΰ1γαΐην3ΐΐ£ΐιΐ£α GluSerAsrJleLysValValErcaihrTrpPrcahrProValGlJTPrcífetAlaLeuIle ValIeuGlyGiyValAlaGlylavtrpaiIfiuPheJhcGlyLeuGlylleEtieRieCysVal ArgÇ^sAr^HisArgArgftr^lnftlaGluArgMetSerGlnlleLysArgLeuTeuSer GluLysLyslhrCysGlnCysPEXíIisArgl^eGlnLy^IhrcysSerProIle.

33ã* - Método ds acordo com a reivindicação 3Θ, ca-racferizado por o referido primata nSio humano ser o chimpanzé, e por α o referido CD4 ou seu. fragmenta compreender a seguinte sequfncia de aminoácidoss

^ΡΑΞηΑτ^01γνα1Ριχ>Ρ^βΑΓ9(Ηΐ5ΐ>£αΓ QuLeuValIjeiXSlriLeuAlaLeuLeuPro AlaAlalhrGInGlyLysLysValVa 1,1 eiXSlyLysLysGlyAspOurValGluLeuIhr cysIhrAlaSerGlriLysLysSerlleGIrffheHislirpLyaAsnSerAsnGlrtlhrLys IleLeuGlyAsnGlnGlySerPheljeiíIhrLysGlyProSerLysLeuAsnAspArgVal AspSerΑΓ9Ατ^5βτΐ£υΤτρΑΞραΐη3^Α3η^βΏιτΐ£ΐιΙ lei leLysAsnLeuLys I leGluAspSerAsp/nidryrl le<^sGluValGlyAspGlriLysGluGluValGlhLsu I^ValPheGlyLeuIhrAlaAsnSerAsp/IhrHisI euLeuGlnGlyGlnSer^uThr LeuBirLeuGluSerPròProGlySerSerProSerValGlnCysArgSerPrQArgSly LysAsnlleGlnGlyGlyLysIhrLeuSerValSerGlnLeuGluLeuGlnAspSerGly IhrTrpOYirCysTtirValLeuGlnAsnGlriLysLysValGluPheLysIleAspIleVal ValLeuAlaPheGlnLysAlaSerSerlléValTyrLysLysGluGlyGluGlnValGlu PheSerFheProIeuMaPheíhrValGluLysIvsulhrGlySerGlyGlulBuTtpíErp GlnM.aGluto^aSerSerSerLysSerTtpIléIhrPheAspLeuLysAsnLysGlu ValSerValLysArgValIhrGlnAspProLysLeuGInMetGlyLysLysLeuProLeu HisIeuΊhr]JeuPrcGlJ^MaL·euProGlrlfΓyrAlaGlySerGlyΔsnLeuΏIrL·euAla LeuGluMaLysIhrGlyLysLeuHisGInGluValAsnLeuValValMetArgAlaTlir Glnl£tX5lJiLysftsnLeufIhrCysGluValTrpGlyPrciPirgerProLysL£uMetJjeu SerLaiLysLeuGliiAsilLy5Glu&laLysValSerLysA£gGluLysAlaValTEpVal LsuAsnPrΌGluMaGly^fetIiφGlr^ysLeuLeuSer¾spSerGlyGInVa 1T euT eu GluSerAsnlIeLysValIeuPrdlhrTi^SerThrProValGlhPrcMetAiaLeiiTle ArgCyΞArgHisftrgArgArgGIJlAlaGIIlArg^^etSerGlriIleLysArgL·euLβuSer GluLysLy^IhrCysGlriCysPrcíiisArgFheGlnLysItirCysSerProI le ; ou um seu fragmento glicosilado,, -sr . 