PT94973A - Processo de preparacao de fragmentos 6-17 da beta-endorfina - Google Patents

Description

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Ref: 0/3118-545 memGria descritiva

ANTECEDENTES DO INVENTO

Campo; 0 presente invento refere-se a pêptidos derivados de um fragmento da hormona β-lipotrõpica (β-LPH) .

Estado da Arte: A hormona β-lipotrõpica humana consiste de 89 aminoãcidos e tem actividade de mobilização de gorduras. Jã foram descritos na literatura, fragmentos desta hormona que têm diferentes funções. Os fragmentos 39-56 da β-LPH têm, por exemplo, um efeito sobre os melanõcitos e, consequentemente, influenciam a pigmentação da pele. As β-endorfinas, fragmentos 59-89 da β-LPH, têm um efeito analgésico, relativamente ao qual a naloxona tem uma acção antagónica. 0 efeito analgésico da morfina pode, do mesmo modo, ser antagonizado pela naloxona, pelo que se justifica a conclusão de que a morfina e as β-endorfinas têm influência num mesmo receptor.

Para além disso, jã se verificou que a β-endorfina possui certas propriedades psico-farmacolõgicas. Assim, este péptido retarda a extinção do comportamento de evitamento (activo) em ratazanas, no bem conhecido teste de subida ao poste (comportamento de evitamento ao salto do poste). Esta característica da β-endorfina não pode ser antagonizada por antagonistas conhecidos da morfina, tais como a naloxona ou a natrexona, pelo que, certamente, se justifica, a conclusão de que a acção psico-farmacolõgica da β-endorfina se estabelece independentemente dos centros receptores de opiáceos do cérebro .

Verificou-se que além da β-endorfina, os fragmentos de péptido, mais pequenos, seus derivados, tf-endorfina e met-encefalina, também inibem a extinção do comportamento de evitamento, de um modo semelhante.

Também se verificou que, o péptido da T-endorfina, a β-endorfina 1-17, que difere da zr-endorfina pela presença de apenas un ami-noãcido adicional (leucina), no lado do terminal C, apresenta uma - 3 - _

Ref: 0/3118-545 acção psico-farmacológica, se bem que de natureza totalmente diferente da das endorfinas oc- e p-. Enquanto que com a íí-endorfina, a extinção do comportamento de evitamento era retardada, verificou-se que, em contraste, a T-endorfina acelera a extinção do comportamento de evitamento. É notável que a adição de um resíduo de aminoãci-do na parte do terminal C da íf-endorfina, cause uma tão drástica inversão do efeito sobre o comportamento. Além da própria γ-endor-fina, também foram divulgados derivados da y-endorfina, ver Fedido de Patente Alemã 2 826 533, correspondente a GB 2 000 151. Este pedido de patente descreve, inter alia o derivado β-endorfina day--endorfina, que lhe atribuí propriedades analgésicas, propriedades anti-depressivas, calmantes, sedativas e hipnóticas.

No Pedido de Patente Europeia EP-A-0 004 394 (correspondente â Patente US NÇ 4 256 736), afirma-se que os pêptidos com a sequência de aminoãcidos dà β-endorfina 2-17, ou análogos muito semelhantes, seus derivados, aceleram a extinção do comportamento de evitamento, em maior grau do que no caso day-endorfina. Além disso, em contraste com a γ-endorfina, esses pêptidos não têm nenhuma outra afinidade, qualquer que seja ela, relativamente aos receptores de opiáceos.

Verificou-se, também, que a sequência completa 2-17 da B--endorfina não ê necessária para manter a actividade de extinção acelerada (patente Europeia n? 0 015 036, correspondente â Patente US n9 4 271 152).

Contudo, os pêptidos das duas referências mencionadas em último lugar apresentam desvantagens. Nao são metabolicamente estáveis. Consequentemente, podem surgir efeitos secundários, como resultado dos fragmentos de pêptido formados durante a degradação metabólica. A síntese de diversos pêptidos relacionados com a B-LPH 62--77, mas encurtados a partir da extremidade N terminal, ê descrita em Greven, H.M. et al., "Synthesis of fragments of human β-lipotro-pin, B^-LPH Part IV. The synthesis of shortened peptides related to des-l-tyrosine-^-endorphin /"p-LPH- (62-77)^/" , Journal of the’ Royal 71 315

Ref: 0/3118-545 - 4 - rzL·*. ^

Netherlands Chemical Society, 99/9, pp. 284-286 (Set. 1980). Nas síntese descritas, foi utilizada a abordagem clássica da condensação de fragmentos.

SUMÁRIO DO INVENTO 0 invento inclui um novo fragmento 6-17 da jB-endorfina que possui um derivado da lisina na posição 9. Esses fragmentos da en-dorfina são surpreendentemente e metabolicamente estáveis.

Os novos pêptidos, de acordo com o invento, contêm, pelo menos, a sequência de aminoácidos de acordo com a formula geral I: 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17

Tr e-R^-L-Glu-X-L- Ser-R2~L-Tre-Pro-L-Leu-Val-Tre-R2 (I) na qual X ê um derivado da lisina, seleccionado do grupo Lis(Ac), Lis(Z), des-Lis, A2I1Í, Nle, Met, Leu e Lis/lar)alquil/, R-^ ê Ser, Ala ou Pro, R2 ê L-Gln, D-Gln, Glu(tiramina), ou seus derivados contendo iodo, e R^ ê L-Le.u, Leu-NHCH^, Met, Fen#Fen(Cl), Fen(I), Cha, Mag, Vai, (HO)Leu, Bua ou Bug.

Tal como já foi descrito, na especificação da Patente Europeia n9 0 015 036, os quatro aminoácidos do terminal N da sequência 2-17 não são essenciais para a acção da 7>-endorfina. Contudo, i bem possível que um ou mais desses aminoácidos do terminal N esteja presente nos pêptidos de acordo com o invento, sem que a actividade seja, como resultado, enfraquecida. A sequência de amonoãcidos torna--se então: (II) L-Gli-L-Gli-L-Fen-L-Met-Tre-R^-L-Glu-X-L-Ser-R2-L-Tre-Pro- -L-Leu-Val-Tre-R^, na qual X, R^, R2 e R^ são definidos tal como o foram acima. 0 invento também inclui os pêptidos que consitem apenas das sequências de acordo com as formulas I e II, e seus derivados - 5 - 71 315

Ref: 0/3118-545 funcionais. Essas sequências são, então: (III) H-Tre-R^-L-Glu-X-L-Ser-í^-L-Tre-Pro-L-Leu-Val-Tre-R^-OH e

(IV) H-L-Gli-L-Gli-L-Fen-L-Met-Tre-R^-L-Glu-X-L-Ser-R2~L-Tre--Pro-L-Leu-Val-Tre-R-OH

DESCRIÇÃO DAS CONCRETIZAÇÕES PREFERIDAS

Os pêptidos de Formulas (II), (III) e (IV) são preferidos, uma vez que a sua preparação é económica e simultaneamente, além disso, dão origem a menos efeitos secundários ao se degradarem, uma vez que são libertados menos fragmentos de péptido.

De entre os pêptidos preferidos, os metabolicamente mais estáveis são os pêptidos nos quais X i Nle ou Lis-(Ac).

Os melhores resultados são obtidos em combinação com um conjunto de substituições, tais como as que são indicadas abaixo. Pêptidos de acordo com as fórmulas acima, nas quais X é Nle, R^‘ é Ser, R2 ê Gin e R^ é Leu. Pêptidos de acordo com as fórmulas acima, nas quais X ê Lis-(Ac), R^ é Ser, R2 é Gin e R^ é Leu. Pêptidos de acordo com as fórmulas acima, nas quais X é Lis-(Ac), R^ i Pro, R2 é Gin e R^ é Leu. Pêptidos de acordo com as fórmulas acima, nas quais X i Lis-(Ac), R^ ê Pro, R2 é Gin, R^ ê Cha e Tre, na posição 76, ê D--Tre.

No caso dos aminoãcidos para os quais não ê indicada a configuração L ou D, não existe preferência por qualquer uma delas. Contudo, a configuração D é, em geral, mais estável.

Começando a partir dos pêptidos de acordo com o invento, podem ser preparados muitos pêptidos derivados, sem desvio em relação ao espirito do invento. Muitos métodos de produção de derivados, - 6 - ^ 71 315

Ref: 0/3jl8-545 úteis neste invento, são descritos no Pedido de Patente Europeia n9 0 015 036, cujo conteúdo é incorporado através desta referência.

