PT94676A - Processo para a preparacao de derivados do taxol e de composicoes farmaceuticas que os cont}em - Google Patents

Description

Descrição da patente de invenção de THE UNIVERSITX OF KANSAS, norte-americana,instituição de ensino superior e de investigação científica, estabelecida em Research Gra-duate, Studias & Public Service, 226 Strong Hall, Lawrence, Kansas 66044, Estados Unidos da América, (inventores: Valentino J. Stella e Abraham E. Mathew, residentes nos E.U.A.), para "PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DE DERIVADOS DO TAXOL Ξ DE COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS QUE OS CONTEM"

Descrição

ANTECEDENTES E ÂMBITO DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se a derivado^ do taxol que têm maior solubilidade em água do que o taxol, e apresentam uma excelente actividade antitumor. Os compostos são particularmente uteis para o tratamento de alguns cancros em que o taxol se mostrou activo, incluindo tumores de pulmão, melanona, leucemia, tumores mamários, e cancro do cólon, no homem. 0 taxol é um sequisterpeno diterpenóide conhecido que foi originalmente isolado da casca do tranco do - 1 -

teixo ocidental, ffaxus brevifolia. e tem a seguinte estrutura:

CH H3C ' CH COO 0 OH

H3c

o S^° \Kj? a 0H (I)

Sabe-se que o taxol tem uma potente ac-tividade antititumor contra vários tipos de tumor. Este composto é, contudo, apenas ligeiramente solúvel em água e este facto tem criado problemas significativos no desenvolvimento de composições farmacêuticas úteis para a terapia humana. Algumas formulações de taxol para injecção ou infusão I.V. foram desenvolvidas utilizando principalmente o cremoforo EL^ como veículo do medicamento para resolver os problemas de baixa solubilidade em água éo taxol. O cremoforo, contudo, e ele próprio um pouco tóxico causando a libertação da his tamina idiossincrática e uma resposta do tipo anafilactóide, e assim a utilização deste veículo não e uma solução desejável para o problema do desenvolvimento de boas formulações do taxol. A presente invenção, refere assim, o desenvolvimento de derivados do taxol que são mais solúveis em água do que o taxol, mas que também apresentam a mesma ou semelhante actividade antitumor e citotóxica excelente do taxol. - 2 - ί ϊ

(ΓΓ ~5SUGSí4SmtSll ·.<

RESIMO Ε OBJBCTIVOS DA INVENÇÃO

Constitui, assim, um objectivo da presente invenção desenvolver derivados do taxol que apresentem uma boa actividade antitumor e que sejam solúveis em agua.

Constitui outro objectivo da invenção desenvolver formulações de derivados do taxol que utilizam veículos não tóxicos, evitando assim a utilização de veículos tóxicos, como por exemplo o cremoforo.

Constitui ainda um outro objectivo da presente invenção desenvolver derivados do taxol que apresentam boa estabilidade a valores de pH adequados para a preparação de formulações farmacêuticas (pH 3 a 4), mas que rapidamente se desintegram in vivo a um pH fisiológico (pH 7,4) para actuarem potencialmente como pró-medicamento de taxol.

Estes e outros objectivos da invenção são realizados pelo desenvolvimento de derivados de taxol que tem uma boa actividade antitumor e uma boa solubilidade na água.

DESCRIÇÃO PORMENORIZADA DA INVgNÇgQ

Os novos derivados de taxol da presente invenção podem, em geral, ser descritos como ésteres nas posições 2 e/ou 7 do taxol, representados pela seguinte fórmulas 3

(II) fia qual R e R* são cada um H ou o resíduo de um amino ácido escolhido no grupo consistindo em alanina# leucina, isoleuci-na, valina, fenilalanina, prolina, lisina e arginina ou um grupo com a formula

N

R (III)

R 2 3 na qual n é um inteiro de 1 a 3 e R e R são cada um hidrogénio ou um radical alquilo com um a três átomos de carbono e em que R e R juntamente com o átomo de azoto a que estão ligados formam um anel heterocíclico saturado possuindo quatro a cinco átomos de carbono, com a condição que pelo menos um de entre R e não ser hidrogénio.

Na formula (III) acima apresentada, 2 3 , quando R e/ou R são diferentes de hidrogénio, estes compos* 4

tos podem ser considerados, e são por vezes referidos como "amino ácidos alquilados". Assim, os compostos com a fórmula (I) podem ser genericamente considerados como ésteres nas posições 2* e/ou 7 do taxol formados com amino ácidos ou amino ácidos alquilados. A ifivençSo inclui assim (a) derivados esterifiçados no grupo 2'-hidroxilo do taxol, (b) derivados esterifiçados no grupos 7-hidroxilo do taxol, e (c) derivados esterificados nas posições 2*- e 7- dos grupos hidroxilo.

De entre os compostos incluídos na fórmula geral (I), acima apresentados, podem considerar-se como compostos preferidos da invenção os seguintes compostos específicos: 1. 2’(N, N-dietilaminopropionil)taxol 2. 2*(N, N-dimetilglicil)taxol 3. 7-(N,N-dimetilglicil)-tax.ol 4. 2*,7-di-(N, N-dimetilglicil)taxol 5. 7(N,N-dietilaminopropionil)taxol 6. 2*-7-di(N, N-dietilaminopropionil)taxol 7. 2'-(L-glicil)taxol 8. 7-(L-glicil)taxol 9. 2’,7-di-(l-glicil)taxol 10. 2'-(L-alanil)taxol 11. 7-(L-alanil)taxol 12. 2',7-di(L-alanil)taxol 13. 2*-(L-leucil)taxol 5 14. 7~ (L-leutíil) taxol 15. 2‘7-di (L~laucil)taxol 16. 2‘-(L-isoleucil)taxol 17. 7-(L-isoleucil)taxol IS. 21t 7-di(L-isolencil)taxol 19. 2'-(L-valil)taxol 20. 7^ (L-valil) taxol 21. 2', 7-di (L-valil) taxol 22. 2(L-fenilalanil) taxol 23. 7-(L«fenilalanil)taxol 24. 2'# 7-di (L-£enilalanil) taxol 25. 2'-(L-prolil)taxol 26. 7-(L-prolil)taxol 27. 27-di (L-prolil) taxol SS'-. 21-(L-lisil)taxol 29. 7-(L-lisil)taxol 30. 2*,7-di(L-lisil)taxol 31. 2·-(L-glutamil)taxol 32. 7-(L-glutamil)taxol 33. 2',7-di(L-glutamil)taxol 34. 2‘-(L-arginil)taxol 35. 7-(L-arginil)taxol 6

36. 21,7-di (L-arginil) taxol

Procedimentos de Preparação

Verificou-'se que as características de reactividade química dos grupos hidroxilo nas posições 2‘ e 7 do taxol, especificamente o 2'-hidroxilo é quimicamente mais reactivo do que o grupo 7-bidroxilo. Esta observação foi depois utilizada para dirigir a posição dos derivados nos procedimentos de preparação. Ρτ-eparacão dos derivados de 2'-éster

Os derivados de 2'-éster podem ser pre parados por um de dois processos, dppendendo do derivado ser obtido com um amino acido ou com um amino ácido alquilado

Para preparar os ésteres de amino ácidos alquilados, segue-se o seguinte esquema reaccional:

B,?gue ma X amino ácido alquilado + taxol *—) derivado 2'-éster do taxol

OH

<®2>η

N R" H 0 c=o . «^n N/ \ R2 R' - 7 -

CH3GOO

ο 3 na qual n, R‘ e R são como acima definidos.

Para preparar os ésteres de amino ácidos, segue-se o seguinte esquemas

Bscruema II

Amino ácido N-protegido + taxo! --^ derivado de amino ácido 2'-N-protegido do taxol clivagem do grupo pro-^tector derivado de éster 2‘-amino ácido do taxol

Sm ambas os esquemas reaccionais acima apresentados (Bsquema I e II), a reacção do amino ácido alquilado ou protegido é conduzida na presença de um reagente de condensação, e com ou sem a presença adicional de um catalisador, preferivelmente á temperatura ambiente.

Os reagentes dè condensação adequados incluem carbodiimidas, como por exemplo diciclohexil carbodi-imida (DCC).

Os catalisadores adequados incluem a 4--dimetilamino-piridina (DMAP) e a piridina.