34=„ - Método de acordo com s reivindicação 3Θ5 carácter is ado por o referido CD4 ou seu fragmento compreender a seguinte sequência de aminoácidoss AlaAlalhrGlnGlyLysLysValVal LeuGlyLysLysGlyAspIhrValGluLeiflhr Cysltu:MaSerGlnLysLysSerIleGlnPheHisTrpLysAsnSerAsnGln-@-Lys I leleuGlyAsnGJjiGlySerPhel^uíItirLysGlyProSerLysLeuAsnAspArg-#-AspSerArgArgSerLeuTrpAspGlriGlyAsnEÍie-$-LeuI lei leLysAsnLeuLys IleGluAspSerAspGíirTyrlleCysGluValGlyAspGlnLysGluGluValGlríLeu Ι^ΥοίΙΡΙτθΟΙγΙ^υΏίΓΑΙ^ΑΗηδβΓΑΒρΏιτΗΐ sLeiiLeiJGlnSlyGlnSerLeuflhr LeuffhrLeuGliJSerPrQProGlySerSerPcoSerValGlnCysArgSerPrQArgGly LysAsnI leGlnGlyGlyLysIhrLeuSerValSerGlnLeuGluLeuGlnAspSerGly ItirTrpOlirCysThrValIjeuGInAsnGInLysLysValGluRieLysIleAspXIeVal ValLeuMaPheGIriLysAlaSerSerT leValT^LysLysGluGlyGlijGlnVa] Glu PheSerPheProI^uAlal^eahrValGliiysIaullhrGlySerGlyGluI^uTEpíItp GliyvlaGluArgAlaSerSerSerLysSedltpIleíIhrlfieAspLeuLysAsriLysGlu ValSerValLysArgValΊhrGlnAsí^dLysL·euGlrí^fetGlyLysLysL·euProLeu H.i s!euIhrleuPrcGIj^aLeuPr(a5]jnfiyrAlaGlySeiGlyAsnLeiflhrLeuAla LeuGluAlaLyálhrGlyLysI^uHisGlnGluValAsnLeuValValMetArgAlaThr GIxiI^iXSlnLysÃsrJjeuítLt^sGluValTrpGlyPrctthrSerProLysIjeul^tLeu SerLeuLysIeuGluAsnLysGlxoAlaLysValSerLysArgGluLysAlaValTrpVal ItiuAsnProGlxiMaGlj^tTrpGlnCysLeuLeuSerAspSerGlyGlnValLeuLeu GluSerAsrJléLysValLeuErdlhrTcpSerTlirProValGlnPrcMetAlaLeuIle ValLeuGlyGlyValAlaGlyLeuT.euLeuRÍelleGlyLeuGlylleRiePheCysVal ArgCysArgHisArgArgArgGlnAla-%-ArgMetSerGlnI leLysArgLeuLeuSer GluLysIysItaCysGInCysProHisArgRieGinLysItirCysSerProIle,
— §2 — é Thr ou 11 e, é Vai ou Λ i Hi a;1 è Thr ou i~k .. £5 /* Sln ou BI U| seu derivado gl icos-ilado» rea.vxndis.aw3Q ca™ Humano ser o macaco sgmen to compreender a -·· ristodo de acordo com a ractensado por o referido primata nlo rhesus, e por o referido CD4 ou seu f? seguinte sequência de aminoa.cidosã ePrnPh^rgHí ηϊ aiiT auT euValTeuGT ni^uAlaLeuLeuPro Μ3νά1ΏΐΓθΙ^^γΞίγεναΐνά1ΐ£υαΐγΙγ^γ3θ1γΑΞρ/Ι^τναΐαΐυΐ£ΐί1ϊιτ CyslhrMaSerGlriLysLYHAsríB^liiPheHisTrpLysAsnSerAsriGlriIleLys IleLeuGlylleGlnGlyl^uRieLeuCIhrLysGlyProSerLysLeuSerAspArgAla AspSerAi^LysSerLeuItpAspGlriGlyCysRieSerMetl lei leLysAsnLeuLy s IleGluAspSerAspahrTyrlleCYsGluValGluAsnLysLysGluGluValGluLeu I^uValI^eGlylfiuIhrAlaAsnSerAspaiudlisLeuIjeu. 100