Os compostos do invento são úteis, inter alia, devido à sua actividade anti-psicõtica.

Nesta dèscrição aplica-se o seguinte: I. Foram usadas as abreviaturas seguintes para os grupos pro-tectores ou activadores utilizados: tBu = butil terciário

Me = metil Z = benziloxicarbonil II. As abreviaturas seguintes foram atribuídas aos solventes ou reagentes utilizados:

To = tolueno etOH = etanol

Bu. = butanol HOAc = ácido acético

Am = álcool amílico I.A.N. ou IAN = nitrito iso-amílico DMF = dimetilformamida DCC = diciclo-hexilcarbodiimida DCU = diciclo-hexilureia TFA = ácido trifluoroacético N.E.M. — N-etilmorfolina HOBt = N-hidroxibenzotriazolo III. Foram usadas as abreviaturas seguintes, para os grupos aminoãcidos:

Met = metionil

Fen = fenilalanil

Pro = prolil

Ser = seril

Lis ' = lisil

Tre = treonil 71 315 Ref: 0/3118-545 «—»

Glu = glutamil

Gin = glutaminil

Vai = valil

Leu = leucil

Ala = alanil

As outras abreviaturas, são abreviaturas para derivados de aminoãcidos e são definidas tal como se segue. Cha = ciclo-hexilala-nina; A2hi = acido 2,6-diamino-hexinõico; tiramina = descarboxiti-rosina; HO(Leu) = acido lêucico; Bua = butilalanina terciária;

Bug = butilglicina terciária; Lis(Ac) = Lis-(acetil); Lis-Z = li-sina com um grupo benziloxicarbonilo na posição E; Mag = metalilgli-cina.

Os péptidos e os derivados de pêptidos de acordo com a fórmula geral I, são preparados do modo habitual para compostos deste tipo. Ver, por exemplo, EP 0 015 036 Al, páginas 5-11. Os métodos jnais frequentemente utilizados para a preparação dos compostos em questão, podem ser sumarizados como se segue, em três métodos alternativos: a) uma reacção de condensação de (1) um composto (amino-ãcido ou péptido) com um grupo carboxilo livre e outros grupos re-activos protegidos com (2) um composto (aminoãcido ou péptido) com um grupo amino livre e outros grupos reactivos protegidos, na presença de um agente de condensação, b) uma reacção de condensação de (1) um aminoãcido ou um péptido com um grupo carboxilo activado e outros grupos reactivos, possivelmente, protegidos com (2) um composto (aminoãcido ou péptido) com um grupo amino livre e outros grupos reactivos, possivelmente, protegidos, e c) uma reacção de condensação de (1) um aminoãcido ou um péptido com um grupo carboxilo livre e outros grupos reactivos protegidos com (.2) um composto (aminoãcido, péptido ou amina) com um grupo amino activado e outros grupos reactivos, possivelmente, protegidos, após o que os grupos protectores são removidos, se desejado. Métodos para activar grupos carboxilo são conhecidos per 71 315

Ref: 0/3118-545 - 8 - se e essa activação pode ter lugar, inter alia, através da conversão do grupo carboxilo num halogeneto de ãcido, num anidrido de azida, num imidazolido, ou num éster activado, tal como a N-hidro-xi-succinimida ou o éster p-nitrofenílico.

Para métodos de activação, ver: Houben-Weyl, Methoden der Organischen Chemie (Methods of Prganic Chemistry), 4.a edição, parte XV/2 (Georg Thieme Verlag).

Os métodos mais habituais para as reacções de condensação acima são: o método da carbodiimida, o método da azida, o método do anidrido misto e o método que envolve os ésteres activados, tal como é descrito em The Peptides, volume I, 1965 (Academic Press) E. Schrõder e K. Lubke.

Além disso, o chamado método da "Fase Sólida", de Merri-field, descrito no J. Am. Chem. Soe. '85, 2149 (1963), pode ser usado para a preparação dos péptidos ou dos derivados de péptidos, em questão. Neste caso, o acoplamento dos aminoãcidos do péptido a preparar começa, de preferência, a partir do lado do terminal carboxi. Com este método é necessária uma fase sólida, sobre a qual estão localizados grupos reactivos ou sobre a qual tais grupos podem ser aplicados. Esta pode ser, por exemplo, um copolímero de benzeno e divinilbenzeno com grupos clorometil, reactivos, ou uma fase poli-mêrica, tornada reactiva com a função hidroximetilo ou com benzila-mina.

Uma fase sólida particularmente adequada é, por exemplo, a resina do álcool p-alcoxibenzílico (resina de 4-hidroximetil, fe-noximetil-copoliestireno - 1% divinilbenzeno), descrita por Wang J, Am. Chem. Soc. 95 (1974), 1328. Depois da síntese, os péptidos podem ser separados dessa fase sob condições moderadas.

Uma resina que contenha grupos clorometil também é uma fase sólida muito adequada. Quando ê usada uma fase sólida deste tipo, a ligação â resina do primeiro aminoãcido, com grupo a-amino protegido, tem lugar através de uma ligação éster.

Depois da síntese da sequência de aminoácidos desejada, se- 71 315

Ref: 0/3118-545 - 9 - ^ b * gue-se a separação do pêptido da resina, usando, por exemplo, fluo-reto de hidrogénio líquido, usando ácido trifluorometanossulfõnico ou usando ácido metanossulfõnico dissolvido em ácido trifluoroacéti-co, 0 pêptido também pode ser removido do suporte usando um álcool inferior, de preferência o metanol ou o etanol, caso em que se forma, directamente, um éster de alquilo inferior do pêptido. Da mesma forma, a separação com ajuda de amoníaco produz a amida de um pép-tido de acordo com o invento.

Os grupos reactivos que não podem participar na reacção de condensação, podem ser eficazmente protegidos por "grupos protecto-res" adequados, os quais podem ser removidos muito facilmente, através de hidrólise ou de redução. Assim, um grupo carboxilo pode ser protegido eficazmente, por exemplo, por esterificação com, pelo menos, uma quantidade estequiometricamente eficaz de metanol, etanol, butanol terciário, álcool benzilico ou álcool p-nitrobenzílico, ou através de conversão numa amida, tal como descrito, por exemplo, em Houben-Weyl, Methoden der Organischen Chemie (Methods of Organic Chemistry), 4.a edição, parte XV/1, páginas 315 et seq. Contudo, este ultimo grupo protector é muito difícil de remover, pelo que, de preferência, só será usado para proteger o grupo carboxilo do aminoácido do terminal C, no último pêptido, ou o grupo y-carboxi do ácido glutâmico.

Os grupos ácido, são grupos que podem, em geral, proteger com eficácia um grupo amino, por exemplo, um grupo ácido derivado de um ácido carboxílico alifático, aromático, aralifático ou hete-rocíclico (tal como o ácido acético, o ácido benzóico ou o ácido piridina-carboxílico), ou um grupo ácido derivado de um ácido carbónico (tal como os grupos etoxicarbonilo, benziloxicarbonilo (Boc), t-butiloxicarbonilo ou p-metoxi-benziloxi-carbonilo), ou um grupo ácido derivado de um ácido sulfónico (tal como os grupos benzenos-sulfonilo ou p-toluenossulfonilo). Contudo podem ser usados outros grupos, tal como grupos arilo ou aralquilo, substituídos ou não substituídos, por exemplo, benzilo e trifenilmetilo, ou grupos como o orto-nitrofenilsulfenilo ou o 2-benzoíl-l-metilvinilo. (Ver Houben-Weyl, parte XV/1, páginas 46 e seguintes). 71 315

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Também é recomendável proteger o grupo £.-amino da lisina e, possivelmente, o grupo hidroxilo da serina e da treonina. Contudo, esta última protecção nem sempre ê necessária. Grupos protec-tores habituais, em relação a este assunto, são um grupo t-butilo-.xi-carbonilo ou um grupo tosilo, para o grupo £-amino da lisina, e um grupo t-butilo ou benzilo para o grupo hidroxilo da serina e da treonina.

Os grupos protectores podem ser removidos, de acordo com diversos métodos convencionais, o que depende da natureza do grupo particular, por exemplo, com o auxílio de ácido trifluoroacético, ou através de redução moderada, por exemplo, com hidrogénio e um catalisador, como o paládio, ou com HBr em ácido acético glacial.