No Esquema reaccional (II), podem utilizai}·' -se vários grupos protectores de amino conhecidos e amino ácidos protegidos comercialmente disponíveis.como materiais de partida. Podem ser utilizados amino ácidos protegidos com t-BOC, FIDO ou carbobenziloxi (CBZ), Preferem-se os amino ácidos protegidos com grupos t-BOC ou FMOC. Embora a despro· tecção do grupo t-BOC nos 2'-ésteres utilizando uma solução aquosa de ácido formico e outro ácido orgânico resultante da degradação do produto e também numa modificação estereo- - 8 - J *

qumica, a utilização de ácido fórmico a 99% produziu melhores resultados. No caso de ésteres de amino ácidos protegidos com FI'DC a recuperação do produto depende das condições de processamento. Assim, na fase final de desprotecção, as condições utilizadas para remover o grupo protector na posição 7 das moléculas de taxol. Estas modificações indesejáveis parecem consistir em modificações estereoquimicas da molécula.

Como exemplos, os compostos de alanina N-protegidos podem ser apresentados na forma seguinte: CH- 0 1 3

CH.-C-O-C-NH-CH-OOOH

I I

CHg CHg protegido com t-BOC

CH2-0-C~Nn~CII~000H protegido com FiOC GH,

Tal como acima referido, verificou-se que o grupo 2'-hidroxilo do taxol é quimicamente mais reactivo do que o grupo 7-hidroxilo. Assim, em ambos os Esquemas I e II acima apresentados a substituição ou esterificação é dirigida para a posição 2* fazendo reagir o amino ácido alquilado ou N-protegido com taxol numa proporção lsl ou ligeiramente superior a 1:1 molar. Esta reacção de quantidades molares iguais resulta na produção de um grande excesso do derivado de 2'-éster do taxol, embora se possa produzir, como produto - 9 - ϊ k

secundário, um derivado de 7-éster de taxol. B. Pr-eparacao dos esteres na posição 7 Esquema III

Dado que o grupo 2'-hidroxilo do taxol é mais reactivo do que o hidroxilo na posição 7, esta reac-ção de esterificação necessita da utilização de um procedimento diferente do utilizado para preparar os derivados 2',

Assim, para preparar os esteres da posição 7, utiliza-se o procedimento em que o 2'-hidroxilo e em primeiro lugar prote gido em bloqueado, e em seguida o hidroxilo na posição 7 é esterificado e em seguida I removido do grupo 2'-protector ou bloqueado. taxol + composto protector - y taxol 2'-protegido — amino ácido alquilado desproteger a posição 2' 4* taxol 7-esterificado ^--taxol substituido com amino acido 2'-protegido, 7-alquilado

Podem utilizar-se vários grupos bloquean-tes para bloquear a posição 2 do taxol, como por exemplo alguns conhecidos. Utilizando um exemplo de um grupo bloquean-te e utilizando um amino ácido alquilado como exemplo, pode resumir-se o Esquema reaceional (III) na forma seguintes 10 -

taxol + cloroformato de 2, 2, 2-tricloroet.il-2'-(troe)- taxol N, N-dimetil glicina reagente de condensação desprotecção da catalisador posição 2' 7- (N, N-dimetilglicil) taxol {--- 2(troe) -7- (N, N- -dimetilglicil)-taxol

Poderá utilizar-se vários grupos bloquea-ntes para bloquear a posição 2 do taxol, como por exemplo alguns conhecidos. Utilizando um exemplo de um grupo bloguean-te e utilizando um amino ácido alquilado como exemplo, pode resumir-se o Esquema reaccional (III) na forma seguinte:

No esquema reaccional acima apresentado, a reacção do 2*-troc-taxol e- o amino ácido alquilado é efec-tuado na presença de um reagente de condensação e de um catalisador. Os reagentes de condensação e os catalisadores adequados são os mesmos dos acima referidos para os Esquemas I e II,. A desprotecção do 2*-(troe.) taxol pode ser efectuada, por exemplo, utilizando uma mistura de zinco e ácido acético.

Esquema XV:

Como procedimento alternativo, os derivados do taxol 7-substituido podem também ser preparados por um procedimento em que em primeiro lugar se faz reagir o taxol com 2-3 equivalentes de um amino ácido N-bloqueado para produzir o taxol.J2,,7-dissubstituído. sendo ambos os aminos 11 ácidos nas posições 2' e 7 desprotegidos, e o amino ácido na posição 2* é em seguida clivado. Este procedimento pode ser representado na forma seguinte, utilizando o alanilo protegido com t-BOC como amino ácido bloqueado exemplar. taxol + N-t-BOC-alanina--2', 7-di (t-BOC-L- (2-equivalentes) -alanil)taxol desprotecção amino ácido 21,7-di (L) -alanil) taxol clivagem de 2'-alanil 7'(L-alanil)taxol

Neste procedimento, semelhante ao do Esquema XXI, a reacção do taxol e do amino ácido protegido é conduzida na presença de um reagente de condensação e de um catalisador. A desprotecção dos amino ácidos e conduzida segundo um processo de desprotecção de amino ácidos conhecidos, como por exemplo o tratamento com um ácido moderado como por exemplo o acido fórmico. A clivagem do 2*-amino ácido é conduzida ajustando o valor do pK na solução de 2‘,7-amino ácido) taxol a valores de pH 7-7,4, por exemplo por mistura do 2‘,7-di (amino ácido) taxol com um tampão de fosfato a um valor de pH de 7-7,4. 0 ajuste do pH deste modo cliva o 2'-amino ácido para produzir o 7-(amino ácido) taxol desegado.

Assim, por exemplo, faz-se reagir o taxol com 2-3 equivalentes molares do amino ácido N-protegido (pro tegido com t-BOC, GBZ οα FMDC) ça de DCC e de uma quantidade em cloreto de metileno na presen· catalítica de 4-dimetilaminopiri-· 12 -

dina, Deste modo, o amino ácido protegido é introduzido na posição 2*, e 7. Os grupos protectores são removidos por um agente de desprotecção adequados (por exemplo por hidrogenó-lise ácida, básica moderada). 0 derivado 2*-7-bis amino ácido do taxol é deixado repousar num tampão de fosfato a um valor do pH neutro durante 24-48 horas, ocorrendo a desprotecção selectiva na posição 2' para se obter o derivado 7-substitui-do do taxol.

Podia também utilizar-se um esquema reaccional semelhante para produzir os derivados de taxol 7--substituídos com amino ácidos alquilados. Esta reacção seria semelhante à anterior, com a excepção de se substituir o amino ácido N-protegido com o amino ácido alquilado pretendido e se eliminar a fase de desprotecção. Este esquema pode ser representado na forma seguintes

Esquema V: taxol + amino ácido alquilado—y 2',7-(dissubstituido) (2-equivalentes) taxol clivagem do amino ácido 2’-alquilado 4/ 7-(substituído)taxol G* Preparação, dos derivados de 2». 7-dissubstituido Taxol

Os derivados dissubstituidos podem ser preparados utilizando os procedimentos acima referidos, ou parte desses procedimentos. Estes procedimentos podem ser resumidos da forma seguintes 13 i

Esauema VI: substituição com amino ácidos alquilados taxol + amino ácido alquilado -^ 2‘, 7-(amino ácido alqui- (2-3 equivalentes) lado dissubstituido (taxol)

Esquema VII t substituição com amino ácidos taxol + amino ácido N-protegido -—^ 2', 7-(amino ácido alqui-(2,3 equivalentes) lado dissubstituido) taxol desprotecção do amino ácido

Ar 21,7- (amino ácido dissubfι· tituido) taxol 0 Esquema VI I basicamente o mesmo do Esquema I acima apresentado, com a excepção de a reacçlo ter lugar com 2 equivalentes do amino ácido alquilado. Além disso, embora o Esquema I possa ser conduzido na presença ou ausência de um catalisador, o processo do Esquema VI requer a presença de um catalisador devido à reduzida reactividade química do grupo hidroxilo na posição 7 do taxol. 0 Esquema VII é basicamente o mesmo do Esquema II. C0ntudo, re£eriu-se acima que no Esquema II, o FiOC é o grupo protector preferido de modo a evitar modificações esteáricas na posição 7 durante a fase de desprotecção.

Este problema não ocorre, contudo, no Esquema de reacçlo VII dado que o grupo hidroxilo na posição 7 não está livre. Assim, podem utilizar-se vários grupos pro-tectores conhecidos, incluindo t-BOC e FMQC. 14 -

Pensa-se que os especialistas podem, utilizando a descrição acima referida, preparar todos os compostos da presente invenção. Apresentam-se, contudo, os seguiii-tes compostos como realizações específicas preferidas ilustrativas dos procedimentos de preparação.