mano ser o chimpanzé,! s compreender a. seguinte

AlaAlaΊhrGlrιGlyLysLysValValL·euGlyLysLysGlyAsp/IllrValGluL·euΏlr CysThrAlaSerGInLysLysSerlleGinHieHisTrpLysAsnSerAsnGliiíIlirLys IleLeuGlyAsnGlnGlySerPheLeiflíirLysGlyProSerLysLeuAsnAspArgVal AspSerArgArgSerLeuTrpAspGlnGlyAsnPhélhrLeuI lei leLysAsnLeuLys IleGluAspSerAspllirTycIleCysGXuValGlyAspGlriLysGliiGluValGlnLeu ou o seu derivado glicosilado,

seguinte sequência de aminoácidos» MetAsnArgGlyValPraPheRrigHi κΤ enT faiT f»nVa1 T f>ivr| nj 01 iS,~) aT p>nT ^jiPrn MaMaXhrGlrTGlyLysLysVedValI^uGlyLysLysGlyAspahrValGlulBiíttir CysThrMaSerGlrJJysLysSerIleGlnPheHisTrpLysAsnSerAsnGln--ê-Lys I leLeuGlyAsnGlnGlySerPhel gxfltirLysGIyProSerLysL^oAsnAspArgAla AspSerArgArgSerLeuIrpAspGlriGlyAsnFiie-Ç-LeuI lei leLysAsnLeuLys IleGluAspSerAsjpOlH^iyrlleCysGluValGluAspGlrújysGli^luValGlnlÊU LeuValPheGlyLeilIhrAlaAsnSerAspfllujHisLeuLeu 101 • Λτ _ em aue

-e- ír- Thr ou 1 le? é Vai ou Ala, *~·ψ é Thr ou Ftq ρ OU seu derivado glic osx lado ρ ; condi Lção de que psl o menos e s nr. 3Sê, - Método para α tratamento de infecçSes par HIV ou SIV? caracterizado por compreender a administração de uma composição farmacêutica que compreende mg/kg até 5Θ mg/kg da uma proteína de fusão que compreende CB4 de primata não humanos ou de um seu fragmento que se ligue a q ρ 12θs e uma cadeia pesada de imunoqlobulina ou uma cadeia leve imunológica, em que a referida região variável da cadeia de imunog1ohu1ina foi substituída com CD4 de primata não humano, ou om seu fragmento que se ligue a gp'120 de HIV ou S! vP fragmento esse de CD4 de primata que é capaz de se liqar a qpI28 de HIV e SIV»