Os péptidos de acordo com o invento também incluem os seus derivados funcionais os quais se consideram ser: a) sais de adição de ácidos dos péptidos; b) amidas dos péptidos, especificamente amidas do terminal C; c) ésteres, especificamente ésteres do terminal C; d) derivados N-acilo, especificamente derivados de acilo do terminal N e, em particular, derivados acetilo do terminal N; e e) complexos dos péptidos com metais.

Os sais podem ser obtidos directamente a 'partir do meio re- accional no qual os péptidos são preparados, ou podem ser preparados, subsequentemente, por reacção do péptido com uma base.

Os sais de adição de ácidos podem ser obtidos, directamente, por isolamento do péptido do meio ácido desejado, cu o péptido obtido pode ser, subsequentemente, convertido num sal de adição de ácido, por reacção do péptido com um ácido, como o HC1, o HBr, o ácido fosfórico, o ácido sulfúrico, o ácido acético, o ácido maleico, o ácido tartãrico, o ácido cítrico, o ácido poliglutâmico, a carboximetil-celulose, etc.

Os sais de metal, especificamente os sais de metais alca- 71 315

Ref: 0/3118-545 - H - linos, são obtidos por reacção dos péptidos com a base metálica desejada/ tal como NaOH, ^200^/ NaHCO^, etc.

Os derivados N-acilo, devem ser entendidos como sendo, es-pecificamente, os derivados de acilo do terminal N. Estes derivados podem ser preparados usando um aminoãcido que jã disponha de um grupo acilo particular na síntese peptídica. Assim, o grupo acilo também funciona como grupo protector, na síntese peptídica. Desta forma, o derivado de acilo desejado ê preparado directamente. Contudo, também ê possível introduzir, subsequentemente, o grupo acilo desejado, acilando o piptido de modo convencional. 0 grupo N-acilo, preferencialmente, utilizado ê o grupo acetilo.

De igual modo, os ésteres e as amidas são preparados, preferencialmente, através da utilização de um aminoãcido jã provido com o grupo éster ou amida desejado na síntese peptídica; contudo, também é possível preparã-los esterifiçando, subsequentemente, o pêptido obtido da forma convencional, ou convertendo-o numa amida.

As amidas que são utilizadas preferencialmente, são a amida não substituída, a monometilamida ou dimetilamida, a monoetila-mida ou a dietilamida.

Os derivados N-alquilo e Ν,Ν-dialquilo, tais como os derivados N-monometilo ou Ν,Ν-dimetilo, podem ser preparados usando, na síntese peptídica, o ãcido N-monoalquilamino relevante ou, caso seja desejado, o ãcido Ν,Ν-dialquilamino.

Os complexos metálicos, podem ser obtidos promovendo o contacto do pêptido com óxidos metálicos, hidróxidos metálicos ou sais metálicos, escassamente solúveis. Os sais metálicos escassamente solúveis, utilizados são, em geral, fosfatos metálicos, pirofosfa-tos metálicos e polifosfatos metálicos.

Os metais que podem ser usados neste método, são os metais pertencentes aos grupos B da Tabela Periódica, por exemplo, cobalto, níquel, cobre, ferro e, de preferência, zinco, e, também, metais pertencentes aos grupos principais da Tabela Periódica e são capazes de formarem complexos, como o magnésio e o alumínio. A prepara- 71 315

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ção destes complexos metálicos decorre do modo conyencional.

Assim, um complexo metálico pode ser obtido, adicionando o péptido e um õxido metálico, hidróxido metálico ou sal metálico escassamente solúvel, a um meio aquoso. 0 complexo metálico também pode ser obtido, adicionando um meio alcalino, a uma solução aquosa do péptido e de um sal metálico solúvel, processo através do qual se forma o complexo péptido-hidrõxido metálico, insolúvel.

Além disso, o complexo metálico pode ser obtido adicionando o péptido, um sal metálico solúvel e um sal solúvel diferente, a ura meio aquoso, de preferência alcalino, processo através do qual se forma, in situ, ura complexo péptido-sal metálico, insolúvel.

Os complexos metálicos podem ser usados directamente, como suspensões ou, por exemplo, podem ser criodessecados e, subsequentemente, re-suspensos. 0 invento também inclui preparações farmacêuticas que contenham péptidos de acordo com o invento. Os péptidos de acordo com o invento podem ser administrados oralmente, rectalmente ou paren-teralmente. De preferência, os péptidos são usados na forma de uma preparação para injecção, para o que são dissolvidos, suspensos ou emulsionados num fluído adequado. Contudo, misturados com agentes auxiliares ou cargas adequadas, também podem ser convertidos mama forma adequada para administração oral, tal como pílulas, comprimidos e drageias. Os péptidos em questão, também podem ser administrados na forma de um supositório ou de um "spray" . Também podem ser escolhidas formas de administração com uma acção prolongada, tal como implante e injecções de depósito.

Os péptidos são utilizados em quantidades eficazes, em combinação com excipientes conhecidos, e são usados, de preferência, numa dosagem de 1 /g a 1 mg, por kg de massa corporal e por dia, dependente da forma de administração. A dosagem preferida para administração (subcutâneamente) em humanos, situa-se entre 1 e 30 mg por dia, mais particularmente entre 3 a 10 mg por dia.

Nos exemplos seguintes apresenta-se a preparação de um cer- 71 315

Ref: 0/3118-545 fe - 13

to numero de péptidos. EXEMPLO 1

R 1

IA

Preparação de um pêptido de acordo com a Formula I, na qual = Pro, X = Lis-(Ac), R2 = Glu e R3 = Leu-OH Ac H-Tre-Pro-Glu-Lis-Ser-Glu-Tre-Pro-Leu-Val-Tre-Leu-OH Ac » Boc-Tre-Pro-Glu-Lis-NoH, 1A.1. Z-Lis(Ac)-OMe

Dissolvem-se 3,94 g de Z-Lis(Boc)-OMe em 40 ml de cloreto de metileno. Depois de se fazer borbulhar HCl gasoso durante 1 hora, a solução é evaporada. 0 resíduo é dissolvido em DMF, apôs o que se adicionam 1,8 g de Ac-ON e se ajusta o pH a 8,0 com N.E.M.

Apôs agitaçao durante 72 horas, â temperatura ambiente e a pH 8,0, a solução é evaporada até â secura e o resíduo é dissolvido em acetato de etilo e lavado com HCl 0,1 N e com solução a 10% de NaCl. Depois de secagem (Na2S04), obtém-se o Z-Lis(Ac)-OMe como um óleo com um rendimento de 100%. 0 R^ em cloreto de metileno/metanol (9:1) é de 0,80 sobre Si02> IA.2. Z-Glu(OtBu)-Lis(Ac)-OMe

Dissolvem-se 3,4 g de Z-Glu(OtBu)-OH e 2,7 g de HOBt em 35 ml de DMF, apôs o que se arrefece a mistura até -10°C. Adicionam-se, então, ã mistura arrefecida 2,4 g de Η-Lis(Ac)-OMe.HCl (obtido por hidrogenação de Z-Lis(Ac)-OMe em DMF, na presença de um equivalente de HCl, usando Pd/C como catalisador), dissolvidos em 20 ml de DMF, e 1 equivalente de N.E.M. 0 pH da mistura é ajustado a 6,5 com N.E.M., e são, então, adicionados 2,3 g de DCC. Depois de se agitar durante 15 minutos, a -10°C e durante 18 horas, â temperatura ambiente, a DCU ê separada, por filtração e o filtrado é evaporado até à secura. O resíduo é dissolvido em 100 ml de acetato de etilo (EtoAc) e ê lavado, sucessivamente com solução a 5% de KHSO^, solução a 5% de NaHC03 e solução a 10% de NaCl. Apôs secagem (Na2S04), o filtrado « 71 315 « Ref: 0/3118-545 - 14

é eyaporado. 0 resíduo e recristalizado a partir de acetato de eti- - -20 lo/n-hexano, (1:2). Rendimento: 41,3%; P.f.: 95-97°C; / = 7,7° (c = 1, DMF); Rf em cloreto de metileno/metanol (9:1) = 0,52 sobre sío2. IA. 3. Z-Pro-Glu(OtBu)-Lis(Ac)-OMe

Dissolvem-se 1,12 g de Z-Pro-OH e 1,8 g de HOBt em 15 ml de DMF, apôs o que se arrefece a mistura até -10°C. São, então, adicionados â mistura arrefecida, 1,74 g de H-Glu (OtBu)-Lis(Ac)-OMe. .HC1 (obtido após hidrogenação catalítica do Z-peptido correspondente, na presença de 1 equivalente de HC1) dissolvidos em 15 ml de DMF, após o que o pH da mistura é ajustado a 6,7 por adição de N.E.M.; são, então, adicionados, 1,01 g de DCC. São, então, realizadas as mesmas operações que foram indicadas em 1A.2 depois da adição de DCC.