Sxemplo I - 2‘-(N, N-dimetilglicil)taxol ou um seu sal

1. R =s 0=C-CH2-N(CH3) 2, R'*H

I

2. R = 0=G-CH2-N(GH3) 2, R*—H

.CHgSO H (a) Composto 1 - 2*-(N,N-dimetilglicil)taxol A uma solução de taxol {0,21 g, 0,246 mmol) e N, N--dimetilglicina (0,0254 g, 0,246 mmol) em cloreto de metileno anidro (12 ml), são adicionados 1,3-diciclo-hexilcarbodiimida (0,15 g, 0,72 mmol) e 4-dimetilami-nopiridina (0,025 g. 0,2 mmol). Agita-se a mistura 15

reaccional em condições anídrâs durante um dia. Adicionou-se mais 50 mg de DGC e continua-se a agitação durante mais seis horas. Filtra-se a mistura reaccional e evaporouase o filtrado em azoto. Cromatografa--se em gel de sílica silanizada (35 g, 26 cm) e eluiu-· -se sucessivamante cora acetato de etilo:éter do petróleo (1:1) e acetato de etilo. As fracções de acetato de etilo:éter do petróleo provocam o aparecimento, após evaporação lenta, de um sólido gue ê separado por filtração. Concentram-se as águas mães e adiciona-se éter do petróleo até aparecer uma solução turva e separam-se para se obter mais compostos. 0 peso total é de 0,14 g (61%) P.F. 168 - 71°C (dec.) Mo espectro de RMN o composto 2 (300 MHz, CDClg) as ressonâncias no protão 2' são desviadas de 4,71 ppm no taxol para 5, 59 ppm. Sste facto é coerente corji a esterificação na posição 2'. Todas as outras ressonâncias do espectro estão de acordo com a estrutura atribuida. A pureza determinou por HPLC é de 98 -- 99,5 %. Espectro de massa: (FAB) nv^e 939. (Μ + H)*

Análise elementar: calculada para C51H58N2°15; C, 65, 26, H, 6,22, N, 2,98; determinado C, 65,16, H 6,28, N, 3,13%.

Composto 2 - Sal do ácido metanossulfónico de 2*-- (N, N-dimetilglicil) taxol.

Dissolve-se o 2'-(N, N-dimetilglicil) taxol (0,06 g, 0,064 mmol) em t-butanol (2 ml) e água (1,5 ml). Arrefece-se a mistura para ~5°C e adiciona-se gota a gota ácido metanos sul fónico (3,1 ml, 2 mg/ml, 0,0645 mmol) e agita-se a mistura a 0-5°C durante um minuto e filtra-se através de um filtro de 20 ,um (miliporos) para dentro de um frasco arrefecido numa mistura de gelo isopropanol. Liofiliza-se a solução para se obterem 0,058 g do produto. 16

83%), p. f. 170 - 173° Análise elementar:

Calculado para C52H62Í>T2S°18 ·2Η20? 57,83, H, 6,27 N, 2,6; determinado, C, 57,49, H, 6,06, N, 2,73%.

Propriedades físicas P. Mol.: 1035 P«F.: 170-173 (Dec.)

Solubilidade: 15 mg/mL (Ligeira mente turva) 2 mg/mL (Transparente)

Estudos de Estabilidade Química:

Submeteu-se o composto a estudos de estabilidade de acordo corn^os seguintes procedimentos:

Estudarara-se as estabilidades de derivados em vários valores de pH a 25°C e 37°C. Os estudos de plasma foram efectuados a 37 C em plasma de ratos e humano. 0 plasma humano foi obtido do Hospital Watkins e o plasma de ratos foi obtido de Animal Care Ifeit da Universidade de Kansas, A concentração do derivado utilizada era cerca de 20- 25 jig/ml. Preparou-se uma solução de base do composto a 0,8-1,0 mg/ml e foi adicionada a plasma para se obter a concentração desejada (20-25 /íg/ml). Removeram-se cem mibrolitros de amostra que se arrefeceram com 250 ^ul de acetonitrilo e centrifugou-se para precipitar as proteínas do plasma. Estudou-se a cinética da degradação por representação da área de pico de HPLC em função do tempo. Calcularam-se os valores de tn- e tr_. 90 50

Os estudos^químicos e de plasma foram seguidos por cromatografia líquida de alto rendimento utilizando uma coluna RP-8 (15 cm) e uma pré-coluna (5 cm). 0 de-tector foi fixado a 227 nm. A fase móvel consistia de 'acetato (0,02 M (pH 5) : acetonitrilo 50:50 ou 35:65 e o caudal va— 17 -

riável de 1-1,5 ml/min, ou nos mesmos solventes conteddo hidrogenossulfato de tetrahutilalónio (Ο,ΟΟΙΜ) e um caudal de 1 ml/min.

Nos estudos de estabilidade, o desaparecimento do pico do composto resultava na formação de um pico com um tempo de retenção igual ao do taxol* A identificação deste pico foi depois confirmada pelos estudos de degradação dos novos derivados. Assim, incubou-se 2* (DMG) ta-xol com água a 37°G e concentrou-se o produto e purificou-se por TLC preparativa. Após purificação analisou-se o produto por métodos de HPLC e espectroscopia, 0 produto apresentava um pico do ião molecular a m/e 860 (M + Li) , indicando que o produto era o taxol.

CondicSes de Operação de HPLCs Colunas fase moveis

Detector:

Caudais Tempo de ret. RP-8, 150 mm de comprimento, 4, 6 mm idem

Acetato (pH5)s

Acetonitri lo 50 : 50 s 0,02 M

Kratos Spectroflow 757 1 mL/min 11.2 mL composto 2 5.5 mL taxol 18 - I ίΤ ." Resultados de Estabilidade piuimica: condições Acetato 0,02 M (0,1 mg/mL) (pH 3,5, 25°C) (pH 4,5, 25°C) água (2 mg/mL) (pH 3,8, 37°G) Estabilidade de Piasma,. 37°Cs condições plasma do rato (20 pg/mL) plasma do cão (20 jag/mL) plasma humano (20 >ug/mL) h/2hrs) 96, 2 55.4 89, 8 t1/2 ^min^ 3,05121,6 198,6

Exemplo II - Sais de 2 * (ΚΓ, N-dietilaminopropionil)taxol CH3C0° 0 OR·

1. R=0=G-CH2-GH2N(C2H5) 2,

R*-H • HC1 2. RO^C-CHo-CH^ÍG^Hç) l3L~3“

R‘-H 19 -

(a)

Composto 3 - sal de HC^ de 2*-(3-(N,N-dietilamino)--propionil)taxol. A ama solução de taxo! (0,12 g, 0,14 mmol) em CH Cl (12 ml) contendo cloridrato do ácido N,N-dietilamino-propionico (0,025 g, 0,145 mmol), são adicionados 1,3-dicIclbhexilcarbodiimida (0,08 g, 0,38 mmol) e 4-dimetilarídnopiridina (0,01 g, 0,081 mmol).

Agita-se a mistura resultante à temperatura ambiente durante 24 horas. Filtrasse a mistura reaccional e evapora-se o filtrado em azoto. Cromatografa-se o material bruto numa coluna de gel de sílica silani-zada (18 g, 22 cm) e faz-se a eluiçSo sucessivamente com acetato de etiloséter do petróleo ls2, acetato cfe etiloséter do petróleo lsl e acetato de etilo.

Ag fracções de acetato de etiloreter do petróleo formam em evaporação lenta um precipitado sólido que é separado por filtração. Combinam-se as águas mies contendo o produto, concentram-se e adiciona-se éter do petróleo até turvar e guarda-se. Filtra-se o produto para se obterem 0,068 g do produto (48%), Os valores de P.F. 188-191°C, espectro de massa (FAB) m%e 981 Z~M + Hj?t RMN (300 H , CDCl ) indicavam que as ressonâncias do 2 3 protão 21 se desviava de 4, 71 ppm no taxol para 5,53 ppm. Os grupos N-etilo apresentavam uma ressonância de metilo a 1,0 ppm e a ressonância de C^ a 2, 52 ppm. Todas as outras características de ressonância do composto esperado foram observadas.

Análise elementar calculada para C54H65GIN2°15' C, 63,73, K, 6,43, N, 2,75; determinado C, 64,84, H, 6,84, N, 2,89%. 20

Propriedades físicas (para o composto 3) P* Mol. P.F. i Solubilidade 1017.56

186-189°C (dec.) -0.8 mg/mL

Condições de HPLC Coluna: fose móvel: RP-8, 150 mm comprimento, 4, 6 mm idem Acetonirilo 35:65 0.0 2 M Acetato (pH 5):

Detector: Caudal Volume de Ret

Kratos Spectroflow 757 1.5 mL/min 3) 16.71 mL (composto

Estabilidade químicas Condições Acetato 0,02 M (0,01 mg/mL, pH 3.5, 25°C) tl/2 438,6 (horas) 0.25 tl/2 (min). 4,2

Fosfato 0,02 M (0,0 2 mg/mL, pH 7,4, 25°C)

Estabilidade do Plasma. 37°C Condições

Plasma humano 21

(b) Composto 4 - Sal de ácido metanos sul fónico de 2'--(N,N-dietilaminopropionil)taxol

Para preparar o sal do ácido mefcanossulfónico do ácido N,N-dietilaminopropiónico, humidificaram-se 10 g de GAE-sefadex (Pharmacia) com NaC^ 0,1 M durante 75 horas e deitaram-se 75% desse material numa coluna. Lavou-se a coluna com água destilada (700 ml). Equilibrou-se a coluna com 500 ml de CH^SO^Na (preparado a partir de ácido metanossulfónico 0,5 Me hidróxido de sódio 0,5 M e tritulou-se a pH 6(. Verificou-se o desaparecimento completo de C-j- recolhendo o eluído e ensaiando para a determinação da presença de C^- por adição de algumas gotas de nitrato de prata a 1% nalgumas gotas de ácido nítrico. A coluna foi ainda lavada com água destilada ate pH neutro.