39â = · Método de acordo com a reivindicação 38, cs-racterizado por o referido primata não humano ser o macaca rhesus, e por o referido CD4 ou seu fragmento compreender a seguinte sequência de aminoácidoss ^t^nAi^lylleRroRieargHisLeuLeuT iSuValijeiKSInLeuAlaLeuLeuEro AlaVaiaJu^lnGlyLysLysValValLeuGlyLysLysGlyAspOhrValGluLeuflhr Cy^hrAlaSerGlriLysLysAsrtlhrGlnRieHisItpLyE^nSerAsnGlnlleLys I leLeuGlylleGlnGlyLeuH^el euThrLysGlyProSerLysLei^SerAspftrgAla AΞpSerArgLyΞSerLeuTrpAspGIrlGlyCyΞPheSerMetIleIleLyΞAsnL·euLyΞ IleGluAspSerAspOhrTyrlleCysGluValGluAsnLysLysGluGluValGluLeu LeuValItLeGlyliaiTIirAlaÃsnSerAspIhrfí i sT £^I^iKSluGlyGlnSerLeuflhr LafflurleuGliíSerProRn^lySerSerEroSerValLysCysArgSerProGlyGly LysAsnlleGlnGlyGlyArgBirlleSerValProGInljeuGluArcfGlnAspSerGly ThrltpOhrCysThrValSerGlnAspGlnLysIhrValGluPheLysIleAspIleVal ValLeuMaPheGlnLysMaSerSerOirVcLlTyrLysLysGluGlyGluGInValGlu PheSerPheProLeuAlaPheíIhrLeuG luLysLeiflhrG lySerG lyGluIeuTrp/Trp GlnMaGluArgAlaSerSerSerLysSerTcpIleThrPheAspLeuLysAsriLysGlu ValSerValLysAtrgVallhrGlnAspProLysLeuGlhMetGlyLysLysLeuProLeu HisleiíIhrl£uProGlnAlal£uPrx01ríI^MaGlySei^lyAsnLeud3irLau^la LeuGluMaLysThrGiyLynT eufíi sGIrCluValAsnleuValValMetArgAlaThr GlnPheGlrGluAsnl£uBxr^ysGluValTrpGlyPrcffhrSerProLysLeiiIiirLeu SerLeuLysLeuGluAsriLysGlyAlalhrValSerLysGlnAlaLysAláValTrpVal LeuAsriProGluAlaGlyMatÍri^lnCysLeuLeuSerAspSerGlyGlnValLeviT eu GluSerAsnIleLysValValPrcOh]^IipPníIhrProValGlríPrcMetAlaLeuIle ValIauGlyGlyVal^aGlyLeuLeuLeuI^eflhrGlyLeuGlylléEÍiePheCysVal ArgCyEArgHisArgArgAr^lnAlaGluAr^fetSerGlnl leLysArgLfiuLeuSer GluLysLysThrcysGlnCysRrcHisArgHieGInLyslhrCysSerProIle. X 4ÔSn ··· Método de acordo cts® a reivindicação 383 ca-~ racterisado por o referido primata não humano ser o chimpansé = e por α o referida CD4 ou seu fragmenta compreender a seguinte sequfncia de aminoácidoss MetAsnArgGlyValProPheArgHisLsuIeu^uValIeuGlr^uMaleuLeuPro MaMaIí»31nGlyLysLysValVall£:uGlyLysLysGlyAspatirValGluLeiiIhr CysOlirAlaSerGlnLysLysSerlleGlnRieHisTrpLysAsnSerAsnGlríIhrLys IleLeuGlyAsnGlnGlySerRieLeuIhrLysGlyRroSerLysLeuAsnAspArgVal Α3ρ8άτΑτ9Αι^80τΙάΡΤΓρΑοραΐη31γΑ5η^είΙ^τΙβΐιΙ lei leLysAsnLeuLys IleGluAspSerAspíIhrTyrlleCysGluValGlyAspGlnLysGluGluValGlnleu LeuValPheGlyDauTlirMaAsnSerAspnirHisIjauIeuGlnGlyGlnSerLeulhr LeuItLrljeuGlxiSerProProGlySerSerProSerValGlnCysArgSerPrQArgGly LysAsnIleGlnGlyGlyLySlIhrLβuSerValSerGlnL·euGluLeuGlnAspSeΓGly ThrTi^Tiiih^slhrValIjeuGlnAsnGlnLysLysValGluPheLysIleAspIleVal