Rendimento, após agitação com éter, 80,0%; P.f.: 111 - 113°C; — — 9 Π / =-30,3°Cc = 1, DMF); Rf em cloreto de metileno/metanol (9:1) é 0,61 sobre Si02* IA.4. Boc-Tre-Pro-Glu(OtBu)-Lis(Ac)-OMe São acoplados 833 mg de Boc-Tre-OH e 1,7 g de H-Pro-Glu-(OtBu)-Lis(Ac)-OMe (obtido depois da hidrogenação catalítica em DMF) através do método DCC/HOBT, e purificados, tal como descrito em 1A.2. O tetrapêptido protegido ê obtido como uma espuma, com um rendimento de 68,2%. Rf em cloreto de metileno/metanol (9:1) ê 0,28 sobre SiC^. 1A.5. Boc-Tre-Pro-Glu(OtBu)-Lis(Ac)-N^H,

Dissolvem-se 1,5 g de Boc-Tre-Pro-Glu(OtBu)-Lis(Ac)-OMe em 15 ml de metanol, apÕs o que se adicionam 0,88 ml de hidrato de hidrazina. Depois de se agitar durante 18 horas, â temperatura ambiente, adicionam-se mais 0,88 ml de hidrato de hidrazina. Depois de se agitar durante um total de 72 horas, a solução é evaporada. 0 resíduo é recristalizado a partir de acetato de etilo/êter (1:1). 71 315

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Rendimento 96,7%; Rf em cloreto de metileno/metanol (9:1) é 0,31 sobre Si02. 1A.6 Z-Ser-Glu(OtBu)-Tre-Pro-Leu-Val-Tre-Leu-OtBu

Acetilou-se H-Leu-Val-Tre-Leu-OtBu / ver Recl. Trav. Chim. Pays Bas 98, 571 (1979) _7 com um equivalente de Z-Pro-OH, usando 1,1 equivalentes de DCC e 2,0 equivalentes de HOBt, tal como foi descrito acima. O rendimento no pentapiptido protegido foi de 80%;

Rf em CH2Cl2-Me0H-H20 (70-30-5) i 0,80 sobre SÍ02* A redução catalítica em DMF, foi seguida por uma reacção promovida por DCC/HOBt, com Z-Tre-OH, tal como acima, produzindo Z-Tre-Pro-Leu-Val-Tre-Leu--OtBu com um rendimento de 93%. 0 Rf em Tol-EtOH (4-1) e 0,53 sobre SiC>2. O z-Glu(OtBu)-OH foi acoplado ao hexapéptido, depois de recuperação do grupo Z como habitualmente, utilizando, de novo, DCC e HOBt? o rendimento foi de 76,7% (ôleo), depois de extracções ãci-do/base. Rf em Tol-EtOH (4-1) i 0,46 sobre Si02· Hidrogenação catalítica, seguida de acilação do produto resultante, com Z-Ser-OH, utilizando DCC e HOBt, produziu o composto do tíutlo, com um rendimento de 48%; /”a_7p°= -40,6© (c = 0,5; DMF); p.f. = 133 - 135°C;

Rf em Tol-EtOH é 0,36 sobre Si02· ψ

IA. 7 H-Tre-Pro-Glu-Lis-Ser-Glu-Tre-Pro-Leu-Val-Tre-Leu-OH

Dissolveram-se 0,68 g de Boc-Tre-Pro-Glu(OtBu)-Lis(Ac)--N2H^ em 10 ml de DMF e são adicionados 2,2 ml de HC1 0,1 N/DMF. A solução, arrefecida adicionou-se durante 10 minutos, 0,15 ml de solução de I.A.N. (-20°C); depois de se agitar durante 10 minutos, é adicionada uma solução de 0,76 g de H-Ser-Glu-(OtBu)-Tre-Pro-Leu--Val-Tre-Leu-OtBu (obtida a partir de 1A.6 depois de redução catalítica) em 10 ml de DMF, e o pH foi ajustado a 7,2 com N.E.M. Depois de 4 dias a 4-8°C, o dodeca-péptido protegido ê isolado por precipitação, a partir de etanol-acetato de etilo-eter, (1:1:1), com um rendimento de 70,8%.

Dissolveram-se 0,85 g do péptido protegido em 10 ml de TFA--H20 (91%, v/v), e adicionaram-se algumas gotas de anisolo. Depois de 1 hora ã temperatura ambiente, ê adicionado éter, o precipitado 71 315

Ref: 0/3118-545 - 16 - formado ê removido por filtração, e é lavado com éter. 0 material bruto é dissolvido era t-BuOH-^O (1:1) e ê adicionada uma resina de permuta iônica na forma acetato; depois de se agitar durante 30 minutos a resina foi removida por filtração, e o filtrado foi lio-filizado. Purificação, por distribuição em contra-corrente (sistema de solventes n-BuOH-HOAc-I^O = 4-1-5, produz 230 mg do péptido;

Rf em n-BuOH-pir-HOAc-H20 (8-3-1-4) é 0,24 sobre Si02-

Ac

I 1A.8 Η-Τ^-Ρηο-Θ^-ΙιΐΒ-ΒθΓ-Οίη-ΤΓΟ-Ρηο-Ι^-νΒΐ-ΤΓθ-Ι^-ΟΗ

Dissolveram-se 0,68 g de Boc-Tre-Pro-Glu(OtBu)-Lis(Ac)-~N2H3' em ^ DMF' aPÕs o que se adicionaram 2,2 ml de HC1 1,0 M/DMF. A solução ê arrefecida até -20°C. Adicionam-se, então, 0,15 ml de I.A.N., e o conjunto é agitado durante 10 minutos, a -20°C. Adicionou-se, então, uma solução de 0,76 g de H-Ser-Glu-Tre-Pro-Leu--Val-Tre-Leu-OtBu em 10 ml de DMF. 0 pH da mistura reaccional é, então, levado a 7,2 com N.E.M. Depois de ser conservado no frigorífico durante 4 dias, o dodeca-péptido protegido foi obtido por precipitação a partir de etanol/acetato de etilo/éter (1:1:1), com 84,8% de rendimento.

Introduziram-se 1,06 g deste dodeca-péptido, em 12 ml de TFA/H20 (9:1). Adicionaram-se algumas gotas de anisolo a esta mistura. A mistura foi agitada durante 1 hora â temperatura ambiente e, a seguir, foi vertida em éter. 0 sélido foi separado por filtração e, a seguir, foi redissolvido, em t-Bu0H/H20 (1:1), após o que se adicionou um permutador de iões na forma . acetato, e se agitou a mistura durante meia hora. 0 permutador de iões foi separado por filtração, e o filtrado foi liofilizado. A substância foi purificada por distribuição, em contra-corrente, no sistema de solventes n-Bu0H:H0Ac:H20 = 4:1:5. Rendimento: 330 mg. Rf em n-BuOH:piri-dina:H0Ac:H20 (8:3:1:4) é 0,28 sobre Si02· EXEMPLO 2

Preparação de um péptido, de acordo com a Fórmula I, na qual R^ = Pro, X = Lis-(Ac) , R2 = Gin, Tre.^ D-Tre e R^ = Cha-OH. 71 315

Ref: 0/3118-545 - 17 -

Ac I

H-Tre-Pro-Glu-Lis-Ser-Gln-Tre-Pro-Leu-Val-D-Tre-Cha-OH

Para a preparação de Boc-Tre-Pro-Glu(OtBu) -Lis (Ac) -N2H3, ver o Exemplo IA. 1-5. 2.1 H-S er-Gln-Tre pro-Leu-Va1-D-Tre-Cha-0tBu 2.1.1 H-Cha-OtBu.HC1

Dissolvem-se 9,8 g de H-Fen-OtBu.HCl em 50 ml de MeOH. Adiciona-se, então, Pt02, apõs o que o vaso reaccional é agitado durante 48 horas, com H2, sob pressão elevada (3 bar; aproximadamen-te 3 atmosferas). O Pt02 é removido e o filtrado é evaporado. 0 H-Cha-0tBu.HC1 ê obtido como um solido com um rendimento de 94,2%.