Deitaram-se 2,5 g de sal de HC1 de ácido N,N-dietila-minopropiónico em 15 ml de água numa coluna e eluiu-se com água. Recolheram-se quatro fracções de 50 ml. As primeiras fracções continham o produto. Estas frac-çQes foram combinadas e removeu-se o solvente. Dissolve u-s a o resíduo numa mistura de cloreto de metileno--etanol e ecou-se em sulfato de magnésio e removeu-se o solvente para se obterem 3,1 g de produto. Precipi-tou-sa de etanol e éter para se obterem 2,6 g de sal do ácido metanossulfónico do ácido N, N-dietilamino-propiónico. A uma solução de taxol (0,05 g, 0,058 mmol) de sal do ácido metanossulfónico do ácido N,N-dietilaminopro-piónico (0,014 g, 0,058 mmol) em cloreto de metileno (10 ml) é adicionada 1,3-diciclohexilcarbodiimida (0,061 g, 0,3 mmol). Agita-se a mistura à temperatura ambiente durante 24 horas. Filtra-se a mistura reaccio nal e evapora-se o filtrado em azoto. Cromatografa-se o resíduo numa coluna de gel de sílica silanizada e 22 -

elui-se com acetato de etiloíéter do petróleo lsl e acetato de etilo. Ag fracçSes de acetato de etiloíéter do petróleo, após evaporação lenta, produziram 0,048 g do produto (74%). P.f. 170-174°C.

Propriedades físicas?

P.Mol. P. f. Solubilidade Pureza por HPLC 1077.12 170-74 ^ 10 mg/ml > 99%

Estabilidade químicas tl/° ^oras^ 305 20.7

Condições Acetato 0,02 M

(pH 4,5, 25°C) Acetato 0,02 M (pH 5,5, 25°C) 23

Exemplo III - Preparação do 7-{N, N-dimetilglicil)taxol ou de um seu sal

5. 0=C-0~CHo~CCl , Ci O i R' =H 6. 1 R=C=C-0-GH o-C01„ ^ 3 1 R' a0=O-CH2-N (GH3) 2 1 7. R=H, 1 R,*0«G-CH2-N(GH3)2 I 8. R=H, 1 R'=0=G-GH2-N(CH3)2 CH3S03H 24 2*-(troe)taxol (Composto 5)

Dissolvesse taxol (0,27 g, 0,316 mmol) em cloreto de metileno (10 ml) e piridina (1,5 ml). Arrefeceu--se a mistura reaccional para -20° a -25°C e adiciona-se cloroformato de 2, 2, 2-tricloroetilo (80 ^1). Agita-se a mistura reaccional a essa temperatura durante 3 horas. A^iciona-se mais 25 ^ul de cloroformato e agita-se a mistura durante a noite. Diluiu-se a mistura reaccional com cloreto de metileno (50 ml) e lava-se sucessivamente com HC1 0,1 N (25 ml x 2) e bicarbonato de sódio frio (0,05 M) (25 ml x 1) e água, Seca-se o extracto orgânico em sulfato de magnésio anidro, e remove*se o solvente. Purifica-se o material bruto por TLC preparativo em placas de gel de sílica silanizada e revela-se em acetato de etilo--éter do petróleo ls3 e corta-se uma banda acima do taxol e elui-se com acetato de etilo e remove-se o solvente para se obterem 0,32 g (97%), p.f. 221-226°C (dec., macia a 16o°C). 2'-(Troe)-7- (N,N-dimetilglicil) taxol (Composto 6)

Dissolve-se uma mistura de 2 *-(troe) taxol (0,27 g, 0, 262 mmol) e N, N-dimetilglicina (0,054 g, 0,524 mmol) em dicloreto de metileno (15 ml). A esta solu-ç&o adicionam-se 1,3-diciclohexilcarbodiimida (0,215 g, 1,04 mmol) e 4-dimetilaminopiridina (0,025 g, 0, 2 mmol) e agita-se a mistura à temperatura ambiente durante dois dias. Filtra-se a mistura reaccional e remove-se o solvente. Parifica-se o material bruto por TLC preparativa em placas de gel de sílica silanizada e revela-se em acetato de etiloíéter de petróleo 1:1. Corta-se uma banda por baixo do taxol (R£ 0,47, acetato de etilo: éter do petróleo 1:1) e elui-se com acetato de etilo, e remove-se o solvente para se obterem O, 26 g do produto (89%). 25

StBXSKEK ίϊ

tf* **wrst-2 r.«i»f*iu*< p.f. 176-l80°c (dec.)

Análise elementar, calculado para ^54^60^3^2° 17# C, 58,12, H, 5,42, N, 2,51; determinado, G, 58,68, H, 6,00, N, 3,18%. (c) 7-(Ν,Ν-dimetilglicil)Taxol (Composto 7) A uma solução de 2'-(troe)-7-(Ν,Ν-dimetilglicil) taxol (0,335 g, 0,3 mmol) em metanol-ácido acético 9*3 (12 ml) é adicionado pó de zinco (0, 275 g) e agita-se a mistura à temperatura ambiente durante vinte e cinco minutos e filtra-se, Concentra-se o filtrado até cerca de 1 ml e dilui-se com dicloreto de metileno (35 ml) e lava-se sucessivamente com HC1 0,01 M (20 ml x 2), bicarbonato de sódio frio 0,01 M e água. Seca-se a fase do extracto orgânico em sulfato de sódio anidro e remove-se o solvente para se obterem 0, 24 g de produto. Purifica-se este composto por TLC preparativa em placas de gel de sílica silanizada (20 x 20. 3 Nos) e revela-se em cloreto de metileno: acetato de etilo 7:1. A banda correspondente ao 7-(DMG) taxol (Rf 0,35) é cortada e eluída com acetato de etiljo e etanol e remove-se o solvente para se obterem 0,19 g do produto (68%). p. f. 180-185°C (dec. amaciado a ~140°C) · Espectro de massa (FAB) m/e 939 £~M + H_/t No espectro de rMN (300 MHz, CDCl-j) as ressonâncias de 7-H a 4,33 ppm em taxol aparecem como um dobleto de dobletos a 5,65 ppm. A ressonância de N-(CH3)2 aparece como singleto a 2,35 ppm. 0 grupo metileno do glicinato apareceu a 3,16 ppm. (d)

Sal do ácido metanossulfónieo de 7-(dimetilglicil) taxol (Composto 8).

Dissolve-se 7-(dimetilglicil)taxol (0,065 g, 0,069 mmol) em t-butanol (2.5 ml) e água (1 ml). Arrefece-se a solução para 5-l0°C e adiciona-se ácido metanossul- 26 - * *

tffsnr

-•'•-itíres cr?-. «Tiasn-i sutuH fónico (3,36 ml, 2 mg/ml, 0,0697 mmol). Agita-se a mistura durante 2 minutos e filtra-se através de um filtro de miliporos para um frasco refrigerado com gelo. Liofilisa-se o filtrado para se obterem 0,066 g de produto (94%). Pf. 164-168 (dec).