ValIeuAlaPheGlnLysAlaSerSerlleValTyrLysLysGluGlyGluGlriValGlu RieSerPheProLaAIaHiegigValGlviLysIeiflhrGlySerGlyGluI^u(Itp>rrp GlnMaGluArgAlaSerSerSerLysSerTrpIleOlirPtieAspIjeuLysAsnLysGlu ValfíelΛ7alLysArgValΏlrGlnAΞpProLysLeuGlrl^ϊetGlyLyΞLyεLeuErQL·eu H isLeuIhrLeuPrcGlnMaleuRrcGlriryrAlaGlySerGlyAsriIeuJlirLeuAla IeliSluAlaLyslhrGIyLysLeuHisGInGluValAsrileuValValMetArgAlaihr GlriLeuGlnLysAsnLeulhrCysGluVallipGlyPrc/IhrSerProLysLeuMetleu SerLeuLysLeuGluAsnLysGluAlaLysValSerLysArgGluLysAlaValTrpVal IauAsr^<^luMaGlyMetíEcpGlnCysIjeul£uSerAspSerGlyGlnVaILeuLeu GluSerAsnI leLysValLeuPíxGiicltpSerihrProValGlnPro^tAlaLeuI le ValleuGlyGlyValAlaGlyLeuLeuLeuPhelleGlyLeuGlyIléPhePheCysVal ArgC^sArgHisArgArgAr^lnAlaGlnArgMetSerGlnl leLysArgLeuLeuSer GluLysLyslliECysGlrK^sPnSIisArgHieSlrúly^IhrCysSerProIle; ou um seu fragmento glico-siladun «tis. Método ds acordo racterizatío por o referido Cd4 ou seguinte sequência de aminoitcidass com a reivindicação 38, seu fragmento compreender c MetAsnArgGlyValProPheArgH isT euLeuIeuValIauGIxíteuMaleuT fíuPro MaAlalhrGlr^lyLysLysValValLeuGlyLysLysGlyAsp/mrValGluLeuIiir C^sThrAlaSerGlnLysLysSerl leGlnPheHisIipLysAsnSerAsnGLn-ê-Lys IleLeuGlyAsnGlnGlySerPheLeuIhrLysGlyProSerLysLeuAsnAspArg-#-Α3ρ5βτΑτ9Ατ98βΓΐ£ϋΊϊρΑ£ρ8ΐΓΐ01γΑ3ηΗιβ-$-ΐΒΐιΙ1θΙ1^γ3Α3ηΐ£ΐ^3 IleGliaAspSerAspGSiriyrlleCysGluValGlyAspGlnLysGlijGluValGlnLeu LeuValHieGlyleiilhrMaAsriSerAspOirHisLeuLeuGlnGlyGlnSerLeifliir IaiíIhrLeuGluSerPrdProGlySerSerProSerValGlJiC^sArgSerPrQArgGly LysAsnlleGlnGlyGlyLyslhrleuSerValSerGlriLeuGluT euGlrAspSerGly IhrTrp/IhrCysItu^alIeuGlJTAsnGlxiLysLysValGluRieLysIleAspIleVal ValLeuAlaHieGlnLysAlaSerSerlleValTyrLysLysGluGlyGluGlnValGlu I¾eSerRleProL·euAlaPheΊhrValGluLysL·eιfllϊrGlySerGlyGlι^uItp(Γφ GlnAlaGluArgAlaSerSerSerLysSerTEpI letthrPheAspI^uLysAsnLysGlu ValSerValLysArgValThrGlnAspProLysLeuGlnMetGlyLysLysLeuProLeu Ηΐ3Ι^ευ!]^ΐ£ϋΡτςΛ1η^θΙ>αϋΕτςΛΐιϊΐντΑΐ3θ1γ8θΓ61γΑ3ηΙβνίΙ1ΐΓΐ£υΑΐ3 LeuGluMaLySThrGlyLysLeuHisGlnGluValAsnljsuValVallfetArgAlaltir GlnT.euGlnLysAsnl euTiirCysGluValTrpGlyPrdlhrSerRroLysLeuMetXeu SerLeuLysLeuGluAsr&ysGluAlaLysValSerLysArr^luLysMaValTrpVal IguAsnPtx^luA3^1yMata^pGlnCysl£ixT ^LSerAspSerGlyGlnValLeuLeu GluSerAsaEleLysValLeuPrc/IhrTt^SerThrPrxÍValGlriPix^tAlaXeuIle ValteuGlyGlyValAlaGlyLeul eAiLeuFhelleGlylguGlyllePheRieCysVal ArgCysArlgHisArgAΓgArgΞlrtfiLa^-Arçp^etSerGIrιIleL·ysAΓgIJeuIJeuSer GliiLysLysThrCysGlnCysPnDHisArgPheGlriLysIhrCysSerProI le,