Rf em CH2Cl2:Me0H:H20 (14:6:1) ê 0,94 sobre Si02· 2.1.2 H-D-Tre-Cha-OtBu

Dissolveram-se 10,4 g de Z-D-Tre-OH e 7,9 g de HOBt em 100 ml de DMF. O conjunto foi arrefecido até -10°C. Foram, então, adicionados à mistura arrefecida 10,28 g de H-Cha-OtBu.HC1 em 180 ml de DMF e 1 equivalente de T.E.A. e, subsequentemente, são adicionados 8,9 g de DCC. Depois de se agitar durante 2 horas, a 5°C e durante 18 horas â temperatura ambiente, a DCU foi separada por filtração e o filtrado foi evaporado até â secura. O resíduo foi dissolvido em 125 ml de EtOAc e foi lavado com solução a 5% de NaHC03, solução a 30% de NaCl, HC1 0,1 M e, de novo, com solução a 30% de NaCl. Depois de secagem (Na2S0^) e de filtração, o filtrado foi evaporado até â secura. O resíduo foi recristalizado a partir de éter/ n-hexano (1:4). Rendimento 79,7%, ponto de fusão 118 - 120°C; Rf em To:EtOH (4:1) é 0,66 sobre Si02· O pêptido obtido acima ê dissolvido em MeOH, depois do que se adiciona Pd/C (.10%) e se faz borbulhar H2, até já não ser detec-tada libertação de C02· Depois de filtração o filtrado i evaporado. Rf em To:EtOH (8:2) é 0,27 sobre Si02·

2.1.3 Z-Ser-Glu-Tre-Pro-Leu-Val-OH - 18 - - 18 - 71 315 Ref: 0/3118-545 àA~

Acoplaram-se 33,6 g de Z-Ser-Gln-Tre-Pro-OH e 16,2 g de H-Leu-Val-OtBu através do método DCQ/HOBt. Dissolveram-se 33,6 g de Z-Ser-Glu-Tre-Pro-OH e 10,5 g de HOBt em 30 ml de DMF, apôs o que a mistura ê arrefecida até -10°C. São, então, adicionados, â mistura arrefecida 16,2 g de H-Leu-Val-OtBu.HCl em 30 ml de DMF + 1 equivalente de N.E.M..0 pH da mistura e ajustado a 6,7 com N.E.M., depois do que se adicionam 12,3 g de DCC. Depois de agitação durante 15 minutos, a -10°C e durante 18 horas, â temperatura ambiente, a DCU é separada por filtração e o filtrado é evaporado até â secura. 0 resíduo é dissolvido em 2-BuOH/CH2Cl2 (2:3) e é lavado, sucessivamente, com solução a 15% de NaCl, solução a 5% de KHSO^, solução a 5% de NaKCO^ e, de novo, com solução a 15% de NaCl. Depois de secagem e filtração, o filtrado é evaporado, até â secura. A substância ê obtida depois de recristalização a partir de DMF--EtOH-EtOAc com 48,0% de rendimento. Rf em To:EtOH (8:2) é 0,26 sobre Si02·

Dissolvem-se 1,4 g de Z-Ser-Gln-Tre-Pro-Leu-Val-OtBu em 15 ml de TFA a 90%, depois do que se adicionam algumas gotas de ani-solo. O acido livre ê obtido , depois de se agitar durante 1 1/2 horas e de se verter em éter. Rendimento 84,0%. Rf em CH2Cl2:MeOH: H20é 0,45 (14:6:1) , sobre Si02· 2.1.4 H-Ser-Gln-Tre-Pro-Leu-Val-D-Tre-Cha-OtBu São disssolvidos 0,98 g de Z-Ser-Glu-Tre-Pro-Leu-Val-OH em 0,26 g de HOBt, em 10 ml de DMF, depois do que a solução é arrefecida até -10°C. É, então, adicionada uma solução de 0,40 g de H-D-Tre-Cha-OtBu, em 5 ml de DMF, seguindo-se-lhe a adição de 0,27 g de DCC. Apôs agitação durante 2 horas, a 5°C, e durante 18 horas, â temperatura ambiente, a DCU é separada por filtração e o filtrado ê evaporado. O sólido é obtido por precipitação a partir de MeOH/ éter/n-hexano, (20:60:60), com 67,9% de rendimento; ponto de fusão 197 - 199°C. Rf em To:EtOH (8:2) é 0,24 sobre Si02· O péptido é, então, dissolvido em DMF e em um equivalente de HC1, depois do que se adiciona Pd/C (10%). Faz-se borbulhar H2, até que jã não seja detectada mais libertação de C02· 0 Pd/C ê se- 71 315

Rfe: 0/3118-545 - 19 parado por filtração. Rf em CH2C12:MeOH:Agua (14:16:1) é 0,34 sobre sío2. São acoplados 0,33 g de Boc-Tre-Ser-Glu-(OtBu)-Lis(Ac)--N2H2 e 0,38 g de H-Ser-Glu-Tre-Pro-Leu-Val-D-Tre-Cha-OtBu através do método da azida. O dodeca-piptido protegido é isolado por cristã lização a partir de etanol/acetato de etilo/êter (5:5:1), num rendimento quantitativo.

Introduzem-se 610 mg do péptido obtido em 6 ml de TFA/H20, (9:1), depois do que se adicionam algumas gotas de anisolo. A mistura é agitada durante 1 hora, â temperatura ambiente e, a seguir, ê vertida em éter. A restante preparação é feita conforme jã foi descrito. Rendimento: 400 mg. Rf em n-BuOH:Piridina:HOAc:H20, (4:1:1:2) é 0,42 sobre Si02· EXEMPLO 3 Método de preparação de um péptido de acordo com a Formula II, na qual R^ = Ser, X = Lis-(Ac), R2 = Gin e R^ = Leu-OH.

Y

H-Tre-Ser-Glu-Lis-Ser-Gln-Tre-Pro-Leu-Val-Tre-Leu-OH 3A.1 Z-Tre-Ser-Glu(OtBu)-Lis(Ac)-OMe São acoplados 4,54 g de Z-Tre-Ser-N2H2 e 5,4 g de H-Glu-(OtBu)-Lis(Ac)-OMe.HCl através do método da azida. Depois de lavagem, obtêm-se o tetra-péptido protegido por cristalização a partir de acetato de etilo com 84,6% de rendimento. P.F. 148 - 149°C; - -?0 / a_/D = -5,25°(c = 1, DMF). Rf = 0,73 em n-butanol/ãcido acético/ água (4:1:1), sobre Si02· 3A. 2 Z-Tre-Ser-Glu (OtBu) -Lis (Ac) -KUH,

Dissolvem-se 1,4 g de Z-Tre-Ser-Glu(OtBu)-Lis(Ac)-OMe em 20 ml de MeOH, após o que são adicionados 1,5 ml de hidrato de hi-drazina. Depois de se agitar durante 18 horas, ã temperatura ambiente, ê filtrado um sólido que depois de ser lavado com agua é seco. -P0

Rendimento 67,8%. P.f. 193 - 194oC; l a_/£= -l,5o(c=l, DMF); Rf em 71 315

Ref: 0/3118-545

& - 20 n-butanol/ãcido acêtico/ãgua (4:1:1) é 0,41 sobre Si02·

3A.3 H-Tre-Ser-Glu-Lis-Ser-Glu-Tre-Pro-Leu-Val-Tre-Leu-OH São acoplados 767 mg de z-Tre-Ser-Glu(OtBu)-Lis(Ac)-N2H3 e 0,97 g de H-Ser-Gln-Tre-Pro-Leu-Val-Tre-Leu-OtBu através do método da azida, e preparados conforme foi descrito em 2.1.4. Rendimento 746 mg do dodeca-pêptido protegido.