Análise elementars C, 58, 29, H, 6,19, H, 6,00, N, 1,72» calculado para C52H62W2°18S* 2H2°' N, 2,6; determinados G, 58,05,

Propriedades físicass P. Hol. P.P. · Solubilidades

1035 164-168°C > 2 mg/mL WGJBpn,aig.e.e.s.?, Colunas fase móvelí

Detectors caudal

Ret, volumes

Estabilidade químicas

Condiçbes:

Acetato 0.02 M (pH 3,5, 25°C) 0,02 M Acetato (pH 4,5, 25°C)

Fosfato 0,02 M pH 7,4 (25°C) RP-8, 150 mm comprimento 4,6 mm idem. 0,02M Acetato (pH 5)í Acetonitrilo 35s65

Kratos Spectroflow 757 1.5 mli/min 15.07 mL (Composto 8) ti/g (horas) 3397 1719 33.8 horas 27 -

9. R = R ' =0=€-CK„-i\T (CII_ ) 0 2 3 2 n- acas

Dissolve-se (0,06 g, 0,0702 mmol) em clore-j: de metileno anidro (5 ml) e adicionou-se N,N-dimetilglicina (0,015 g, 0,145 mmol). A mistura adicionou-se 1,3-diciclohe-xilcarbodiimida (0,08 g, 0,388 mmol) e 4-dimetilaminopiridina (0.008 g, 0,065 mmol). Agita-se a mistura reaecional à temperatura ambiente durante 24 hora-s s filtra-se. Remove-se o solv£: te do filtrado. Purifica-se o resíduo por TLC preparativa em p de gel de sílica silanizada e revela-se com acetato de etilo--éter de petróleo 1:1. Despreza-se uma banda (Rf = 0,17) acima de dimetilaminopiridina e elui-se com acetato de etilo e etanol e remove-se o solvente. Recristalização o resíduo de 28 - UE \3SS^ -.5= de acetato de etilo-eter de petróleo para se obterem 0,046 g de produto (64%) P.F. 194-198°C. Espectro de massa : m/e 1024 (M+). Na. espefctro de RMN (300 MHz, GDC13) o protão C2 (4, 71 ppm) e o protão - C7 (4,33 ppm) desviavam-se para 5,5 ppm e 5,6 ppm respectivamente, mostrando uma esterifica-ção na posição 2* e 7. 5?ambém o protão de N-CH^ aparecia como singleto a 2,3 ppm.

Analise elementar calculada para C__H_ N O * 55 66 3 16 C 63.39 determinado 0 63.00 H 6,48 H 6,98 N 4,03 N 3,98 S-intese, do sal do ácido metanos sul fónico de 217-(N, N-dimetil.-qliciDtaxol A uma solução de 2, 7-(dimetilglicil) taxol (60 mg, 0.0585 mmol) dm t-butanol (2 ml) e água (1 ml) arrefecida para 0-5°G é adicionado ácido metanossulfónico (11,37 mg, 3,79 ml, 0,117 mmol). Agita-se a mistura a 0-5°C durante 2 minutos e filtra-se através de um filtro de mili- poros (0,2 ^) e liofiliza-se mg de produto. P.F. 160 - 63°G. Propriedades físicas P.Mol. P. F. Solubilidade pureza em HPLC Condições de Operação em HPLG Coluna: fase móvel: Detector: o filtrado para seobterem 62 1217 160-163°C (dec.) > 10 mg/ml ~ 96% RP-8, 150 mm, 4,6 mm Dl 0,02 M acetato (pH5): Acetonitrilo 50:50 contendo 0.005M TBk Kratos espectroflow 757 29

caudalί 1 ml/Min.

Ret. Volumes 6, 64 Ril* 5,8 tnL (taxol)

Exemplo V - Ρτ-eparafrão de 7p (-L-alanil)taxol ou de um seu sal (a) 2^7-01^. Boc.-Ir-alanil)taxol A uma solução de taxol (0, 21 g, O, 246 mmol) e N--t.Boc-Ir-alanina (0,14 g, 0,739 mmol) em cloreto de metileno (15 ml) I adicionada 1,3-diciclohexilcarbo-diimida (0,25 g, 1,21 mmol) e dimetilaminopiridina (0,025 g, 0,20 mmol). Agita-se a mistura à temperatura ambiente durante 24 horas e filtra-se. Cromato-grafa-se o resíduo em coluna de gel de sílica sila- nizada (20 g, 14 cm) e elui-se com acetato de etilo; éter de petróleo Isl e acetato de etilo. As frac-çdes de acetato de etilo - éter de petróleo contendo o derivado di-substituido são reunidas, e o solvente é removido para se obterem 0,27 g do composto (92%). P.F. 158 - 161°C (dec.). (b) 7-(L-Alanil)faxo!

Misturam-se 2, 7-di- (t.Boc-L-alanil)taxol (0,29 g, 0, 242 mmol) e ácido fórmico (2 ml) e agita-se à temperatura ambiente durante 40 minutos e remove-se o ácido fórmico em excesso em azoto. Dissolve-se o resíduo em etanol e adiciona-se éter de petróleo, Filtra-se o sólido para se obterem 0,27 g de 2',7-di-- (alanil)taxol.

0 d erivado de dialanil bruto assim obtido é retomado em acetonitrilo (4 ml) e tampão de fosfato (0,02 M, pH 7,4, 50 ml) e agita-se a mistura à temperatura ambiente durante 12 horas. Aumenta-sé o valor de pH - 30 - * ♦

da solução para 6, 8 utilizando alguns ml de NagHFO^ a 5%. Agita-se a solução turva à temperatura ambien- mL· te durante mais 8 horas. Dilui-se a mistura reaccio-nal cora cloreto de metileno (50 ml), e adiciona-se a ela bicarboneto de sódio frio (0,05 M, 50 ml). Sxtrai-se imediatamente a mistura reaccional com cloreto de metileno (50 ml x 3) e lava-se o extracto orgânico uma vez com agua e seca-se em sulfato de sódio anidro. Removem-se o solvente para se obterem 0,24 g do produto. Purifica-se este composto por croma-tografia de coluna numa coluna de gel de sílica sila-nizada para se obterem 0.135 g de produto (63%). (Pureza > 95%). p.F. 159 - 163°C. Bspectro de massa (FAB) im/e 925(M-*H) ‘. Ho espectro de RMN (300 MHz, CDClg) o 7-H a 4,33 ppm da taxol aparecia como doble-to de dobletos a 5, 65 ppm. 0 grupo CH^ no radical de alanina aparecia como dobleto a 1, 27 ppm.

Analise elementar calculada para ^50 **5 3^2° 16 2 5 H20 C, 61,91, H, 6.54, N, 2,89, determinado C, 61,41, H, 6,59, N, 2,78%. (c) Sal do ácido metanossulfónico de 7-(alanil)taxol A uma solução de 7-(alanil)taxol (62 mg, 0,0658 mmol) em t&butanol (2 ml) e água (1 ml) arrefece-se para 0-5°C é adicionado ácido metanossulfónico (6,39 mg;

2,13 ml; 3 rng/ml) e a mistura è agitada a esta temperatura durante 2 minutos e filtrada através de um filtro de miliporos (0,2 jM). Liofiliza-se o filtrado para se obterem 66 mg do produto, p.f. 180-184°C 31 - v.iwrcwTgB··.»:»· SSgsmaBaaaa Vu/úf-1· ί' ImV » <·..* - SSEssasassaiia, \ 9 .!&

Propriedades físicas P.Mol. P.F.

Solubilidade 10 21 180-184°C (dec.) > 2 mg/ml

CondicSes de Operação de HPLC Colunas fose moveis

Betector: caudais Volume de Ret. RP-8, 150 mm de comprimento, 4,6 mm Dl acetato (pH 5); Acetoni-

trilo 50 s 50 0.0 2M contendo Ο,ΟΟΙΜ de hidrogénio sul·* fato de TetrabutiiL e amónio

Kratos spectro-flow 757 1 mL/min. 8, 7 mL 7.3 (taxol) c ti/g (horas) 11.9

Estabilidade do Plasma, __37 Cs CondiçSes do plasma humano (20 /ig/ml)

Exemplo VI - Preparado de 21 - (CBZ-L-Alanil) taxol (a) 2(GB2-)-L~Alanil) taxol A uma solução de taxol (30 mg? 0,0036 mrnol) e CB£.L. alanina (8,5 mg, 0,036 mrnol) em cloreto de metileno (5 ml), foram adicionados DCC (45 mg) e 4-dimetilami-nopiridina (4 mg) e a mistura é agitada a temperatura ambiente durante 3 dias. Filtrou-se a mistura reaccio--nal e remove-se o solvente do filtrado. Purificou-se o resíduo por TLC preparativa em placas de gel de 32 -

sílica silanisada e revela-se em acetato de etilo--éter de petróleo Isl e corta-se a banda por cima do taxol e elui-se com acetato de etilo e remove-se o solvente para se obterem 28 mg de 2‘-(CBZ-L-alanil) taxol. (b) Sintese do 2'-(alanil)taxol pela âesoroteccão de 2 *- (CB2-li-alaní.l) taxol

Dissolve-se o 2*-(CBZ-L-alanil)taxol em etanol na presença de um ácido orgânico como por exemplo ácido acético ou fórmico e agita-se à temperatura ambiente durante 2 horas na presença de 5% de paládio em carvão. Filtra-se a mistura reaccional para remover o catalisador e remove-.se o solvente. 0 produto bruto é dissolvido em etanol e adiciona-se éter do petróleo para se obter o 2(alanil)taxol como sal formato ou acetato com rendimento baixo ou moderado.