I sás que —1™ Th r ou I le, ê Mal ou Ala, •~S— é* Thr ou Pro, e —é 81n ou 61u§ ou o seu derivado glicosilado. a reivindicação 38, ca-ΐragmento compreender a. ~ Método de acordo com racterisado por o referido CM ou seu seguinte sequência de aminoácidoss IfetÃsnArqGlyValPrdPheArqH i sT euT auT euValLeuGliiIauAlaLeuLeuEro MaAlalhrGlnGlyLysLysValValLa^lyLysLysGlyAspahrValGluLeuflhr C^sIiirMaSeiGlJiLysLysSerIleGlnPheHisTrpLysAsnSerAsnGln-@-Lys IleLeuGlyAsnGlnGlySerPheLeuIhrLysGlyProSerLysLeuAsnAspfirg-#-AspSerArgArgSerLeiírrpAspGlnGlyAsriPhe-$-lÊUlleIlèLysAsnLeuLys IleGluAspSerAspíIhriyrlleC^luValGlyAspGlnLysGluGluValGlnLeu I^uValPheGlyLeuIhrAlaAsnSerAspghrH i sLeuIeu em que ê Thr ou I le. é Vai ou Ala, e è Thr ou Prop au ou o seu derivado glicosilado*

43ã = - Método da acorda com a reivindicação 38, ca· isr mercada raeterizado por a proteina da fusão vel. 44£- „ - Método de acordo com a rei vindicaçlo 38 5 ca~ atío por a referida proteina de fusão estar 1igada a um -i. *—í L·. X t Ο ΐ— ϊ—? Λ .1. ΐΧ , 1* ca radioacti va ou agente de for maçao de imagens por NMR, Método de acordo com reivindicação 33, carscte- ou risado por o referido polipeptídeo citotáxico ser ricina toxina da diΐ teria» 4Aa. Método de acorde :om a reivindicaçlo -5B, ca* rã» ter i saoo por a protexna os τ lis a o xnciu.xr uma cadeia 1 ct£ imunoglofaulina e uma cadeia pesada de imunoglobulins. 47ã» - Método de acordo com a reivindicação 38, ca-r a c: t e r is a d o por a proteina de fusão compreender cadeia pesada de imunoglobulina da classe IqM, Iq81 ou IaG3» 48â. — Processo ρ-ara a produção de um complexo, ca— raeterizado por compreender o contacta de uma proteina, glicopra-teina ou fragmento de CD4 de primata não humano, ou uma sua coiTiposição farínac'§uticas com gpi20? produzindo deste modo o referido complexo» rrocass

acorao com rsivinoicaçao 4b csractBrizado por compreender a ligação dos referidos proteína glicaproieina ou fragmento de CD45 ou. uma sua composição farma· c s lí t .i c a >j a Uirf pol i pe pt ídso c itotóxic o, marca Γ-Sd IDSC tiva ou y aqante de form ação de imagens por NMR , que se 1igue a células infectadas C DsTl gpl 2© ds HIV du SIV5 produzind o deste modo □ referido c ompl &>i O s rBlVinOIt-dCâD 4v! 5©ã» - Processo de acordo com ricma caracterízadci por o referido polipepiídeo eitoióxico ser ou toxina da difteria» Sis..· — Processo para a detsccao de qpí20 de HIV ou de SXV numa amostra, carsctenzado por coispresndsrs Ca) o contacto de uma amostra suspeita de conter gpí2ô de HIV ou. de SIV com a proteína de fusão que compreende CD4 de primata não humano, ou de um seu fragmento que se ligue a g ρ12©, s uma cadeia pesada de imunogiofaulina ou uma cadeia leve imunológica, em que a referida região variável da cadeia de imunoglobulina foi substituída com CD4 de primata não humano, ou om seu fragmento que se ligue a qp 12© de HIV ou. SIV, fragmenta esse de CD4 de primata que é capaz de se ligar a gol2© de HIV e 81Vs s ch) detecção da formação do complexo» 52§» - Processo de acordo com a reivindicação 51, caracterizado por a proteina ds fusão ser marcada de modo detestável . - ίΦΡ* SIV numa SfTtQStra. Processo para a tíetecção de qρ 1.2@ de H i v ou de ϊ i_iierJ.^aoo por coopreericlers (a) o contacto cie unta amostrai suspeita de conter gρ120 de HIV ou de SIV com CD4 snmwi·? fn n; ? r··i á *-i-· primata não humano; ou um < b) a oecsccSo oa torniscãc ao coírpísko, 54s- Processo de acordo com caracterizado por o referido CD4 de primata não humano ou fragmento ser marcada de modo detectável. re x v .x mui c aç ao Lisboa3 22 de Agosto de 1990

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