Dissolve-se Z-Tre-Ser-Glu(OtBu)-Lis(Ac)-Ser-Glu-Tre-Pro--Leu-Val-Tre-Leu-OtBu em DMF, apôs o que se adiciona Pd/C (10%) e se faz borbulhar H2, até jã não se detectar libertação de C02· Depois de se separar o Pd/C por filtração, o filtrado i evaporado. O material obtido é dissolvido em 10 ml de TFA/H20 (9:1), depois do que se adicionam algumas gotas de anisolo. A mistura é agitada durante 1 1/2 horas, â temperatura ambiente e, em seguida, é vertida era éter. Apôs filtração, o sólido é dissolvido em t-Bu0H/H20 (1:1), sendo adicionado a seguir, um permutador de iões na forma acetato, apôs o que a mistura ê agitada durante meia hora. O permutador de iões ê, então, separado por filtraçãoe o filtrado é liofi-lizado. A substância é purificada através de distribuição em contra· -corrente no sistema de solventes n-BuOH:HOAc:H20, (4:1:5). Rendimento apôs liofilização, 265 mg. Rf em n-BuOH:piridina:HOAC:H20 (8:3:1:4) ê 0,29 sobre Si02· EXEMPLO 4

Preparação de um péptido de acordo com a Fórmula I, na qual X = Lis-(Ac), R^ = Pro, R2 = Gin e R^ = Leu-OH. Ψ

H-Tre-Pro-Glu-Lis-Ser-Gln-Tre-Pro-Leu-Val-Tre-Leu-OH

Preparação de: Z-Pro-Glu(OtBu)-Lis(Ac)-OMe

Dissolvem-se 2,5 g de Z-Pro-OH e 2,75 g de HOBt em 25 ml de DMF, apôs o que a mistura, ê arrefecida até -10°C. São, a seguir, adicionados â mistura arrefecida 4,82 g de H-Glu(OtBu)-Lis(Ac)-OMe. HC1 em 40 ml de DMF, e 1 equivalente de N.E.M., o pH da mistura ê 71 315

Ref: 0/3118-545 - 21 -

ajustado a 6,7, com N.E.M., e são adicionadas 2,3 g de DCC. Depois de se agitar durante 15 minutos, a -10°C e durante 18 horas, â temperatura ambiente, a DCU ê separada por filtração, e o filtrado ê evaporado ate à secura. 0 resíduo é dissolvido em 100 ml de EtOAc e é lavado, sucessivamente com solução a 5% de KHSO^, solução a 5% de NaHC03 e solução a 15% de NaCl. Depois de se secar e filtrar, o filtrado ê evaporado ate â secura. A recristalização a partir de EtOAc/iter de petróleo (1/2), não tinha qualquer efeito, de modo que a substância foi obtida na forma de um óleo com 92,7% de rendimento. Rf em To:EtOH (8:2) = 0,26 sobre Si02.

Preparação de: Boc-Tre-Pro-Glu (OtBu) -Lis (Acj -QME 0 tripêptido obtido acima ê dissolvido em DMF + um equivalente de HC1, após o que se adiciona Pd/C (10%), e se borbulha H2, até jã não se detectar mais libertação de C02· Depois de se separar o Pd/C por filtração, o filtrado é usado directamente.

Dissolvem-se 1,7 g de Boc-Tre-OH e 2,1 g de HOBt em 17 ml de DMF, depois do que se arrefece a mistura até -10°C. A seguir, adiciona-se â mistura arrefecida o H-Pro-Glu(OtBu)-Lis(Ac)-OMe.HCl, obtido acima, em.DMF e 1 equivalente de N.E.M.. Depois, o pH da mistura ê ajustado a 6,7, com N.E.M., e adicionam-se 1,8 g de DCC. Segue-se o processo de preparação tal como descrito anteriormente, para os restantes passos . A substância ê obtida na forma de um óleo com 79,3% de rendimento. Rf em CH2Cl2:MeOH:Ãgua (70:30:5) ê 0,73 sobre Si02·

Boc-Tre-Pro-Glu(OtBu)-Lis(Ac)-N^H^

Dissolvem-se 4,6 g de Boc-Tre-Pro-Glu(OtBu)-Lis(Boc)-OMe em 46 ml de etanol, depois do que são adicionados 2,5 ml de hidrato de hidrazina. Depois de agitação durante 16 horas, a mistura é evaporada e o resíduo ê agitado com EtOAc/êter (1:2). Depois de agitação com H20, o sólido resultante é obtido com um rendimento de 50%. Rf em To:EtOH (4:1) = 0,21 sobre Si02·

Ac

I

H-Tre-Pro-Glu-Lis-Ser-Gln-Tre-Pro-Leu-Val-Tre-Leu-OH 71 315

Ref: 0/3118-545 - 22 -

Dissolvem-se 1,1 g da hidrazida obtida em 5.3 , em 15 ml de DMF, apõs o que se adicionam 1,50 ml de HC1 2,0 M/DMF. A solução é arrefecida até -20°C e são "adiconados 0,23 ml de I.A.N. e a mistura é agitada durante 10 minutos, a -20°C.

Adicionam-se 1,4 g de H-Ser-Glu-Tre-Pro-Leu-Val-Tre-Leu--OtBu, obtido através de hldrogenação, em 15 ml de DMF e o pH da mistura reaccional é ajustado a 7,2 e a mistura ê colocada num frigorifico durante 4 dias. A mistura ê, então, evaporada. Obtém-se ura solido por precipitação a partir de MeOH/éter (1:5), o qual ê purificado por purificação em coluna (SÍO2) no sistema n-BuOH:piri-dinaíHOACÍÍ^O = 8:3:1:4 (em volume). Rendimento 400 mg. Rf em n-Bu: Piridina^.Aci^O, (8:3/4:1/4:1) é 0,73 sobre Si02·

Introduzem-se 350 mg do péptido obtido em 4 ml de TFA a 90%. A mistura é agitada durante 1 hora, â temperatura ambiente e, então, é vertida em éter. 0 sólido obtido i separado por filtração, é seco, e é, então, dissolvido em terc-Bu0H/H20 (1:1), apôs o que é adicionado um permutador de iões, na forma acetato (LewatitR), e a mistura e agitada durante meia hora. O permutador de iões é separado por filtração, e o filtrado é congelado e criodessecado. A substância é purificada, através de distribuição em contra-corrente no sistema n-BuOH:HOAc: 1^0 = 4:1:5. Rendimento 160 mg. Rf em n-Bu0H:piridina:H0Ac:H20 (4:1:1:2) ê 0,25 sobre Si02- EXEMPLO 5

Preparação de um péptido de acordo com a fórmula I, na qual X = Nle, R^ = Ser, R2 = Glu e R^ — Leu-OH. H-Tre-Ser-Glu-Nle-Ser-Glu-Tre-Pro-Leu-Val-Tre-Leu-OH Síntese de Z-Tre-Ser-Glu(OtBu) -Nle-N,,!^ 5.1 H-Glu(OtBu)-Nle-OMe

Dissolvem-se 5,15 g de Z-Glu(OtBu)-OH e 2,95 g de HOBt, em 30 ml de DMF, após o que a mistura é arrefecida até -10°C. Adicio- 71 315

Ref: 0/3118-545 :?

- 23 - nam-se, então, â mistura arrefecida 2,6 g de H-Nle-OMe.HCl (J. Med. Chem. 16, 1285 (1973)) , em 20 ml de DMF, e 1 equivalente de N-.E.M., o pH da mistura é ajustado a 6,0 com N.E.M. e são, então, adicionados 3,3 g de DCC. Depois de se agitar durante 2 horas, a 4°C, e durante a noite, â temperatura ambiente, a DCU ê separada por filtração e o filtrado é evaporado até ã secura. 0 resíduo é dissolvido era 100 ml de EtOAc, e ê lavado, sucessivamente, com solução a 15% de NaCl, solução a 5% de KHSO^, solução a 5% de NaHCO^ e solução a 15% de NaCl. Apôs secagem e filtração, o filtrado ê evaporado até â secura. 0 resíduo i recristalizado a partir de éter/n-hexano. Rendimento: 81,6%. Ponto de fusão 48 - 50°C. Rf em To:EtOH (8:2) é 0,73, sobre Si02» 5.2 O piptido obtido é dissolvido em DMF, depois do que se adicionam Pd/C (.10%) e 1 equivalente de HC1/DMF. Faz-se borbulhar , até jã não se detectar mais libertação de C02· Depois de filtração, o filtrado é usado, tal e qual, na etapa 5.3. Rf em To:EtOH (8:2) é 0,32 sobre Si02· 5.3 Z-Tre-Ser-Glu (OtBu) -Nle-N^

Dissolvem-se 3,9 g de Z-Tre-Ser-N2H2 em 30 ml de DMF e 7,3 ml de 3,0 HC1/DMF . A solução límpida é arrefecida até -20°C. Adi-cionam-se 1,6 ml de I.A.N., após o que a mistura ê agitada durante 20 minutos, a -20°C. Adicionam-se, então, 4,2 g do pêptido obtido no Exemplo 5.2 em 40 ml de DMF, e o pH da mistura reaccional é ajustado a 7,2 e a mistura ê colocada no frigorífico durante 4 dias. A mistura é, depois, evaporada, o resíduo é dissolvido em Et0Ac/H20 e lavado com água, solução de KHS04 a 5%, solução de NaHCO^ a 5%, e H20. Depois de secagem e filtração, a substância ê obtida, como um õleo com um rendimento de 89,1%. Rf em To:EtOH (4:1) é 0,40 sobre Si02· 0 ôleo obtido ê dissolvido em 60 ml de MeOH, apôs o que são adicionados 6,0 ml de hidrato de hidrazina. Depois de se agitar durante 18 horas, e apôs se adicionar éter, o sólido é separado por filtração, sendo recristalizado a partir de MeOH. Rendimento 64,1%.