Exemplo. VII - Preparação de 2*-(lisil)taxol (a) Sjntese de 21-(N-di-t-boc-lisil)taxol A uma mistura de taxol (30 mg, 0,03'5 mmol) e IM-di. t.boc-L-lisina (19 mg, 0,0368 mmol) em cloreto de me-tileno (10 ml) são adicionados DCC (100 mg) e 4— -dimetilaminopiridina (10 mg) e agita-se a mistura à tepperatura ambiente durante 2 dias e filtra-se. Remove-se o solvente da mistura. Purifica-se o resíduo por TLC preparativa em placas de gel de sílica sila-nizada e revela-se em acetato de etilo-éter de petróleo 1:1, e corta-se a banda por cima do taxol e eluiu-se com acetato de etilo e remove-se o solvente para se obterem 20 mg do produto. 33

(b)

Sjntese de 2*-(lisil)taxol pala desprotecgão do grupo t-boc

Faz-se reagir o derivado de aminoácido protegido com N-t-boc do taxol com ácido fórmico (99%), Sigma, à temperatura ambiente durante 30-40 minutos. Removesse o ácido fórmico em excesso por evaporação em azoto. Purifica-se o material bruto por cristalização ou cromatografia para se obter o derivado de amino ácido N-protegido do taxol como sal formato.

Exemplo VIII - Preparação de 2*-(L-alanll)taxol (a) Sintese de 21-(FIVOC-L-alanil) taxol A uma solução de taxol (60 mg, 0,072 mmol) e N--FMOC-L-alanina (22,4 mg) em cloreto de metileno (6 ml) é adicionado DCC (60 mg) e 4-dimetilaminopiridina (2 mg) e agita-se a mistura a temperatura ambiente durante 2 dias e filtra-se. Remove-se o solvente do filtrado. Purifica-se o material bruto por TLC preparativa em placas de gel de sílica silanizado e revela-se em acetato de etilo-éter de petróleo ls2. A banda por cima do taxol é cortada e eluída com cloreto de metileno e remove-se o. solvente para se obterem 48 mg de produto compreendéndo 2'-(FMDC-L-alanil)taxol p.f. 162-64°C (dec.). (b) D^sproteccão do grupo FI-:PC do derivado de aminoácido protecido do taxol

Faz—se reagir o derivado de aminoácido do taxol protegido com N-FMJC com piperidina em cloreto de metileno durante duas horas e remove-se o solvente. Puri fica-se o resíduo por cromatografia para se obter o derivado de aminoácido do taxol desprotegido. - 34 -

Composições Farmacêuticas

Os compostos da invenção podem ser formulados por si próprios em composições farmacêuticas ou podem ser formulados sob a forma dos seus sais farmaceu-ticamente aceitáveis, particularmente como sais de adição de ácido farmaceuticamente aceitáveis ou os sais básicos aceitáveis não tóxicos. Estes sais podem ser preparados a partir dos compostos da invenção de acordo com processos químicos convencionais.

Normalmente, os sais são preparados fazendo reagir a base ou o ácido livre com quantidades estequiométricas ou com um seu excesso do ácido inorgânico ou orgânico formador de sal pretendido num solvente adequado ou várias combinações de solventes. Como exemplo, a base livre pode ser dissolvida numa solução aquosa do ácido adequado e o sal pode ser recuperado por técnicas convencionais, por exemplo, por evaporação da solução. Alternativamente, a base livre pode ser dissolvido num solvente orgânico como por exemplo um alcanoilo inferior, um éter, um éster de alquilo, ou misturas suas por exemplo metanol, etanol, éter, acetato de etilo, uma solução de acetato de etilo-éter, e produtos semelhantes, e em seguida ser tratado com o acido adequado para formar o sal correspondente. 0 sal é recuperado por técnicas de recuperação convencionais, por exemplo, por filtração do sal pretendido ou separação espontânea da solução ou pode ser precipitado pela adição de um solvente em que o sal seja insolúvel e ser recuperado a partir dele.

Os derivados do taxol da invenção podem ser utilizados no tratamento de cancros devido à sua cito-toxicidade, e actividade antitumor. Os novos compostos são administráveis na forma de comprimidos, pílulas, misturas em pó, cápsulas e soluções injectáveis, supositórios, emulsões, dispersões, pré-misturas para alimentos, e noutras formas ade quada. A composição farmacêutica que contém o composto é 35

convenientemente misturada com um veículo orgânico farmaceu-ticamente não tóxico ou com um veículo inorgânico farmaceuti-camente não tóxico, geralmente cerca de 0,01 mg até 2 500 mg, ou mais, por unidade de dosagem, preferivelmente 50-500 mg. Os veículos farmaceuticarnente aceitáveis típicos são, por exemplo, manitol, ureia, dextranos, lactose, amidos de batata e de milho, estearato de magnésio, talco, óleos vegetais, polialquileno glicóis, etil celulose, poli (vinilpirroli·· dona), carbonato de cálcio, oleato de etilo, miristato de isopropilo, benzoato de benzilo, carbonato de sódio, gelatina,, carbonato de potássio, ácido silícico, e outros veículos convencionalmente utilizados e aceitáveis, h composição farmacêutica pode também conter substâncias auxiliares não tóxicas como por exemplo agentes emulsionantes, conservantes, molhantes, e produtos semelhantes, por exemplo, raamolaurato de sorbitano, oleato de trietanolamina, monoestearato de po-lioxietileno, tripalmitato de glicerilo, sulfossuccinato de dioctilo e de sódio, e produtos semelbanqes.

Um exemplo de um processo típico para preparar um comprimido que contém os agentâs activos é misturar em primeiro lugar o agente com um ligante não tóxico como por exemplo gelatina, mucilagem de acácia, etil celulose, ou produtos semelhantés. A mistura é adequadamente efeo tuada num misturador em V convencional e geralmente em condições anidras. 3m seguida, a mistura assim preparada pode ser introduzida em máquinas convencionais de fazer comprimidos, e os agregados podem ser transformados em comprimidos.

Os comprimidos recentemente preparados podem ser revestidos, ou podem não ser revestidos. Os revestimentos representativos adequados são os revestimentos não tóxicos incluindo laca, metil celulose, cera de carnaúba, copolímeros de esti-reno-ácido maleico, e produtos semelhantes. Para a administração oral, preparam-se comprimidos contendo 0,01 mg, 5 mg, 25 mg, 50 mg, 500 mg, etc., até 2000 pg tendo em atenção o acima referido e por técnicas conhecidas e apresentadas em Remingston‘s Pharmaceutical Science, Capítulo 39, Mack Publis 36 -

hing Co., 1965

Para se obter o comprimido, o composto activo, amido de milho, lactose, fosfato de dicálcio e carbonato de cálcio são uniformemente misturados em condições secas num misturador em V convencional ate todos os ingredientes serem uniformemente misturados. Em seguida, a pasta de amido de milho é preparada sob a forma de uma pasta a 10% e é misturada com o composto anterior até se obter uma mistura uniforme. Faz-se em seguida passar a mistura através de uma rede convencional moderada, seca-se numa atmosfera anidra e em seguida mistura-se com estearato de cálcio, e prensa-se para se obterem comprimidos, e revestem-se estes se desejado. Preparam-se de modo idêntico outros comprimidos contendo 10, 50, 100, 150 mg, etc. A seguinte Formulação I é um exemplo de uma formulação para comprimidos compreendendo um composto da invenção.

FORMULAÇÃO I —— 11 i i.fH.iia i ii n a, ii mu mm

Por comprimido. mg 50.0 15.0 4.5 15.0 67.0 2.0 50.0

Ingredientes:

Composto activo Amido de milho Pasta de amido de milho Carbonato de cálcio Lactose

Sgtearato de cálcio Fosfato de dicálcio - 37 -

A preparação de cápsulas contendo 10 mg a 2500 mg para utilização oral consiste essencialmente numa mistura do composto activo com um veículo não tóxico e envolver-se a mistura numa folha polimérica, geralmente de gelatina ou produtos semelhantes. As cápsulas podem ter a forma macia conhecida de uma cápsula obtida envolvendo o composto em d ispersão intima com um veículo alimentar, compatível, ou a cápsula pode ser uma cápsula dura consistindo essencialmente do novo composto misturado com um sólido não tóxico como por exemplo talco, estearato de cálcio, carbonato de cálcio, ou produtos semelhantes. As cápsulas contendo 25 mg, 75 mg, 125 mg, e produtos semelhantes, do novo composto, isoladamente ou em mistura de dois ou mais dos novos compostos são preparados,por exemplo, da forma seguinte:

FORMULAÇÃO II

Ingredientes por cápsula, mg

Composto activo 50.0

Carbonato de cálcio 100.0

Lactose, u.s.P. (Farmacopeia

Amer i can a) 200.0

Amido 130.0

Estearato de magnésio 4,5

Os ingredientes acima referidos são misturados em conjunto num misturador convencional e em seguida são introduzidos em cápsulas comercialmente disponíveis. Quando se utilizam concentrados superiores do agente activo, faz-se uma redução correspondente na quantidade de lactose.

Os compostos da invenção podem também ser liofilizaèos e, se desejado, combinados com outros exci^ 38 -

£ΰ3®ώί*“ΰ.· ··

pientes farmaceuticamente acercáveis para preparar formulações adequadas para a administração parentérica, injectá-vel. Para essa administração, a composição pode ser reconsti-tuida em água (normal, salina), ou uma mistura de água e de um solvente orgânico, como por exemplo propileno glicol, etano1, e produtos semelhantes. A dose administrada, quer como dose única, dose múltipla, ou dose diária, variará obviamente, como o composto particular da invenção utilizada devido à potência variável do composto, via escolhida de administração, peso do paciente e natureza da condição do paciente. A dosagem administrada não está sujeita a limites definidos, mas será geralmente uma quantidade eficaz, ou o equivalente numa base molar da forma livre farmacologicamente activa produzida a partir de uma composição para dosagem após a libertação metabólica do medicamento activo para conseguir os seus efeitos farmacológicos e fisiológicos pretendidos. A dosagem administrada está geralmente na gama de 0,8 a 8 mg/kg de peso corpóreo com csrca de 50- 275 rng/m do pacien- 2 te, especialmsnte cerca de 230-275 mg/m .

Actividade Biológica

Tal como acima referido, os derivados do taxol da invenção são úteis pela sua actividade anti-tumor. Os compostos são particularmente úteis no tratamento dos mesmos cancros em que o taxol se mostrou activo, incluindo cancros do pulmão, melanoma. leucemia, cancros da mama e, cancros do cólon, humanos. A actividade biológica dos derivados do taxol foi ensaiada por (a) estudos in vitro para medir a cinética da associação de microtúbulos; e (B) estudos in vitro na cinética da cultura das células de melanona B15? e (C) estudos in vivo no xenografto da cépsula sub-renal SRG de MS-1. 39

(A) Eatudos Cinéticos de Associação de Microtúbulos in vitro

Os microtubulos são uma parte integral das células eucariócica s, e a associação de microtúbulos esta impotentemente associada com a divisão e multiplicação das células. Foi demonstrado que a polimerização de mierotú— bulos é muito sensível ao cálcio; o cálcio pode inibir a associação da tubulina e despolimerizar os microtúbulos pré--associados. Foram estudados compostos anti-tumores conhecidos tendo em conta o seu efeito na associação de microtúbulos.

Demonstrou-se que os alcaloides vinca, por exemplo vinblastina e vincristina, rompem os microtúbulos celulares, isto é, eles mostraram in vitro que inibem a associação de microtúbulos e despolimerazar os microtúbulos estabilizados.

De modo semelhante, demonstrou-se que a colchicina despolimerazada os microtúbulos nas células. O taxol, por outro lado, apresenta um mecanismo muito específico de aeçãO,, dado que ele promove a associação de microtúbulos mas inibe a sua separação, interferindo portanto com as fases Sg e M dos ciclos e divisão das células. Sstudos in vitro mostram que os microtúbulos, logo que polimerizados, resistem, na presença do taxol, à despolimerizaçao por outros agentes como por exemplo CaCl2 ou a temperaturas baixas que normalmente despolimerizam os microtúbulos.

Foram conduzidos ensaios para investigar o efeito dos derivados do taxol na associação de microtúbulos. A associação de microtúbulos foi efectuada utilizando derivados 2' e 7 de acordo com os procedimentos in vitro referidos, por exemplo, em Meliado e col., Biochemical and Biophysical Research Communications, Vol 124, N2 2 (1984), 40

ρρ. 329-336; Magri e col., J. 0r9'. Chem., 51/ 797-80 2 (1986); e Parness e col», Biochemical and Biophysical Research Communications/ Vol. 105/ N2 3/ pp. 1082-1091 (1982). A capacidade destes compostos para associarem microtúMos seguiu a ordems taxol y 7-(N#N-dimetilglicil)taxol(11) 'y 2'-(N/N-dietilaminopropionil)taxol (8) y 2*-(N^N-dime-tilglicil)taxol(2). Este estudo mostra que um grupo 2'-hidro~ xilo livre é essencial para a associação de microtubulos. Os derivados 2'-são activos apenas se o grupo 2'-hidroxilo ficar livre durante o decurso da experiência. Os derivados -7 tem grupos 2'-hidroxilo livres e são, portanto/ activos. Este resultado estã em bom acordo com as actividades do 2' e 7-acetil taxol referidas na literatura/ Mellado e col., ΒχΟ Chemical and Biophysical Research Communications/ Vol 124, N2 2 (1984)/ pp 324-336. (3) Estudos de Cultura de Células B 16 in vitro

Para confirmar a actividade dos derivados de taxol de invenção/ conduziram-se estudos de culturas de células in vitro utilizando células de melanona B-16.

Estes estudos foram conduzidos de acordo com procedimentos convencionais tal como os deshritos em Donoso e Himes Câncer Biodâerri/ BiophysicS/ Vol. 7 (1984) p.133.

No estudo de proliferação de células do melanoma B-16/ a ordem da sua eficiência foi de taxol >2'-- (N,N-dimetilglicil)taxol 2(N# N-dêtilaminopropionil)taxol > 7-(N, N-dimetilglioil)taxol. Este estudo e outros estudos cinéticos indicam que os 2’-derivados regressam ao taxol e apresentam actividade. Assim/ os 2’-derivados actuam provaYel-mente como pró-medicamentos. P0r outro ladO/ os 7-derivados possuem actividade própria e não parecem actuar como poómedi-camentos. (C) Estudos In Vivo 41 -

0 terceiro tipo de experiência conduzida para confirmar a actividade biológica dos derivados do taxol compreendia estudos in vivo em ratos no xenograft nx-1 do carcinoma mamário humano com acpsula suprarenal.

Os procedimentos seguidos sSo os referidos nas páginas 23-24 da Publicação NIH Me 84-2635, In 37ivo Câncer Model (Fevereiro de 1984).

Procedimento

Mo procedimento, utilizam-se grupos de ensaio de ratos (6 ratos) por grupo de ensaio) e os grupos de controlo de 12 ratos por cada grupo. Implanta-se um fragmento de tumor (Xenografto MX-l do carcinoma mamário humano) por baixo da cobertura membranosa do rim de cada rato.

Segue-se o seguinte esquema de ensaios

Dia O: Anestesiam-se os animais. Regista-se o peso corpóreo (Peso do Dia 1). Implanta-se o tumor, mefle-se e regista-se. Distribuem-se aleatoricamente os animais após eles recuperarem da anestesia. 3fectuam-se culturas bacteriológicas. Determinam-se as solubilidades do agente de ensaio. Registam-se as mortes diariamente

Dia 1 s Controlam-se as culturas. Despresa-se a experiência se contaminada. Preparam-se os materiais de ensaio. Iniciam-se as injecçSes do agente de ensaio (na base da garganta) com base no peso corpóreo individual. 0 tratamento é £4D nos dias 1, 5, e 9.

Prepara-se o agente de ensaio fresco em cada dia de injecção e administra-se com base no peso corpóreo individual para esse dia.

Dia 2 : Recontrolarn-se as culturas. Para-se o ensaio se estiverem contaminados e regista-se esse facto. 42

Dias 5 e 9 :P^eparam-se o agente de ensaio fresco em cada dia de injecção e administra-se com base no peso corpóreo individual para esse dia.

Dia 11: Termina-se e avalia-se os resultados da experiência

Registam-se os pesos corpóreos (Peso do Dia 2). Mede·--se o tumor em unidades QMU (unidade Micrométrica Oc|i< lar-10 OMU - 1 mm) e regista-se.

Avaliação: 0 parâmetro medido é a alteração média do peso do tumor (delta) com base nas medidas de comprimento e de largura em milirnetros. Os. pesos corpóreos médios dos animais são comparados para os Dia 1 e Dia 11, calcula-se o valor de T/C para todos os grupos de ensaio com 65% dos sobreviventes no Dia 11. Uma diferença excessiva na alteração de peso corpóreo (ensaio menos controlo) pode também ser utilizada na avaliação da toxicidade. As dimensões são medidas e registadas em Unidades Microme tricas Oculares (OMU). Utiliza-se um computador para os seguintes cálculos: 1) Conversão de OKU em milímetros (mm). 2) Cálculo dos pesos dos tumores (mg) a partir das dimensões dos tumores (mm x mm) seguido a fórmula para o volume de um elipsóide alongado; 2

W em que L é a maior das duas medidas.