Ref: 0/3118-545 - 24 -

Ponto de fusão 207 - 209°C. Rf em TorEtOH (8:2) ê 0,10 sobre SiO^. 5.4 H-Tre-Ser-Glu-Nle-Ser-Glu-Tre-Fro-Leu-Val-Tre-Leu-OH

Dissolvem-se 0,98 g da hidrazida obtida a partir do Exemplo 5.3, em 10 ml de DMF e 0,83 ral de 3,9N HC1/DMF. A solução límpida ê arrefecida até -20°C. Adicionam-se, depois, 0,22 ml de I.A.N. e a mistura e agitada durante 30 minutos, a -20°C. São adicionados 1,05 g de H-Ser-Glu-Tre-Pro-Leu-Val-Tre-Leu-OtBu em 10 ml de DMF, e o pH da mistura reaccional é ajustado a 7,2, e a mistura é colocada no frigorífico durante 4 dias. A mistura é vertida em agua, após o que se separa um solido por filtração. Rendimento 88,2%, Rf em CH2Cl2:Me0H:H20 (70:30:5) é 0,78 sobre SiO^

Dissolve-se Z-Tre-Ser-Glu(OtBu)-Nle-Ser-Gln-Tre-Pro-Leu--Val-Tre-Leu-OtBu em DMF, após o que são adicionados Pd/C (10%) e 1 equivalente de HC1 (2N), H2 ê borbulhado até jã não ser detectada mais libertação de C02. Depois de se separar o Pd/C por filtração, O filtrado é evaporado. O piptido hidrogenado é introduzido em 11 ml de TFA a 90%, ao qual são adicionadas algumas gotas de anisolo. A mistura é agitada, durante 1 1/2 horas â temperatura ambiente e, a seguir, ê vertida em éter. O sólido é separado por filtração e é seco. Depois de se dissolver em terc-BuOH/H20 (1:1), ê adicionado um permutador de iões, na forma de acetato, e a mistura é agitada durante meia hora. O permutador de iões ê, então, separado, por filtração e o filtrado ê liofilizado. A substância ê purificada através de distribuição em contra-corrente no sistema de solventes Bu:Ac:Ãgua. (4:1:5). As fracções combinadas são evaporadas, o resíduo ê dissolvido em 50 ml de terc-Bu0H/H20 (1:1), e a solução e congeladae criodessecada.Rendimento: 240 mg, Rf em BuOH:Piridina: H0Ac:H20 (4:1:1:2) é 0,50 sobre Si02. EXEMPLO 6

Preparação de um péptido de acordo com a fórmula I, na qual X = Lis-(Ac), = Ser, R2 = Gin e R3 = Fen-OH. - 25 - 71 315

Ref: 0/3118-545 6.1 H-Tre-Fen-OtBu

Dissolvem-se 2,5 g de Z-Tre-OH e 2,7 g de HOBt, em 25 ml de DMF, apôs o que a mistura i arrefecida ati -10°C. são, então, adicionados 2,6 g de H-Fen-OtBu.HCl, em 20 ml de DMF, e 1 equivalente de N.E.M., â mistura arrefecida, o pH da mistura é ajustado a 6,7, com N.E.M. e 2,3 g de DCC são, então, adicionados. Depois de se agitar durante 15 minutos, a -10°C e durante 18 horas, â temperatura ambiente, a DCU é separada por filtração e o filtrado ê evaporado ate à secura. 0 resíduo i dissolvido em 100 ml de EtOAc e lava-se com soluções de KHSO^ a 5%, NaHCO^ a 5%, e NaCl a 15%. Apõs secagem e filtração o filtrado ê evaporado até à secura. A re-cristalização a partir de êter/n-hexano (1:1) produziu o dipéptido protegido, com 91,4% de rendimento. Rf em To:EtOH (4:1) é 0,60 sobre Si02. 0 péptido obtido ê dissolvido em DMF apõs o que ê adicionado Pd/C (10%) e borbulhando-se H2 até que jã não se detecte mais libertação de CC>2. O Pd/C ê separado por filtração. Rf em CH2C12: MeOH, (.8:2) é 0,49 sobre Si02·

6.2 Boc-Tre-Ser-Glu(OtBu)-Lis(Ac)-Ser-Gln-Tre-Pro-Leu Val-OH

Dissolvem-se 8,19 g de Z-Ser-Glu-Tre-Pro-Leu-Val-OH em 1QQ ml de MeOH e 1 equivalente de HC1, apõs o que se adicionou Pd/C (10%). Borbulha-se H2 até jã não se detectar mais libertação de C02. O Pd/C é separado por filtração e o filtrado ê evaporado.

Rf em AmOH:Piridina:H20, (5:3:2) ê 0,21 sobre Si02· São acoplados 8,43 g de Boc-Tre-Ser-Glu(OtBu)-Lis(Ac)-I^H^ e 7,10 g de H-Ser-Gln-Tre-Pro-Leu-Val-OH através dó método da azi-da. Depois de precipitação a partir de EtOAc/DMF, o decapéptido é obtido com um rendimento de 44,8%. Rf em Am0H:Piridina:H20, (5:3:2) é 0,70 sobre Si02·

6.3 H-Tre-Ser-Glu-Lis(Ac)-Ser-Gln-Tre-Pro-Leu-Val-Tre-Fen-OH São acoplados 1,3 g de Boc-Tre-Ser-Glu(OtBu)-Lis(Ac)-Ser--Gln-Tre-Pro-Leu-Val-OH e 0,36 g de H-Tre-Fen-OtBu.HCl utilizando 71 315

Ref: 0/3118-545 - 26 - o método DCÇ/HOBt, jã descrito anteriormente. Obtém-se o dodeca-pip-tido protegido, através de precipitação a partir de EtOAc, com um rendimento de 50%. Rf em Cí^Cl^MeOH, (.8:2) é 0,55 sobre Si02·

Dissolvem-se 830 mg do péptido obtido em 8 ml de TFA a 90%. A mistura ê agitada durante 1 hora e, a seguir, é vertida em éter. A restante preparação ê análoga âs dos exemplos anteriores. O rendimento ê de 400 mg. Rf em n-Bu0H:Piridina:H0Ac:H20, (4:1:1:2) ê 0,32 sobre Si02. EXEMPLO 7 la I, Pro13 Método de preparação de um péptido de acordo com a fórmu-na qual X = Lis-(Ac) , R.^ = Ser, R2 = Gin, R^ = Leu-OH e =Apro.