Calcula-se a alteração (delta) no peso médio do tumor para cada grupo de ratoss

Alteração no Peso Médio de Tumor « Peso Médio do Tumor Final - Peso Médio do Tumor Inicial - 43

4) Calcula—se alteração (delta) no peso médio do tumor para os grupos de ensaio (I) e de controlo (C). 5) Calcula-se o valor de T/C% para todos os grupos de ensaio com 65% de sobreviventes no Dia da Avaliação Finalí T/C% « x 100 - Se p positivo A PC Δ T/C% * ,_ X 100 - Se /\ pt negativo. Λ Peso Médio do Tumor de Ensaio Inicial

Critério para a Actividadeg

Considera-se necessário um valor inicial de T/C — 20% para demonstrar uma actividade moderada. Considera-se uma actividade signifitativa um valor reprodutível de T/C S 10%.

Resultados obtidoss

Os resultados obtidos nos ensaios e£ec-tuados em várias derivados de taxol são apresentados nas Tabelas 1 e 2. 44 - és η g O Ω • o § á H) C/l θ' H H HX? 2j Ω Pt ft S! I a p o ao o o Q OH • O a << B co a co 3 aí Pt ft fx!

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ΤΑΒΒΙΑ 1 - ENSAIOS - PARC ΐNO MAS MAMÁRIOS HUMANOS co 9 i B §m SCO o c H B Ω â ^ ω w 01 a o m Hl (¾ 3 Ei <$ . B S o H B a cq \aS ê CO H$ Ω ãfco << Dí H & Hl P-t Ω B a P Q Ω <C P ^

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*

tituido com a fórmula (II) em que R é um grupo com a fórmula (III) e R» e H. 3- -

Processo de acordo com a reivindicação 1* caracterizado por se fazerem reagir 2 equivalentes do referido composto com a fórmula (iv) com 1 equivalente de taxol, para assim formarem um composto 2*-7~di (substituído) com a for· mula (li) em que R e R* são cada um um grupo com a fórmula (li i) * _ 4ê -

Processo de acordo com a reivindicação 3, caracterizado por se submeter o referido composto 2*-7--di-(substituído) a uma reacção de clivagem, em que 2,-substi-· tuinte ê clivado para assim formar um composto 7-substituido com a fórmula (II) em que R e H e R* é um grupo com a fórmula (III). -5â-

Processo de acordo com a reivindicação I, caracterizado por a referida reacção ser efectuada na presença de um reagente de condensação, e na presença ou ausência de um catalisador. _ õs -

Processo de acordo com a reivindicação 4, caracterizado por a referida reacção de clivagem compreender submeter-se o mesmo composto 2‘-7-di(substituído) a um valor de pH de 7-7,4. - 49 -

Claims (1)

1. λ

   À partir destes resultados, pode observar-se que os derivados de taxol da invenção apresentam uma actividade anti-tumor excelente. Estes compostos, são portanto úteis como agentes antitumor devido à sua actividade biológica e à sua maior solubilidade em água quando comparados com o taxol. Tendo sido a invenção descrita, será óbvio que a mesma pode ser variada de muitas maneiras. Estas variações não devem ser encaradas como um desvio do espírito e *mbito da invenção, e pretende-se que todas estas modificações óbvias para a especialista estejam incluidas dentro do âmbito das reivindicações anexas. —1---I .........λ i» - ia _ Processo para a preparação de um composto com a fórmula II

   (II) 0

   - 47

   na qual R e R* são cada um H ou ura grupo com a fórmula III C = o I (CSiJ (III) . 2 n N R R" 2 3 na qual n é um inteiro de 1 a 3 e R e R são cada urn hidrogénio ou um radical alquilo com um a tr^s átomos de carbono ou em que R e R formam/ juntamentecom o átomo de azoto a que estão ligados, um anel heterocíclico com quatro a cinco átomos de carbono, com a condição de pelo menos um de R e R não ser hidrogénio, caracterizado por se fazer reagir o taxo 1 com um composto com a fórmula IV OH (IV) N /\ R" R 9 3 na qual n, R“ e R são como acima definidos. - 23 - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o referido taxol e o referido composto com a fórmula (IV) reagirem numa proporção de 1:1 com base em equivalentes, para assim formarem um composto 2’-subs·· - 48 -

   ο na qual R e R' são cada um H ou o resíduo de um aminoacido# com a condição de pelo menos um de R e R* não ser hidrogénio, caracterizado por se fazer reagir o taxol com um aminoacido N-protegido, e em seguida se desproteger o referido aminoáci-do. -8B- Processo de acordo com a reivindicação 7, caracterizado por o referido taxol e o referido aminoacido N-protegido reagirem numa -proporção de líl equivalentes# para assim formarem um derivado de taxol 2'-substituido. - 50 k *

   « 9§ w Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o referido taxol e o referido aminoaci*·» do N-protegido reagirem numa proporção de 1:2 equivalentes, para assim formarem um derivado de taxol 2',7-di(substituído), - lo a - Processo de acordo com a reivindicação 9, caracterizado por se submeter o referido composto com a formula (II )a uma reacção de clivagem, em que o 2 '-substi-tuinte aminoácido ê clivado para assim formar um derivado 7-(aminoácido) do taxol. - 11- - Processo de acordo com a reivindicação 7, caracterizado por a referida reacção de desprotecção ser efectuada por tratamento com um ácido moderado. 12â - Processo para a preparação de um composto com a formula II 51 -

   (II) ο na qual R ê o resíduo de um aminoácido e scolhido no grupo consistindo em alanina, leucina, isoleucina, salina, veni-lalanina, pro&ina, lisina e arginina ou um grupo com a fórmula III 0 (III) <®2>η N R2 R3 2 3 na qual n é um inteiro de 1 a 3 e R e R são cada um hidrogénio ou um radical alquilo com:um a trêã átomos de carbono ou em que R e R juntamente com o átomo de azoto a que estão ligados formam um anel heterocíclico saturado com quatro a cinco átomos de carbono, caracterizado por (a) fazer-se reagir o taxol com um composto com um grupo protector de hidroxilo para se obter o 2(protegido) taxol, 52 -

   (b) fazer-se reagir o referido 2'-(protegido)taxol com ala-nina, leucina, isoleubína, valina, fenilalanina, pro-lina, Usina, arginina ou um composto com a formula OH Wn H 2 3 na qual R , R e n são como acima definidos, para se obter um 2·-(protegido), 7-(substituído)taxol, e (c) desproteger-se a posição-2. 13» - Processo de acordo com a reivindicação 12, caracterisado por a referida fase de desprotecção ser efectuada fazendo reagir o referido 2'-(protegido), 7-(substituído) taxol com uma mistura de zinco e ácido acético. - 14s - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se obter nomeadamente o 2(N, N-dimetil· glicil)-taxol ou um seu sal de adição de ácido. 53 - 15β - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se obter nomeadamente o 2,-(N/N-dietil-aminopropionil)taxol ou um seu sal de adição de ácido. - 169 _ Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se obter nomeadamente o 7-(N,N-dimetil-glicil)taxol ou um seu sal de adição de ácido. - 172 - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se obter nomeadamente o 2', 7-di(iSi,N-di-metilglicil)taxol ou um seu sal de adição de ácido. - 189 - Processo de acordo com a reivindicação 1# caracterizado por se obter nomeadamente o 7-(alanil)taxol ou um seu sal de adição de ácido. - 189 „ Processo para a preparação de uma composição farmacêutica caractèrizado por se incorporar como ingrediente activo uma quantidade antitumor eficaz de pelo menos um composto com a formula II 54 • · ¢5^

   Η (III na qual R e R* são cada um E ou o resíduo de um aminoácido escolhido no grupo consistindo em alanina/ leucina, isoleu-cina, salina, fenilalanina, prolina. lisina e arginina ou um grupo com a -formula III (III) ;L2)n R

   Rv O Q na qual n é um inteiro de 1 a 3 e R eR são cada um hidrogénio ou um radical alquilo com um a três átomos de carbono ou em que R e R juntamente com o atomo de azoto a que estão ligados formam um anel heterocíclico saturado com quatro a cinco átomos de carbono, com a condição de pelo menos um de R e R·1 não ser hidrogénio, ou um seu sal farmaceutiaamente aceitável em associação com um veículo, diluente ou excipi-ente farmaceuticamente aceitável. 55 - I » - 20 â - Processo de acordo com a reivindicação 19, caracterizado por se incorporar nomeadamente o 2'-(N,N~ -dimetilglicil)taxol. - 21â - Processo de acordo com a reivindicação 19, caracterizado por se incorporar nomeadamente o 2'-(N, N--dietilaminopropionil)taxol. Lisboa, 12 de Julho de 1990

   56 -