H-Tre-Ser-Glu-Lis-Ser-Gln-Tre-Z\Pro-Leu-Val-Tre-Leu-OH 7.1 H-APro-Leu-Val-Tre-Leu-OtBu 7.1. Fmoc-ΔPro-OH

Dissolve-se 1,0 g de H-APro-OH (L-3,4-di-hidroproliná) em 50 ml de uma solução a 10% de Na2C02, após o que a solução é arrefecida num banho de gelo. Adiciona-se, depois, gota a gota, uma solução de 2,3 g de Fmoc-Cl em 100 ml de dioxano, e depois a mistura é agitada durante 3 horas, ã temperatura ambiente. Após evaporação do dioxano, a fase aquosa é acidificada até pH 2,5 e i extractada com éter. Depois de secagem sobre Na2SO^, ê adicionado hexano à solução etérea. Rendimento 94,6%, ponto de fusão 98 - 100°C. 7.1.2 Η- A Pr o-Leu -Val-Tr e-Leu -OtBu São acoplados 1,0 g de Fmoc-ΔPro-OH e 1,6 g de H-Leu-Val--Tre-Leu-OtBu.HCl em DMF, utilizando o método DCC/HOBt, jã descrito anteriormente. A substância é obtida, através de macerações com EtOH, com um rendimento de 73,5%; ponto de fusão 237-238°C. Rf em To:EtOH (8:2) ê 0,53 sobre Si02· 71 315

Ref: 0/3118-545 - 27

7.2 Boc-Tre-Ser-Glu(OtBu)-Lis(Ac)-Ser-Gln-Tre-OH 7.2.1 Boc-Gln-Tre-OBZl São acoplados 2,5 g de Boc-Gln-OH e 2,5 g de H-Tre-OBZl. •HC1, através do método DCC/HOBt, descrito anteriormente. 0 dipêp-tido ê obtido por cristalização a partir de EtOAc/hexano (1:1)/ com um rendimento de 100%; ponto de fusão 89 - 91°C. Rf em To:EtOH (8:2) é 0,46 sobre Si02· 7.2.2 Boc-Ser-Gln-Tre-OBZl a) Dissolvem-se 4/4 g do dipéptido obtido de acordo com 7.2.1, em 44 ml de TFA a 90%, e a solução resultante é deixada â temperatura ambiente durante 30 minutos. A seguir, a solução ê adicionada, gota a gota, a éter e o éleo resultante ê evaporado. Rf em CH2Cl2:MeOH (8:2) e 0,14 sobre Si02· b) São acoplados 2,0 g de Boc-Ser-OH e 4,5 g de H-Gln-Tre--OBZ/O-TFA, através do método DCC/HOBt, já descrito. Depois das lavagens habituais, o tripéptido protegido é isolado por precipitação a partir de EtOAc/éter/hexano, (1:1:1), com um rendimento de 31,7%; ponto de fusão ê 134 - 136°C. Rf em CH2Cl2:MeOH, (8:2) ê 0,77 sobre sio2.

7.2.3 Boc-Tre-Ser-Glu(OtBu)-Lis(Ac)-Ser-Gln-Tre-OH a) Introduzem-se 1,6 g de Boc-Ser-Gln-Tre-OBZl, em 16 ml de TFA e, depois de 30 minutos, a solução é adicionada, gota a gota, a éter. Adiciona-se éter ao óleo resultante e o precipitado formado ê separado por filtração. Rendimento 96,9%. Rf em CH2~ Cl2:MeOH:H20 (14:6:1) ê 0,25 sobre Si02· b) São acoplados um ao outro 1,6 g de Boc-Tre-Ser-Glu (OtBu) -Lis(Ac)“N2H2 e 1,6 g de H-Ser-Gln-Tre-OBZloTFA, utilizando o método da azida, conforme jã foi descrito anteriormente. A substância, ê obtida por cristalização a partir de EtOAc, com um rendimento de 70,4%; ponto de fusão 166 - 168°C. Rf em CH2Cl2:MeOH (9:1) ê 0,18 sobre Si02· - 28 - 71 315

Ref: 0/3118-545 c) Dissolvem-se 1,12 g de Boc-Tre-Ser-Glu(OtBu)-Lis(Ac)--Ser-Gln-Tre-OBZl em DMF. Ê, então, adicionado Pd/C (10%) a essa solução. Depois de se borbulhar H2 durante 18 horas, o Pd/C ê removido por filtração. Rf em CH2Cl2:Me0H:H20 (14:6:5) é 0,27 sobre SÍO2

Ac

7.3 H-Tre-Ser-Glu-Lis-Ser-Gln-Tre-A Pro-Leu-Val-Tre-Leu-OH São acoplados 1,01 g de Boc-Tre-Ser-Glu(OtBu)-Lis(Ac)-Ser--Gln-Tre-OH e 0,60 g de H-Pro-Leu-Val-Tre-Leu-OtBu pelo método DCC/HOBt, jã descrito. Depois de filtração da DCU o filtrado é adicionado a água. O sólido é obtido, com um rendimento de 53,1%.

Rf em CH2Cl2:MeOH, (8:2), ê 0,71 sobre Si02·

Introduzem-se 850 mg do pêptido protegido obtido em 10 ml de TFA a 90%. A mistura é agitada durante 1 hora â temperatura ambiente, e, a seguir, ê vertida em éter. O sólido obtido é separado por filtração, é seco e, a seguir, e dissolvido em terc-BuOH/H20 (.1:1). Depois de ser agitada juntamente com um permutador de iões, a solução é congelada e criodessecada. A substância é purificada por cromatografia em coluna, no sistema de solventes n-BuOH:Piridina: H0Ac:H20, (8:3:1:4). Rendimento: 270 mg. Rf em n-BuOH:Piridina:HOAc: H20, (4:1:1:2) ê 0,37 sobre SiC>2 -

Claims (9)

71 315 Ref: 0/3118-545 - 29 - REIVINDICA Ç Õ Έ S

1 - Processo para a preparação de pêptidos terapeutica- mente úteis e inetabolicamente estáveis, de formula (I) Tre-R1-L-Glu-X-L-Ser-R2-L-Tre-Pro~L-Leu-Val-Tre-R3 (I) na qual; X é um derivado da lisina, seleccionado do grupo que compreende Lis(Ac), Lis(Z), des-Lis, A2I1Í, Nle, Met, Leu ou Lis/Tar)al-quilo7; é Ser, Ala ou Pro? R2 ê L-Gln, D-Gln, Glu(tiramina) ou seus derivados contendo iodo, e R3 i L-Leu, Leu-NHCH^, Met, Fen, Fen(Cl), Fen(I), Cha, Mag, Vai, (HO)Leu, Bua ou Bug; ou de seus sais de adição de ácidos, caracterizado por compreender; a) o acoplamento de dois fragmentos, incluindo cada um dos fragmentos um ou mais aminoãcidos, seleccionados do grupo Tre, R·^, Glu, X, Ser, R2, Pro, Leu, Vai e R3, em que R^ X, R2 e R3 tem o significado atribuído anteriormente, sendo a sequência de aminoãcidos, em cada um dos fragmentos, a sequência de uma parte do péptido da fórmula (I), e os fragmentos, em conjunto, compreendem a sequência completa do péptido de fórmula (I), sendo o referido acoplamento efectuado por condensação, seja em fase homogénea, seja sobre uma fase sólida, e b) a remoção opcional de quaisquer grupos protectores e/ ou fase sólida, do péptido assim acoplado.

2 - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracteri zado por se preparar um péptido cora a fórmula; H-Tre-R^-L-Glu-X-L-Ser-R2_L-Tre-Pro-L-Leu-Val-Tre-R3-OH ou um seu derivado funcional. - 30 - Ref: 0/3118-545

3 - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracteri-zado por se preparar um pêptido com a fórmula: H-L-Gli-L-Gli-L-Fen-L-Met-Tre-R1-L-Glu-X-L-Ser-R2-L-Tre-Pro-L--Leu-Val-Tre-R3-0H, ou um seu derivado funcional.

4 - Processo de acordo com a reivindicação 2, caracteri-zado por no pêptido, X ser Lis(Ac).

5 - Processo de acordo com a reivindicação 2, caracteri-zado por no pêptido, X ser.Nle.

6 - Processo de acordo com a reivindicação 4, caracteri-zado por no pêptido R^ ser Pro, R2 ser Gin e R^ ser Leu.

7 - Processo de acordo com a reivindicação 4, caracteri-zado por se preparar um pêptido com a fórmula: H-Tre-Pro-L-Glu-Lis(Ac)-L-Ser-Gln-L-Tre-Pro-L-Leu-Val-D-Tre-Cha-OH.

8 - Processo de acordo com a reivindicação 5, oaracteri-zado por, no pêptido, R.^ ser Ser, R2 ser Gin e R3 ser Leu.

9 - Processo de acordo com a reivindicação 4, caracteri-zado por, no pêptido, R-j^ ser Ser, R2 ser Gin e R3 ser Leu. Lisboa, 10. á0Q. 19>0 & Por AKZO N.V. - 0 AGENTE OFICIAL -